CN110609136B - Zyx斑联蛋白在恶性脑胶质母细胞瘤诊断及治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种与脑胶质瘤相关的肿瘤分子标志物及其应用。本发明公开一种ZYX斑联蛋白作为恶性脑胶质母细胞瘤诊断标志物的应用，所述ZYX斑联蛋白的表达量高低与胶质瘤的侵袭强弱正相关。所述ZYX斑联蛋白的表达量高低与胶质瘤的恶性级别正相关。本发明证实了ZYX斑联蛋白的表达量与胶质瘤发生发展的动态关系，为胶质瘤的治疗、诊断、疗效预测，或预后判断等提供了重要的指导意义。

Description

ZYX斑联蛋白在恶性脑胶质母细胞瘤诊断及治疗中的应用

技术领域

.本发明属于生物医药技术领域，涉及一种与脑胶质瘤相关的肿瘤分子标志物及其应用。

背景技术

.脑胶质细胞瘤也被称为神经胶质细胞瘤，是最常见的神经系统肿瘤,其中又以高级别胶质瘤(WHO IV级)的胶质母细胞瘤具有进展快、病死率高以及治愈率低等特点。此外，高级别胶质瘤因其肿瘤浸润性生长，与脑组织间无边界，难以实现手术完全切除，成为当前医学界的难题。

.经典的组织病理学主观性较强、不能客观、系统、准确的反映肿瘤组织的基因学背景和生物学特征。2008年，TCGA研究团队发现了胶质母细胞瘤基因组DNA最常见改变的3条信号通路，这一发现为胶质瘤的发病机制和靶向治疗提供了坚实的基础。

.目前胶质瘤的辅助诊断分子标志物有IDH、MGMT、EGFR、 P53、PTEN等，但目前尚未见研究和报道ZYX斑联蛋白在恶性脑胶质母细胞瘤诊断或治疗中的应用。

.ZYX斑联蛋白(Zyxin)是一种细胞骨架相关的磷蛋白，分子量为69KD，广泛分布于机体的各种细胞中，特别在内皮和平滑肌细胞中尤为丰富。在正常细胞的胞浆中ZYX斑联蛋白主要位于粘着斑、肌动蛋白应力纤维和粘着带参与肌动蛋白骨架组装及力传导，从而介导细胞与细胞、细胞与基质之间相互作用，最终影响细胞迁移、增殖和死亡。另外，ZYX斑联蛋白还可以进入细胞核内调节许多重要基因的表达。近些年来，越来越多的研究表明，当机体发生各种恶性肿瘤时，ZYX斑联蛋白在肿瘤的发生发展中起到了各种各样的调节作用，可以反映出胶质瘤的侵袭性程度，因此有望成为一种新的潜在的肿瘤治疗靶点和预后指标。

发明内容

.有鉴于此，本发明的目的在于提供ZYX斑联蛋白作为恶性脑胶质母细胞瘤诊断标志物的应用以及开发为治疗胶质瘤相关药物和/ 或诊断试剂盒的应用。

.为实现上述目的，本发明的技术方案为：

.ZYX斑联蛋白作为恶性脑胶质母细胞瘤诊断标志物的应用，所述ZYX斑联蛋白的表达量高低与胶质瘤的侵袭强弱正相关。

.进一步，所述ZYX斑联蛋白的表达量高低与胶质瘤的恶性级别正相关。

.本发明通过84例胶质瘤病理实验验证，ZYX在脑胶质瘤中随着胶质瘤的恶性级别增加，其表达增多。

.进一步，所述ZYX斑联蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.1所示；ZYX斑联蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。

.ZYX斑联蛋白在制备恶性脑胶质母细胞瘤辅助诊断、疗效预测，或预后判断试剂盒中的应用。

.ZYX斑联蛋白在制备靶向恶性脑胶质母细胞瘤的分子靶向药中的应用。

.进一步，所述的分子靶向药包括单克隆抗体药、ADC，或小分子化学药。

.目前在治疗高级别胶质瘤的分子靶向药物中，主要应用的是针对血管内皮生长因子的单克隆抗体药贝伐单抗。贝伐单抗是一种人工合成的血管内皮生长因子单克隆抗体药，能够抑制肿瘤生长，减轻肿瘤引起的水肿等。但贝伐单抗价格昂贵，且已经证实长期药物的敏感性和效力会降低，因此开发一种针对不同靶点且效力更持久，同时价格更低的药物非常迫切。

.一种靶向治疗恶性脑胶质母细胞瘤的药物，所述药物通过抑制 ZYX斑联蛋白的活性来影响胶质瘤母细胞瘤的进展。

.进一步，所述药物可以为任意药学可接受剂型，可以包括药学可接受任意载体和/或助剂。

.一种敲低ZYX斑联蛋白基因的胶质瘤细胞株。

.上述敲低ZYX斑联蛋白基因的胶质瘤细胞株在恶性脑胶质母细胞瘤辅助诊断、疗效预测，或预后判断中的应用。

.本发明的研究团队已经证实胶质瘤细胞和原代胶质母细胞瘤细胞敲低ZYX蛋白后生存期延长，因此建立敲低ZYX斑联蛋白基因的胶质瘤细胞株对于后续临床机制研究和疾病预测诊断方面都具有重要的指导意义。

本发明有益效果

.本发明提供了ZYX斑联蛋白作为恶性脑胶质母细胞瘤诊断标志物的应用以及开发为治疗胶质瘤相关药物的应用，证实了ZYX斑联蛋白的表达量与胶质瘤发生发展的动态关系，为胶质瘤的治疗、诊断、疗效预测，或预后判断等提供了重要的指导意义。

附图说明

.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

.图1免疫组化检测不同级别胶质瘤病理切片图。

.图2Western blotting检测不同级别胶质瘤ZYX表达图。

.图3慢病毒感染LN229细胞的Western blotting电泳图。

.图4对照组与敲低ZYX组的小鼠生存曲线图。

.图5对照组与敲低ZYX组的小鼠分别接种脑胶质瘤后的病理切片免疫组化图。

具体实施方式

.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

.所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

.实施例1

.免疫组化染色

.1.常规石蜡切片制作：挑取合适的蜡块切片，得到6-8μm的切片。

.2.脱蜡：将切片置于60℃的烘箱中烘烤半个小时，后马上移入至二甲苯I中，浸泡15min，再移入二甲苯II中，浸泡15min。

.3.水化：脱蜡后依次通过100％乙醇、100％乙醇、95％乙醇、 85％乙醇、75％乙醇，每次5min。

.4.蒸馏水洗3次，每次10min。

.5.修复抗原：将抗原修复液1000ml导入高压锅中，加热煮开后，放入切片冒大气2.5min后，关火后余热1min后，取出置于热抗原修复液自然冷却至室温。

.6.PBS洗3次，每次10min。

.7.阻断：将切片置于阻断液中37℃浸泡30min。

.8.PBS洗3次，每次10min。

.9.敷一抗:按照ZYX(1:500)稀释抗体后，加入适量抗体，4℃冰箱过夜。

.10.次日，将切片取出，室温复温30min。

.11.PBS洗3次，每次10min。通用型二抗室温孵育1h。

.12.显色：DAB显色，镜下显色至最大强度，于自来水中中止反应。

.13.染核：于苏木素中染色20s，后用盐酸酒精进行分化1sec。

.14.返蓝：流水冲洗10min。

.15.脱水：按照75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、100％乙醇、 100％乙醇、二甲苯I及二甲苯II的顺序过缸。

.16.封片:脱水结束后，烘干，再用中性树胶溶液封片，再置于37℃烘烤30min。

.免疫组化评分

.免疫组化的评分采用Image-pro plus5.0软件进行。具体的操作如下：

.1.采图

.图片采集都在同一台显微镜下，在相同的亮度、放大倍数及软件参数设定下进行。每一例切片都在调至清晰视野下随机采集3张图片。

.2.软件分析

.1)校正图片光密度:点击Files按钮打开文件，在Measure按钮下点击Calibration，在Intensity的窗口里点击new，然后选择std option density。Options里设定Incident level为230。不关闭窗口。

.2)选色：在Measure下选择Count/size，点击Select colors，选择HSI模式，将H设定为0-30，S设定为0-255，I设定为0-230，然后点击file-save，保存这个选色设置，以后的每张图片直接加载这个选色设置文件就行。

.3)选择测量参数：在Count/size界面点击Measure，选择select measurement下的IOD和Area这两个参数。

.4)测定：用irregular工具圈出测量区域，点击count按纽。测量数据在viewstatistics窗口中，读取其中的IOD SUM数值，作为该张照片的累积光密度值。再点击Edit下的covert AOI(s)to Obiect (s)，再按count按纽，测量数据显示在view statistics窗口中，读取 Area SUM数值，作为该张照片的面积值。

.计算：每张照片最后的相对光密度为IOD SUM除以Area SUM 的值，每例标本的3个相对光密度的平均值即为这例标本的免疫组化评分值。

.实验结果：

.胶质瘤病理显示：ZYX在脑胶质瘤中随着级别的越高，其表达越高。图见图1。

.实施例2

.蛋白质免疫印迹实验

.1配胶：玻璃板洗净晾后，安装在板架上，根据蛋白分子量配置分离胶，使用无水乙醇压平液面，室温静置至胶凝固，倒出上面的无水乙醇，再配制浓缩胶，加入浓缩胶后立即插入梳子，室温静置待胶凝固。

.2SDS-PAGE电泳

.将电泳液的工作液体加入到电泳槽中，将所有蛋白样品和 Marker等体积上样。

.电泳参数设为：恒压电泳，浓缩胶电压80V，分离胶电压120V。待溴酚蓝至分离胶底部时，结束电泳。

.3转膜：取适度大小的PVDF膜，用甲醇活化1min后转移至转膜缓冲液中。按照滤纸、膜、胶及滤纸的顺序放置，充分排除气泡，保证电泳槽充分冲洗以去除残余SDS。置于冰水中，200mA恒流转膜90min。

.4封闭：将膜从电转槽中取出，做好标记后，置于配好的封闭液中，保证足够的封闭液可以覆盖膜表面，室温摇床封闭2h。

.5一抗孵育并洗涤：封闭结束后，用镊子小心夹出PVDF膜，剪去多余的部分，放置于配置好的一抗孵育液中，4℃过夜。洗涤， PBST洗3次，每次10min。

.6二抗孵育并洗涤：根据一抗的来源选择合适的HRP偶联的二抗，二抗按1：5000稀释，将PVDF膜置于其中，让其完全覆盖，室温摇晃1h。洗涤，将膜取出，PBST洗3次，每次10min。

.7显影：用WESTERN BLOTTING ECL HRP化学发光显影液充分覆盖于PVDF膜上，放进Bio-Rad凝胶成像仪内显影。

.实验结果：

.Western blotting验证ZYX蛋白在恶性程度越高的胶质瘤中表达越高。图见图2。

.实施例3

.ZYX敲低细胞株的建立

.1.慢病毒构建

.(1)ZYX-shRNA干扰慢病毒由上海吉凯生物科技公司构建、测序、抽提质粒并包装。

.(2)病毒采用GV112载体，元件顺序：hU6-MCS-CMV4-Puro^r。

.(3)ZYX-shRNA-sh RNA干扰及对照序列见表1

.表1

序列号	shRNA	Sequence(5′-3′)
			SEQ ID NO.3	shZYX#1	TCCACATGAAGTGTTACAA
SEQ ID NO.4	shZYX#2	GTTCCAAGTCCAGTACCAA
			SEQ ID NO.5	shCtrl	TTCTCCGAACGTGTCACGT

.2.慢病毒感染LN229细胞

.(1)LN229细胞病毒感染：六孔板中细胞融合度80％左右时分别加入5u shCtr、shZYX#1和sh ZYX#2病毒(病毒滴度>10^8PFU/ml)。

.(2)感染后筛选：感染48h后，加入嘌呤霉素(5μg/mL)筛选，每隔2天换液并加药，持续2周后即可获得稳定细胞系。收集不同组的蛋白，按照上面的蛋白质免疫印迹实验步骤检验ZYX的表达。

.实验结果：

.ZYX敲低组细胞中的ZYX蛋白表达显著降低，表明ZYX敲低细胞株构建成功。图见图3。

.实施例4

.原位移植瘤形成

.(1)动物：采用4-6周龄的NOD/SCID小鼠，在标准无菌条件下培养。

.(2)麻醉：5％水合氯醛(8μL/μg)，腹腔注射麻醉。

.(3)细胞：建构带有luciferase报告基因病毒的LN229/Ctr、 LN229/sh ZYX#1、GBM1/Ctr和GBM1/sh ZYX#1细胞，每只小鼠接种2×10⁵个细胞。

.(4)原位移植瘤操作：待小鼠充分麻醉后，于冠状缝前0.5mm，前卤点有2mm处进针(预先剪除毛发以便充分暴露)。进针处用75％酒精消毒，使微量注射器缓慢进针，深度约1-2mm并有突破感后，将细胞悬液缓慢注入；注射完毕后，停留1-2min，再缓慢退出；进针处再次消毒。

.(5)每日观察小鼠的状态并称量体重；1月后在活体动物成像系统中观察移植瘤的生长状态；记录小鼠死亡时间并及时处理死亡标本。

.实验结果：

.原位移植瘤形成表明，敲低ZYX后小鼠生存曲线显著延长。图见图4

.对照组显示恶性胶质母细胞瘤高侵袭性生长；敲低ZYX后肿瘤与癌旁组织边缘清晰可见。图见图5。

.上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

<110>中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院

<120> ZYX斑联蛋白在恶性脑胶质母细胞瘤诊断及治疗中的应用

<160> 5

<170> PatentIn Version 3.5

<210> 1

<211> 572

<212> PRT

<213>人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

Met Ala Ala Pro Arg Pro Ser Pro Ala Ile Ser Val Ser Val Ser Ala

1 5 10 15

Pro Ala Phe Tyr Ala Pro Gln Lys Lys Phe Gly Pro Val Val Ala Pro

20 25 30

Lys Pro Lys Val Asn Pro Phe Arg Pro Gly Asp Ser Glu Pro Pro Pro

35 40 45

Ala Pro Gly Ala Gln Arg Ala Gln Met Gly Arg Val Gly Glu Ile Pro

50 55 60

Pro Pro Pro Pro Glu Asp Phe Pro Leu Pro Pro Pro Pro Leu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Gly Asp Asp Ala Glu Gly Ala Leu Gly Gly Ala Phe Pro Pro Pro

85 90 95

Pro Pro Pro Ile Glu Glu Ser Phe Pro Pro Ala Pro Leu Glu Glu Glu

100 105 110

Ile Phe Pro Ser Pro Pro Pro Pro Pro Glu Glu Glu Gly Gly Pro Glu

115 120 125

Ala Pro Ile Pro Pro Pro Pro Gln Pro Arg Glu Lys Val Ser Ser Ile

130 135 140

Asp Leu Glu Ile Asp Ser Leu Ser Ser Leu Leu Asp Asp Met Thr Lys

145 150 155 160

Asn Asp Pro Phe Lys Ala Arg Val Ser Ser Gly Tyr Val Pro Pro Pro

165 170 175

Val Ala Thr Pro Phe Ser Ser Lys Ser Ser Thr Lys Pro Ala Ala Gly

180 185 190

Gly Thr Ala Pro Leu Pro Pro Trp Lys Ser Pro Ser Ser Ser Gln Pro

195 200 205

Leu Pro Gln Val Pro Ala Pro Ala Gln Ser Gln Thr Gln Phe His Val

210 215 220

Gln Pro Gln Pro Gln Pro Lys Pro Gln Val Gln Leu His Val Gln Ser

225 230 235 240

Gln Thr Gln Pro Val Ser Leu Ala Asn Thr Gln Pro Arg Gly Pro Pro

245 250 255

Ala Ser Ser Pro Ala Pro Ala Pro Lys Phe Ser Pro Val Thr Pro Lys

260 265 270

Phe Thr Pro Val Ala Ser Lys Phe Ser Pro Gly Ala Pro Gly Gly Ser

275 280 285

Gly Ser Gln Pro Asn Gln Lys Leu Gly His Pro Glu Ala Leu Ser Ala

290 295 300

Gly Thr Gly Ser Pro Gln Pro Pro Ser Phe Thr Tyr Ala Gln Gln Arg

305 310 315 320

Glu Lys Pro Arg Val Gln Glu Lys Gln His Pro Val Pro Pro Pro Ala

325 330 335

Gln Asn Gln Asn Gln Val Arg Ser Pro Gly Ala Pro Gly Pro Leu Thr

340 345 350

Leu Lys Glu Val Glu Glu Leu Glu Gln Leu Thr Gln Gln Leu Met Gln

355 360 365

Asp Met Glu His Pro Gln Arg Gln Asn Val Ala Val Asn Glu Leu Cys

370 375 380

Gly Arg Cys His Gln Pro Leu Ala Arg Ala Gln Pro Ala Val Arg Ala

385 390 395 400

Leu Gly Gln Leu Phe His Ile Ala Cys Phe Thr Cys His Gln Cys Ala

405 410 415

Gln Gln Leu Gln Gly Gln Gln Phe Tyr Ser Leu Glu Gly Ala Pro Tyr

420 425 430

Cys Glu Gly Cys Tyr Thr Asp Thr Leu Glu Lys Cys Asn Thr Cys Gly

435 440 445

Glu Pro Ile Thr Asp Arg Met Leu Arg Ala Thr Gly Lys Ala Tyr His

450 455 460

Pro His Cys Phe Thr Cys Val Val Cys Ala Arg Pro Leu Glu Gly Thr

465 470 475 480

Ser Phe Ile Val Asp Gln Ala Asn Arg Pro His Cys Val Pro Asp Tyr

485 490 495

His Lys Gln Tyr Ala Pro Arg Cys Ser Val Cys Ser Glu Pro Ile Met

500 505 510

Pro Glu Pro Gly Arg Asp Glu Thr Val Arg Val Val Ala Leu Asp Lys

515 520 525

Asn Phe His Met Lys Cys Tyr Lys Cys Glu Asp Cys Gly Lys Pro Leu

530 535 540

Ser Ile Glu Ala Asp Asp Asn Gly Cys Phe Pro Leu Asp Gly His Val

545 550 555 560

Leu Cys Arg Lys Cys His Thr Ala Arg Ala Gln Thr

565 570

<210> 2

<211> 1716

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

atggcggccc cccgcccgtc tcccgcgatc tccgtttcgg tctcggctcc ggctttttac 60

gccccgcaga agaagttcgg ccctgtggtg gccccaaagc ccaaagtgaa tcccttccgg 120

cccggggaca gcgagcctcc cccggcaccc ggggcccagc gcgcacagat gggccgggtg 180

ggcgagattc ccccgccgcc cccggaagac tttcccctgc ctccacctcc ccttgctggg 240

gatggcgacg atgcagaggg tgctctggga ggtgccttcc cgccgccccc tcccccgatc 300

gaggaatcat ttccccctgc gcctctggag gaggagatct tcccttcccc gccgcctcct 360

ccggaggagg agggagggcc tgaggccccc ataccgcccc caccacagcc cagggagaag 420

gtgagcagta ttgatttgga gatcgactct ctgtcctcac tgctggatga catgaccaag 480

aatgatcctt tcaaagcccg ggtgtcatct ggatatgtgc ccccaccagt ggccactcca 540

ttcagttcca agtccagtac caagcctgca gccgggggca cagcacccct gcctccttgg 600

aagtcccctt ccagctccca gcctctgccc caggttccgg ctccggctca gagccagaca 660

cagttccatg ttcagcccca gccccagccc aagcctcagg tccaactcca tgtccagtcc 720

cagacccagc ctgtgtcttt ggctaacacc cagccccgag ggcccccagc ctcatctccg 780

gctccagccc ctaagttttc tccagtgact cctaagttta ctcctgtggc ttccaagttc 840

agtcctggag ccccaggtgg atctgggtca caaccaaatc aaaaattggg gcaccccgaa 900

gctctttctg ctggcacagg ctcccctcaa cctcccagct tcacctatgc ccagcagagg 960

gagaagcccc gagtgcagga gaagcagcac cccgtgcccc caccggctca gaaccaaaac 1020

caggtgcgct cccctggggc cccagggccc ctgactctga aggaggtgga ggagctggag 1080

cagctgaccc agcagctaat gcaggacatg gagcatcctc agaggcagaa tgtggctgtc 1140

aacgaactct gcggccgatg ccatcaaccc ctggcccggg cgcagccagc cgtccgcgct 1200

ctagggcagc tgttccacat cgcctgcttc acctgccacc agtgtgcgca gcagctccag 1260

ggccagcagt tctacagtct ggagggggcg ccgtactgcg agggctgtta cactgacacc 1320

ctggagaagt gtaacacctg cggggagccc atcactgacc gcatgctgag ggccacgggc 1380

aaggcctatc acccgcactg cttcacctgt gtggtctgcg cccgccccct ggagggcacc 1440

tccttcatcg tggaccaggc caaccggccc cactgtgtcc ccgactacca caagcagtac 1500

gccccgaggt gctccgtctg ctctgagccc atcatgcctg agcctggccg agatgagact 1560

gtgcgagtgg tcgccctgga caagaacttc cacatgaagt gttacaagtg tgaggactgc 1620

gggaagcccc tgtcgattga ggcagatgac aatggctgct tccccctgga cggtcacgtg 1680

ctctgtcgga agtgccacac tgctagagcc cagacc 1716

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

Tccacatgaa gtgttacaa 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

gttccaagtc cagtaccaa 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

ttctccgaac gtgtcacgt 19

Claims (4)

1.ZYX斑联蛋白在制备检测恶性脑胶质母细胞瘤的试剂盒中的应用，其特征在于，所述ZYX斑联蛋白的表达量高低与恶性脑胶质母细胞瘤的侵袭强弱正相关。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ZYX斑联蛋白的表达量高低与胶质瘤的恶性级别正相关。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ZYX斑联蛋白的氨基酸序列如Seq IDNO.1所示。

4.ZYX斑联蛋白在制备恶性脑胶质母细胞瘤辅助诊断、疗效预测，或预后判断试剂盒中的应用。

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