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CN110551216B - 多价抗ox40抗体及其用途 - Google Patents

多价抗ox40抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种包含Fc结构域和至少4个抗原结合片段的多价抗体，特别涉及新的特异性结合OX40的具有至少4个抗原结合片段的多价抗体。本发明还涉及含有所述多价抗体的组合物、编码所述抗体的核酸及包含所述核酸的宿主细胞。此外，本发明还涉及这些新型多价抗体、包含其的组合物、其编码核酸以及包含所述核酸的宿主细胞的治疗和诊断用途。

Description

多价抗OX40抗体及其用途
本发明涉及一种具有至少四个抗原结合位点的多价抗体，特别涉及新的特异性结合OX40的具有至少四个抗原结合位点的多价抗体。本发明还涉及含有所述多价抗体的组合物、编码所述抗体的核酸及包含所述核酸的宿主细胞。此外，本发明还涉及这些新型多价抗体、包含所述多价抗体的组合物、编码核酸以及包含所述核酸的宿主细胞的治疗和诊断用途。
背景技术
多价抗体
大多数的天然抗体是二价抗体，其具有四个可变结构域，即两个VH结构域和两个VL结构域。天然存在的单克隆抗体可以作为多聚体结构如IgM存在，其增加对固定表面上的靶抗原的亲合性。因此，多价抗体在增加抗体抗原亲和力、增强抗体生物学功能方面具有一定的作用。
最近几年，已经开发了多种多样的重组多特异性抗体形式，例如通过融合IgG抗体形式和单链结构域的四价双特异性抗体(参见例如Coloma，M.J.等人，Nature Biotech.15(1997)159-163；WO 2001/077342；和Morrison，S.L.，Nature Biotech.25(2007)1233-1234。可以通过化学方式偶联两种不同的mAb来制造双特异性抗体(参见Staerz，U.D.等，Nature，1985.314(6012)：第628-31页)。其它方法使用了以化学方式偶联两种不同的单克隆抗体或较小的抗体片段(参见Brennan，M.等，Science，1985.229(4708)：第81-3页)。
在近期的研究中，报导了通过在转基因兔和牛的体内表达针对CD28和黑素瘤相关蛋白聚糖的串联scFv(参见Gracie，J.A.等，J Clin Invest，1999.104(10)：第1393-401页)。在这一构建体中，通过CH1连接子连接两个scFv分子，并且发现双特异性抗体的血清浓度高达100mg/L。现有少数研究报导了在细菌中使用极短的Ala3连接子或富含甘氨酸/丝氨酸的较长连接子的可溶性串联scFv分子的表达(参见Leung，B.P.等，J Immunol，2000.164(12)：第6495-502页；Ito，A.等，J Immunol，2003.170(9)：第4802-9页；Karni，A.等，JNeuroimmunol，2002.125(1-2)：第134-40页)。
双价抗体与Fc融合产生更类似Ig的分子，称为双双价抗体(参见Lu，D.等，J BiolChem，2004.279(4)：第2856-65页)。此外，也已描述了在IgG的重链中包含两个Fab重复并且能够结合四个抗原分子的多价抗体构建体(参见美国专利8,722,859B2，及Miller，K.等，JImmunol，2003.170(9)：第4854-61页)。
其他实例是四价IgG单链可变片段(scFv)融合物(Dong J等，2011MAbs 3：273-288；Coloma MJ，Morrison SL 1997Nat Biotechnol 15：159-163；Lu D等，2002J ImmunolMethods 267：213-226)与催化性抗体共价连接的药效团肽(DoppalapudiVR等，2010ProcNatl Acad Sci USA 107：22611-22616)、在一半IgG4分子之间使用动态交换产生双特异性抗体(van der Neut Kolfschoten M等，2007Science 317：1554-1557；Stubenrauch K等，2010Drug Metab Dispos 38：84-91)或通过在一半双特异性抗体的抗原结合片段(Fab)内交换重链结构域与轻链结构域(交叉Mab形式)(Schaefer W等，2011Proc Natl Acad Sci108：11187-92)。
此外，美国专利8,722,859B2描述了在IgG的重链中包含两个Fab重复并且能够结合四个抗原分子的多价抗体构建体。
CN106459182A提供了能够结合两个或更多个抗原，或者两个或更多个表位的多价和多特异性串联Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)。
OX40
OX40(也称为CD134、TNFRSF4和ACT35)最初被描述为大鼠CD4 T细胞上的T细胞激活标志物(Paterson DJ，Jefferies WA，Green JR，Brandon MR，Corthesy P，Puklavec M，Williams AF.Antigens of activated rat T lymphocytes including a molecule of50,000Mr detected only on CD4 positive T blasts.Mol Immunol.1987；24：1281-1290)并且随后显示为在TCR招募中被上调(Mallett S，Fossum S，BarclayAN.Characterization of the MRC OX40 antigen of activated CD4positive Tlymphocytes--a molecule related to nerve growth factor receptor.EMBO J.1990；9：1063-1068)。OX40信号传导能够促进对T细胞的共刺激信号，导致增强的细胞增殖、存活、效应子功能和迁移(Gramaglia I，WeinbergAD，Lemon M，Croft M.Ox-40ligand：a potentcostimulatory molecule fbr sustaining primary CD4 T cell responses.JImmunol.1998；161：6510-6517；Gramaglia I，Jember A，Pippig SD，Weinberg AD，KilleenN，Croft M.The OX40costimulatory receptor determines the development ofCD4memory by regulating primary clonal expansion.J Immunol.2000；165：3043-3050)。
OX40的配体，OX40L主要表达在抗原呈递细胞(APC)上并且其表达可以通过CD40和肥大细胞信号传导、toll样受体(TLR)以及炎性细胞因子被诱导。除了APC之外，非造血细胞例如平滑肌和血管内皮细胞也可以表达OX40L。在过量表达OX40L的转基因小鼠中，有增加的T-细胞激活，并且当被免疫时，这些小鼠产生增强的T细胞应答(Murata K，Nose M，Ndhlovu LC，Sato T，Sugamura K，Ishii N.Constitutive OX40/OX40ligand interactioninduces autoimmune-like diseases.J Immunol.2002；169：4628-4636和Sato T，IshiiN，Murata K，Kikuchi K，Nakagawa S，Ndhlovu LC，Sugamura K.Consequences of OX40-OX40ligand interactions in langerhans cell function：enhanced contacthypersensitivity responses in OX40L-transgenic mice.Eur J Immunol.2002；32：3326-3335)。这一数据表明OX40L表达是T细胞中OX40信号传导的限制性因子。
在携带肿瘤的小鼠中，小鼠OX40的体内连接(通过可溶性小鼠OX40L-免疫球蛋白融合蛋白或小鼠OX40L模拟物，如抗小鼠CD134特异性抗体)增强抗肿瘤免疫，导致各种小鼠恶性肿瘤细胞系的小鼠模型例如淋巴瘤、黑素瘤、肉瘤、结肠癌、乳腺癌和神经胶质瘤中的无肿瘤存活(Sugamura et al.Nature Rev Imm2004；4：420-431)。
在严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠中，人OX40的体内连接(通过抗人OX40特异性抗体，其与人OX40上的OX40L结合结构域相互作用；US2009/0214560A1)增强抗肿瘤免疫，其导致各种人恶性肿瘤细胞系例如淋巴瘤、前列腺癌、结肠癌及乳腺癌的肿瘤生长抑制。
因此，仍然需要开发新的具有至少四个抗原结合位点的多价抗体(例如抗OX40抗体)，其与相应的常规抗体(例如抗OX40抗体)相比，具有更好的激动剂活性，从而更好地用来治疗或延缓各种癌症、免疫相关疾病和T细胞功能障碍性疾病。
在免疫原性差的肿瘤中，单一的抗OX40治疗不能提供足够的抗肿瘤免疫原性。由于TNFR的激动作用需要受体聚集，本领域仍然需要关于TNF家族(尤其是OX40分子)的具有多价抗原结合功能的、具有改善的聚集和受体激动作用的单分子实体，以满足日益增加的健康和医疗需求。本发明满足了这些和其它需求。
发明概述
申请人令人惊奇地发现，本发明提供的具有至少四个抗原结合位点的多价抗体能有效结合抗原，并且与相应的现有技术中已知的二价抗体相比，具有更好的激动剂活性。优选地，所述抗体或其片段能够活化T细胞，例如增强T效应细胞的免疫刺激/效应功能和/或使这些细胞增殖和/或下调T调节细胞的免疫抑制功能。因此，本发明的具有至少四个抗原结合位点的多价抗体能够用来治疗或延缓各种癌症、免疫相关疾病和T细胞功能障碍性疾病。在一个实施方案中，所述具有至少四个抗原结合位点的多价抗体是抗TNF的抗体。所述具有至少四个抗原结合位点的多价抗体是抗OX40的抗体。
本发明提供了具有至少四个抗原结合位点的多价抗体。在一实施方案中，多价抗体含有二聚化结构域和至少四个抗原结合位点。优选的二聚化结构域含有Fc结构域和/或铰链区(或由其组成)。
在一个实施方案中，本发明提供分离的含有二聚化结构域并在其氨基末端含有至少四个抗原结合位点的抗体。本发明进一步提供分离的含有Fc结构域和在Fc结构域氨基末端具有至少四个抗原结合位点的抗体。在一个实施方案中，所述至少四个抗原结合位点结合不同的抗原。在另一个实施方案中，所述至少四个抗原结合位点结合相同的抗原。在一个实施方案中，所述至少四个抗原结合位点为四个相同或者不同的Fv片段。在进一步优选的实施方案中，所述至少四个抗原结合位点为四个不同的Fab片段。在另一个实施方案中，所述Fab片段是相同的Fab片段。
在一个实施方案中，本发明提供分离的抗体，其包含Fc结构域和至少4个抗原结合片段，其中抗原结合片段两两串联，分别直接或者通过接头融合在Fc结构域的氨基末端。
在本发明提供分离的抗体的另一个实施方案中，Fc结构域和2个抗原结合片段组成2价的全长抗体，另外的2个抗原结合片段串联在所述全长抗体的重链的氨基末端，在另一个实施方案中，所述另外2个抗原结合片段通过接头融合在该全长抗体的重链氨基末端。
在一个优选的实施方案中，其中所述的另外的2个抗原结合片段是2个Fv片段或Fab片段，优选地，所述Fab片段分别通过其CH1端(该Fab片段称作远端Fab片段、或称作外Fab)直接或者通过接头(例如几个氨基酸的接头)融合到所述全长抗体的1条重链的氨基末端。在一个优选的实施方案中，所述Fab片段分别通过其CH1片段的氨基酸残基H113(Kabat编号)直接或借助于接头与所述全长抗体的1条重链的氨基末端融合，从而形成VH-CH1-重链(即，Fab-重链)的融合多肽。在一个实施方案中，形成的融合多肽的结构为VH-CH1-接头-重链(即，Fab-接头-重链)。在一个优选的实施方案中，所述接头为(GGGGS)n，其中n＝0-4，在进一步优选的实施方案中，所述接头是GGGGS(SEQ ID NO：57)。
在一个实施方案中，多价抗体包含2条重链融合多肽，其中每条重链融合多肽含有2个或更多个重链可变区。在一个优选实施方案中，多价抗体包含两条相同的重链融合多肽和四条相同的轻链，其中每条重链融合多肽含有2个可变区。
在一个实施方案中，多价抗体包含Fv1-接头1-Fv2-接头2-Fc的结构，其中Fv1是第一个Fv片段，Fv2是第二个Fv片段，其中Fv1与Fv2相同或者不同，在一个优选实施方案中，接头2是天然抗体的铰链区。
在一个进一步优选的实施方案中，多价抗体具有Fab1-接头1-Fab2-接头2-Fc的结构，其中Fab1与Fab2相同或者不同。在更优选的实施方案中，接头1是(GGGGS)n，其中n＝0-4，接头2是天然抗体中连接CH1和CH2的铰链区。在另一个优选的实施方案中，多价抗体具有4个相同或者不同的Fab片段。
在一个优选的实施方案中，多价抗体具有4个相同的Fab片段，其中一个Fab片段的重链H113(Kabat编号)通过接头与另一个Fab片段重链的氨基端相连。在更优选的实施方案中，所述接头是(GGGGS)n，其中n＝0-4。在一个实施方案中，所述Fab是抗TNF的Fab。在一个优选的实施方案中，所述Fab是抗OX40的Fab。
在一个实施方案中，本发明提供了多价抗OX40抗体，其中所述多价抗OX40抗体包含表C所示任一抗体的VH区序列的一个、两个或三个CDR(优选三个CDR)、或其变体。在另一些实施方案中，本发明抗体包含表C所示任一抗体的VL区序列的一个、两个或三个CDR(优选三个CDR)、或其变体。在一些实施方案中，本发明抗体包含表A-E和I所示任一抗体的6个CDR区序列、或其变体。
在一个实施方案中，本发明提供了多价抗OX40抗体，其中所述多价抗OX40抗体包含至少四个相同的Fab片段，所述Fab片段包含3个重链互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含选自SEQ ID NO：1、2、3、59、66、67、68和69的氨基酸序列，或相对于其包含不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列，HCDR2包含选自SEQ ID NO：4、5、6和60的氨基酸序列，或相对于其包含不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列，且HCDR3包含选自SEQ ID NO：7、8、9、70、71和72的氨基酸序列，或相对于其包含不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述改变是氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入。
在一个实施方案中，本发明提供了多价抗OX40抗体，其中所述多价抗OX40抗体包含至少四个相同的Fab片段，所述Fab片段包含轻链可变区(VL)，其中所述LCVR包含互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含选自SEQ ID NO：10和11所示的氨基酸序列，或相对于其包含不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列，LCDR2包含选自SEQ ID NO：12和13所示的氨基酸序列，或相对于其包含不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列，LCDR3包含选自SEQ IDNO：14、15和16所示的氨基酸序列，或相对于其包含不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述改变是氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入。
在一个实施方案中，本发明提供了多价抗OX40抗体，其中所述多价抗OX40抗体包含至少四个相同的Fab片段，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中HCVR包含3个互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含选自SEQ ID NO：1、2、3、59、66、67、68和69的氨基酸序列，或相对于其包含不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列，HCDR2包含选自SEQ ID NO：4、5、6和60的氨基酸序列，或相对于其包含不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列，且HCDR3包含选自SEQ ID NO：7、8、9、70、71和72的氨基酸序列，或相对于其包含不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列，其中LCVR包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：10和11所示的氨基酸序列，或相对于其包含不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：12和13所示的氨基酸序列，或相对于其包含不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO：14、15和16所示的氨基酸序列，或相对于其包含不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述改变是氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入。
在一个实施方案中，本发明提供了多价抗OX40抗体，其中所述多价抗OX40抗体包含至少四个相同的Fab片段，所述Fab片段包含重链可变区(VH)，其中HCVR包含3个互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含选自SEQ ID NO：1、2、3、59、66、67、68和69的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含选自SEQ ID NO：4、5、6和60的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含选自SEQ ID NO：7、8、9、70、71和72的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，本发明提供了多价抗OX40抗体，其中所述多价抗OX40抗体包含至少四个相同的Fab片段，所述Fab片段包含轻链可变区(VL)，其中所述LCVR包含互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含选自SEQ ID NO：10和11所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含选自SEQ ID NO：12和13所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含选自SEQ ID NO：14、15和16所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，本发明提供了多价抗OX40抗体，其中所述多价抗OX40抗体包含至少四个相同的Fab片段，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中HCVR包含3个互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含选自SEQ ID NO：1、2、3、59、66、67、68和69的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含选自SEQ ID NO：4、5、6和60的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含选自SEQ ID NO：7、8、9、70、71和72的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；其中LCVR包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含选自SEQ ID NO：10和11所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含选自SEQ ID NO：12和13所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含选自SEQID NO：14、15和16所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，本发明提供了多价抗OX40抗体，其中所述多价抗OX40抗体包含至少四个相同的Fab片段，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中HCVR包含3个互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；其中LCDR1包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列或由其组成，LCDR2包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列或由其组成，LCDR3包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，本发明的多价抗OX40抗体包含至少四个相同的Fab片段，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中HCVR包含3个互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；其中LCDR1包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列或由其组成，LCDR2包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列或由其组成，LCDR3包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，本发明的多价抗OX40抗体包含至少四个相同的Fab片段，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中HCVR包含3个互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；其中LCDR1包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列或由其组成，LCDR2包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列或由其组成，LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，本发明的多价抗OX40抗体包含至少四个相同的Fab片段，所述Fab片段包含重链可变区VH，其中重链可变区包含选自SEQ ID NO：36、37、38和61的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高同一性的氨基酸序列，或相对于其包含不超过10个，不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的多价抗OX40抗体包含至少四个相同的Fab片段，所述Fab片段包含轻链可变区VL，其包含选自SEQ ID NO：39、40和41所示的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高同一性的氨基酸序列，或相对于其包含不超过10个，不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的多价抗OX40抗体包含至少四个相同的Fab片段，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中重链可变区VH包含选自SEQ ID NO：36、37、38和61的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高同一性的氨基酸序列，或相对于其包含不超过10个，不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列；轻链可变区VL包含选自SEQ ID NO：39、40和41所示的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高同一性的氨基酸序列，或相对于其包含不超过10个，不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述改变是氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入。
在一个实施方案中，本发明的多价抗OX40抗体包含至少四个相同的Fab片段，所述Fab片段包含重链可变区VH，其包含选自SEQ ID NO：36、37、38和61的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，本发明的多价抗OX40抗体包含至少四个相同的Fab片段，所述Fab片段包含轻链可变区VL，其包含选自SEQ ID NO：39、40和41所示的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，本发明的多价抗OX40抗体包含至少四个相同的Fab片段，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中重链可变区VH包含选自SEQ ID NO：36、37、38和61的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区VL包含选自SEQ ID NO：39、40和41所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明的多价抗OX40抗体包含至少四个相同的Fab片段，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中重链可变区VH包含SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区VL包含SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明的多价抗OX40抗体包含至少四个相同的Fab片段，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中重链可变区VH包含SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区VL包含SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明的多价抗OX40抗体包含至少四个相同的Fab片段，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中重链可变区VH包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区VL包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明的多价抗OX40抗体包含至少四个相同的Fab片段，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中重链可变区VH包含SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区VL包含SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，本发明的多价抗OX40抗体包含重链或重链融合多肽，其中重链或重链融合多肽包含选自SEQ ID NO：42、43、45、46、48、49、51、52、53、54、55、56、62、63、64和65的氨基酸序列，或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高同一性的氨基酸序列，或相对于其包含不超过10个，不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的多价抗OX40抗体包含轻链，其中轻链包含选自SEQID NO：44、47、50所示的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高同一性的氨基酸序列，或相对于其包含不超过10个，不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的多价抗OX40抗体包含重链融合多肽和轻链，其中重链融合多肽包含选自SEQ ID NO：51、52、53、54、55、56、64、65的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高同一性的氨基酸序列，或相对于其包含不超过10个，不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列；轻链包含选自SEQ ID NO：44、47、50所示的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高同一性的氨基酸序列，或相对于其包含不超过10个，不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，本发明的多价抗OX40抗体包含重链融合多肽和轻链，其中重链融合多肽包含选自SEQ ID NO：51、52所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ IDNO：44所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明的多价抗OX40抗体包含重链融合多肽和轻链，其中重链融合多肽包含选自SEQ ID NO：53、54所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ IDNO：47所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明的多价抗OX40抗体包含重链融合多肽和轻链，其中重链融合多肽包含选自SEQ ID NO：55、56所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ IDNO：50所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明的多价抗OX40抗体包含重链融合多肽和轻链，其中重链融合多肽包含选自SEQ ID NO：64、65所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ IDNO：47所示的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗体还涵盖抗OX40抗体的氨基酸序列的变体，以及与上文所述的任何抗体结合相同表位的抗体。
在一些实施方案中，本发明的多价抗OX40抗体是IgG1形式的抗体(在抗体命名中以g1表示)或IgG2形式的抗体(在抗体命名中以g2表示)。在一些实施方案中，抗OX40抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗OX40抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗OX40抗体是人抗体。在一些实施方案中，至少部分的抗OX40抗体的框架序列是人共有框架序列。
在一方面，本发明提供能够活化T细胞(例如CD4+T细胞)的具有激动剂活性的多价抗OX40抗体。
在一些实施方案中，多价抗OX40抗体的激动剂活性由T细胞活化后释放的细胞因子的水平来评估。因此，本发明提供了与用IgG对照处理的CD4+T细胞的细胞因子生成相比，提高CD4+T细胞的细胞因子生成的多价抗OX40抗体。在一些实施方案中，该细胞因子是炎性细胞因子，例如IL-2或IFNg。
在一方面，本发明提供了编码以上任何抗OX40抗体或其片段的核酸。在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。在一个实施方案中，提供包含所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞或293细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。
在一个实施方案中，本发明提供制备多价抗OX40抗体的方法，其中所述方法包含在将包含VH-CH1的构建体和包含VL-CL的构建体克隆到表达载体中，转染宿主细胞，并在适于表达编码所述多价抗体的核酸的条件下培养所述宿主细胞，以及任选地分离所述抗体。在某个实施方案中，所述方法还包括从宿主细胞回收抗多价抗OX40抗体。
在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的任何多价抗OX40抗体的组合物，优选地组合物为药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物还包含药用载体。在一些实施方案中，所述药物组合物用于治疗癌症，优选地肺癌(例如非小细胞肺癌)、肝癌、胃癌、结肠癌等。
在一些实施方案中，本发明提供了免疫缀合物，其包含本文中提供的任何多价抗OX40抗体和细胞毒性剂。在一些实施方案中，所述免疫缀合物用于治疗癌症，优选地肺癌(例如非小细胞肺癌)、肝癌、胃癌、结肠癌等。
在一方面中，本发明涉及在受试者中活化T细胞或诱导T细胞介导的抗肿瘤活性或增强机体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何多价抗OX40抗体。本发明还涉及本文所述的任何多价抗OX40抗体制备用于在受试者中活化T细胞或诱导T细胞介导的抗肿瘤活性或增强机体的免疫应答的组合物或药物的用途。
在另一方面中，本发明涉及治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何多价抗OX40抗体。在一个实施方案中，癌症是肺癌(例如非小细胞肺癌)、肝癌、胃癌、结肠癌等。在另一方面，本发明还涉及本文所述的任何多价抗OX40抗体或其片段制备用于在受试者中治疗癌症的药物的用途。在一个实施方案中，癌症是肺癌(例如非小细胞肺癌)、肝癌、胃癌、结肠癌等。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括向所述受试者联合施用有效量的第二药物或活性剂，其中本文所述的多价抗OX40抗体是第一药物。在一些实施方案中，第二药物或活性剂选自化疗剂。在一些实施方案中，第二药物或活性剂选自PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体或抗PD-L2抗体)或者抗血管发生剂(例如贝伐珠单抗)。
在一些实施方案中，受试者或个体是哺乳动物，优选是人。
在一方面中，本发明涉及检测样品中OX40的方法，所述方法包括(a)将样品与本文所述的任何多价抗OX40抗体接触；和(b)检测多价抗OX40抗体和OX40间的复合物的形成。在一个实施方案中，多价抗OX40抗体是被可检测地标记的。
在一些实施方案中，本发明涉及试剂盒或制品，其包含本文所述的任何多价抗OX40抗体。在一些实施方案中，所述试剂盒或制品包含本文所述的多价抗OX40抗体与任选的可药用载体。在一些实施方案中，该试剂盒或制品进一步包含关于施用药物来治疗癌症的说明书。
本发明还涵盖本文所述的任何实施方案的任意组合。本文所述的任何实施方案或其任何组合适用于本文所述的发明的任何和所有抗OX40抗体、方法和用途。
附图说明
图1显示了在CHO细胞中产生的本发明的抗体阻断OX40L与CHO细胞上表达的OX40的结合。
图2通过抗-CD3/抗-CD28刺激加重组OX40L与在CHO细胞中产生的IgG1或IgG2形式的本发明的抗体，在用人OX40和NFkB启动子-luc稳定转染的Jurkat中的荧光素酶报告基因检测。
图3评估了本发明的抗体对OX40信号的激动剂活性。用金黄色葡萄球菌肠毒素E(SEE)(1ng/ml)和在CHO细胞中产生的IgG1或IgG2形式的本发明的OX40抗体的DC共培养测定法进行测定。
图4显示了4xFab mAb的结构，其含有通过外Fab的C末端上的CH1结构域和常规mAb结构中包含的内Fab的N末端与1×GS接头连接的4个相同Fab。
图5.显示了尺寸排阻色谱法对IgG2形式的人四价OX40 mAb：ADI-20057-g2-4xFab的测量
图6.显示了尺寸排阻色谱法对IgG2形式的人四价OX40 mAb：ADI-23515-g2-4xFab的测量
图7.显示了尺寸排阻色谱法对IgG1形式的人四价OX40 mAb：ADI-20112-g1-4xFab的测量
图8显示各抗体的激动剂活性。通过抗-CD3/抗-CD28刺激与293细胞中产生的IgG1、IgG2和4xFab形式的本发明的抗体，用人OX40和NFkB启动子-luc稳定转染的Jurkat中的萤光素酶报告基因检测。
图9显示各抗体的激动剂活性。通过抗-CD3/抗-CD28刺激与293细胞中产生的IgG1、IgG2和4xFab形式的本发明的抗体，混合Raii细胞，用人OX40和NFkB启动子-luc稳定转染的Jurkat中的荧光素酶报告基因检测。
图10评估了本发明的抗-OX40抗体的阻断活性。通过抗-CD3/抗-CD28刺激与重组OX40L和293细胞中产生的IgG1、IgG2和4xFab形式的本发明的抗体，用人OX40和NFkB启动子-luc稳定转染的Jurkat中的荧光素酶报告基因检测。其中图中4xF是4xFab的缩写。
发明详述
定义
在下文详细描述本发明前，应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本发明的范围，其仅会由所附权利要求书限制。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。应当理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项的两项。
如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
本文所用的术语“抗OX40抗体”、“抗OX40”、“OX40抗体”或“结合OX40的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲合力结合人或食蟹猴OX40蛋白或其片段以致所述抗体可以用作靶向人或食蟹猴OX40中的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗OX40抗体与非人或非食蟹猴OX40蛋白结合的程度低于所述抗体与人或食蟹猴OX40结合的约10％，如例如通过放射性免疫测定(RIA)或生物光干涉测定法或MSD测定法测量的。在一些实施方案中，抗OX40的抗体的解离常数(Kd)≤100nM，≤10nM或≤1nM(例如10-7M以下，例如10-7M至10-10M，例如10-8M至10-9M)。
“亲和力”或“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用平衡解离常数(KD)来表述。平衡解离常数是解离速率常数和结合速率常数(分别是kdis和kon)的比值。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括现有技术已知以及本文中所描述的那些。
如本文所用，“单克隆抗体”或“mAb”指来源于例如真核生物的、原核生物的或噬菌体克隆的单一拷贝或克隆的抗体，即，除了通常以很少量存在的可能变体抗体(例如，含有天然突变或在单克隆抗体制品的生产过程中产生的变体抗体)以外，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位。修饰语“单克隆”表示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。单克隆抗体可以例如通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术例如CDR嫁接、或此类或其它本领域已知的技术的组合来产生。
本领域技术人员明了，“全抗体”(在本文中可与“全长抗体”、“完全抗体”和“完整抗体”互换使用)包含至少两条重链(H)和两条轻链(L)。每条重链从N至C端由重链可变区(又称作可变重域或重链可变域，本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(又称作可变轻域或轻链可变域，本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH区和VL区可以进一步再划分为超变区(为互补决定区(CDR)，其间插有较保守的区域(为构架区(FR))。每个VH和VL由三个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。可变区是抗体的重链或轻链中参与抗体与其抗原的结合的结构域。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是显示出多种效应子功能。在本文中，重链的融合多肽指全长抗体的重链与其他肽序列形成的融合多肽，在一个优选的实施方案中，其他肽序列通过其羧基端直接或者通过接头(例如几个氨基酸的接头)融合到所述全长抗体的1条重链的氨基末端。在一个优选的实施方案中，所述的其他肽序列是Fab片段，从而形成VH-CH1-重链(即，Fab-重链)的融合多肽。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。“天然序列Fc结构域”包含与在自然界中找到的Fc结构域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc结构域包括例如天然序列人IgG1Fc结构域(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc结构域；天然序列人IgG3Fc结构域；和天然序列人IgG4Fc结构域；及其天然存在变体。
抗体的“结合位点”或“抗原结合位点”是抗体分子中与抗原实际结合的区域。在一个优选的实施方案中，抗原结合位点由抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)组成的VH/VL对构成。
“抗原结合片段”是比完整或完全抗体的氨基酸残基数要少的完整或完全抗体的一部分或一段，其能结合抗原或与完整抗体(即与抗原结合片段所来源的完整抗体)竞争结合抗原。抗原结合片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、双链抗体(diabody)、单结构域抗体(sdAb)、单链抗体分子(例如scFv)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)、微抗体(minibody)、单结构域抗体(sdAb)。所述Fab片段是一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，例如，通过木瓜蛋白酶消化完全抗体能够获得Fab片段。可以借接头将Fab的轻链(L链)和重链(H链)融合构建成单一多肽链，即单链Fab(scFab)(参见例如US20070274985A1)。通过胃蛋白酶在铰链区的二硫键下面消化完全抗体产生F(ab′)2，其为Fab′的二聚体，是二价的抗体片段。F(ab′)2可以在中性条件下通过破坏铰链区中的二硫键而被还原，从F(ab′)2二聚体转化为Fab′单体。Fab′单体基本上是具有铰链区的Fab片段。Fab′-SH是这样的Fab′，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。Fv片段由抗体单臂的VL和VH结构域组成。另外，可以使用重组方法，将独立编码Fv片段的两个结构域VL和VH的基因，通过编码连接肽(接头)的核酸序列连接在一起，重组表达形成单链Fv或“scFv”，在所述单条蛋白链中VL区和VH区配对以形成所需的结构。
本领域已知根据重链恒定区氨基酸序列，可以将抗体划分为五个主要的类别：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，另外，这些抗体中的数个可以进一步被划分为亚类(同种型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α，δ，ε，γ和μ。根据轻链恒定区氨基酸序列，抗体轻链可归入两种类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(入)。
“IgG形式的抗体”是指抗体的重链恒定区是γ链。γ链有多种亚类，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。在本文中对于IgG1类的抗体在抗体命名时加后缀-g1，在本文中对于IgG2类的抗体在抗体命名时加后缀-g2。
术语“双链抗体(diabody)”指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段在同一多肽链中包含通过短接头连接的VL和VH。在双链抗体中，由于接头过短，同一链上的VH和VL两个结构域之间无法配对，而被迫与另一条链的互补结构域配对从而产生两个抗原结合位点。双链抗体可以是二价的或双特异性的。双链抗体更充分地描述于例如EP 404，097；WO1993/01161；Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)；和Hollinger等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：6444-6448(1993)中。三链抗体和四链抗体同样描述于Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)和邵荣光等人(编辑)，抗体药物研究与应用，人民卫生出版社(2013)。单结构域抗体(sdAb)通常指这样的抗体，其中单个可变结构域(例如，重链可变结构域(VH)或轻链可变结构域(VL)、衍生自骆驼科重链抗体的重链可变结构域、衍生自鱼类IgNAR的VH样单结构域(v-NAR))即可赋予抗原结合，而不需要与另一可变结构域相互作用以识别靶抗原。(关于抗体片段的更详细的描述，也可以参见：基础免疫学(Fundamental Immunology)，W.E.Paul编辑，Raven Press，N.Y.(1993))。
术语“Fc结构域”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc结构域和变体Fc结构域。例如在天然抗体中，Fc结构域由两个相同的蛋白质片段组成，其源自IgG、IgA和IgD同种型中抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域；IgM和IgE Fc结构域在每条多肽链中含有三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。在某些实施方案中，人IgG重链的Fc结构域从Cys226或Pro230延伸至重链的羰基端。然而，Fc结构域的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外说明，Fc结构域或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据Kabat EU编号系统，其也被称为Kabat EU 索引，如在Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.PublicHealth Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991中所述。
“功能性Fc结构域”拥有天然序列Fc结构域的“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括C1q结合、CDC、Fc受体结合、ADCC、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体、BCR)下调等。此类效应器功能一般要求Fc结构域与结合结构域(例如抗体可变域)联合，而且可以使用多种测定法来评估，例如本文定义中所公开的。
术语“...价”抗体指抗体分子中存在的抗原结合位点的数目。“二价”、“三价”和“四价”抗体指抗体分子中分别存在2个抗原结合位点、3个结合位点和4个结合位点。在一个实施方案中，这些抗原结合位点可以结合不同的抗原表位，在另一个实施方案中，这些抗原结合位点结合相同的抗原表位。在一个实施方案中，本文中报道的抗体是“四价的”。
“多价抗体”是指具有几个但至少四个可变结构域的抗体。有利的是多价抗体具有四个或八个可变结构域，即它是二价或四价的。此外，可变结构域可以彼此相同或不同，使得抗体构建体识别一种或几种抗原或抗原表位。多价抗体优选地识别一种或两种抗原，即它们分别是单特异性或双特异性的。
与抗体相关的术语“变体”在本文中指，包含已经通过至少1个，例如1-30，或1-20或1-10个，例如1或2或3或4或5个氨基酸取代、缺失和/或插入而具有氨基酸改变的目标抗体区域(例如重链可变区或轻链可变区或重链CDR区或轻链CDR区)的抗体，其中变体基本上保持改变之前的抗体分子的生物学特性。在一方面，本发明涵盖在本文中所述及的任何抗体的变体。在一个实施方案中，抗体变体保持改变前抗体的至少60％，70％，80％，90％，或100％的生物学活性(例如抗原结合能力)。在一些实施方案中，所述改变不导致抗体变体丧失对抗原的结合，但任选地可以赋予诸如提高的抗原亲和力和不同的效应子功能等性质。可以理解的，抗体的重链可变区或轻链可变区、或各CDR区可以单独改变或组合改变。在一些实施方案中，在一个或多个或全部三个重链CDR中的氨基酸改变不超过1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个。优选地，所述氨基酸改变为氨基酸取代，优选保守取代。
在一些实施方案中，抗体变体与亲本抗体在目的抗体序列区域上具有至少80％、90％或95％或99％或更高的氨基酸同一性。在另一实施方案中，本发明抗体，与表A-E所列任一抗体相比，在重链可变区上具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％或更高的序列同一性。在再一实施方案中，本发明抗体与表A-E所列任一抗体相比，在轻链可变区上具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％或更高的序列同一性。在再一实施方案中，本发明抗体与表A-E所列任一抗体相比，在重链可变区和/或轻链可变区上具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％或更高的序列同一性。在再一实施方案中，本发明抗体与表A-E所列任一抗体相比，在重链(或重链融合多肽)和/或轻链上具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％或更高的序列同一性。
表述“接头”是指适于将Fv片段，或者将Fab片段彼此连接的分子。在一个实施方案中，该分子可以是天然肽或者是人工合成的肽。肽接头可以含有任何氨基酸，优选氨基酸甘氨酸(G)，丝氨酸(S)和脯氨酸(P)。肽接头可以彼此相同或不同。肽接头的非限定性例子公开于Shen等人，Anal.Chem.80(6)：1910-1917(2008)、WO2012/138475和WO2014/087010，将其内容全文并入作为参考。此外，肽接头可以具有约0至10个氨基酸的长度。在前一种情况下，肽接头仅是来自可变结构域之一的COOH残基和另一个可变结构域的NH 2残基的肽键。肽接头优选包含氨基酸序列GG。肽接头也可以具有约3至10个氨基酸，特别是5个氨基酸的长度，最特别是氨基酸序列GGGGS，其用于实现Fv片段或者Fab片段的连接。在多价抗体的构建中，优选，接头将利于促使VH和VL配对，且不干扰VH和VL对形成功能有效的抗原结合位点。
可以用于本发明的肽接头的实例包括：甘氨酸聚合物(G)n；甘氨酸-丝氨酸聚合物(G1-5S1-5)n，其中n是至少1、2、3、4或5的整数；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；以及本领域已知的其它柔性接头。本领域技术人员可以理解，在一些实施方案中，VH和VL之间的接头可以完全由柔性连接肽组成，或者接头可以由柔性连接肽部分以及赋予较小柔性结构的一个或多个部分组成。
根据本发明的多价抗体可以通过常规方法产生。一种方法是有利的，其中编码肽接头的DNA与编码多价抗体Fv片段、Fab片段的DNA连接，使得肽接头将Fv片段、Fab片段彼此连接，并且所得的DNA分子在表达质粒中表达。
编码根据本发明的多价抗体的DNA也是本发明的主题。
本发明的另一主题涉及试剂盒，其包含：
(a)根据本发明的多价抗体构建体，和/或
(b)根据本发明的表达质粒、含有质粒的载体或包含载体的宿主细胞，和
(c)常规助剂，例如缓冲剂，溶剂和对照。
根据本发明的多价抗体完全适于不仅用于诊断而且用于治疗目的。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％以上的所述参照抗体与其抗原的结合，反之，参照抗体在竞争测定中阻断50％以上的该抗体与其抗原的结合。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如NK细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型免疫球蛋白使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337或美国专利No.6,737,056(Presta)中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括PBMC和NK细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所披露的。本文实施例中提供了用于评估ADCC活性的一种例示性测定法。
如本文中使用的，“抗体的激动剂活性”指抗体能活化它所结合的抗原的生物学活性。
“免疫原性”指特定物质引发免疫应答的能力。肿瘤是免疫原性的，并且增强肿瘤免疫原性有助于通过免疫应答清除肿瘤细胞。
“效应子功能”指那些可归于抗体Fc结构域且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。在某些实施方案中，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)，天然杀伤(NK)细胞，单核细胞，细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如血液。
适用于本发明的“抗体及其抗原结合片段”包括但不限于多克隆、单克隆、单价、双特异性、异缀合物、多特异性、重组、异源、异源杂合、嵌合、人源化(特别是嫁接有CDR的)、去免疫的、或人的抗体、Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、由Fab表达库产生的片段、Fd、Fv、二硫化物连接的Fv(dsFv)、单链抗体(例如scFv)、双链抗体或四抗体(Holliger P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(14)，6444-6448)、纳米抗体(nanobody)(也称为单域抗体)、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对本发明抗体的抗Id抗体)和上述任一种的表位结合片段。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。(参见，例如，Kindt等Kuby Immunology，6thed.，W.H.Freeman and Co.91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。此外，可以使用来自与特定抗原结合的抗体的VH或VL结构域来分离结合所述抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等，Nature 352：624-628(1991)。
“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”(在本文中与超变区“HVR”可以互换使用)，是抗体可变区中主要负责与抗原表位结合的氨基酸区域。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本领域公知多种用于在一个给定的VH或VL氨基酸序列中确定其CDR序列的方案：Kabat互补决定区(CDR)是基于序列变异性确定的并且是最常用的(Kabat等人，Sequencesof Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1991))，而Chothia指的是结构环的位置(Chothia等人，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人(1989)Nature 342：877-883)，AbMHVR是Kabat HVR和Chothia结构环之间的折中，并且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用，“接触性”(Contact)HVR基于对可获得的复杂晶体结构的分析。根据不同的CDR确定方案，这些HVR中的每一个HVR/CDR的残基如下所述。
Figure BDA0002076936890000131
在一个实施方案中，本发明抗体的HVR是根据Kabat编号系统位于如下位置的HVR序列：
VL中的位置24-34(LCDR1)、位置50-56(LCDR2)、和位置89-97位置(LCDR3)，以及VH中的位置27-35B或31-35B(HCDR1)、位置50-65(HCDR2)、和位置93-102或95-102(HCDR3)。
在一个实施方案中，本发明抗体的HVR是根据Kabat编号系统位于如下位置的HVR序列：
VL中的位置24-34(LCDR1)、位置50-56(LCDR2)、和位置89-97(LCDR3)，以及VH中的位置27-35B(HCDR1)、位置50-65(HCDR2)、和位置93-102(HCDR3)。
在一个实施方案中，本发明抗体的HVR是根据Kabat编号系统位于如下位置的HVR序列(Kabat定义的CDR)：
VL中的位置24-34(LCDR1)、位置50-56(LCDR2)、和位置89-97(LCDR3)，以及VH中的位置31-35B(HCDR1)、位置50-65(HCDR2)、和位置95-102(HCDR3)。
HVR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat编号位置而确定。
除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”或“HVR”或“HVR序列”涵盖以上述任一种方式确定的HVR或CDR序列。
除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统(Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1991))的编号位置。
在一个实施方案中，本发明CDR序列如下表I所示。
表I：
Figure BDA0002076936890000141
在一个实施方案中，本申请要求保护的抗体的CDR来自表C中所列的VH和/或VL区的CDR。
具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。然而，尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat，Chothia，AbM和Contact方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。例如，在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或Chothia定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含与表A-E所列任一抗体的对应CDR相同的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR，或其变体。在一些实施方案中，本发明的抗体包含与表A-E所列任一抗体的对应重链CDR相同的至少一个、两个、或三个HCDR，或其变体。在一些实施方案中，本发明的抗体包含与表A-E所列任一抗体的对应轻链CDR相同的至少一个、两个、或三个HCDR，或其变体。在本文中，“对应CDR”是指在可变区氨基酸序列中位于基本相似位置上的CDR。在本文中，CDR变体是已经通过至少一个，例如1或2或3个氨基酸取代、缺失和/或插入而修饰的CDR，其中包含CDR变体的抗原结合分子基本上保持包含未修饰CDR的抗原结合分子的生物学特性，例如，保持至少60％，70％，80％，90％，或100％的生物学活性(例如抗原结合能力)。可以理解，各CDR可以单独修饰或组合修饰。优选地，氨基酸修饰为氨基酸取代，尤其是保守氨基酸取代，例如说明书中所列出的优选保守氨基酸置换。
“框架”或“F R”是指除高变区(HVR)(例如互补决定区)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1，FR2，FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常出现在重链可变结构域(VH)(或轻链可变结构域(VL))的以下序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
除非另有说明，抗体各个结构域中的残基的编号根据EU编号系统，其也被称为EU索引，如在Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。
“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域以紧密的，非共价缔合的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接从而使轻链和重链可以以类似于双链Fv种类的“二聚体”结构缔合。在这种构型中，每个可变结构域的三个HVRs相互作用从而限定在VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。总而言之，六个HVRs将抗原结合特异性赋予抗体。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个HVRs的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和性低于完整结合位点。关于scFv的综述参见例如Pluckthun于The Pharmacology of MonoclonalAntibodies，卷113，Rosenburg和Moore编辑，(Springer-Verlag，New York，1994)，pp.269-315中。
“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于这样抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是指这样的框架，即在选择人免疫球蛋白VL或VH框架序列中，其代表最常出现的氨基酸残基。一般而言，对人免疫球蛋白VL或VH序列的选择是从可变结构域序列的亚型中选择。一般而言，该序列的亚型是如Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，1-3卷中的亚型。在一个实施方案中，对于VL，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型III。
多价抗体根据不同的组成部分以及构建方式，可以分为许多种类。不同的多价抗体设计各有利弊，例如，虽然Blinatumomab可以通过重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行大规模培养生产，但是容易形成聚集物、在体内半衰期很短，实际使用的时候需要额外配备连续输液装置；Catumaxomab生产工艺复杂且鼠异源抗体比较容易在人体产生免疫原性问题。此外，四链免疫球蛋白(Ig)样多特异性抗体中非相关重链和轻链的不想要配对导致无活性抗原结合位点和/或其他无功能的不想要的副产物的形成，这在抗体的临床规模生产和治疗性应用中也是一个问题(Klein，C.等人，Progress in overcoming the chainassociation issue in bispecific heterodimeric IgG antibodies，mAbs，2012，4：653-663)。理论上，两条重链能够按四种不同的组合方式缔合，并且这些重链中每一者均可以按随机方式与轻链缔合，产生24(＝总计16)种可能的链组合。在这16种理论上可能的组合当中，实际上发现了10种组合，但其中仅一种组合对应于所需功能性的多特异性抗体。难以从复杂混合物分离出所需的一种多特异性抗体和理论上最大12.5％的固有不良产率致使在细胞表达体系中产生四链Ig样多特异性抗体是困难的。
本申请提供了一种新型的多价抗体，其具有4个Fab片段，该构建体在细胞中可以高的纯度和产量表达，优选纯度和/或产量至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
术语“功能障碍”在免疫功能障碍的背景中指降低的对抗原性刺激的免疫响应性的状态。如本文中使用的，术语“功能障碍”还包括对抗原识别的不感受或不响应，特别地，将抗原识别转化成下游T细胞效应器功能，诸如增殖，细胞因子生成(例如γ干扰素)和/或靶细胞杀伤的能力受损。
“活化T细胞”意指诱导，引起或刺激效应或记忆T细胞具有更新，持续或放大的生物学功能。增强T细胞功能的例子包括：相对于干预前的此类水平，升高的来自CD8+效应T细胞的γ-干扰素(例如IFNg)或白细胞介素(例如IL-2)分泌，升高的来自CD4+记忆和/或效应T细胞的γ-干扰素(例如IFNg)或白细胞介素(例如IL-2)分泌，升高的CD4+效应和/或记忆T细胞增殖，升高的CD8+效应T细胞增殖，升高的抗原响应性(例如清除)。在一个实施方案中，增强的水平是至少50％，或者60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、2倍、3倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。测量此增强的方式是本领域普通技术人员已知的。
“肿瘤免疫”指肿瘤逃避免疫识别和清除的过程。如此，作为治疗概念，肿瘤免疫在此类逃避减弱时得到“治疗”，并且肿瘤被免疫系统识别并攻击。肿瘤识别的例子包括肿瘤结合，肿瘤收缩和肿瘤清除。
“抗血管发生剂”指阻断或在某种程度上干扰血管发育的化合物。抗血管发生剂可以是例如结合涉及促进血管发生的生长因子或生长因子受体的小分子或抗体。在一个实施方案中，抗血管发生剂是结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体，诸如贝伐单抗(AVASTIN)。
术语“PD-1轴结合拮抗剂”是指如下的分子，其抑制PD-1轴结合配偶与一种或多种它的结合配偶相互作用，从而去除源自PD-1信号传导轴上的信号传导的T细胞功能障碍，一项结果是恢复或增强T细胞功能(例如增殖，细胞因子生成，靶细胞杀伤)。如本文中使用的，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂(例如抗PD-1抗体，例如是WO2015/095423中公开的MDX-1106(nivolumab)、MK-3475(pembrolizumab)、CT-011(pidilizumab)或AMP-224)，PD-L1结合拮抗剂(例如抗PD-L1抗体，在一个具体方面，抗PD-L1抗体是WO2015/095423中公开的YW243.55.S70、MDX-1105、MPDL3280A或MEDI4736)和PD-L2结合拮抗剂(例如抗PD-L2抗体，免疫粘附素)。
如本文中使用的，术语“OX40”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类(例如人、食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然OX40，除非另有说明。该术语涵盖“全长”，未加工的OX40以及因细胞中的加工所致的任何形式的OX40。该术语还涵盖OX40的天然发生变体，例如剪接变体或等位变体。
“OX40活化”指OX40的活化。通常，OX40活化导致信号转导。
术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂例子参见WO2015/153513中所公开的那些，包括但不限于：放射性同位素；化学治疗剂或药物；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌，真菌，植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及各种抗肿瘤或抗癌剂。
“化疗剂”包括在治疗癌症中有用的化学化合物。化疗剂的例子参见WO2015/153513中所公开的那些。化疗剂还包括(i)起调节或抑制激素对肿瘤作用的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素类和选择性雌激素受体调控物类(SERM)；(ii)抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂；(iii)抗雄激素类；(iv)蛋白质激酶抑制剂；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常细胞增殖的信号传导途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α，Ralf和H-Ras；(vii)核酶，诸如VEGF表达抑制剂(例如
Figure BDA0002076936890000171
和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗，诸如基因疗法疫苗；和(ix)及任何上述药剂的药学可接受盐，酸和衍生物。化疗剂还包括抗体。许多市售的抗体可以与本发明化合物组合使用。
术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子，单核因子；白介素(IL)，诸如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL-15；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)和γ-干扰素。如本文中使用的，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物，包括通过人工合成产生的小分子实体，及其药剂学可接受的衍生物和盐。
术语“有效量”指本发明的抗体或片段这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在治疗的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；它的大小、年龄和一般健康；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换地使用且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和来源于其的子代，而不考虑传代的数目。子代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体子代。
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括但不限于鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)，肺癌(包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺的腺癌，和肺的鳞癌)，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌)，胰腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，尿道癌，肝瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，黑素瘤，浅表扩散性黑素瘤，恶性雀斑样痣黑素瘤，肢端黑素瘤，结节性黑素瘤，多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，毛细胞性白血病，慢性成髓细胞性白血病，和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)，以及与瘢痣病(phakomatoses)，水肿(诸如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖，脑瘤和脑癌，以及头颈癌，及相关转移。在某些实施方案中，适合于通过本发明的抗体来治疗的癌症包括肺癌(例如非小细胞肺癌)、肝癌、胃癌或结肠癌，包括那些癌症的转移性形式。
术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。
术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”，“癌性”，“细胞增殖性病症”，“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。
“个体”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体是这样的抗体，其已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将抗体纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。
“分离的”核酸是指这样的核酸分子，其已经与其天然环境的组分分离。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
“分离的编码多价抗OX40抗体的核酸”是指一个或多个核酸分子，其编码抗体重和轻链，包括在单一载体或分开的载体中的这样的核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的这样的核酸分子。
相对于参比多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将所述序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参比多肽序列中的相同氨基酸残基的百分比。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。
当在本申请中提到序列同一性的百分比时，若未另外特别指出，这些百分比相对于较长序列的全长计算。相对于较长序列的全长计算适用于核酸序列和多肽序列两者。
术语“药物组合物”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
术语“药用载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂或媒介物。
用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。
术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。
“受试者/患者样品”指从癌症患者或癌症受试者得到的细胞或流体的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。肿瘤样品的例子在本文中包括但不限于肿瘤活检、细针吸出物、支气管灌洗液、胸膜液(胸水)、痰液、尿液、手术标本、循环中的肿瘤细胞、血清、血浆、循环中的血浆蛋白质、腹水、衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症，用法，剂量，施用，联合疗法，禁忌症和/或警告的信息。
实施例
除非明确指明相反，否则本发明的实施将采用本领域技术内的常规化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的方法。这些方法的描述可以参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(第3版，2001)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，1989)；Maniatis 等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1982)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley和Sons，2008年7月更新)；ShortProtocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Pub.Associates和Wiley-Interscience；Glover，DNACloning：A Practical Approach，vol.I&II(IRL Press，Oxford，1985)；Anand，Techniquesfor the Analysis of Complex Genomes，(Academic Press，New York，1992)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins，Eds.，1984)；Perbal，A PracticalGuide to Molecular Cloning(1984)；Harlow和Lane，Antibodies，(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1998)Current Protocols in ImmunologyQ.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach和W.Strober，eds.，1991)；Annual Review of Immunology；以及期刊专著如Advances in Immunology。
实施例1.抗OX40单克隆抗体的制备
抗体生产和纯化
本发明的示例抗体的CDR区、轻链可变区和重链可变区、轻链和重链的氨基酸序列，以及对应的核苷酸序列在本申请的表A-E部分及“序列表”部分列出。另外，上述本发明示例抗体的轻链可变区和重链可变区的序列编号如下表所示。
表1
抗体名称 VH yL
ADI-20112 SEQ ID NO：38 SEQ ID NO：41
ADI-20078 SEQ ID NO：61 SEQ ID NO：40
ADI-23515 SEQ ID NO：37 SEQ ID NO：40
ADI-20057 SEQ ID NO：36 SEQ ID NO：39
在酵母或CHO-S细胞或HEK293细胞中表达并且纯化本发明的如下抗OX40抗体
对于酵母材料：
使表达相应抗体的酵母克隆在适当培养基上生长至饱和，然后在30℃下振荡培养并用IPTG诱导48小时。诱导后，将酵母细胞沉淀并收获上清液用于抗体的纯化。根据制造商的说明书，使用蛋白A柱纯化IgG并用乙酸(PH 2.0)洗脱。根据制造商的说明书，使用木瓜蛋白酶消化纯化的抗体以产生相应的Fab片段并通过KappaSelect(GE HealtheareLifeSciences)对该Fab进行纯化。
对于CHO-S细胞的处理：
根据制造商的说明书使用
Figure BDA0002076936890000191
试剂盒(Invitrogen)产生表达CHO-S细胞系。对于mAb表达，将编码重链和轻链的DNA序列一起插入到pCHO1.0质粒(Invitrogen)中，其中重链在轻链的上游，重链以酶切位点AvrII/Bstz17，轻链以酶切位点EcorV/PacI插入pCHO1.0质粒。将全长人OX40 CDS序列(Sinobiologics)插入到pCHO1.0载体中用于产生稳定的过表达细胞系。
对于HEK293细胞的处理：
对于HEK293细胞中蛋白质的瞬时表达，使用载体PTT5，其中将编码抗体的重链和轻链的DNA通过酶切位点XhoI/NotI分别克隆到单独的载体中。使用本领域的常规标准步骤用PEI(Polysciences)进行对HEK293细胞的转染；之后培养7天，收集上清液，并在AKTA系统(GE)上纯化上清液中表达的相应抗体。
获得上述四个示例抗体。
对照抗体是
pogalizumab
Hu106-222
11D4
tavolixizumab
如本文所用，pogalizumab是在HEK293细胞中瞬时表达的人IgG1 OX40抗体，其利用来自INN：列表114(参见http：//www.who.int/medicines/publications/ druginformation/innlists/PL114.pdf)的重链和轻链序列。如本文所用，Hu106-222是在HEK293细胞中瞬时表达的人源化IgG1 OX40抗体，其利用来自US9006399的重链和轻链序列。如本文所用，11D4是在HEK293细胞中瞬时表达的人源化IgG1 OX40抗体，其利用来自US8236930的重链和轻链序列。如本文所用，tavolixizumab是在HEK293细胞中瞬时表达的人源化IgG1 OX40抗体，其利用来自INN：列表115(参见http：//www.who.int/medicines/ publications/druginformation/innlists/PL115.pdf)的重链和轻链序列。
本文中示例性的序列参见如下的表A-E：
Figure BDA0002076936890000211
Figure BDA0002076936890000221
Figure BDA0002076936890000231
Figure BDA0002076936890000241
Figure BDA0002076936890000251
Figure BDA0002076936890000261
Figure BDA0002076936890000271
实施例2：抗OX40抗体的结合动力学和亲和力测定
本申请采用生物光干涉测量(BLI，ForteBio)测定法测定本发明抗体结合人OX40的动力学和平衡解离常数(KD)。
BLI KD测定(生物光干涉法)
BLI亲和力测定按照现有的方法(Estep，P等人，High throughput solutionBased measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs，2013.5(2)：p.270-8)进行。简言之，传感器在分析缓冲液中线下平衡30分钟，然后线上检测60秒建立基线，在线加载如上所述获得的经纯化的抗体至AHQ传感器(ForteBio)上进行亲和测量。再将具有加载的IgG的传感器暴露于100nM的OX40抗原中作用5分钟，之后将传感器转移至分析缓冲液解离5分钟用于解离速率测量。使用1∶1结合模型进行动力学的分析。
在如该测定法所述进行的实验中，ADI-20057、ADI-20112和ADI-23515(在酵母中表达的IgG1形式的抗OX40抗体的Fab)在小于两位数nM范围内以单价KD结合人OX40_Fc(结合了抗体Fc部分的人OX40，购自R&D Systems)。当抗体在传感器尖端上时，ADI-20112、ADI-23515和ADI-20057(以IgG1形式且在酵母中表达)在个位数的纳摩尔至亚纳摩尔的范围以双价(avid)KD值结合人OX40_Fc，ADI-20112、ADI-23515和ADI-20057(以IgG1形式且在酵母中表达)以个位数的纳摩尔水平结合食蟹猴OX40_Fc(cyno OX40_Fc，购自AcroBiosystems)。当抗体在传感器尖端上时，ADI-23515(以IgG1形式且在酵母中表达)以8.98E-09nM结合小鼠OX40_Fc(购自Acro Biosystems)(表2)。作为阳性对照的11D4表现相似的结合亲和力。
表2：通过生物光干涉测量IgG1形式的本发明的抗体的结合
Figure BDA0002076936890000281
实施例3：本发明抗OX40抗体与人OX40的结合
结合CHO细胞上的人OX40
可以在基于流式细胞术的测定法中测量本发明的抗体与人OX40的结合。
通过多克隆酶切位点(AvrII/PacI)将编码人OX40的cDNA(Sinobiologics)克隆到pCHO1.0载体(Invitrogen)上，然后通过常规转染方法产生并筛选过表达人OX40的CHO细胞(CHO-hOX40细胞)。将CHO-hOX40细胞(细胞密度：0.2×106)与100nM的实验抗体在含0.1％BSA的PBS中在冰上孵育30分钟。然后将细胞洗涤至少两次，并与二抗(藻胆色素蛋白(Phycoerythrin，PE(SouthernBiotech))标记的，终浓度为5μg/ml)在含0.1％BSA的PBS中在冰上(避光)孵育30分钟。将细胞洗涤至少两次并通过流式细胞术进行分析。在Canto II系统(BD Biosciences)上进行流式细胞术，并相应地计算MFI。
实验结果表明：在本测定法中，ADI-20057、ADI-23515和ADI-20112对过表达人OX40的CHO细胞有高的结合强度，在MFI值方面与不表达OX40的CHO细胞相比，具有超过1500倍的差异(表3)。11D4作为阳性对照，也显示出＞1500倍的差异。
表3：通过流式细胞术的酵母中产生的本发明IgG1形式的抗体结合表达人OX40的CHO细胞
Figure BDA0002076936890000291
实施例4.在CHO细胞中产生的OX40抗体的药物动力学
药物动力学测定法
将本发明抗体ADI-20078-IgG1、ADI-20078-IgG2、ADI-20112-IgG1、ADI-20112-IgG2i.v.以10mg/kg剂量给药给雌性Balb/C小鼠后，评估药物动力学数据。基于体重将相应的剂量体积注射到小鼠中。
在开始给药时开始计时血液采集的时间。对于i.v.施用，时间点包括0.083小时(5分钟)直到第21天。在每个时间点从三只小鼠采集血液。将约100μl血液收集到微量离心管中。将血液样品在冰上在3000RPM的速度设置下储存至少10分钟，以获得约40-50ul的血清。
通过使用夹心ELISA方法的免疫测定法来测定给药小鼠的抗体的血清浓度。简言之，在0.2M碳酸盐缓冲溶液(CBS)(PH9.4)中在4℃下用lug/mL的OX40(ACRO，目录号#1044-5CIS1-AF)包被微量滴定板(Nunc，cat#442404)过夜。洗涤后，然后将板在环境温度下用5％脱脂乳封闭1.5小时，将小鼠血清样品施加到包被的板上，在室温下持续1.5小时。将抗-OX40抗体稀释于的正常小鼠血清中制备范围为0.315-80ng/mL的标准曲线。
使用在0.05％PBST(0.05％Tween的PBS溶液)、5％BSA中以1∶100,000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗人Fc抗体(Bethyl，cat#A80-104P-84)检测结合的抗-OX40抗体。在洗涤步骤后，将板用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸盐溶液(TMB)在室温下显色10-15分钟，在5分钟后通过加入2N硫酸终止。使用Thermo ELISA板读数器(Multiskan FC)，在450nm下测量光密度，减去620nm参考波长。定量基于使用Skanit Software3.1(Thermo)制备的标准曲线的四参数逻辑(1/Y2)回归。
通过基于具有各组浓度平均值的非房室模型(non-compartmental model)的PKSolver软件分析PK参数(Cmax，AUC，t1/2，C1和Vss)。
表4
Figure BDA0002076936890000292
Figure BDA0002076936890000301
实施例5.本发明抗体对人OX40L与OX40相互作用的阻断
1.本发明抗体对人OX40L与CHO细胞上的OX40相互作用的阻断
可以通过流式细胞术测量本发明的抗体阻断人OX40与OX40L结合的能力。
将CHO细胞(密度：0.2×106)与实验抗体(100nM)在含0.1％BSA的PBS中在冰上孵育30分钟。然后将细胞洗涤3次，并与融合至小鼠Fc(～10μg/ml)的OX40L(～10μg/ml)在含0.1％BSA的PBS中在冰上(避光)孵育30分钟。将细胞洗涤3次，随后在含0.1％BSA的PBS中在冰上与抗鼠FC-FITC二抗孵育30分钟。洗涤后通过流式细胞术分析细胞。在Accuri C6系统(BD Biosciences)上进行流式细胞术，并且在C6软件上计算MFI。
实验结果表明：在所述实验中，ADI-20057-g2、ADI-23515-g2和ADI-20112-g1(分别为IgG2(g2)和IgG1(g1)形式，并在CHO细胞中表达)阻断人OX40L(60μg/ml)与OX40(ACRO，目录号#1044-5CIS1-AF)的结合，在较高浓度下与Pogalizumab相比显示较低的阻断活性，但是与OX40L具有相似的水平(图1)。ADI-20057-g2显示非常低的阻断水平，类似于IgG对照(图1)。
2.基于荧光素酶报告基因的OX40阻断测定法
可以通过测量抗体阻断OX40L介导的OX40活化的性能来评估本发明的抗-OX40抗体的阻断活性。使用抗-CD3(2μg/ml，Biolegend)、抗-CD28(2μg/ml，Biolegend)和重组OX40L(60μg/ml；Acro Biosystems)，与增加浓度的抗-OX40抗体在溶液中持续18小时，活化过表达人OX40和NFkB-荧光素酶构建体的Jurkat细胞，然后在细胞裂解和加入底物后进行检测和吸光度测量。
结果发现：Pogalizumab在大于约0.08nM或更高的浓度下容易阻断基于OX40L的活化，而在CHO细胞中产生的人IgG1型抗OX40抗体ADI-20112-g1和人IgG2型抗OX40抗体ADI-23515-g2，在20nM及以上浓度可以阻断基于OX40L的活化(图2)。此外发现，抗OX40抗体ADI-20057-g2增加了萤光素酶的水平，表明其具有非OX40L阻断属性并且对OX40聚集具有贡献(图1)。
实施例6.本发明的抗OX40抗体的激动剂活性
可以通过测量T细胞活化后由T细胞释放的炎性细胞因子来评价本发明的抗-OX40抗体的激动剂活性。
1.混合淋巴细胞反应/DC-T细胞共培养测定法
可以通过在混合淋巴细胞反应期间或DC-T细胞共培养测定法测量IL-2的释放评估本发明的抗体对OX40信号的激动剂活性。将2×106个PBMC铺板在6孔组织培养板的每个孔中或T25组织培养瓶中，在完全T细胞培养基中，37℃，5％CO2气氛中培养。将细胞孵育2-3小时，以允许单核细胞PBMC附着。如果附着不足，则使用无血清培养基。通过用3X新鲜培养基(X-VIVO 15，Lonza公司)轻轻地涡旋烧瓶除去未附着的细胞。
通过在含有1％AB血清、10mM HEPES、50μMβ-Me、IL-4(1000U/ml)和GM-CSF(1000U/ml)，或各25-50ng/ml的X-VIVO 15培养基中培养来自PBMC的单核细胞(1×106个细胞/ml)产生的未成熟骨髓DC细胞。2天后，加入补充有IL-4和GM-CSF的新鲜培养基X-VIVO 15。在第5天，将细胞冷冻或通过加入含有rTNFa(1000U/ml)、IL-1b(5ng/ml)、IL-6(10ng/ml)和1μMPGE2的刺激混合物、以3×105个细胞/ml的细胞密度持续2天诱导成熟。根据在UntouchedCD4+T细胞分离试剂盒(Invitrogen)中制造商的说明书进行T细胞分离。装有1.5ml试管架的磁体用于去除不需要的磁珠(QIAGEN)。
将100,000-200,000个分离的T细胞与10,000-20,000个同种异体moDC以总体积200μl在96-圆底组织培养板中混合，在37℃下持续4-5天。加入金黄色葡萄球菌肠毒素E(staphylococcal entertoxin E，缩写为SEE)(1ng/ml)以增加T细胞活化。在混合淋巴细胞实验(MLR)的开始加入测试抗体，并在整个培养期间孵育。根据制造商(eBioscience)的说明书进行IL-2的检测。在Multiskan FC系统(Thermo)上测定OD测量值。
结果表明，在本测定中，在CHO细胞中表达的IgG2形式的人抗体ADI-23515-g2和人IgG1形式抗体ADI-20112-g1和在CHO细胞中表达的人IgG2形式的抗体ADI-20057-g2，在～13.3μg/ml、～4.4μg/ml和～1.48μg/ml浓度下增加IL-2的分泌，其增加IL-2分泌的能力等同于或优于pogalizumab、11D4、Hu106-222和tavolixizumab(图3)。Pogalizumab在所有浓度下具有差的激动剂活性，40μg/ml的11D4、Hu106-222、tavolixizumab、ADI-23515-g1和ADI-20112-g1在40μg/ml的最高OX40抗体浓度下显示较低的激动剂活性(图3)。与较低浓度相比，只有40μg/ml的ADI-20057-g2具有相等或更好的IL-2分泌活化。
实施例7：四价(4xFab)mAb的构建、表达、纯化和分析
1.四价(4xFab)mAb的构建和表达
天然存在的单克隆抗体可以作为多聚体结构如IgM存在，其增加对固定表面上的其靶抗原的亲合性。因为TNFR的激动作用需要受体聚集，所以四价或六价单克隆抗体可以提供增加的聚集和受体激动作用。本发明是一种mAb，其包含四个相同的Fab区域，具有将远端Fab的C末端CH1区域通过接头或者没有接头而连接到常规mAb上的Fab的N末端上，所述接头例如是GGGGS接头。简言之，为了产生四价mAb，将2个构建体(构建体#1和构建体#2)分别通过常规方法采用XhoI和NotI的酶切位点克隆到HEK293细胞的表达载体pTT5中。具体而言，构建体#1包含编码测试抗体VH-CH1的基因序列，其中测试抗体的VH-CH1(从H1到H113，Kabat编号)直接或通过接头(GGGGS)n(其中n可以为0-4的整数，在本实施例中采用了n＝1)融合到相同抗体重链的N末端(图4)。构建体#2是抗体的正常VL-CL(从L1到L110，Kabat编号)链。将2种构建体在HEK293细胞中共转染，筛选表达和分泌的4xFab mAb分子，并选择正确的分子用于进一步的实验。
蛋白表达过程如下：
1)根据所需转染体积传代HEK293细胞(Invitrogen)，转染前一天将细胞密度调整至1×106/ml。转染当天细胞密度约为2×106/ml；
2)取终体积1/10的F17(Gibco，A13835-01)培养基作为转染缓冲液，加入适当的质粒，混匀；
3)加合适的PEI(Polysciences，23966)到质粒中，混匀后室温孵10分钟。将混合物轻柔倒入细胞，36.5℃，8％CO2培养；
4)过夜后各补加转染体积1/50的200g/L的FEED(Sigma，H6784-100G)和200g/L的葡萄糖母溶液，20小时后加VPA(Gibco，11140-050)至2mM/L；
5)连续培养至第7天或者细胞活力≤60％时，收集细胞上清用以纯化。
2.四价(4xFab)mAb的纯化和分析
A.纯化和尺寸排阻色谱法(SEC)
上述获得的4xFab mAb分子在HiTrapTMMabSelect SuReTM5ml柱(GE 11-0034-93)上根据制造商的说明进行纯化，其中使用20mMTris+150mM氯化钠(pH7.2)作为结合缓冲液。采用洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸钠，pH 3.5)洗脱抗体，并用1M Tris-Hcl将洗脱的抗体溶液的pH调节至6。使用Mono S 5/50柱(GE 17-5168-01)根据制造商的说明书，通过离子交换法(CEX)进一步纯化各个4xFab mAb分子，例如ADI-20112-g1-4xFab。
SEC分析方法可用于测试纯化后4xFab抗体的聚集倾向。使用TSKgel SuperSW3000柱(18675)以0.35mL/min的速率进行mAb的快速SEC分析，循环时间为15分钟/运行。将20mM磷酸钠和150mM氯化钠的溶液调节至pH 6.8，用作流动相。注射体积为20μl，在280nm检测UV信号。
结果表明，作为四价分子的IgG2形式的人OX40抗体ADI-20057-g2-4xFab、ADI-23515-g2-4xFab(图4)、作为四价分子的IgG1形式的人OX40抗体ADI-20112-g1-4xFab(图4)，可以在单一蛋白A纯化步骤之后以高纯度表达和纯化，ADI-20057-g2-4xFab和ADI-23515-g2-4xFab的纯度分别为98.72％(图5)和98.51％(图6)。以亲和层析+离子交换+分子筛法的三步法将ADI-20112-g1-4xFab纯化至99.22％纯度(图7)。
实施例8.本发明的抗OX40抗体的激动剂活性
荧光素酶报告基因T细胞活化测定法
可以通过在荧光素酶报告基因测定法中测量NFkB介导的转录活化的促进来评估本发明的抗-OX40抗体的激动剂活性。通过常规方法构建过表达人OX40(Sinobiologics)和NFkB-荧光素酶(Promega)构建体的Jurkat细胞，然后用抗-CD3(2μg/ml；Biolegend)与抗-CD28(2μg/ml；Biolegend)抗体活化过表达人OX40和NFkB-荧光素酶构建体的Jurkat细胞，37℃持续18小时，然后根据本领域技术人员已知的常规方法裂解细胞，向细胞裂解液中添加底物(购自Promega公司)并引发生物发光，之后在检测装置(Molecular Devices)上测试，其指示诱导表达的荧光素酶的相对值。
在如上所述测定法进行的实验中，添加Raji细胞以提供共刺激信号和用于IgG交联的表达FcgRIIb的细胞表面，并使用本发明的以下抗体：在CHO细胞中表达的IgG2形式的人抗-OX40抗体ADI-23515-g2、IgG1形式的人抗-OX40抗体ADI-20112-g1和IgG2形式的人抗OX40抗体ADI-20057-g2。
结果表明，使用抗CD3/抗CD28抗体作为T细胞活化剂，本发明的抗OX40抗体均具有良好的激动剂活性。例如，人抗-OX40抗体ADI-23515-g2、ADI-20112-g1和ADI-20057-g2具有良好的激动剂活性。
根据上述公开的方法和步骤，在HEK293细胞中瞬时表达本发明的4xFab分子人抗-OX40抗体ADI-23515-g2-4xFab(IgG2形式)、人抗-OX40-4xFab抗体ADI-20112-g1-4xFab(IgG1形式)和人抗-OX40抗体ADI-20057-g2-4xFab(IgG2形式)。然后评估本发明的4xFab分子人抗-OX40抗体的激动剂活性。
实验结果表明，在较低浓度，与各个4xFab分子相应的常规IgG对应物相比，所有4xFab抗-OX40抗体均具有更好的激动剂活性(图8)。此外，相比较于在本测定中显示很少或没有激动剂活性的tavolixumab和pogalizumab基准，上述4xFab分子的激动剂活性很高。
与没有Raji细胞相比，当将Raji细胞引入实验中时，Tavolixizumab、pogalizumab和ADI-20112-g1在较高浓度下都具有增加的激动剂活性(图9)。
实施例9.基于荧光素酶报告基因的OX40阻断测定法
可以通过测量抗体阻断OX40L介导的OX40活化的性能来评估本发明的抗-OX40抗体的阻断活性。使用抗-CD3(2μg/ml；Biolegend)、抗-CD28(2μg/ml(Biolegend)和重组OX40L(60μg/ml；Acro Biosystems)，与增加浓度的抗-OX40抗体在溶液中持续18小时，活化过表达人OX40和NFkB-荧光素酶构建体的Jurkat细胞，然后在细胞裂解和加入底物后进行检测和吸光度测量。
在基本上如上述测定法中进行实验，其中在CHO细胞中表达人抗-OX40抗体ADI-23515-g2、人抗-OX40抗体ADI-20112-g1、人抗-OX40抗体ADI-20057-g2。在HEK293细胞中瞬时表达人抗-OX40抗体ADI-23515-g2-4xFab、人抗-OX40IgG1-4xFab抗体ADI-20112-g1-4xFab，和人抗-OX40抗体ADI-20057-g2-4xFab。
结果表明，ADI-20112-g1和ADI-20112-g1-4xFab具有低的OX40L阻断功能。ADI-23515-g2在高于～0.5ug/ml的浓度下显示OX40L阻断，而ADI-23515-g2-4xFab在～0.18ug/ml或以上显示增加的信号(图10)。所有浓度的ADI-20057-g2和ADI-20057-g2-4xFab显示OX40的活化增加(图10)。由于ADI-20057-g2是非配体阻断剂(图2)，这解释了将ADI-20057-g2和ADI-20057-g2-4xFab加入实验中如何可以加强其受体的基于OX40L的活化。这也在DC-T细胞共培养实验中观察到(图3)。
序列表
<110> 信达生物制药（苏州）有限公司
<120> 多价抗OX40抗体及其用途
<130> PF 190312CNI
<160> 72
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 1
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 2
Gly Ser Ile Arg Ser Gly Ala Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 3
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His
1 5
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 4
Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 5
Tyr Ile Tyr Tyr Asp Gly Gln Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 6
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 7
Ala Arg Asp His Ala Ser Ser Ser Trp Tyr Thr Thr His Leu Asp Leu
1 5 10 15
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 8
Ala Arg Asp Val Gly Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 9
Ala Arg Gly Arg Pro Trp Tyr Ser Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Asp
1 5 10 15
Ile
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 10
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 11
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 12
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 13
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 14
Gln Gln Ser Ala Asn Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 15
Gln Gln Ser Glu Arg Ser Pro Phe Thr
1 5
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 16
Gln Gln Ser Asp His Tyr Pro Thr
1 5
<210> 17
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
20 25
<210> 18
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 18
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
20 25
<210> 19
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
20 25
<210> 20
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 20
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 21
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 21
Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 22
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 22
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 23
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 24
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 24
Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys
1 5 10 15
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 25
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 25
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 26
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 27
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 28
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 29
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 30
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 30
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
20
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 31
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 32
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 33
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 33
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 34
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 34
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 35
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 36
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp His Ala Ser Ser Ser Trp Tyr Thr Thr His Leu Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 37
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 37
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Ser Gly
20 25 30
Ala Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Asp Gly Gln Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Val Gly Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 38
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 38
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Pro Trp Tyr Ser Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala Asn Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 40
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 40
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Glu Arg Ser Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 41
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp His Tyr Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 42
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 42
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp His Ala Ser Ser Ser Trp Tyr Thr Thr His Leu Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 43
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 43
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp His Ala Ser Ser Ser Trp Tyr Thr Thr His Leu Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys
210 215 220
Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 44
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 44
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala Asn Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 45
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 45
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Ser Gly
20 25 30
Ala Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Asp Gly Gln Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Val Gly Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 46
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 46
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Ser Gly
20 25 30
Ala Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Asp Gly Gln Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Val Gly Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys
210 215 220
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 47
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 47
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Glu Arg Ser Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 48
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 48
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Pro Trp Tyr Ser Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 49
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 49
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Pro Trp Tyr Ser Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg
210 215 220
Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 50
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp His Tyr Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 51
<211> 688
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp His Ala Ser Ser Ser Trp Tyr Thr Thr His Leu Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
225 230 235 240
Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val
245 250 255
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His Trp
260 265 270
Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn
275 280 285
Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val
290 295 300
Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser
305 310 315 320
Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp His
325 330 335
Ala Ser Ser Ser Trp Tyr Thr Thr His Leu Asp Leu Trp Gly Arg Gly
340 345 350
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
370 375 380
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
385 390 395 400
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
405 410 415
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
420 425 430
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
435 440 445
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
450 455 460
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
465 470 475 480
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
485 490 495
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
500 505 510
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
515 520 525
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
530 535 540
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
545 550 555 560
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
565 570 575
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
580 585 590
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
595 600 605
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
610 615 620
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
625 630 635 640
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
645 650 655
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
660 665 670
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
675 680 685
<210> 52
<211> 684
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp His Ala Ser Ser Ser Trp Tyr Thr Thr His Leu Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
225 230 235 240
Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val
245 250 255
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His Trp
260 265 270
Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn
275 280 285
Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val
290 295 300
Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser
305 310 315 320
Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp His
325 330 335
Ala Ser Ser Ser Trp Tyr Thr Thr His Leu Asp Leu Trp Gly Arg Gly
340 345 350
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
370 375 380
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
385 390 395 400
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
405 410 415
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
420 425 430
Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
435 440 445
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu
450 455 460
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
465 470 475 480
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
485 490 495
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
500 505 510
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
515 520 525
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
530 535 540
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
545 550 555 560
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
565 570 575
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
580 585 590
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
595 600 605
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
610 615 620
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
625 630 635 640
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
645 650 655
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
660 665 670
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
675 680
<210> 53
<211> 687
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 53
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Ser Gly
20 25 30
Ala Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Asp Gly Gln Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Val Gly Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln
225 230 235 240
Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr
245 250 255
Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Ser Gly Ala Tyr Tyr Trp Ser
260 265 270
Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile
275 280 285
Tyr Tyr Asp Gly Gln Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val
290 295 300
Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
305 310 315 320
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Val
325 330 335
Gly Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
340 345 350
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
355 360 365
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
370 375 380
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
385 390 395 400
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
405 410 415
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
420 425 430
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
435 440 445
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
450 455 460
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
465 470 475 480
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
485 490 495
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
500 505 510
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
515 520 525
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
530 535 540
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
545 550 555 560
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
565 570 575
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
580 585 590
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
595 600 605
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
610 615 620
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
625 630 635 640
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
645 650 655
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
660 665 670
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675 680 685
<210> 54
<211> 682
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 54
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Ser Gly
20 25 30
Ala Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Asp Gly Gln Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Val Gly Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln
225 230 235 240
Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr
245 250 255
Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Ser Gly Ala Tyr Tyr Trp Ser
260 265 270
Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile
275 280 285
Tyr Tyr Asp Gly Gln Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val
290 295 300
Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
305 310 315 320
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Val
325 330 335
Gly Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
340 345 350
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
355 360 365
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
370 375 380
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
385 390 395 400
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
405 410 415
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn
420 425 430
Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
435 440 445
Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro
450 455 460
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
465 470 475 480
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
485 490 495
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
500 505 510
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
515 520 525
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
530 535 540
Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
545 550 555 560
Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
565 570 575
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
580 585 590
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
595 600 605
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
610 615 620
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
625 630 635 640
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
645 650 655
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
660 665 670
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
675 680
<210> 55
<211> 691
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Pro Trp Tyr Ser Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
225 230 235 240
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg
245 250 255
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His
260 265 270
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile
275 280 285
Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
290 295 300
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
305 310 315 320
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly
325 330 335
Arg Pro Trp Tyr Ser Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Asp Ile Trp Gly
340 345 350
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
355 360 365
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
370 375 380
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
385 390 395 400
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
405 410 415
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
420 425 430
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
435 440 445
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys
450 455 460
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
465 470 475 480
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
485 490 495
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
500 505 510
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
515 520 525
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
530 535 540
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
545 550 555 560
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
565 570 575
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
580 585 590
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
595 600 605
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
610 615 620
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
625 630 635 640
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
645 650 655
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
660 665 670
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
675 680 685
Pro Gly Lys
690
<210> 56
<211> 686
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 56
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Pro Trp Tyr Ser Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
225 230 235 240
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg
245 250 255
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His
260 265 270
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile
275 280 285
Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
290 295 300
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
305 310 315 320
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly
325 330 335
Arg Pro Trp Tyr Ser Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Asp Ile Trp Gly
340 345 350
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
355 360 365
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
370 375 380
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
385 390 395 400
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
405 410 415
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
420 425 430
Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
435 440 445
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys
450 455 460
Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
465 470 475 480
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
485 490 495
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
500 505 510
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
515 520 525
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser
530 535 540
Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
545 550 555 560
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
565 570 575
Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
580 585 590
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
595 600 605
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
610 615 620
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser
625 630 635 640
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
645 650 655
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
660 665 670
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
675 680 685
<210> 57
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 57
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 58
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 58
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 59
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 59
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 60
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 60
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 61
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 61
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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Cys Ala Arg Asp Val Gly Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 62
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 62
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Val Gly Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 63
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 63
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Val Gly Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys
210 215 220
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 64
<211> 687
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 64
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Val Gly Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln
225 230 235 240
Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr
245 250 255
Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr Trp Ser
260 265 270
Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile
275 280 285
Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val
290 295 300
Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
305 310 315 320
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Val
325 330 335
Gly Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
340 345 350
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
355 360 365
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
370 375 380
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
385 390 395 400
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
405 410 415
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
420 425 430
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
435 440 445
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
450 455 460
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
465 470 475 480
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
485 490 495
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
500 505 510
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
515 520 525
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
530 535 540
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
545 550 555 560
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
565 570 575
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
580 585 590
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
595 600 605
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
610 615 620
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
625 630 635 640
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
645 650 655
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
660 665 670
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675 680 685
<210> 65
<211> 682
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 65
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Val Gly Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln
225 230 235 240
Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr
245 250 255
Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr Trp Ser
260 265 270
Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile
275 280 285
Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val
290 295 300
Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
305 310 315 320
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Val
325 330 335
Gly Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
340 345 350
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
355 360 365
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
370 375 380
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
385 390 395 400
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
405 410 415
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn
420 425 430
Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
435 440 445
Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro
450 455 460
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
465 470 475 480
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
485 490 495
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
500 505 510
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
515 520 525
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
530 535 540
Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
545 550 555 560
Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
565 570 575
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
580 585 590
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
595 600 605
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
610 615 620
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
625 630 635 640
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
645 650 655
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
660 665 670
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
675 680
<210> 66
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 66
Ser Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 67
Ser Gly Ala Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 68
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 68
Ser Tyr Gly Met His
1 5
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 69
Ser Gly Ser Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 70
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 70
Asp His Ala Ser Ser Ser Trp Tyr Thr Thr His Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 71
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 71
Asp Val Gly Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 72
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体/抗体片段序列
<400> 72
Gly Arg Pro Trp Tyr Ser Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Asp Ile
1 5 10 15

Claims (28)

1.一种分离的抗体，其包含Fc结构域和4个Fab片段，其中Fc结构域和2个Fab片段组成2价的全长抗体，另外的2个Fab片段分别通过其CH1片段的Kabat编号的氨基酸残基H113借助于接头与所述全长抗体的1条重链的氨基末端融合，从而形成结构为“VH-CH1-接头-重链”的融合多肽，其中所述4个Fab片段是相同的、抗OX40的Fab片段，所述Fab片段分别包含3个重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3和3个轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:14，其中所述接头为(GGGGS)n，其中n＝1-4。
2.权利要求1的抗体，其中所述4个Fab片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；轻链可变区包含与SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
3.权利要求1或2的抗体，其中所述的重链的融合多肽包含与选自SEQ ID NO:51或52所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；轻链包含与SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
4.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。
5.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体是具有激动剂活性的多价抗OX40抗体。
6.权利要求1或2的抗体，其中所述接头是GGGGS(SEQ ID NO：57)。
7.一种分离的多价抗OX40抗体，包含重链融合多肽和轻链，其中重链融合多肽包含选自SEQ ID NO:51、52所示的氨基酸序列，轻链包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。
8.编码权利要求1-7中任一项抗体的核酸。
9.包含权利要求8的核酸的载体。
10.权利要求9的载体，其中所述载体是表达载体。
11.包含权利要求8的核酸或权利要求9的载体的宿主细胞。
12.权利要求11的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核宿主细胞或真核宿主细胞。
13.权利要求12的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。
14.权利要求13的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞或293细胞。
15.一种制备如权利要求1-7中任一项所述的抗体的方法，其中所述方法包含步骤：
a)将包含VH-CH1的构建体和包含VL-CL的构建体克隆到表达载体中，
b)转染宿主细胞，并在适于表达编码所述抗体的核酸的条件下培养所述宿主细胞，任选地，
c)分离所述抗体。
16.一种包含权利要求1-7中任一项的抗体的组合物。
17.权利要求16的组合物，其中所述组合物为药物组合物。
18.权利要求16的组合物，其中所述组合物还包含药用载体。
19.一种免疫缀合物，其包含权利要求1-7中任一项的抗体和细胞毒性剂。
20.权利要求16的组合物或者权利要求19的免疫缀合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
21.权利要求20所述的用途，其中所述癌症是肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌。
22.权利要求21所述的用途，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。
23.权利要求1-7中任一项的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
24.权利要求23所述的用途，其中所述癌症是肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌。
25.权利要求24所述的用途，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。
26.一种检测样品中OX40的非诊断方法，所述方法包括：
(a)将样品与权利要求1-7中任一项的抗体接触；和
(b)检测多价抗体和OX40间的复合物的形成。
27.权利要求26所述的用途，其中所述抗体被可检测地标记。
28.一种试剂盒或制品，其包含权利要求1-7中任一项的抗体。
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