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CN110157675B - 一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种靶向性T淋巴细胞，包括靶向CD19的嵌合抗原受体CAR‑CD19和/或靶向BCMA的嵌合抗原受体CAR‑BCMA，对肿瘤细胞的靶向识别性广且强，可避免肿瘤细胞出现靶点逃逸，高效且特异性地杀伤肿瘤细胞，扩大了其广谱杀伤性。本发明还提供了该靶向性T淋巴细胞的制备方法和应用。

Description

一种靶向性T淋巴细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种靶向性T淋巴细胞及其制备方法和应用。
背景技术
白血病是造血系统的一种恶性疾病，在我国各年龄组恶性肿瘤的死亡率中较高。CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)技术是一种新型免疫细胞疗法，它是将经过CAR改造的T细胞回输至人体，激活自身免疫系统，对肿瘤细胞进行杀伤，以达到清除恶性肿瘤细胞的目的。
虽然CAR-T技术在血液瘤等的治疗上取得了显著的疗效，但是在复杂的肿瘤微环境中(例如多种肿瘤抗原同时出现)，其对肿瘤细胞的识别、杀伤能力大大降低，限制了其临床应用。举例来说，对于淋巴细胞白血病，大多数患者的肿瘤细胞都表达CD19，但也存在不表达CD19的情况(即CD19阴性逃逸)。因此，有必要提供对恶性肿瘤靶向性较强的T淋巴细胞。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种靶向性T淋巴细胞及其制备方法和应用。该T淋巴细胞可靶向至B细胞恶性肿瘤(如淋巴细胞白血病)的两个肿瘤靶点，对肿瘤细胞的靶向性高、识别性较广且强，可避免肿瘤细胞出现靶点逃逸，扩大了该T细胞的广谱杀伤性。
第一方面，本发明提供了一种靶向性T淋巴细胞，包括靶向CD19的嵌合抗原受体CAR-CD19和/或靶向BCMA的嵌合抗原受体CAR-BCMA，其中，所述CAR-CD19包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向CD19的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-BCMA包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向BCMA的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；其中，所述靶向CD19的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列，所述靶向BCMA的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
优选地，所述靶向性T淋巴细胞，可以为带CAR-CD19和CAR-BCMA的双靶点嵌合抗原受体T细胞(即，靶向CD19和BCMA的双靶点嵌合抗原受体T细胞)，也可以为带CAR-CD19的嵌合抗原受体T细胞和带CAR-BCMA的嵌合抗原受体T细胞的混合，还可以为带所述CAR-CD19和所述CAR-BCMA的双靶点嵌合抗原受体T细胞、带所述CAR-CD19的嵌合抗原受体T细胞，以及带所述CAR-BCMA的嵌合抗原受体T细胞的混合。
此时，所述靶向性T淋巴细胞，既可以识别表面表达有CD19抗原蛋白的肿瘤细胞，也可以识别表面表达有BCMA抗原蛋白的肿瘤细胞，当然对同时有CD19抗原蛋白和BCMA抗原蛋白的肿瘤细胞的识别性也较好，能够有效避免肿瘤细胞出现CD19免疫逃逸的发生。
其中，当所述靶向性T淋巴细胞为带CAR-CD19和CAR-BCMA的双靶点CAR-T时，嵌合抗原受体CAR-CD19和CAR-BCMA的分布位置不作限定，可以是交替分布(例如ABAB…，AABABB…)或依次分布(例如AAAA…BBB…)，但两者之间并无共价连接，此时它们相应的CD19单链抗体和BCMA单链抗体之间也并无共价连接，这样可使它们保持较好的识别能力。
上述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向CD19的单链抗体或所述靶向BCMA的单链抗体的氨基酸序列的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，所述胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区的氨基酸序列的氨基端相连。
上述提及的CD19是血液系统中B细胞系标志物，通过与B细胞上的B细胞受体的结合参与B细胞发育、细胞内信号传导等过程。CD19是B系恶性肿瘤(例如淋巴细胞白血病)较常用的靶点，但也有不少恶性B细胞中并不表达CD19。而BCMA是肿瘤坏死因子受体TNF超家族的成员，是一种较重要的B细胞生物标志物，在绝大多数正常细胞及器官中都不表达，广泛存在于多发性骨髓瘤(MM)细胞及血液系统B系恶性肿瘤表面。因此，选用BCMA作为对CD19阴性逃逸或CD19抗原丢失的B系恶性肿瘤细胞的靶标，能避免肿瘤细胞出现CD19逃逸。
可选地，所述靶向CD19的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述靶向BCMA的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。本发明所述靶向CD19的单链抗体保留有对CD19抗原的亲和活性，能够高效识别表面表达有CD19抗原的肿瘤细胞。类似地，所述靶向BCMA的单链抗体也保留有对BCMA抗原的亲和活性，能够高效识别表面表达有BCMA抗原的肿瘤细胞。
可选地，所述靶向CD19的单链抗体的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:3具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:1。所述靶向BCMA的单链抗体的氨基酸序列的编码基因同样应该考虑简并碱基。
本发明中，所述CAR-CD19中的胞外铰链区用于促进所述靶向CD19的单链抗体与肿瘤细胞上的CD19结合；类似地，所述CAR-BCMA中的胞外铰链区用于促进所述靶向BCMA的单链抗体与肿瘤细胞上的BCMA结合。
可选地，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、CD5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。
进一步可选地，所述胞外铰链区为CD8α铰链区。
可选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
可选地，所述CD8α铰链区的编码基因包括如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。
可选地，所述CD8α铰链区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:10具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:9。
本发明中，所述CAR-CD19中的跨膜区用于固定所述靶向CD19的嵌合抗原受体CAR-CD19；类似地，所述CAR-BCMA中的跨膜区用于固定所述靶向BCMA的嵌合抗原受体CAR-BCMA。
可选地，所述跨膜区包括CD3跨膜区、CD4跨膜区、CD8跨膜区、CD28跨膜区中的一种或多种的组合。
进一步可选地，所述跨膜区为CD8跨膜区。
可选地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。
可选地，所述CD8跨膜区的编码基因包括如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。
可选地，所述CD8跨膜区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:12具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:11。
本发明中，所述胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路。
可选地，所述胞内信号区包括4-1BB信号区、CD3ζ信号区、ICOS信号区、CD27信号区、OX40信号区、CD28信号区、IL1R1信号区、CD70信号区、TNFRSF19L信号区中的一种或多种的组合。
在本发明一实施方式中，所述胞内信号区为从氨基端到羧基端顺次连接的4-1BB信号区和CD3ζ信号区。相应地，所述胞内信号区的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接的4-1BB信号区的编码基因和CD3ζ信号区的编码基因。
在本发明另一实施方式中，所述胞内信号区还可以为从氨基端到羧基端顺次连接的CD27信号区和CD3ζ信号区。
可选地，所述4-1BB信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。
可选地，所述4-1BB信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列。
可选地，所述4-1BB信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:14具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:13。
可选地，所述CD3ζ信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。
可选地，所述CD3ζ信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列。
可选地，所述CD3ζ信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:16具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:15。
需要说明的是，本发明中，所述CAR-CD19中的胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，与所述CAR-BCMA中对应的胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区对应的氨基酸序列可以相同，也可以不同。
在本发明一实施方式中，所述CAR-CD19的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。
可选地，所述CAR-CD19的编码基因包括如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列。
可选地，所述CAR-CD19的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:17具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:5。
在本发明一实施方式中，所述CAR-BCMA的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
可选地，所述CAR-BCMA的编码基因包括如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列。
可选地，所述CAR-BCMA的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:18具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:6。
本发明第一方面提供的靶向性T淋巴细胞，包括靶向CD19的嵌合抗原受体CAR-CD19和/或靶向BCMA的嵌合抗原受体CAR-BCMA，能识别两个肿瘤靶点，增强了对肿瘤细胞的识别，避免肿瘤细胞逃逸。当CAR-CD19和/或CAR-BCMA与肿瘤细胞上相应的抗原蛋白结合后，所述靶向性T淋巴细胞的胞内信号区被激活，促进T细胞在患者体内的扩增，并高效且特异性地杀伤肿瘤细胞，尤其是表达CD19和/或BCMA的肿瘤细胞，扩大了该T细胞的广谱杀伤性。此外由于所述CD19和BCMA的单链抗体为人源化单链抗体，这使得该靶向性T细胞避免引起人机体的免疫反应，具有持久的在体维持能力，如活性和杀伤力。
本发明所述靶向性T淋巴细胞可以高效识别并杀伤表达有CD19和/或BCMA的肿瘤细胞，尤其是恶性B淋巴细胞，例如淋巴细胞白血病细胞。
第二方面，本发明提供了一种重组病毒载体，包括如第一方面所述的靶向性T淋巴细胞中所述CAR-CD19和/或CAR-BCMA的编码基因。
可选地，当所述重组病毒载体含有CAR-CD19的编码基因和CAR-BCMA的编码基因时，在所述重组病毒载体上所述CAR-CD19的编码基因和所述CAR-BCMA的编码基因之间，还包括一特殊序列，该特殊序列用于使所述CAR-CD19编码基因和所述CAR-BCMA的编码基因在转录翻译后可以得到两个独立的蛋白CAR-CD19和CAR-BCMA。在采用这样的重组病毒载体转染CD3阳性T淋巴细胞后，所得的靶向性T淋巴细胞为带CAR-CD19和CAR-BCMA的双靶点嵌合抗原受体T细胞。进一步可选地，所述特殊序列可以是RBS序列、IRES序列、T2A序列或其他蛋白酶序列等。
可选地，所述重组病毒载体带有所述CAR-CD19的编码基因，或者带有所述CAR-BCMA的编码基因。优选采用CAR-CD19编码基因的重组病毒载体与带CAR-BCMA编码基因的重组病毒载体分开或同时地共同感染T淋巴细胞，可得到如本发明第一方面所述的靶向性T淋巴细胞，且感染效率较高，所得靶向性T淋巴细胞能较充分地表达CAR-CD19和/或CAR-BCMA。
可选地，所述CAR-CD19的编码基因包括如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列。
优选地，所述CAR-CD19的编码基因包括如SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列。如SEQID NO：19所示的核苷酸序列与如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列相比，多了下文所述的连接肽的编码基因。所述信号肽的编码基因可以较好地指导所述嵌合抗原受体CAR-CD19表达到细胞表面。
可选地，所述CAR-BCMA的编码基因包括如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列。
优选地，所述CAR-BCMA的编码基因包括如SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列。如SEQID NO：20所示的核苷酸序列与如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列相比，多了下文所述的连接肽的编码基因。所述信号肽的编码基因可以较好地指导所述嵌合抗原受体CAR-BCMA达到细胞表面。
可选地，所述重组病毒载体中的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。进一步可选地，所述病毒载体为慢病毒载体。在本发明第四方面提供的制备方法的步骤(1)-(3)示出了所述重组病毒载体的制备过程。
本发明第二方面提供的所述重组病毒载体，具有较高的感染效率以及转录效率，其中的CAR-CD19和/或CAR-BCMA的编码基因片段能通过基因重组插入宿主基因组，得到上述靶向性T淋巴细胞，使其持续、稳定地发挥靶向、杀伤效力。
第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如第二方面所述的重组慢病毒载体。
本发明第三方面提供的所述宿主细胞用于组装如第二方面所述的重组病毒载体，使其具有感染性。
可选地，所述宿主细胞包括但不限于HEK293T细胞、293细胞、293T细胞、293FT细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、COS1细胞和COS7细胞。
第四方面，本发明提供了一种靶向性T淋巴细胞的制备方法，包括：
(1)分别提供靶向CD19的嵌合抗原受体CAR-CD19的编码基因和靶向BCMA的嵌合抗原受体CAR-BCMA的编码基因；
所述CAR-CD19的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向CD19的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；所述CAR-BCMA的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向BCMA的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；
其中，所述靶向CD19的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列，所述靶向BCMA的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；
(2)将所述CAR-CD19的编码基因和所述CAR-BCMA的编码基因分别插入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-CD19重组质粒和pWPXLD-CAR-BCMA重组质粒；
(3)分别对所述pWPXLD-CAR-CD19重组质粒和所述pWPXLD-CAR-BCMA重组质粒进行包装，得到带CAR-CD19编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-BCMA编码基因的第二重组慢病毒；
(4)将所述第一重组慢病毒与所述第二重组慢病毒分开或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，经分离获得靶向性T淋巴细胞。
以CAR-CD19的编码基因为例，上述“从5’端到3’端顺次连接”具体为：所述信号肽的编码基因序列的3’端与所述靶向CD19的单链抗体的编码基因的5’端相连，所述靶向CD19的单链抗体的编码基因的3’端与所述胞外铰链区编码基因的5’端相连，所述胞外铰链区的编码基因的3’端与所述跨膜区的编码基因的5’端相连，所述跨膜区的编码基因的3’端与所述胞内信号区的编码基因的5’端相连。
本发明中，所述信号肽用于指导所述嵌合抗原受体CAR-CD19或CAR-BCMA表达到细胞表面，所述信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。而CAR-CD19的编码基因中信号肽与所述CAR-BCMA的编码基因中信号肽的氨基酸序列可以相同，也可以不同，也可以是它们的信号肽的氨基酸序列相同，而核苷酸序列不同。
可选地，所述信号肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列。
可选地，所述信号肽的编码基因包括如SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列。
可选地，所述信号肽的编码基因包括如SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列。
可选地，所述信号肽的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:22或如SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:21。
对于所述胞外铰链区、跨膜区、胞内信号区的具体选择及相应的编码基因序列，可参见本发明第一方面所述，这里不再赘述。
可选地，所述CAR-CD19的编码基因包括如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列。
可选地，所述CAR-CD19的编码基因包括如SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列。当然，所述CAR-CD19的编码基因也可包括与SEQ ID NO：19所示序列具有碱基简并性质的核苷酸序列。
可选地，所述CAR-BCMA的编码基因包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列。
可选地，所述CAR-BCMA的编码基因包括如SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列。当然，所述CAR-BCMA的编码基因也可包括与SEQ ID NO：20所示序列具有碱基简并性质的核苷酸序列。
以CAR-CD19为例，SEQ ID NO：19与SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列相比，多了连接肽的编码基因，但在嵌合抗原受体CAR-CD19表达到T细胞表面时，信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。因此，在翻译成的嵌合抗原受体CAR-CD19的氨基酸序列(SEQ IDNO：5)中并未带有如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列。CAR-BCMA的情况与之类似。
以CAR-CD19为例，所述CAR-CD19的编码基因序列插入到pWPXLD载体中BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pWPXLD载体的延伸因子1α(EF1α)之后，以EF1α为启动子。所述CAR-CD19的编码基因序列插入到pWPXLD载体时，所述CAR-CD19的基因序列的5’端还可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamH1酶切位点相连，3’端还可加入终止密码子与pWPXLD载体中EcoR1酶切位点相连。CAR-BCMA的情况与之相同。
可选地，步骤(3)中，所述“分别对所述pWPXLD-CAR-CD19重组质粒和所述pWPXLD-CAR-BCMA重组质粒进行包装，得到带CAR-CD19编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-BCMA编码基因的第二重组慢病毒”，包括：
将所述pWPXLD-CAR-CD19重组质粒与包膜质粒和包装质粒共转染宿主细胞，得到所述第一重组慢病毒；将所述pWPXLD-CAR-BCMA重组质粒与包膜质粒和包装质粒共转染宿主细胞，得到所述第二重组慢病毒。
采用本发明所述的方法制备重组质粒及包装病毒，其中，所述pWPXLD-CAR-CD19重组质粒和pWPXLD-CAR-CD22重组质粒上，CAR-CD19的编码基因和所述CAR-BCMA的编码基因经过了密码子优化，且分子量适宜，重组慢病毒的包装效率高，同时通过宿主细胞制得的病毒的浓度较高。相应地，采用第一重组慢病毒和第二重组慢病毒来联合转染CD3阳性T淋巴细胞时，这两种重组慢病毒的用量较低，可降低实验成本。
本发明一实施方式中，所述包膜质粒为PMD2G，所述包装质粒为psPAX2，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
所述包膜质粒PMD2G编码水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳，所述水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳可以协助重组慢病毒向细胞膜粘附，并保持重组慢病毒的感染性。
本发明所述重组慢病毒可以进一步含有来自其它病毒的被膜蛋白。例如，作为这种蛋白质，最好是来自感染人类细胞的病毒被膜蛋白。对这种蛋白质没有特别的限定，可例举出逆转录病毒的兼嗜性病毒手皮膜蛋白等，例如可以使用来自小鼠白血病病毒(MuMLV)4070A株的被膜蛋白。另外，也可以使用来自MuMLV 10Al的被膜蛋白。另外，作为疱疹病毒科的蛋白，可以举出例如，单纯性疱疹病毒的gB、gD、gH、gp85蛋白，EB病毒的gp350、gp220蛋白等。作为嗜肝病毒科的蛋白，可以例举出B型肝炎病毒的S蛋白等。所述被膜蛋白还可为麻疹病毒糖蛋白与其他单链抗体融合后形成。
重组慢病毒的包装通常采用瞬时转染或采用细胞系包装。瞬时转染时可以用作包装细胞使用的人类细胞株，例如包括293细胞、293T细胞、293FT细胞、293LTV细胞、293EBNA细胞及其他的从293细胞分离的克隆；SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞、HeLa细胞、HT1080细胞、TE671细胞等。也可以采用来源于猴子的细胞株，例如，COS1细胞、COS7细胞、CV-1细胞、BMT10细胞等。而且，通常采用的磷酸钙和PEI转染试剂，还有一些转染试剂如Lipofectamine2000、FuGENE和S93fectin也被经常使用。
重组慢病毒的包装也采用一些慢病毒包装细胞系，如使用最普遍的Env糖蛋白、VSVG蛋白或HIV-1gag-pol蛋白所产生的稳定细胞系。
为了安全起见，大规模使用的慢病毒载体系统都是采用分割基因组的方法，即将起不同辅助功能的基因定位于不同的质粒。目前有四质粒系统(编码gag-pol基因、Rev基因、VSVG基因、SIN转移基因分别位于四个不同的质粒)、三质粒系统(去掉了编码Rev基因的质粒，在gag-pol质粒中gag-pol基因采用了在人细胞中偏爱性的密码子)和二质粒系统(慢病毒载体包装所必需的辅助基因位于同一个质粒上，这些辅助基因是单一的基因序列；另一个则是转基因质粒)。也有超过四质粒系统的慢病毒包装系统在使用。
可选地，步骤(4)中，所述CD3阳性T淋巴细胞是从人源外周血单个核细胞中分离获得。所述人源外周血单个核细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。进一步可选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
具体地，所述CD3阳性T淋巴细胞的获得过程如下：先将外周血单个核细胞按一定比例加入CD3/CD28免疫磁珠，并孵育一段时间后，放入磁铁进行筛选，得到免疫磁珠包被的CD3阳性T淋巴细胞，去除磁珠后，获得CD3阳性T淋巴细胞。
其中，步骤(4)中，将所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒分开或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，包括：
先采用所述第一重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞后，再采用所述第二重组慢病毒进行转染；或先采用所述第二重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞后，再采用所述第一重组慢病毒进行转染；或采用所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒同时地转染CD3阳性T淋巴细胞。这里“联合转染”是指针对同一组细胞进行。
进一步地，步骤(4)中，所采用的第一重组慢病毒与第一重组慢病毒的病毒滴度之比是1：(0.5-2)。
本发明中，制备得到的所述靶向性T淋巴细胞包括带所述CAR-CD19和所述CAR-BCMA的双靶点嵌合抗原受体T细胞、带所述CAR-CD19的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-BCMA的嵌合抗原受体T细胞中的至少一种。可选地，带所述CAR-CD19和所述CAR-BCMA的双靶点嵌合抗原受体T细胞，或者为带所述CAR-CD19的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-BCMA的嵌合抗原受体T细胞的混合，或者为带所述CAR-CD19的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-BCMA的嵌合抗原受体T细胞的一种或两种与所述双靶点嵌合抗原受体T细胞的混合。
优选地，所述靶向性T淋巴细胞为带所述CAR-CD19和所述CAR-BCMA的双靶点嵌合抗原受体T细胞，或者为带所述CAR-CD19的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-BCMA的嵌合抗原受体T细胞的混合，或者为带所述CAR-CD19和所述CAR-BCMA的双靶点嵌合抗原受体T细胞、带所述CAR-CD19的嵌合抗原受体T细胞，以及带所述CAR-BCMA的嵌合抗原受体T细胞这三种的混合。
此时，靶向性T淋巴细胞的表面具有两个独立的、未共价结合的嵌合抗原受体(也即是有两个独立的单链抗体)，不影响它们对各自靶标的识别、结合，能同时、高效地识别肿瘤细胞上的CD19和BCMA靶标。所述靶向性T淋巴细胞对表达CD19和BCMA中一种或两种的肿瘤细胞均能识别和杀伤，可避免肿瘤细胞出现靶点逃逸，提高了其靶向识别的广度和强度，以及杀伤广谱性，在复杂的肿瘤微环境下也具有较强的肿瘤杀伤能力。
在本发明另一实施方式中，当所需靶向性T淋巴细胞为带所述CAR-CD19的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-BCMA的嵌合抗原受体T细胞的混合时，也可以采用以下方式制得：采用上述第一重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，得到带所述CAR-CD19的嵌合抗原受体T细胞；采用上述第二重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，得到带所述CAR-BCMA的嵌合抗原受体T细胞；然后将这两种嵌合抗原受体T细胞进行混合。这样也可用于B系恶性肿瘤的诊断和/治疗。
本发明第四方面提供的靶向性T淋巴细胞的制备方法中，采用带CAR-CD19编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-BCMA编码基因的第二重组慢病毒分别或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，可使得制得的靶向性T淋巴细胞上嵌合抗原受体CAR-CD19和/或CAR-BCMA的表达效率更高，以具有较好的肿瘤识别、杀伤能力。
第五方面，本发明提供了一种如本发明第一方面所述的靶向性T淋巴细胞、如本发明第二方面所述的重组病毒载体、如本发明第三方面所述的宿主细胞或如本发明第四方面所述的制备方法制得的靶向性T淋巴细胞在制备诊断和/或治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
特别地，适用于表达CD19和/或BCMA的恶性肿瘤，尤其是恶性B淋巴细胞相关的肿瘤，例如B淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤等的诊断和治疗。
所述应用可以具体为：提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的靶向性T淋巴细胞或采用如第二方面所述的重组病毒载体转染得到的靶向性T淋巴细胞或采用如第四方面所述的制备方法所制得的靶向性T淋巴细胞，如本发明第二方面所述的重组病毒载体、如本发明第四方面所述的宿主细胞中的一种或多种。
本发明的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本发明实施例的实施而获知。
附图说明
图1为本发明实施例提供的pWPXLd-CAR-CD19重组质粒的质粒图谱。
图2为本发明实施例提供的pWPXLd-CAR-BCMA重组质粒的质粒图谱。
图3为本发明实施例提供的靶向性T淋巴细胞的体外肿瘤细胞杀伤效果图。
图4为本发明实施例提供的靶向性T淋巴细胞治疗肿瘤小鼠的效果图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例一一种靶向性T淋巴细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备靶向CD19的嵌合抗原受体CAR-CD19的基因序列
分别制备信号肽、靶向CD19的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因，所述CAR-CD19中，信号肽的编码基因如SEQ ID NO：22所示，靶向CD19的单链抗体的编码基因如SEQ ID NO：3所示，CD8α铰链区的编码基因如SEQ ID NO：10所示，所述CD8跨膜区的编码基因如SEQ ID NO：12所示，所述4-1BB信号区的编码基因如SEQID NO：14所示，所述CD3ζ信号区的编码基因如SEQ ID NO：16所示。
通过PCR的方法将上述信号肽、靶向CD19的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起，得到CAR-CD19的编码基因，该CAR-CD19的编码基因如SEQ ID NO：19所示。
(2)制备靶向BCMA的嵌合抗原受体CAR-BCMA的基因序列
分别制备信号肽、靶向BCMA的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因，所述CAR-BCMA所用的信号肽的编码基因如SEQ ID NO：23所示，靶向BCMA的单链抗体的编码基因如SEQ ID NO：4所示，CD8α铰链区的编码基因如SEQ ID NO：10所示，CD8跨膜区的编码基因如SEQ ID NO：12所示，所述4-1BB信号区的编码基因如SEQID NO：14所示，所述CD3ζ信号区的编码基因如SEQ ID NO：16所示。
通过PCR的方法将上述信号肽、靶向BCMA的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起，得到CAR-BCMA的编码基因，该CAR-BCMA的编码基因如SEQ ID NO：20所示。
(3)构建pWPXLd-CAR-CD19重组质粒和pWPXLd-CAR-BCMA重组质粒
将CAR-CD19的编码基因插入到pWPXLD载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，并在pWPXLD载体EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-CD19的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-CD19的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建如图1所示的pWPXLd-CAR-CD19重组质粒。
将CAR-BCMA的编码基因插入到pWPXLD载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，并在pWPXLD载体EF1α之后，以EF1α为启动子。其中当所述CAR-BCMA的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-BCMA的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建如图2所示的pWPXLd-CAR-BCMA重组质粒。
(4)重组慢病毒构建
将pWPXLd-CAR-BCMA重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者共转染入培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，将病毒按照100μL、2×108TU/mL分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到带CAR-CD19的第一重组慢病毒。
将pWPXLd-CAR-BCMA重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者共转染入培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，将病毒按照100μL、2×108TU/mL分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到带CAR-BCMA的第二重组慢病毒。
(5)靶向性T淋巴细胞的制备
a)PBMC(外周血单个核细胞)的分离
PBMC来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。最好是来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
抽取病人血液，送样至血液分离室；采集外周血单个核细胞，Ficoll离心分离后取中间层细胞；经PBS洗涤后，得到PBMC。
b)免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞
取上述PBMC，加入不含血清的基础培养基，配成细胞悬液；按磁珠与细胞的比例为3:1，加入CD3/CD28免疫磁珠，室温孵1-2h；采用磁铁对孵育好磁珠的细胞进行筛选；PBS洗涤，去除免疫磁珠后，得到CD3阳性T淋巴细胞。
c)病毒转染法制备抗原特异性T淋巴细胞
取上述经过免疫磁珠分离法得到的CD3阳性T淋巴细胞，同时加入与CD3阳性细胞数相应的病毒滴度的带CAR-CD19的第一重组慢病毒和带CAR-BCMA的第二重组慢病毒进行共同培养，其中第一重组慢病毒与第二重组慢病毒的用量(滴度)之比是1：1。
培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×106个/mL，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×106个/mL，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，得到靶向性T淋巴细胞，即CAR-CD19单阳性T淋巴细胞和CAR-BCMA单阳性T淋巴细胞，CAR-19/CAR-BCMA双阳性T淋巴细胞细胞，并保存在回输专用的细胞冻存液中。
效果实施例
效果实施例一：评估本发明靶向性T淋巴细胞的体外肿瘤细胞杀伤情况
将经过本发明实施例一制得的靶向性T淋巴细胞(实验组)与未经制备的T淋巴细胞(阴性对照组)、具有单独的CAR–CD19的T细胞(CD19CAR–T单独组)以及具有单独的CAR–BCMA的T细胞(BCMA CAR–T单独组)进行比较，在体外将上述四组效应细胞与靶细胞(Raji细胞或Nalm-6细胞)按数量比为1:10、1:3、1:1、3:1和10:1的比例，在37℃、5％CO2下进行共培养，在培养后的第15-18小时，收集细胞，进行流式染色，检测细胞杀伤情况，结果如图3所示。从图3中可看出，经过本发明所述的方法制备的靶向性T淋巴细胞的肿瘤杀伤力在60％以上，甚至可达99％，远远高于其他对照组，这说明经本发明方法制备的靶向性T淋巴细胞具有超强的肿瘤杀伤能力。
效果实施例二，评估本发明靶向性T淋巴细胞对小鼠体内肿瘤细胞杀伤情况
将经过本发明实施例一制备的靶向性T淋巴细胞(实验组)与未经制备的T淋巴细胞(阴性对照组)、具有单独的CAR–CD19的T细胞(CD19 CAR–T单独组)以及具有单独的CAR–BCMA的T细胞(BCMACAR–T单独组)，在小鼠淋巴细胞白血病模型中，给每只小鼠尾静脉注射1×106个细胞(n＝9)，得到小鼠的生存曲线，结果如图4所示。从图4可以看出本发明制备的靶向性T淋巴细胞能在注入小鼠体内30天后，使得小鼠存活率能稳定在80％左右，远远超过阴性对照组和以上两个单独组。图4的结果表明提供的靶向性T淋巴细胞能够较好地保护小鼠免于因淋巴细胞白血病导致的死亡。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳宾德生物技术有限公司
<120> 一种靶向性T淋巴细胞及其制备方法和应用
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 2
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
130 135 140
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
145 150 155 160
Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala
180 185 190
Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser
195 200 205
Thr Ala Thr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr
210 215 220
Tyr Phe Cys Ala Leu Ala Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 3
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360
ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 420
tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 480
cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 540
tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 600
ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 660
tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 720
tcctca 726
<210> 4
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacatcgtgc tgacccagag ccctcctagc ctggccatga gcctgggcaa gagggccacc 60
atcagctgca gggccagcga aagcgtgacc atcctgggca gccacctgat ccactggtac 120
cagcagaagc ctggccagcc ccctaccctg ctgatccagc tggccagcaa cgtgcagaca 180
ggcgtgcctg ccaggtttag cggcagcggc agcaggaccg acttcaccct gaccatcgac 240
cctgtggagg aggacgacgt ggccgtgtac tactgcctgc agagcaggac catccctagg 300
accttcggcg gcggcaccaa gctggagatt aagggaggcg gaggatctgg cggcggagga 360
agtggcggag ggggatctgg gggaggcgga agccagatcc agctggtgca gagcggccct 420
gagctgaaga agcccggcga gaccgtgaag atcagctgca aggccagcgg ctacaccttc 480
accgactaca gcatcaactg ggtgaagagg gcccctggca agggcctgaa gtggatgggc 540
tggatcaaca ccgagaccag ggagcccgcc tacgcctacg acttcagggg caggttcgcc 600
ttcagcctgg agacaagcgc cagcaccgcc accctgcaga tcaacaacct gaagtacgag 660
gacaccgcca catacttctg cgccctggcc tacagctacg ccatggacta ctggggccag 720
ggcacatccg tgaccgtgag cagc 744
<210> 5
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
245 250 255
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
260 265 270
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
275 280 285
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
290 295 300
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
305 310 315 320
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
325 330 335
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
340 345 350
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln
355 360 365
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
370 375 380
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
385 390 395 400
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
405 410 415
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
420 425 430
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
435 440 445
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
450 455 460
Arg
465
<210> 6
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
130 135 140
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
145 150 155 160
Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala
180 185 190
Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser
195 200 205
Thr Ala Thr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr
210 215 220
Tyr Phe Cys Ala Leu Ala Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
245 250 255
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
260 265 270
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
275 280 285
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
290 295 300
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
305 310 315 320
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
325 330 335
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
340 345 350
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
355 360 365
Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
370 375 380
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
385 390 395 400
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
420 425 430
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
435 440 445
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
450 455 460
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 7
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn
100 105 110
Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
130 135 140
Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu
145 150 155 160
Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val
165 170 175
Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val
180 185 190
Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg
195 200 205
Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met
210 215 220
Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His
225 230 235 240
Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
275 280 285
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
290 295 300
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
305 310 315 320
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys
325 330 335
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
340 345 350
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
355 360 365
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
370 375 380
Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
385 390 395 400
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
405 410 415
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
420 425 430
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
435 440 445
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
450 455 460
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
465 470 475 480
Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 8
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala
20 25 30
Met Ser Leu Gly Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
35 40 45
Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr
65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro
145 150 155 160
Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser
165 170 175
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro
180 185 190
Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu
195 200 205
Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu
210 215 220
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Thr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu
225 230 235 240
Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Leu Ala Tyr Ser Tyr Ala Met Asp
245 250 255
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
275 280 285
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
290 295 300
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
305 310 315 320
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
325 330 335
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
340 345 350
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
355 360 365
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
370 375 380
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
385 390 395 400
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
405 410 415
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
420 425 430
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
435 440 445
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
450 455 460
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
465 470 475 480
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 9
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 10
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 11
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 12
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 13
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 14
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 16
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 17
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360
ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 420
tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 480
cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 540
tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 600
ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 660
tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 720
tcctcaacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 780
cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 840
gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 900
cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat 960
atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 1020
tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc 1080
gcagacgccc ccgcgtacaa gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1140
cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1200
aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1260
gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1320
ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1380
gccctgcccc ctcgc 1395
<210> 18
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gacatcgtgc tgacccagag ccctcctagc ctggccatga gcctgggcaa gagggccacc 60
atcagctgca gggccagcga aagcgtgacc atcctgggca gccacctgat ccactggtac 120
cagcagaagc ctggccagcc ccctaccctg ctgatccagc tggccagcaa cgtgcagaca 180
ggcgtgcctg ccaggtttag cggcagcggc agcaggaccg acttcaccct gaccatcgac 240
cctgtggagg aggacgacgt ggccgtgtac tactgcctgc agagcaggac catccctagg 300
accttcggcg gcggcaccaa gctggagatt aagggaggcg gaggatctgg cggcggagga 360
agtggcggag ggggatctgg gggaggcgga agccagatcc agctggtgca gagcggccct 420
gagctgaaga agcccggcga gaccgtgaag atcagctgca aggccagcgg ctacaccttc 480
accgactaca gcatcaactg ggtgaagagg gcccctggca agggcctgaa gtggatgggc 540
tggatcaaca ccgagaccag ggagcccgcc tacgcctacg acttcagggg caggttcgcc 600
ttcagcctgg agacaagcgc cagcaccgcc accctgcaga tcaacaacct gaagtacgag 660
gacaccgcca catacttctg cgccctggcc tacagctacg ccatggacta ctggggccag 720
ggcacatccg tgaccgtgag cagcaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 780
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 840
ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 900
gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg caaacggggc 960
agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1020
gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 1080
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtacaagc agggccagaa ccagctctat 1140
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1200
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1260
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1320
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1380
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgc 1413
<210> 19
<211> 1455
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gccttaccag tgaccgcctt gctcctgccg ctggccttgc tgctccacgc cgccaggccg 60
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 120
atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 180
gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 240
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 300
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 360
gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 420
ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 480
tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 540
cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 600
tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 660
ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 720
tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 780
tcctcaacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 840
cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 900
gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 960
cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat 1020
atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 1080
tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc 1140
gcagacgccc ccgcgtacaa gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1200
cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1260
aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1320
gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1380
ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1440
gccctgcccc ctcgc 1455
<210> 20
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gccctgcctg tgacagccct gctgctgcct ctggctctgc tgctgcatgc cgctagaccc 60
gacatcgtgc tgacccagag ccctcctagc ctggccatga gcctgggcaa gagggccacc 120
atcagctgca gggccagcga aagcgtgacc atcctgggca gccacctgat ccactggtac 180
cagcagaagc ctggccagcc ccctaccctg ctgatccagc tggccagcaa cgtgcagaca 240
ggcgtgcctg ccaggtttag cggcagcggc agcaggaccg acttcaccct gaccatcgac 300
cctgtggagg aggacgacgt ggccgtgtac tactgcctgc agagcaggac catccctagg 360
accttcggcg gcggcaccaa gctggagatt aagggaggcg gaggatctgg cggcggagga 420
agtggcggag ggggatctgg gggaggcgga agccagatcc agctggtgca gagcggccct 480
gagctgaaga agcccggcga gaccgtgaag atcagctgca aggccagcgg ctacaccttc 540
accgactaca gcatcaactg ggtgaagagg gcccctggca agggcctgaa gtggatgggc 600
tggatcaaca ccgagaccag ggagcccgcc tacgcctacg acttcagggg caggttcgcc 660
ttcagcctgg agacaagcgc cagcaccgcc accctgcaga tcaacaacct gaagtacgag 720
gacaccgcca catacttctg cgccctggcc tacagctacg ccatggacta ctggggccag 780
ggcacatccg tgaccgtgag cagcaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900
ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960
gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg caaacggggc 1020
agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1080
gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 1140
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtacaagc agggccagaa ccagctctat 1200
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1260
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1320
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1380
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1440
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgc 1473
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro
20
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gccttaccag tgaccgcctt gctcctgccg ctggccttgc tgctccacgc cgccaggccg 60
<210> 23
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gccctgcctg tgacagccct gctgctgcct ctggctctgc tgctgcatgc cgctagaccc 60

Claims (9)

1.一种靶向性T淋巴细胞，其特征在于，包括靶向CD19的嵌合抗原受体CAR-CD19和靶向BCMA的嵌合抗原受体CAR-BCMA，其中，所述CAR-CD19包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向CD19的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-BCMA包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向BCMA的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；
其中，所述靶向CD19的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO ：1所示的氨基酸序列，所述靶向BCMA的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO ：2所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的靶向性T淋巴细胞，其特征在于，所述CAR-CD19的氨基酸序列包括如SEQ ID NO ：5所示的氨基酸序列，所述CAR-BCMA的氨基酸序列包括如SEQ ID NO ：6所示的氨基酸序列。
3.一种重组病毒载体，其特征在于，包括如权利要求1-2任一项所述的靶向性T淋巴细胞中所述CAR-CD19和CAR-BCMA的编码基因。
4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求3所述的重组病毒载体。
5.一种靶向性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包括：
（1）分别提供靶向CD19的嵌合抗原受体CAR-CD19的编码基因和靶向BCMA的嵌合抗原受体CAR-BCMA的编码基因；
所述CAR-CD19的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向CD19的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；所述CAR-BCMA的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向BCMA的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；
其中，所述靶向CD19的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列，所述靶向BCMA的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；
（2）将所述CAR-CD19的编码基因和所述CAR-BCMA的编码基因分别插入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-CD19重组质粒和pWPXLD-CAR-BCMA重组质粒；
（3）分别对所述pWPXLD-CAR-CD19重组质粒和所述pWPXLD-CAR-BCMA重组质粒进行包装，得到带CAR-CD19编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-BCMA编码基因的第二重组慢病毒；
（4）将所述第一重组慢病毒与所述第二重组慢病毒分开或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，经分离获得靶向性T淋巴细胞。
6.如权利要求5所述的靶向性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述CAR-CD19的编码基因包括如SEQ ID NO ：7所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列，所述CAR-BCMA的编码基因包括如SEQ ID NO ：8所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列。
7.如权利要求5所述的靶向性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所采用的第一重组慢病毒与第二重组慢病毒的病毒滴度之比为1：（0.5-2）。
8.如权利要求7所述的靶向性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述靶向性T淋巴细胞为带所述CAR-CD19和所述CAR-BCMA的双靶点嵌合抗原受体T细胞，或者为带所述CAR-CD19的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-BCMA的嵌合抗原受体T细胞的混合，或者为带所述CAR-CD19和所述CAR-BCMA的双靶点嵌合抗原受体T细胞、带所述CAR-CD19的嵌合抗原受体T细胞，以及带所述CAR-BCMA的嵌合抗原受体T细胞的混合。
9.如权利要求3所述的重组病毒载体、如权利要求4所述的宿主细胞、如权利要求1-2任一项所述的靶向性T淋巴细胞、或如权利要求5-8任一项所述的制备方法制得的靶向性T淋巴细胞在制备诊断和/或治疗表达CD19和/或BCMA抗原蛋白的恶性肿瘤的药物中的应用。
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