CN110172098B

CN110172098B - 抗α-突触核蛋白的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN110172098B
Application number: CN201910446324.0A
Authority: CN
Inventors: 滕国生; 高冷; 殷玉和; 吴丛梅; 孙尧; 牛晓辉; 张凤英
Original assignee: Changchun University of Technology
Current assignee: Changchun University of Technology
Priority date: 2019-05-27
Filing date: 2019-05-27
Publication date: 2023-03-10
Anticipated expiration: 2039-05-27
Also published as: CN110172098A

Abstract

本发明涉及抗体药物技术领域，具体涉及抗α‑突触核蛋白的单克隆抗体及其应用。本发明提供的抗α‑突触核蛋白的单克隆抗体能够特异性结合α‑突触核蛋白的单体和聚合体，对于人α‑突触核蛋白的单体和聚合体均具有较高的亲和力，对β‑突触核蛋白和γ‑突触核蛋白不具有结合力；能够有效抑制α‑突触核蛋白的单体的聚合，并且促进小胶质细胞对已形成的α‑突触核蛋白聚合体的清除，保护神经元细胞免受α‑突触核蛋白聚合体的毒性，可用于预防、治疗和诊断α‑突触核蛋白相关的疾病和病症，如帕金森病、路易体痴呆，合并阿尔茨海默病和帕金森病、纯自主神经衰竭、多系统萎缩等。

Description

抗α-突触核蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗体药物技术领域，具体涉及抗α-突触核蛋白的单克隆抗体及其应用。

背景技术

1.α-突触核蛋白(α-synuclein)

α-突触核蛋白(α-synuclein)是突触核蛋白家族的一员，该蛋白家族由一群分子量约为14KD的蛋白组成，除α-synuclein外，还包括β-synuclein和γ-synuclein。人α-synuclein由位于第四染色体的SNCA基因编码，含有140个氨基酸，分为三个结构域，分别为N端的KTKEGV重复区(1-60aa)，中间的NAC区(61-95aa)和C端的脯氨酸富集区(96-140aa)。α-synuclein在脑组织中广泛表达，约占脑细胞中胞质总蛋白的1％，尤其在新皮质、海马、黑质、丘脑和小脑中高表达，也在心脏、肌肉和其它组织中少量表达。

α-synuclein主要位于成熟神经元细胞的突触前末端，它不参与突触的形成，而是维持或调节现有的突触。正常生理状态下，α-synuclein的功能包括结合脂肪酸，调节某些酶和转运体的生理功能，并在突触可塑性、神经递质释放和突触囊泡再循环方面起着重要作用。现有证据表明，α-synuclein在SNARE复合物形成过程中起着分子伴侣蛋白的作用。它同时通过N端和C端结构域结合质膜的磷脂和突触蛋白-2，参与神经元高尔基体的活动和囊泡运输。除此之外，在突触前区域，α-synuclein通过与脑泡和磷脂膜相互作用，影响多巴胺的储存，并且通过和囊泡膜的作用，调节多巴胺的释放。α-synuclein对于认知功能的正常发展也是必不可少的，实验表明，敲除α-synuclein表达基因的小鼠在空间学习和工作记忆方面受损。

2.α-synuclein相关的疾病

由突触核蛋白异常引起的疾病被称做突触核蛋白病，也叫做路易体病。目前，路易体疾病仍然是老年人群中运动障碍和认知恶化的常见原因。突触核蛋白病的特征是多巴胺系统退化，运动改变，认知障碍，并形成路易体(LBs)和/或路易神经突起。突触核蛋白病包括神经元的和神经退行性的疾病，如帕金森病(PD，包括特发性帕金森病)，路易体痴呆(DLB，也称为弥漫性路易体病，DLBD)，合并阿尔茨海默病和帕金森病，纯自主神经衰竭和多系统萎缩(MSA)。一些非运动性体征和症状被认为是发生突触核蛋白病的先兆。这些早期症状包括REM睡眠行为障碍(RBD)、嗅觉丧失和便秘。而在疾病(例如PD和DLB)进展的晚期，通常可以检测到可溶性α-synuclein寡聚体在PD和DLB病人脑脊液中的显著增高，以及由α-synuclein形成的不溶性纤维沉淀，即路易小体(LBs)。

α-synuclein是路易小体和神经包涵体的主要组成部分，是导致帕金森病和路易体病发病的重要机制，α-synuclein基因突变可以导致罕见家族性帕金森病。在人类、小鼠和果蝇等不同物种的动物模型中，α-synuclein过表达导致的形态和神经改变也证实了α-synuclein在路易体病发生过程中的重要作用。

α-synuclein的异常也和部分阿尔茨海默病(AD)的发病相关。α-synuclein和AD之间的联系首先是在AD病人脑内的斑块中发现“非淀粉样成分(NAC)”，该种成分后来被证实是α-synuclein的片段。α-synuclein在体外能够促进Aβ的聚集，但是在体内并没有提高淀粉样斑块的沉积。尽管α-synuclein在体内对斑块的形成没有影响，但是通过比较单表达人APP/Aβ或α-synuclein基因的转基因鼠和双转基因鼠发现，双转基因鼠表现出神经突触丢失、胆碱乙酰转移酶阳性神经元的减少，以及比单转基因鼠更严重的认知损害。这项研究也同时揭示了Aβ能够在体内和体外极大地促进α-synuclein的聚集。

3.α-synuclein的病理学机制

(1)α-synuclein的聚集

α-synuclein通常以可溶性单体蛋白的形式存在，但在溶液中呈无序状态，缺乏稳定的三级结构。可溶性α-synuclein可以通过泛素-蛋白酶系统(UPS)途径和伴侣蛋白介导的自噬(CMA)进行降解。但在病理条件下，α-synuclein单体会有聚集的倾向，聚合成寡聚体，进而形成分子量较高的不溶性纤维体。这些高度磷酸化和泛素化的不溶性纤维体会影响线粒体代谢，降低巨噬细胞的自噬效率，并产生神经元毒性造成神经元细胞死亡。α-synuclein的聚积和折叠受多种因素的影响，包括磷酸化、线粒体和溶酶体功能障碍，氧化和氮化应激。除此之外，突触核蛋白酶对α-synuclein C端的切割也会导致单体α-synuclein形成寡聚体，并且和疾病的严重程度密切相关。

(2)α-synuclein的清除

路易体中α-synuclein的清除可以通过蛋白酶体进行。研究表明，泛素-蛋白酶系统(UPS)或蛋白酶体的功能缺失会导致PD患者体内α-synuclein的聚集，内含体的形成以及神经元的退变。同样，通过抑制蛋白酶体的功能或过表达α-synuclein，也会导致细胞死亡的增加。

UPS降解的蛋白通常有着比较短的半衰期(<10小时)，而α-synuclein的半衰期一般在16个小时左右。但是，一些研究并没有在蛋白酶体抑制剂存在的条件下检测到α-synuclein的升高，这很有可能是因为α-synuclein被降解半衰期更长蛋白的溶酶体降解了。这种降解被称为伴侣蛋白介导的自噬(CMA),涉及到hsc70伴侣蛋白和溶酶体膜受体lamp2a。野生型的α-synuclein既可以被UPS也可以被CMA降解。但是对PD病人脑黑质的研究表明，不溶性α-synuclein和α-synuclein聚合物会结合蛋白酶体并抑制其功能。α-synuclein的突变和多巴胺氧化形式也损害导致自噬上调的CMA途径。而α-synuclein的功能性清除障碍以及由此导致的蛋白质质量控制系统损害，特别是自噬，已成为神经退行性变的显著致病机制。

另外一些研究表明，伴侣蛋白介导的自噬，也叫作巨型自噬，在降解α-synuclein聚合体的过程中起着重要作用。基于这些研究，发现野生型α-synuclein可以被CMA系统清除，而聚合体的α-synuclein只能通过巨型自噬来进行清除。但是，也需要考虑到，自噬系统本身的干扰，如在退行性细胞应激环境中所见，也可能促进α-突触核素的毒性。

4.治疗性抗α-synuclein抗体

事实上，通常在介入治疗时，已经可以检测到聚合体的出现，而自身抗体在此时即使可以改善症状，也并不能完全清除聚合体，这也体现在大规模比较PD病人和正常人自身抗体时，并没有统计学上的差异。随着对α-synuclein清除机制的深入研究，针对于α-synuclein抗体介导的清除成为治疗α-synuclein病的突破点。在动物实验中，结合α-synuclein C端的抗体能够减少PD模型鼠脑中α-synuclein的聚集并缓解病理症状。而溶酶体抑制剂能够降低抗体的保护作用，表明自噬介导的清除机制参与了α-synuclein聚合体的降解。

除此之外，能够有效的抑制α-synuclein的聚集也成为了治疗α-synuclein病的突破口之一。通过抗体来抑制α-synuclein的聚集，能够有效地减少α-synuclein聚合物对神经元的毒性，降低神经元的损害，同时，聚合物的减少也能够促进体内UPS和CMA系统对于α-synuclein的清除，对神经元细胞起到保护作用。减轻、减缓α-synuclein病的症状，起到良好的治疗作用。

现有技术中针对α-synuclein的抗体的研究主要集中在区分对α-synuclein单体和聚合体亲和力方面的差异性、对不同α-synuclein形式和表位的结合以及抗体的来源(比如杂交瘤途径和自身抗体来源)。而且，多数抗体仅通过验证与α-synuclein单体或聚合体的结合来体现抗体的功能(如利用ELISA方法，免疫组化方法，免疫印迹方法等)，但是对于抗体在药用方面的功效并未确定，仅有少量抗体验证了在动物方面的效能，但是也只是处在研究的起始阶段。然而，在抗体成药的研发过程中，体外细胞学的介入是必不可少的，可以弥补动物体内细胞学活性研究的不足，为新药分子的筛选提供理论和实际的依据。

根据α-synuclein的病理机制，α-synuclein单体的聚集和聚合体的毒性是引发一系列病症的诱因，因此，开发高效的抗α-synuclein抗体，有效的防止α-synuclein单体聚集并清除聚合体是α-synuclein病治疗的基础，具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种对α-突触核蛋白的单体和聚合体同时具有较高且适当的亲和力、特异性高，且具有较好生物学活性的抗α-突触核蛋白的单克隆抗体及其应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明经大量筛选获得抗α-突触核蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体能够结合人、鼠、猴的α-突触核蛋白单体及人的α-突触核蛋白聚合体，对于人的α-突触核蛋白单体和聚合体均具有较高的亲和力，可呈剂量依赖性抑制α-突触核蛋白单体的聚合并促进小胶质细胞对于α-突触核蛋白聚合体的吞噬，同时通过抑制和清除两种机制减少α-突触核蛋白聚合物的沉积，减轻减缓由α-突触核蛋白聚合导致的神经毒作用。

具体而言，首先，本发明提供抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段，所述单克隆抗体或其片段能够特异性地结合α-突触核蛋白单体以及α-突触核蛋白聚合体，所述单克隆抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR区序列如下：

(1)CDR1：具有如SEQ ID NO.1-3所示的任一序列或具有如SEQ ID NO.1-3所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(2)CDR2：具有如SEQ ID NO.4-6所示的任一序列或具有如SEQ ID NO.4-6所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)CDR3：具有如SEQ ID NO.7-9所示的任一序列或具有如SEQ ID NO.7-9所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。

所述抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段的轻链可变区的CDR区序列如下：

(1)CDR1：具有如SEQ ID NO.10-12所示的任一序列或具有如SEQ ID NO.10-12所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(2)CDR2：具有如SEQ ID NO.13-15所示的任一序列或具有如SEQ ID NO.13-15所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)CDR3：具有如SEQ ID NO.16-18所示的任一序列或具有如SEQ ID NO.16-18所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。

单克隆抗体的CDR区很大程度地决定抗体结合抗原的亲和力和特异性，具备上述序列的CDR区有利于提高单克隆抗体和α-突触核蛋白的结合亲和力，同时降低与β-突触核蛋白、γ-突触核蛋白的结合亲和力，提高特异性。

进一步地，本发明所述的抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段重链可变区的FR区序列如下：

(1)FR1：具有如SEQ ID NO.19-21所示的任一序列或具有如SEQ ID NO.19-21所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(2)FR2：具有如SEQ ID NO.22-24所示的任一序列或具有如SEQ ID NO.22-24所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)FR3：具有如SEQ ID NO.25-27所示的任一序列或具有如SEQ ID NO.25-27所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(4)FR4：具有如SEQ ID NO.28-30所示的任一序列或具有如SEQ ID NO.28-30所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。

进一步地，本发明所述的抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段轻链可变区的FR区序列如下：

(1)FR1：具有如SEQ ID NO.31-33所示的任一序列或具有如SEQ ID NO.31-33所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(2)FR2：具有如SEQ ID NO.34-36所示的任一序列或具有如SEQ ID NO.34-36所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。

(3)FR3：具有如SEQ ID NO.37-39所示的任一序列或具有如SEQ ID NO.37-39所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(4)FR4：具有如SEQ ID NO.40-42所示的任一序列或具有如SEQ ID NO.40-42所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。

作为优选，本发明所述的抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段的重链可变区具有如SEQ ID NO.43-45所示的任一序列或具有如SEQ ID NO.43-45所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。

作为优选，本发明所述的抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段的轻链可变区具有如SEQ ID NO.46-48所示的任一序列或具有如SEQ ID NO.46-48所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。

本发明中，上述“经缺失、替换、或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白的氨基酸序列”是指在一个或多个氨基酸残基处不同于所示的序列但保留所得到的分子的生物学活性的序列，其可为“保守修饰的变体”或经“保守的氨基酸取代”改造得到的。“保守修饰的变体”或经“保守的氨基酸取代”是指本领域技术人员已知的氨基酸取代，进行这种取代通常不改变所得到的分子的生物学活性。一般而言，本领域技术人员公认在单克隆抗体功能非必需区的单个氨基酸取代基本上不改变生物学活性。示例性取代优选依照以下所示的取代进行：

表1示例性保守氨基酸取代

本发明中，“经缺失、替换、或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白的氨基酸序列”中“多个”为≥2个且≤30个。

作为本发明的优选方案，所述的抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段包含如下任一种的轻链可变区和重链可变区的组合：

(1)轻链可变区的序列如SEQ ID NO.46所示或为与如SEQ ID NO.46所示的序列具有至少90％的同源性的序列，重链可变区的序列如SEQ ID NO.43所示或为与如SEQ IDNO.43所示的序列具有至少90％的同源性的序列；优选地，所述同源性为至少95％；更优选为至少98％；

(2)轻链可变区的序列如SEQ ID NO.47所示或为与如SEQ ID NO.47所示的序列具有至少90％的同源性的序列，重链可变区的序列如SEQ ID NO.44所示或为与如SEQ IDNO.44所示的序列具有至少90％的同源性的序列；优选地，所述同源性为至少95％；更优选为至少98％；

(3)轻链可变区的序列如SEQ ID NO.48所示或为与如SEQ ID NO.48所示的序列具有至少90％的同源性的序列，重链可变区的序列如SEQ ID NO.45所示或为与如SEQ IDNO.45所示的序列具有至少90％的同源性的序列；优选地，所述同源性为至少95％；更优选为至少98％。

上述具有至少90％的同源性的序列或至少95％或至少98％得同源性是指与所述抗体的序列经同源比对得到的同源性不低于90％、95％或98％并且与所述抗体具有相同的功能，即能够结合α-突触核蛋白单体和α-突触核蛋白聚合体。

在上述抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段的轻链可变区和重链可变区的基础上，本领域技术人员可以根据需要利用本领域常规技术手段构建全长单克隆抗体分子。

作为优选，全长单克隆抗体分子为IgG型或IgM型。所述IgG型包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的一种。

作为优选，所述单克隆抗体的轻链为κ型。

进一步地，本发明提供产生所述抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段的杂交瘤细胞。

进一步地，本发明还提供一种抗原，其具有如SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62或SEQID NO.63所示的氨基酸序列。

进一步地，本发明还提供编码所述抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段的核酸。

根据上述重链和轻链的氨基酸序列，本领域技术人员可以根据表达宿主的密码子偏好性设计能够编码上述重链和轻链的不同的核苷酸序列，所有能够编码本发明提供的轻链和重链的核酸均在本发明的保护范围内。

作为优选，编码所述抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段的重链可变区和轻链可变区的核酸具有如下任一种核苷酸序列：

(1)编码重链可变区的核酸如SEQ ID NO.49-51所示或为其互补序列；编码轻链可变区的核酸如SEQ ID NO.52-54所示或为其互补序列；

其中，所述如SEQ ID NO.49-51所示的互补序列如SEQ ID NO.55-57所示，所述如SEQ ID NO.52-54所示的互补序列如SEQ ID NO.58-60所示。

(2)与(1)的核苷酸序列编码相同的单克隆抗体或其片段，但因遗传密码的简并性而与(1)的核苷酸序列不同的序列

(3)与(1)或(2)所述序列具有至少有80％同源性的序列。

(4)(1)、(2)或(3)所示的核苷酸序列经替换、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的与(1)、(2)或(3)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。

本发明中，“经替换、缺失或添加一个或多个核苷酸”中所述多个为≥2个且≤30个。

本发明还提供含有所述核酸的生物材料，所述生物材料包括表达盒、载体、转座子、宿主细胞、工程菌或转基因细胞系。

所述载体包括但不限于克隆载体、表达载体、质粒载体，所有包含所述编码抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段的核酸的载体均在本发明的保护范围内。

所述宿主细胞或转基因细胞系可以为来源于微生物、植物或动物的细胞或细胞系，所有含有所述编码抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段的核酸或包含所述核酸的载体的宿主细胞或转基因细胞系均在本发明的保护范围内。

进一步地，本发明提供一种复合物或偶联物，其包含所述抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段或由所述抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段制备得到。

作为优选，所述复合物为所述抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段经化学标记或生物标记得到。

所述化学标记包括但不限于同位素、免疫毒素和/或化学药物。

所述生物标记包括但不限于生物素、亲和素或酶标记。

作为优选，所述偶联物为所述抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段或所述经化学标记或生物标记得到的复合物与固体或半固体介质偶联得到。

所述固体介质或非固体介质包括但不限于胶体金、聚苯乙烯平板或珠粒。

进一步地，本发明提供所述抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段或所述编码抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段的核酸或含有所述核酸的生物材料或所述复合物或偶联物的如下任一应用：

(1)在制备用于预防或治疗α-突触核蛋白病的药物中的应用；

(2)在制备用于缓解α-突触核蛋白的聚合物毒性或控制α-突触核蛋白病发展的产品中的应用；

(3)在制备用于抑制α-突触核蛋白单体聚合或α-突触核蛋白的寡聚体、原纤维、纤维体、路易小体形成的产品中的应用；

(4)在制备用于减少α-突触核蛋白聚合体积累的产品中的应用；

(5)在制备用于促进小胶质细胞对α-突触核蛋白聚合体的吞噬和清除的产品中的应用；

(6)在制备α-突触核蛋白、α-突触核蛋白聚合体、α-突触核蛋白抗体的检测试剂或试剂盒中的应用。

进一步地，本发明提供一种药物，包含所述抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段或所述抗α-突触核蛋白的的单克隆抗体或其片段制备得到。

所述药物具有如下任一功能：

(1)用于预防或治疗α-突触核蛋白病；

(2)用于缓解α-突触核蛋白的聚合物毒性或控制α-突触核蛋白病发展；

(3)用于抑制α-突触核蛋白单体聚合或α-突触核蛋白的寡聚体、原纤维、纤维体、路易小体的形成；

(4)用于减少α-突触核蛋白聚合体、原纤维、纤维体，路易小体的积累。

(5)用于促进小胶质细胞对α-突触核蛋白聚合体的吞噬和清除。

作为优选，本发明所述的抗α-突触核蛋白单克隆抗体或其片段阻断α-突触核蛋白单体聚合的抗体浓度IC50值为2.693μg/ml～3.678μg/ml。

作为优选，本发明所述的抗α-突触核蛋白单克隆抗体或其片段介导小胶质细胞对α-突触核蛋白聚合体吞噬的剂量以抗体浓度计为2μg/mL～5μg/mL。

本发明中，所述α-突触核蛋白病包括但不限于帕金森病、路易体痴呆、合并阿尔茨海默病和帕金森病、纯自主神经衰竭、多系统萎缩。

作为优选，所述药物的剂型为注射液剂或注射粉针剂。

作为一种实施方式，所述注射液中，所述抗α-突触核蛋白单克隆抗体或其片段的浓度为5μg/mL。

本发明经实验验证证明，本发明提供的所述抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段能够与α-突触核蛋白单体相结合，同时也与α-突触核蛋白聚合体相结合，因此能够用于α-突触核蛋白单体或α-突触核蛋白聚合体的检测。并且，由于突触核蛋白病患者脑脊液、血液、肠道中α-突触核蛋白的表达异常，本发明提供的抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段能够用于制备α-突触核蛋白标志物检测的试剂盒。

上述检测可采用本领域常规的抗原或抗体检测方法，包括但不限于ELISA法。

进一步地，本发明提供一种用于检测α-突触核蛋白单体或其聚合体的检测试剂或试剂盒，其包含所述抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段、或者包含所述复合物或偶联物。

为便于α-突触核蛋白的检测，所述检测试剂盒还包括包被缓冲液、洗涤液、封闭液、显色液中的一种或多种。

上述包被缓冲液、洗涤液、封闭液、显色液可以采用本领域常用的配方，例如：所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液；所述洗涤液中含有PBS、Tween、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠和磷酸氢二钾；所述封闭液中含有PBS和BSA；所述显色液中含有TMB溶液、底物缓冲液和终止液；所述底物缓冲液含有柠檬酸和磷酸氢二钠；所述终止液为过氧化氢水溶液。

当用于检测表面表达α-突触核蛋白的细胞时，所述检测试剂盒还包括PBS、羊抗鼠IgG Fc和TITC二抗。

进一步地，本发明还提供所述抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段的制备方法，包括将编码所述抗α-突触核蛋白的的单克隆抗体或其片段的核酸导入宿主细胞，表达所述抗α-突触核蛋白的的单克隆抗体或其片段，经分离纯化得到。

本发明还提供一种疾病的诊断方法，以本发明提供的检测试剂盒检测α-突触核蛋白的表达和积累，根据α-突触核蛋白的在脑脊液和血浆中的量，参考正常对照(1.57±0.6ng/ml(脑脊液)和59.54±35.1ng/ml(血浆))，判断是否患有α-突触核蛋白相关的疾病。

本发明还提供一种疾病的预防或治疗方法，包括：给予本发明所述的药物。

上述疾病包括但不限于帕金森病(PD，包括特发性帕金森病)，路易体痴呆(DLB)，合并阿尔茨海默病和帕金森病，纯自主神经衰竭和多系统萎缩(MSA)。

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel)。

其中，氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。

“抗体”是指由能特异结合抗原的一种或多种多肽构成的蛋白质。抗体的一种形式构成了抗体的基本结构单元。这种形式是四聚物，它由两对完全相同的抗体链构成，每一对都有一个轻链和一个重链。在每对抗体链中，轻链和重链的可变区联合在一起共同负责结合抗原，而恒定区则负责抗体的效应器功能。

抗体重链或轻链的“可变区”是该链的N端成熟区域。目前已知的抗体类型包括κ和λ轻链，以及α，γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，δ，ε和μ重链或它们的其它类型等价物。全长的免疫球蛋白“轻链”(大约25kDa或大约214个氨基酸)包含一个由NH2-末端上大约110个氨基酸形成的可变区，以及一个COOH-末端上的κ或λ恒定区。全长的免疫球蛋白“重链”(大约50kDa或大约446个氨基酸)，同样包含一个可变区(大约116个氨基酸)，以及重链恒定区之一，例如γ(大约330个氨基酸)。

“抗体”包括任何同型体的抗体或免疫球蛋白，或保持与抗原特异结合的抗体片段，包括但不限于Fab，Fv，scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合蛋白质。抗体可以被标记和检测，例如，可以通过放射性同位素、能产生可检测物的酶、荧光蛋白质、生物素等等进行标记并被检测。抗体还可以结合于固相载体，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。

所述“单克隆抗体”系指具有单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物显示出对于特定表位的单一结合特异性和亲和性。

所述药物中含有至少一种功能成分，还包括可药用的载体。优选地，所述可药用载体是水、缓冲水溶液、等渗盐溶液如PBS(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润湿剂、乳化剂或缓冲液物质作为添加剂。

本文使用的“CDR区”或“CDR”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高变区，如Kabat etal.所定义(Kabat et al.,Sequences of proteins of immunological interest,5thEd.,U.S.Department of Health and Human Services,NIH,1991，以及以后版本)。存在三个重链CDR和三个轻链CDR。根据情况，本文所用术语CDR或CDRs是为了指示这些区域之一、或者这些区域的几个或者甚至全部，所述区域包含通过抗体对抗原或其识别表位的亲和力而负责结合的大部分氨基酸残基。

本发明的有益效果如下：

本发明提供的抗α-突触核蛋白单克隆抗体能够特异性结合α-突触核蛋白的单体和聚合体，对于α-突触核蛋白的单体和聚合体均具有较高的亲和力(对人α-突触核蛋白单体的亲和力最高为15.6nM；对人α-突触核蛋白聚合体的亲和力最高为8.9nM)，对β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白不具有结合力；能够有效抑制α-突触核蛋白的单体的聚合(抑制率最高达到98.78％，IC50为2.693μg/ml)，并且促进小胶质细胞对已形成的α-突触核蛋白聚合体的清除(BV2小胶质细胞对人α-synuclein聚合体的吞噬率最高达到89.55％，IC50为1.97μg/ml)，保护神经元细胞免受α-突触核蛋白聚合体的毒性，可用于预防、治疗和诊断α-突触核蛋白相关的疾病和病症，如帕金森病、路易体痴呆，合并阿尔茨海默病和帕金森病、纯自主神经衰竭和多系统萎缩等。

相对于现有技术中的抗α-突触核蛋白单克隆抗体，本发明的抗体除具有以上描述的有益效果外，还在生物学活性上体现出卓越的效果。在进行生物学活性验证时，本发明通过细胞学活性检测方法，在细胞水平验证了抗体介导的清除功能，完整地验证了本发明的抗体在抗体介导的小胶质细胞吞噬方面的功能。符合α-突触核蛋白相关疾病的病理学发病机制，能够作为成药分子筛选的基础和依据。在生物学活性方面，本发明的抗α-突触核蛋白单克隆抗体对于α-synuclein聚合体的积累发挥“标本兼治”的功效，一方面在“本”上抑制单体的聚合，另一方面在“标”上清除聚合体，并激活体内固有的UPS和CMA清除系统，使得体内清除系统逐渐恢复平衡，避免一直或过量用药导致的毒副作用。基于成药分子对于抗体亲和力的需求，本发明的抗体虽然对单体和聚合体都有着较高的亲和力，可以保证和α-synuclein单体和聚合体的有效结合，但仍然存在差异性，也可以再次通过亲和力成熟将两者的差异化加大，从而保证既可以达到对单体的结合，防止单体的聚合，也可以达到和聚合体结合，促进脑内小胶质细胞对于聚合体的吞噬清除。同时，本发明的抗体的亲和力适中，不会产生过高的亲和力，一方面避免了对单体过高亲和力造成外周α-synuclein的持续清除，另一方面也避免了抗体和脑内α-synuclein聚合体持续结合，过分激活脑内巨噬细胞，导致的脑内炎症等副作用。因此，本发明的抗体的适中的亲和力可以保证防止单体的聚合，以及聚合体的适当清除，不至于引起脑内炎症，也可以通过激活清除机制，使得α-synuclein聚合体一方面通过抗体介导清除，一方面通过本身体内UPS和CMA的系统进行清除，最大化地清除α-synuclein聚合体，同时最小化抗体造成的毒副作用。

附图说明

图1为本发明实施例1中非还原SDS-PAGE电泳检测纯化的人、猴和鼠的α-synuclein-连接肽-7his融合蛋白；Marker：蛋白质分子量标记；lane1：人α-synuclein-连接肽-His；lane2:猴α-synuclein-连接肽-His；lane3:鼠α-synuclein-连接肽-His。

图2为本发明实施例3中非还原SDS-PAGE电泳检测纯化的单克隆抗体2A1、2B1和2C1；Marker:蛋白质分子量标记；lane1:2A1纯化抗体；lane2:2B1纯化抗体；lane3:2C1纯化抗体。

图3为本发明实施例4中总RNA电泳检测；M：DL2000分子量标记，lane1-3分别为2A1、2B1和2C1总RNA的电泳条带。

图4为本发明实施例4中PCR扩增2A1、2B1和2C1抗体重链可变区和轻链可变区琼脂糖电泳检测结果；A：PCR扩增候选抗体重链可变区琼脂糖电泳检测结果；M：DL2000分子量标记，lane1-3分别为2A1、2B1、2C1重链可变区条带；B：PCR扩增候选抗体轻链可变区琼脂糖电泳检测结果；M：DL2000分子量标记，lane1-3分别为2A1、2B1、2C1轻链可变区条带。

图5为本发明实施例9中抗体2A1、2B1、2C1抑制人α-synuclein单体聚合的剂效曲线。

图6为本发明实施例10中抗体2A1、2B1、2C1介导的小胶质细胞对人α-synuclein聚合体吞噬的剂效曲线。

具体实施方式

本发明提供了抗α-synuclein单克隆抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的抗α-synuclein单克隆抗体2A1、2B1和2C1的重链恒定区为鼠IgG1，轻链恒定区为鼠κ链的恒定区，其中，抗体2A1的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.43所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.46所示；抗体2B1的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.47所示；抗体2C1的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.45所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.48所示。

本发明提供的抗α-synuclein单克隆抗体2A1、2B1和2C1能够结合人α-synuclein的单体和聚合体，该效果的检测通过ELISA法进行，其结果通过OD₄₅₀值表示，本发明提供抗体与人α-synuclein单体和聚合体结合的OD₄₅₀值不低于0.5。

本发明提供的抗α-synuclein单克隆抗体2A1、2B1和2C1特异性地结合α-synuclein，而不与突触核蛋白家族的β-synuclein和γ-synuclein结合，该效果通过ELISA方法测定，结果通过OD₄₅₀值表示。

本发明提供的抗α-synuclein单克隆抗体2A1、2B1和2C1具有种属交叉性，可以与人、猴、鼠的α-synuclein结合，该效果的检测通过ELISA方法进行，其结果通过OD₄₅₀值表示。

本发明提供的抗α-synuclein单克隆抗体2A1、2B1和2C1与α-synuclein之间的亲和力用KD(平衡解离常数)来表征，本发明提供抗α-synuclein单克隆抗体的KD值不高于30nM。

本发明提供的抗α-synuclein单克隆抗体2A1、2B1和2C1可呈剂量依赖阻断α-synuclein单体的聚合，其阻断效果通过抑制率百分比表示，本发明提供的抗体抑制率不低于50％，其剂效IC₅₀值不高于2.693μg/ml。

本发明提供的抗α-synuclein单克隆抗体2A1、2B1和2C1能够呈剂量依赖性地介导小胶质细胞对α-synuclein聚合体的吞噬作用，该结果以吞噬率百分比表示。本发明提供的抗体介导小胶质细胞对α-synuclein聚合体的吞噬率不低于50％，其剂效IC50值不高于1.97μg/ml。

本发明提供的抗α-synuclein单克隆抗体2A1、2B1和2C1能有效抑制α-synuclein单体向多聚体的聚合；并且对已形成的α-synuclein聚合体，通过抗体介导的作用，促进小胶质细胞对α-synuclein聚合体的吞噬和清除，减轻或减缓α-synuclein聚合体对神经元细胞的毒性作用。因此，本发明提供的α-synuclein单克隆抗体不但能够起到治疗作用，也能够有效地预防α-突触核蛋白病。

本发明所述的α-突触核蛋白病包括但不限于帕金森病(PD，包括特发性帕金森病)，路易体痴呆(DLB)，合并阿尔茨海默病和帕金森病，纯自主神经衰竭和多系统萎缩(MSA)。

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1人、猴、鼠α-synuclein蛋白的制备

1、人、猴、鼠α-synuclein基因合成及表达载体构建

将人源、猴源和鼠源α-synuclein全长蛋白的氨基酸序列分别与连接肽-7his氨基酸序列融合，人、猴、鼠α-synuclein氨基酸序列分别如SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62和SEQID NO.63所示。设计人、猴、鼠α-synuclein全长融合蛋白(α-synuclein-连接肽-7his)对应的编码核苷酸序列，在5’端加上HindIII酶切位点和Kozak序列GCCGCCACC，3’端加上终止密码子TAG和EcoRI酶切位点，并通过PCR扩增α-synuclein融合蛋白的编码DNA，并克隆到pUC57simple载体中，获得人、猴、鼠pUC57simple-α-synuclein-连接肽-7his质粒。

酶切(HindIII和EcoRI)人、猴、鼠的质粒pUC57simple-α-synuclein-连接肽-7his和载体pcDNA3.1，电泳回收得到的融合基因片段α-synuclein-连接肽-7his，并与pcDNA3.1载体进行连接反应重组构建获得人、猴、鼠α-synuclein全长融合蛋白(α-synuclein-连接肽-7his)的表达质粒，具体如下：

pcDNA3.1-人α-synuclein-连接肽-7his；

pcDNA3.1-猴α-synuclein-连接肽-7his；

pcDNA3.1-鼠α-synuclein-连接肽-7his。

2、瞬转表达

对pcDNA3.1-人α-synuclein-连接肽-7his、pcDNA3.1-猴α-synuclein-连接肽-7his和pcDNA3.1-鼠α-synuclein-连接肽-7his进行瞬时表达。

使用FreeStyle^TM 293F细胞在Freestyle培养基中进行瞬转表达。转染前24小时，在125ml锥形瓶中接种6×10⁵细胞/ml的293F细胞，在37℃5％CO₂孵育箱中用摇床培养(120rpm/min)。转染时先取60μl的293fectin加入到1ml的OPtiMEM中，充分混匀后，室温孵育5分钟；同时将重组轻链质粒和重组重链质粒按1:1的比例进行混合，总DNA的量为30μg，溶于1ml的OPtiMEM中。然后将DNA和293fectin充分混合，总体积为2ml，室温孵育15分钟，然后将混合物全部加入细胞培养孔中，混匀，37℃5％CO₂温箱中130rpm摇床培养7天。将培养液进行高速离心、微孔滤膜抽真空过滤。

3、蛋白纯化

根据厂家提供的操作方法采用镍柱(蛋白纯化液相色谱系统/AKTA Purifier 10,GE)进行纯化，得到纯化的人、猴、鼠α-synuclein-连接肽-7his融合蛋白。纯化后的融合蛋白通过SDS-PAGE确定蛋白纯度，如图1所示。

实施例2杂交瘤细胞的制备

1、小鼠免疫

分别以实施例1制备的人α-synuclein-连接肽-7his融合蛋白作为抗原，将抗原与佐剂以体积为1:1的比例混合后，对免疫原人α-synuclein进行乳化。首次免疫使用弗氏完全佐剂乳化抗原，2周后，开始第二次免疫，使用弗氏不完全佐剂乳化抗原，腹腔注射，每只小鼠注射的抗原的量为150μg，每次注射体积为200μL。

在第三次免疫后3天，对小鼠进行眼眶采血，取少量血液样本进行血清效价检测，经间接ELISA方法检测血清效价滴度达到1:210000或者以上后，对小鼠进行加强免疫。

2、准备融合用细胞(骨髓瘤细胞)

提前三周复苏用于融合的骨髓瘤细胞P3X63Ag8.653，并用含1X 8-氮鸟嘌呤和10％胎牛血清的DMEM培养基培养两周，融合一周前换用10％胎牛血清的DMEM培养，维持P3X63Ag8.653的密度为70％-80％至融合当天。

3、细胞融合及HA筛选：

脾细胞的获取和制备：取加强免疫后的小鼠2只，采集免疫血清后拉颈处死并浸泡于75％酒精中2-3分钟。剪开免疫小鼠的腹部侧面的皮肤和腹膜，暴露脾脏。用剪尖剔除周围组织获取脾脏，用研磨棒研磨后，经细胞筛网过滤后制备成单细胞悬液。

细胞融合前处理：收集培养瓶内的P3X63Ag8.653，1000rpm/5min离心后弃上清，重悬后进行活细胞计数。2000rpm/5min离心脾细胞悬液，弃上清后重悬并进行活细胞计数。记录P3X63Ag8.653活细胞数，脾细胞活细胞数。

细胞融合：按脾细胞：P3X63Ag8.653＝2:1的比例混合细胞，2000rpm/5min离心后倒净上清，震散细胞沉淀，在37℃水浴中缓慢滴加1mL预热的50％PEG1500溶液，并使管底在37℃水中划圈摇动，上述操作时间控制在1min左右，静置反应30s，于管内由慢到快地加入37℃预热的DMEM培养基，终止反应。将终止反应后的细胞悬液800rpm离心3min后弃去上清，轻轻震散细胞沉淀。

HAT培养基筛选：配制含1×HAT、1×青-链霉素、15％胎牛血清和85％DMEM培养基的HAT筛选培养基。用上述的HAT筛选培养基重悬鼠杂交瘤细胞和饲养细胞，并混合两者。按300μl/孔将细胞悬液加到20块96孔细胞培养板中，置于37℃细胞培养箱中培养。培养1周后，用HT培养基进行第一次换液，并置于37℃细胞培养箱中培养；培养3天后，用HT培养基进行第二次换液。

4、阳性细胞株的筛选

融合后2周，取细胞上清进行ELISA实验，检测细胞上清与人α-synuclein蛋白单体和聚合体的结合情况，筛选出α-synuclein蛋白单体和聚合体和细胞上清结合均为阳性的细胞后，对双阳性的细胞进行扩大培养和亚克隆。

5、扩大培养

将ELISA单体和聚合体检测均为阳性的细胞株从96孔中转入24孔中培养，待长满后转入25cm²培养瓶中培养。

6、有限稀释法亚克隆

吹打混匀阳性细胞株，并吸取少量进行活细胞计数。吸取约200个细胞加入80ml完全培养基中混匀，铺板4块。另吸取约400个细胞加入80ml完全培养基中混匀，铺板4块。另吸取约1000个细胞加入20mL完全培养基中混匀，铺板1块。共以3个不同的细胞密度铺板9块，分别为0.5细胞/孔,1细胞/孔,10细胞/孔。将96孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

7、克隆检测和扩大培养

取单克隆细胞孔上清进行ELISAα-synuclein单体和聚合体结合检测，分别检测细胞克隆抗体与人α-synuclein单体和聚合体的结合情况。将ELISA检测为双阳性的细胞株从96孔中转入24孔中培养，待长满后转入25cm²培养瓶中培养。

8、亚类的鉴定

包被羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgM和IgGA,50ng/100μl/孔，4℃过夜，3％BSA室温封闭，加入待测细胞上清，室温孵育2小时，加入酶标二抗羊抗鼠IgG、κ、λ，显色，终止，450nm读数。经检测判断所测细胞株的亚类为IgG1，κ。

9、细胞冻存

冻存液配制：90％胎牛血清，10％DMSO。

重悬培养瓶内细胞，细胞计数后，以1000rpm/min离心5min后弃上清，用含10％DMSO的胎牛血清进行吹打悬浮，以1×10⁷细胞/管冻存于冻存盒内，-80℃过夜，次日转入液氮中。

10、单克隆杂交瘤基因保存

收集阳性单克隆细胞株，加入Trizol裂解细胞并提取RNA,反转录成cDNA,于-80℃保存。

实施例3单克隆抗体制备及鉴定

1.采用体外培养法制备抗体

对实施例2制得的杂交瘤细胞株进行复苏，方法为将含有10％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM培养基复苏并使用小瓶培养，待细胞汇合度约90％后，进行传代扩培，扩培至细胞培养上清共约200mL。

2.抗体纯化

收集培养约7天左右的细胞上清，测量体积(约200mL)，加入NaCl使上清中NaCl为2.5M，经0.22μm混合纤维素微孔滤膜真空过滤后，4℃保存，Protein A亲和层析进行抗体纯化。上样：含2.5M NaCl的细胞培养上清经0.22μm虑膜过滤后浓缩至30ml后直接上样；流洗：pH 7.4 2.5M PBS流洗，冲至UV280基线为0；洗脱：pH3.5 0.1M柠檬酸溶液，每段2ml收集洗脱液，每管加入100μl 1M Tris溶液；浓缩收集液，使用PBS洗脱至初始成分比例小于0.1％。SDS-PAGE检测核实纯化抗体纯度，如图2所示。

实施例4单克隆抗体筛选和基因测序

经小鼠免疫、杂交瘤细胞构建及单克隆化后，基于抗体结合实验(ELISA)，家族蛋白(β-synuclein、γ-synuclein)和种属蛋白(人、鼠、猴α-synuclein)交叉实验(ELISA)，以及亲和力测定和抗体抑制α-synuclein单体聚合的实验和抗体介导的BV2小胶质细胞对α-synuclein聚合体的吞噬实验(吞噬率>50％)的筛选结果，最终得到三个细胞学活性较高的单克隆抗体细胞株，分别命名为2A1、2B1和2C1单克隆抗体细胞株，将三个细胞株进行总RNA提取，并反转录成cDNA，然后以cDNA为模板PCR扩增抗体的重链可变区和轻链可变区。

三株单克隆抗体总RNA采用Invitrogen公司的

reagent试剂盒(15596-026)试剂盒按照其说明书进行提取，提取结果见图3。

接着采用Takara公司的5’RACE FULL试剂盒(D315)，以总RNA为模板，试剂盒中的随机引物进行反转录为第一链cDNA，然后重链以恒定区设计引物(mVH-R)和试剂盒中的接头引物进行PCR扩增，轻链以恒定区设计引物(mVL-R)和试剂盒中的接头引物进行PCR扩增。mVH-R和mVL-R的序列如下:

mVH-R：CTCAGGGAARTARCCYTTGAC

mVL-R：TCACTGCCATCAATCTTCCAC

三个单克隆抗体细胞株的重链可变区和轻链可变区PCR扩增后电泳检测如图4。

琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR片段后将样品送至泓讯科技测序。最终确定单克隆抗体2A1、2B1和2C1的重链可变区序列分别如SEQ ID NO.1～3所示，轻链可变区序列分别如SEQ ID NO.4～6；重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.49-51所示，轻链可变区核苷酸序列分别如SEQ ID NO.52-54所示(表2)。

表2单克隆抗体2A1、2B1和2C1的序列

实施例5抗α-synuclein单克隆抗体和人α-synuclein蛋白单体和聚合体的结合实验(ELISA)

用pH7.2的0.01M PBS缓冲液分别稀释人α-synuclein单体蛋白和人α-synuclein聚合体蛋白(ab218819,Abcam)，并以100ng蛋白/100μl/孔包被96孔板，在4℃条件下包被过夜。用250μl/孔PBST(PBS+1‰Tween 20)洗板3次后加入250μl/孔的2％milk-PBS，在37℃条件下封闭2小时。洗板三次后加入候选单克隆抗体细胞培养上清或阴性抗体对照(100μl/孔)，在室温条件下孵育1小时。随后洗板6次，再加入2％milk-PBS稀释10000倍的山羊抗鼠IgG Fc-HRP二抗(100μl/孔)，在室温下孵育1小时。洗板4次后用TMB显色试剂盒显色(100μl/孔)，在室温条件下避光显色5分钟后用2M H₂SO₄(100μl/孔)终止显色。终止显色后立即用酶标仪在波长450nm处测OD值。实验数据如表3所示，所有检测的α-synuclein单克隆抗体均能很好地与人α-synuclein蛋白单体和聚合体结合。

表3 ELISA检测单克隆抗体2A1、2B1和2C1与人α-synuclein单体和聚合体结合

实施例6抗α-synuclein单克隆抗体与人α、β、γ-synuclein蛋白的家族交叉实验(ELISA)

用pH7.2的0.01M PBS缓冲液分别稀释人α-synuclein蛋白(ab218818,Abcam)，人β-synuclein蛋白(ab82630,Abcam)和人γ-synuclein蛋白(ab48712,Abcam)，并以100ng蛋白/100μl/孔包被96孔板，在4℃条件下包被过夜。用250μl/孔PBST(PBS+1‰Tween 20)洗板3次后加入250μl/孔的2％milk-PBS，在37℃条件下封闭2小时。洗板三次后加入候选单克隆纯化抗体或阴性抗体对照(100μl/孔)，在室温条件下孵育1小时。随后洗板6次，再加入2％milk-PBS稀释10000倍的山羊抗鼠IgG Fc-HRP二抗(100μl/孔)，在室温下孵育1小时。洗板4次后用TMB显色试剂盒显色(100μl/孔)，在室温条件下避光显色5分钟后用2M H₂SO₄(100μl/孔)终止显色。终止显色后立即用酶标仪在波长450nm处测OD值。实验数据如表4所示，所有检测的α-synuclein单克隆抗体均能很好地结合人α-synuclein蛋白，但不结合人β-synuclein蛋白和人γ-synuclein蛋白。该实验结果表明所检测的α-synuclein单克隆抗体特异性结合α-synuclein蛋白。

表4 ELISA检测单克隆抗体2A1、2B1和2C1与人α、β、γ-synuclein蛋白的结合

实施例7抗α-synuclein单克隆抗体与人、猴、鼠α-synuclein蛋白的种属交叉实验(ELISA)

用pH7.2的0.01M PBS缓冲液分别稀释人、猴、鼠α-synuclein蛋白，并以100ng蛋白/100μl/孔包被96孔板，在4℃条件下包被过夜。用250μl/孔PBST(PBS+1‰Tween 20)洗板3次后加入250μl/孔的2％milk-PBS，在37℃条件下封闭2小时。洗板三次后加入候选单克隆纯化抗体或阴性抗体对照(100μl/孔)，在室温条件下孵育1小时。随后洗板6次，再加入2％milk-PBS稀释10000倍的山羊抗鼠IgG Fc-HRP二抗(100μl/孔)，在室温下孵育1小时。洗板4次后用TMB显色试剂盒显色(100μl/孔)，在室温条件下避光显色5分钟后用2M H₂SO₄(100μl/孔)终止显色。终止显色后立即用酶标仪在波长450nm处测OD值。实验数据如表5所示，所有检测的α-synuclein单克隆抗体均能很好地与人、猴、鼠α-synuclein蛋白结合。该实验结果表明所检测的α-synuclein单克隆抗体可在猴、鼠体内进行药效药代实验。

表5 ELISA检测单克隆抗体2A1、2B1和2C1与人、猴、鼠α-synuclein蛋白的结合

实施例8抗α-synuclein单克隆抗体与人α-synuclein蛋白单体和聚合体的亲和力测定(Biacore)

使用Biacore T200仪器检测抗α-synuclein单克隆抗体的亲和力常数,通过氨基共价结合将抗小鼠Fc抗体(GE Healthcare公司,BR-1008-38)偶联在CM5生物传感芯片(GEHealthcare公司)上，芯片上的抗小鼠Fc抗体捕获候选单克隆抗体，不同浓度的人α-synuclein蛋白单体或人α-synuclein蛋白聚合体以30μl/min流速流过芯片上的候选单克隆纯化抗体，人α-synuclein蛋白单体或聚合体与候选单克隆纯化抗体进行结合，结合时间为120秒，解离时间为300秒.用BIAevalution软件(GE Healthcare公司)进行动力学拟合，亲和力常数结果见表6，其中2B1与人α-synuclein蛋白单体结合的亲和力最高，2A1与人α-synuclein蛋白聚合体结合的亲和力最高。

表6单克隆抗体2A1、2B1和2C1与人α-synuclein蛋白单体或聚合体结合的亲和力常数

实施例9抗α-synuclein单克隆抗体抑制人α-synuclein单体的聚合实验

为了检测待测抗α-synuclein单克隆抗体是否能够抑制人α-synuclein单体的聚合，从而减少具有神经毒性的α-synuclein聚合体的生成，本实施例利用少量人α-synuclein聚合体作为种子诱导人α-synuclein单体自发聚合，并通过和待测抗α-synuclein单克隆抗体共孵育来抑制聚合体的生成，利用硫黄素T荧光检测法，比较待测抗体组和阴性对照组的荧光强度，并计算待测抗体对α-synuclein单体聚合的抑制率。

硫黄素T(ThT)溶液配制：将3.19mg硫黄素T(ab120751,Abcam)溶解于10ml去离子水中，制成1mM的硫黄素T的水溶液，并用0.2μm的滤膜过滤除菌。

将新鲜配制的终浓度分别为10nM的人α-synuclein聚合体(ab218819,Abcam)、100μM的人α-synuclein单体(ab218818,Abcam)、25μM的硫黄素T及50μg/ml的待测抗体或同型对照抗体(鼠IgG1)或空白对照(PBS缓冲液)混匀于PBS(PH7.4)缓冲液中，以100μl/孔(3复孔)加于96孔酶标板(3603，Corning)，将板密封后置于振荡器上，以600rpm/min的速率在室温孵育24小时。随后在酶标仪(激发光450nm/发射光485nm)上读取荧光值,并通过以下公式计算抗体对α-synuclein单体聚合的抑制率。

抑制率＝[(ThT_blank-ThT_ab)/(ThT_blank-ThT_{isotype control})]*100％

实验结果见表7，其中抗体2A1具有最好的抗聚合作用，其次为2B1和2C1。

表7单克隆抗体2A1、2B1和2C1对人α-synuclein单体聚合的抑制率

抗体名称	抑制率(％)
		2A1	98.78
2B1	93.20
		2C1	86.46
阴性同型对照抗体	1.61
		空白对照	0

为了检测2A1、2B1和2C1是否能够呈剂量依赖抑制人α-synuclein单体的聚合，并进一步比较2A1、2B1和2C1三个抗体的抑制聚合能力，2A1、2B1和2C1抗体的起始终浓度被提高到200μg/ml，并以两倍稀释10个浓度点做剂效曲线，具体实验过程如下：

将新鲜配制的终浓度分别为10nM的人α-synuclein聚合体(ab218819,Abcam)、100μM的人α-synuclein单体(ab218818,Abcam)和25μM的硫黄素T混匀，并分别加入初始浓度为200μg/ml，2倍稀释10个浓度点的待测抗体或同型对照抗体(鼠IgG1)或空白对照(PBS缓冲液)，混匀于PBS(PH7.4)缓冲液中，以100μl/孔(3复孔)加于96孔酶标板(3603，Corning)中。将板密封后置于振荡器上，以600rpm/min的速率在室温孵育24小时。随后在酶标仪(激发光450nm/发射光485nm)上读取荧光值,并通过以下公式计算抗体对α-synuclein单体聚合的抑制率。

抑制率＝[(ThT_blank-ThT_ab)/(ThT_blank-ThT_{isotype control})]*100％

用Prism6软件以抗体浓度为横坐标，以硫黄素T荧光值为纵坐标作剂效曲线，并生成IC50值，结果见表8。其中2A1的IC50值最低，其次为2B1和2C1，表明2A1具有最好的抑制α-synuclein单体聚合的能力，优于2B1和2C1，符合表7中单点检测的实验结果。此外，检测的三个抗体均具有完整的剂效曲线，如图5所示，表明抗体抑制α-synuclein单体聚合的作用具有剂量依赖性，其抗体浓度IC50范围为2.693μg/ml～3.678μg/ml。

表8单克隆抗体2A1、2B1和2C1抑制人α-synuclein单体聚合的IC50值

抗体名称	IC50(μg/ml)
		2A1	2.693
2B1	2.948
		2C1	3.678

实施例10抗α-synuclein单克隆抗体介导小胶质细胞(BV2)对α-synuclein聚合体的吞噬实验

为了检测待测抗α-synuclein单克隆抗体是否能够介导小胶质细胞(BV2)吞噬人α-synuclein聚合体，从而能够加速人α-synuclein聚合体的清除，本实施例通过共孵育BV2小胶质细胞、待测抗体和人α-synuclein聚合体，利用硫黄素T荧光检测法，比较待测抗体组和阴性对照组的荧光强度，并计算待测抗体介导的小胶质细胞对人α-synuclein聚合体的吞噬率。

准备BV2鼠小胶质细胞：复苏BV2细胞并在37℃，5％CO₂条件下于DMEM培养基(DMEM+10％FBS+1％PS)中扩大培养至所需数量，移除培养基，用DPBS清洗细胞两次后加胰酶消化，将细胞在1000rpm离心3分钟，弃上清，加2ml DMEM培养基重悬细胞并计数，计数后将细胞稀释至2x10⁵/ml,取100μl细胞悬液加于96孔酶标板(3606，Corning)中,使每孔中的细胞量达到2x10⁴/100μl(3复孔)，在37℃，5％CO₂培养箱中孵育16小时。

在孵育后的BV2细胞中分别加入终浓度为50μg/ml的待测抗体或阴性对照抗体(鼠IgG1)或空白对照(DMEM培养基)和30μg/ml的α-synuclein聚合体，使其终体积达到200μl。在37℃，5％CO₂培养箱中孵育5小时后，每孔取50μl上清转移至新的96孔酶标板(3606，Corning)，并加入终浓度为25μM硫黄素T混匀，使每孔的终体积达到100μl。将酶标板置于酶标仪(激发光450nm/发射光485nm)中读取荧光值，并通过以下公式计算待测抗体介导的BV2小胶质细胞对α-synuclein聚合体的吞噬率。

吞噬率＝[(ThT_blank-ThT_ab)/(ThT_blank-ThT_{isotype control})]*100％

实验结果见表9，其中抗体2A1介导的BV2小胶质细胞对人α-synuclein聚合体具有最高的吞噬率，其次为2C1和2B1。

表9单克隆抗体2A1、2B1和2C1介导的BV2小胶质细胞对人α-synuclein聚合体的吞噬率

抗体名称	吞噬率(％)
		2A1	89.55
2B1	78.61
		2C1	85.79
阴性同型对照抗体	1.39
		空白对照	0

为了检测抗体介导的BV2小胶质细胞对α-synuclein聚合体的吞噬作用存在剂效关系并进一步比较2A1、2B1和2C1三个抗体介导的小胶质细胞吞噬能力，2A1、2B1和2C1抗体的起始终浓度被提高到200μg/ml,并以两倍稀释10个浓度点做剂效曲线，具体实验过程如下：

BV2小胶质细胞在37℃，5％CO₂条件下于DMEM培养基(DMEM+10％FBS+1％PS)中扩大培养至所需数量，移除培养基，用DPBS清洗细胞两次后加胰酶消化，将细胞在1000rpm离心3分钟，弃上清，加2ml DMEM培养基重悬细胞并计数，计数后将细胞稀释至2x10⁵/ml,取100μl细胞悬液加于96孔酶标板(3606，Corning)中,使每孔中的细胞量达到2x10⁴/100μl(3复孔)，在37℃，5％CO₂培养箱中孵育16小时。

在孵育后的BV2细胞中分别加入起始终浓度为200μg/ml，两倍稀释至10个浓度点的待测抗体或阴性对照抗体(鼠IgG1)或空白对照(DMEM培养基)，每个浓度点均加入终浓度为30μg/ml的α-synuclein聚合体，使每孔的终体积达到200μl。在37℃，5％CO₂培养箱中孵育5小时后，每孔取50μl上清转移至新的96孔酶标板(3606，Corning)，并加入终浓度为25μM硫黄素T混匀，使每孔的终体积达到100μl。将酶标板置于酶标仪(激发光450nm/发射光485nm)中读取荧光值，并通过以下公式计算待测抗体介导的BV2小胶质细胞对α-synuclein聚合体的吞噬率。

吞噬率＝[(ThT_blank-ThT_ab)/(ThT_blank-ThT_{isotype control})]*100％

用Prism6软件以抗体浓度为横坐标，以硫黄素T荧光值为纵坐标作剂效曲线，并生成IC50值，实验结果见表10。其中2A1的IC50值最低，表明2A1介导的小胶质细胞吞噬率最好，其次为2C1和2B1。该实验结果符合表7中的单点检测的吞噬率结果。此外，所检测的3个抗体在介导小胶质细胞吞噬α-synuclein聚合体的作用上呈剂量依赖性，如图6所示，其抗体作用浓度IC50值范围为1.97μg/ml～3.43μg/ml。

表10单克隆抗体2A1、2B1和2C1介导的BV2小胶质细胞对人α-synuclein聚合体的吞噬IC50值

抗体名称	IC50(μg/ml)
		2A1	1.97
2B1	3.43
		2C1	2.59

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 长春工业大学

<120> 抗α-突触核蛋白的单克隆抗体及其应用

<130> KHP191111330.0

<160> 63

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Tyr Gly Met Asn

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ser Tyr Gly Met His

1 5

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Asn Tyr Trp Met Asn

1 5

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Trp Lys Asn Thr Arg Ser Gly Glu Ser Thr Tyr Asp Glu Glu Phe

1 5 10 15

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asn Lys Asn Thr Arg Thr Asn Gly Ser Thr Tyr Asp Gln Glu Phe

1 5 10 15

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Trp Lys Asp Thr Arg Asn Ser Asp Ser Thr Ser Asp Gln Glu Phe

1 5 10 15

<210> 7

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ala Leu Asp Tyr

1

<210> 8

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Trp Leu Asp Tyr

1

<210> 9

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ser Leu Ala Tyr

1

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Asn Ile Gly

1 5 10

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Ile Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Arg Ala Ser Gln Gly Leu Asn Arg Tyr Leu Gly

1 5 10

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

His Gly Thr Asn Leu Glu Asp

1 5

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser

1 5

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Ala Gly Ser Asn Leu Asp Ser

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Val Gln Tyr Thr Gln Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Trp Thr

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Leu Gln Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Thr

1 5

<210> 19

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Leu Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

20 25 30

<210> 20

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Glu Ile Gln Leu Val Gln Pro Gly Pro Glu Leu Lys Lys Leu Gly Glu

1 5 10 15

Thr Met Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Thr Phe Thr

20 25 30

<210> 21

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Glu Ile Gln Val Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Leu Gly Glu

1 5 10 15

Met Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr

20 25

<210> 22

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly

1 5 10

<210> 23

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Lys Trp Met Gly

1 5 10

<210> 24

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Trp Ile Lys Gln Lys Pro Glu Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly

1 5 10

<210> 25

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Ser Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

1 5 10 15

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

20 25 30

Ala Arg

<210> 26

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Lys Asp Arg Phe Ala Phe Ser Val Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr

1 5 10 15

Leu Glu Ile Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

20 25 30

Ala Lys

<210> 27

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Arg Gly Arg Phe Leu Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe

1 5 10 15

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

20 25 30

Gly Arg

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 29

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

Trp Gly Gln Ala Thr Ser Leu Thr Val Ser Ala

1 5 10

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 31

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys

20

<210> 32

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys

20

<210> 33

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys

20

<210> 34

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 35

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 36

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Phe Lys Gly Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 37

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 38

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 39

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ala Asp Tyr Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 40

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

1 5

<210> 41

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 42

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys

1 5 10

<210> 43

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Leu Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Lys Asn Thr Arg Ser Gly Glu Ser Thr Tyr Asp Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Ser Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 44

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

Glu Ile Gln Leu Val Gln Pro Gly Pro Glu Leu Lys Lys Leu Gly Glu

1 5 10 15

Thr Met Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Asn Lys Asn Thr Arg Thr Asn Gly Ser Thr Tyr Asp Gln Glu Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Ala Phe Ser Val Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Ile Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Lys Trp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Ala Thr Ser Leu Thr Val Ser

100 105 110

Ala

<210> 45

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

Glu Ile Gln Val Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Leu Gly Glu

1 5 10 15

Met Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp

20 25 30

Met Asn Trp Ile Lys Gln Lys Pro Glu Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly

35 40 45

Trp Lys Asp Thr Arg Asn Ser Asp Ser Thr Ser Asp Gln Glu Phe Arg

50 55 60

Gly Arg Phe Leu Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe Leu

65 70 75 80

Gln Ile Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gly

85 90 95

Arg Ser Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 46

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Asn

20 25 30

Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu Ile

35 40 45

Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Thr Gln Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

100 105

<210> 47

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Ile Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 48

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Leu Asn Arg Tyr

20 25 30

Leu Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Phe Lys Gly Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Gly Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Thr Ser Phe Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys

100 105

<210> 49

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgaa ctgaagaagc ttggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca gactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120

ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg aaaaacacca ggtctggaga gtcaacatat 180

gatgaagagt tcaagggacg gtttgccttt tcttcggaaa catctgccag cactgcctat 240

ttgcagatca acaacctcaa gagtgaggac acggctacat atttctgtgc aagggctctt 300

gactactggg gccaaggaac cactctcaca gtctcctca 339

<210> 50

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

gagatccagc tggtgcagcc cggccccgag ctgaagaagc tgggcgagac catgaagatg 60

agctgcaagg ccagcggcca caccttcacc agctacggca tgcactgggt gaagcagagc 120

cacggcaaga acctgaagtg gatgggcaac aagaacacca ggaccaacgg cagcacctac 180

gaccaggagt tcaaggacag gttcgccttc agcgtggaga ccagcgccac caccgcctac 240

ctggagatca acaacctgaa gagcgaggac accgccacct acttctgcgc caagtggctg 300

gactactggg gccaggccac cagcctgacc gtgagcgcc 339

<210> 51

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

gagatccagg tggtgcagag cggcgccgag ctgaagaagc tgggcgagac catgaggatc 60

agctgcaagg ccagcggcta cagcttcacc aactactgga tgaactggat caagcagaag 120

cccgagaagg gcctgaagtg gatgggctgg aaggacacca ggaacagcga cagcaccagc 180

gaccaggagt tcaggggcag gttcctgttc agcctggaga ccagcgccag caccgccttc 240

ctgcagatca acaacctgaa gagcgaggac accgccacct acttctgcgg caggagcctg 300

gcctactggg gccagggcac caccctgacc gtgagcagc 339

<210> 52

<211> 315

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

gacatcctga tgacccaatc tccatcctcc atgtctgtat ctctgggaga cacagtcagc 60

atcacttgcc atgcaagtca gggcattagc aggaatatag ggtggttgca gcagaaacca 120

gggaaatcat ttaagggcct gatttatcat ggaaccaact tggaagatgg agttccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tggagcagat tattctctca ccatcagcag cctggaatct 240

gaagattttg cagactatta ctgtgtacag tatactcagt ttccgctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggag 315

<210> 53

<211> 315

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctctgggaga aagagtcagt 60

ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt atttacttaa gctggtttca gcagaaacca 120

gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc gcatccactt tagattctgg tgtcccgaaa 180

aggttcagtg gcagtaggtc tgggtcagat tattctctca ccatcagcag ccttgagtct 240

gaagattttg cagactatta ctgtctacaa tatgctagtt atccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaa 315

<210> 54

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

gacatcctga tgacccagac ccccagcagc atgagcgtga gcctgggcga cagggtgagc 60

atcacctgca gggccagcca gggcctgaac aggtacctgg gctggctgca gcagaagccc 120

ggcaagacct tcaagggcct gatctacgcc ggcagcaacc tggacagcgg cgtgcccagc 180

aggttcagcg gcagcaggag cggcgccgac tacagcctga ccatcagcag cctggagagc 240

gaggacttcg ccgactacta ctgcctgcag tacaccagct tcccctggac cttcggcgcc 300

ggcaccaagc tggagatgaa g 321

<210> 55

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

tgaggagact gtgagagtgg ttccttggcc ccagtagtca agagcccttg cacagaaata 60

tgtagccgtg tcctcactct tgaggttgtt gatctgcaaa taggcagtgc tggcagatgt 120

ttccgaagaa aaggcaaacc gtcccttgaa ctcttcatca tatgttgact ctccagacct 180

ggtgtttttc cagcccatcc actttaaacc ctttcctgga gcctgcttca cccagttcat 240

tccatagtct gtgaaggtat acccagaagc cttgcaggag atcttgactg tctctccaag 300

cttcttcagt tcaggtccag actgcaccaa ctggatctg 339

<210> 56

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

ggcgctcacg gtcaggctgg tggcctggcc ccagtagtcc agccacttgg cgcagaagta 60

ggtggcggtg tcctcgctct tcaggttgtt gatctccagg taggcggtgg tggcgctggt 120

ctccacgctg aaggcgaacc tgtccttgaa ctcctggtcg taggtgctgc cgttggtcct 180

ggtgttcttg ttgcccatcc acttcaggtt cttgccgtgg ctctgcttca cccagtgcat 240

gccgtagctg gtgaaggtgt ggccgctggc cttgcagctc atcttcatgg tctcgcccag 300

cttcttcagc tcggggccgg gctgcaccag ctggatctc 339

<210> 57

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

gctgctcacg gtcagggtgg tgccctggcc ccagtaggcc aggctcctgc cgcagaagta 60

ggtggcggtg tcctcgctct tcaggttgtt gatctgcagg aaggcggtgc tggcgctggt 120

ctccaggctg aacaggaacc tgcccctgaa ctcctggtcg ctggtgctgt cgctgttcct 180

ggtgtccttc cagcccatcc acttcaggcc cttctcgggc ttctgcttga tccagttcat 240

ccagtagttg gtgaagctgt agccgctggc cttgcagctg atcctcatgg tctcgcccag 300

cttcttcagc tcggcgccgc tctgcaccac ctggatctc 339

<210> 58

<211> 315

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

ctccagcttg gtcccagcac cgaacgtgag cggaaactga gtatactgta cacagtaata 60

gtctgcaaaa tcttcagatt ccaggctgct gatggtgaga gaataatctg ctccagatcc 120

actgccactg aaccttgatg gaactccatc ttccaagttg gttccatgat aaatcaggcc 180

cttaaatgat ttccctggtt tctgctgcaa ccaccctata ttcctgctaa tgccctgact 240

tgcatggcaa gtgatgctga ctgtgtctcc cagagataca gacatggagg atggagattg 300

ggtcatcagg atgtc 315

<210> 59

<211> 315

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

ttccagcttg gtgcctccac cgaacgtcca cggataacta gcatattgta gacagtaata 60

gtctgcaaaa tcttcagact caaggctgct gatggtgaga gaataatctg acccagacct 120

actgccactg aaccttttcg ggacaccaga atctaaagtg gatgcggcgt agatcaggcg 180

tttaatagtt ccatctggtt tctgctgaaa ccagcttaag taaatactaa tttcctgact 240

tgcccgacaa gtgagactga ctctttctcc cagagaggca gataaggagg atggagactg 300

ggtcatctgg atgtc 315

<210> 60

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

cttcatctcc agcttggtgc cggcgccgaa ggtccagggg aagctggtgt actgcaggca 60

gtagtagtcg gcgaagtcct cgctctccag gctgctgatg gtcaggctgt agtcggcgcc 120

gctcctgctg ccgctgaacc tgctgggcac gccgctgtcc aggttgctgc cggcgtagat 180

caggcccttg aaggtcttgc cgggcttctg ctgcagccag cccaggtacc tgttcaggcc 240

ctggctggcc ctgcaggtga tgctcaccct gtcgcccagg ctcacgctca tgctgctggg 300

ggtctgggtc atcaggatgt c 321

<210> 61

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys

20 25 30

Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val

35 40 45

Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr

50 55 60

Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys

65 70 75 80

Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys

85 90 95

Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile

100 105 110

Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro

115 120 125

Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala

130 135 140

<210> 62

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys

20 25 30

Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val

35 40 45

Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr

50 55 60

Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys

65 70 75 80

Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Ile Lys

85 90 95

Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile

100 105 110

Leu Gln Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro

115 120 125

Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala

130 135 140

<210> 63

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys

20 25 30

Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val

35 40 45

Val His Gly Val Thr Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr

50 55 60

Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys

65 70 75 80

Thr Val Glu Gly Ala Gly Asn Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys

85 90 95

Lys Asp Gln Met Gly Lys Gly Glu Glu Gly Tyr Pro Gln Glu Gly Ile

100 105 110

Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Gly Ser Glu Ala Tyr Glu Met Pro

115 120 125

Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala

130 135 140

Claims

1.抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其片段能够特异性地结合α-突触核蛋白单体以及α-突触核蛋白聚合体；所述单克隆抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区，

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.43所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.46所示；

或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.47所示；

或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.45所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.48所示。

2.根据权利要求1所述的抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述单克隆抗体为IgG1型。

3.编码权利要求1或2所述的抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段的核酸。

4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，编码所述抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段的重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.49所示，编码所述抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段的轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.52所示；

或者，编码所述抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段的重链可变区的核酸序列如SEQ IDNO.50所示，编码所述抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段的轻链可变区的核酸序列如SEQ IDNO.53所示；

或者，编码所述抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段的重链可变区的核酸序列如SEQ IDNO.51所示，编码所述抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段的轻链可变区的核酸序列如SEQ IDNO.54所示。

5.含有权利要求3或4所述核酸的生物材料，其特征在于，所述生物材料为表达盒、载体、转座子或宿主细胞。

6.一种复合物或偶联物，其特征在于，包含权利要求1或2所述的单克隆抗体或其片段或由权利要求1或2所述的单克隆抗体或其片段制备得到。

7.根据权利要求6所述的复合物或偶联物，其特征在于，所述复合物为权利要求1或2所述的单克隆抗体或其片段经化学标记或生物标记得到；

所述偶联物为权利要求1或2所述的单克隆抗体或其片段或所述复合物与固体或半固体介质偶联得到。

8.权利要求1或2所述的抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段或权利要求3或4所述的核酸或权利要求5所述的生物材料或权利要求6或7所述的复合物或偶联物的如下任一应用：

(1)在制备用于预防或治疗α-突触核蛋白病的药物中的应用；

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述α-突触核蛋白病包括帕金森病、路易体痴呆、合并阿尔茨海默病和帕金森病、纯自主神经衰竭、多系统萎缩。

10.一种药物，其特征在于，包含权利要求1或2所述的单克隆抗体或其片段或由权利要求1或2所述的单克隆抗体或其片段制备得到；

所述药物具有如下任一功能：

(1)用于预防或治疗α-突触核蛋白病；

(4)用于减少α-突触核蛋白聚合体、原纤维、纤维体，路易小体的积累；

11.根据权利要求10所述的药物，其特征在于，所述α-突触核蛋白病包括帕金森病、路易体痴呆、合并阿尔茨海默病和帕金森病、纯自主神经衰竭、多系统萎缩。

12.一种用于检测α-突触核蛋白单体或其聚合体的检测试剂或试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的单克隆抗体或其片段、或者包含权利要求6或7所述的复合物或偶联物。