CN110016486A - 一种微生物发酵法生产l-羟脯氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物发酵法生产L‑羟脯氨酸的方法，按大肠杆菌接入发酵培养基，发酵培养基中添加有碳源、氮源，在碳源存在下，于水性介质中使碳源转化为L‑羟脯氨酸，再从该水性介质中提取生成的L‑羟脯氨酸；将L‑羟脯氨酸发酵液经过陶瓷膜过滤，得到截留物和滤清液，滤清液送入纳滤膜，进行除杂澄清，得到纳滤清液和纳滤截留液，纳滤清液经反渗透膜过滤浓缩得到浓缩液；浓缩液经活性炭脱色后得L‑羟脯氨酸溶液，将其送入蒸发器，蒸发结晶得到白色的L‑羟脯氨酸晶体。采用多级膜组合过滤浓缩，分离和提取出L‑羟脯氨酸，此工艺既在保证L‑脯氨酸的收率和品质的基础上，又实现了废水的零排放，在发酵培养基中以糖、醇或有机酸为碳源，来直接获得大量的L‑羟脯氨酸。
Description
技术领域
本发明涉及一种L-羟脯氨酸的方法，具体涉及一种微生物发酵法生产L-羟脯氨酸的方法。
背景技术
L-脯氨酸(L-Proline，C5H9NO2)又称吡咯烷酮羧酸，是一种含有亚氨基的环状中性氨基酸，构成蛋白质的20种基本氨基酸之一，属人体非必需氨基酸。作为抗病毒药物阿扎那韦的主要原料，具有很高的应用价值。
目前，国内外报道的生产羟脯氨酸的方法主要有蛋白水解提取法、化学合成法、微生物发酵法和酶促转化法四种。从天然蛋白质水解液中提取，所用原料有明胶，鸡毛，鱼皮或是毛发水解液等，但由于生产成本高，不适用于现代化工业大生产；直接发酵法，原料成本低，反应条件温和，易大规模生产。
已知的纯化方法有离子交换树脂法，氧化铝层析法，在使用氧化铝层析柱法对L-脯氨酸进行分离时，有时很难用溶剂展开或洗脱下来而达不到分离的目的，因此氧化铝层析柱法存在费时多，难分离等缺点。采用离子交换方法，将除去菌体的发酵液在特定的pH条件下上柱，让羟脯氨酸吸附在离子交换柱上，随后用去离子水对离子交换柱充分洗涤，除去杂质，然后用洗脱液将羟脯氨酸从离子交换柱上洗脱，但存在羟脯氨酸易氧化，收率不稳定的问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种微生物发酵法生产L-羟脯氨酸的方法。该方法能高效的分离出成品并提高纯度和提取率。
本发明提供如下技术方案：
一种微生物发酵法生产L-羟脯氨酸的方法，包括以下步骤：
S1、按大肠杆菌接入发酵培养基，发酵培养基中添加有碳源、氮源，在旋转式摇床中220-250rpm震荡或搅拌以维持菌体生长所需的氧气量，pH控制在5-7，培养温度在25-37℃，培养时间12-72小时，在碳源存在下，于水性介质中使碳源转化为L-羟脯氨酸，再从该水性介质中提取生成的L-羟脯氨酸；
S2、将L-羟脯氨酸发酵液经过陶瓷膜过滤，得到截留物和滤清液，滤清液送入分子量为800～1000Da的纳滤膜，进行除杂澄清，得到纳滤清液和纳滤截留液，纳滤清液经反渗透膜过滤浓缩得到浓缩液；
S3、浓缩液经活性炭脱色后得L-羟脯氨酸溶液，将其送入蒸发器，蒸发结晶得到白色的L-羟脯氨酸晶体。
进一步的，采用大肠杆菌作生产菌，接入种子罐，在pH＝0H，培养温度35-37℃，每10分钟降温1℃，在pH＝6.5H，种子培养温度为33℃，镜检无杂菌，再移入发酵罐。
进一步的，所述发酵培养基中的碳源为糖、醇或有机酸。
进一步的，所述糖为葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉水解物，醇为甘油或山梨；有机酸为富马酸、柠檬酸或琥珀酸。
进一步的，所述发酵培养基中的氮源为无机铵盐或有机氮。
进一步的，所述无机铵盐为硫酸铵、氯化铵和磷酸铵，有机氮为酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米浆、豆粕中的多种混合。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：采用多级膜组合过滤浓缩，分离和提取出L-羟脯氨酸，此工艺既在保证L-脯氨酸的收率和品质的基础上，又实现了废水的零排放，在发酵培养基中以糖、醇或有机酸为碳源，来直接获得大量的L-羟脯氨酸。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种微生物发酵法生产L-羟脯氨酸的方法，包括以下步骤：
S1、按大肠杆菌接入发酵培养基，发酵培养基中添加有碳源、氮源，在旋转式摇床中220rpm震荡或搅拌以维持菌体生长所需的氧气量，pH控制在5，培养温度在25℃，培养时间12小时，在碳源存在下，于水性介质中使碳源转化为L-羟脯氨酸，再从该水性介质中提取生成的L-羟脯氨酸；
S2、将L-羟脯氨酸发酵液经过陶瓷膜过滤，得到截留物和滤清液，滤清液送入分子量为800Da的纳滤膜，进行除杂澄清，得到纳滤清液和纳滤截留液，纳滤清液经反渗透膜过滤浓缩得到浓缩液；
S3、浓缩液经活性炭脱色后得L-羟脯氨酸溶液，将其送入蒸发器，蒸发结晶得到白色的L-羟脯氨酸晶体。
采用大肠杆菌作生产菌，接入种子罐，在pH＝0H，培养温度35℃，每10分钟降温1℃，在pH＝6.5H，种子培养温度为33℃，镜检无杂菌，再移入发酵罐。
发酵培养基中的碳源为糖、醇或有机酸。糖为葡萄糖；有机酸为富马酸。发酵培养基中的氮源为无机铵盐或有机氮。无机铵盐为硫酸铵、氯化铵和磷酸铵，有机氮为酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米浆、豆粕中的多种混合。
实施例2
一种微生物发酵法生产L-羟脯氨酸的方法，包括以下步骤：
S1、按大肠杆菌接入发酵培养基，发酵培养基中添加有碳源、氮源，在旋转式摇床中235rpm震荡或搅拌以维持菌体生长所需的氧气量，pH控制在6，培养温度在30℃，培养时间40小时，在碳源存在下，于水性介质中使碳源转化为L-羟脯氨酸，再从该水性介质中提取生成的L-羟脯氨酸；
S2、将L-羟脯氨酸发酵液经过陶瓷膜过滤，得到截留物和滤清液，滤清液送入分子量为900Da的纳滤膜，进行除杂澄清，得到纳滤清液和纳滤截留液，纳滤清液经反渗透膜过滤浓缩得到浓缩液；
S3、浓缩液经活性炭脱色后得L-羟脯氨酸溶液，将其送入蒸发器，蒸发结晶得到白色的L-羟脯氨酸晶体。
采用大肠杆菌作生产菌，接入种子罐，在pH＝0H，培养温度36℃，每10分钟降温1℃，在pH＝6.5H，种子培养温度为33℃，镜检无杂菌，再移入发酵罐。
发酵培养基中的碳源为糖、醇或有机酸。糖为乳糖，醇为山梨；有机酸为柠檬酸。发酵培养基中的氮源为无机铵盐或有机氮。无机铵盐为硫酸铵、氯化铵和磷酸铵，有机氮为酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米浆、豆粕中的多种混合。
实施例3
一种微生物发酵法生产L-羟脯氨酸的方法，包括以下步骤：
S1、按大肠杆菌接入发酵培养基，发酵培养基中添加有碳源、氮源，在旋转式摇床中250rpm震荡或搅拌以维持菌体生长所需的氧气量，pH控制在7，培养温度在37℃，培养时间72小时，在碳源存在下，于水性介质中使碳源转化为L-羟脯氨酸，再从该水性介质中提取生成的L-羟脯氨酸；
S2、将L-羟脯氨酸发酵液经过陶瓷膜过滤，得到截留物和滤清液，滤清液送入分子量为1000Da的纳滤膜，进行除杂澄清，得到纳滤清液和纳滤截留液，纳滤清液经反渗透膜过滤浓缩得到浓缩液；
S3、浓缩液经活性炭脱色后得L-羟脯氨酸溶液，将其送入蒸发器，蒸发结晶得到白色的L-羟脯氨酸晶体。
采用大肠杆菌作生产菌，接入种子罐，在pH＝0H，培养温度37℃，每10分钟降温1℃，在pH＝6.5H，种子培养温度为33℃，镜检无杂菌，再移入发酵罐。
发酵培养基中的碳源为糖、醇或有机酸。糖为半乳糖，醇为甘油；有机酸为琥珀酸。发酵培养基中的氮源为无机铵盐或有机氮。无机铵盐为硫酸铵、氯化铵和磷酸铵，有机氮为酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米浆、豆粕中的多种混合。
发酵培养基中的碳源为糖、醇或有机酸。糖还可以为果糖、淀粉水解物。
发酵前期长菌速率更快，且出现发酵前期溶菌的比例明显减少，通过调节pH和分段降温的方式，可有效改善L-羟脯氨酸发酵前期溶菌的问题，提高发酵长菌期菌种生长的速率。
添加混合无机铵盐或有机氮弥补单一有机氮源在菌体生长方面的不足，提高了种子移种后发酵长菌期菌种生长的速率。
采用大肠杆菌作生产菌，来源广泛，通过提供含碳源、氮源发酵的营养液，有利于发酵，震荡或搅拌以维持菌体生长所需的氧气量，有利于大肠杆菌在碳源碳源的存在下，发酵充分，使碳源转化为L-羟脯氨酸。
采用多级膜组合过滤浓缩，分离和提取出L-羟脯氨酸，此工艺既在保证L-脯氨酸的收率和品质的基础上，又实现了废水的零排放，在发酵培养基中以糖、醇或有机酸为碳源，来直接获得大量的L-羟脯氨酸。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.一种微生物发酵法生产L-羟脯氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、按大肠杆菌接入发酵培养基，发酵培养基中添加有碳源、氮源，在旋转式摇床中220-250rpm震荡或搅拌以维持菌体生长所需的氧气量，pH控制在5-7，培养温度在25-37℃，培养时间12-72小时，在碳源存在下，于水性介质中使碳源转化为L-羟脯氨酸，再从该水性介质中提取生成的L-羟脯氨酸；
S2、将L-羟脯氨酸发酵液经过陶瓷膜过滤，得到截留物和滤清液，滤清液送入分子量为800～1000Da的纳滤膜，进行除杂澄清，得到纳滤清液和纳滤截留液，纳滤清液经反渗透膜过滤浓缩得到浓缩液；
S3、浓缩液经活性炭脱色后得L-羟脯氨酸溶液，将其送入蒸发器，蒸发结晶得到白色的L-羟脯氨酸晶体。
2.根据权利要求1所述的一种微生物发酵法生产L-羟脯氨酸的方法，其特征在于：在接入发酵罐之前，采用大肠杆菌作生产菌，接入种子罐，在pH＝0H，培养温度35-37℃，每10分钟降温1℃，在pH＝6.5H，种子培养温度为33℃，镜检无杂菌，再移入发酵罐。
3.根据权利要求1所述的一种微生物发酵法生产L-羟脯氨酸的方法，其特征在于：所述发酵培养基中的碳源为糖、醇或有机酸。
4.根据权利要求3所述的一种微生物发酵法生产L-羟脯氨酸的方法，其特征在于：所述糖为葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉水解物，醇为甘油或山梨；有机酸为富马酸、柠檬酸或琥珀酸。
5.根据权利要求1所述的一种微生物发酵法生产L-羟脯氨酸的方法，其特征在于：所述发酵培养基中的氮源为无机铵盐或有机氮。
6.根据权利要求5所述的一种微生物发酵法生产L-羟脯氨酸的方法，其特征在于：所述无机铵盐为硫酸铵、氯化铵和磷酸铵，有机氮为酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米浆和豆粕中的多种混合。
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