CN111733129A - 一种聚肌胞诱导的高效dc-cik细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫技术领域，具体涉及利用聚肌苷酸和聚胞苷酸的共聚物‑聚肌胞(Poly I:C)，聚肌胞是一种是动物体内3型Toll样受体的配体,激活TLR‑3后可介导机体一系列的免疫反应,对机体的特异性免疫和非特异性免疫均有很好的促进作用。本发明用聚肌胞诱导的DC‑CIK具有较对照组更高增殖、高分化(尤其CD3+CD4‑CD8+，CTL)、高杀瘤活性。利用聚肌胞诱导的自体高效DC‑CIK及其它免疫细胞，应用于临床肿瘤患者的治疗。以期恢复或提高肿瘤患者免疫功能，提高机体自身的免疫系统对肿瘤细胞进行杀灭和抑制其增殖。降低肿瘤细胞负荷，清除微小的残留病灶或明显抑制了残留肿瘤/癌症细胞增殖的方式，消除复发、转移的因素，增大治愈的可能性，延长生存时间，提高生活质量。从而达到治疗肿瘤/癌症的目的。
Description
技术领域
本发明涉及免疫技术领域，具体涉及利用聚肌苷酸和聚胞苷酸的共聚物-聚肌胞(polyinosinic:polycytidylic acid copolymer,Poly I:C)，聚肌胞是一种是动物体内3型 Toll样受体的配体,激活TLR-3后可介导机体一系列的免疫反应,如诱导干扰素、白介素、肿瘤坏死因子等细胞因子的分泌,促进单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞及树突状细胞的增殖与成熟等,对机体的特异性免疫和非特异性免疫均有很好的促进作用。
使用聚肌胞加入诱导培养基中协同诱导DC-CIK(巨噬细胞-细胞因子活化的肿瘤杀伤细胞)细胞的增殖与分化，使DC-CIK的杀瘤活性得到大幅提升。以期获得一种聚肌胞诱导的自体高效DC-CIK细胞，应用于临床肿瘤患者的治疗。达到更好的杀灭残余的肿瘤细胞，减少肿瘤复发、转移的因素，增大治愈的可能性，延长患者的生存时间，提高患者生存质量。
背景技术
自体免疫细胞(DC-CIK)应用于肿瘤生物治疗是一种新兴的、安全的及具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种治疗肿瘤的新型治疗方法。该方法是运用生物学技术和生物制剂，对从肿瘤患者外周血采集、分离的免疫细胞-单个核细胞(包括树突状细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞)进行体外诱导培养和扩增后，回输到病人体内以激发和增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。肿瘤生物治疗技术是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗的方法。
聚肌胞是聚肌苷酸和聚胞苷酸的共聚物，是一种高效的干扰素(IFN)诱生剂,具有广谱抗病毒、刺激吞噬、调整机体免疫、抗肿瘤、抗某些细菌和原虫感染等功能。目前在人类医学上用于治疗肝炎、疱疹病毒感染及一些肿瘤性疾病等方面,显示了其确实的临床疗效。
同时，聚肌胞是动物细胞3型Toll样受体(TLR-3)的配体,聚肌胞激活TLR-3后可介导机体一系列的免疫反应,如诱导干扰素、白介素、肿瘤坏死因子等细胞因子的分泌,促进免疫细胞(包括：单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞及树突状细胞)的增殖与成熟等,促进体内抗体的生成。聚肌胞对机体的特异性免疫和非特异性免疫均有很好的促进作用。
聚肌胞的免疫调节作用：免疫是机体的一种生理性保护功能,是机体识别和消灭外来侵入的任何异物(病毒、细菌等),处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞以及识别和处理体内突变细胞和病毒感染细胞的能力。现代免疫学认为,免疫力是人体识别和排除“异己”的生理反应。机体的免疫能力可分为特异性免疫与非特异性免疫两种,两者是密切联系的。非特异性免疫是生物在种系发展过程中不断与病原微生物斗争中形成的,并可遗传给后代的一种免疫功能，它是与人体的组织特性和生理机能密切相关的。特异性免疫是机体在后天受内外环境因素的刺激而获得的免疫功能。它能识别再次接触的相同抗原,并发生相应的免疫学反应, 它需要在高度分化的组织和细胞的参与下才能完成。
(1)聚肌胞增强免疫细胞的活性；
(2)聚肌胞促进多种细胞因子的分泌；
(3)聚肌胞对Mx蛋白的诱生作用；
(4)聚肌胞促进体内抗体的生成。
聚肌胞的抗肿瘤作用研究已经证明,聚肌胞不仅可以抑制致瘤病毒和致瘤病毒如多瘤病毒、单纯泡疹病毒等引发的肿瘤。对移植肿瘤,如小鼠的多种网状细胞肉瘤、腹水瘤、S91黑色素瘤、乳腺瘤、纤维肉瘤等,以及地鼠的鼠肉瘤,都不同程度的抑制。
肿瘤生物治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。肿瘤生物治疗是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。
免疫系统是人体的防御体系，一方面发挥着清除细菌、病毒、外来异物的功能，另一方面消除体内衰老细胞以及发生突变的细胞(部份突变细胞会变成肿瘤细胞)。机体免疫系统和肿瘤细胞相互作用的结果决定了肿瘤的最终演变。对于健康的人来说，其免疫系统的强大足以及时清除突变的癌细胞。但对于肿瘤病人来说，普遍存在免疫系统低下，不能有效地识别、杀灭肿瘤/癌症细胞；另一方面，肿瘤/癌症细胞大量增殖，会进一步抑患者的免疫功能，而且，肿瘤/癌症细胞有多种机制来逃脱免疫细胞的识别与杀伤，肿瘤/癌症的免疫治疗就是借助分子生物学技术和细胞工程技术，提高肿瘤/癌症的免疫原性，给机体补充足够数量的功能正常的免疫细胞和相关分子，激发和增强机体抗瘤免疫应答，提高肿瘤/癌症对机体抗肿瘤/ 癌症免疫效应的敏感性，在体内、外诱导肿瘤/癌症特异性和非特异性效应细胞和分子，达到最终清除肿瘤/癌症的目的。
肿瘤/癌症生物治疗，其作用不是杀死全部肿瘤/癌症细胞，而是由于当肿瘤/癌症细胞负荷明显降低时，机体的免疫功能恢复后，通过清除微小的残留病灶或明显抑制了残留肿瘤/ 癌症细胞增殖的方式来达到治疗肿瘤/癌症的目的。肿瘤/癌症免疫治疗正是通过人为的干预，来调动机体自身的免疫系统对癌细胞进行杀灭和抑制其增殖。
实验及临床均提示机体的免疫系统具有清除肿瘤/癌症的作用，在原发性肿瘤/癌症手术切除或经氩氟刀等微创手术消融掉局部肿瘤/癌症后，用免疫疗法能杀灭剩余的肿瘤/癌症细胞，消除复发、转移的因素，增大治愈的可能性，延长生存时间，提高生活质量。
截止2013年，肿瘤/癌症生物治疗已被视为继手术、放疗、化疗之后的第四种治疗方法。生物疗法包括细胞因子治疗、免疫细胞治疗、基因治疗、分子靶向治疗和抗体治疗等。
生物细胞免疫疗法是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。生物细胞免疫疗法治疗肿瘤，具有以下优势：
1.效果确切，有效率高。对有些肿瘤/癌症，有效率高达70％。
2.无放、化疗毒副作用，病人不痛苦，耐受性好，杀瘤特异性强。
3.能够激发全身性的抗癌效应，对多发病灶或转移的恶性肿瘤同样有效。
4.可以帮助机体快速恢复被放、化疗破坏的抗癌免疫系统，提高远期抗癌能力。
5.对肿瘤/癌症术后防复发效果显著，远期抗癌效果良好。
6.可单独使用也可与其它治疗方法联合使用。单次有效，多次使用，效果更佳。
自体DC-CIK细胞是众多免疫细胞疗法的一种。DC-CIK细胞能以不同的机制识别肿瘤细胞，通过直接的细胞质颗粒穿透封闭的肿瘤细胞膜，实现对肿瘤细胞的裂解；通过诱导肿瘤细胞凋亡杀伤肿瘤细胞；DC-CIK细胞能分泌IL-2、IL-6、IFN-γ等多种抗肿瘤的细胞因子； DC-CIK细胞回输后可激活机体自身的免疫系统，提高机体的免疫功能。
该疗法既可单独使用，也可以作为手术、化疗和放疗后的有力辅助手段，效果显著。结合手术切除、介入、射频、氩氦刀等治疗，可清除不能用手术切除的极微小瘤灶或是体内散存的瘤细胞，在延缓或阻止肿瘤的转移或复发方面有重要作用；对于部分暂时不适宜做手术、介入或其它治疗的肿瘤患者，也可以先进行DC-CIK细胞治疗，提高身体机能状况，改善生活质量，争取其它治疗机会。
由于生物免疫治疗技术是利用人体自身的免疫细胞，而不是传统的化学药品来杀伤肿瘤细胞的，因此该技术安全无毒副作用，适用于肿瘤/癌症各阶段的治疗，自DC-CIK在临床开展以来已为无数肿瘤/癌症患者解除了病痛的折磨，为肿瘤患者带来健康的福音！
肿瘤生物治疗是优于手术、放疗和化疗的最新肿瘤治疗技术，是通过生物技术在高标准的实验室内培养出可杀伤肿瘤的自体免疫细胞，回输体内，直接杀伤癌细胞的治疗方法。与传统的治疗方法不同，肿瘤生物治疗在不损伤和机体免疫系统和功能的前提下，直接识别、消灭存在于人体内血液、淋巴中的癌细胞，恢复和增强机体自然抗癌免疫系统和功能。肿瘤生物治疗具有不伤身体、无痛、无需住院等优点，能提高患者自身的免疫与生活质量，并适用于所有的肿瘤疾病，该生物治疗技术已正式运用于临床。
DC即树突状细胞，发现于1973年。它是机体中功能最强的专职抗原递呈细胞，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原。DC细胞与肿瘤的发生、发展有着密切关系，是激活机体免疫系统、激发抵御肿瘤/癌症侵袭最有效的途径之一。通过大量体外活化培养负载肿瘤抗原的 DC细胞，在细胞数量达到规模化后回输给病人，可诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应。临床验证，大部分实体瘤内浸润的DC数量多则患者预后好。
在肿瘤免疫中，DC不能直接杀伤肿瘤细胞，但能通过识别肿瘤细胞特异性抗原，将其信号呈递给具杀伤效应的T细胞来达到监测、杀灭肿瘤的功能，因此常与肿瘤杀伤细胞CIK细胞联合使用。
DC是迄今为止发现的功能最为强大的抗原提呈细胞(即把肿瘤的相关信息提供给人体内正常存在的具有杀伤肿瘤活性的细胞)，在人体的免疫系统里扮演近似“雷达”的角色；CIK 是外周血单个核细胞，在体外经多种细胞因子共同诱导培养后，产生的一类以CD3+CD56+T 细胞为主要效应细胞的异质细胞群，因此CIK同时具有T细胞和NK细胞这两种人体内主要具有抗肿瘤活性细胞的效应，其在体外抗肿瘤活性较以往生物治疗中培养的LAK、CTL、TIL活性强100～1000倍。医学家们对其更形象地描述是：如果T细胞在人体的免疫系统充当“炮弹”的角色，那么DC-CIK则相当于威力更为强大的“导弹”。
发明内容
聚肌胞是哺乳动物细胞3型Toll样受体(TLR-3)的配体,聚肌胞具有激活TLR-3后可介导机体一系列的免疫反应,如诱导干扰素、白介素、肿瘤坏死因子等细胞因子的分泌,促进免疫细胞(包括：单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞及树突状细胞)的增殖与成熟等,促进体内抗体的生成。对机体的特异性免疫和非特异性免疫均有很好的促进作用。
因此，选择聚肌胞作为DC-CIK协同诱导剂，高效诱导自体单个核细胞的增殖、分化、成熟，回输至病人体内，用于肿瘤患者的治疗。以期恢复或提高肿瘤患者免疫功能，提高机体自身的免疫系统对肿瘤细胞进行杀灭和抑制其增殖。降低肿瘤细胞负荷，清除微小的残留病灶或明显抑制了残留肿瘤/癌症细胞增殖的方式，消除复发、转移的因素，增大治愈的可能性，延长生存时间，提高生活质量。从而达到治疗肿瘤/癌症的目的。
首先选择采集正常健康自愿献血者外周血，经常规分离单个核细胞。用不同浓度的聚肌胞协同诱导DC-CIK细胞，经对细胞的增殖数量多少、流式细胞仪检测其CD标志物及对肿瘤细胞的杀伤活性，确立最适有效浓度。
附图说明
图1是据检测的OD450值，用Graphpad Prism5软件，以聚肌胞浓度为横坐标，对应的OD值为纵坐标制作细胞的增殖曲线；
图2是根据计数结果，用Graphpad Prism5软件，以细胞培养天数为横坐标，以细胞数目为纵坐标，制作的柱状图；
图3是选择流式CD3+CD4-CD8+细胞，以CD4为横坐标，CD8为纵坐标制作的分区图；
图4是各组杀瘤活性百分率，用Graphpad Prism5软件制作的杀瘤活性柱状图。
具体实施方式
实施例一、聚肌胞最适浓度的选择
材料：
1.聚肌胞(产地：上海源叶生物科技有限公司；Cas：24939-03-5)
2.Hyclone RPMI 1640
3.健康自愿者外周抗凝血
4.条件培养基：含IL-2 100000IU/ml、抗人CD3人源化嵌合抗体1000μg/ml、IL-1α
10000ng/ml、GMCSF10000ng/ml、γ干扰素10000ng/ml。
5.CCK8检测试剂盒(北仁化学科技(北京)有限公司，型号：CK04)
6.其它：板式酶标仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司，型号：RT-6100)、二氧化碳孵箱 (Thermo SCIENTIFIC，型号：3111)、洁净工作台(Thermo SCIENTIFIC，型号：1379)等。
准备：
1.DC-CIK培养基的制作：分别取“方法步骤2”的含血浆培养基，按DC-CIK条件培养基：基础培养基＝1:100比例加入500μl DC-CIK条件培养基，即成。
方法：
1.无菌采集健康自愿者外周血5ml，250IU肝素抗凝，并轻轻充分混匀。转移至15ml离心管，2000rpm离心沉淀10分钟；
2.收集上层血浆约2.5ml加入50mlRPMI-1640中备用；
3.血球沉淀物，加生理盐水混悬至10ml；
4.将“步骤3”样品用吸管沿管壁缓慢地加到已预先加入3ml淋巴细胞分层液的15ml一次性无菌塑料离心管中，使加入的血液重叠于分层液上，形成明显的分界面(注意不要摇动)；
5.置水平离心机2000rpm离心20min，小心取出；
6.用一次性无菌塑料巴氏吸管轻轻插入离心管中，吸出白色云雾状的单个核细胞层，转移至15ml离心管中，加生理盐水至15ml，充分混匀细胞，2000rpm离心5min，如此反复洗涤2次；苔盼蓝染色计数，再次2000rpm离心5min，弃上清；
7.根据细胞计数结果，用DC-CIK-Hyclone RPMI 1640培养基悬浮细胞沉淀，使细胞终浓度为2×105个/ml，备用；
8.分别在96孔细胞培养板中用DC-CIK-Hyclone RPMI 1640培养基4倍梯度稀释聚肌胞，使聚肌胞终浓度分别为1、0.25、0.0625……直至9.54E-07mg/ml。同时设无聚肌胞的空白对照。每一浓度2复孔、每孔100μl；
9.再分别加入“步骤7”的备用细胞，每孔100μl；
10.置饱和湿度、5％二氧化碳、37℃二氧化碳培养箱培养72小时；
11.培养结束前4hr，每孔分别加入CCK8检测试剂10μl；
12.培养结束，用板式酶标仪检测OD450值。
结果：
据检测的OD450值，用Graphpad Prism5软件，以聚肌胞浓度为横坐标，对应的OD值为纵坐标制作细胞的增殖曲线；图1是“聚肌胞最适浓度的选择”图。
结论：
据OD450值，用Graphpad Prism5软件制作细胞的增殖曲线(柱状图)。
聚肌胞终浓度分别为1、0.25、0.0625mg/ml有明显刺激DC-CIK细胞增殖的作用。
实施例2聚肌胞对DC-CIK增殖的影响
材料：
1.聚肌胞(上海源叶生物科技有限公司；Cas：24939-03-5)
2.Hyclone RPMI 1640
3.健康自愿者外周抗凝血
4.条件培养基：含IL-2 100000IU/ml、抗人CD3人源化嵌合抗体1000μg/ml、IL-1α10000ng/ml、GMCSF10000ng/ml、γ干扰素10000ng/ml。
5.板式酶标仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司，型号：RT-6100)、二氧化碳孵箱(Thermo SCIENTIFIC，型号：3111)、洁净工作台(Thermo SCIENTIFIC，型号：1379)等
准备：
1.对照组DC-CIK培养基的制作：分别取“方法步骤2”的含2％自体血浆的HycloneRPMI 1640 各250ml培养基，加入DC-CIK条件培养基2.5ml，即成Control DC-CIK-HycloneRPMI 1640培养基。
2.实验组DC-CIK培养基的制作：分别取“方法步骤2”的含2％自体血浆的HycloneRPMI 1640 各250ml培养基，加入DC-CIK条件培养基2.5ml。再加入聚肌胞，使终浓度为1mg/ml，即成DC-CIK-Hyclone RPMI 1640培养基。
方法：
1.无菌采集健康自愿者外周血20ml，1000IU肝素抗凝，并轻轻充分混匀。转移至50ml离心管，2000rpm离心沉淀10分钟；
2.收集上层血浆约10ml血浆加入500ml Hyclone RPMI-1640中，等分为2瓶，即每瓶250ml。备用；
3.血球沉淀物，加生理盐水混悬至20ml；
4.将“步骤3”样品用吸管沿管壁缓慢地加到2支已预先加入2.5ml淋巴细胞分层液的15ml 一次性无菌塑料离心管中，使加入的血液重叠于分层液上，形成明显的分界面(注意不要摇动)；
5.置水平离心机2000rpm离心20min，小心取出；
6.用一次性无菌塑料巴氏吸管轻轻插入离心管中，吸出白色云雾状的单个核细胞层，转移至50ml离心管中，加生理盐水至50ml，充分混匀细胞，2000rpm离心5min，如此反复洗涤2次；第三次用生理盐水悬浮细胞，苔盼蓝染色计数、并分为两份，使每份细胞均含2.5×106个单个核细胞，再次2000rpm离心5min，弃上清；
7.根据细胞计数结果，分别用Control DC-CIK-Hyclone RPMI 1640和DC-CIK-Hyclone RPMI 1640培养基5ml悬浮细胞沉淀；
8.分别转移至25cm2细胞培养瓶中，并作好标记；
9.置饱和湿度、5％二氧化碳、37℃二氧化碳培养箱培养0、72、120、168小时；
10.培养结束分别取样，苔盼蓝染色计数。
结果：
根据计数结果，用Graphpad Prism5软件，以细胞培养天数为横坐标，以细胞数目为纵坐标，制作柱状图；图2是“聚肌胞对DC-CIK增殖的影响”图。
结论：
根据以上结果，可以看出随着培养时间的增加，聚肌胞组和无聚肌胞组细胞数量均有所增加。两者第三天细胞数量无明显差异，但聚肌胞组细胞数量在第五天和第七天较无聚肌胞组有显著差异，聚肌胞组细胞数量明显高于无聚肌胞组。
实施例3聚肌胞诱导的高效DC-CIK表型鉴定
材料：
1.聚肌胞(上海源叶生物科技有限公司；Cas：24939-03-5)
2.Hyclone RPMI 1640
3.健康自愿者外周抗凝血
4.条件培养基：含IL-2 100000IU/ml、抗人CD3人源化嵌合抗体1000μg/ml、IL-1α10000ng/ml、GMCSF10000ng/ml、γ干扰素10000ng/ml。
5.流式标记抗体CD3:BV510，CD4:BUV496，CD8:BV786
6.其它：流式细胞仪(BD，型号：FACSymphony)、二氧化碳孵箱(ThermoSCIENTIFIC，型号：3111)、洁净工作台(Thermo SCIENTIFIC，型号：1379)等
准备：
1.对照组DC-CIK培养基的制作：取“方法步骤2”的含2％自体血浆的Hyclone RPMI1640 250ml培养基，加入DC-CIK条件培养基2.5ml即成DC-CIK条件培养基，即成ControlDC-CIK-Hyclone RPMI 1640培养基。
2.实验组DC-CIK培养基的制作：取“方法步骤2”的含2％自体血浆的Hyclone RPMI1640 250ml培养基，加入DC-CIK条件培养基2.5ml。再加入聚肌胞，使终浓度为1mg/ml，即成DC-CIK-Hyclone RPMI 1640培养基。
方法：
1.无菌采集健康自愿者外周血20ml，1000IU肝素抗凝，并轻轻充分混匀。转移至50ml离心管，2000rpm离心沉淀10min；
2.收集上层血浆约10ml,分别取12.5ml血浆加入500ml YQ-1640/RPMI-1640中，等分为2 瓶，即每瓶250ml。备用；
3.血球沉淀物，加生理盐水混悬至20ml；将“步骤3”样品用吸管沿管壁缓慢地加到2 支已预先加入3ml淋巴细胞分层液的15ml一次性无菌塑料离心管中，使加入的血液重叠于分层液上，形成明显的分界面(注意不要摇动)；
4.置水平离心机2000rpm离心20min，小心取出；
5.用一次性无菌塑料巴氏吸管轻轻插入离心管中，吸出白色云雾状的单个核细胞层，转移至50ml离心管中，加生理盐水至50ml，充分混匀细胞，2000rpm离心5min，如此反复洗涤2次；第三次用生理盐水悬浮细胞，苔盼蓝染色计数、并分为两份，使每份细胞均含2.5×106个单个核细胞，再次2000rpm离心5min，弃上清；
6.根据细胞计数结果，分别用Control DC-CIK-Hyclone RPMI 1640DC-CIK-Hyclone RPMI 1640培养基5ml悬浮细胞沉淀；
7.分别转移至25cm2细胞培养瓶中，并作好标记；
8.置饱和湿度、5％二氧化碳、37℃、二氧化碳培养箱培养0、72、120、168小时；
9.培养结束分别取样用CD3、CD4、CD8荧光抗体进行常规标记；
10.用流式细胞仪进行检测。
结果：
选择流式CD3+CD4-CD8+细胞，以CD4为横坐标，CD8为纵坐标制作分区图。图3是“聚肌胞诱导的高效DC-CIK表型鉴定”图。
结论：
随着细胞培养时间的增加，CD3+CD4-CD8+细胞数量均不同程度增加。聚肌胞组较无聚肌胞 CD3+CD4-CD8+细胞数量明显增加，具有显著差异。
实施例4聚肌胞诱导的高效DC-CIK杀瘤活性
材料：
1.聚肌胞：(上海源叶生物科技有限公司；Cas：24939-03-5)
2.Hyclone RPMI 1640
3.健康自愿者外周抗凝血
4.条件培养基：含IL-2 100000IU/ml、抗人CD3人源化嵌合抗体1000μg/ml、IL-1α10000ng/ml、GMCSF10000ng/ml、γ干扰素10000ng/ml。
5.人类髓性白血病细胞株K562
6.CCK8检测试剂盒(北仁化学科技(北京)有限公司，型号：CK04)
7.板式酶标仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司，型号：RT-6100)、二氧化碳孵箱(Thermo SCIENTIFIC，型号：3111)、洁净工作台(Thermo SCIENTIFIC，型号：1379)等。
准备：
1.对照组DC-CIK培养基的制作：取“方法步骤2”的含2％自体血浆的Hyclone RPMI1640 250ml培养基，加入DC-CIK条件培养基2.5ml即成Control DC-CIK-Hyclone RPMI1640 培养基。
2.实验组DC-CIK培养基的制作：取“方法步骤2”的含2％自体血浆的Hyclone RPMI1640 250ml培养基，加入DC-CIK条件培养基2.5ml。再加入聚肌胞，使终浓度为1mg/ml，即成DC-CIK-Hyclone RPMI 1640培养基。
3.靶细胞：取处于对数生长期的K562细胞，苔盼蓝染色计数并常规离心洗涤。然后用含 5％新生小牛血清的Hyclone RPMI 1640培养基调细胞浓度为4×104个/ml，备用。
方法：
1.无菌采集健康自愿者外周血20ml，1000IU肝素抗凝，并轻轻充分混匀。转移至50ml离心管，2000rpm离心沉淀10分钟；
2.收集上层血浆约10ml,加入500ml RPMI-1640中，等分为2瓶，即每瓶250ml。备用；
3.血球沉淀物，加生理盐水混悬至20ml；
4.将“步骤3”样品用吸管沿管壁缓慢地加到2支已预先加入2.5ml淋巴细胞分层液的15ml 一次性无菌塑料离心管中，使加入的血液重叠于分层液上，形成明显的分界面(注意不要摇动)；
5.置水平离心机2000rpm离心20min，小心取出；
6.用一次性无菌塑料巴氏吸管轻轻插入离心管中，吸出白色云雾状的单个核细胞层，转移至50ml离心管中，加生理盐水至50ml，充分混匀细胞，2000rpm离心5min，如此反复洗涤2次；第三次用生理盐水悬浮细胞，苔盼蓝染色计数、并分为两份，使每份细胞均含2.5×106个单个核细胞，再次2000rpm离心5min，弃上清；
7.根据细胞计数结果，分别用Control DC-CIK-Hyclone RPMI 1640和DC-CIK-Hyclone RPMI 1640培养基5ml悬浮细胞沉淀；
8.分别转移至25cm2细胞培养瓶中，并作好标记；
9.置饱和湿度、5％二氧化碳、37℃二氧化碳培养箱培养0、72、120、168小时；
10.培养结束前分别取样用生理盐水洗涤3次，苔盼蓝染色分别计数。分别各取5×106个细胞，均用Hyclone RPMI 1640悬浮细胞。2000rpm、离心沉淀5min。沉淀物再次用含5％新生小牛血清的Hyclone RPMI 1640培养基2.5ml重悬细胞,使终浓度为2×106个/ml；
11.取圆底一次性无菌的96孔细胞培养板，如下表1分别加样。即：Control DC-CIK-Hyclone RPMI 1640组细胞杀瘤活性检测加样为：实验组每孔加入浓度为2× 106个/ml的Control DC-CIK-Hyclone RPMI 1640组细胞100μl，同时加入浓度为4× 104个/ml的K562细胞100μl；效应对照组每孔加入浓度为2×106个/ml的Control DC-CIK-HycloneRPMI 1640组细胞100μl，同时加入含5％新生小牛血清的Hyclone RPMI 1640 100μl；靶细胞组则仅每孔加入浓度为4×104个/ml的K562细胞100μl和含5％新生小牛血清的HycloneRPMI 1640 100μl即可。
12.置饱和湿度、5％二氧化碳、37℃二氧化碳培养箱培养16小时；每孔加入CCK8，每孔 10μl。4小时后，用板式酶标仪测定OD450值。
表1 Hyclone 1640培养基加样表
备注：每组均作四复孔；单位：μl。
结果：
1、结果计算：杀瘤百分率＝[1-(实验组OD450-效应对照组OD450)/靶细胞对照组OD450]×100％；
2、将各组检测数据代入以上公式，即得各组的杀瘤活性；
3、将各组杀瘤活性百分率，用Graphpad Prism5软件制作杀瘤活性柱状图；图4是“聚肌胞诱导的高效DC-CIK杀瘤活性”图。
结论：
根据上述结果可以看出，随着细胞培养时间增加，两组细胞杀瘤活性均有不同程度增加，聚肌胞组较无聚肌胞组杀瘤活性增加更为显著，具有显著差异。
Claims (2)
1.聚肌胞高效诱导DC-CIK细胞的方法。
2.聚肌胞作为其它免疫细胞(如NK、CIK、DC、γδT等细胞)协同诱导剂，高效诱导自体单个核细胞的增殖、分化、成熟。
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