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CN111529714A - 一种全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途 - Google Patents

一种全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途 Download PDF

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CN111529714A CN202010537824.8A CN202010537824A CN111529714A CN 111529714 A CN111529714 A CN 111529714A CN 202010537824 A CN202010537824 A CN 202010537824A CN 111529714 A CN111529714 A CN 111529714A
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Abstract

本发明涉及药物领域，特别是涉及一种全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途。本发明提供一种全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物，包括药物分子基团和磷硫键取代的核酸适配体片段，所述药物分子基团选自丝裂霉素C基团，所述药物分子基团与磷硫键取代的核酸适配体片段之间通过连接基团连接。本发明所提供的全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物不仅具有核酸适配体所有的优点，通过对核酸适配体片段的磷酸骨架的硫代磷酸酯修饰，大大提高核酸适体‑丝裂霉素C偶联物抗酶切的能力，延长其血液循环半衰期，在稳定性提升的同时，保留了其原有的靶向性和特异性，具有良好的产业化前景。

Description

一种全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物及其制备方 法和用途
技术领域
本发明涉及药物领域，特别是涉及一种全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途。
背景技术
丝裂霉素(Mitomycin)为头状链霉菌的培养液中分离出的抗肿瘤抗生素，对多种实体瘤有效，能与DNA的双螺旋结构形成交联，破坏DNA的结构与功能，抑制增殖期DNA的复制，对增殖期中的细胞均有杀伤作用，同时也可作用、于静止期的细胞，从而抑制肿瘤细胞，临床适用于消化道癌，如胃癌、肠癌、肝癌及胰癌等。
核酸适体(Aptamer)是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段，能够特异性结合靶标分子。与常用的靶向分子抗体相比，核酸适体筛选周期短，易于合成和修饰，制备成本低，稳定性更强，靶标范围广，毒性和免疫原性低，组织穿透性强，在肿瘤诊疗中具有更广阔的应用前景。除了用作抗肿瘤药物以外，核酸适体更可以用作靶向分子，连接一些具有优良抗肿瘤性能，但不具有靶向性的小分子抗肿瘤药物，赋予其靶向能力，能特异性识别肿瘤细胞表面高表达的靶标蛋白，将药物运送到肿瘤部位，从而实现药物精准释放，提高抗肿瘤药效，降低对正常组织的毒副作用。
但在实际应用中，核酸适体存在着一系列棘手问题。其中最重要的是它的体内不稳定性。裸露的天然核酸在血液循环中容易被体内各种核酸酶识别酶切，从而在未到达靶向病变部位时就可能已被降解，导致其功效大大降低。为了解决这一问题，研究者们采取各种对核酸的修饰方法来保护其不被酶切。其中最常见的就是对核酸进行化学修饰，比如对核酸骨架的化学修饰，糖环的化学修饰以及对碱基的化学修饰。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物，包括药物分子基团和磷硫键取代的核酸适配体片段，所述药物分子基团选自丝裂霉素C基团，所述药物分子基团与磷硫键取代的核酸适配体片段之间通过连接基团连接。
在本发明一些实施方式中，所述药物分子基团的结构式如下所示：
Figure BDA0002537672590000021
在本发明一些实施方式中，所述磷硫键取代的核酸适配体片段具体为核酸适配体片段中的磷氧键被磷硫键取代。
在本发明一些实施方式中，所述核酸适配体片段的多核苷酸序列包括如SEQ IDNO.1所示的序列。
在本发明一些实施方式中，所述磷硫键取代的核酸适配体片段5’端与连接基团之间通过-S-S-键连接。
在本发明一些实施方式中，所述连接基团的化学结构式如下所示：
Figure BDA0002537672590000022
在本发明一些实施方式中，所述磷硫键取代的核酸适配体药物偶联物的结构式如下所示：
Figure BDA0002537672590000023
本发明另一方面提供上述的全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物的制备方法，包括：将药物分子与磷硫键取代的核酸片段连接，以提供所述的全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物。
在本发明一些实施方式中，所述制备方法具体包括：将药物分子修饰连接分子，将修饰有连接分子的药物分子与磷硫键取代的核酸片段连接，以提供所述的全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物。
本发明另一方面提供上述的全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物在制备药物中的用途。
附图说明
图1显示为本发明实施例1中丝裂霉素C核酸适体偶联物鉴定结果示意图。
图2显示为本发明实施例2中肿瘤细胞靶向摄取能力实验结果示意图。
图3显示为本发明实施例3中体外靶向毒性实验结果示意图。
图4显示为本发明实施例4中大鼠药物代谢动力学检测结果示意图。
图5显示为本发明实施例5中小鼠活体成像实验结果示意图。
图6显示为本发明中磷硫键取代的核酸适配体片段的化学结构示意图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。
本发明发明人经过大量实践研究后意外地发现，将核酸适配体的磷酸骨架进行硫代磷酸酯的修饰后，可以有效改善核酸适配体药物偶联物的体内半衰期，使其具有更好的药物稳定性，在此基础上完成了本发明。
本发明第一方面提供一种全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物，包括药物分子基团和磷硫键取代的核酸适配体片段，所述药物分子基团选自丝裂霉素C基团，所述药物分子基团与磷硫键取代的核酸适配体片段之间通过连接基团连接。所述磷硫键取代的核酸适配体片段具体指核酸适配体片段的分子结构中磷氧键至少部分或全部地被磷硫键替换，具体结构变化如图6所示，图中，左图为磷氧键未被取代的结构，右图为磷氧键被磷硫键替换后的结构。磷硫键取代的核酸适配体片段可以与丝裂霉素C偶联，这种修饰方法能大大提高核酸适体-丝裂霉素C偶联物抗酶切的能力，延长其血液循环半衰期，同时还能提高其对靶细胞的内吞能力，进一步提高偶联物在肿瘤治疗中的药效。
本发明所提供的核酸适配体药物偶联物，可以包括药物分子基团，所述药物分子基团具体可以为丝裂霉素C分子所形成的丝裂霉素C基团。在本发明一优选实施方式中，所述药物分子具体可以是化学结构式如下所示的化合物：
Figure BDA0002537672590000041
所述药物分子可以包括环乙胺，从而可以通过环乙胺基团与连接分子反应，以形成药物分子基团。在本发明一优选实施方式中，所述药物分子基团的化学结构式如下所示：
Figure BDA0002537672590000042
本发明所提供的核酸适配体药物偶联物中，可以包括磷硫键取代的核酸适配体片段。核酸适配体片段的具体序列的选择很大程度上决定了所述核酸适配体药物偶联物的靶向性，也很大程度上决定了核酸适配体药物偶联物整体上的稳定性，所述核酸适配体片段的多核苷酸序列可以包括如SEQ ID NO.1所示的序列：XQ-2d，5’-ACTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATACTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC-3’(SEQ ID NO.1)。所述核酸适配体片段通常靶向于其所对应的蛋白，例如，如上所示的核酸适配体片段可以靶向CD71蛋白，实现肿瘤细胞的特异性靶向，所述CD71蛋白通常在多种肿瘤细胞表面高度表达。如上所述，磷硫键取代的核酸适配体片段具体指核酸适配体片段的分子结构中磷氧键全部被磷硫键取代。所述磷硫键取代的核酸适配体片段通常可以由合适的核酸片段经过化学修饰后形成，合适的修饰方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以为对核酸片段的磷酸骨架进行硫代磷酸酯修饰，具体的制备方法可以参照M·E·杜格拉斯,B·J·梅洛.硫代磷酸寡核苷酸的制备方法:CN。所述核酸适配体片段通常还可以由5’端被-SH修饰的核酸片段形成，从而可以在核酸适配体片段5’端与连接基团之间形成-S-S-键连接。对核酸片段5’端进行-SH修饰的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以使用C6巯基亚磷酰胺单体对核酸片段进行修饰，以获得5’端被-SH修饰的核酸片段。在本发明一优选实施方式中，可以使用DNA固相合成的方法将C6巯基亚磷酰胺单体修饰在5’端，所述C6巯基亚磷酰胺单体的化学结构式如下所示：
Figure BDA0002537672590000051
核酸片段5’端糖环上的羟基与亚磷酰胺单体交联，反应方程式如下所示：
Figure BDA0002537672590000052
其中，五元杂环支链上的-CH2-连接的曲线部分表示核酸片段的剩余部分，实心圆表示固相支持物CPG。DNA磷酸骨架上进行了巯基修饰，制备获得的产物脱去保护基团，即可获得5’端被-SH修饰的核酸片段，进一步通过该-SH基团与连接基团连接，从而在核酸适配体片段5’端与连接基团之间通过-S-S-键连接，-S-S-键所连接的核酸适配体片段所对应的结构式可以如下所示：
Figure BDA0002537672590000053
本发明所提供的核酸适配体药物偶联物，可以包括连接基团，所述连接基团的结构式如下所示：
Figure BDA0002537672590000054
所述连接基团主要用于防止aptamer的靶向性受到影响。所述连接基团的两端可以分别与药物分子基团和磷硫键取代的核酸适配体片段连接。具体来说，所述磷硫键取代的核酸适配体片段5’端与连接基团之间通过-S-S-键连接，药物分子基团可以与连接基团之间通过-COO-键连接。所述连接基团通常可以是由合适的连接分子与药物分子和核酸片段所形成的基团，例如，所述连接分子可以包括
Figure BDA0002537672590000055
Figure BDA0002537672590000056
从而可以与药物分子和核酸片段连接以形成连接基团。在本发明一优选实施方式中，所述连接分子具体可以是化学结构式如下所示的化合物：
Figure BDA0002537672590000061
在本发明一更优选实施例中，全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物的化学结构式如下所示：
Figure BDA0002537672590000062
其中，-S-S-所连接的曲线部分为磷硫键取代的核酸适配体片段。
本发明第二方面提供本发明第一方面所提供的全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物的制备方法，包括：将药物分子与磷硫键取代的核酸片段连接，以提供所述的全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物，提供磷硫键取代的核酸片段的方法具体可以参照如上所给出的文献方法。
本发明所提供的制备方法中，所述制备方法具体可以包括：1)将药物分子修饰连接分子；2)将修饰有连接分子的药物分子与磷硫键取代的核酸片段反应，以提供所述的全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物。
本发明所提供的制备方法中，药物分子通常为丝裂霉素C分子，所述丝裂霉素C分子通常含有二甲亚胺基团(aziridine)。将含有二甲亚胺基团(aziridine)的药物分子修饰合适的连接分子，以提供修饰有连接分子的药物分子的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是：将药物分子和连接分子在催化剂存在的条件下反应，所使用的催化剂通常可以是有机碱，更具体可以是4-二甲基吡啶等。再例如，所述反应通常可以在合适的反应溶剂存在的条件下进行，具体可以是DMF等。再例如，反应通常可以在室温或加热的条件下进行，具体的反应温度可以是室温条件。
本发明所提供的制备方法中，将修饰有连接分子的药物分子与磷硫键取代的核酸片段反应，以提供所述的全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以将修饰有连接分子的药物分子与磷硫键取代的核酸片段充分混合。再例如，所述反应通常可以在合适的反应溶剂存在的条件下进行，具体可以是DMF等。再例如，反应通常可以在室温或加热的条件下进行，具体的反应温度可以是室温条件。
在本发明一优选实施方式中，所述制备方法中，将药物分子修饰连接分子，以提供修饰有连接分子的药物分子的反应方程式如下所示：
Figure BDA0002537672590000071
在本发明一优选实施方式中，所述制备方法中，将药物分子与磷硫键取代的核酸片段反应，以提供所述的全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物的反应方程式如下所示：
Figure BDA0002537672590000072
本发明第三方面提供本发明第一方面所提供的全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物在制备药物中的用途。本发明所提供的全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物对于靶标细胞(例如，可以是肿瘤细胞，具体可以是人胰腺癌细胞等，更具体可以是PL45细胞等)具有良好的特异性和靶向性，核酸适配体药物对于肿瘤细胞具有良好的靶向摄取能力和靶向杀伤能力、且在肿瘤部位具有更长的滞留时间，从而可以被作为肿瘤治疗药物。
本发明所提供的全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物不仅具有核酸适配体所有的优点，通过对核酸适配体片段的磷酸骨架的硫代磷酸酯修饰，大大提高核酸适体-丝裂霉素C偶联物抗酶切的能力，延长其血液循环半衰期，在稳定性提升的同时，保留了其原有的靶向性和特异性，具有良好的产业化前景。
下面通过实施例对本申请的发明予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。
实施例1
a.4-硝基苯基-4-(2-二巯基吡啶基)乙基碳酸酯的制备：
Figure BDA0002537672590000073
往50mL三口圆底烧瓶中加入88mg(0.4mmol)2,2’-二巯基吡啶，31.3mg(0.4mmol)2-巯基乙醇，加入10mL二氯甲烷。室温下搅拌2h，反应过程用TLC监测。减压旋蒸除去二氯甲烷，硅胶色谱柱反应纯化，得20mg 2-(2-二巯基吡啶基)乙醇，黄白色油状液体，产率53％。
往50mL三口圆底烧瓶中加入18.7mg(0.1mmol)2-(2二巯基吡啶基)乙醇，加入10mL无水二氯甲烷，加入对硝基苯基氯甲酸酯40mg(0.2mmol)，N,N'-二异丙基乙胺25.9mg(0.2mmol)，4-二甲氨基吡啶1.22mg(催化量)，室温搅拌过夜，反应过程用TLC监测。反应完成后，加入0.01M的盐酸溶液中和过量碱，然后用二氯甲烷/饱和食盐水萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥后减压旋蒸出去二氯甲烷，硅胶色谱柱分离得到19.35mg 4-硝基苯基-4-(2-二巯基吡啶)乙基碳酸酯，黄白色油状液体，产率55％。
b.丝裂霉素C-4-(2-吡啶二硫基)乙基碳酸酰胺的制备：
50mL三口圆底烧瓶中加入4-硝基苯基-4-(2-二巯基吡啶)乙基碳酸酯19.35mg(0.055mmol)，丝裂霉素C16.7mg(0.05mmol)，催化量的4-二甲氨基吡啶，再在氮气保护下加入N,N-二甲基甲酰胺10mL，室温搅拌过夜，反应进程用TLC监测。反应完成后用二氯甲烷/饱和盐水萃取，收集有机相，用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸除去二氯甲烷，硅胶色谱柱分离纯化得24.7mg丝裂霉素C-4-(2-二巯基吡啶)乙基碳酸酰胺，黑色固体，产率为90％。
Figure BDA0002537672590000081
c.丝裂霉素C核酸适体偶联物制备：
丝裂霉素C-4-(2-二巯基吡啶)乙基碳酸酰胺1mg溶于200μL N,N-二甲基甲酰胺中，加入200μL 30μM巯基修饰的硫代核酸适体溶液和巯基修饰的未硫代核酸适体溶液(SEQID NO.1)(购自上海生工生物工程股份有限公司)，37℃震荡24h。反应后反向制备柱纯化，所得到的目标产物用冷冻干燥方法得到产物，溶于超纯水后得144μL 25μM，产率为60％，质谱结果如图1所示，其中，图1A为未硫代核酸适体药物偶联物(ApDC)相对分子质量示意图，图1B为硫代核酸适体药物偶联物(S-ApDC)相对分子质量示意图示意图。
Figure BDA0002537672590000082
实施例2
硫代核酸适体-丝裂霉素C偶联物被肿瘤细胞靶向摄取能力：
进一步考察硫代核酸适体药物偶联物S-ApDC(实施例1制备获得)选择性进入肿瘤细胞的能力，同时加入对照序列药物偶联物CpDC(5’-ATTGCACTTACTATATTGCACTTACTATATTGCACTTACTAT-3’，SEQ ID NO.2，未硫代，制备方法参照实施例1，仅核酸序列不同)。PL45细胞或者MCF-7细胞消化后接种到12孔板中，密度为10万/皿，37℃培养箱培养24小时后用DPBS洗涤三次，然后分别加入200μL含有250nM Cy5标记的单链(XQ-2d或S-XQ-2d，分别为未硫代核酸适体和硫代核酸适体，均未偶联药物，SEQ ID NO.1)和S-ApDC/CpDC，37℃孵育2h后用DPBS洗涤3次后用胰酶消化1-2min，用流式(BD FACS Verse)检测，结果如图2所示，左图为PL45细胞实验结果示意图，右图为MCF-7细胞实验结果示意图。对于PL45细胞来说，S-ApDC和S-XQ-2d都表现出比XQ2d更强的内吞能力，而CpDC内吞能力最差。对于MCF-7细胞来说，所有的内吞能力都相对较差。
实施例3
体外靶向毒性实验：
细胞用DPBS清洗后加入200μL胰酶消化2-3min，吹打重悬到培养基，计数板计数后接种到96孔板，每个孔5000个细胞，培养24h后分别加入系列浓度梯度的含丝裂霉素C、S-ApDC和ApDC的新鲜培基，然后再培养72h。然后用CCK-8试剂盒检测细胞活力，结果如图3所示，左图为PL45细胞实验结果示意图，右图为MCF-7细胞实验结果示意图。对于靶向细胞PL45来说，ApDC的毒性强于单独药物丝裂霉素C，S-ApDC的毒性与丝裂霉素C相当。同时对于非靶向细胞MCF-7而言，ApDC毒性与单独药物相似，没有增强效果，而S-ApDC几乎不表现出毒性，从而进一步证明S-ApDC的安全性。
实施例4
大鼠药物代谢动力学检测：
为了验证硫代修饰是否能提高偶联物的血液循环半衰期，进一步进行了大鼠药物代谢动力学实验。130g左右的大鼠分别尾静脉注入Cy5标记的S-ApDC和ApDC 100μM 200μL，然后在0、0.5、1、2、4、8、12h时眼球取血1mL左右，用小动物成像仪检测血液荧光强度，与血液荧光强度-样品浓度标准曲线作对比，计算出不同时间点的样品荧光强度，通过拟合计算出血液循环半衰期，如图4所示。结果表明，硫代修饰后可大大提高偶联物在大鼠体内的半衰期。
实施例5
小鼠活体成像实验：
为了验证硫代修饰后偶联物的体内分布和肿瘤靶向能力，进一步进行了小鼠活体成像实验。首先进行小鼠植瘤，8周左右的BALB/c裸鼠分别皮下注入2*10^4个PL45细胞，成瘤两个星期后进行成像。分别尾静脉注入100μl 50μM Cy5标记的S-ApDC和ApDC，然后在0,0.5,1,2,4,8,12,24,48h时进行小动物成像。结果如图5所示，S-ApDC能更好的到达肿瘤部位，而且在体内的滞留时间更长。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物，包括药物分子基团和磷硫键取代的核酸适配体片段，所述药物分子基团选自丝裂霉素C基团，所述药物分子基团与磷硫键取代的核酸适配体片段之间通过连接基团连接。
2.如权利要求1所述的核酸适配体药物偶联物，其特征在于，所述药物分子基团的结构式如下所示：
Figure FDA0002537672580000011
3.如权利要求1所述的核酸适配体药物偶联物，其特征在于，所述磷硫键取代的核酸适配体片段具体为核酸适配体片段中的磷氧键被磷硫键取代。
4.如权利要求3所述的核酸适配体药物偶联物，其特征在于，所述核酸适配体片段的多核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列。
5.如权利要求3所述的核酸适配体药物偶联物，其特征在于，所述磷硫键取代的核酸适配体片段5’端与连接基团之间通过-S-S-键连接。
6.如权利要求1所述的核酸适配体药物偶联物，其特征在于，所述连接基团的化学结构式如下所示：
Figure FDA0002537672580000012
7.如权利要求1所述的核酸适配体药物偶联物，其特征在于，所述磷硫键取代的核酸适配体药物偶联物的结构式如下所示：
Figure FDA0002537672580000013
8.如权利要求1～7任一权利要求所述的全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物的制备方法，包括：将药物分子与磷硫键取代的核酸片段连接，以提供所述的全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括：将药物分子修饰连接分子，将修饰有连接分子的药物分子与磷硫键取代的核酸片段连接，以提供所述的全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物。
10.如权利要求1～7任一权利要求所述的全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物在制备药物中的用途。
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