CN111733234A

CN111733234A - 一种食管癌分子标志物及其应用

Info

Publication number: CN111733234A
Application number: CN201910229348.0A
Authority: CN
Inventors: 王筠; 钟姗; 盛司潼; 刘乃嘉
Original assignee: Shenzhen China Gene Technologies Co ltd; Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen China Gene Technologies Co ltd; Shenzhen University
Priority date: 2019-03-25
Filing date: 2019-03-25
Publication date: 2020-10-02

Abstract

本发明涉及一种食管癌分子标志物及其应用，所述食管癌分子标志物包括miR‑3914或/和miR‑8082。与正常食管上皮组织或细胞相比，其在食管癌组织或细胞中的表达量显著降低。其可作为食管癌肿瘤诊断的分子标志物，为食管癌的辅助诊断提供了一个新的、较可靠的分子检测工具，并且还可以作为食管癌发病与发展的调控治疗靶点，具有一定的临床意义。

Description

一种食管癌分子标志物及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤标志物技术领域，尤其涉及一种食管癌分子标志物及其应用。

背景技术

食管癌是由食管上皮细胞异常增生所致的、全球最常见的消化道恶性肿瘤之一。依经典分类，可分为食管鳞癌和食管腺癌两种不同的病理亚型。流行病学研究表明前者是食管癌的主要病理类型，可占到总发病数的九成，是目前亟待解决的、对生命健康的重大威胁。

microRNA(miRNA)是一类全长约18-24个核苷酸的内源性非编码小RNA，主要通过与下游信使RNA(mRNA)3'非编码区(3'UTR)互补结合导致直接抑制蛋白质翻译或转录本的降解调整下游基因的表达。越来越多的证据支持miRNA可作为肿瘤发生、发展的关键调控因子，也是用作人类癌症诊疗中有用的诊断和预后标志物。

CN108828229A公开了一种食管癌肿瘤标志物组合及其应用，该发明提供了用于检测特异蛋白质组合中各个蛋白质的物质在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为诊断或辅助诊断食管癌；所述特异蛋白质组合包括以下五种蛋白质：GLU2B蛋白、FINC蛋白、COCA1蛋白、KRT16蛋白和H4蛋白；所述用于检测特异蛋白质组合中各个蛋白质的物质为用于检测血清样本中特异蛋白质组合中各个蛋白质的物质。

CN103173449A公开了与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物及其应用，筛选得到的miR-382可辅助判断食管癌患者的预后或死亡风险，推动了食管癌诊治方面的发展。

CN109022584A公开了一种食管癌的分子标志物，为FXR1基因或/和FXR1基因的表达产物。FXR1基因在食管癌组织中显著高表达，能够作为食管癌的分子标志物用于食管癌诊断。高表达的FXR1基因与食管癌病人的不良预后以及食管癌的远处转移密切相关，提示FXR1基因能够作为食管癌的预后标志物，为食管癌的远处转移诊断、预后评估、治疗效果监测提供有效信息。该发明还公开了FXR1基因的表达抑制剂，包括siRNA或/和shRNA，在用于FXR1基因的表达抑制时，干扰效果好，具有临床基因治疗的应用潜力。另外，该发明也公开了稳定敲减FXR1基因的细胞株，是FXR1基因稳定低表达的食管癌细胞，有利于实现对FXR1基因功能的进一步研究。

目前关于食管癌相关肿瘤标志物的报道还很有限，具有针对性的早诊或个性化的治疗策略也很有限。因此，能够开发出一种新的食管癌诊疗的分子标志物是很有临床意义的。

发明内容

针对现有发明的不足，本发明的目的在于提供一种食管癌分子标志物及其应用，其作为食管癌诊断的标志性物质，能够明确清楚地表征食管癌的发生。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种食管癌分子标志物，所述食管癌分子标志物包括miR-3914或/和miR-8082。

miR-3914：NCBI号：NC_000007.14，基因ID：100500836，序列是：SEQ ID NO.1:tggacttcag atttaacttc tcattttctg gttccttcta atgagtatgc ttaacttggt agaaggaaccagaaaatgag aagttgagta ggaactcta；

miR-8082：NCBI号：NC_000004.12，基因ID：102465878，序列是：SEQ ID NO.2:gcctgtgtga tgatggagct gggaatactc tggggagaga gtcctctttt cagctgtatt ttgcttccttcccacacaga c。

目前有关miR-3914和miR-8082的报道甚少。其中miR-8082只有一篇与亨廷顿氏病相关的研究，即：Eric R.等研究发现，与正常对照组比较，miR-8082在前期亨廷顿氏病携带者中的表达显著增加。而这两个miRNAs在肿瘤研究领域中均未见任何报道，故有望成为新型的肿瘤标志物。

所述食管癌分子标志物包括单独的miR-3914、单独的miR-8082，以及miR-3914和miR-8082的组合三种情况。

优选地，所述食管癌为食管鳞癌。

在本发明中，与正常食管上皮细胞相比，所述食管癌分子标志物在食管癌细胞中的表达量降低。

优选地，所述食管癌分子标志物对肿瘤病变相关蛋白p53蛋白、c-Myc蛋白和Bcl-2蛋白进行调控。

优选地，所述调控的方式为：使p53蛋白的表达量上调、使c-Myc蛋白的表达量以及Bcl-2蛋白的表达量下调。

优选地，所述使p53蛋白的表达量上调是指：用miR-8082和miR-3914的mimic转染食管癌细胞KYSE180，可分别使p53蛋白的表达上调1.287和1.259倍。

所述使c-Myc蛋白的表达量下调是指：用miR-8082和miR-3914的mimic转染食管癌细胞KYSE180，可分别使c-Myc蛋白的表达下调至0.823和0.603倍。

所述使Bcl-2蛋白的表达量下调是指：用miR-8082和miR-3914的mimic转染到食管癌细胞KYSE180，可分别使Bcl-2蛋白的表达下调0.671和0.7425倍。

第二方面，本发明提供一种食管癌分子标志物检测试剂盒，所述试剂盒中包括检测miR-3914或/和miR-8082的表达水平的试剂。

优选地，所述试剂盒中包括针对miR-3914或/和miR-8082的引物或探针。

所述试剂盒可以采用定量PCR方法检测miR-3914或/和miR-8082的表达水平。

上述试剂盒包含miRNA特异性5’端引物，miR-3914 5’端引物序列：SEQ ID NO.3:AAGGAACCAGAAAATGAGAAGT；miR-8082 5’端引物序列：SEQ ID NO.4:TGATGGAGCTGGGAATACTCTG；U6上游引物序列：SEQ ID NO.5:5’-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC；U6下游引物序列:SEQ ID NO.6:5’-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3’；还包括Takara公司miRNA检测3’端特异性通用引物；所用试剂盒为实时荧光定量PCR检测试剂盒，适用于SYBRGreen，例如可配合Takara RR82WR TB Green^TM Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)，ROXplus进行miRNA定量检测。

本发明所述试剂盒可以用于食管癌辅助诊断，以及疗效预测、评估或预后。

第三方面，本发明提供一种如上所述的食管癌分子标志物在制备以该标志物为靶点的药物中的应用。

本发明所述食管癌分子标志物在食管癌中低表达，其可以作为一种药物靶点为食管癌的治疗提供策略，具有深远的临床意义和应用前景。

第四方面，本发明提供一种抑制食管癌细胞增殖的药物，所述药物包括miR-3914或/和miR-8082的激动剂。

优选地，所述miR-3914或/和miR-8082的激动剂能够促进miR-3914或/和miR-8082的表达或激活miR-3914或/和miR-8082的功能。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种新的食管癌分子标志物，所述食管癌分子标志物包括miR-3914或/和miR-8082，其可作为食管癌肿瘤诊断的新型分子标志物，为食管癌的辅助诊断提供了强有力的分子生物学工具，并且可以作为食管癌的治疗靶点，具有重要的临床意义。

附图说明

图1是miR-3914在癌旁正常组织与食管鳞癌组织中的表达量对比图；

图2是miR-8082在癌旁正常组织与食管鳞癌组织中的表达量对比图；

图3是miR-3914和miR-8082在癌旁正常细胞和食管鳞癌细胞中的表达量对比图；

图4是未转染细胞、miR-8082和miR-3914转染细胞转染细胞中p53蛋白、c-Myc蛋白和Bcl-2蛋白的免疫印迹图；

图5是未转染细胞、miR-8082转染细胞和miR-3914转染细胞中p53蛋白、c-Myc蛋白和Bcl-2蛋白的表达量对比图；

图6是miR-3914和miR-8082的基因调控网络图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

本实施例用以鉴定miR-3914或/和miR-8082可以作为食管癌分子标志物，实验所用40对食管鳞癌组织和癌旁正常组织标本采集自汕头大学医学院附属肿瘤医院，实验所用正常细胞系Het-1A和食管鳞癌细胞系KYSE180、KYSE150来源于ATCC细胞库。

具体实验方法如下：

检测miR-3914和miR-8082在癌旁正常组织样本和食管鳞癌组织样本中的表达水平：

(1)组织标本获取：新鲜组织手术离体后迅置于RNA wait保护液中用于提取RNA，-80℃长期保存待用。

(2)组织RNA提取：预冷研钵，加入适量液氮，切取30-50mg的新鲜组织块迅速转移到加有液氮的研钵中，快速将组织块研磨至粉末状，迅速转移到1.5mL离心管中，使用AllPrep DNA/RNA Mini Kit提取总RNA，提取过程参照试剂盒说明书。

(3)反转录和定量检测：使用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit进行逆转录；针对miR-3914和miR-8082设计特异性PCR引物如下表所示，使用

Premix ExTaq^TM II Kit进行qRT-PCR分析；按照试剂盒说明书进行操作，以U6为内参计算miRNA相对表达量，检测miR-3914和miR-8082在癌旁正常组织样本和食管鳞癌组织样本中的表达水平。

(4)采用两组间比较的Student t-test检验(阈值设定p<0.05则认为具有统计学差异)计算miR-3914和miR-8082在癌旁正常组织和食管鳞癌组织中的表达水平。

实验结果如图1和图2所示(图1为miR-3914在癌旁正常组织与食管鳞癌组织中的表达量对比图，图2为miR-8082在癌旁正常组织与食管鳞癌组织中的表达量对比图)，与癌旁正常组织相比，miR-3914和miR-8082在食管鳞癌组织中的表达均显著下调。

检测miR-3914和miR-8082在癌旁正常细胞样本和食管鳞癌细胞样本中的表达水平：

(1)将2×10⁵个KYSE180细胞接种于6孔板中，使用包含10％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素的RPMI-1640培养基，在37℃，5％(v/v)CO₂的细胞培养箱中培养正常细胞系Het-1A和食管鳞癌细胞系KYSE180、KYSE150，待细胞铺满大于90％采用Trizol法提取细胞总RNA。

(2)使用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit进行逆转录；设计特异性PCR引物同上，使用

Premix Ex Taq^TM II Kit进行qRT-PCR分析；按照试剂盒说明书进行操作，以U6为内参计算miRNA相对表达量，检测miR-3914和miR-8082在正常食管上皮细胞样本和食管鳞癌细胞样本中的表达水平。

(3)采用多组间比较的One-way ANOVA检验(阈值设定p<0.05则认为具有统计学差异)计算miR-3914和miR-8082在癌旁正常细胞和食管鳞癌细胞中的表达水平。

实验结果如图3所示，与癌旁正常细胞Het-1A相比，miR-3914和miR-8082在食管鳞癌细胞KYSE180或KYSE150中的表达均显著下调。

实施例2

本实施例用以鉴定miR-3914和/或miR-8082与肿瘤发病相关蛋白的调控关系，具体实验方法如下：

(1)将2×10⁵个KYSE180细胞接种于6孔板中，待细胞铺满约70-90％时，按照lipofectamine2000说明书利用miR-3914和miR-8082的mimic对KYSE180细胞进行转染，于48h后提取细胞的总蛋白(miR-3914mimic序列：SEQ ID NO.7:5’-AAGGAACCAGAAAAUGAGAAGU-3’；miR-8082mimic序列：SEQ ID NO.8:5’-UGAUGGAGCUGGGAAUACUCUG-3’)。

(2)转染后的细胞总蛋白置于10％(v/v)SDS-PAGE胶进行电泳，转膜至硝酸纤维素膜上，用5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)室温封闭1.5h，孵育一抗(c-Myc，p53，Bcl-2，GAPDH，以上抗体均为兔源单克隆抗体)4℃过夜。用含1‰(v/v)吐温的Tris-Hcl缓冲溶液洗膜，二抗(辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG)室温封闭1h，再使用ECL化学发光底物使印迹条带可视化，并采用Tanon化学发光检测系统进行成像分析，如图4所示(图中1、2、3分别代表未转染同株细胞组、miR-8082mimic转染细胞组和miR-3914mimic转染细胞组)，与未转染同株细胞比较，miR-8082mimic和miR-3914mimic转染后细胞p53蛋白的表达量增加，同时c-Myc和Bcl-2蛋白的表达量降低。

(3)定量分析：采用Tanon化学发光检测系统定量分析软件进行定量分析，以正常食管上皮细胞表达量为参照1.000，对miR-3914mimic和miR-8082mimic转染细胞组对p53，c-Myc和Bcl-2蛋白的表达进行相对定量。实验结果如图5所示(图中1、2、3分别代表未转染同株细胞组、miR-8082mimic转染细胞组和miR-3914mimic转染细胞组)，与未转染同株细胞比较，miR-8082和miR-3914的mimic处理组可分别使p53蛋白的表达上调1.287和1.259倍；使c-Myc蛋白的表达下调至0.823和0.603倍；使Bcl-2蛋白的表达下调0.671和0.7425倍。

实施例3

本实施例对miR-3914或/和miR-8082的下游靶基因进行预测并对其生物学功能进行分析，具体实验方法如下：利用TargetScan和RNA22数据库，预测miR-3914和miR-8082的差异表达靶基因，再利用DAVID 6.8(http://david.ncifcrf.gov)对差异表达靶基因进行基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析和Kyoto encyclopedia of genes andgenomes(KEGG)信号通路富集分析，再利用Cytoscape软件建立调控网络图。

实验结果如下：

(1)通过对TargetScan和RNA22数据库的交集分析，发现miR-3914有434个下游靶基因，miR-8082有1740个下游靶基因。

(2)miR-3914的差异表达靶基因GO分析结果如表1所示：miRNA-3914的下游靶基因主要参与组氨酸甲基化，调节神经细胞凋亡过程，骨骼系统发展，RNA聚合酶II启动子的转录负调节，调节突触传递等生物过程；具有染色质结合转录激活因子活性，RNA聚合酶II核心启动子近端区序列特异性结合，RNA聚合酶II核心启动子近端区序列特异性DNA结合，氧化还原酶活性，ADP-核糖基化因子结合等分子功能。

miR-8080的差异表达靶基因GO分析结果如表2所示：miRNA-8082下游靶基因参与的生物过程主要有RNA聚合酶II启动子转录的正调节，蛋白质复合物组装，调节I-κB激酶/NF-κB信号传导，细胞增殖的负调节，细胞凋亡过程，RNA转录后的基因沉默等；分子功能主要包括蛋白结合序列特异性DNA结合，受体信号蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性，转录共激活因子活性，GTP酶激活剂活性，配体依赖性核受体转录共激活因子活性等。

miR-3914和miR-8082的差异表达靶基因GO分析结果显示，两者均能与DNA特异性结合，均参与RNA聚合酶II启动子转录和细胞凋亡等过程。

(3)miR-3914的差异表达靶基因KEGG通路分析结果如表3所示：miR-3914靶基因富集通路主要有癌症相关通路、泛醌和其他萜醌生物合成、肾细胞癌、粘着斑和阿米巴病5条通路；miR-8082的差异表达靶基因KEGG通路分析结果如表4所示：miR-8082靶基因富集通路主要有神经营养因子信号通路、胰腺癌、破骨细胞分化、甲状腺激素信号通路、ErbB信号通路、黑色素瘤、癌症中的蛋白聚糖、癌症相关通路等通路。综上，miR-3914和miR-8082的下游靶基因均呈与癌症相关通路相关(p值<0.05)。

(4)miR-3914和miR-8082在癌症相关通路调控的基因数分别为17个和52个，建立基因调控网络图，如图6所示，且miR-3914和miR-8082可共同调控LAMC2基因、CCDC6基因和PDGFB基因。

表1

表2

表3

表4

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种食管癌分子标志物及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳大学，深圳华因康基因科技有限公司

<120> 一种食管癌分子标志物及其应用

<130> 2019

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工合成序列

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tggacttcag atttaacttc tcattttctg gttccttcta atgagtatgc ttaacttggt 60

agaaggaacc agaaaatgag aagttgagta ggaactcta 99

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<212> DNA

<213> 人工合成序列

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gcctgtgtga tgatggagct gggaatactc tggggagaga gtcctctttt cagctgtatt 60

ttgcttcctt cccacacaga c 81

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<211> 22

<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 5

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<211> 22

<212> DNA

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<211> 22

<212> RNA

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<210> 8

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工合成序列

<400> 8

ugauggagcu gggaauacuc ug 22

Claims

1.一种食管癌分子标志物，其特征在于，所述食管癌分子标志物包括miR-3914或/和miR-8082。

2.如权利要求1所述的食管癌分子标志物，其特征在于，所述食管癌为食管鳞癌。

3.如权利要求1或2所述的食管癌分子标志物，其特征在于，与正常食管上皮组织或细胞相比，所述食管癌分子标志物在食管癌组织或细胞中的表达量降低。

4.如权利要求1-3中任一项所述的食管癌分子标志物，其特征在于，所述食管癌分子标志物对肿瘤病变相关蛋白p53蛋白、c-Myc蛋白和Bcl-2蛋白进行调控。

5.如权利要求4所述的食管癌分子标志物，其特征在于，所述调控的方式为：使p53蛋白的表达量上调、使c-Myc蛋白的表达量以及Bcl-2蛋白的表达量下调。

6.一种食管癌分子标志物检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括检测miR-3914或/和miR-8082的表达水平的试剂。

7.如权利要求6所述的食管癌分子标志物检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括针对miR-3914或/和miR-8082的引物或探针。

8.如权利要求1-5中任一项所述的食管癌分子标志物在制备以该标志物为靶点的药物中的应用。

9.一种抑制食管癌细胞增殖的药物，其特征在于，所述药物包括miR-3914或/和miR-8082的激动剂。

10.如权利要求9所述的抑制食管癌细胞增殖的药物，其特征在于，所述miR-3914或/和miR-8082的激动剂能够促进miR-3914或/和miR-8082的表达或激活miR-3914或/和miR-8082的功能。