CN110286190B

CN110286190B - 一种同时测定don及多种don生物转化产物的方法

Info

Publication number: CN110286190B
Application number: CN201910558911.9A
Authority: CN
Inventors: 胥倩; 田纪春; 李彩霞; 谷淑波; 王群青
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2019-06-26
Filing date: 2019-06-26
Publication date: 2024-03-22
Anticipated expiration: 2039-06-26
Also published as: CN110286190A

Abstract

本发明公开了一种同时测定DON及多种DON生物转化产物的方法，包括如下步骤：(1)对待测样品进行预处理；(2)通过Q Exactive^TM组合型四极杆Orbitrap质谱仪测定预处理后的样品中DON及DON生物转化产物的含量。本发明的样品前处理简单，通过一次提取可将样品中的DON及多种DON生物转化产物最大限度的提取出来；采用本发明的方法可以快速、准确的对DON及八种DON生物转化产物同时进行测定。

Description

一种同时测定DON及多种DON生物转化产物的方法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种同时测定DON及多种DON生物转化产物的方法。

背景技术

禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是引起小麦赤霉病的主要病原体，经常在田间生长或贮藏期间感染小麦等谷物。感病后的小麦籽粒会携带多种毒素，其中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)，亦称呕吐毒素，在人类和动物饮食中经常出现，严重影响食品安全与人畜健康。

DON毒素是一种倍半烯衍生物，化学分子式C₁₅H₂₀O₆，是世界上最常见的谷物污染物之一，属于B型单端孢霉烯族真菌毒素的一种。DON食物中毒对人类的急性影响包括腹痛，头晕，头痛，咽喉刺激，恶心，呕吐，腹泻和血便。

近年来研究发现，在赤霉病污染的谷物中除了游离态DON外，还存在结合态DON。结合态DON是作物在受到赤霉病菌侵染时，为降低DON在作物中的积累、抵御赤霉病扩展代谢产生的，又称DON生物转化产物。DON生物转化产物主要包括：3-ADON、DON-3-G、DON-15-G、DON-3-Sulfate、DON-13-NAC、DON-10-GSH、DON-S-Cys-Gly、DON-S-Cys等。在谷物加工及其制品的生产过程中，DON生物转化产物和DON一样可以留存在食品及饲料中。由于常规的毒素分析中难以被检测，DON生物转化产物又称为隐蔽型DON。动物饲喂试验表明，DON生物转化产物可以在哺乳动物肠道内重新转化为游离态的DON，并进而表现出DON的毒性。因此，建立DON生物转化产物的定量检测方法，对于准确评价谷物中真菌毒素的含量水平具有重要意义。

目前关于检测谷物及食品中DON及DON生物转化产物的报道主要有：《Journal ofagricultural and food chemistry》，2012，46，11638和《Mycotoxinresearch》，2012，28，181通过多功能MycoSep226或225柱净化后液相串联质谱法测定谷物、玉米及其产品中DON、D3G、3ADON及15ADON的含量。此类方法前处理操作繁琐且成本较高，而且对D3G回收率偏低(50％-60％)；《Food additives and contaminants：Part A》，2009，26，507样本提取后未净化直接液相串联质谱法测定小麦和玉米中DON及D3G含量。此方法虽然前处理简单快捷，但是样品中含有的脂类等干扰物质严重减低检测灵敏度，而且长期使用对质谱离子源造成极大损坏。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种同时测定DON及多种DON生物转化产物的方法。本发明的样品前处理简单，通过一次提取可将样品中的DON及多种DON生物转化产物最大限度的提取出来；采用本发明的方法可以快速、准确的对DON及八种DON生物转化产物同时进行测定。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种同时测定DON及多种DON生物转化产物的方法，包括如下步骤：

(1)对待测样品进行预处理；

(2)通过Q Exactive^TM组合型四极杆Orbitrap质谱仪测定预处理后的样品中DON及DON生物转化产物的含量；

所述DON生物转化产物包括：3-ADON、DON-3-G、DON-15-G、DON-3-Sulfate、DON-13-NAC、DON-10-GSH、DON-S-Cys-Gly和DON-S-Cys。

优选的，步骤(1)中，样品预处理的方法为：将待测样品磨碎后，以体积分数为75％的甲醇水溶液作为提取溶剂进行超声提取，离心，将离心后的上清液分离出来，浓缩干燥。

进一步的，超声提取时间为30min。

进一步的，所述离心的转速为13000rpm，离心时间为5min。

本发明还对提取溶剂进行了优选，分别以水、纯甲醇、95％甲醇、50％甲醇、20％甲醇和乙醇作为溶剂提取同一样品，结果发现，以75％的甲醇水溶液作为提取溶剂能最大程度的同时将材料中的DON及DON生物转化产物提取出来。

进一步的，所述样品的预处理还包括：将浓缩干燥后的样品用体积分数为20％的乙腈水溶液重悬，然后通过0.22μm的滤膜过滤的步骤。

优选的，步骤(2)中，测定的色谱条件为：采用C18柱；流动相由A相和B相组成，A相为0.1％乙酸水溶液，B相为乙腈；采用梯度洗脱。

进一步的，所述梯度洗脱的程序为：0-0.2min，A相＝90％；0.2-6min，A相递减至10％；6-8min，A相＝10％；8-8.1min，A相递增至90％；8.1-10min，A相＝90％。

进一步的，所述C18柱为Thermo HYPERSIL GOLD C18色谱柱。

流动相及洗脱程序的选择直接影响液相色谱的分离效果，本发明在试验过程中对多个流动相体系进行了试验，如乙腈-水、甲醇-水，结果发现，只有乙腈-水体系能将目标峰和别的杂质峰分开，其他的流动相体系都不能将目标峰分开，而且峰形较差。为进一步改善目标峰的分离度和峰形，本发明在水相中加入了0.1％的乙酸，极大的改善了目标峰的峰形和分离度。同时，为了使DON及八种DON生物转化产物能够得到较好的分离，本发明采用梯度洗脱，并对洗脱程序进行多次优化，最终得到最优的梯度洗脱程序为：0-0.2min，A相＝90％；0.2-6min，A相递减至10％；6-8min，A相＝10％；8-8.1min，A相递增至90％；8.1-10min，A相＝90％，在该洗脱程序下能够在最短的时间内将DON及八种D ON生物转化产物分离。

优选的，步骤(2)中，测定的质谱条件为：：正离子模式：喷雾电压：3.8kv；鞘气：40；辅助气：10；离子传输管温度：350℃。微扫数：1；AGC target:2e5；分辨率：17500；归一化碰撞能量：15，30，45；

负离子模式：喷雾电压：2.9kv；鞘气：4；辅助气：0；离子传输管温度：350℃。微扫数：1；AGC target:2e5；分辨率：17500；归一化碰撞能量：15，30，45。

进一步的，所述质谱条件还包括：

本发明的有益效果：

本发明首次实现了对DON及八种DON生物转化产物的同时检测。对于没有标样的DON生物转化产物，本发明可以对其进行相对定量，即比较不同样品中目标物含量的高低；对于有标样的DON及DON生物转化产物，该方法精密度、准确度、稳定性均满足定量分析的要求，具有准确度高、重现性好、稳定、可靠的特点，可用于准确评价谷物中真菌毒素的含量水平。

附图说明

图1：同一样品的跑样结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

术语说明：

Q Exactive^TM组合型四极杆Orbitrap质谱仪：将四极杆母离子选择性与高分辨率和准确质量数Orbitrap检测相结合，特别适用于非目标或目标化合物筛查。能够实现广泛的定性和定量应用。目前已广泛用于药物发现、蛋白质组学、环境和食品安全、临床研究和法医毒理学。

DON生物转化产物：脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)在植物体内会被添加各种基团，形成DON生物转化产物。

正如背景技术部分所介绍的，建立DON及DON生物转化产物的定量检测方法，对于准确评价谷物中真菌毒素的含量水平具有重要意义。现有报道的检测谷物及食品中DON及DON生物转化产物的方法主要存在前处理复杂、检测的DON生物转化产物的种类有限等问题。

3-ADON、DON-3-G、DON-15-G、DON-3-Sulfate、DON-13-NAC、DON-10-GSH、DON-S-Cys-Gly和DON-S-Cys这八种DON生物转化产物是目前比较主流的DON生物转化产物，对这八种DON生物转化产物进行同时检测将具有更广泛的实际应用价值。但这八种DON生物转化产物中的多种，由于其发现时间晚，目前还未有相应的标样。而且由于正负离子模式液相不同，提取方法不同，无法对上述所有目标物进行同时检测。因此，对这八种DON生物转化产物进行同时检测的难度极大。

基于此，本发明的目的是提供一种能够同时测定DON及多种DON生物转化产物的方法。

测定DON及多种DON生物转化产物的首要步骤是如何从样品中将目标物有效提取出来。本发明是将待测样品磨碎后，以体积分数为75％的甲醇水溶液作为提取溶剂进行超声提取，离心，将离心后的上清液分离出来，浓缩干燥。采用这种方法可以最大限度的将目标物从样品中提取出来。

将目标物从样品中提取出来后，下一步是需要对目标物进行同时检测，由于本发明检测的目标物为DON及八种DON生物转化产物，目标物数量多，确定同时检测的参数条件的难度大。为实现对所有目标物进行同时检测，本发明对正负离子模式进行了合并，跑样方法中同时采用正负离子扫描模式。本发明采用的是Q Exactive^TM组合型四极杆Orbitrap质谱仪进行检测，该仪器可以实现正负离子模式切换，因此可以在跑同一个样品时同时进行正负离子扫描。

在对检测条件，特别是质谱条件进行摸索时，本发明首先利用全扫描模式提取目标物的母离子质谱信息，在全扫描模式上找到目标物后，再采用PRM模式跑样，同时对母离子与子离子进行质谱信息提取后确定目标物到底有没有出峰。其中，全扫描模式与PRM模式都可以同时实现正负离子模式扫描。

本发明中目标物的确定是通过子离子与母离子质谱来实现的，因此无需标样即可实现对目标物进行检测。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：

1.禾谷镰刀菌侵染后的小麦小穗样品磨碎后，每100mg样品加入1.5ml 75％的甲醇水，常温超声30min，13000prm离心5min，取上清转移至一新离心管内，真空浓缩至干粉状。

2.进样前使用100μl 20％乙腈水重悬，通过0.22μm的滤膜过滤后即可对DON衍生物进行检测。

3.DON及DON-3G需要用在重悬溶液的基础上使用20％乙腈水稀释100倍后上机检测。

液相条件：

色谱柱：Thermo HYPERSIL GOLD C18色谱柱(2.1×150,3μm)；

柱温：35℃；

流动相：A:0.1％乙酸溶液，B:乙腈；

洗脱梯度：0-0.2min，A＝90％；0.2-6min，A递减至10％；6-8min，A＝10％；8.1min，A递增至90％；8.1-10min，A＝90％；

进样体积：7μl

质谱条件：

正离子模式：喷雾电压：3.8kv；鞘气：40；辅助气：10；离子传输管温度：350℃。微扫数：1；AGC target:2e5；分辨率：17500；归一化碰撞能量：15，30，45；

注：[M]-的意思是目标物分子增加一个电子，呈负离子模式。

其中，首先利用全扫描模式提取目标物的母离子质谱信息，在全扫描模式上找到目标物后，再采用PRM模式跑样，同时对母离子与子离子进行质谱信息提取，确定目标物是否出峰；全扫描模式与PRM模式均为正负离子模式扫描。采用本发明的检测方法可以实现对DON及八种DON生物转化产物的同时检测。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种同时测定DON及多种DON生物转化产物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)对待测样品进行预处理；

(2)通过Q ExactiveTM组合型四极杆Orbitrap质谱仪测定预处理后的样品中DON及DON生物转化产物的含量；

所述DON生物转化产物包括：3-ADON、DON-3-G、DON-15-G、DON-3-Sulfate、DON-13-NAC、DON-10-GSH、DON-S-Cys-Gly和DON-S-Cys；

所述待测样品为小麦小穗；

步骤(1)中，所述样品预处理的方法为：将待测样品磨碎后，以体积分数为75％的甲醇水溶液作为提取溶剂进行超声提取，离心，将离心后的上清液分离出来，浓缩干燥；

步骤(2)中，所述测定的色谱条件为：采用C18柱；流动相由A相和B相组成，A相为0.1％乙酸水溶液，B相为乙腈；采用梯度洗脱；

所述梯度洗脱的程序为：0-0.2min，A相＝90％；0.2-6min，A相递减至10％；6-8min，A相＝10％；8-8.1min，A相递增至90％；8.1-10min，A相＝90％；

所述C18柱为Thermo HYPERSIL GO LD C18色谱柱；

步骤(2)中，所述测定的质谱条件为：正离子模式：喷雾电压：3.8kv；鞘气：40；辅助气：10；离子传输管温度：350℃；微扫数：1；AGC target:2e5；分辨率：17500；归一化碰撞能量：15，30，45；

负离子模式：喷雾电压：2.9kv；鞘气：4；辅助气：0；离子传输管温度：350℃；微扫数：1；AGC target：2e5；分辨率：17500；归一化碰撞能量：15，30，45；

所述质谱条件还包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声提取时间为30min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心的转速为13000rpm，离心时间为5min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品的预处理还包括：将浓缩干燥后的样品用体积分数为20％的乙腈水溶液重悬，然后通过0.22μm的滤膜过滤的步骤。