CN110526963A - 一种抑制抗原免疫递呈的非酶解低过敏性酪蛋白制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种将牛奶中酪蛋白化学修饰的低敏性处理方法，以抑制酪蛋白的免疫递呈过程，从而降低其致敏性。该制备方法包括：将新鲜牛奶离心脱脂，用无水乙醇和超纯水除去脂溶性和水溶性杂质，超纯水透析后冻干；将冻干得到的酪蛋白固体溶于含有1mMNaHCO3和5mMβ‑巯基乙醇的麦芽七糖溶液，冻干后置于饱和Mg(NO3)2溶液孵育，透析，冻干后即可得到低敏性酪蛋白。本发明成本低，操作简单，且不破坏酪蛋白感官性质和营养品质，又有显著降低酪蛋白致敏性的特点。
Description
技术领域
本发明涉及乳制品加工领域，更具体地说，是涉及一种抑制抗原免疫递呈的非酶解低过敏性酪蛋白的制备方法。
背景技术
食物过敏是人类最为常见的健康问题。牛奶作为八大过敏原之一，是婴幼儿早期接触的第一个也是最常见的食物过敏原。牛奶中含有约3％-3.5％的蛋白质，基于他们在不同pH下的溶解度，可分为：酪蛋白和casein，CN)和乳清蛋白(whey protein)。酪蛋白的等电点为pH 4.6，其主要由四种蛋白组成：αs1-CN，αs2-CN，β-CN和κ-CN，各自的比例分别为4：1：4：1。
酪蛋白占牛奶蛋白的80％，是牛奶中的最主要过敏原。人们很早就知道改变过敏蛋白结构可以降低其致敏性。目前，食品工业上常见的降低牛奶蛋白过敏性的方法有：热处理、微波、高压、发酵和酶水解等。大多数低敏性牛奶产品的研究集中在热处理对牛奶蛋白过敏性的影响上，一些非热技术也因为对牛奶成分和感官属性的影响极小，从而开始得到的更多人的关注。酶水解可通过蛋白酶将长肽段水解成小分子肽链或氨基酸，消除或破坏过敏表位结构。然而，这些水解产物通常口感不佳，且口味微苦，并且乳化能力较低，加之生产成本较高，因而在婴儿配方食品中的应用受到了限制。
已有学者通过美拉德反应等方法修饰过敏蛋白表位从而降低过敏性，但是一般的美拉德反应无法被控制，除了会形成终产物之外，还会形成其他许多物质，影响糖基化修饰的成功率，结果稳定性差。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制抗原免疫递呈过程的非酶解低过敏性酪蛋白的制备方法，本发明通过麦芽七糖对酪蛋白进行化学修饰，操作简便快捷，既能够保持酪蛋白原有的营养品质和感官性质，又能够明显降低其致敏性，为低过敏性酪蛋白的制作和加工提供技术支持。
一种抑制抗原免疫递呈过程的非酶解低过敏性酪蛋白的制备方法，包括如下步骤：
a、取新鲜牛奶，离心后去除上层脂肪,离心条件为2000-2300xg,离心20-23min；
b、用1M HCl溶液将步骤a得到的去脂牛奶调pH至4.6-4.9，离心取沉淀；
c、将步骤b得到的沉淀与无水乙醇混合，充分搅拌后离心，取沉淀；沉淀与无水乙醇体积比为1：5，离心条件为1500-2500xg，离心20-25min；
d、将步骤c得到的沉淀与超纯水混合，充分搅拌后离心，取沉淀；沉淀与超纯水体积比为1：5，离心条件为1300-2300xg，离心20-25min；重复3-6次；
e、将步骤d得到的沉淀进行透析，冷冻干燥；透析温度为4-8℃，每隔3-5h换一次透析液，透析24-30h；
f、将步骤e得到的酪蛋白固体溶于麦芽七糖溶液，冷冻干燥得到固体；麦芽七糖溶液的质量浓度为100-130g/L，其中含有1mM NaHCO3和5mMβ-巯基乙醇；
g、将步骤f得到的固体溶于饱和Mg(NO3)2溶液，孵育；孵育温度为60-80℃，孵育时间为24-30h；
h、将步骤g孵育后的溶液冷却至室温，透析，经冷冻干燥得到低敏性酪蛋白；透析温度为4-8℃，每隔3-5h换一次透析液，透析24-30h。
所述步骤a中，离心条件为2000xg,离心23min。
所述步骤b中，调pH至4.6。
所述步骤c中，沉淀与无水乙醇体积比为1：2，离心条件为2000xg，离心20min。
所述步骤d中，沉淀与超纯水体积比为1：3，离心条件为2000xg，离心20min；重复5次。
所述步骤e中，透析温度为6℃，每隔4h换一次透析液，透析26h。
所述步骤f中，麦芽七糖溶液的质量浓度为120g/L。
所述步骤g中，孵育温度为70℃，孵育时间为28h。
所述步骤h中，透析温度为6℃，每隔5h换一次透析液，透析28h。
本发明的有益效果是：本发明通过麦芽七糖化学修饰对鲜牛奶中酪蛋白进行改性实现非酶解方法，改性后的酪蛋白能显著抑制特异性IgE抗体的结合，进而抑制肥大细胞脱颗粒，从而显著降低其致敏性，经过大量检索也未发现采用上述通过麦芽七糖化学修饰对鲜牛奶中酪蛋白进行改性文献，本案对酪蛋白的改性开创了独创性思路。
附图说明
图1是提纯后的低敏性酪蛋白Native-PAGE电泳图,1为天然酪蛋白，2为低敏性酪蛋白；
图2是Caco-2细胞转运试验图；
图3是β-氨基己糖苷酶释放测定；
图4是IgE结合能力测定；
具体实施方式
实施例1
一种抑制抗原免疫递呈过程的非酶解低过敏性酪蛋白的制备方法，包括如下步骤：
a、取新鲜牛奶，离心后去除上层脂肪,离心条件为2000xg,离心20min；
b、用1M HCl溶液将步骤a得到的去脂牛奶调pH至4.6，离心取沉淀；
c、将步骤b得到的沉淀与无水乙醇混合，充分搅拌后离心，取沉淀；沉淀与无水乙醇体积比为1：5，离心条件为1500xg，离心20min；
d、将步骤c得到的沉淀与超纯水混合，充分搅拌后离心，取沉淀；沉淀与超纯水体积比为1：5，离心条件为1300xg，离心20min；重复3次；
e、将步骤d得到的沉淀进行透析，冷冻干燥；透析温度为4℃，每隔3h换一次透析液，透析24h；上述a-e步骤主要用于酪蛋白分离提纯；
f、将步骤e得到的酪蛋白固体溶于麦芽七糖溶液，冷冻干燥得到固体；麦芽七糖溶液的质量浓度为100g/L，其中含有1mM NaHCO3和5mMβ-巯基乙醇；
g、将步骤f得到的固体溶于饱和Mg(NO3)2溶液，孵育；孵育温度为60℃，孵育时间为24h；
h、将步骤g孵育后的溶液冷却至室温，透析，经冷冻干燥得到低敏性酪蛋白；透析温度为4℃，每隔3h换一次透析液，透析24h。上述f-h步骤主要用于非酶解低过敏性酪蛋白的制备。
经冷冻干燥得到的低敏性酪蛋白进行SDS-PAGE操作，其步骤如下：将低敏性酪蛋白溶于超纯水中，稀释至1mg/mL。按照3：1的比例与loading buffer混合，上样时每个孔加入10μL。80V，跑20分钟，当条带进入分离胶时，将电压调至160V，跑3h。其中，分离胶的浓度为10％，浓缩胶的浓度为5％。经检测，所提取得低敏性酪蛋白纯度＞95％，表明该方法可用于高效生产低敏性酪蛋白。
实施例2
一种抑制抗原免疫递呈过程的非酶解低过敏性酪蛋白的制备方法，包括如下步骤：
a、取新鲜牛奶，离心后去除上层脂肪,离心条件为2300xg,离心23min；
b、用1M HCl溶液将步骤a得到的去脂牛奶调pH至4.9，离心取沉淀；
c、将步骤b得到的沉淀与无水乙醇混合，充分搅拌后离心，取沉淀；沉淀与无水乙醇体积比为1：5，离心条件为2500xg，离心25min；
d、将步骤c得到的沉淀与超纯水混合，充分搅拌后离心，取沉淀；沉淀与超纯水体积比为1：5，离心条件为2300xg，离心25min；重复6次；
e、将步骤d得到的沉淀进行透析，冷冻干燥；透析温度为8℃，每隔5h换一次透析液，透析30h；
f、将步骤e得到的酪蛋白固体溶于麦芽七糖溶液，冷冻干燥得到固体；麦芽七糖溶液的质量浓度为130g/L，其中含有1mM NaHCO3和5mMβ-巯基乙醇；
g、将步骤f得到的固体溶于饱和Mg(NO3)2溶液，孵育；孵育温度为80℃，孵育时间为30h；
h、将步骤g孵育后的溶液冷却至室温，透析，经冷冻干燥得到低敏性酪蛋白；透析温度为8℃，每隔5h换一次透析液，透析30h。
经冷冻干燥得到的低敏性酪蛋白进行SDS-PAGE操作，其步骤如下：将低敏性酪蛋白溶于超纯水中，稀释至1mg/mL。按照3：1的比例与loading buffer混合，上样时每个孔加入10μL。80V，跑20分钟，当条带进入分离胶时，将电压调至160V，跑3h。其中，分离胶的浓度为10％，浓缩胶的浓度为5％。经检测，所提取得低敏性酪蛋白纯度＞95％，表明该方法可用于高效生产低敏性酪蛋白。
实施例3
一种抑制抗原免疫递呈过程的非酶解低过敏性酪蛋白的制备方法，包括如下步骤：
a、取新鲜牛奶，离心后去除上层脂肪,离心条件为2200xg,离心22min；
b、用1M HCl溶液将步骤a得到的去脂牛奶调pH至4.8，离心取沉淀；
c、将步骤b得到的沉淀与无水乙醇混合，充分搅拌后离心，取沉淀；沉淀与无水乙醇体积比为1：5，离心条件为2000xg，离心22min；
d、将步骤c得到的沉淀与超纯水混合，充分搅拌后离心，取沉淀；沉淀与超纯水体积比为1：5，离心条件为2200xg，离心23min；重复5次；
e、将步骤d得到的沉淀进行透析，冷冻干燥；透析温度为6℃，每隔4h换一次透析液，透析26h；
f、将步骤e得到的酪蛋白固体溶于麦芽七糖溶液，冷冻干燥得到固体；麦芽七糖溶液的质量浓度为120g/L，其中含有1mM NaHCO3和5mMβ-巯基乙醇；
g、将步骤f得到的固体溶于饱和Mg(NO3)2溶液，孵育；孵育温度为70℃，孵育时间为26h；
h、将步骤g孵育后的溶液冷却至室温，透析，经冷冻干燥得到低敏性酪蛋白；透析温度为7℃，每隔4h换一次透析液，透析28h。
经冷冻干燥得到的低敏性酪蛋白进行SDS-PAGE操作，其步骤如下：将低敏性酪蛋白溶于超纯水中，稀释至1mg/mL。按照3：1的比例与loading buffer混合，上样时每个孔加入10μL。80V，跑20分钟，当条带进入分离胶时，将电压调至160V，跑3h。其中，分离胶的浓度为10％，浓缩胶的浓度为5％。经检测，所提取得低敏性酪蛋白纯度＞95％，表明该方法可用于高效生产低敏性酪蛋白。
实验1：
天然和低敏性酪蛋白的caco-2细胞转运试验，其步骤如下：
在24孔板中将caco-2细胞(2×104个/mL)接种在孔径为0.1μm的聚碳酸酯膜上。使用Millicell-ERS-2电阻仪测量跨上皮电阻(TEER)，仅使用TEER＞500Ω的细胞单层。将天然和低敏性酪蛋白在DMEM培养基中稀释至2mg/mL，取100μL至caco-2细胞单层表面上，同时将500μL DMEM培养基加入到接收室。在15，30，60，120，240和300min时，从接收室中取出30μL的样品，并且每次用等体积培养基补充接收室。
(2)酶联免疫吸附试验检测和结果：
将得到的样品稀释至100μL，加入到96孔板，每个样品做6个平行孔，4℃下包被过夜。用PBS洗涤5次，并拍干。向每个孔中加入200μL封闭液，37℃封闭1小时，洗涤后拍干，每孔加入100μL一抗(用封闭液稀释30倍的牛奶过敏患者血清)，37℃孵育1小时，洗涤后拍干，加入用封闭液稀释5000倍的二抗(HRP标记的链霉抗生物素蛋白)，37℃孵育1小时，并洗涤拍干。每孔加入100μL TMB显色液，37℃孵育30min，每孔加入50μL2M硫酸溶液，在450nm处测定OD值，根据标准曲线计算蛋白浓度。结果如上表所示。
由上表可得，在转运过程中，天然酪蛋白随着时间的推移，透过Caco-2细胞的浓度成对数上升，而低敏性酪蛋白的浓度一直平缓上升。这说明相比天然酪蛋白，低敏性蛋白更不易透过Caco-2细胞，即这种低敏性蛋白阻断了过敏原穿过肠道上皮细胞接触免疫系统的抗原免疫递呈过程。
实验2
天然和低敏性酪蛋白的IgE结合能力测定，其步骤如下：
分别将纯化后的天然和低敏性酪蛋白溶于PBS缓冲液，稀释至10μg/mL。包被时每个样品做6个平行孔，在酶标板上每孔加入100μL样品，4℃下包被过夜。用超纯水洗涤，并拍干，重复上述操作5次。向每个孔中加入200μL封闭液，37℃封闭1小时，洗涤后拍干，重复5次。每孔加入100μL一抗(用封闭液稀释10倍的牛奶过敏患者血清)，37℃孵育1小时，洗涤后拍干，加入用封闭液稀释100倍的二抗(HRP标记的链霉抗生物素蛋白)，37℃孵育孵育2小时，洗涤拍干。加入60μL TMB显色液，37℃孵育30分钟，加入30μL终止液(2M硫酸溶液)。在450nm处测定OD值。结果如下表所示：
| 组别 | 空白 | 天然酪蛋白 | 低敏性酪蛋白 |
| 浓度(μg/mL) | 0 | 10 | 10 |
| OD450值 | 0.0339±0.0034 | 0.6796±0.0067 | 0.4520±0.0475 |
检测结果显示，与天然酪蛋白组相比，低敏性酪蛋白组的IgE活性显著下降，表明用该方法制备的低敏性酪蛋白确实显著降低了致敏性。
实验3
天然和低敏性酪蛋白的β-氨基己糖苷酶释放测定，其步骤如下：
将人源肥大细胞LAD 2(1×106个细胞/孔)接种在96孔板上(每孔50μL)，置于37℃培养箱培养24小时。取出96孔板，每孔加入低敏性酪蛋白(1mg/mL)或天然样品100μL，每个样品做3个平行，37℃孵育60min。加入100μL稀释100倍的牛奶过敏患者血清，孵育60min，1000rpm离心5分钟。取新的96孔板，每个孔加入上清液30μL，再加入50μL 3mM PNAG溶液(3mmolPNAG溶于0.1M柠檬酸缓冲液，pH 4.5)，37℃孵育60min。每个孔加100μL 0.2M甘氨酸溶液(pH 10.7)，并在450nm处测定OD值。为了测定β-氨基己糖苷酶的总活性，在除去上清液之前用0.1％Triton-X 100裂解细胞，后续步骤同上。结果表示为：β-氨基己糖苷酶释放率(％)＝{待测样品吸光度/(空白细胞组细胞培养基上清吸光度+空白细胞组细胞裂解液吸光度)}×100％结果如下表所示：
检测结果显示，与天然酪蛋白组相比，低敏性酪蛋白组的细胞β-氨基己糖苷酶释放率显著低于天然酪蛋白组，表明用该方法制备的低敏性酪蛋白不易引起肥大细胞脱颗粒，具有更低的致敏风险。
Claims (9)
1.一种抑制抗原免疫递呈过程的非酶解低过敏性酪蛋白的制备方法，包括如下步骤：其特征在于：a、取新鲜牛奶，离心后去除上层脂肪,离心条件为2000-2300xg,离心20-23min；
b、用1M HCl溶液将步骤a得到的去脂牛奶调pH至4.6-4.9，离心取沉淀；
c、将步骤b得到的沉淀与无水乙醇混合，充分搅拌后离心，取沉淀；沉淀与无水乙醇体积比为1：5，离心条件为1500-2500xg，离心20-25min；
d、将步骤c得到的沉淀与超纯水混合，充分搅拌后离心，取沉淀；沉淀与超纯水体积比为1：5，离心条件为1300-2300xg，离心20-25min；重复3-6次；
e、将步骤d得到的沉淀进行透析，冷冻干燥；透析温度为4-8℃，每隔3-5h换一次透析液，透析24-30h；
f、将步骤e得到的酪蛋白固体溶于麦芽七糖溶液，冷冻干燥得到固体；麦芽七糖溶液的质量浓度为100-130g/L，其中含有1mM NaHCO3和5mMβ-巯基乙醇；
g、将步骤f得到的固体溶于饱和Mg(NO3)2溶液，孵育；孵育温度为60-80℃，孵育时间为24-30h；
h、将步骤g孵育后的溶液冷却至室温，透析，经冷冻干燥得到低敏性酪蛋白；透析温度为4-8℃，每隔3-5h换一次透析液，透析24-30h。
2.根据权利要求1中所述的一种抑制抗原免疫递呈过程的非酶解低过敏性酪蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤a中，离心条件为2000xg,离心23min。
3.根据权利要求2中所述的一种抑制抗原免疫递呈过程的非酶解低过敏性酪蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤b中，调pH至4.6。
4.根据权利要求3中所述的一种抑制抗原免疫递呈过程的非酶解低过敏性酪蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤c中，沉淀与无水乙醇体积比为1：2，离心条件为2000xg，离心20min。
5.根据权利要求4中所述的一种抑制抗原免疫递呈过程的非酶解低过敏性酪蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤d中，沉淀与超纯水体积比为1：3，离心条件为2000xg，离心20min；重复5次。
6.根据权利要求5中所述的一种抑制抗原免疫递呈过程的非酶解低过敏性酪蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤e中，透析温度为6℃，每隔4h换一次透析液，透析26h。
7.根据权利要求6中所述的一种抑制抗原免疫递呈过程的非酶解低过敏性酪蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤f中，麦芽七糖溶液的质量浓度为120g/L。
8.根据权利要求7中所述的一种抑制抗原免疫递呈过程的非酶解低过敏性酪蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤g中，孵育温度为70℃，孵育时间为28h。
9.根据权利要求8中所述的一种抑制抗原免疫递呈过程的非酶解低过敏性酪蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤h中，透析温度为6℃，每隔5h换一次透析液，透析28h。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191203 |
|
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