CN112334229A - 图案化的微流体装置及其制造方法 - Google Patents

Abstract

一种制造微流体装置(200,201,202,300,301,302,400,401,402)的方法包括以下步骤：将聚合物珠的单层附接到第一基材(210,410)上，将金属氧化物膜沉积到第一基材(210,410)上并沉积在聚合物珠的单层上方，以及移除聚合物珠以形成金属氧化物纳米孔(240,440)的阵列，其中，在纳米孔(240,440)的底部处暴露第一基材(210,410)。所述方法还包括：将有机磷酸酯层沉积到金属氧化物膜上。所述方法还需要将硅烷涂层或丙烯酸酯聚合物沉积到暴露的第一基材(210,410)上。所述方法还包括：使第二基材(220,420)与第一基材(210,410)结合，以将金属氧化物纳米孔(240,440)的阵列包封在第一和第二基材(210,220,410,420)内的腔体中。

Description

图案化的微流体装置及其制造方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119，要求2018年6月14日提交的第62/685,100号美国临时申请的优先权权益，其内容通过引用全文纳入本文。

技术领域

本公开一般涉及用于生物分子分析，尤其是基因测序的图案化的微流体装置及制造图案化的微流体装置的方法。

背景技术

生物样品在组成和数量上通常很复杂。分析生物样品中的生物分子常涉及将单个样品划分成成千上万个样品来进行定量测定。这通常使用固体基材表面来选择性地固定并分配生物样品中的不同生物分子来实现。

已经发现微流体装置在生物分子分析中有广阔应用，这主要是由微流体在空间和/或时间上控制生物反应的能力驱动，该能力对许多生物分子分析来说至关重要。例如，对于基于光学检测的大规模平行基因测序技术(也称为下一代测序，NGS)，可以捕获由基因组DNA样品产生的数百万个短DNA片段，并将其分配到微流体装置的图案化表面上，以使得这些DNA片段在空间上彼此分开，从而有利于测序，例如，通过合成、连接或单分子实时成像进行测序。这些基因测序技术可用于对整个基因组，或者对小部分的基因组(例如外显子或预选的基因子集)进行测序。

本公开的实施方式代表了相对于现有技术水平，在微流体装置及其制造方法方面的进步。根据本文提供的描述，这些优点和其他优点以及附加的发明特征将变得显而易见。

概述

本公开的实施方式提供了用于基因测序应用的微流体装置，其包含在蚀刻的通道底板表面上的图案化的纳米孔。本文公开的某些实施方式包括用于制造在蚀刻的通道底板表面上含有图案化的纳米孔的微流体装置的方法，以及使用在蚀刻的通道底板表面上包含图案化的纳米孔的微流体装置的方法以用于基因测序应用。

在一些实施方式中，所述微流体装置包括：微流体装置的选择性表面化学涂层，所述微流体装置在蚀刻的通道底表面上含有图案化的纳米孔，其中，纳米孔的间隙壁由金属氧化物制成并且涂覆有有机磷酸酯分子，所述有机磷酸酯分子抵抗与DNA、蛋白质和/或核苷酸的结合，并且纳米孔的底表面由SiO₂(二氧化硅)或玻璃制成并涂覆有硅烷分子，所述硅烷分子通过静电相互作用或共价键而促进与DNA、蛋白质和/或核苷酸的结合。

在一些实施方式中，一种制造微流体装置的方法包括以下步骤：对第一基材进行蚀刻以形成至少一个通道，将聚合物珠的单层附接到第一基材上，使用等离子体蚀刻来减小聚合物珠的尺寸，将金属氧化物膜沉积到第一基材上并沉积在聚合物珠的单层上方，以及移除聚合物珠以形成金属氧化物纳米孔阵列，其中，在纳米孔的底部处暴露第一基材。所述方法还可包括：将有机磷酸酯层沉积到金属氧化物膜上，所述有机磷酸酯被构造用于抵抗与DNA、蛋白质和/或核苷酸的结合。所述方法还可包括：将硅烷涂层或丙烯酸酯聚合物沉积到在纳米孔的底部出暴露的第一基材上，以及使第二基材与第一基材结合以将金属氧化物纳米孔阵列包封在第一基材和第二基材内的腔体内。如本文所用的术语“腔体”是指在结合之后由第一基材和第二基材的内表面界定的三维空间，而“通道”是指有时候在第一基材和/或第二基材中建立的U形底板，或者在前述基材底板中形成的可单独寻址(addressable)的通道。

在一些实施方式中，所述方法包括：将含有聚合物珠的溶液分配到在浸没的基材上方的液体中，以及将单层中的聚合物珠转移到基材上。所述方法可以任选地包括：加热基材以造成聚合物珠附接于基材，以及随后将聚合物珠暴露于氧等离子体以减小聚合物珠的尺寸。所述方法还可以包括：从基材移除聚合物珠。例如，可在溶剂溶液，例如乙醇或其他溶剂中，利用声波处理来移除聚合物珠。附加或替代性地，可采用化学或者酶消化或降解来移除聚合物珠[例如，当聚合物珠由可降解或可生物降解的聚合物，如聚半乳糖醛酸(PGA)制成时]。例如，由PGA制成的珠可通过等离子体来减小尺寸，以及可使用果胶酶(一种植物酶)来从表面移除。

在一些实施方式中，所述方法包括：沉积有机磷酸酯层，其是含聚乙二醇的有机磷酸酯和/或聚乙烯基磷酸中的一种(例如，在所形成的纳米孔的侧壁为金属氧化物的实施方式中，进行所述沉积)。附加或替代性地，所述方法包括：沉积有机磷酸酯层，其是胺封端的有机磷酸酯、环氧基封端的有机磷酸酯、羧基有机磷酸酯和/或含有不饱和部分的有机磷酸酯衍生物中的一种，所述不饱和部分例如环烯、环炔、杂环烯或杂环炔(例如，在纳米孔的底部为金属氧化物的实施方式中，进行所述沉积)。进一步地，所述方法可以包括：在纳米孔底部处的暴露的第一基材上，沉积胺封端的硅烷、环氧基封端的硅烷、羧基封端的硅烷、硫羟封端的硅烷和/或含有不饱和部分的硅烷衍生物中的一种，所述不饱和部分例如环烯、环炔、杂环烯或杂环炔(例如，在纳米孔的底部为二氧化硅或玻璃的实施方式中，进行所述沉积)。附加或替代性地，所述方法可以包括：沉积羧基封端的硅烷和/或聚乙二醇硅烷中的一种(例如，在纳米孔的侧壁为二氧化硅的实施方式中，进行所述沉积)。

在一些实施方式中，DNA引物(primer)共价结合或以其他方式结合到一个或多个纳米孔的底部。前述聚合物珠可以由聚苯乙烯或类似材料制成，例如聚酯、聚丙烯、可生物降解的聚合物(例如聚半乳糖醛酸(PGA))或另外合适的材料。在一些实施方式中，各个聚合物珠的直径为0.05微米至5微米。在一些实施方式中，相邻纳米孔之间中心到中心的平均距离为0.05微米至5微米。所述基材可以包括一个或多个单独寻址的通道，在其中附接有聚合物珠。

可以使用胶粘剂、可紫外固化的胶粘剂、聚合物胶带和压敏胶带来进行第一基材和第二基材的结合。在替代性实施方式中，可使用激光辅助结合来进行第一基材和第二基材的结合，其中，在第一基材与第二基材之间插入结合层(例如，金属或金属氧化物结合层)。在一些实施方式中，将负电荷赋予聚合物珠，例如呈现羧酸根的聚苯乙烯珠，以及将正电荷赋予基材，例如，3-氨基丙基三乙氧基硅烷涂覆的玻璃基材。

在一些实施方式中，微流体装置包括第一基材，其在第一内表面上具有纳米孔的第一图案化阵列，并且具有侧壁，所述侧壁具有端表面。在一些这样的实施方式中，第二基材具有第二内表面和周向表面部分，并且第一基材的端表面结合到第二基材的周向表面部分，以使得第一内表面和第二内表面限定在结合的第一基材与第二基材内的腔体。

在一些实施方式中，第二基材在第二内表面上具有纳米孔的第二图案化阵列。在一些这样的实施方式中，纳米孔的第一图案化阵列或纳米孔的第二图案化阵列可以被设置在第一或第二内表面中的一个或多个通道内。在一些实施方式中，所述一个或多个通道的深度为30微米(μm)至500微米(μm)。

在一些实施方式中，微流体装置包括位于第一或第二基材的一个端部处的进口，以及位于与第一端部相对的第一或第二基材的另一端部处的出口。金属氧化物膜的厚度可以在1纳米(nm)至500纳米(nm)的范围内。在某些实施方式中，金属氧化物膜对波长在400纳米(nm)至750纳米(nm)范围内的光是透明的。

在一些实施方式中，一种制造微流体装置的方法包括以下步骤：对第一基材进行蚀刻以形成至少一个通道，将金属氧化物层沉积到第一基材上，将聚合物珠的单层附接到第一基材上，使用等离子体蚀刻来减小聚合物珠的尺寸，将二氧化硅膜沉积到第一基材上并沉积在聚合物珠的单层上方，以及移除聚合物珠以形成二氧化硅纳米孔的阵列，其中，在纳米孔的底部处暴露第一基材的金属氧化物层。所述方法还可包括：将有机磷酸酯层沉积到纳米孔的金属氧化物底部上，所述有机磷酸酯被构造用于促进与DNA、蛋白质和/或核苷酸的结合。在一些实施方式中，所述方法包括：将硅烷涂层沉积到纳米孔的二氧化硅侧壁上，所述硅烷涂层被构造用于抵抗与DNA、蛋白质和/或核苷酸的结合。在一些实施方式中，所述方法包括：使第二基材与第一基材结合，以将二氧化硅纳米孔的阵列包封在第一基材和第二基材内的腔体中。

在一些实施方式中，微流体装置包括第一基材和设置在第一基材上的金属氧化物或二氧化硅纳米孔的阵列。在纳米孔的底部处可暴露第一基材。第二基材可结合到第一基材，由此将金属氧化物或二氧化硅纳米孔的阵列包封在第一基材与第二基材之间的腔体中。

在以下的具体实施方式中给出了其他特征和优点，其中的部分特征和优点对本领域的技术人员而言，根据所作描述就容易看出，或者通过实施包括以下具体实施方式、权利要求书以及附图在内的本文所述的各个实施方式而被认识。

应理解，前面的一般性描述和以下的具体实施方式都仅仅是示例性的，并且旨在提供用于理解权利要求的性质和特性的总体评述或框架。所附附图提供了进一步理解，附图被结合在本说明书中并构成说明书的一部分。附图说明了一个或多个实施方式，并与说明书一起用来解释各种实施方式的原理和操作。

附图简要说明

并入本说明书中并形成本说明书一部分的附图例示了本公开的几个方面。在附图中：

图1是示出了根据示例性实施方式构建的图案化的微流体装置的示意图；

图2A、2B和2C是根据示例性实施方式，示出了三种单侧图案化的微流体装置沿着通道方向的侧视图的示意图，其中，顶部和底部基材以不同的方式结合在一起；

图3A、3B和3C是根据与图2A、2B和2C所示的实施方式不同的示例性实施方式，示出了三种双侧图案化的微流体装置沿着通道方向的侧视图的示意图，其中，顶部和底部基材以不同的方式结合在一起；

图4A、4B和4C是根据与图2A、2B和2C所示的实施方式和图3A、3B和3C所示的实施方式不同的示例性实施方式，示出了三种双侧图案化的微流体装置沿着通道方向的侧视图的示意图，其中，顶部和底部基材以不同的方式结合在一起；

图5是根据示例性实施方式，例示了用于采用纳米球光刻法来制造图案化的微流体装置的方法的流程图；

图6A-6E是示例性扫描电子显微镜图像的例示，其示出了在具有通道的玻璃切片的通道底板表面上的紧密堆积的聚苯乙烯珠，所述例示示出了不同时间段的氧等离子体处理的效果；

图7是聚苯乙烯珠的直径根据氧等离子体灰化持续时间而变化的图示；

图8是示出了在剥离掉紧密堆积的聚苯乙烯珠之后的金属氧化物纳米孔的示例性扫描电子显微镜图像；以及

图9示出了Cy3-dT30与共价附接于纳米孔底表面的dA30分子杂交后的荧光显微图像。

虽然下文将公开某些优选的实施方式，但是不旨在限于这些实施方式。相反，旨在覆盖如所附权利要求限定的本公开的精神和范围内所包括的所有替代形式、修改和等同形式。

具体实施方式

本公开的实施方式涉及使用纳米球光刻法对表面进行图案化，更具体地，涉及对微流体通道的表面进行图案化。纳米球光刻法可用于在大面积基材(例如，平坦的玻璃晶片和玻璃片材)上产生周期性表面纳米织构。在一些实施方式中，可应用纳米球光刻法对深的微流体通道内侧进行纳米图案化。

申请人已经确定，对固体基材的表面进行图案化可以作为有效手段来选择性地捕获生物样品中的感兴趣的生物分子并因此划分所述生物分子。光刻和纳米压印方法能够在制作图案(包括纳米图案化)中实现高产量和高保真度。然而，这些过程在要被图案化的固体基材的几何结构上可能受到限制。例如，光刻法可以用于对平坦的晶片基材(例如，玻璃、纯二氧化硅和硅)进行图案化，而纳米压印可以用于对平坦或弯曲的晶片基材进行图案化。然而，可能难以实施这些方法以用于在微流体通道内侧进行纳米图案化。

下文所述的本公开的一些实施方式包括微流体装置，其在蚀刻的通道底板表面上包含图案化的纳米孔，以及制造图案化的微流体装置的方法，其用于生物分子分析，尤其是基因测序。图案化的微流体装置可以包含一个或多个通道，例如，多个单独寻址的通道。

图1是示出了图案化的微流体装置100的一些实施方式的示意图，其包括8个独立寻址的通道105。在一些实施方式中，在每个通道105的至少一个通道表面上，存在图案化的纳米孔110。在一些实施方式中，图案化的微流体装置100包括针对每个通道105的进口端口120和出口端口130。黑色区域140示出了第一(顶部)和第二(底部)基材被接合或结合在一起以形成密封(例如，通过结合层)的区域。在一些实施方式中，所述密封是气密性的。

通道105和进口端口120/出口端口130可在第一(顶部)基材上或第二(底部)基材上。第一基材可以是玻璃、玻璃陶瓷、二氧化硅或另一种合适的材料，而第二基材可以是玻璃、玻璃陶瓷、硅、二氧化硅或另一种合适的材料。在400nm至750nm之间的波长范围内，第一基材和/或第二基材可以是透明的。图案化的纳米孔110可以由金属氧化物、二氧化硅或另一种合适的材料制成。例如，如本文所述，图案化的纳米孔可以被限定在包含金属氧化物、二氧化硅或另一种合适材料的膜内，并且所述膜被设置在第一基材和/或第二基材上(例如，使用纳米球光刻法)。金属氧化物或二氧化硅可在比用于纳米球光刻法的聚合物微球的玻璃化转变温度Tg更低的温度下沉积。金属氧化物可以是下述物质(例如，可以包含下述物质中的一种或多种)：Al₂O₃、ZnO₂、Ta₂O₅、Nb₂O₅、SnO₂、MgO、氧化铟锡、CeO₂、CoO、Co₃O₄、Cr₂O₃、Fe₂O₃、Fe₃O₄、In₂O₃、Mn₂O₃、NiO、a-TiO₂(锐钛矿)、r-TiO₂(金红石)、WO₃、Y₂O₃、ZrO₂或其组合。在一些实施方式中，金属氧化物对可见波长(例如，400nm至750nm)内的光透明。

图2A、2B和2C的示意图示出了三种示例性单侧图案化的微流体装置200、201、202的沿着通道方向的侧视图，其中，单侧图案化的微流体装置200、201、202包括第一或顶部基材210和第二或底部基材220，其中，在这三种实施方式的每一者中，顶部基材210和底部基材220使用不同的机制接合在一起。

在所示的实施方式中，单侧图案化的微流体装置200、201、202在第一或顶部基材的通道底板(例如，蚀刻的通道底板)表面上包括图案化的纳米孔240。例如，顶部基材210可以经过第一化学蚀刻来形成通道，并且在通道的底板表面上可以通过纳米球光刻法形成图案化的纳米孔240。在一些这样的实施方式中，底部基材220是平坦的，并且包括从底部基材220的外表面到内表面的两个开口，一个为进口端口250，另一个为出口端口260。进口端口250和出口端口260可为微流体装置200、201、202提供流体运动路径。流体运动路径限定了生物样品通过微流体装置的方向和途径。具体地，生物样品可经由微流体装置的进口端口，通过物理力(例如，泵送)被负载到微流体装置的通道中。一旦被负载，则生物样品可填满微流体通道的整个空间并且与顶部通道底板(top channel floor)和底表面接触，直到生物样品到达出口端口并进一步离开装置。基因测序可包括许多读取循环，每个循环包括多次流体交换(例如，核苷酸添加，终止子切割，缓冲液洗涤)。

在图2A所示的单侧图案化的微流体装置200的一些实施方式中，顶部基材210和底部基材220通过被设置在顶部基材210与底部基材220之间的结合层230直接结合在一起。例如，结合层230被设置在第一基材210的经蚀刻的通道的侧壁215的端表面上。在一些实施方式中，结合层230包含金属。例如，所述金属可以是(例如包括)以下中的一种或多种：金、铬、钛、镍、铜、锌、铈、铅、铁、钒、锰、镁、锗、铝、钽、铌、锡、铟、钴、钨、镱、锆或其适当的组合、或其氧化物。适当的组合包括这些金属的已知合金、或金属氧化物，例如，氧化铟锡或氧化铟锌。

在一些实施方式中，首先在顶部基材210上图案化结合层230，随后进行保护(例如，用光致抗蚀剂或耐蚀刻剂的聚合物胶带)。在化学蚀刻后，可在顶部基材210上形成通道。在纳米球光刻后，在通道(包括通道底板表面)内侧可形成图案化的纳米孔阵列240。最后，可去除保护(例如，光致抗抗蚀剂或聚合物胶带)以暴露结合层230。可使用激光辅助辐射结合工艺来实现经图案化的顶部基材210与平坦的底部基材220的结合。在一些实施方式中，所述结合可以是激光结合，例如，如在美国专利号9,492,990、9,515,286和/或9,120,287中所述，所述文献的全文通过引用纳入本文。

在一些实施方式中，结合层230可包括胶粘剂、可紫外固化的胶粘剂、聚合物-碳黑复合膜、压敏双面胶带或聚酰亚胺双面胶带。顶部基材210可以首先用光致抗蚀剂、油墨或耐蚀刻剂的聚合物胶带部分保护。在化学蚀刻了未保护区域以形成通道后，可使用纳米球光刻法在通道的底板表面上或者可独立寻址的通道105(参见图1)上形成图案化的纳米孔阵列240。最后，可去除保护性光致抗抗蚀剂、油墨或聚合物胶带。结合层230则可沉积到或位于顶部基材210的保护区域上(例如，第一基材210的通道的侧壁215的端表面上)。顶部基材210与底部基材220的结合可通过压力(例如，当结合层是胶带时)，通过紫外交联(例如，当结合层230是可紫外固化的胶粘剂时)或通过另一种合适的过程来实现。

在图2B所示的单侧图案化的微流体装置201的一些实施方式中，顶部基材210包括在未蚀刻的端表面上的金属结合层230，并且还包括在整个内表面上的图案化的纳米孔240，所述整个内表面包括端表面区域和通道的底板表面，同时，底部基材是平坦的。在一些实施方式中，顶部基材210涂覆有金属结合层230。在蚀刻形成通道以及接着的纳米球光刻之后，除了通道的的底板表面之外，在通道的侧壁215的端表面上也可设置有图案化的氧化物层240a。因此，上述金属结合层230和图案化的氧化物层240a可一起用来将顶部基材210结合到底部基材220。

在图2C所示的单侧图案化的微流体装置202的一些实施方式中，顶部基材210包括在其整个内表面上的图案化的纳米孔240，所述整个内表面包括端表面区域和通道的底板表面(与图1所示的单独寻址的通道105相反)，同时，底部基材220是平坦的。可通过由金属氧化物层制造的图案化的纳米孔240a来实现顶部基材210与平坦的底部基材220的结合。图案化的纳米孔240a可位于通道侧壁215的端表面上，该端表面与底部基材220紧密接触。

图3A、3B和3C的示意图示出了三种示例性双侧图案化的微流体装置300、301、302沿着通道方向的侧视图，其中，在这三个实施方式的每一者中，顶部基材210和底部基材220以不同的方式结合在一起。在所示的一些实施方式中，第一或顶部基材210包括在蚀刻的通道底板表面上的图案化的纳米孔240，而第二或底部基材220是平坦的并且包括在其整个内表面上的图案化的纳米孔240。

在图3A所示的一些实施方式中是双侧图案化的微流体装置300。顶部基材210可包括具有图案化的纳米孔240的通道底板，以及具有端表面的侧壁215，所述端表面包括结合层230。底部基材220可以是平坦的，并且在顶部基材210的通道开口下方包括图案化的纳米孔240。底部基材220可具有在顶部基材210的结合层230下方的周向表面区域。底部基材220还可包括进口端口250和出口端口260。进口端口250和出口端口260可为微流体装置300、301、302提供流体运动路径。可通过结合层230来实现顶部基材210与底部基材220的结合。

在图3B所示的一些实施方式中是双侧图案化的微流体装置301。顶部基材210可包括在通道的侧壁215的端表面的非蚀刻区域上的金属结合层230，以及在通道的底板表面上的图案化的纳米孔240。底部基材220可以是平坦的，并且在其整个内表面上包括图案化的纳米孔240。可通过顶部基材210的金属结合层230与底部基材220的含金属氧化物层的图案化的纳米孔240a接触，来实现顶部基材210与底部基材220的结合。

在图3C所示的一些实施方式中是双侧图案化的微流体装置302，其中，顶部基材210和底部基材220在它们的整个内表面上均包括图案化的纳米孔240。可通过两个金属氧化物层来实现顶部基材210与底部基材220的结合，每个金属氧化物层包括彼此紧密接触的图案化的纳米孔240a。

图4A、4B和4C的示意图示出了三种示例性双侧图案化的微流体装置400、401、402沿着通道方向的侧视图，其中，在这三个实施方式的每一者中，顶部基材410和底部基材420以不同的方式结合在一起。在所示的一些实施方式中，顶部基材410和底部基材420均包括蚀刻的通道以及在它们的蚀刻的通道的底板表面上的图案化的纳米孔440。所述两个基材410、420在组成和厚度上可以相同或不同。

在图4A所示的一些实施方式中是双侧图案化的微流体装置400，其中，顶部基材410和底部基材420各自包括具有图案化的纳米孔440的通道以及相应的侧壁415、425，所述侧壁415、425分别包括结合层430a和430b。底部基材420还可包括进口端口450和出口端口460。进口端口450和出口端口460可为微流体装置400、401、402提供流体运动路径。可通过所述两个结合层430a和430b来实现顶部基材410与底部基材420的结合。

在图4B所示的一些实施方式中，双侧图案化的微流体装置401被构造成使顶部基材410和底部基材420在其相应的侧壁415、425的端表面上的非蚀刻区域上包括金属结合层430，并且在其整个内表面上进一步包括图案化的纳米孔440。可通过两个金属结合层430以及它们的顶部图案化的纳米孔区域470来实现顶部基材410与底部基材420的结合。

在图4C所示的一些实施方式中，双侧图案化的微流体装置402被构造成顶部基材410和底部基材420各自在其整个内表面上包括图案化的纳米孔440。可通过两个金属氧化物层470来实现顶部基材410与底部基材420的结合，每个金属氧化物层470在彼此紧密接触的配合侧壁端表面上具有图案化的纳米孔。

本公开的实施方式还包括一种在具有或不同有通道的基材上制造纳米图案化的孔的方法。在一些实施方式中，所述方法包括改进的Langmuir–Blodgett(朗格缪尔布洛杰特)膜类型转移方法。在一些实施方式中，如图5所示，所述方法包括以下步骤：提供水浴容器，其包括基材支架框架和在该框架下方的排水管；将第一基材放置在基材支架框架的顶部上；加入水直到第一基材被水浸没；将包含有机溶剂中的聚合物珠的溶液分配到水浴容器中，直到在水-空气界面处形成聚合物珠单层；使用排水管排水以将聚合物珠单层转移至第一基材；对包括聚合物珠单层的第一基材进行干燥；任选地在升高的温度下烘烤第一基材以增强聚合物珠与第一基材的附接；减小聚合物珠的尺寸(例如，应用氧等离子体来减小聚合物珠的尺寸)；任选地，在升高的温度下烘烤基材以增强聚合物珠与第一基材的附接；在第一基板上沉积金属氧化物或二氧化硅膜；剥离掉聚合物珠以在第一基材上形成图案化的纳米孔(例如，剥离掉聚合物珠之后，纳米孔构成了留在沉积的金属氧化物或二氧化硅膜内的空隙)；将第二基材放置在图案化的第一基材的顶部上；以及将第二基材与第一基材结合(例如，通过进行激光辅助结合)以形成微流体装置。

在一些实施方式中，所述方法包括用能够使DNA、蛋白质和/或核苷酸结合到图案化的纳米孔的材料涂覆微流体装置的通道内表面。在一些实施方式中，在进行纳米球光刻之前，第一基材包括蚀刻的通道。在一些实施方式中，在进行纳米球光刻之前，第一基材包括被金属氧化物进一步涂覆的蚀刻的通道。取决于应用，得到的纳米孔可具有以下四种可能构造中的一种：裸基材底部/SiO₂侧壁，裸基材底部/金属氧化物侧壁，金属氧化物底部/SiO₂侧壁，或者金属氧化物底部/金属氧化物侧壁。根据纳米孔构造和应用，所述涂层可以是有机磷酸酯、硅烷中的一种或两种。例如，当形成的纳米孔是金属氧化物底部/SiO₂侧壁时，可首先施涂能够与DNA、蛋白质或核苷酸结合的有机磷酸酯，以涂覆金属氧化物底部，然后，可使用抵抗与DNA、蛋白质和/或核苷酸结合的硅烷(例如聚乙二醇硅烷)涂覆SiO₂侧壁。

基材可以是切片、晶片、玻璃片或另一种合适的构造。例如，晶片可以是标准的6英寸晶片、8英寸晶片、12英寸晶片或正方形晶片。在一些实施方式中，基材可以是平坦的，或者含有蚀刻的通道。基材上的图案化的纳米孔的尺寸可由氧等离子体处理之前和之后的聚合物珠的尺寸限定。在基材上的图案化纳米孔的相邻纳米孔之间的节距，或中心到中心的距离可由聚合物珠的原始尺寸限定。例如，当使用1μm聚合物珠时，节距可以是约1μm。图案化的纳米孔的尺寸可由氧等离子体处理之后的聚合物珠的尺寸限定。例如，当聚合物珠的尺寸从1μm减小到0.5μm时，金属氧化物孔的直径可以是约0.5μm。金属氧化物或二氧化硅孔的深度可由所沉积的金属氧化物或二氧化硅膜的厚度限定。例如，当沉积50纳米(nm)的金属氧化物层时，所形成的金属氧化物纳米孔的深度可以是约50nm。在一些实施方式中，使用所述纳米球光刻获得的图案化的纳米孔的直径可以通过在图案化的基材的整个表面上方沉积金属或硅氧化物膜层来进一步减小，该沉积例如使用原子层沉积、电子束沉积、等离子体增强的化学气相沉积或其他方法进行。

在一些实施方式中，使用氧等离子体处理来减小聚合物珠的尺寸。附加或替代性地，氩等离子体或其他合适的方法可用于减小聚合物珠的尺寸。在一些实施方式中，尺寸减小受三个参数控制：等离子体功率、气体流动速率和/或等离子体处理的持续时间。例如，在图6A所示的一些实施方式中，使用改进的Langmuir-Blodgett膜转移方法，在1x3英寸切片的通道内侧形成了单层的600nm聚苯乙烯纳米珠。所述切片包括8个可独立寻址的通道，每个通道的宽度为2.38mm，长度为70mm并且通道深度为100μm。在用氧等离子体处理(例如，将聚苯乙烯暴露于氧等离子体)不同时间后，聚苯乙烯珠的尺寸随着等离子体处理的持续时间而均匀且逐渐地减小(参见图6A-6E)。

随着等离子体处理的持续时间增加，聚合物珠的尺寸不断减小。图7示出了在15毫托和40(SCCM)氧气下，在200W功率下，珠尺寸的减小根据等离子体处理的持续时间而变化的图示。SCCM是标准立方厘米/分钟，其是流量测量术语，表明在气体的温度和压力的标准条件中的cm³/min。

图8示出了在通道内侧的图案化的金属氧化物纳米孔的一些实施方式的代表性扫描电子显微镜(SEM)图像。例如，单层的1μm聚苯乙烯微珠被转移到包括8个可独立寻址的通道105(如图1所示)的1x3英寸玻璃基材，每个通道105的宽度为2.38mm，长度为70mm并且通道浓度为100μm。在120℃下进行30秒的任选烘烤，以增加聚苯乙烯珠与玻璃表面的附接。然后在200瓦、15毫托、40SCCM氧气下，用氧等离子体处理基材及其聚苯乙烯珠的单层，处理300秒。之后，在120℃下再次烘烤基材30秒，以增加聚苯乙烯珠与玻璃基材表面的附接。随后沉积50nm Al₂O₃(氧化铝)层以在基材表面上形成金属氧化物纳米孔阵列。最后，在乙醇溶液中采用声波处理来剥离掉聚合物珠。图8的SEM图像显示，玻璃基材的通道底板表面包括均匀性相对较高的Al₂O₃纳米孔阵列。在一些情况中，小百分比的所形成的纳米孔可比预计的更大。不希望囿于理论，认为这种比预计的纳米孔更大可能是由于开始的聚苯乙烯珠具有较大的尺寸。虽然所形成的大多数纳米孔之间具有均匀的距离(例如，均匀的节距)，但是少数的纳米孔分开得更远(例如，大于预计节距)。不希望囿于理论，认为这种更大的分离可能是由于随机发生的珠尺寸和/或珠间隔的差异。在一些实施方式中，这种随机发生的特征(例如，空的或大尺寸的纳米孔)可用作成像和后续的数据分析过程的位置标记或识别记号(例如，基准点)。附加或替代性地，在膜沉积期间或者膜沉积步骤之后，可使用例如激光直写方法来引入物理记号(例如，线、正方形或圆形特征)，并且用作位置标记或识别记号(例如，基准点)。

虽然参考图5-7所述的一些实施方式包括由聚苯乙烯制造的聚合物珠，但是在本公开中包括其他实施方式。例如，在一些实施方式中，聚合物珠包括可降解(例如，可生物降解)的聚合物[例如，聚半乳糖醛酸(PGA)]。在一些这样的实施方式中，聚合物珠可如本文参考聚苯乙烯珠所述进行尺寸减小(例如，等离子体处理)。附加或替代性地，可使用化学或酶降解或消化(例如，使用果胶酶，其是一种植物酶)来移除聚合物珠。在各个实施方式中，所述珠可由各种材料制成(例如聚合物或其他材料)，它们可进行尺寸减小并从基材移除，以形成如本文所述的纳米孔。

在一些实施方式中，通过在孵育某段时间之后，从浓的、分散良好的聚合物珠悬浮溶液中取出基材，可形成聚合物珠单层。在一些这样的实施方式中，聚合物珠可具有负电荷，例如，羧基化的聚苯乙烯珠；而基材可具有正电荷，例如，基材具有氨基丙基硅烷涂层。聚合物珠与基材之间的静电相互作用可增加聚合物珠与基材表面的接合。这种相互作用可能导致珠在基材上相对较随机地分布。通过控制珠浓度、溶剂、孵育时间、取出速率或者珠与基材表面之间的相互作用，可在基材表面上形成分离良好且均匀分布的聚合物珠单层。当发生这种情况时，可以省略等离子体处理，并且可使得到的涂覆有珠的基材直接经受氧化物膜沉积，并且在剥离掉珠后可形成纳米孔。

在一些实施方式中，通过旋涂浓的、分散良好的聚合物珠悬浮溶液，可在基材表面上形成聚合物珠单层。

本公开还公开了微流体装置的选择性表面化学涂层，所述微流体装置在蚀刻的通道底板表面上含有图案化的纳米孔，其中，纳米孔的间隙壁由金属氧化物制成并且涂覆有有机磷酸酯分子，所述有机磷酸酯分子抵抗与DNA、蛋白质和/或核苷酸的结合，并且纳米孔的底表面由SiO₂或玻璃制成并涂覆有硅烷分子，所述硅烷分子通过静电相互作用或共价键而允许结合到DNA、蛋白质和/或核苷酸。

所用的硅烷分子可以是氨基丙基硅烷等(例如，当DNA是DNA纳米球并且通过静电相互作用附接于经硅烷涂覆的区域时)。所用的硅烷分子可以是环氧基硅烷(例如，当DNA具有胺末端因而可形成共价键时)。所用的硅烷分子可以是氨基硅烷[例如，当DNA具有胺末端，并且利用双官能链接分子(例如，BS3，或含有酸酐部分的聚合物)将DNA共价连接到氨基硅烷涂覆的区域时]。所用的硅烷分子可以是3-巯基丙基三甲氧基硅烷等(例如，当DNA具有硫羟末端因而在DNA与硅烷分子之间可形成共价键时)。附加或替代性地，纳米孔表面的底部可涂覆有允许DNA共价附接的丙烯酸酯聚合物，例如，如在美国专利公开号2016/0122816A1[Novel Polymers and DNA Copolymer Coatings(新型聚合物和DNA共聚物涂层)]中所述，所述文献的全文通过引用纳米本文。

本公开的一些实施方式包括一种将微流体装置用于基因测序应用的方法，所述微流体装置包括在蚀刻的通道底板表面上的图案化的纳米孔。在一些实施方式中，引物DNA序列(例如，dA30或dT30)共价或以其他方式附接于基材的金属氧化物纳米孔的底部区域，随后捕获从样品中获得的单链DNA分子，簇生成以及测序。从样品中获得的单链DNA分子可包含与引物DNA序列互补的序列。可使用桥式扩增，或排他性扩增，或模板行走方法来进行成簇。通过合成、或连接、或单分子实时成像测序，可实现这种测序。

图9示出了在与dA30阵列杂交后，Cy3-dT30的荧光显微图像。通过双官能链接物BS3将dA30的5’-胺末端共价连接到使用上述纳米球光刻形成的纳米孔阵列的底表面内的硅烷涂层的胺基团，实现dA30阵列的形成。此处，使用纳米球光刻方法(使用5分钟氧等离子体处理后为1μm的聚苯乙烯珠作为模板)在1x3英寸的8通道基材的通道底板表面上首先形成Al₂O₃纳米孔阵列。随后，使基材在100瓦下经受10分钟的氧等离子体处理，然后在90℃时用在水中的5mg/ml聚(乙烯基磷酸)[西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)]涂覆5分钟。接着在去离子水中清洗3次基材，以及在100％乙醇中清洗一次基材。在氮气干燥并且在90℃下在炉中退火10分钟后，接着在室温下，用在95％乙醇/5％水中的pH～5的2％3-氨基丙基三乙氧基硅烷孵育10分钟，随后在100％乙醇中清洗四次，并且氮气干燥。该两步涂覆得到了形成于纳米孔的底表面上的3-氨基丙基三乙氧基硅烷涂层，以及形成于纳米孔的侧壁表面上的聚(乙烯基磷酸)涂层，聚(乙烯基磷酸)涂层抵抗与DNA、蛋白质和/或核苷酸的结合。接着，在室温下，在存在1X PBS中的200μM BS3的情况下，使经涂覆的基材与100μM 5’-胺-C6-dA30反应，之后用去离子水清洗并且氮气干燥。结果，dA30被特定地附接到所形成的纳米孔的底表面。最后，使涂覆有dA30的基材与在1X PBS中的1μM Cy3-dT30杂交30分钟，清洗，氮气干燥，并且使用共聚焦荧光显微技术检测。结果显示，在所有的纳米孔中具有dT30杂交荧光信号。

另外，除了通道之外，8通道基材在基材的顶端表面处还包括经铬图案化的涂层。在基材的整个内表面上形成Al₂O₃纳米孔后，在室温下使用激光辅助结合，将基材构建成与另一玻璃底部基材(1x3英寸)结合。所得的微流体装置被构建成具有气密性密封，并且能够基于模板行走和合成测序来进行DNA测序。这些结果一起提示，dA30官能化的微流体装置支持大规模平行DNA测序。

如本文所公开的，图案化的微流体装置可由薄的和/或具有通道的基材制成，由于用于高分辨率成像的物镜的有限的工作距离，允许对微流体通道的顶表面和底表面的光学荧光成像有更好的质量。常规的光刻法和纳米压印通常可适用于在相对较厚的平坦基材(例如，0.5mm、0.7mm、1mm、1.1mm)上图案化。对于较薄的基材(例如，0.1mm、0.2mm、0.3mm)，图案化过程通常需要载体。载体的使用可使制造过程复杂化并增加成本。相较之下，纳米球光刻法可应对较薄的基材，或者厚度可变的基材(例如，具有通道的基材)。

本公开的图案化的微流体装置能够实现DNA测序分析并具有高的信号背景比，这是因为间隙区域(例如，相邻的纳米孔之间)可涂覆有抵抗与DNA、蛋白质和/或核苷酸结合的材料，并且纳米孔的底表面可涂覆有促进与DNA、蛋白质和/或核苷酸结合的材料。附加地，相比于常规的光刻法或纳米压印技术，所公开的用于制造图案化的微流体装置的方法可以更低的成本实施，这是因为所述方法可在不需要用于产生纳米图案的复杂且昂贵的仪器的情况下实施。另外，所公开的制造方法可放大、具有灵活性，并且具有高的吞吐量。所公开的方法在基材方面也具有灵活性，例如，平坦或具有通道的基材，圆形或正方形晶片，小型(例如切片)或大型(例如，晶片、玻璃片)基材。所公开的方法可以放大，因为它们可应用于大尺寸基材，例如5代(Gen 5)显示器玻璃面板。所公开的方法可容易地达到每小时几千个晶片的吞吐量。

本文所引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均通过引用并入本文，其程度与每个参考文献被单独且具体地指示为通过引用并入本文的全文相同。

在本公开(特别是在所附权利要求的上下文中)中的术语“一个”和“一种”和“该”等类似表达应解释为涵盖单数和复数，除非另有说明或者上下文明确另有所指。术语“包含”、“具有”、“包括”以及“含有”应解释为开放式术语(即，表示“包括，但不限于”)，除非另有说明。除非本文中另有说明，本文中对数值范围的引用仅仅是一种速记方法，单独表示落在该范围内的各个独立的值，且各个独立的值包括在说明书范围内，如同它们被单独引用。本文所述的所有方法可以任何合适的顺序进行，除非另有说明或者清楚指出相反。除非另有说明，本文所提供的任何和所有实施例，或者示例性的语言(如，“例如”)的使用仅仅是为了更好地阐述公开的实施方式。说明书中的所有语言都不应解释为指示任意未主张的要素为必需。

对本领域的技术人员而言，显而易见的是可以进行各种修改和变动而不偏离公开的实施方式的精神或范围。因为本领域技术人员可以结合实施方式的精神和实质，对所公开的实施方式进行各种改良、组合、子项组合和变化，因此，应认为本公开的实施方式包括所附权利要求书范围内的全部内容及其等同内容。

Claims (37)

1.一种制造微流体装置的方法，所示方法包括以下步骤：

将珠的单层沉积到第一基材上；

减小设置在第一基材上的珠的尺寸；

将包含金属氧化物或二氧化硅中的至少一种的膜沉积到第一基材上并沉积在珠的单层的上方；

从第一基材移除珠，以在膜中形成纳米孔阵列，在纳米孔的底部处暴露第一基材；以及

使第二基材与第一基材结合，以将纳米孔阵列包封在第一基材与第二基材之间的腔体中。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述珠包括聚合物珠。

3.如权利要求2所述的方法，其中，所述聚合物珠包括聚苯乙烯珠。

4.如权利要求2所述的方法，其中，所述聚合物珠包括可降解的聚合物。

5.如权利要求1所述的方法，其中，减小珠的尺寸包括：在从第一基材移除珠之前，将珠暴露于等离子体来减小珠的尺寸。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述等离子体包含氧等离子体。

7.如权利要求1所述的方法，其中，减小珠的尺寸包括减小珠的直径。

8.如权利要求1所述的方法，其中，从第一基材移除珠包括：使用声波与溶剂的组合来从第一基材移除珠。

9.如权利要求1所述的方法，其中，从第一基材移除珠包括：化学或酶降解所述珠。

10.如权利要求1所述的方法，其包括：用第一材料涂覆纳米孔阵列中的一个或多个纳米孔的底表面，所述第一材料能与DNA、蛋白质或核苷酸中的至少一种结合。

11.如权利要求10所述的方法，其中：

所述一个或多个纳米孔的底表面包括第一基材的暴露部分，所述第一基材包含SiO₂或玻璃；并且

第一材料包含以下中的至少一种：胺封端的硅烷、环氧基封端的硅烷、羧基封端的硅烷、硫羟封端的硅烷或含有不饱和部分的硅烷衍生物。

12.如权利要求10所述的方法，其中：

所述一个或多个纳米孔的底表面包括第一基材的暴露部分，所述第一基材包含金属氧化物；并且

第一材料包括以下中的至少一种：胺封端的有机磷酸酯、含环氧基的有机磷酸酯或羧基有机磷酸酯。

13.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：将DNA引物结合到一个或多个纳米孔的底部。

14.一种制造微流体装置的方法，所示方法包括以下步骤：

将单层的聚合物珠沉积到第一基材上；

将包含金属氧化物或二氧化硅的膜沉积到第一基材上并沉积在聚合物珠的单层的上方；

从第一基材移除聚合物珠，以形成设置在膜中的纳米孔阵列，其中，在纳米孔的底部处暴露第一基材；以及

使第二基材与第一基材结合，以将纳米孔阵列包封在第一基材与第二基材之间的腔体中。

15.如权利要求14所述的方法，其中，将聚合物珠的单层沉积到第一基材上包括：

将包含聚合物珠的溶液分配到液体上；以及

将在液体-空气界面处形成的单层中的聚合物珠转移到第一基材上。

16.如权利要求15所述的方法，其中：

将聚合物珠的单层沉积到第一基材上包括：加热第一基材以增强聚合物珠与第一基材的接合；并且

所述方法包括：在将膜沉积到第一基材上并沉积在聚合物珠的单层上方之前，将聚合物珠暴露于氧等离子体，以减小聚合物珠的尺寸。

17.如权利要求14所述的方法，其中，从第一基材移除聚合物珠包括：使用声波与溶剂的组合来从第一基材移除聚合物珠。

18.如权利要求14所述的方法，其中，从第一基材移除聚合物珠包括：化学或酶降解所述聚合物珠。

19.如权利要求14所述的方法，其包括：用第一材料涂覆纳米孔阵列中的一个或多个纳米孔的底表面，所述第一材料能与DNA、蛋白质和/或核苷酸结合。

20.如权利要求19所述的方法，其中：

所述一个或多个纳米孔的底表面包括第一基材的暴露部分，所述第一基材包含SiO₂或玻璃；并且

第一材料包含以下中的至少一种：胺封端的硅烷、环氧基封端的硅烷、羧基封端的硅烷、硫羟封端的硅烷或含有不饱和部分的硅烷衍生物。

21.如权利要求19所述的方法，其中：

所述一个或多个纳米孔的底表面包括第一基材的暴露部分，所述第一基材包含金属氧化物；并且

第一材料包括以下中的至少一种：胺封端的有机磷酸酯、含环氧基的有机磷酸酯或羧基有机磷酸酯。

22.如权利要求14所述的方法，所述方法包括：将DNA引物结合到一个或多个纳米孔的底部。

23.如权利要求14所述的方法，其中，所述聚合物珠包括聚苯乙烯。

24.如权利要求14所述的方法，其中，各个聚合物珠的直径为0.05微米至5微米。

25.如权利要求14所述的方法，其中，相邻纳米孔之间中心到中心的平均距离为0.05微米至5微米。

26.如权利要求14所述的方法，其中，将聚合物珠的单层沉积到第一基材上包括：在第一基材的一个或多个通道中沉积聚合物珠。

27.如权利要求14所述的方法，其中，使第二基材与第一基材结合包括：使用胶粘剂、可紫外固化的胶粘剂、聚合物胶带或压敏胶带中的至少一种来结合第一基材和第二基材。

28.如权利要求14所述的方法，其中，使第二基材与第一基材结合包括：使用激光辅助结合来结合第一基材和第二基材，其中，在第一基材与第二基材之间设置有结合层，所述结合层包括金属或金属氧化物中的至少一种。

29.如权利要求14所述的方法，所述方法包括：赋予聚合物珠负电荷，以及赋予第一基材正电荷。

30.如权利要求14所述的方法，其中，所述膜的厚度为1纳米至500纳米。

31.如权利要求14所述的方法，其中，所述膜对波长在450纳米至750纳米范围内的光是透明的。

32.一种微流体装置，所述装置包括：

第一基材，包括在第一内表面上的纳米孔的第一图案化阵列，以及侧壁，所述侧壁具有端表面；和

第二基材，包括第二内表面和周向表面部分；

其中，第一基材的端表面结合到第二基材的周向表面部分，使得第一内表面和第二内表面限定了在结合的第一基材和第二基材内的腔体。

33.如权利要求32所述的微流体装置，其中，第二基材包括第二内表面上的纳米孔的第二图案化阵列。

34.如权利要求32所述的微流体装置，其中，纳米孔的第一图案化阵列或纳米孔的第二图案化阵列被设置在第一内表面或第二内表面各自的一个或多个通道内。

35.如权利要求34所述的微流体装置，其中，所述一个或多个通道的深度为30微米至500微米。

36.如权利要求32所述的微流体装置，所述装置包括位于第一或第二基材的第一端部处的进口，以及位于与第一端部相对的第一或第二基材的另一端部处的出口。

37.一种微流体装置，所述装置包括：

第一基材；

纳米孔阵列，被限定在位于第一基材上的膜中，所述膜包含金属氧化物或二氧化硅，在纳米孔的底部处暴露第一基材；和

与第一基材结合的第二基材，由此使得纳米孔阵列被包封在第一基材与第二基材之间的腔体中。

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