CN111315406A - 包括皂苷的脂质体调配物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了含有皂苷和任选的脂多糖的脂质体调配物。本文还提供了包括所述脂质体调配物和抗原的药物组合物和疫苗组合物。所述药物组合物和疫苗组合物能够引发或增强免疫应答，例如用于疫苗用途或治疗用途。还提供了与制备所述脂质体调配物和使用所述脂质体调配物引发或增强免疫应答相关的组合物和方法。

Description

包括皂苷的脂质体调配物及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年9月8日提交的美国临时申请第62/556,257号的优先权权益，所述美国临时申请出于任何目的通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本公开总体上涉及药物组合物和疫苗组合物。更具体地，本文所描述的实施例涉及包括皂苷以及任选地脂多糖(LPS)的脂质体调配物及其制备方法。

背景技术

高等生物的免疫系统已经被表征为将外来因子(或“非自身”)因子与熟悉的或“自身”组分区分开，使得外来因子引发免疫应答，而“自身”组分被忽略或容忍。免疫应答传统上被表征为体液应答或细胞介导的应答，在所述体液应答中由被称为浆细胞的分化的B淋巴细胞产生对抗原具有特异性的抗体，在所述细胞介导的应答中各种类型的T淋巴细胞通过多种机制起作用以消除抗原。例如，能够识别特异性抗原的CD4+辅助性T细胞可以通过释放如细胞因子等可溶性介质而作出应答，从而募集免疫系统的另外的细胞以参与免疫应答。而且，还能够进行特异性抗原识别的CD8+细胞毒性T细胞可以通过结合并破坏或损坏荷抗原细胞或颗粒而作出应答。在免疫学领域中已知根据各种调配物提供某些疫苗组合物，通常是出于在宿主中诱导期望的免疫应答的目的。

通过向宿主施用疫苗引发特异性免疫应答的若干策略包含用加热灭活或活的减毒感染性病原体(如病毒、细菌或某些真核病原体)进行免疫；用能够指导编码期望进行免疫应答的一个或多个抗原的基因材料的表达的非毒性感染物进行免疫；并且用亚基疫苗组合物进行免疫，所述亚基疫苗组合物含有来自特定病原体的分离的免疫原(如蛋白质)以便诱导针对病原体的免疫。(参见例如，Liu,1998《自然医学(Nature Medicine)》,4(5增刊):515)。对于某些抗原，可能存在一种或多种类型的期望免疫，对此这些方法均不是特别有效的，所述方法包含开发疫苗组合物，所述疫苗组合物能有效地保护宿主免疫性地免受人类免疫缺陷病毒或其它感染性病原体、癌症、自身免疫疾病或其它临床病况。

疫苗组合物中已经采用了各种佐剂，以提高与任何给定抗原相关的免疫原性，同时使潜在毒性最小化。例如，皂树皂苷是从皂树(Quillaja saponaria)的树皮中提取的三萜皂甙的混合物。粗制皂苷已经被用作抗口蹄疫的疫苗组合物中的佐剂，并用于扩增抗如克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)疟原虫等原生动物寄生虫的实验性疫苗组合物以及对绵羊红细胞的体液应答所赋予的保护性免疫(Bomford,《变态反应与免疫学国际档案(Int.Arch.Allerg.appl.Immun.)》,67:127(1982))。然而，由于粗制混合物中存在影响佐剂活性和毒性的异质性和杂质，因此不期望将粗制皂苷用于兽医实践或用于人类的药物组合物中。Quil-A是皂树皂苷材料的部分纯化的水提取物，并且在化学上被表征为与三萜类皂皮酸的糖苷键中的碳水化合物部分。尽管Quil-A较粗制皂苷有改进，但其还被示出为展示相当大的异质性。QS21是具有佐剂活性的经HPLC纯化的Quil-A的无毒部分，并且其生产方法在美国专利第5,057,540号中公开(如QA21)。

长久以来已经知道，肠道菌(enterobacterial)脂多糖(LPS)是免疫系统的强有力的刺激物，尽管其在佐剂中的使用因其毒性作用而受到缩减。然而，如美国专利第8,273,361号中所公开的，LPS的脂质A尾部的合成无毒衍生物(吡喃葡萄糖基脂质A(GLA))被示出具有很强的诱导免疫应答的潜力。Ribi等人(1986,《细菌内毒素的免疫学和免疫药理学(Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins)》,普莱南出版公司(Plenum Publ.Corp.),纽约,第407页-419页)已经描述了天然存在的LPS的无毒衍生物(单磷酰基脂质A(MPL))，所述衍生物通过从还原端氨基葡萄糖中去除核心碳水化合物基团和磷酸盐而产生。

MPL的另外的解毒版本是从二糖主链的3-位置去除酰基链所产生的，并且被称为3-O-脱酰单磷酰基脂质A(3D-MPL)。所述MPL可以通过GB 2122204B中传授的方法纯化和制备，所述参考文献还公开了二磷酰基脂质A及其3-O-脱酰变体的制备。例如，3D-MPL已经以具有小于0.2μm直径的小粒径的乳液形式制备，并且其制造方法在WO 94/21292中公开。在WO9843670A2中描述了包括单磷酰基脂质A和表面活性剂的水性调配物。

将被调配成佐剂组合物的细菌LPS-衍生的佐剂可以从细菌来源中纯化和处理，或可替代地其可以是合成的。例如，已经公开了合成的皂苷，以及具体地合成的QS21(SQS 21)(Ragupathi等人,《疫苗专家评论(Expert Rev Vaccines.),2011年4月；10(4):463-470)。纯化的单磷酰基脂质A在Ribi等人1986(上文)中描述，并且衍生自沙门氏菌属(Salmonellasp)的3-O-脱酰单磷酰基或二磷酰基脂质A在GB 2220211和美国专利第4,912,094号中描述。已经描述了3D-MPL和β(l-6)氨基葡萄糖二糖类以及其它经过纯化和合成的脂多糖(WO98/01139；美国专利第6,005,099号和EP 0 729 473B1，Hilgers等人,1986《变态反应与免疫学国际档案》,79(4):392-6；Hilgers等人,1987,《免疫学(Immunology)》,60(1)；141-6；和EP 0 549 074B1)。另外，已经描述了通过修饰GLA设计的合成第二代脂质佐剂(SLA)(Paes等人,2016,《疫苗(Vaccine)》,34(35):4123-4131)。

3D-MPL和衍生自皂树的树皮的皂苷的组合物已在EP0761231B和US20080279926中描述。WO 95/17210公开了基于鲨烯、α-生育酚和聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯(TWEEN^TM-80)的佐剂乳液系统，所述佐剂乳液系统用QS21调配并且任选地包含3D-MPL。不管此类组合物的可及性如何，使用源自天然产物的佐剂都伴随着高生产成本、批次间的不一致性、与大规模生产相关的困难以及关于任何给定制剂的组成成分中杂质存在的不确定性。

因此，需要改进的疫苗组合物，以及具体地有益地含有高纯度、化学定义的佐剂组分的疫苗组合物，所述佐剂组分表现出批次间的一致性，并且在不引入不需要的或结构上未定义的污染物的情况下可以以工业规模高效地生产。本公开满足了这些需求并提供了其它相关的优点。

发明内容

本公开在其若干方面涉及在脂质体调配物中有利地采用皂苷和任选的脂多糖作为一种或多种组分的组合物和方法。一方面，脂质体调配物包含皂苷和脂多糖(LPS)。另一方面，脂质体调配物包含皂苷并且不含有LPS。另一方面，脂质体调配物包含与固醇复合的皂苷和任选的LPS。

在某些实施例中，提供了包括天然衍生和纯化的QS21或合成的QS21的皂苷(参见例如，美国专利第5,057,540号；EP 0 362 279B1；WO 95/17210)。

根据本文描述的本公开的一个实施例，所述皂苷与固醇复合，其中所述固醇是胆固醇。

本公开的脂质体调配物中使用的任选的脂多糖可以选自本领域已知和可获得的TLR4激动剂。在某些具体实施例中，TLR4激动剂选自GLA、MPL或3D-MPL。

根据本文描述的本公开的一方面，提供了具有以下结构的GLA化合物：

其中R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁-C₂₀烷基；并且R²和R⁴是C₉-C₂₀烷基。在一些实施例中，R¹、R³、R⁵和R⁶是C_11-14烷基；并且R²和R⁴是C_12-15烷基。在一些实施例中，R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁烷基；并且R²和R⁴是C₁₃烷基。在一些实施例中，R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁烷基；并且R²和R⁴是C₉烷基。在一些实施例中，R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₀烷基；并且R²和R⁴是C⁸烷基。

在一些实施例中，GLA具有以下结构并且在本文中称为SLA：

在一些实施例中，GLA具有以下结构(在实例中称为GLA*)：

在本文描述的本公开的某些实施例中，提供了与感染性疾病、癌症或自身免疫疾病相关的抗原。

另一方面，本公开提供了用于刺激和增强针对衍生自与感染性疾病相关的至少一种感染性病原体或与其发生免疫交叉反应的抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向有此需要的哺乳动物施用本公开的组合物。在某些实施例中，本公开提供了用于引发和增强针对与癌症相关的至少一种表位、生物分子、细胞或组织的免疫应答的方法。在某些实施例中，本公开提供了用于刺激和增强针对与自身免疫疾病相关的至少一种表位、生物分子、细胞或组织的免疫应答的方法。在某些实施例中，本公开提供了用于刺激和增强针对与感染性疾病相关的至少一种表位、生物分子、细胞或组织的免疫应答的方法

还提供了制造本发明的含皂苷的脂质体的方法。

应当理解的是，本文描述的各种实施例的属性中的一个、一些或所有属性可以被组合以形成本公开的其它实施例。参照以下详细说明和附图，本公开的这些和其它方面将是显而易见的。本文所公开的所有参考文献均通过引用以其整体并入本文，就好像每个参考文献都被单独并入一样。

附图说明

图1：此图示出用于本发明的示例性调配物的示例性制造和放大工艺流程

图2：此图描绘豚鼠随时间的推移的存活率。执行Mantel-Cox检验以确定显著性，其中p,0.05指示显著性。沿着线的符号仅用于将线区分，并且不指示单个动物。

具体实施方式

本公开总体上涉及包含皂苷和任选的脂多糖(LPS)的脂质体调配物，以及用于将所述脂质体调配物用于药物组合物和疫苗组合物的相关方法。在某些方面，脂质体调配物可以包含与固醇复合的皂苷和任选的LPS。本公开的药物组合物和疫苗组合物包含例如含有QS21和任选的GLA的脂质体调配物。在另一个实例中，本公开的药物组合物和疫苗组合物可以包含脂质体调配物，所述脂质体调配物含有与固醇复合的QS21和任选的GLA。在具体的优选实施例中，皂苷与胆固醇复合。

含有脂质体调配物的药物组合物和疫苗组合物任选地进一步包括抗原，其中所述抗原与感染性疾病、癌症或自身免疫疾病相关。本公开还设想使用脂质体调配物作为药物组合物或疫苗组合物以引发或增强患有感染性疾病、癌症或自身免疫疾病的受试者的免疫应答。

全球范围内皂树树皮的可获得性越来越受到限制，这表明这种自然资源可能不足以大规模生产每剂量中采用高浓度皂苷的疫苗组合物(Ragupathi等人，《疫苗专家评论》2011；10(4):463-470。此外，尽管天然皂苷具有强效的佐剂活性，但是与天然皂苷的获得相关的昂贵成本是其广泛使用的限制因素。相反，与本领域中已知的以前的含皂苷的调配物相比，本文提供的脂质体调配物、药物组合物和疫苗组合物有利地以每剂量低浓度范围使用皂苷。因此，本公开的组合物有益地含有高纯度、化学限定的组分，所述组分表现出批次间一致性并且可以以工业规模高效地制造。

I.定义

除非另外指示，否则以下术语具有以下含义。任何未定义的术语具有其领域认可的含义。

如在本文中和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包含复数指代物。

应当理解，本文描述的本公开的方面和实施例包含“包括”方面和实施例，“由方面和实施例组成”和“基本上由方面和实施例组成”。

在本描述中，除非另外指示，否则术语“约”和“基本上由...组成”意指所指示的范围、值或结构的±20％。

替代方案(例如，“或”)的使用应当被理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。

如本文所使用的，术语“包含”、“具有”和“包括”同义地使用，所述术语和其变体旨在被解释为非限制性的。

如本文所使用的，术语“高分子”是指由但不限于生物或合成来源的肽、蛋白质、寡核苷酸和多核苷酸例证的大分子。

术语“烷基”意指含有指示数量的碳原子的直链或支链、非环状或环状、不饱和或饱和的脂肪族烃。不饱和烷基含有在相邻碳原子之间的至少一个双键或者三键。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指代任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链或支链的，其可以包括经修饰的核苷酸或氨基酸，并且可以被非核苷酸或非氨基酸中断。这些术语还涵盖天然修饰或通过介入修饰的核苷酸或氨基酸聚合物；所述介入例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记组分缀合。所述定义内还包含例如含有核苷酸或氨基酸(包含例如非天然氨基酸等)的一种或多种类似物以及本领域已知的其它修饰的多核苷酸或多肽。

术语“分离”意指分子已经从其天然环境去除。

“纯化”意指分子纯度已增加，使得其以比在其天然环境下和/或在实验室条件下初次合成和/或扩增时存在的纯度更高的纯度的形式存在。纯度是相关术语并且不一定意指绝对纯度。

如在本文中可互换使用的，“多核苷酸”或者“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，包含DNA和RNA。核苷酸可以是例如脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应并入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸(如甲基化核苷酸)和其类似物。如果存在，可以在聚合物的组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。

如本文所使用的，“寡核苷酸”通常是指短的、通常单链的、通常合成的多核苷酸，所述多核苷酸的长度通常但不一定小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不是互相排斥的。上文针对多核苷酸的描述等同地并且全部地适用于寡核苷酸。

“个体”或“受试者”是任何哺乳动物。哺乳动物包含但不限于人、灵长类、农畜、竞技动物、宠物(如猫、狗、马)以及啮齿动物。

除非另有指示，否则本公开的实践将采用分子生物学、重组DNA、生物化学和化学的常规技术，所述技术在本领域的技术范围内。此类技术在文献中进行了充分解释。参见例如《分子克隆实验室手册(Molecular Cloning A Laboratory Manual)》,第2版,Sambrook等人编辑,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press):(1989)；《DNA克隆(DNA Cloning)》,第I卷和第II卷(D.N.Glover编辑,1985)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编辑,1984)；Mullis等人,美国专利第4,683,195号；《核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑1984)；B.Perbal,《分子克隆实用指南(A Practical Guide To Molecular Cloning)》(1984)；专题论文：《酶学方法(Methods In Enzymology)》(学术出版社公司(Academic Press,Inc.),纽约)；以及Ausubel等人,《当代分子生物学实验手册(Current Protocols in MolecularBiology)》,约翰威利父子出版公司(John Wiley and Sons),巴尔的摩,马里兰州(1989)。

II.脂质体调配物

本公开提供了脂质体调配物。脂质体调配物包括皂苷和任选的LPS。另外，脂质体调配物可以任选地包含至少一种固醇和至少一种磷脂。

A.佐剂

如本文所讨论的，本公开的脂质体调配物包括皂苷和任选的LPS。众所周知，皂苷和LPS具有佐剂活性。

皂苷

在以下文献中教导了皂苷：例如，美国专利第6,544,518号；Lacaille-Dubois,M和Wagner H.(1996《植物医学(Phytomedicine)》2:363-386)，美国专利第5,057,540号,Kensil,《治疗性药物载体系统锐评(Crit Rev Ther Drug Carrier Syst)》,1996,12(1-2):1-55，和EP 0 362 279B1。包括Quil A(皂苷)的级分的被称为免疫刺激复合物(ISCOMS)的微粒结构是溶血性的，并且已经用于制造疫苗组合物(Morein,B.,EP 0109942B1)。据报道这些结构具有佐剂活性(EP 0 109 942B1；WO 96/11711)。溶血性皂苷QS21和QS17(QuilA的HPLC纯化级分)已经被描述为强效的全身性佐剂，并且其生产方法在美国专利第5,057,540号和EP 0 362 279B1中公开。在这些参考文献中还描述了QS7(Quil-A的非溶血性级分)的用途，所述QS7充当全身性疫苗组合物的强效佐剂。QS21的用途在Kensil等人(1991.《免疫学杂志(J.Immunology)》146:431-437)中进一步描述。QS21和聚山梨酯或环糊精的组合物也是已知的(WO 99/10008)。在WO 96/33739和WO 96/11711中描述了包括Quil A的级分(如QS21和QS7)的微粒佐剂系统。在全身性疫苗接种研究中已经使用的其它皂苷包含衍生自其它植物物种(如丝石竹属(Gypsophila)和肥皂草属(Saponaria))的皂苷(Bomford等人,《疫苗》,10(9):572-577,1992)。

在本文提供的脂质体调配物的一个实施例中，皂苷是衍生自皂树的树皮的免疫活性皂苷级分。在一个这种实施例中，皂苷级分是QS21。

由于全球范围内皂树树皮的供应越来越受到限制，以及与获得具有批次间一致性的高度纯化的免疫活性皂苷级分相关的挑战，已经描述了合成皂苷(如合成QS21(SQS21)、QS21-Api和QS21-Xyl)的化学生产(Ragupathi等人《疫苗专家评论》.2011年4月；10(4):463-470)。合成QS21(SQS 21)和天然衍生的QS21已经显现出具有类似的佐剂活性。

在本文提供的脂质体调配物的某些实施例中，皂苷是合成的。在一个这种实施例中，合成皂苷是合成QS21(SQS21)。

七叶皂苷是与皂苷有关的可以用于本文公开的脂质体调配物的实施例中的另一种化合物。七叶皂苷在默克(Merck)索引(第12版：条目3737)中被描述为存在于马栗树(欧洲七叶树)的种子中的皂苷的混合物。通过色谱法和纯化(Fiedler,Arzneimittel-Forsch.4,213(1953))并且通过离子交换树脂(Erbring等人,美国专利第3,238,190号)描述了其分离。七叶皂苷(也称为七叶素)的级分已经被纯化并且显现出生物活性(YoshikawaM等人(《化学与药学通报(Chem Pharm Bull)》(东京)1996年8月；44(8):1454-1464))。在默克索引(第12版，条目3204)中也被描述为皂苷的毛地黄皂苷衍生自紫花毛地黄(Digitalispurpurea)的种子，并且根据由以下描述的程序进行纯化：Gisvold等人,《美国药师协会杂志(J.Am.Pharm.Assoc.)》,1934,23,664；和Rubenstroth-Bauer,《生理化学(Physiol.Chem.)》,1955,301,621

在某些说明性实施例中，皂苷包括Quil-A或其衍生物，所述衍生物包含QS21和QS7(阿奎拉生物制药有限公司(Aquila Biopharmaceuticals Inc.),弗雷明汉,马萨诸塞州)；七叶皂苷；毛地黄皂苷；或丝石竹属或昆诺阿藜(Chenopodium quinoa)皂苷。其它说明性调配物包含多于一种本公开的脂质体调配物中的皂苷，例如包括QS21、QS7、Quil-A、七叶皂苷或毛地黄皂苷的组中的至少两种的组合。

在本文中设想包括皂苷和任选的LPS的脂质体调配物是用于向人类受试者施用的组合物。在某些实施例中，皂苷的浓度为每剂量约0.5μg到每剂量约10μg，或每剂量约1μg到每剂量约10μg。在一些优选实施例中，皂苷的浓度为每剂量约0.5μg到每剂量约8μg，或每剂量约1μg到每剂量约8μg。熟练的实践者将理解，如果组分的浓度为每剂量约0.5μg到每剂量约10μg，则待递送到受试者的量将为每剂量约0.5μg到约10μg。可以在递送给受试者之前将调配物本身稀释。

在本文提供的组合物的某些说明性实施例中，皂苷的浓度为每剂量约1μg、每剂量约2μg、每剂量约3μg、每剂量约4μg、每剂量约5μg、每剂量约6μg、每剂量约7μg、每剂量约8μg、每剂量约9μg或每剂量约10μg。在一些实施例中，皂苷的浓度为每剂量约1μg到每剂量约2μg、每剂量约2μg到每剂量约3μg、每剂量约3μg到每剂量约4μg、每剂量约4μg到每剂量约5μg、每剂量约5μg到每剂量约6μg、每剂量约6μg到每剂量约7μg、每剂量约7μg到每剂量约8μg、每剂量约8μg到每剂量约9μg，或每剂量约9μg到每剂量约10μg。在一些方面，皂苷的浓度为每剂量小于约1μg，例如每剂量约0.5μg到每剂量约1μg。

LPS

在本发明的示例性实施例中，LPS是免疫刺激剂。换句话说，LPS能够单独或与同疾病状态相关的抗原组合在受试者中引发免疫应答。在某些说明性实施例中，LPS是TLR4激动剂。如本文所使用的，“TLR4激动剂”是指通过其与TLR4的相互作用影响其生物活性的激动剂。在某些优选实施例中，在本公开的调配物中使用的TLR4激动剂是吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)，如在美国专利公开第US2007/021017号、第US2009/045033号和第US2010/037466号中描述的，所述美国专利的内容通过引用以其整体并入本文。

如上所述，由于GLA是化学合成的，因此其可以以基本上均质的形式制备，这是指GLA制剂相对于GLA分子的纯度为至少80％、优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少95％、和仍更优选地至少96％、97％、98％或99％。

例如，在某些实施例中，TLR4激动剂是具有以下式(I)的结构：

或其药学上可接受的盐的合成GLA，其中：

L₁、L₂、L₃、L₄、L₅和L₆相同或不同，并且独立地是-O-、-NH-或-(CH₂)-；

L₇、L₈、L₉和L₁₀相同或不同，并且独立地不存在或是-C(＝O)-；

Y₁是酸官能团；

Y₂和Y₃相同或不同，并且独立地是-OH、-SH或酸官能团；

Y₄是-OH或-SH；

R₁、R₃、R₅和R₆相同或不同，并且独立地是C_8-13烷基；并且R₂和R₄相同或不同，并且独立地是C_6-11烷基。

在合成GLA结构的一些实施例中，R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₀烷基；并且R²和R⁴是C₈烷基。在某些实施例中，R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁烷基；并且R²和R⁴是C₉烷基。

例如，在某些实施例中，TLR4激动剂是具有以下式(II)的结构或其药学上可接受的盐的合成GLA：

在以上GLA结构的某些实施例中，R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁-C₂₀烷基；并且R²和R⁴是C₁₂-C₂₀烷基。在另一个具体实施例中，GLA具有上述式，其中R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁烷基；并且R²和R⁴是C₁₃烷基。在另一个具体实施例中，GLA具有上述式，其中R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₀烷基；并且R²和R⁴是C₈烷基。

在另一个具体实施例中，GLA具有上述式，其中R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁-C₂₀烷基；并且R²和R⁴是C₉-C₂₀烷基。在某些实施例中，R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁烷基；并且R²和R⁴是C₉烷基。

在某些实施例中，TLR4激动剂是具有以下式(III)的结构或其药学上可接受的盐的合成GLA：

在以上GLA结构的某些实施例中，R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁-C₂₀烷基；并且R²和R⁴是C₉-C₂₀烷基。在某些实施例中，R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁烷基；并且R²和R⁴是C₉烷基。

在某些实施例中，TLR4激动剂是具有以下式(IV)的结构的合成GLA：

在以上GLA结构的某些实施例中，R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁-C₂₀烷基；并且R²和R⁴是C₉-C₂₀烷基。在某些实施例中，R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁烷基；并且R²和R⁴是C₉烷基。

在某些实施例中，TLR4激动剂是具有以下式(V)的结构或其药学上可接受的盐的合成GLA：

在以上GLA结构的某些实施例中，R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁-C₂₀烷基；并且R²和R⁴是C₉-C₂₀烷基。在某些实施例中，R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁烷基；并且R²和R⁴是C₉烷基。

在某些实施例中，TLR4激动剂是具有以下结构或其药学上可接受的盐的合成GLA：

在某些实施例中，TLR4激动剂是具有以下结构(并且在本文中称为SLA)或其药学上可接受的盐的合成GLA：

在某些实施例中，TLR4激动剂是具有以下结构或其药学上可接受的盐的合成GLA：

在本文提供的脂质体调配物的示例性实施例中，LPS是具有根据式(II)的结构或其药学上可接受的盐的GLA，其中R¹、R³、R⁵和R⁶是C11烷基；并且R²和R⁴是C13烷基。在本文提供的脂质体调配物的示例性实施例中，LPS是具有根据式(II)的结构或其药学上可接受的盐的GLA，其中R¹、R³、R⁵和R⁶是C10烷基；并且R²和R⁴是C8烷基。在本文提供的脂质体调配物的另一个示例性实施例中，LPS是MPL。

在本文描述的组合物的某些实施例中，LPS是通过修饰GLA设计的合成的第二代脂质佐剂(SLA)。在另一个实施例中，将减毒的脂质A衍生物(ALD)并入本文描述的组合物中。ALD是已经被改变或构造使得分子显示脂质A的更小或不同的不良反应的脂质A类分子。这些不良反应包含如在鸡胚50％致死剂量测定(CELD₅₀)中评估的致热原性、局部Shwarzman反应性和毒性。根据本公开有用的ALD包含单磷酰基脂质A(MLA或MPL)和3-脱酰单磷酰基脂质A(3D-MLA或3D-MPL)。MLA(MPL)和3D-MLA(3D-MPL)已知并且不需要在本文中进行详细描述。参见例如通过引用的方式并且出于所有目的并入本文的美国专利第4,436727号和第4,912,094号。

在以上TLR4激动剂化合物中，可以根据分子中的官能团确定总电荷。例如，磷酸基可以是带负电荷的或中性的，这取决于磷酸基的电离状态。

GLA化合物的合成

如以上所提及的，本公开提供了GLA化合物。本公开的代表性GLA化合物可以通过已知的有机合成技术(参见例如通过引用以其整体并且出于所有目的并入本文的美国专利第8,722,064号和第8273,361号)来制备。

本公开的化合物通常可以用作游离碱或游离酸。可替代地，本公开的化合物可以以酸加成盐或碱加成盐的形式使用。本公开的游离氨基化合物的酸加成盐可以通过本领域公知的方法来制备，并且可以由有机酸和无机酸形成。合适的有机酸包含马来酸、富马酸、苯甲酸、抗坏血酸、琥珀酸、甲磺酸、乙酸、草酸、丙酸、酒石酸、水杨酸、柠檬酸、葡萄糖酸、乳酸、扁桃酸、肉桂酸、天冬氨酸、硬脂酸、棕榈酸、乙醇酸、谷氨酸和苯磺酸。合适的无机酸包含盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸和硝酸。

类似地，本公开的酸化合物的碱加成盐可以通过本领域公知的方法来制备，并且可以由有机碱和无机碱形成。合适的有机碱包含但不限于三乙胺和吡啶。合适的无机碱包含但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾和氨。因此，术语式(I)的“药学上可接受的盐”旨在涵盖任何和所有可接受的盐形式。

另外，前药也包含在本公开的内容内。前药是当将这种前药施用于患者时在体内释放式(I)的化合物的任何共价键合的载剂。通常通过以使得通过常规操作或在体内使修饰断裂的方式修饰官能团来制备前药，从而得到母体化合物。前药包含例如本公开的化合物，其中羟基、胺或巯基键合到当施用于患者时断裂以形成羟基、胺或巯基的任何基团。因此，前药的代表性实例包含(但不限于)式(I)的化合物的醇和胺官能团的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物。进一步地，在羧酸(COOH)的情况下，可以采用酯，如甲酯、乙酯等。

关于立体异构体，式(I)的化合物可以具有手性中心并且可以以外消旋体、外消旋混合物以及单独的对映异构体或非对映异构体形式出现。在本公开内包含所有此类异构形式，包含其混合物。此外，式(I)的化合物的结晶形式中的一些结晶形式可以以多晶型物形式存在，所述一些结晶形式包含在本公开中。另外，式(I)的化合物中的一些化合物也可以与水或其它有机溶剂形成溶剂化物。此类溶剂化物类似地包含在本公开的范围内。

在本文中设想包括皂苷和LPS的脂质体调配物是用于向人类受试者施用的组合物。在某些实施例中，LPS的浓度为每剂量约1μg、每剂量约2μg，或每剂量约2.5μg到每剂量约25μg。在一些优选实施例中、LPS的浓度为每剂量约3μg到每剂量约20μg。

在本文提供的组合物的某些说明性实施例中，LPS的浓度为每剂量约2.5μg、每剂量约3μg、每剂量约3.5μg、每剂量约4μg、每剂量约4.5μg、每剂量约5μg、每剂量约5.5μg、每剂量约6μg、每剂量约6.5μg、每剂量约7μg、每剂量约7.5μg、每剂量约8μg、每剂量约8.5μg、每剂量约9μg、每剂量约9.5μg、每剂量约10μg、每剂量约10.5μg、每剂量约11μg、每剂量约11.5μg、每剂量约12μg、每剂量约12.5μg、每剂量约13μg、每剂量约13.5μg、每剂量约14μg、每剂量约14.5μg、每剂量约15μg、每剂量约15.5μg、每剂量约16μg、每剂量约16.5μg、每剂量约17μg、每剂量约17.5μg、每剂量约18μg、每剂量约18.5μg、每剂量约19μg、每剂量约19.5μg、每剂量约20μg、每剂量约20.5μg、每剂量约21μg、每剂量约21.5μg、每剂量约22μg每剂、每剂量约22.5μg、每剂量约23μg、每剂量约23.5μg、每剂量约24μg、每剂量约24.5μg，或每剂量约25μg。

在某些实施例中，LPS的浓度为每剂量约2.5μg到每剂量约5μg、每剂量约5μg到每剂量约7.5μg、每剂量约7.5μg到每剂量约10μg、每剂量约10μg到每剂量约12.5μg、每剂量约12.5μg到每剂量约15μg、每剂量约15μg到每剂量约17.7μg、每剂量约17.5μg到每剂量约20μg、每剂量约20μg到每剂量约22.5μg，或每剂量约22.5μg到每剂量约25μg。

皂苷与LPS的比率

在本文描述的脂质体调配物的示例性方面，皂苷与LPS的比率为约1到2.5。在具有皂苷与LPS的此比率的一些实施例中，皂苷的浓度为每剂量约1μg，并且LPS的浓度为每剂量约2.5μg。在具有皂苷与LPS的此比率的一些实施例中，皂苷的浓度为每剂量约2μg，并且LPS的浓度为每剂量约5μg。在具有皂苷与LPS的此比率的一些实施例中，皂苷的浓度为每剂量约3μg，并且LPS的浓度为每剂量约7.5μg。在具有皂苷与LPS的此比率的一些实施例中，皂苷的浓度为每剂量约4μg，并且LPS的浓度为每剂量约10μg。在具有皂苷与LPS的此比率的一些实施例中，皂苷的浓度为每剂量约5μg，并且LPS的浓度为每剂量约12.5μg。在具有皂苷与LPS的此比率的一些实施例中，皂苷的浓度为每剂量约6μg，并且LPS的浓度为每剂量约15μg。在具有皂苷与LPS的此比率的一些实施例中，皂苷的浓度为每剂量约7μg，并且LPS的浓度为每剂量约17.5μg。在具有皂苷与LPS的此比率的一些实施例中，皂苷的浓度为每剂量约8μg，并且LPS的浓度为每剂量约20μg。在具有皂苷与LPS的此比率的一些实施例中，皂苷的浓度为每剂量约9μg，并且LPS的浓度为每剂量约22.5μg。在具有皂苷与LPS的此比率的一些实施例中，皂苷的浓度为每剂量约10μg，并且LPS的浓度为每剂量约25μg。

B.固醇

与固醇一起以其淬灭形式存在的皂苷可以有效地促进人类受试者的T细胞应答。固醇是类固醇，并且是指具有类固醇的四元环结构特征并且在3-碳位置处具有羟基(-OH)或酯(-OR)取代的任何分子。固醇天然存在于植物、动物和微生物的膜中，并且分别被称为植物固醇、动物固醇和真菌固醇。固醇可以在其它环碳中的一个或多个环碳处被进一步取代，并且在环中还可以含有各种双键。固醇的非限制性实例可以包含胆固醇、胆固醇氯甲酸酯、豆固醇、谷固醇、麦角固醇、羊毛固醇、链固醇(desmosterol)或菜油固醇。固醇通常与皂苷结合形成稳定的不溶性复合物。在本文描述的组合物的具体实施例中，脂质体调配物包括皂苷和任选的LPS，其中皂苷与固醇复合。在示例性实施例中，脂质体调配物包括皂苷和任选的LPS，其中皂苷与胆固醇复合。

在包括与固醇复合的皂苷的脂质体调配物的某些实施例中，皂苷与固醇的比率为约1:110到1:200。在一些实施例中，皂苷与固醇的比率为约1:110到1:150。在一些优选实施例中，皂苷与固醇的比率为约1:120到1:150。在示例性实施例中，皂苷与固醇的比率为约1:125。通常，固醇起到降低皂苷的溶血活性的作用。在一些方面，固醇起到将皂苷的溶血活性降低50％、60％、70％、80％、90％或甚至100％的作用。

在其它优选实施例中，本公开还设想包括与固醇复合的皂苷和LPS的脂质体调配物，其中LPS的浓度为每剂量约10μg或每剂量约5μg。在某些实施例中，皂苷与固醇复合，其中皂苷的浓度为每剂量约4μg或每剂量约2μg。在示例性实施例中，脂质体调配物包括与固醇复合的皂苷和LPS，其中皂苷的浓度为每剂量约4μg，并且LPS的浓度为每剂量约10μg。

在另一个示例性实施例中，脂质体调配物包括与固醇复合的皂苷和LPS，其中皂苷的浓度为每剂量约2μg，并且LPS的浓度为每剂量约5μg。

在其它优选实施例中，本公开还设想包括与固醇复合的皂苷和LPS的脂质体调配物，其中皂苷是衍生自皂树的树皮的免疫活性皂苷级分。在优选实施例中，活性皂苷级分是QS21。在本文描述的组合物的其它实施例中，皂苷是合成的。在示例性实施例中，脂质体调配物包括与胆固醇复合的QS21和LPS。在另一个示例性实施例中，脂质体调配物包括与胆固醇复合的合成QS21(SQS21)和LPS。

C.磷脂

脂质体已经用于递送亚基蛋白疫苗组合物和佐剂。由于调整脂质体调配物以实现期望的脂质浓度、电荷、大小以及抗原和佐剂的分布或靶向的能力，脂质体是有吸引力的递送媒剂。已经评估了许多基于脂质体的系统，其包含阴离子、阳离子和中性脂质体。本文中设想脂质体调配物的脂质组分可以包括任何脂质中的至少一种脂质(其包含磷脂)以形成稳定的脂质体结构。

在本文提供的组合物的某些实施例中，脂质体调配物包括至少一种磷脂。在一些实施例中，磷脂是阴离子。在一些实施例中，磷脂是阳离子。在其它实施例中，磷脂具有中性电荷。

表1提供用于本公开的示例性脂质的非限制性列表。

表1：示例性脂质

在本文描述的脂质体调配物的某些示例性实施例中，脂质组分包括选自由以下组成的组的至少一种磷脂：DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC、DLPG、DMPG、DPPG、DSPG、DOPG、DSTAP、DPTAP、DSPE、DPPE、DMPE、DLPE、DLPS 1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸、DMPS 1,2-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸、DPPS：1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸、DSPS 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸、DOPS 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸、POPS 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸、DLPI 1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸-(l'-肌醇)、DMPI 1,2-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸-(l'-肌醇)、DPPI 1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸-(l'-肌醇)、DSPI 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸肌醇、DOPI 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(l'-肌醇)和POPI 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸肌醇。熟练的实践者将理解，磷脂可以呈盐形式(例如，铵盐或钠盐)。

D.脂质体特征大小

本公开提供了脂质体调配物。本文提供的脂质体的大小可以通过本领域已知的技术评估，包含但不限于x射线和激光衍射、动态光散射(DLS)、CryoEM或Malvern Zetasize。在一些实施例中，脂质体的大小是指Z平均直径。

本文提供的脂质体的平均直径(即数均直径)为1微米或更小。特别期望脂质体颗粒的平均粒径(即数均直径)为约900nm或更小、约800nm或更小、约700nm或更小、约600nm或更小、约500nm或更小、约400nm或更小、300nm或更小，或200nm或更小，例如，约50nm到约900nm、约50nm到约800nm、约50nm到约700nm、约50nm到约600nm、约50nm到约500nm、约50nm到约400nm、约50nm到约300nm、约50nm到约200nm、约50nm到约175nm、约50nm到约150nm、约50nm到约125nm、约50nm到约100nm。

本文描述的脂质体的大小通常为约80nm、约85nm、约90nm、约95nm、约100nm、约105nm、约110nm、约115nm、约120nm、约125nm、约130nm、约135nm、约140nm、约145nm、约150nm、约155nm、约160nm、约165nm、约170nm、约175nm、约180nm、约185nm、约190nm、约195nm、或约200nm。熟练的实践者将理解，脂质体由颗粒构成。平均粒径是指构成脂质体的颗粒的平均直径。

本公开的示例性脂质体调配物能够过滤穿过至少0.45微米过滤器。在示例性实施例中，脂质体调配物能够过滤穿过0.20或0.22微米过滤器。

体积

本公开的某些实施例涵盖包括皂苷和LPS的脂质体调配物，其中调配物的体积适用于人体剂量。在一些实施例中，调配物的体积为约0.5ml到约1.5ml。在具体实施例中，调配物的体积为约0.5ml、约0.6ml、约0.7ml、约0.8ml、约0.9ml、约1.0ml、约1.1ml、约1.2ml、约1.3ml、约1.4ml、或约1.5ml。在某些实施例中，调配物的体积为约0.5ml到约0.75ml、约0.75ml到约1.0ml、约1.0ml到约1.25ml、或约1.25ml到约1.5ml。

稳定性

本文提供的脂质体调配物是稳定的，从而可实现容易使用、可制造性、可运输性和储存。在各种温度和各种条件下，随着时间的推移维持脂质体调配物的物理化学特征，包含但不限于脂质体大小。

粒径随时间变化的演变提供了胶体稳定性信息。示例性稳定的脂质体调配物是其脂质体在不同温度下(通常是但不限于37摄氏度、25摄氏度或5摄氏度)在某一时间段内(例如，30天或7天的时间段)保持基本上相同的z平均直径大小的脂质体调配物。通过保持基本上相同的Z平均直径大小，意味着脂质体在30天的时间段内保持在其原始大小的20％、15％、10％、5％以内。特别稳定的脂质体调配物是其颗粒在25摄氏度或甚至37摄氏度下在30天的时间段内保持基本上相同的Z平均直径大小的脂质体调配物。

脂质体调配物的稳定性可以通过本领域技术人员熟悉的技术测量。在一些实施例中，目测观察稳定性。目测检查可以包含对微粒、絮状物或聚集物的检查。通常，胶体稳定性由脂质体的粒径确定，如通过测量Z平均直径确定，并且任选地表示为随着时间的推移或在各种温度或某些条件下的大小变化。在一些实施例中，稳定性通过评定粒径的增加来确定。在一些实施例中，稳定性例如通过使用动态光散射(DLS)技术测量多分散指数(PDI)来确定。在其它实施例中，稳定性通过使用DLS技术测量ζ电势来确定。

在一些实施例中，脂质体的Z平均直径在所测定的时间段内增加了小于50％、小于40％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于12％、小于10％、小于7％、小于5％、小于3％、小于1％。

在一些实施例中，脂质体的多分散性指数维持在约0.5、约0.4、约0.3、约0.2、约0.1、或约0.1到约0.5、约0.1到约0.4、约0.1到约0.3、或约0.1到约0.2。

III.示例性调配物

一方面，脂质体调配物含有皂苷和任选的LPS。另一方面，脂质体调配物含有与固醇复合的皂苷和任选的LPS。另一方面，脂质体调配物含有皂苷和LPS，其中皂苷与固醇复合。

在某些实施例中，皂苷的浓度为每剂量约1μg到每剂量约8μg，并且LPS的浓度为每剂量约3μg到每剂量约20μg。

在一个示例性实施例中，脂质体调配物包括皂苷和任选的LPS，其中皂苷以约1:110到1:200的比率与固醇复合。在另一个示例性实施例中，脂质体调配物包括皂苷和任选的LPS，其中皂苷以约1:125的比率与固醇复合。

在具体实施例中，皂苷与固醇复合，并且皂苷的浓度为每剂量约4μg。在具体实施例中，皂苷与固醇复合，并且皂苷的浓度为每剂量约2μg。

在具体实施例中，皂苷与固醇复合，并且LPS存在且其浓度为每剂量约10μg。在具体实施例中，皂苷与固醇复合，并且LPS存在且其浓度为每剂量约5μg。

在示例性实施例中，皂苷与固醇复合，皂苷的浓度为每剂量4μg，并且LPS存在且其浓度为每剂量约10μg。在另一个示例性实施例中，皂苷与固醇复合，皂苷的浓度为每剂量2μg，并且LPS存在且其浓度为每剂量约5μg。

在本文描述的脂质体调配物的优选实施例中，皂苷是衍生自皂树的树皮的免疫活性皂苷级分。在示例性实施例中，皂苷级分是QS21。

在具体实施例中，皂苷是合成的。在某些实施例中，脂质体调配物包括与固醇复合的合成QS21(QS21)和任选的LPS。

在本文提供的调配物的示例性实施例中，皂苷与胆固醇复合。

在本文提供的调配物的示例性实施例中，调配物进一步包括选自由以下组成的组的磷脂：DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC、DLPG、DMPG、DPPG、DSPG、DOPG、DSTAP、DPTAP、DSPE、DPPE、DMPE和DLPE。

在示例性实施例中，LPS是具有根据式(II)的结构或其药学上可接受的盐的GLA，并且其中R¹、R³、R⁵和R^6是C₁₁烷基；并且R²和R⁴是C₁₃烷基。在另一个示例性实施例中，脂质体调配物包括皂苷和LPS，其中LPS是具有根据式(II)的结构或其药学上可接受的盐的GLA，并且其中R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₀烷基；并且R²和R⁴是C₈烷基。

在另一个示例性实施例中，LPS是MPL。

在具体实施例中，脂质体调配物的体积适于人体剂量。在示例性实施例中，脂质体调配物的体积为约0.5ml到约1.5ml。

在具体的示例性实施例中，用于向人类受试者施用的脂质体调配物包括皂苷和LPS，其中皂苷的浓度为每剂量约1μg到每剂量约10μg，并且LPS的浓度为每剂量约3μg到每剂量约25μg，其中皂苷与固醇复合，并且皂苷与固醇的比率为约1:110到约1:200。在某些实施例中，皂苷的浓度为每剂量约1μg到每剂量约8μg，并且LPS的浓度为每剂量约3μg到每剂量约20μg。

在示例性实施例中，用于向人类受试者施用的脂质体调配物包括皂苷和LPS，其中皂苷的浓度为每剂量约1μg到每剂量约10μg，并且LPS的浓度为每剂量约3μg到每剂量约25μg，其中皂苷与固醇复合，并且皂苷与固醇的比率为约1:125。在某些实施例中，皂苷与LPS的比率为1:2.5。

在示例性实施例中，脂质体调配物包括皂苷和LPS，其中皂苷与固醇复合，皂苷的浓度为每剂量4μg，LPS的浓度为每剂量约10μg，并且其中皂苷与固醇复合并且皂苷与固醇的比率为约1:125。

在另一个示例性实施例中，脂质体调配物包括皂苷和LPS，其中皂苷与固醇复合，皂苷的浓度为每剂量2μg，LPS的浓度为每剂量约5μg，并且其中皂苷与固醇复合并且皂苷与固醇的比率为约1:125。

在某些示例性实施例中，用于向人类受试者施用的脂质体调配物含有QS21和LPS，其中QS21的浓度为每剂量约1μg到每剂量约10μg，LPS的浓度为每剂量约3μg到每剂量约25μg，QS21与固醇复合，并且皂苷与固醇的比率为约1:110到约1:200。

在某些示例性实施例中，脂质体调配物含有QS21和LPS，所述QS21以约1:110到约1:200的比率与胆固醇复合。在具体实施例中，包括以约1:110到约1:200的比率与胆固醇复合的QS21和LPS的脂质体调配物进一步包括选自由以下组成的组的磷脂：DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC、DLPG、DMPG、DPPG、DSPG、DOPG、DSTAP、DPTAP、DSPE、DPPE、DMPE和DLPE。

在某些示例性实施例中，脂质体调配物包括以约1:110到约1:200的比率与胆固醇复合的QS21，和根据式(II)或其药学上可接受的盐的GLA，其中R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁烷基；并且R²和R⁴是C₁₃烷基。

在其它示例性实施例中，脂质体调配物包括以约1:110到约1:200的比率与胆固醇复合的QS21，和根据式(II)或其药学上可接受的盐的GLA，其中R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₀烷基；并且R²和R⁴是C₈烷基。

在另一个示例性实施例中，脂质体调配物包括QS21和MPL，所述QS21以约1:110到约1:200的比率与胆固醇复合。

在另一个示例性实施例中，脂质体调配物包括皂苷和任选的脂多糖，其中皂苷与固醇复合，并且皂苷与固醇的重量比为约1:110到约1:200、1:110到约1:150、1:120到约1:150、或约1:125。脂质体调配物可以包括例如磷脂，并且磷脂与固醇的重量比可以为例如1:1到约10:1。在一些方面，脂质体调配物包括磷脂，并且磷脂与固醇的重量比为约4:1。皂苷的浓度例如可以为每剂量约0.5μg到每剂量约10μg；每剂量约1μg到每剂量约10μg；每剂量约1μg到每剂量约8μg。脂多糖任选地存在，当存在时，其浓度可以例如为每剂量1.25μg到每剂量约25μg，或每剂量约3μg到每剂量约25μg，但是也设想了不同的剂量水平。皂苷的浓度可以例如为每剂量约1μg到每剂量约8μg，并且脂多糖的浓度可以为每剂量约3μg到每剂量约20μg。脂多糖与皂苷的比率可以为例如约2.5比1。皂苷的浓度可以例如为每剂量约4μg，并且脂多糖的浓度可以例如为每剂量约10μg。皂苷的浓度可以例如为每剂量约2μg，并且脂多糖的浓度可以例如为每剂量约5μg。调配物可以包括例如浓度为约8μg/ml的皂苷、浓度为约20μg/ml的脂多糖、浓度为约4mg/ml的磷脂和浓度为约1mg/ml的固醇。调配物可以是稀释形式(例如，2到10倍稀释或更高)或浓缩形式(例如，2到10倍浓缩或更高)。在这些实施例的任一个实施例中，皂苷可以是衍生自皂树的树皮的免疫活性皂苷级分。皂苷可以是例如QS21。在这些实施例的任一个实施例中，固醇可以是胆固醇，但是也设想其它固醇。在这些实施例的任一个实施例中，脂质体可以由磷脂构成。可以使用任何合适的磷脂，包含例如DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC、DLPG、DMPG、DPPG、DSPG、DOPG、DSTAP、DPTAP、DSPE、DPPE、DMPE、DLPE、DLPS、DMPS、DPPS、DSPS、DOPS、POPS、DLPI、DMPI、DPPI、DSPI、DOPI或POPI。可以使用本文描述的脂多糖中的任一种脂多糖以及本领域已知的其它脂多糖。紧接施用前，调配物的体积将适于人体剂量。示例性体积包含0.5ml到约1.5ml。抗原可以与调配物混合。可以使用本文描述的抗原中的任一种抗原以及本领域已知的其它合适的抗原。调配物可以用于引发或增强受试者的免疫应答。受试者可以患有多种疾病，包含例如癌症、感染性疾病或自身免疫疾病。受试者可以是人。每剂量可以递送各种量的皂苷和LPS(例如，2μg的皂苷与5μg的LPS(例如，GLA)；4μg的皂苷与10μg的LPS(例如，GLA)。

还提供一种制造本文描述的含皂苷的脂质体调配物中的任一种脂质体调配物的方法，所述方法包括将皂苷与预形成的含固醇的脂质体混合。皂苷可以是例如QS21，并且在一些方面，将粗皂苷混合物Quil A纯化以获得皂苷。在一些方面，皂苷在与脂质体混合之前溶解于缓冲液中。可以通过将磷脂和固醇混合并通过高压均质化减小所得脂质体的粒径来制备预形成的含固醇脂质体。

IV.药物组合物和疫苗组合物

在某些方面，将本文描述的脂质体调配物掺入药物组合物或疫苗组合物中。也可以将如本文所述的多肽、抗原、多核苷酸、部分、变体、融合多肽等掺入药物组合物或疫苗组合物中。药物组合物通常包括脂质体调配物，所述脂质体调配物与生理学上可接受的载剂组合。疫苗组合物(也被称为免疫原性组合物)通常包括抗原和如本文所述的多肽、多核苷酸、部分、变体、融合蛋白等中的一种或多种。

在优选实施例中，药物组合物含有本文提供的脂质体调配物和任选的抗原。脂质体调配物和药物组合物任选地与抗原混合。在此类实施例中，脂质体调配物和药物组合物被调配为使得它们适合与抗原混合。在一些优选实施例中，疫苗组合物含有本文提供的脂质体调配物和抗原。

A.抗原

抗原可以是任何靶表位、分子(包含生物分子)、分子复合物(包含含有生物分子的分子复合物)、亚细胞组装体、期望针对其引发或增强受试者的免疫反应性的细胞或组织。通常，术语抗原将指所关注的多肽抗原。然而，本文所使用的抗原也可以是指编码多肽抗原的核酸分子(例如，DNA或RNA)。抗原也可以是编码所关注的多肽抗原的重组构建体(例如，表达构建体)。合适的抗原包含但不限于细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、原生动物抗原、植物抗原、癌症抗原或其组合。本文描述的抗原可以涉及或衍生自例如感染性疾病、癌症、自身免疫疾病、过敏、哮喘或刺激抗原特异性免疫应答将是期望或有益的任何其它病况。

在某些实施例中，抗原可以衍生自与感染性疾病相关的至少一种感染性病原体或与其发生免疫交叉反应。在某些实施例中，抗原可以衍生自与癌症相关的至少一种表位、生物分子、细胞或组织或与其发生免疫交叉反应。在某些实施例中，抗原可以衍生自与自身免疫疾病相关的至少一种表位、生物分子、细胞或组织或与其发生免疫交叉反应。

应当理解，本发明的脂质体调配物和药物组合物在所述组合物不含有抗原的情况下可以引发人体的免疫应答，在某些其它实施例中，本公开的药物组合物和疫苗组合物含有能够引发人或其它哺乳动物宿主的免疫应答的抗原或抗原组合物。抗原或抗原组合物可能能够独自或在与本发明的调配物和组合物组合时引发免疫应答。在一些方面，本发明的调配物增强了抗原或抗原组合物引发人或其它哺乳动物的免疫应答的能力。

抗原或抗原组合物可以包含衍生自一种或多种细菌病原体的组合物，所述细菌病原体如奈瑟氏球菌属(Neisseria spp)，包含淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhea)和脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)(例如，荚膜多糖及其缀合物、转铁结合蛋白、乳铁蛋白结合蛋白、PilC、黏附素)；化脓性链球菌(S.pyogenes)(例如，M蛋白或其片段、C5A蛋白酶、脂磷壁酸)、无乳链球菌(S.agalactiae)、变形链球菌(S.mutans)；杜克嗜血杆菌(H.ducreyi)，莫拉菌属(Moraxella spp)，包含卡他莫拉菌(M catarrhalis)，其也被称为粘膜炎布兰汉球菌(Branhamella catarrhalis)(例如，高分子量和低分子量黏附素和侵袭素)；博德特氏菌属(Bordetella spp)，包含百日咳博德特氏菌(B.pertussis)(例如，百日咳杆菌粘附素、百日咳毒素或其衍生物、丝状血凝素、腺苷酸环化酶、菌毛)、副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)和支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)；分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)，包含结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(例如，ESAT6、抗原85A、-B或-C)、牛分枝杆菌(M.bovis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、鸟分枝杆菌(M.avium)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)；军团菌属(Legionellaspp)，包含嗜肺军团菌(L.pneumophila)；埃希氏杆菌属(Escherichia spp)，包含肠毒性大肠杆菌(E.coli)(例如，定居因子、不耐热毒素或其衍生物、耐热毒素或其衍生物)、肠出血性大肠肝菌、肠致病性大肠杆菌(例如，志贺样毒素或其衍生物)；弧菌属(Vibrio spp)，包含霍乱弧菌(V cholera)(例如，霍乱毒素或其衍生物)；志贺菌属(Shigella spp)，包含索氏志贺菌(S.sonnei)、痢疾志贺菌(S.dysenteriae)、弗氏志贺菌(S.flexnerii)；耶尔森菌属(Yersinia spp)，包含小肠结肠炎耶尔森菌(Y.enterocolitica)(例如，Yop蛋白)、鼠疫耶尔森菌(Y.pestis)、假结核病耶尔森菌(Y.pseudotuberculosis)；弯曲菌属(Campylobacter spp)，包含空肠弯曲菌(C.jejuni)(例如，毒素、黏附素和侵袭素)和大肠弯曲菌(C.coli)；沙门氏菌属(Salmonella spp)，包含伤寒沙门氏菌(S.typhi)、甲型副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi)、霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)、肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)；李斯特菌属(Listeria spp.)，包含单核细胞李斯特菌(L.monocytogenes)；螺杆菌属(Helicobacter spp)，包含幽门螺杆菌(H.pylori)(例如，尿素酶、过氧化氢酶、空泡毒素)；假单胞菌属(Pseudomonas spp)，包含铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)，包含金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)；肠球菌属(Enterococcus spp.)，包含粪肠球菌(E.faecalis)、屎肠球菌(E.faecium)；梭菌属(Clostridium spp.)，包含破伤风梭菌(C.tetani)(例如，破伤风毒素及其衍生物)、肉毒梭菌(C.botulinum)(例如，肉毒毒素及其衍生物)、艰难梭菌(C.difficile)(例如，梭菌(clostridium)毒素A或B及其衍生物)；芽孢杆菌属(Bacillus spp.)，包含炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)(例如，肉毒杆菌毒素及其衍生物)；棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)，包含白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)(例如，白喉毒素及其衍生物)；疏螺旋体属(Borrelia spp.)，包含伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)(例如，OspA、OspC、DbpA、DbpB)、伽氏疏螺旋体(B.garinii)(例如，OspA、OspC、DbpA、DbpB)、埃氏疏螺旋体(B.afzelii)(例如，OspA、OspC、DbpA、DbpB)、安德森疏螺旋体(B.andersonii)(例如，OspA、OspC、DbpA、DbpB)、赫姆斯疏螺旋体(B.hermsii)；埃立克体属(Ehrlichia spp.)，包含马埃立克体(E.equi)和人粒细胞埃立克体病的药剂；立克次氏体属(Rickettsia spp)，包含立氏立克次体(R.rickettsii)；衣原体属(Chlamydia spp.)，包含沙眼衣原体(C.trachomatis)(例如，MOMP、肝素结合蛋白)、肺炎衣原体(C.pneumoniae)(例如，MOMP、肝素结合蛋白)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)；钩端螺旋体属(Leptospiraspp.)，包含肾脏钩端螺旋体(L.interrogans)；密螺旋体属(Treponema spp.)，包含苍白密螺旋体(T.pallidum)(例如，罕见外膜蛋白)、齿垢密螺旋体(T.denticola)、痢疾密螺旋体(T.hyodysenteriae)；或其它细菌病原体。

在某些实施例中，本公开的药物组合物和疫苗组合物含有能够引发人或其它哺乳动物宿主的免疫应答的抗原或抗原组合物，其中所述抗原或抗原组合物可以包含衍生自一种或多种感染性病毒的组合物，如衍生自HIV-1(如tat、nef、gp120或gp160)、人类疱疹病毒(如gD或其衍生物，或即刻早期蛋白(如来自HSV1或HSV2的ICP27))、巨细胞病毒((特别是人类)(如gB或其衍生物)、轮状病毒(包含减毒活病毒)、爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein Barrvirus)(如gp350或其衍生物)、水痘带状疱疹病毒(如gpI、II和IE63)，或衍生自肝炎病毒如乙型肝炎病毒(例如，乙型肝炎表面抗原或其衍生物)、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒，或衍生自其它病原病毒如副粘病毒：呼吸道合胞体病毒(如F和G蛋白或其衍生物)、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头状瘤病毒(例如，HPV6、11、16、18等)、黄病毒(例如，黄热病病毒、登革病毒、蜱传脑炎病毒、日本脑炎病毒)、或流感病毒(全活病毒或灭活病毒、裂解流感病毒、鸡蛋中生长的细胞或MDCK细胞、或完整流感病毒(如由Gluck,《疫苗》,1992,10,915-920中所描述的)、或其纯化或重组蛋白如HA、NP、NA或M蛋白、或其组合)。

在某些其它实施例中，本公开的药物组合物和疫苗组合物含有能够引发人或其它哺乳动物宿主的免疫应答的抗原或抗原组合物，其中所述抗原或抗原组合物可以包含衍生自一种或多种寄生虫的组合物(参见例如，John,D.T.和Petri,W.A.,《Markell和Voge的医学寄生虫学(Markell and Voge's Medical Parasitology)》-第9版,2006,WB桑德斯出版社(Saunders),费城；Bowman,D.D.,《Georgis的兽医寄生虫学(Georgis'Parasitology forVeterinarians)》-第8版,2002,WB桑德斯出版社,费城)如疟原虫属(Plasmodium spp.)，包含恶性疟原虫(P.falciparum)；弓形虫属(Toxoplasma spp.)，包含刚地弓形虫(T.gondii)(例如，SAG2、SAG3、Tg34)；内阿米巴属(Entamoeba spp.)，包含溶组织内阿米巴(E.histolytica)；巴贝虫属(Babesia spp.)，包含果氏巴贝虫(B.microti)；锥体虫属(Trypanosoma spp.)，包含冈比亚布氏锥体虫(T.cruzi)；贾第虫属(Giardia spp.)，包含兰伯氏贾第虫(G.lamblia)；利什曼虫属(Leshmania spp.)，包含硕大利什曼虫(L.major)；肺囊虫属(Pneumocystis spp.)，包含卡氏肺囊虫(P.carinii)；毛滴虫属(Trichomonasspp.)，包含阴道毛滴虫(T.vaginalis)；或衍生自能够感染哺乳动物的蠕虫，如：(i)线虫感染(包含但不限于蠕形住肠线虫(Enterobius vermicularis)、人蛔虫(Ascarislumbricoides)、毛首鞭形线虫(Trichuris trichuria)、美洲板口线虫(Necatoramericanus)、十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale)、班氏吴策线虫(Wuchereriabancrofti)、马来丝虫(Brugia malay)、盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)、麦地那龙线虫(Dracanculus medinensis)、旋毛虫(Trichinella spiralis)和粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis))；(ii)吸虫感染(包含但不限于曼氏裂体吸虫(Schistosoma mansoni)、埃及裂体吸虫(Schistosoma haematobium)、日本裂体吸虫(Schistosoma japonicum)、湄公血吸虫(Schistosoma mekongi)、华支睾吸虫(Opisthorchis sinensis)、并殖吸虫属(Paragonimus sp)、肝片吸虫(Fasciolahepatica)、大拟片吸虫(Fasciola magna)、大片吸虫(Fasciola gigantica))；以及(iii)绦虫感染(包含但不限于牛带绦虫(Taenia saginata)和猪带绦虫(Taenia solium))。因此，某些实施例可以设想包含某种抗原的疫苗组合物，所述抗原衍生自裂体吸虫属(Schisostoma spp.)、曼氏裂体吸虫、埃及裂体吸虫、和/或日本裂体吸虫，或衍生自酵母菌如念珠菌属(Candida spp.)，包含白色念珠菌(C.albicans)；隐球菌属(Cryptococcusspp.)，包含新型隐球菌(C.neoformans)。

某些优选实施例设想衍生自至少一种感染性病原体的抗原，所述感染性病原体如细菌、病毒或真菌，包含：放线菌，如结核分枝杆菌或麻风分枝杆菌或另一种分枝杆菌；细菌，如以下属中的成员：埃希氏杆菌、沙门氏菌、奈瑟氏菌、包柔氏螺旋体、衣原体、梭菌或博德特氏菌；病毒，如单纯性疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV，如HIV-1或HIV-2)、流感病毒、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、冠状病毒(如SARS或MERS)、轮状病毒、诺如病毒、小核糖核酸病毒(如脊髓灰质炎病毒、肠病毒或柯萨奇病毒)、兽医病原体，例如，猫免疫缺陷病毒(FIV)、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、肝炎病毒、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、黄病毒病毒(如登革病毒、日本脑炎病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、波瓦桑病毒或蜱传脑炎病毒)、亨尼帕病毒(如亨德拉或尼帕病毒)、布尼亚病毒(如汉塔病毒或裂谷热病毒)、沙粒病毒(如拉沙病毒、胡宁病毒、马丘波病毒或瓜纳托病毒)、丝状病毒(如埃博拉病毒或马尔堡病毒)、狂犬病病毒(如狂犬病毒)、呼吸道合胞体病毒、人乳头状瘤病毒(HPV)和巨细胞病毒；真菌，如曲霉菌(Aspergillus)、芽生菌(Blastomyces)、球孢子菌(Coccidioides)和肺孢子菌(Pneumocysti)或酵母菌，包含念珠菌(Candida)种如白念珠菌(C.albicans)、光滑念珠菌(C.glabrata)、克柔念珠菌(C.krusei)、葡萄牙念珠菌(C.lusitaniae)、热带念珠菌(C.tropicalis)和近平滑念珠菌(C.Parapsilosis)；寄生虫，如原生动物，例如，疟原虫属，包含恶性疟原虫、间日疟原虫(P.vivax)、三日疟原虫(P.malariae)和卵形疟原虫(P.ovale)；或另一种寄生虫，如以下中的一种或多种：棘阿米巴(Acanthamoeba)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、管圆线虫(Angiostrongylus)、曼氏裂体吸虫、埃及裂体吸虫、日本裂体吸虫、隐孢子虫(Cryptosporidium)、钩虫(Ancylostoma)、溶组织内阿米巴、结肠内阿米巴(Entamoeba coli)、迪斯帕内阿米巴(Entamoeba dispar)、哈氏内阿米巴(Entamoeba hartmanni)、波氏内阿米巴(Entamoeba polecki)、班氏吴策线虫、贾第虫(Giardia)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)和利什曼虫(Leishmania)。在具体实施例中，抗原可以来自涉及结核病、流感、阿米巴病、HIV、肝炎或利什曼病的抗原或与其有关。

根据本公开，在某些方面，本文描述的药物组合物和疫苗组合物中包含的抗原不衍生自西尼罗病毒或不与其相关。在一些方面，所述抗原衍生自TB、HIV或疟疾或与其相关。

在一些实施例中，抗原是流感相关抗原。在一些实施例中，抗原是引起流感的抗原。在一些实施例中，抗原来自引起流感的病毒。在一个实施例中，抗原包括来自H5N1的血凝素(HA)。在一个实施例中，抗原包括来自H5N1的神经氨酸酶。

例如，在某些实施例中，抗原衍生自疏螺旋体属，抗原可以包含核酸、病原体衍生抗原或抗原制剂、重组产生的蛋白质或肽，以及嵌合融合蛋白。一个这种抗原是OspA。OspA可以是借助于其在宿主细胞中的生物合成的呈脂化形式的完全成熟蛋白质(Lipo-OspA)或者可以可替代地是非脂化衍生物。此类非脂化衍生物包含具有流感病毒的非结构蛋白的第一81个N-端氨基酸(NS1)的非脂化NS1-OspA融合蛋白和完整OspA蛋白，并且另一个MDP-OspA是非脂化形式的携带3个附加N-端氨基酸的OspA。

其它特异性抗原衍生自结核分枝杆菌，例如Th Ra12、Tb H9、Tb Ra35、Tb38-1、Erd14、DPV、MTI、MSL、mTTC2和hTCC1(WO 99/51748)。针对结核分枝杆菌的蛋白质还包含融合蛋白及其变体，其中结核分枝杆菌的至少两个、三个或四个或更多个多肽融合到更大蛋白质中。某些融合包含Ra12-TbH9-Ra35、Erd 14-DPV-MTI、DPV-MTI-MSL、Erd14DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erd 14-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、TbH9-DPV-MTI(WO 99151748)。可以使用的其它抗原包含在US 2010/0129391、WO 2008/124647和美国专利第8,486,414号中描述的抗原、抗原的组合和融合蛋白，所述文献通过引用的方式并且出于所有目的并入本文。在一个示例性实施例中，融合蛋白是ID93。在一个示例性实施例中，融合蛋白是ID91。在一个示例性实施例中，融合蛋白是ID97。

其它特异性抗原衍生自衣原体并且包含例如高分子量蛋白质(HWMP)(WO 99/17741)、ORF3(EP 366 412)和假定膜蛋白质(Pmp)。其它衣原体抗原可以选自WO 99128475中描述的组。某些抗原可以衍生自链球菌属(Streptococcus spp)，包含肺炎链球菌(S.pneumoniae)(例如，荚膜多糖及其缀合物、PsaA、PspA、链球菌溶血素、胆碱结合蛋白)和蛋白质抗原肺炎球菌溶血素(《生物化学与生物物理学学报(Biochem Biophys Acta)》,1989,67,1007；Rubins等人,《微生物发病机理(Microbial Pathogenesis)》25,337-342)及其突变体去毒衍生物(WO 90/06951；WO 99/03884)。其它细菌疫苗组合物包括衍生自嗜血杆菌属(Haemophilus spp.)的抗原，包含B型流感嗜血杆菌(H.influenzae)(例如，PRP及其缀合物)、不可分型的流感嗜血杆菌例如OMP26、高分子量黏附素、P5、P6、蛋白D和脂蛋白D、以及丝束蛋白和丝束蛋白衍生肽(美国专利第5,843,464号)或其多拷贝变体或融合蛋白。

其它特异性抗原衍生自乙型肝炎。乙型肝炎表面抗原的衍生物是本领域公知的并且尤其包含欧洲专利申请EP-A414 374；EP-A-0304 578和EP 198474中阐述、描述的那些PreS1、PreS2、S抗原。

在其它实施例中，抗原衍生自人乳头状瘤病毒(HPV)，所述HPV被认为是生殖器疣(HPV 6或HPV 11以及其它)的原由，并且HPV病毒是宫颈癌(HPV16、HPV18以及其它)的原由。特定抗原包含L1颗粒或衣壳体、以及包括选自HPV 6和HPV 11蛋白E6、E7、L1和L2的一种或多种抗原的融合蛋白。某些形式的融合蛋白包含如WO 96/26277中公开的L2E7和GB9717953.5(PCT/EP98/05285)中公开的蛋白D(1/3)-E7。另外的可能的抗原包含HPV 16、18、33、58抗原。例如，L1或L2抗原单体、或L1或L2抗原作为病毒样颗粒(VLP)一起呈现，或者单独的L1蛋白单独呈现在VLP或衣壳体结构中。此类抗原、病毒样颗粒和衣壳体是本身已知的。参见例如WO 94/00152、WO 94/20137、WO 94/05792和WO 93/02184。

在其它实施例中，抗原是融合蛋白。融合蛋白可以被单独包含或例如作为如E7、E2或F5等融合蛋白包含；特定实施例包含包括L1E7融合蛋白的VLP(WO 96/11272)。特定HPV16抗原包括早期蛋白E6或F7，其与蛋白D载剂融合以形成来自HPV 16的蛋白D-E6或E7融合物或其组合；或E6或E7与L2的组合(WO 96/26277)。可替代地，HPV 16或18早期蛋白E6和E7可以呈现为单个分子，例如蛋白D-E6/E7融合物。组合物可以任选地含有例如呈蛋白D-E6或蛋白D-E7融合蛋白或蛋白D E6/E7融合蛋白的形式的来自HPV 18的E6和E7蛋白中的任一者或两者。组合物另外可以包括来自其它HPV菌株(例如来自菌株HPV 31或33)的抗原。

抗原还可以衍生自引起疟疾的寄生虫。例如，来自恶性疟原虫(Plasmodiafalciparum)的抗原包含RTS,S和TRAP。RTS是杂合蛋白，所述杂合蛋白包括恶性疟原虫的环子孢子(CS)蛋白的基本上所有C-端部分，所述C-端部分通过乙型肝炎表面抗原的preS2部分的四个氨基酸与乙型肝炎病毒的表面(S)抗原连接。公开为WO 93/10152的要求英国专利申请第9124390.7号的优先权的国际专利申请第PCT/EP92/02591号中公开了其完整结构。当在酵母菌中表达时，RTS作为脂蛋白颗粒被产生，并且当与来自HBV的S抗原共表达时，其产生称为RTS,S的混合颗粒。

公开为WO 90/01496的国际专利申请第PCT/GB89/00895号中描述了TRAP抗原。本公开的实施例是疟疾疫苗，其中抗原制剂包括RTS,S和TRAP抗原的组合。可能是多级疟疾疫苗的组分的候选物的其它疟原虫抗原是恶性疟原虫MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、钳合蛋白、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27125、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230及其在疟原虫属中的类似物。

在一个实施例中，抗原衍生自癌细胞，因为可以用于癌症的免疫治疗性治疗。例如，抗原可以是肿瘤排斥抗原，如针对前列腺、乳房、结肠直肠、肺、胰腺、肾或黑色素瘤癌症的那些肿瘤排斥抗原。示例性癌症或癌细胞衍生的抗原包含MAGE 1、3和MAGE 4或其它MAGE抗原，如WO 99/40188中公开的那些抗原、PRAME、BAGE、Lage(也被称为NY Eos 1)、SAGE和HAGE(WO 99/53061)或GAGE(Robbins和Kawakami,1996,《免疫学前沿观点(CurrentOpinions in Immunology)》,8,第628到636页；Van den Eynde等人,《国际临床与实验室研究杂志(International Journal of Clinical&Laboratory Research)》(1997&1998)；Correale等人(1997),《国家癌症研究所杂志(Journal of the National CancerInstitute)》89,第293页。癌症抗原的这些非限制性实例表达于广泛范围的肿瘤类型中，如黑色素瘤、肺癌、恶性毒瘤和膀胱癌。参见例如美国专利第6,544,518号。

其它肿瘤特异性抗原包含但不限于肿瘤特异性或与肿瘤相关的神经节苷脂，如GM₂和GM₃或其与载体蛋白的缀合物；或自身肽激素，如可用于治疗许多癌症的全长促性腺激素释放激素(GnRH，WO 95/20600)、短10氨基酸长肽。在另一个实施例中，使用了前列腺抗原，如前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、PSCA(例如，《美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)》,95(4)1735-1740 1998)、PSMA，或在一个实施例中称为Prostase的抗原。(例如，Nelson等人,《美国国家科学院院刊》(1999)96:3114-3119；Ferguson等人,《美国国家科学院院刊》1999.96,3114-3119；WO 98/12302；美国专利第5,955,306号；WO 98/20117；美国专利第5,840,871号和第5,786,148号；WO 00/04149。其它前列腺特异性抗原是从WO 98/137418和WO/004149中已知的。另一个是STEAP(《美国国家科学院院刊》96 14523 14528 7-12 1999)。

用于本公开的上下文中的其它肿瘤相关抗原包含：Plu-1(《生物化学杂志(JBiol.Chem)》274(22)15633-15645,1999)、HASH-1、HasH-2、Cripto(Salomon等人,《生物测定(Bioessays)》199,21:61-70,美国专利第5,654,140号)和Criptin(美国专利第5,981,215号)。另外，尤其与癌症疗法的疫苗组合物相关的抗原还包括酪氨酸酶和生存素。

本文公开的实施例还可以包括将用于抵抗通过如HER-2/neu表达等肿瘤相关抗原表达表征的任何癌症的癌症抗原或者其它癌症特异性或癌症相关抗原。

可以通过广泛范围的本领域接受的方法中的任一种方法来完成对患有癌症或疑似有罹患癌症的风险的受试者的癌症的诊断，所述方法可以根据各种因素而变化，包含临床表现、癌症进展程度、癌症类型以及其它因素。癌症诊断的实例包含：对患者样品(例如，血液、皮肤活检、其它组织活检、外科手术样品等)的组织病理学、组织化学、免疫组织化学和免疫组织病理学检查；对定义的遗传(例如，核酸)标志物的PCR试验；对循环癌症相关抗原或承载此类抗原的细胞或者对具有定义的特异性的抗体的血清学试验；或本领域技术人员将熟悉的其它方法。参见例如美国专利第6,734,172号；第6,770,445号；第6,893,820号；第6,979,730号；第7,060,802号；第7,030,232号；第6,933,123号；第6,682,901号；第6,587,792号；第6,512,102号；第7,078,180号；第7,070,931号；JP5-328975；Waslylyk等人,1993《欧洲生物化学杂志(Eur.J.Bioch.)》211(7):18。

根据本公开的某些实施例的脂质体调配物、药物组合物和疫苗组合物以及方法还可以用于预防或治疗自身免疫疾病，所述自身免疫疾病包含其中宿主或受试者的免疫系统不利地介导针对“自身”组织、细胞、生物分子(例如，肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、蛋白脂质、脂质、糖脂、如RNA和DNA等核酸、寡糖、多糖、蛋白多糖、糖胺聚糖等等以及受试者细胞和组织的其它分子组分)或表位(例如，特定的免疫定义的识别结构，如由抗体可变区互补决定区(CDR)或由T细胞受体CDR识别的那些)的免疫应答的疾病、病况或病症。

因此，自身免疫疾病表征为涉及在任一情况下针对正常自体组织的细胞或抗体的异常免疫应答。通常将哺乳动物的自身免疫疾病分类为以下两种不同类别中的一种：细胞介导的疾病(即T细胞)或抗体介导的病症。细胞介导的自身免疫疾病的非限制性实例包含多发性硬化、类风湿性关节炎、桥本甲状腺炎、I型糖尿病(青少年型糖尿病)和自身免疫尿道炎(autoimmune uvoretinitis)。抗体介导的自身免疫病症包含但不限于重症肌无力、全身性红斑狼疮(或SLE)、格雷夫斯氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少、自身免疫性哮喘、冷球蛋白血症、血栓性血小板减少性紫癜、原发性胆道硬化症以及恶性贫血。与全身性红斑狼疮相关的一种或多种抗原是小核核糖核酸蛋白(snRNP)；与格雷夫斯氏病相关的一种或多种抗原是促甲状腺激素受体、甲状腺球蛋白以及甲状腺上皮细胞的其它组分(Akamizu等人,1996；Kellerman等人,1995；Raju等人,1997；以及Texier等人,1992)；与天疱疮相关的一种或多种抗原是钙粘素样天胞疮抗原，如桥粒芯蛋白3和其它粘附分子(Memar等人,1996:Stanley,1995；Plott等人,1994；和Hashimoto,1993)；并且与血栓性血小板减少性紫癜相关的一种或多种抗原是血小板的抗原。(参见例如美国专利第6,929,796号；Gorski等人(编辑),《自身免疫(Autoimmunity)》,2001,克吕维尔学术出版社(KluwerAcademic Publishers),诺维尔,马萨诸塞州；Radbruch和Lipsky,P.E.(编辑)《自身免疫与慢性炎症时论(微生物学和免疫学本期专题)(Current Concepts in Autoimmunity andChronic Inflammation(Curr.Top.Microbiol.and Immunol.))2001,施普林格出版社(Springer),纽约)。

在某些实施例中，本公开的组合物将特别适用于治疗老年人和/或免疫抑制患者，包含进行肾透析的受试者、进行化学治疗和/或放射治疗的受试者、移植受体等。此类个体对疫苗组合物通常展现出减弱的免疫应答，并且因此，使用本公开的组合物可以增强在这些受试者中实现的免疫应答。

在其它实施例中，本公开的组合物中使用的一种或多种抗原包含与呼吸道疾病(如因细菌感染(例如，肺炎球菌感染)引起或加剧的那些呼吸道疾病)相关的抗原，以用于预防和治疗如慢性阻塞性肺病(COPD)等病况。COPD在生理学上由患有慢性支气管炎和/或肺气肿的患者的不可逆或部分可逆气道阻塞的存在来定义(《美国呼吸与重症护理医学杂志(Am J Respir Crit.Care Med.)》,1995年11月；152(5Pt 2):S77-121)。COPD的加剧通常由细菌(例如，肺炎球菌)感染(《临床微生物综述(Clin Microbiol Rev.)》2001年4月；14(2):336-63)引起。

在优选实施例中，在药物组合物内含有脂质体调配物。在另一个优选实施例中，在疫苗组合物内含有脂质体调配物。在示例性实施例中，药物组合物包括脂质体调配物和抗原。在另一个示例性实施例中，疫苗组合物包括脂质体调配物和抗原。在一些此类示例性实施例中，抗原与感染性疾病、癌症或自身免疫疾病相关。在示例性实施例中，脂质体调配物和药物调配物可以用于治疗疾病，如感染性疾病、癌症或自身免疫疾病。在示例性实施例中，脂质体调配物和药物调配物可以用于引发患有疾病(如感染性疾病、癌症或自身免疫疾病)的哺乳动物(包含人)的增强的免疫应答。在此类实施例中，脂质体调配物和药物调配物可以或可以不进一步包括抗原和/或编码抗原的核酸。

根据本文公开的某些实施例，药物组合物和疫苗组合物可以代替包括抗原而包括编码抗原的核酸。例如，在实施例中，药物组合物和疫苗组合物可以含有至少一种重组表达构建体，所述重组表达构建体包括启动子，所述启动子与编码抗原的核酸序列可操作地连接。在某些另外的实施例中，重组表达构建体存在于病毒载体中，如腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒或逆转录病毒载体。用于制作和使用此类表达构建体和载体的组合物和方法是本领域已知的，用于表达如本文中提供的多肽抗原，例如根据Ausubel等人(编辑),《当代分子生物学实验手册(Current Protocols in Molecular Biology)》,2006约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons),纽约。重组表达构建体的非限制性实例通常可以见于例如以下中：美国专利第6,844,192号；第7,037,712号；第7,052,904号；第7,001,770号；第6,106,824号；第5,693,531号；第6,613,892号；第6,875,610号；第7,067,310号；第6,218,186号；第6,783,981号；第7,052,904号；第6,783,981号；第6,734,172号；第6,713,068号；第5,795,577号和第6,770,445号以及其它文献，其教导可以适用于本文提供的多肽抗原的表达，以用于某些当前公开的实施例。

除了皂苷和任选的脂多糖之外，本文所提供的组合物还可以包括至少一种另外的免疫刺激剂，所述皂苷和脂多糖通常在本发明的调配物和组合物中充当免疫刺激剂。免疫刺激剂是增强(enhance)或加强(potentiate)对抗原的免疫应答(抗体和/或细胞介导的)的任何物质。免疫刺激剂的实例包含佐剂、可生物降解的微球(例如，聚乳酸乳交酯)和脂质体(化合物掺入其中；参见例如，富勒顿(Fullerton)，美国专利第4,235,877号)。疫苗制剂通常在例如Powell和Newman编辑,《疫苗设计(Vaccine Design)》(亚基和佐剂法),(1995)中进行描述。

例如，并且通过背景(参见例如，美国专利第6,544,518号)，当通过全身和粘膜途径施用时，已知含有未甲基化的CpG二核苷酸(“CpG”)的免疫刺激性寡核苷酸是佐剂(WO96/02555，EP 468520，Davis等人,《免疫学杂志》,1998,160(2):870-876；McCluskie和Davis,《免疫学杂志》,1998,161(9):4463-6)。CpG是存在于DNA中的胞嘧啶-鸟苷二核苷酸基序的缩写。CG基序在免疫刺激中的核心作用由Krieg,《自然(Nature)》,374,p546 1995阐明。详细的分析已经示出，CG基序必须在特定的序列环境中，并且此类序列在细菌DNA中很常见，但在脊椎动物DNA中很少见。免疫刺激序列通常是：嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中二核苷酸CG基序未被甲基化，但已知其它未甲基化的CpG序列具有免疫刺激性，并且可以用于本公开的某些实施例中。当调配成疫苗组合物时，CpG可以在游离溶液中与游离抗原一起施用(WO 96/02555；McCluskie和Davis，上文)或共价缀合到抗原(PCT公开第WO 98/16247号)，或用如氢氧化铝等载剂进行调配(例如Davis等人,上文；Brazolot-Millan等人,《美国科学院院刊(Proc.NatLAcad.Sci.USA)》,1998,95(26),15553-8)。

用于本公开组合物中的其它说明性寡核苷酸通常含有两个或更多个由至少三个、更优选至少六个或更多个核苷酸分开的二核苷酸CpG基序。本公开的寡核苷酸通常是脱氧核苷酸。在一个实施例中，寡核苷酸中的核苷酸间是二硫代磷酸酯，或更优选地为硫代磷酸酯键，尽管磷酸二酯和其它核苷酸间键在本公开的范围内，包含具有混合核苷酸间键的寡核苷酸。用于产生硫代磷酸寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于美国专利第5,666,153号、第5,278,302号和W095/26204中。

寡核苷酸的其它实例具有在以下出版物中公开的序列；对于本文所公开的某些实施例，所述序列优选地含有硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键：

CPG 7909：Cooper等人,“CPG 7909佐剂改善抗逆转录病毒治疗的HIV感染的成人的乙型肝炎病毒疫苗血清保护(CPG 7909 adjuvant improves hepatitis B virusvaccine seroprotection in antiretroviral-treated HIV-infected adults)”,《艾滋病(AIDS)》,2005年9月23日；19(14):1473-9。

CpG 10101：Bayes等人,“通向临床试验(Gateways to clinical trials)”,《实验临床药理学中的方法和发现(Methods Find.Exp.Clin.Pharmacol.)》,2005年4月；27(3):193-219。Vollmer J.,“针对TLR9的免疫刺激性CpG寡脱氧核苷酸配体的药物开发进展(Progress in drug development of immunostimula-tory CpG oligodeoxynucleotideligands for TLR9)”,《生物疗法的专家意见(Expert Opinion on BiologicalTherapy)》,2005年5月；5(5):673-682。

替代性CpG寡核苷酸可以包括上述公开物中描述的序列的变体，不同之处在于其具有对其进行的无关紧要的核苷酸序列取代、插入、缺失和/或添加。本公开的某些实施例中利用的CpG寡核苷酸可以通过本领域已知的任何方法合成(例如，EP 468520)。方便地，此类寡核苷酸可以利用自动合成器合成。寡核苷酸通常是脱氧核苷酸。在优选实施例中，寡核苷酸中的核苷酸间键是二硫代磷酸酯或更优选地硫代磷酸酯键，尽管磷酸二酯也在当前设想的实施例的范围内。还设想了包括不同核苷酸间键的寡核苷酸，例如，混合的硫代磷酸酯磷酸二酯。还可以使用稳定寡核苷酸的其它核苷酸间键。

B.载剂和赋形剂

本公开的药物组合物和疫苗组合物可以使用各种公知的程序中的任何一种程序来调配。在某些实施例中，药物组合物和疫苗组合物被制备成稳定的乳液(例如，水包油乳液)或水溶液。

在某些应用中，本文公开的组合物可以通过对受试者口服施用来递送。因此，这些组合物可以与惰性稀释剂或与易食用的载剂一起调配，或其可以被密封在硬壳或软壳明胶胶囊中，或其可以被压制成片剂，或其可以直接掺入饮食的食品中。

在某些情况下，如例如在美国专利第5,543,158号；美国专利第5,641,515号和美国专利第5,399,363中所描述的(所述美国专利中的每一个具体地通过引用整体并入本文)，期望在肠胃外、皮下、静脉内、皮内、肌肉内或甚至腹膜内递送本文所公开的组合物。可以在适当地混合有如羟基丙基纤维素等表面活性剂的水中制备以游离碱或药学上可接受的盐的形式存在的活性化合物的溶液。还可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中以及在油中制备分散体。在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有用于防止微生物生长的防腐剂。

适于注射使用的药物组合物形式包含无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末(美国专利第5,466,468号，所述美国专利具体地通过引用以其整体并入本文)。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且必须具有达到容易注射的程度的流动性。其必须在制造和存储条件下保持稳定，并且必须防止如细菌和真菌等微生物的污染作用。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。恰当的流动性可以例如通过使用如卵磷脂等包衣、通过在分散体的情况下维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)可以促进防止微生物的作用。在许多情况下，将优选的是包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)延长可注射组合物的吸收。

例如，对于在水溶液中的肠胃外施用，如果需要，所述溶液应当被适当地缓冲，并且液体稀释剂首先用足够的生理盐水或葡萄糖进行等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。就此而言，鉴于本公开，本领域技术人员将知道可以采用的无菌水性介质。例如，可以将一个剂量溶解在1ml的等渗NaCl溶液中，并且添加到1000ml的皮下输液流体或在打算输注的部位进行注射(参见例如，《雷明顿药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)》,第15版,第1035页到1038页和第1570页到1580页)。剂量的一些变化必然会根据正在治疗的受试者的病况而发生。在任何情况下，负责施用的人将确定用于个体受试者的适当剂量。此外，对于人类施用，制剂应满足FDA生物制品标准办公室所要求的无菌性、产热原性以及一般的安全性和纯度标准。

通过将活性化合物以所需的量根据需要与以上枚举的各种其它成分一起掺入适当的溶剂中、然后进行过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入到无菌媒剂中来制备分散体，所述无菌媒剂含有基础分散介质以及来自以上枚举的那些的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空-干燥和冷冻-干燥技术，所述真空-干燥和冷冻-干燥技术从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分加上任何另外的期望成分的粉末。

本文所公开的组合物可以以中性或盐形式调配。药学上可接受的盐包含与如例如盐酸或磷酸等无机酸或如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有机酸形成的(与蛋白质的游离氨基形成的)酸加成盐。与游离羧基形成的盐还可以衍生自如例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁等无机碱以及如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等有机碱。在调配后，溶液将以与剂量调配物相容的方式施用，并以对麻风病治疗有效的量施用。调配物可以以如可注射溶液、药物释放胶囊等各种剂型容易地施用。

如本文所使用的，“载剂”包含任何和所有溶剂、分散介质、媒剂、涂层、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载剂溶液、悬浮液、胶质物等。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域普通技术人员公知的。除了任何常规介质或药剂与所述活性成分不相容的情况之外，设想其在治疗性组合物中的用途。补充性活性成分也可以掺入到组合物中。

短语“药学上可接受的”是指当向人类施用时不会产生不可接受的过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。含有作为活性成分的蛋白质的水性组合物的制备是本领域普通技术人员所理解的。通常，将此类组合物制备为可注射的液体溶液或悬浮液；也可以制备适于在注射之前溶于或悬浮于液体的固体形式。所述制剂也可以被乳化。

在某些实施例中，本公开的组合物可以通过鼻内喷雾、吸入和/或其它气溶胶递送载剂来递送。例如，在美国专利第5,756,353号和美国专利第5,804,212号(所述美国专利具体地通过引用以其整体并入本文)中已经描述了通过鼻喷雾剂将基因、多核苷酸和肽组合物直接递送到肺部的方法。同样地，使用鼻内微粒树脂(Takenaga等人,1998)和溶血磷脂酰甘油化合物(美国专利第5,725,871号，具体地通过引用以其整体并入本文)递送药物在制药领域也是公知的。同样地，美国专利第5,780,045号(具体地通过引用以其整体并入本文)中描述了采用聚四氟乙烯载体基质形式的经粘膜药物递送。

药物组合物或疫苗组合物可以可替代地含有免疫刺激剂和编码一个或多个如以上所描述的多肽或融合多肽的DNA分子，使得原位生成所期望的多肽。在此类组合物中，编码融合蛋白的DNA可以存在于本领域普通技术人员已知的各种递送系统中的任何递送系统内，包含核酸表达系统、细菌系统和病毒表达系统。适当的核酸表达系统含有在患者体内表达所需的DNA序列(如合适的启动子和终止信号)。细菌递送系统涉及施用在其细胞表面上表达多肽的免疫原性部分的细菌(如卡介苗(Bacillus-Calmette-Guerrin))。在特定实施例中，可以使用病毒表达系统(例如，痘苗病毒或其它痘病毒、逆转录病毒或腺病毒)引入所述DNA，这可能涉及使用非致病性(缺陷性)有复制能力的病毒(replication competentvirus)。将DNA掺入到此类表达系统的技术是本领域普通技术人员公知的。DNA还可以是“裸的”，如例如，在Ulmer等人,《科学(Science)》259:1745-1749(1993)中所描述的并且通过Cohen,《科学》259:1691-1692(1993)所综述的。裸DNA的摄取可以通过将DNA包被到可生物降解的珠粒上来增加，所述珠粒被高效地运输到细胞中。

C.试剂盒和制品

在某些实施例中还设想了含有本文所描述的脂质体调配物、药物组合物和疫苗组合物的试剂盒，所述试剂盒可以在一个或多个容器中提供。在一个实施例中，脂质体调配物的所有组分一起存在于单个容器中。在某些实施例中，药物组合物的所有组分一起存在于单个容器中。在某些实施例中，疫苗组合物的所有组分一起存在于单个容器中。在其它实施例中，药物组合物和疫苗组合物的组分可以在两个或更多个容器中。在优选实施例中，脂质体调配物在一个容器中提供，并且抗原在另一个容器中提供。

本公开的试剂盒可以进一步包括如本文所描述的使用的说明或用于混合小瓶中容纳的材料的说明。在一些实施例中，小瓶中的材料是干燥的或冻干的。在一些实施例中，小瓶中的材料是液体。

根据此类试剂盒实施例的容器可以是任何适合的容器、器皿、小瓶、安瓿、管、杯、箱、瓶、烧瓶、广口瓶、碟、单孔或多孔设备的孔、储器、罐等等、或本文所公开的组合物可以放置、储存和/或运输并进入其中以去除内含物的其它装置。通常，此类容器可以由兼容有预期用途并且可以容易地实现对所容纳的内含物的恢复的材料制成。此类容器的非限制性实例包含玻璃和/或塑料密封或可再密封管和安瓿，包含具有橡胶隔片或其它密封装置的那些，所述橡胶隔片或其它密封装置与使用针和注射器取出内含物相容。此类容器可以例如由玻璃或者化学上兼容的塑料或树脂制成，所述化学上兼容的塑料或树脂可以由某种材料制成或可以涂覆有所述材料，所述材料允许从容器高效地恢复材料和/或保护材料免于例如降解条件(如紫外线或温度极限)或免于引入包含微生物污染物的不需要的污染物。容器优选地是无菌的或可灭菌的，并且由将与任何载剂、赋形剂、溶剂、媒剂等相容的材料制成，如可以用于悬浮或溶解本文描述的疫苗组合物和/或免疫佐剂组合物和/或抗原和/或重组表达构建体等。

V.制备本公开的组合物的方法

本发明人已经有利地发现，含皂苷的脂质体可以由将皂苷(和任选的LPS)与预先形成的脂质体混合以产生本文所描述的调配物的方法来制备。

如本文所提供的，一种制备示例性脂质体调配物的方法涉及将LPS与DOPC和胆固醇以4比1的磷脂:胆固醇重量比混合。在真空下蒸发氯仿并用磷酸盐缓冲液水合薄膜之前在氯仿存在下在圆底玻璃烧瓶中执行混合步骤。在某些实施例中，LPS是SLA。在示例性实施例中，LPS是GLA。在一些实施例中，进一步的步骤包含水浴超声处理(对于10ml的比例)或高压均质化(对于>100ml的比例)，以将粒径均匀地减小到纳米(nm)尺寸(基于DLS测量结果的70-130nm的平均粒径)。高压均质化可以在20,000psi、10-15℃和5次均质化过程下使用微流体学110EH或110P微射流机模型进行。

在某些实施例中，QS21通过粗皂苷混合物Quil-A的HPLC纯化获得。在优选实施例中，在无菌过滤之前，可以将QS21单独地溶解在磷酸盐缓冲液中，并且然后混合到已制备的含有LPS和胆固醇的脂质体中。在示例性实施例中，最终制造的产物用0.22μm的过滤器(密理博公司Steripak GP10)进行过滤灭菌，并含有4mg/mL的DOPC、1mg/mL的胆固醇，20μg/ml的GLA和8mg/ml的QS21。可以通过在施用前将脂质体调配物与抗原以1比1的比率混合来制备药物组合物或疫苗组合物。制造后，可以将调配物在5℃下储存，并且放置在稳定性监测程序中，所述稳定性监测程序包含在制造时以及在制造日期后1周、2周、1个月、3个月、6个月、12个月等对粒径(通过DLS)和视觉外观进行测量。另外，LPS和QS21浓度可以在制造时以及在制造日期后6个月、12个月等使用带电气溶胶检测(CAD)通过HPLC测量。在一些实施例中，本文所描述的脂质体调配物储存在较高温度(25℃、37℃和60℃)下，以用于加速稳定性监测。

VI.引发或增强免疫应答的方法

本文提供了在受试者中引发或增强免疫应答的方法，包含向有需要的受试者施用本文所描述的脂质体调配物、药物组合物或疫苗组合物的步骤。在一些实施例中，调配物或组合物进一步包括抗原，其中抗原是多肽抗原或编码多肽抗原的核酸分子。在一些此类实施例中，调配物或组合物适于与多肽抗原或编码多肽抗原的核酸分子混合

在本文所提供的实施例中，受试者是哺乳动物(例如，包含农场动物(牛、猪、山羊、马等)的动物、宠物(猫、狗等)、以及啮齿动物(大鼠、小鼠等)或人类)。在一个实施例中，所述受试者是人。在另一个实施例中，所述受试者是非人类哺乳动物。在另一个实施例中，所述非人类哺乳动物是狗、牛或马。

在示例性实施例中，将本文所公开的脂质体调配物掺入到疫苗组合物中。本文所描述的脂质体调配物可以用于引发或增强受试者的免疫应答(包含非特异性应答和抗原特异性应答)。在一些实施例中，所述免疫应答包括全身性免疫应答。在一些实施例中，所述免疫应答包括粘膜免疫应答。引发或增强免疫应答包含刺激免疫应答和促进免疫应答。

因此，本公开提供了用于更改(例如，以统计学上显著的方式例如相对于如对于本领域技术人员将熟悉的适当对照物增加或减少)能够产生免疫应答的宿主的免疫应答的组合物。如本领域普通技术人员将知道的，免疫应答可以是宿主的免疫状态的任何主动变更，所述主动变更可以包含参与宿主免疫状态的维护和/或调节的一个或多个组织、器官、细胞或分子的结构或功能的任何变更。通常，免疫应答可以通过各种公知的参数中的任何参数检测到，包含但不限于以下的体内或体外确定：可溶性免疫球蛋白或抗体；如细胞因子、淋巴因子、趋化因子、激素、生长因子等可溶性介体等，以及其它可溶性小肽、碳水化合物、核苷酸和/或脂质介体；如通过免疫系统的细胞的更改的功能或结构性质确定的细胞活化状态变化，例如细胞增殖、更改的能动性、如特异性基因表达或细胞溶解行为等特异化活动的诱导；免疫系统的细胞的细胞分化，包含更改的表面抗原表达谱或细胞凋亡(程序性细胞死亡)的发生；或可以检测到免疫应答的任何其它标准。因此，所述调配物可以起到增强和/或诱导抗体产生的作用(例如，诱导中和抗体的产生；增强抗原特异性抗体应答)。

免疫应答通常可以例如被宿主免疫系统的细胞和组织看作自身结构与非自身结构之间在分子或细胞等级的区别，但是本公开不应如此限制。例如，免疫应答还可以包含由自身分子、细胞或组织的免疫识别产生的免疫系统状态变化，如可能伴随任何数量的正常状况，如免疫系统组分的典型调节，或如可能存在于病理状况中，如在自动免疫和退行性疾病中观察到的不适当的自动免疫应答。作为另一个实例，除了通过上调特定免疫系统活性(如抗体和/或细胞因子产生或激活细胞介导的免疫)来诱导之外，免疫应答还可以包含可能是所选抗原的结果、抗原施用的途径、特异性耐受性诱导或其它因素的抑制、衰减或对可检测免疫的任何其它下调。

可以通过本领域普通技术人员将容易熟悉的多个公知的免疫学测定中的任何测定来建立对由本公开的疫苗组合物诱导的免疫应答的确定。此类测定包含但不限于以下的体内或体外确定：可溶性抗体；如细胞因子、淋巴因子、趋化因子、激素、生长因子等可溶性介体等，以及其它可溶性小肽、碳水化合物、核苷酸和/或脂质介体；如通过免疫系统的细胞的更改的功能或结构性质确定的细胞活化状态变化，例如细胞增殖、更改的能动性、如特异性基因表达或细胞溶解行为等特异化活动的诱导；免疫系统的细胞的细胞分化，包含更改的表面抗原表达谱或细胞凋亡(程序性细胞死亡)的发生。用于执行这些和类似测定的程序是广泛已知的并且可以参见于例如Lefkovits(《免疫学方法手册：综合技术资料(Immunology Methods Manual:The Comprehensive Sourcebook of Techniques)》,1998；还参见《免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)；还参见例如Weir,《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》,1986布莱克威尔科学出版社(Blackwell Scientific),波士顿,马萨诸塞州；Mishell和Shigii(编辑)《细胞免疫学选定方法(Selected Methods in Cellular Immunology)》,1979费里曼出版社(FreemanPublishing),旧金山,加利福尼亚州；Green和Reed,1998《科学》,281:1309以及其中引用的参考文献)。

可以通过各种已知技术来完成对抗原反应性T细胞的增殖的检测。例如，可以通过测量DNA合成速率来检测T细胞增殖，并且可以通过控制候选抗原反应性T细胞所暴露的刺激物(如，特异性期望抗原或对照抗原脉冲的抗原呈递细胞)来确定抗原特异性。已经受刺激发生增殖的T细胞展现出增加的DNA合成速率。用于测量DNA合成速率的典型方式是例如通过用氚化胸腺嘧啶来脉冲标记T细胞的培养物，所述氚化胸腺嘧啶是并入新合成的DNA中的核苷前体。可以使用液体闪烁分光光度计来确定合并的氚化胸腺嘧啶的量。用于检测T细胞增殖的其它方式包含测量白介素-2(IL-2)产量、Ca²⁺流量或上染率的增加，如3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-联苯-四唑。可替代地，可以测量淋巴因子(如干扰素-γ)的合成，或可以量化可以对特定抗原进行应答的T细胞的相对数量。

可以例如通过测定来自使用如放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、平衡渗析法或包含蛋白印迹法的固相免疫印迹法等体外方法用根据本公开的疫苗治疗的宿主的样品(例如，含免疫球蛋白样品，如血清、血浆和血液)来实现对抗原特异性抗体产生的检测。在优选实施例中，ELISA测定可以进一步包含用对抗原具有特异性的固相单克隆抗体来对靶抗原进行抗原捕获固定例如以增强测定的灵敏度。还可以例如使用可从商业来源(例如，西格玛公司(Sigma),圣路易斯(St.Louis),密苏里州(Mo.)；还参见《R&D Systems公司2006年目录(R&D Systems 2006Catalog)》,R&D Systems公司,明尼阿波里斯市(Minneapolis)，明尼苏达州(MN))容易获得的方法、设备和试剂、通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来容易地确定对可溶介体(例如，细胞因子、趋化因子、淋巴因子、前列腺素)的精化。

评估本文所公开的药物组合物或疫苗组合物的免疫原性的另一种方式，其中核酸分子编码蛋白抗原以表达用于通过免疫印迹和/或微阵列筛选患者血清或粘膜分泌物的重组蛋白抗原。蛋白与患者样品之间的阳性反应表明患者对所讨论的蛋白质已经产生了免疫应答。此方法还可以用于鉴定免疫显性抗原和/或蛋白抗原内的表位。

可以使用本领域所公知的常规测定来监测任何数量的其它免疫学参数。这些常规测定可以包含例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定、第二抗体体外应答、使用已经建立的标志物抗原系统对各种外周血或淋巴单核细胞亚群的流式免疫细胞荧光分析、免疫组织化学或其它相关测定。这些和其它测定可以见于例如，Rose等人(编辑),《临床实验室免疫学手册(Manual of Clinical Laboratory Immunology)》,第5版,1997美国微生物学学会(American Society of Microbiology),华盛顿特区(Washington,DC)。

因此，设想的是，本文所提供的疫苗组合物将能够引发或增强宿主的选自以下的至少一个免疫应答：T_Hl-型T淋巴细胞应答、T_H2-型T淋巴细胞应答、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答、抗体应答、细胞因子应答、淋巴因子应答、趋化因子应答以及炎症应答。在某些实施例中，免疫应答可以包括以下中的至少一种：产生一个或多个细胞因子，其中细胞因子选自干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；产生一个或多个白介素，其中白介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-16、IL-18和IL-23；产生一个或多个趋化因子，其中趋化因子选自MIP-1α、MIP-1β、RANTES、CCL4和CCL5；以及选自记忆T细胞应答、记忆B细胞应答、效应子T细胞应答、细胞毒性T细胞应答和效应子B细胞应答的淋巴细胞应答。参见例如，WO94/00153；WO 95/17209；WO 96/02555；美国专利第6,692,752号；美国专利第7,084,256号；美国专利第6,977,073号；美国专利第6,749,856号；美国专利第6,733,763号；美国专利第6,797,276号；美国专利第6,752,995号；美国专利第6,057,427号；美国专利第6,472,515号；美国专利第6,309,847号；美国专利第6,969,704号；美国专利第6,120,769号；美国专利第5,993,800号；美国专利第5,595,888号；Smith等人,1987《生物化学期刊(J Biol Chem.)》262:6951；Kriegler等人,1988《细胞(Cell)》53:45 53；Beutler等人,1986《自然》320:584；美国专利第6,991,791号；美国专利第6,654,462号；美国专利第6,375,944号。

本文所提供的组合物的功效还可以通过用所关注的病原体感染攻击适当的动物模型在体内测定。

本文所描述的组合物可以用于增强针对一种或多种细菌病原体的保护性免疫，所述细菌病原体如奈瑟氏球菌属，包含淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌(例如，荚膜多糖及其缀合物、转铁结合蛋白、乳铁蛋白结合蛋白、PilC、粘附素)；化脓性链球菌(例如，M蛋白或其片段、C5A蛋白酶、脂磷壁酸)、无乳链球菌、变形链球菌；杜克嗜血杆菌；莫拉菌属，包含卡他莫拉菌，其也被称为粘膜炎布兰汉球菌(例如，高分子量和低分子量黏附素和侵袭素)；博德特氏菌属，包含百日咳博德特氏菌(例如，百日咳杆菌粘附素、百日咳毒素或其衍生物、丝状血凝素、腺苷酸环化酶、菌毛)、副百日咳博德特氏菌和支气管炎博德特氏菌；分支杆菌属，包含结核分支杆菌(例如，ESAT6、抗原85A、-B或-C)、牛分枝杆菌、麻风分枝杆菌、鸟分枝杆菌、副结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌；军团菌属，包含嗜肺军团菌；埃希氏杆菌属，包含肠毒性大肠杆菌(例如，定居因子、不耐热毒素或其衍生物、耐热毒素或其衍生物)、肠出血性大肠肝菌、肠致病性大肠杆菌(例如，志贺样毒素或其衍生物)；弧菌属，包含霍乱弧菌(V.cholera)(例如，霍乱毒素或其衍生物)；志贺菌属，包含索氏志贺菌、痢疾志贺菌、弗氏志贺菌；耶尔森菌属，包含小肠结肠炎耶尔森氏菌(例如，Yop蛋白)、鼠疫耶尔森菌、假结核病耶尔森菌；弯曲菌属，包含空肠弯曲菌(例如，毒素、黏附素和侵袭素)和大肠弯曲菌；沙门氏菌属，包含伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌；李斯特菌属，包含产单核细胞李斯特菌；螺杆菌属，包含幽门螺杆菌(例如，尿素酶、过氧化氢酶、空泡毒素)；假单胞菌属，包含铜绿假单胞菌；葡萄球菌属，包含金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌；肠球菌属，包含粪肠球菌、屎肠球菌；梭菌属，包含破伤风梭菌(例如，破伤风毒素及其衍生物)、肉毒梭菌(例如，肉毒毒素及其衍生物)、艰难梭菌(例如，梭菌毒素A或B及其衍生物)；芽孢杆菌属，包含炭疽芽孢杆菌(例如，肉毒杆菌毒素及其衍生物)；棒状杆菌属，包含白喉棒状杆菌(例如，白喉毒素及其衍生物)；疏螺旋体属，包含伯氏疏螺旋体(例如，OspA、OspC、DbpA、DbpB)、伽氏疏螺旋体(例如，OspA、OspC、DbpA、DbpB)、埃氏疏螺旋体(例如，OspA、OspC、DbpA、DbpB)、安德森疏螺旋体(例如，OspA、OspC、DbpA、DbpB)、赫姆斯疏螺旋体；埃立克体属，包含马埃立克体和人粒细胞埃立克体病的药剂；立克次氏体属，包含立氏立克次体；衣原体属，包含沙眼衣原体(例如，MOMP、肝素结合蛋白)、肺炎衣原体(例如，MOMP、肝素结合蛋白)、鹦鹉热衣原体；钩端螺旋体属，包含肾脏钩端螺旋体；密螺旋体属，包含苍白密螺旋体(例如，罕见外膜蛋白)、齿垢密螺旋体、痢疾密螺旋体；或其它细菌病原体。

本文所描述的组合物可以用于增强针对病毒的保护性免疫。此类病毒和病毒抗原包含，例如，HIV-1(如tat、nef、gpl20或gpl60)、人类疱疹病毒(如gD或其衍生物或即刻早期蛋白如来自HSV1或HSV2的ICP27)、巨细胞病毒(尤其是人类、如gB或其衍生物)、轮状病毒(包含减毒活病毒)、爱泼斯坦-巴尔病毒(如gp350或其衍生物)、水痘带状疱疹病毒(如gpI、II和IE63)、或衍生自肝炎病毒如乙型肝炎病毒(例如，乙型肝炎表面抗原或其衍生物)、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒、或衍生自其它病原病毒如副粘病毒：呼吸道合胞体病毒(如F和G蛋白或其衍生物)、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头状瘤病毒(例如，HPV6、11、16、18等)、黄病毒(例如，登革病毒、日本脑炎病毒、黄热病毒、

塞卡病毒、玻瓦桑病毒、蜱传脑炎病毒)或流感病毒(全活病毒或灭活病毒、裂解流感病毒、鸡蛋中生长的细胞或MDCK细胞、或完整流感病毒(如由Gluck,《疫苗》,1992,10,915-920中所描述的)、或其纯化或重组蛋白如HA、NP、NA或M蛋白、或其组合)。根据本公开，本文所描述的组合物不会引发或增强针对西尼罗病毒的保护性免疫。

本文所描述的组合物可以用于增强针对一种或多种寄生虫的保护性免疫(参见例如，John,D.T.和Petri,W.A.,《Markell和Voge’s的医学寄生虫学》-第9版,2006,WB桑德斯出版社,费城；Bowman,D.D,《Georgis的兽医寄生虫学》-第8版,2002,WB桑德斯出版社,费城)如疟原虫属，包含恶性疟原虫；弓形虫属，包含刚地弓形虫(例如，SAG2、SAG3、Tg34)；内阿米巴属，包含溶组织内阿米巴；巴贝虫属，包含果氏巴贝虫；锥体虫属，包含冈比亚布氏锥体虫；贾第虫属，包含兰伯氏贾第虫；利什曼虫属，包含硕大利什曼原虫；肺囊虫属，包含卡氏肺囊虫；毛滴虫属，包含阴道毛滴虫；或衍生自能够感染哺乳动物的蠕虫，如：(i)线虫感染(包含但不限于蠕形住肠线虫、人蛔虫、毛首鞭形线虫、美洲板口线虫、十二指肠钩虫、班氏吴策线虫、马来丝虫、盘尾丝虫、麦地那龙线虫、旋毛虫和粪类圆线虫)；(ii)吸虫感染(包含但不限于曼氏裂体吸虫、埃及裂体吸虫、日本裂体吸虫、湄公血吸虫、华支睾吸虫、并殖吸虫属、肝片吸虫、大拟片吸虫、大片吸虫)；以及(iii)绦虫感染(包含但不限于牛带绦虫和猪带绦虫)。在某些实施例中，抗原衍生自血吸虫属、曼氏裂体吸虫、埃及裂体吸虫、和/或日本裂体吸虫，或衍生自酵母菌如念珠菌属，包含白色念珠菌；隐球菌属，包含新型隐球菌；如细菌、病毒或真菌等感染性病原体，包含放线菌，如结核分枝杆菌或麻风分枝杆菌或另一种分枝杆菌；细菌，如沙门氏菌属、奈瑟氏球菌、包柔氏螺旋体、衣原体或博代氏杆菌的成员；病毒，如单纯性疱疹病毒、人体免疫缺陷病毒(HIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、肝炎病毒、EB病毒(EBV)、寨卡病毒(ZIKV)、呼吸道合胞体病毒、人乳头状瘤病毒(HPV)和巨细胞病毒；HIV，如HIV-1或HIV-2；真菌，如曲霉菌、芽生菌、球孢子菌和肺孢子菌或酵母菌，包含念珠菌属，如白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、葡萄牙念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌；寄生虫，如原生动物，例如，疟原虫属，包含恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫；或另一种寄生虫，如以下一种或多种：棘阿米巴、溶组织内阿米巴、管圆线虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、日本血吸虫、隐孢子虫、钩虫、溶组织内阿米巴、结肠内阿米巴、迪斯帕内阿米巴、哈氏内阿米巴、波氏内阿米巴、班氏线虫、贾第虫和利什曼虫。

本文所描述的组合物可以用于增强针对至少一种衍生自癌症的抗原的保护性免疫，所述癌症包含腺癌、脉络膜恶性黑色素瘤、急性白血病、听神经瘤、壶腹癌、肛门癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胰腺癌、膀胱癌、支气管癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、宫体癌、CUP综合征(未知原发癌)、结肠直肠癌、小肠癌、小肠肿瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌类型、尤因瘤、胃肠肿瘤、胃癌(gastric cancer)、胆囊癌(gallbladder cancer)、胆囊癌(gall bladder carcinomas)、子宫癌、宫颈癌(cervicalcancer)、子宫颈、胶质母细胞瘤、妇科肿瘤、耳、鼻和喉肿瘤、血液肿瘤、毛细胞白血病、尿道癌、皮肤癌、皮肤睾丸癌、脑肿瘤(神经胶质瘤)、脑转移瘤、睾丸癌、垂体肿瘤、类癌、卡波西肉瘤、喉癌、生殖细胞肿瘤、骨癌、结肠直肠癌、头颈部肿瘤(耳、鼻和喉区域的肿瘤)、结肠癌、颅咽管瘤、口腔癌(口腔区和嘴唇上的癌症)、中枢神经系统癌症、肝癌、肝转移瘤、白血病、眼睑肿瘤、肺癌、淋巴结癌(霍奇金氏/非霍奇金氏)、淋巴瘤、胃癌(stomach cancer)、恶性黑色素瘤、恶性肿瘤、胃肠道恶性肿瘤、乳腺癌、直肠癌、髓母细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、霍奇金病、蕈样肉芽肿、鼻癌、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、肾癌、肾细胞癌、非霍奇金氏淋巴瘤、少突胶质细胞瘤、食管癌、溶骨性癌和骨形成性癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、浆细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、前列腺癌、咽癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、阴道癌、甲状腺癌、施内伯格氏病、食道癌、脊柱瘤(spinalioms)、T细胞淋巴瘤(蕈样肉芽肿)、胸腺瘤、尿道癌、泌尿肿瘤、尿路上皮癌、外阴癌和宫颈癌(cervical carcinoma)。

本文所描述的组合物可以用于增强针对一种或多种衍生自自身免疫疾病的抗原的保护性免疫，所述自身免疫疾病如多发性硬化、类风湿性关节炎、桥本甲状腺炎、I型糖尿病(青少年型糖尿病)和自身免疫性眼色素视网膜炎(autoimmune uvoretinitis)。抗体介导的自身免疫性病症包含但不限于重症肌无力、全身性红斑狼疮(或SLE)、格雷夫斯氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少、自身免疫性哮喘、冷球蛋白血症、血栓性血小板减少性紫癜、原发性胆道硬化症以及恶性贫血。

脂质体调配物、药物组合物和疫苗组合物的典型施用途径包含但不限于口服、局部、肠胃外、舌下、口腔、直肠、阴道、静脉内、皮内、透皮、鼻内、粘膜内或皮下。在一些示例性实施例中，脂质体调配物、药物组合物和疫苗组合物的施用是肌内、眼部、肠胃外或肺部。

在优选实施例中，本文所描述的脂质体调配物、本文所描述的药物组合物和本文所描述的疫苗组合物的施用方法引发或增强受试者的免疫应答。

在优选实施例中，本文所描述的脂质体调配物、本文所描述的药物组合物和本文所描述的疫苗组合物的施用方法引发或增强患有癌症、感染性疾病或的受试者的自身免疫疾病免疫应答。

在示例性实施例中，本文所描述的脂质体调配物、本文所描述的药物组合物和本文所描述的疫苗组合物的施用方法引发或增强患有癌症、感染性疾病或自身免疫疾病的人类受试者的免疫应答。

还应理解的是，本公开的治疗方法可以包含单独或与其它药剂结合施用本公开的组合物，并且因此，治疗性疫苗可以是作为更广泛的治疗方案的一部分的多个治疗组分之一。

上述各种实施例可以被组合以提供进一步的实施例。本说明书中提及的和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物均通过引用以其整体并入本文。这些实施例的多个方面可根据需要进行修改以使用不同专利、申请和公开的概念来提供另外的实例。

实例

实例1：用于脂质体调配物GLA-LSQ的合成方法(例如，GLA*或SLA作为LPS)，Q21作为皂苷，胆固醇作为固醇，并且二油酰基磷脂酰胆碱作为磷脂，并且GLA*-LSQ调配物或SLA-LSQ调配物的皂苷与固醇重量比为1:125。

为了制造示例性GLA*-LSQ或SLA-LSQ脂质体调配物，在真空下蒸发氯仿并用磷酸盐缓冲液水合薄膜之前，首先在玻璃圆底烧瓶中将GLA*或SLA与二油酰基磷脂酰胆碱和胆固醇(4:1磷脂:胆固醇w:w比率)在氯仿中混合。水浴超声处理(对于10ml的比例)或高压均质化(对于>100ml的比例)将粒径均匀地减小到纳米尺寸(基于动态光散射[DLS]的70-130nm平均大小)。高压均质化在20,000psi、10-15℃和5次均质化过程下使用微流体学110EH或110P微射流机模型进行。QS21分子通过粗皂苷混合物Quil A的HPLC纯化获得。在无菌过滤之前，将QS21单独地溶解在磷酸盐缓冲液中，并且然后混合到已制备的SLA-或GLA*-脂质体中。所述过程目前是可复写的且稳健的。示例性的最终制造的产物用0.22μm过滤器(密理博公司Steripak GP10)进行过滤灭菌并且含有4mg/ml的DOPC、1mg/ml的胆固醇、20μg/ml的GLA*或SLA、以及8μg/ml的QS21，目前设计用于在施用前与抗原1:1混合。制造后，将调配物在5℃下储存，并且放置在稳定性监测程序中，所述稳定性监测程序包含在制造时以及在制造日期后1周、2周、1个月、3个月、6个月、12个月等对粒径(通过DLS)和视觉外观进行测量。另外，GLA*或SLA和QS21浓度是在制造时以及在制造日期后的6个月、12个月等使用带电气溶胶检测(CAD)通过HPLC测量的。在IDRI的制造批次中，粒径和佐剂浓度监测表明SLA-LSQ和GLA*-LSQ调配物的良好的稳定性。样品还在较高的温度(25℃，37℃和60℃)下储存，以进行加速稳定性监测。

实例2：将ID93+GLA-SE和ID93+GLA-LSQ的比较作为对经BCG致敏的豚鼠的促进。本研究的目的是确定与ID93疫苗一起在经BCG致敏的豚鼠中使用的最佳佐剂调配物。ID93疫苗是由与毒性和潜伏期相关的4种Mtb蛋白(Rv2608、Rv3619、Rv3620和Rv1813)调配成融合蛋白的重组亚基疫苗抗原。最终的891个氨基酸融合蛋白的经过预测的质量为93KDa。将ID93与两种不同的佐剂调配物GLA*-SE和GLA*-LSQ的组合进行了测试，并确定了疫苗在经BCG致敏的豚鼠中的保护效力。将80只雌性豚鼠用于用BCG进行皮内致敏的研究并休息3个月。用ID93疫苗免疫3次，间隔3周(第0天、第21天、第42天)。在第3次免疫后10周，用低剂量的气溶胶(1.17x10⁷cfu/ml)结核分枝杆菌北京4619(M.tuberculosis Beijing 4619)进行攻击。ID93的剂量为10μg。佐剂A为具有5μg的GLA*和2μg的QS21的GLA*-LSQ。佐剂B为GLA-SE(5μg的GLA)。组1是唯一未用BCG致敏的组，并且单独施用生理盐水，组2施用生理盐水，组3施用佐剂A，组4施用ID93和佐剂A，并且组5施用ID93和佐剂B。

在感染后60天，与BCG致敏组类似，与生理盐水对照物相比，ID93-GLA-SE疫苗使肺部和脾脏中的细菌负荷显著减少。另外，与生理盐水组相比，ID93-GLA-SE组的纵隔淋巴结细菌减少，而BCG致敏组的细菌的减少在这个时间点不具有统计学意义。与BCG致敏组相比，唯一示出了提高的存活率的组是ID93+GLA-LSQ。与生理盐水组相比，ID93+GLA-LSQ在感染后30天和60天均显著减少了脾脏中的细菌，但肺部或MDL中细菌没有显著减少。

实例3：1期，进行随机双盲临床试验以评估在健康成人受试者中肌肉内施用的候选疫苗ID93+GLA*-LSQ和ID93+GLA-SE的安全性、耐受性和免疫原性

正在进行随机双盲临床试验以评估在70名18-49岁的健康成人中，单独或用GLA-SE或GLA*-LSQ佐剂调配的ID93重组蛋白抗原的安全性、耐受性和免疫原性。下表1中概述了4个治疗组。受试者在第1天、第29天和第57天总共接受3个剂量的肌肉内施用。受试者将被监测大约422天(第三次研究注射后365天)，包含仅每次研究注射前和注射后7天完成的安全性实验室分析。将获得用于免疫学测定的血液样品(路明克斯公司(Luminex)，在第1天和第71天进行细胞内细胞因子染色，在第1天和第85天进行抗体分析)。

表1

组	N	研究注射	研究注射的时机
				1	20	10μg ID93+5μg GLA*-LSQ	第1天、第29天、第57天
2	20	10μg ID93+10μg GLA*-LSQ	第1天、第29天、第57天
				3	20	10μg ID93+5μg GLA-SE	第1天、第29天、第57天
4	10	10μg ID93	第1天、第29天、第57天

吡喃葡萄糖基脂质A(GLA*)是合成的Toll样受体4(TLR4)激动剂。将GLA调配成稳定的水包油乳液(SE)以产生佐剂调配物GLA-SE。由于GLA分子的TLR4活性，GLA-SE与重组蛋白抗原(ID93)的组合导致了Thl型T细胞应答。GLA*-LSQ是包含GLA和皂苷QS-21的脂质体调配物。已经示出用脂质体调配的GLA刺激稳健的免疫应答，但添加如QS-21等另外的免疫刺激配体会增加Th1免疫应答(Christensen D等人,《疫苗专家评论》2011；10:513-21)。QS-21衍生自皂荚树(皂树)并且已经示出引发表达IFNγ和TNF的CD4 T细胞并产生针对多种抗原的细胞毒性T淋巴细胞。

将GLA*与QS-21(LSQ)调配成脂质体组合物以产生佐剂GLA*-LSQ，并且将20μg/mL的GLA*和8μg/mL的QS-21在一次性小瓶中组合供应。GLA*-LSQ表现为朦胧的液体。每个2mL的小瓶含有的填充体积为0.4mL，并且必须储存在2-8℃下。以下是关于注射重组程序的说明：组1：10μg的ID93+5μg的GLA*-LSQ：通过添加1.25mL如以上所描述的WFI重组小瓶的ID93(浓度：80μg/mL的ID93)。将0.2mL经过重组的ID93和0.2mL的WFI添加到0.4mL小瓶的GLA*-LSQ中，并充分混合。此最终混合小瓶中的总体积现在为0.8mL(浓度：20μg/mL的ID93；10μg/mL的GLA)。将>0.5mL的混合制剂抽吸到1mL的注射器中，并用23-25号1-1¹/₂英寸针头替换针头以进行IM注射。去除任何气泡，并灌注注射器以递送0.5mL(10μg的ID93和5μg的GLA)。遵守针对注射器和剂量制剂的标准医院政策，以确保施用所需剂量。组2：10μg的ID93+10μg的 GLA*-LSQ：通过添加1.25mL如以上所描述的WFI重组小瓶的ID93(浓度：80μg/mL的ID93)。将0.15mL的经过重组的ID93、0.45mL的WFI和0.2mL的GLA*-LSQ添加到单独的0.4mL小瓶的GLA*-LSQ中，并充分混合。此最终混合小瓶中的总体积现在为1.2mL(浓度：10μg/mL的ID93；10μg/mL的GLA)。将>1.0mL的混合制剂抽吸到2.5mL或3mL的注射器中，并用23-25号1-1¹/₂英寸针头替换针头以进行IM注射。去除任何气泡，并灌注注射器以递送1.0mL(10μg的ID93和10μg的GLA*)。遵守针对注射器和剂量制剂的标准医院政策，以确保施用所需剂量。组3：10μ g的ID93+5μg的GLA*-SE：通过添加1.25mL如以上所描述的WFI重组小瓶的ID93(浓度：80μg/mL的ID93)。将0.2mL的经过重组的ID93和0.2mL的WFI添加到0.4mL小瓶的GLA-SE中，并充分混合。此最终混合小瓶中的总体积现在为0.8mL(浓度：20μg/mL的ID93；10μg/mL的GLA)。将>0.5mL的混合制剂抽吸到1mL的注射器中，并用23-25号1-1¹/₂英寸针头替换针头以进行IM注射。去除任何气泡，并灌注注射器以递送0.5mL(10μg的ID93和5μg的GLA*)。遵守针对注射器和剂量制剂的标准医院政策，以确保施用所需剂量。组4：单独的10μg的ID93：通过添加1.25mL如以上所描述的WFI重组小瓶的ID93(浓度：80μg/mL的ID93)。将0.3mL的经过重组的ID93和0.9mL的WFI添加到无菌空瓶中并充分混合。此最终混合小瓶中的总体积现在为1.2mL(浓度：20μg/mL的ID93)。将>0.5mL的混合制剂抽吸到1mL的注射器中，并用23-25号1-1¹/₂英寸针头替换针头以进行IM注射。去除任何气泡，并灌注注射器以递送0.5mL(10μg的ID93)。遵守针对注射器和剂量制剂的标准医院政策，以确保施用所需剂量。

通过对ID93的IgG抗体应答来测量的抗体应答将在研究日(第1天和第85天)使用描述性统计进行总结。将呈现从基线到每次访问的变化。针对每种剂量的免疫应答数据随时间推移的图表将呈现置信限度。针对IgG和细胞因子的应答率将以精确的置信区间呈现，并使用费希尔精确测试在治疗组之间进行比较。当数据为正态分布时，将使用方差分析来比较细胞因子浓度的大小，或当数据分布为非高斯分布时，使用适当的非参数分析方法。

Claims (85)

1.一种用于向人类受试者施用的脂质体调配物，所述脂质体调配物包括皂苷和脂多糖，其中所述皂苷的浓度为每剂量约1μg到每剂量约10μg，并且所述脂多糖的浓度为每剂量约3μg到每剂量约25μg，其中脂多糖与皂苷的重量比为约2.5比1。

2.根据权利要求1所述的调配物，其中所述皂苷的浓度为每剂量约1μg到每剂量约8μg，并且所述脂多糖的浓度为每剂量约3μg到每剂量约20μg。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的调配物，其中所述皂苷与固醇复合。

4.根据权利要求3所述的调配物，其中皂苷与固醇的重量比为约1:110到约1:200。

5.根据权利要求3所述的调配物，其中皂苷与固醇的重量比为约1:110到约1:150。

6.根据权利要求3所述的调配物，其中皂苷与固醇的重量比为约1:120到约1:150。

7.根据权利要求3所述的调配物，其中皂苷与固醇的重量比为约1:125。

8.根据前述权利要求中任一项所述的调配物，其中所述皂苷的浓度为每剂量约4μg。

9.根据前述权利要求中任一项所述的调配物，其中所述脂多糖的浓度为每剂量约10μg。

10.根据权利要求1到7中任一项所述的调配物，其中所述皂苷的浓度为每剂量约2μg。

11.根据权利要求1到7或权利要求10中任一项所述的调配物，其中所述脂多糖的浓度为每剂量5μg。

12.根据前述权利要求中任一项所述的调配物，其中所述皂苷是衍生自皂树的树皮的免疫活性皂苷级分。

13.根据权利要求12所述的调配物，其中所述皂苷级分是QS21。

14.根据权利要求1到11中任一项所述的调配物，其中所述皂苷是合成的。

15.根据权利要求3到14中任一项所述的调配物，其中所述固醇是胆固醇。

16.根据前述权利要求中任一项所述的调配物，其进一步包括磷脂。

17.根据权利要求16所述的调配物，其中所述磷脂选自由以下组成的组：DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC、DLPG、DMPG、DPPG、DSPG、DOPG、DSTAP、DPTAP、DSPE、DPPE、DMPE和DLPE。

18.根据权利要求1到17中任一项所述的调配物，其中所述脂多糖是吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)。

19.根据权利要求1到17中任一项所述的调配物，其中所述脂多糖具有以下式：

其中R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁烷基；并且R²和R⁴是C₁₃烷基，或其药学上可接受的盐。

20.根据权利要求1到17中任一项所述的调配物，其中所述脂多糖具有式：

或

或其药学上可接受的盐。

21.根据权利要求1到17中任一项所述的调配物，其中所述脂多糖具有以下式：

其中R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₀烷基；并且R²和R⁴是C₈烷基，或其药学上可接受的盐。

22.根据权利要求1到17中任一项所述的调配物，其中所述脂多糖是单磷酰基脂质A(MPL)。

23.根据权利要求1到22中任一项所述的调配物，其中所述调配物的体积适于人体剂量。

24.根据权利要求23所述的调配物，其中所述体积为约0.5ml到约1.5ml。

25.一种药物组合物，其包括根据权利要求1到24中任一项所述的调配物。

26.根据权利要求25所述的药物组合物，其进一步包括抗原。

27.一种疫苗组合物，其包括根据权利要求1到24中任一项所述的调配物和抗原。

28.根据权利要求26或27所述的组合物，其中所述抗原衍生自(i)与感染性疾病相关的至少一种感染性病原体，(ii)与癌症相关的至少一种表位、生物分子、细胞或组织或(iii)与自身免疫疾病相关的至少一种表位、生物分子、细胞或组织，或与其发生免疫交叉反应，从而引发或增强免疫应答。

29.一种引发或增强受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1到24中任一项所述的脂质体调配物、根据权利要求25或26所述的药物组合物或根据权利要求27或28所述的疫苗组合物。

30.根据权利要求29所述的方法，其中根据权利要求1到24中任一项所述的脂质体调配物、根据权利要求25或26所述的药物组合物或根据权利要求27或28所述的疫苗组合物与抗原组合施用。

31.根据权利要求29或权利要求30所述的方法，其中所述受试者患有癌症、感染性疾病或自身免疫疾病。

32.根据权利要求29到31中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

33.一种用于向人类受试者施用的脂质体调配物，其包括皂苷和任选的脂多糖，其中所述皂苷与固醇复合，并且皂苷与固醇的重量比为约1:110到约1:200。

34.根据权利要求33所述的调配物，其中所述脂质体调配物包括磷脂，并且磷脂与固醇的重量比为1:1到约10:1。

35.根据权利要求33所述的调配物，其中所述脂质体调配物包括磷脂，并且磷脂与固醇的重量比为约4:1。

36.根据权利要求33所述的调配物，其中所述皂苷的浓度为每剂量约0.5μg到每剂量约10μg。

37.根据权利要求33所述的调配物，其中所述皂苷的浓度为每剂量约1μg到每剂量约10μg。

38.根据权利要求33所述的调配物，其中所述皂苷的浓度为每剂量约1μg到每剂量约8μg。

39.根据权利要求33到38中任一项所述的调配物，其中存在所述脂多糖，并且所述脂多糖的浓度为每剂量1.25μg到每剂量约25μg。

40.根据权利要求33到39中任一项所述的调配物，其中存在所述脂多糖，并且所述脂多糖的浓度为每剂量约3μg到每剂量约25μg。

41.根据权利要求33所述的调配物，其中所述皂苷的浓度为每剂量约1μg到每剂量约8μg，并且存在所述脂多糖，并且所述脂多糖的浓度为每剂量约3μg到每剂量约20μg。

42.根据权利要求33到41中任一项所述的调配物，其中所述调配物包括浓度为约8μg/ml的皂苷、浓度为约20μg/ml的脂多糖、浓度为约4mg/ml的磷脂和浓度为约1mg/ml的固醇。

43.根据权利要求42所述的调配物呈稀释形式，优选地为2到10倍稀释。

44.根据权利要求42所述的调配物呈浓缩形式，优选地为2到10倍浓缩。

45.根据权利要求33到44中任一项所述的调配物，其中皂苷与固醇的比为约1:110到约1:150。

46.根据权利要求33到44中任一项所述的调配物，其中皂苷与固醇的比为约1:120到约1:150。

47.根据权利要求33到44中任一项所述的调配物，其中皂苷与固醇的比为约1:125。

48.根据权利要求33到47中任一项所述的调配物，其中脂多糖与皂苷的比为约2.5比1。

49.根据权利要求33到48中任一项所述的调配物，其中所述皂苷的浓度为每剂量约4μg。

50.根据权利要求33到49中任一项所述的调配物，其中所述脂多糖的浓度为每剂量约10μg。

51.根据权利要求33到48中任一项所述的调配物，其中所述皂苷的浓度为每剂量约2μg。

52.根据权利要求33到48或权利要求51中任一项所述的调配物，其中所述脂多糖的浓度为每剂量5μg。

53.根据权利要求33到52中任一项所述的调配物，其中所述皂苷是衍生自皂树的树皮的免疫活性皂苷级分。

54.根据权利要求53所述的调配物，其中所述皂苷级分是QS21。

55.根据权利要求33到54中任一项所述的调配物，其中所述固醇是胆固醇。

56.根据权利要求33到55中任一项所述的调配物，其包括磷脂，其中所述磷脂选自由以下组成的组：DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC、DLPG、DMPG、DPPG、DSPG、DOPG、DSTAP、DPTAP、DSPE、DPPE、DMPE和DLPE。

57.根据权利要求56所述的调配物，其中所述磷脂是DOPC。

58.根据权利要求33到57中任一项所述的调配物，其中所述脂多糖是吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)。

59.根据权利要求33到57中任一项所述的调配物，其中所述脂多糖具有以下式：

其中R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁烷基；并且R²和R⁴是C₁₃烷基，或其药学上可接受的盐。

60.根据权利要求33到57所述的调配物，其中所述脂多糖具有以下式：

或

或其药学上可接受的盐。

61.根据权利要求33到57中任一项所述的调配物，其中所述脂多糖具有以下式：

其中R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₀烷基；并且R²和R⁴是C₈烷基，或其药学上可接受的盐。

62.根据权利要求33到57中任一项所述的调配物，其中所述脂多糖是单磷酰基脂质A(MPL)。

63.根据权利要求33到43和45到62中任一项所述的调配物，其中所述调配物的体积适用于人体剂量。

64.根据权利要求63所述的调配物，其中所述体积为约0.5ml到约1.5ml。

65.一种药物组合物，其包括根据权利要求33到43和45到62中任一项所述的调配物。

66.根据权利要求65所述的药物组合物，其进一步包括抗原。

67.一种疫苗组合物，其包括根据权利要求33到43和45到62中任一项所述的调配物和抗原。

68.根据权利要求66或67所述的组合物，其中所述抗原衍生自(i)与感染性疾病相关的至少一种感染性病原体，(ii)与癌症相关的至少一种表位、生物分子、细胞或组织或(iii)与自身免疫疾病相关的至少一种表位、生物分子、细胞或组织，或与其发生免疫交叉反应，从而引发或增强免疫应答。

69.一种引发或增强受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求33到43和45到62中任一项所述的脂质体调配物、根据权利要求65或66所述的药物组合物或根据权利要求67或68所述的疫苗组合物。

70.根据权利要求69所述的方法，其中根据权利要求33到43和45到62中任一项所述的脂质体调配物、根据权利要求65或66所述的药物组合物或根据权利要求67或68所述的疫苗组合物与抗原组合施用。

71.根据权利要求69或权利要求70所述的方法，其中所述受试者患有癌症、感染性疾病或自身免疫疾病。

72.根据权利要求69到71中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

73.根据权利要求69到72中任一项所述的方法，其中将每剂量约2μg的皂苷递送到所述受试者。

74.根据权利要求73所述的方法，其中将每剂量约5μg的GLA递送到所述受试者。

75.根据权利要求69到72中任一项所述的方法，其中将每剂量约4μg的皂苷递送到所述受试者。

76.根据权利要求75所述的方法，其中将每剂量约10μg的GLA递送到所述受试者。

77.根据前述权利要求中任一项所述的调配物或组合物，其中所述调配物和组合物不用于治疗西尼罗病毒。

78.根据前述权利要求中任一项所述的调配物或组合物，其中所述调配物和组合物与抗原混合，并且所述抗原不与西尼罗病毒相关或不衍生自西尼罗病毒。

79.根据前述权利要求中任一项所述的调配物或组合物，其中所述调配物和组合物不用于治疗TB、HIV或疟疾。

80.根据前述权利要求中任一项所述的调配物或组合物，其中所述调配物和组合物与抗原混合，并且所述抗原不与TB、HIV或疟疾相关或不衍生自TB、HIV或疟疾。

81.根据权利要求80所述的调配物和组合物，其中所述抗原是ID93、ID91或ID97。

82.一种制造根据前述权利要求中任一项所述的含皂苷的脂质体调配物的方法，其包括将所述皂苷与预先形成的含固醇的脂质体混合。

83.根据权利要求82所述的方法，其中所述皂苷为QS21，并且将所述粗皂苷混合物QuilA纯化以得到所述皂苷。

84.根据权利要求82或83中任一项所述的方法，其中所述皂苷在与脂质体混合之前溶解于缓冲液中。

85.根据权利要求82到84中任一项所述的方法，其中通过混合所述磷脂和所述固醇并通过高压均质化减小所得脂质体的粒径来制备所述预先形成的含固醇的脂质体。

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