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CN110320654A - 基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像系统及方法 - Google Patents

基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像系统及方法 Download PDF

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CN110320654A
CN110320654A CN201910503173.8A CN201910503173A CN110320654A CN 110320654 A CN110320654 A CN 110320654A CN 201910503173 A CN201910503173 A CN 201910503173A CN 110320654 A CN110320654 A CN 110320654A
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psf
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lcos
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周游
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Abstract

本发明公开了一种基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像系统及方法,其中,系统包括:光照模块,用于通过激光光照获得尺寸覆盖空间光调制器LCOS投影面的平行光照;波前调制模块,用于将LCOS放置在光照端的傅里叶面上,通过投影强度图样对于光照进行波前调制;二维扫描模块,用于控制照明光束在物面上实现二维扫描;光照干涉模块,用于通过光照干涉生成4Pi的点扩散函数PSF,并照射荧光样本;成像模块,用于采集两路荧光信号的干涉图像;控制器,用于控制波前调制模块调整光照的偏振方向,以生成不同倾斜角度4Pi的PSF,且得到多张干涉图像,并根据多张干涉图像获取三维体成像结果。该系统能够实现对于活体样本的快速三维成像。

Description

基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像系统及方法
技术领域
本发明涉及显微成像技术领域,特别涉及一种基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像系统及方法。
背景技术
在显微成像领域,实现快速的三维活体成像是当前的前沿问题。光场显微技术,通过牺牲一定的空间分辨率能够实现实时的三维成像,广泛用于斑马鱼胚胎发育等问题的研究。
然而,如何获得更高分辨率(包括横向和轴向)的成像质量,是一个有待解决的问题。此外,在荧光成像中,由于存在光漂白和光毒性等问题,限制荧光信号的强度,如何获得更高信噪比的荧光图像也是一个重要的研究方向。
发明内容
本申请是基于发明人对以下问题的认识和发现做出的:
由于DMD(Digital Micromirror Device,数字微镜器件)、LCOS(Liquid Crystalon Silicon,硅基液晶显示屏)以DM(Deformation mirror,变形镜)等空间光调制器的发展,在光照或者采集端的傅里叶面进行波前调制,成为一种实现显微成像性能提升的常用手段。在自适应光领域,该方法可以用以消除系统误差和光学器件的像差,提高成像的强度和分辨率。而通过波前调制,实现对于光照PSF(point-spread function,点扩散函数)的编辑,用以实现特殊的成像目的,也是一个被广泛采用的技术。例如,通过在光照端放置圆环实现强度调制,产生贝塞尔光束,实现光照PSF的轴向拉长等。
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
为此,本发明的一个目的在于提出一种基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像系统,该系统能够实现对于活体样本的快速三维成像。
本发明的另一个目的在于提出一种基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像方法。
为达到上述目的,本发明一方面实施例提出了一种基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像系统,包括:光照模块,用于通过激光光照获得尺寸覆盖空间光调制器LCOS投影面的平行光照;波前调制模块,用于将所述LCOS放置在光照端的傅里叶面上,通过投影强度图样对于所述光照进行波前调制;二维扫描模块,用于控制照明光束在物面上实现二维扫描;光照干涉模块,用于通过光照干涉生成4Pi的点扩散函数PSF,并照射荧光样本;成像模块,用于采集两路荧光信号的干涉图像;控制器,用于控制所述波前调制模块调整所述光照的偏振方向,以生成不同倾斜角度4Pi的PSF,且得到多张干涉图像,并根据所述多张干涉图像获取三维体成像结果。
本发明实施例的基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像系统,利用对于光照波前的强度调制,实现样本轴向的多点同时激发,能够提高荧光成像的信噪比;结合稀疏的采集和相应的重建算法,能够实现对于活体样本的快速三维成像。
另外,根据本发明上述实施例的基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像系统还可以具有以下附加的技术特征:
进一步地,在本发明的一个实施例中,所述光照模块进一步用于控制所述激光光照通过5倍放大的4F系统,并在其傅里叶面上放置20um的圆孔,以得到所述平行光照。
进一步地,在本发明的一个实施例中,所述波前调制模块包括:1/4波片,所述1/4波片用于调整所述光照的偏振方向,空间光调制器LCOS,所述空间光调制器LCOS用于投影强度图样。
进一步地,在本发明的一个实施例中,所述二维扫描模块包括二维振镜和扫描透镜,其中,所述扫描透镜用于匹配后级光路,以减小所述二维振镜的扫描误差,并结合后级的套管透镜构成4F系统将光束尺寸调整至目标尺寸。
进一步地,在本发明的一个实施例中,所述光照干涉模块进一步用于通过前级的分束器将所述光照分成两路,并通过两个物镜和匹配的两个套管透镜产生两束相对的光照,以通过光照干涉得到所述4Pi的PSF,并以此照射荧光样本。
进一步地,在本发明的一个实施例中,其中,一路光照使用一面反射镜,另一路光照使用两面反射镜,使得形成的两路光照的PSF在与光轴垂直的横向面上沿着其中一个维度对称。
为达到上述目的,本发明另一方面实施例提出了一种基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像方法,包括:通过激光光照获得尺寸覆盖LCOS投影面的平行光照;将空间光调制器LCOS放置在光照端的傅里叶面上,通过投影强度图样对于所述光照进行波前调制,并控制照明光束在物面上实现二维扫描;生成干涉的4Pi的PSF,照射荧光样本,并采集两路荧光信号的干涉图像;调整所述光照方向,以生成不同倾斜角度4Pi的PSF,且得到多张干涉图像,并根据所述多张干涉图像获取三维体成像结果。
本发明实施例的基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像方法,利用对于光照波前的强度调制,实现样本轴向的多点同时激发,能够提高荧光成像的信噪比;结合稀疏的采集和相应的重建算法,能够实现对于活体样本的快速三维成像。
另外,根据本发明上述实施例的基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像方法还可以具有以下附加的技术特征:
进一步地,在本发明的一个实施例中,所述通过激光光照获得尺寸覆盖LCOS投影面的平行光照,包括:控制所述激光光照通过5倍放大的4F系统,并在其傅里叶面上放置20um的圆孔,以得到所述平行光照。
进一步地,在本发明的一个实施例中,还包括:通过与后级光路匹配的扫描透镜减小二维振镜的扫描误差,并结合后级的套管透镜构成4F系统将光束尺寸调整至目标尺寸。
进一步地,在本发明的一个实施例中,所述生成干涉的4Pi的PSF,包括:通过前级的分束器将所述光照分成两路,并通过两个物镜和匹配的两个套管透镜产生两束相对的光照,以通过光照干涉得到所述4Pi的PSF,并以此照射荧光样本,其中,一路光照使用一面反射镜,另一路光照使用两面反射镜,使得形成的两路光照的PSF在与光轴垂直的横向面上沿着其中一个维度对称。
本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1为根据本发明实施例的基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像系统的方框示意图;
图2为根据本发明实施例的基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像系统的结构示意图;
图3为根据本发明实施例的基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像系统的原理流程图;
图4为根据本发明实施例的基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像方法的流程图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出,其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
下面参照附图描述根据本发明实施例提出的基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像系统及方法,首先将参照附图描述根据本发明实施例提出的基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像系统。
图1是本发明一个实施例的基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像系统的方框示意图。
如图1所示,该基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像系统10包括:光照模块100、波前调制模块200、二维扫描模块300、光照干涉模块400、成像模块500和控制器600。
其中,光照模块100用于通过激光光照获得尺寸覆盖空间光调制器LCOS投影面的平行光照。波前调制模块200用于将LCOS放置在光照端的傅里叶面上,通过投影强度图样对于光照进行波前调制。二维扫描模块300用于控制照明光束在物面上实现二维扫描。光照干涉模块400用于通过光照干涉生成4Pi的点扩散函数PSF,并照射荧光样本。成像模块500用于采集两路荧光信号的干涉图像。控制器600用于控制波前调制模块调整光照的偏振方向,以生成不同倾斜角度4Pi的PSF,且得到多张干涉图像,并根据多张干涉图像获取三维体成像结果。本发明实施例的系统10能够实现对于活体样本的快速体成像。
可以理解的是,本发明实施例的系统10也可以称为4Pi成像系统,通过LCOS器件投影强度图样,调制4Pi成像系统的光照波前,产生所需的多角度4Pi的PSF;通过二维振镜,实现光照的横向扫描,对样本面进行激发和采集。本发明实施例通过一系列优化设计的强度图样,调制4Pi成像系统的光照PSF,实现轴向拉长和多角度旋转,以此扩展成像景深;结合相关重构算法,合成多次采集的数据,实现对于荧光物体的三维高分辨体成像。
具体而言,本发明实施例的系统10可以利用双物镜配合波前调制生成不同倾斜角度的超分辨率4Pi点扩散函数,进而通过断层扫描法重建样本三维信息。如图1所示,光照模块100可以采用488nm光源,经过准直和扩束,获得尺寸恰好覆盖LCOS器件202调制面的平行光照。波前调制模块200,主要包括1/4波片201和空间光调制器LCOS器件202,其中,LCOS器件202放置在光照端的傅里叶面上,通过投影强度图样实现对于光照的波前调制。二维扫描模块300,主要包括二维振镜系统301和扫描透镜302,用以实现照明光束在物面上的二维扫描。光照干涉模块400主要包括两个套管透镜402、403和两个相对放置的物镜404、405,用以形成干涉的4Pi的PSF,照射荧光样本。成像模块500主要包括两个二向色镜501和502、成像透镜503和像感器504,用以采集两路荧光信号的干涉图像。控制器600,同步控制上述LCOS器件202上的强度图样投射、振镜301的二维扫描以及像感器504的图像采集,实现对样本荧光信息的采样。
下面将结合图2对基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像系统10进行进一步阐述。
进一步地,在本发明的一个实施例中,如图2所示,光照模块100进一步用于控制激光光照通过5倍放大的4F系统101,并在其傅里叶面上放置20um的圆孔102,实现空间滤波和扩束,产生大小合适的平行光照。
进一步地,在本发明的一个实施例中,如图2所示,在波前调制模块200中,通过旋转1/4波片201调整入射光的偏振方向,使其与LCOS器件202相匹配,LCOS器件202的屏幕上显示用以调制波前的强度图样,然后再通过后级的4F系统将调制的光照投射到二维振镜面302上。通过LCOS在光照的傅里叶面依次投影多张强度图像,同时实现对于两路光照的相同调制,这两路光照经过两个相对放置物镜的干涉之后,产生对于三维样本的轴向多点激发。
进一步地,在本发明的一个实施例中,如图2所示,在二维扫描模块300中,扫描透镜302经过特殊设计用以匹配后级光路,减小二维振镜301的扫描误差,以及与后级的套管透镜402及403构成4F系统,实现光束尺寸的调整,从而调整至目标尺寸。
进一步地,在本发明的一个实施例中,如图2所示,在光照干涉模块400中,首先通过分束器401将光照分成两路,然后两个物镜404及405和匹配的两个套管透镜402及403产生两束相对的光照,通过光照干涉获得4Pi的PSF,并以此照射荧光样本。其中一路光照使用一面反射镜,另一路光照使用两面反射镜,因而形成的两路光照的PSF,在与光轴垂直的横向面(XY面)上沿着其中一个维度是对称的。
进一步地,在本发明的一个实施例中,如图2所示,在成像模块500中,在两个光路中分别放置二向色镜501和502,将激发光源与出射荧光的信号拆分,使其在采集端聚合并再次产生干涉,最终,通过成像透镜503和像感器504采集图像。
下面将结合图3对基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像系统10的原理进行介绍。
S1,在LCOS器件202上投影特定内外径的圆环实现强度调制,从而在两个物镜404和405的后方获得两束贝尔塞光的干涉,拓展了传统4Pi系统PSF的景深,产生轴向多点激发的4Pi的PSF。
S2,在LCOS器件202的投影面上,沿着一个维度移动上述强度调制的圆环,由于两路光照的PSF沿着一个方向是对称的,因而此时会产生旋转的轴向多点激发PSF。
S3,通过多次移动,依次采集多张该光照激发下的样本荧光图像;然后在LCOS器件202的另一个维度进行类似的操作,并完成相应的采集。
S4,由二维振镜302实现光照在样本中的横向扫描,由LCOS器件202上的多张强度图像实现光照在样本轴向的旋转扫描。
S5,控制器600同步控制上述LCOS器件202上的强度图样投射、振镜301的二维扫描以及像感器504的图像采集,实现对样本荧光信息的采样。
S6,通过相应的重建算法从采集的多张图像中重建样本的三维图像。
需要说明的是,所实现的多点同时激发能够获得更大的成像信噪比和更高的时间分辨率;而且由于样本轴向信息的固有特征,可以稀疏地进行有限的轴向旋转激发,并以此实现对于活体样本的三维成像
根据本发明实施例提出的基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像系统,利用对于光照波前的强度调制,实现样本轴向的多点同时激发,能够提高荧光成像的信噪比;结合稀疏的采集和相应的重建算法,能够实现对于活体样本的快速三维成像。
其次参照附图描述根据本发明实施例提出的基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像方法。
图4是本发明一个实施例的基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像方法的流程图。
如图4所示,该基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像方法包括:
在步骤S401中,通过激光光照获得尺寸覆盖LCOS投影面的平行光照。
在步骤S402中,将空间光调制器LCOS放置在光照端的傅里叶面上,通过投影强度图样对于光照进行波前调制,并控制照明光束在物面上实现二维扫描。
在步骤S403中,生成干涉的4Pi的PSF,照射荧光样本,并采集两路荧光信号的干涉图像。
在步骤S404中,调整光照方向,以生成不同倾斜角度4Pi的PSF,且得到多张干涉图像,并根据多张干涉图像获取三维体成像结果。
进一步地,在本发明的一个实施例中,通过激光光照获得尺寸覆盖LCOS投影面的平行光照,包括:控制激光光照通过5倍放大的4F系统,并在其傅里叶面上放置20um的圆孔,以得到平行光照。
进一步地,在本发明的一个实施例中,还包括:通过与后级光路匹配的扫描透镜减小二维振镜的扫描误差,并结合后级的套管透镜构成4F系统将光束尺寸调整至目标尺寸。
进一步地,在本发明的一个实施例中,生成干涉的4Pi的PSF,包括:通过前级的分束器将光照分成两路,并通过两个物镜和匹配的两个套管透镜产生两束相对的光照,以通过光照干涉得到4Pi的PSF,并以此照射荧光样本,其中,一路光照使用一面反射镜,另一路光照使用两面反射镜,使得形成的两路光照的PSF在与光轴垂直的横向面上沿着其中一个维度对称。
需要说明的是,前述对基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像系统实施例的解释说明也适用于该实施例的基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像方法,此处不再赘述。
根据本发明实施例提出的基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像方法,利用对于光照波前的强度调制,实现样本轴向的多点同时激发,能够提高荧光成像的信噪比;结合稀疏的采集和相应的重建算法,能够实现对于活体样本的快速三维成像。
此外,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中,“多个”的含义是至少两个,例如两个,三个等,除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像系统,其特征在于,包括:
光照模块,用于通过激光光照获得尺寸覆盖空间光调制器LCOS投影面的平行光照;
波前调制模块,用于将所述LCOS放置在光照端的傅里叶面上,通过投影强度图样对于所述光照进行波前调制;
二维扫描模块,用于控制照明光束在物面上实现二维扫描;
光照干涉模块,用于通过光照干涉生成4Pi的点扩散函数PSF,并照射荧光样本;
成像模块,用于采集两路荧光信号的干涉图像;以及
控制器,用于控制所述波前调制模块调整所述光照的偏振方向,以生成不同倾斜角度4Pi的PSF,且得到多张干涉图像,并根据所述多张干涉图像获取三维体成像结果。
2.根据权利要求1所述的系统,其特征在于,所述光照模块进一步用于控制所述激光光照通过5倍放大的4F系统,并在其傅里叶面上放置20um的圆孔,以得到所述平行光照。
3.根据权利要求1所述的系统,其特征在于,所述波前调制模块包括:
1/4波片,所述1/4波片用于调整所述光照的偏振方向,
空间光调制器LCOS,所述空间光调制器LCOS用于投影强度图样。
4.根据权利要求1所述的系统,其特征在于,所述二维扫描模块包括二维振镜和扫描透镜,其中,所述扫描透镜用于匹配后级光路,以减小所述二维振镜的扫描误差,并结合后级的套管透镜构成4F系统将光束尺寸调整至目标尺寸。
5.根据权利要求1所述的系统,其特征在于,所述光照干涉模块进一步用于通过前级的分束器将所述光照分成两路,并通过两个物镜和匹配的两个套管透镜产生两束相对的光照,以通过光照干涉得到所述4Pi的PSF,并以此照射荧光样本。
6.根据权利要求4所述的系统,其特征在于,其中,一路光照使用一面反射镜,另一路光照使用两面反射镜,使得形成的两路光照的PSF在与光轴垂直的横向面上沿着其中一个维度对称。
7.一种基于多角度4Pi显微镜的快速三维体成像方法,其特征在于,包括:
通过激光光照获得尺寸覆盖LCOS投影面的平行光照;
将空间光调制器LCOS放置在光照端的傅里叶面上,通过投影强度图样对于所述光照进行波前调制,并控制照明光束在物面上实现二维扫描;
生成干涉的4Pi的PSF,照射荧光样本,并采集两路荧光信号的干涉图像;以及
调整所述光照方向,以生成不同倾斜角度4Pi的PSF,且得到多张干涉图像,并根据所述多张干涉图像获取三维体成像结果。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述通过激光光照获得尺寸覆盖LCOS投影面的平行光照,包括:
控制所述激光光照通过5倍放大的4F系统,并在其傅里叶面上放置20um的圆孔,以得到所述平行光照。
9.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,还包括:
通过与后级光路匹配的扫描透镜减小二维振镜的扫描误差,并结合后级的套管透镜构成4F系统将光束尺寸调整至目标尺寸。
10.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述生成干涉的4Pi的PSF,包括:
通过前级的分束器将所述光照分成两路,并通过两个物镜和匹配的两个套管透镜产生两束相对的光照,以通过光照干涉得到所述4Pi的PSF,并以此照射荧光样本,其中,一路光照使用一面反射镜,另一路光照使用两面反射镜,使得形成的两路光照的PSF在与光轴垂直的横向面上沿着其中一个维度对称。
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