CN118497230B - 肠杆菌素合酶编码基因在发酵生产丝氨酸中的应用 - Google Patents
肠杆菌素合酶编码基因在发酵生产丝氨酸中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种肠杆菌素合酶编码基因在发酵生产丝氨酸中的应用，借助CRISPRi技术对丝氨酸生产菌株中可能存在的非传统丝氨酸代谢途径中的潜在靶点基因进行筛选，筛选出影响丝氨酸合成的非丝氨酸代谢途径的有效抑制靶点entB、entD、entE、entF。基于抑制新靶点entB、entD、entE、entF构建的丝氨酸生产菌株及利用其发酵生产丝氨酸的方法，突破了传统理性化代谢工程改造的局限性，为微生物发酵法生产丝氨酸提供了新思路。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程及发酵工程技术领域，具体地，涉及一株丝氨酸生产菌株的基因工程改造以及利用其发酵生产丝氨酸的方法。
背景技术
L-丝氨酸（L-serine）属于非必需氨基酸，在脂肪和脂肪酸的新陈代谢及肌肉的生长中发挥着重要作用，参与细胞膜的制造、肌肉组织和神经鞘的合成等生命活动，被广泛地应用于食品、医药、化妆品等领域，具有重要的商业价值。目前，L-丝氨酸的主要生产方法有酶转化法、蛋白质水解法、化学合成法等。但是这些方法有成本高、产量少、造成环境污染的特点，不适用于大规模的产业化生产。而微生物发酵法可以克服以上问题，是一种绿色环保可持续的生产方法，逐渐成为现今和未来L-丝氨酸生产的热点。
大肠杆菌，由于其遗传背景较为清晰，易于培养，是生产氨基酸的重要工程菌株之一，通过传统代谢工程获得以大肠杆菌为微生物底盘的L-丝氨酸生产菌株的技术已相对成熟。现有技术中，针对L-丝氨酸生物合成的代谢工程主要集中于强化合成途径关键酶、过表达及突变限速酶、抑制竞争途径和强化L-丝氨酸胞外转运途径。例如，CN 115838683A公开了一种改造L-丝氨酸合成模块、降解模块、转运模块和副产物合成模块的大肠杆菌基因工程菌，并以此提高其L-丝氨酸耐受性的方法。
近年来，为进一步提高L-丝氨酸产量，常采用传统诱变或适应性进化的方法对上述通过代谢工程获得的L-丝氨酸生产菌株进行非理性改造。但是，传统诱变或适应性进化的方法具有不确定性强、工作量大、周期长等缺陷。基于微生物代谢系统的复杂性，尽管L-丝氨酸生产菌株的代谢途径被逐步地解析，但由于缺乏L-丝氨酸生物合成与其他细胞物质代谢之间联系的深入了解，L-丝氨酸产量难以进一步提升，因此需要挖掘更多的未知基因靶点来寻求突破传统L-丝氨酸代谢途径的限制，以期提高微生物发酵法生产L-丝氨酸的产量和糖酸转化率等重要生产指标。
CRISPR干扰技术（clustered regularly interspaced palindromic repeatsinterference, CRISPRi）通过在核酸酶催化残基中引入点突变，从而设计出一种催化活性部分失活的Cas9蛋白（dCas9），这些突变使Cas9内切酶不能切断双链DNA，但允许使用RNA进行引导，在sgRNA的作用下，dCas9蛋白可精确定位目标靶点，空间上阻碍RNA聚合酶（RNApolymerase, RNAP）的转录过程，实现特定基因的表达下调。该技术可用于高通量的功能基因筛查，从而实现解析微生物代谢网络结构的能力，已经广泛应用于微生物代谢工程增强所需产物的生物合成。
发明内容
为打破对丝氨酸生产菌株进行理性化分子改造所存在的局限性，同时也为了解决目前微生物发酵法生产丝氨酸的产量较低以及转化率不高等问题，本发明借助CRISPRi技术对L-丝氨酸生产菌株中可能存在的非传统L-丝氨酸代谢途径中的潜在靶点基因进行筛选，选择中心碳代谢模块和相关副产物途径中的38个基因作为目标基因，利用CRISPRi系统构建筛选体系，筛选出影响L-丝氨酸合成的非传统L-丝氨酸代谢途径的有效抑制靶点entB、entD、entE、entF。这四个基因的表达产物组成肠杆菌素合酶（enterobactinsynthase），在肠杆菌素的合成过程中扮演重要角色。
将大肠杆菌的entB、entD、entE、entF基因分别敲除后得到突变菌株-ΔentB、突变菌株-ΔentD、突变菌株-ΔentE和突变菌株-ΔentF，其发酵生产L-丝氨酸的产量和转化率均大大提高。基于敲除筛选出的新靶点entB、entD、entE、entF构建的L-丝氨酸生产菌株及利用其发酵生产L-丝氨酸的方法，突破了传统的理性化分子改造的局限性，为微生物发酵法生产L-丝氨酸提供了新的思路。
本发明提供一种肠杆菌素合酶编码基因在发酵生产L-丝氨酸中的应用，所述肠杆菌素合酶编码基因选自 entB、entD、entE、entF，所述entB的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述entD的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述entE的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述entF的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明提供一种肠杆菌素合酶编码基因entB在发酵生产L-丝氨酸中的应用，所述entB的序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供一种肠杆菌素合酶编码基因entD在发酵生产L-丝氨酸中的应用，所述entD的序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明提供一种肠杆菌素合酶编码基因entE在发酵生产L-丝氨酸中的应用，所述entE的序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明提供一种肠杆菌素合酶编码基因entF在发酵生产L-丝氨酸中的应用，所述entF的序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明提供一种用于发酵生产L-丝氨酸的突变菌株，其是将大肠杆菌的肠杆菌素合酶编码基因抑制或敲除后而得到的，所述肠杆菌素合酶编码基因选自entB、entD、entE、entF，所述entB的序列如SEQ ID NO:1所示，所述entD的序列如SEQ ID NO:2所示，所述entE的序列如SEQ ID NO:3所示，所述entF的序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明提供一种用于发酵生产L-丝氨酸的突变菌株，其是将大肠杆菌的肠杆菌素合酶编码基因entB抑制或敲除后而得到的突变菌株-ΔentB，优选对entB进行敲除处理。
本发明提供一种用于发酵生产L-丝氨酸的突变菌株，其是将大肠杆菌的肠杆菌素合酶编码基因entD抑制或敲除后而得到的突变菌株-ΔentD，优选对entD进行敲除处理。
本发明提供一种用于发酵生产L-丝氨酸的突变菌株，其是将大肠杆菌的肠杆菌素合酶编码基因entE抑制或敲除后而得到的突变菌株-ΔentE，优选对entE进行敲除处理。
本发明提供一种用于发酵生产L-丝氨酸的突变菌株，其是将大肠杆菌的肠杆菌素合酶编码基因entF抑制或敲除后而得到的突变菌株-ΔentF，优选对entF进行敲除处理。
本发明提供一种发酵生产L-丝氨酸的方法，其是利用上述突变菌株-ΔentB进行发酵。
本发明提供一种发酵生产L-丝氨酸的方法，其是利用上述突变菌株-ΔentD进行发酵。
本发明提供一种发酵生产L-丝氨酸的方法，其是利用上述突变菌株-ΔentE进行发酵。
本发明提供一种发酵生产L-丝氨酸的方法，其是利用上述突变菌株-ΔentF进行发酵。
本发明提供一种肠杆菌素合酶编码基因在促进L-丝氨酸发酵生产中的用途，所述促进L-丝氨酸发酵生产是通过抑制或敲除微生物的肠杆菌素合酶编码基因实现的，所述肠杆菌素合酶编码基因选自entB、entD、entE或entF。
本发明提供一种促进L-丝氨酸发酵生产的方法，抑制或敲除微生物的肠杆菌素合酶编码基因，所述肠杆菌素合酶编码基因选自entB、entD、entE或entF。
本发明提供一种提高大肠杆菌L-丝氨酸产量的方法，抑制或敲除大肠杆菌中的肠杆菌素合酶编码基因，所述肠杆菌素合酶编码基因选自entB、entD、entE或entF。
本发明提供一种具有提高的L-丝氨酸产量的突变菌株，其特征在于，是将大肠杆菌的肠杆菌素合酶编码基因抑制或敲除后而得到的，所述肠杆菌素合酶编码基因选自entB、entD、entE或entF。
本发明还提供突变菌株在发酵生产丝氨酸中的用途。
本发明提供一种发酵生产L-丝氨酸的方法，使用上述突变菌株发酵制备丝氨酸。
上述发酵生产L-丝氨酸的方法，具体地以上述突变菌株作为生产菌株，先进行种子培养，再接种到发酵罐中进行L-丝氨酸发酵培养。
所述种子培养基组成为：葡萄糖10-50 g/L、磷酸二氢钾1-5 g/L、酵母浸粉2-10g/L、蛋白胨1-5 g/L、硫酸铵1-5 g/L、柠檬酸1-5 g/L、硫酸镁0.5-1 g/L、一水合硫酸锰1-5mg/L、VB1 0.5-3 mg/L、VH 1-5 mg/L、氯化钴1-5 mg/L、硫酸锌1-5 mg/L、消泡剂0.1-1 mL/L、Amp 10-100 µg/mL。
所述发酵罐发酵培养基组成：葡萄糖10-50 g/L、磷酸氢二钾5-10 g/L、酵母浸粉2-6 g/L、蛋白胨2-10 g/L、硫酸铵2-6 g/L、玉米浆1-10 g/L、柠檬酸1-5 g/L、硫酸镁1-3g/L、一水合硫酸锰5-20 mg/L、VB1 0.5-3 mg/L、VH 1-5 mg/L、氯化钴1-5 mg/L、硫酸锌1-5mg/L、硫酸铜0.1-1 mg/L、氯化钙2-6 mg/L、消泡剂0.1-1 mL/L、Amp 10-100 µg/mL。
所述种子培养，接种量为0.5-1.0％，培养温度为35-40 ℃，pH控制在6.5-7.5，溶氧控制在10-30％，残糖控制在0.1-0.3％，培养周期为10-15 h。
所述发酵罐中L-丝氨酸发酵培养，接种量为10-15％，培养温度为35-40 ℃，pH控制在6.5-7.5，溶氧控制在10-30％，残糖控制在0.1-0.3％，发酵周期为45-55h。
附图说明
图1 本发明实施例3中38个携带不同sgRNA的菌株摇瓶发酵测试结果
图2 本发明实施例4中突变菌株摇瓶发酵测试结果
图3 本发明实施例5中突变菌株发酵罐发酵测试结果
图4 本发明实施例5中突变菌株发酵罐测试的最终L-丝氨酸产量及转化率结果
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步详细阐述本发明。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件。
表1. 本发明使用及构建的质粒
表2. 本发明使用及构建的菌株
表3. 本发明构建质粒及基因编辑所用引物
实施例1：基础L-丝氨酸生产菌株的构建
本发明利用CRISPRi系统对非理性目标基因进行抑制后检测其丝氨酸产量的变化，从而筛选目标基因。由于大肠杆菌自身即能够合成L-丝氨酸，因此使用任意一株大肠杆菌作为基础菌株，均可达到筛选的目的。但为了便于检测以及更明显地展示L-丝氨酸的产量对比，按照本领域的常规做法优选丝氨酸产量高的菌株作为基础菌株。
作为其中的一个例子，本实施例按照参考文献1（Zhang Y, Kang P, Liu S, etal. glyA gene knock-out in Escherichia coli enhances L-serine productionwithout glycine addition[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2017,22(4): 390-396.）中所记载的工程菌株E4G2 (pPK10)的构建方法，以大肠杆菌W3110代替所述文献中的大肠杆菌MG1655作为起始菌株，敲除基因sdaA、sdaB、tdcG、glyA，构建并转入过表达质粒pTrc99a-pgk-serA fbr-serB-serC-Ptrc-gcvTHP-kbl-tdh，得到基础L-丝氨酸生产菌株，记为S1。
实施例2：CRISPRi系统的构建
（1）S1电转化感受态细胞的制备
从LB固体平板培养基（Amp，50 µg/mL）中挑取长势良好的S1单菌落，接种到5 mL的LB液体培养基（Amp，50 µg/mL），于37 ℃摇床过夜活化。次日吸取1 mL过夜培养的菌液接种至装有100 mL LB液体培养基（Amp，50 µg/mL）的500 mL锥形瓶中，培养至OD600为0.4-0.6。将菌液在冰上预冷20 min，然后在离心机中4 ℃、4200 rpm离心10 min收集菌体，并用预冷的16%甘油反复重悬清洗2-3次，最后加入1 mL预冷的16%甘油溶液，吹吸重悬菌体，并分装至1.5 mL离心管（100 µL/管），液氮速冻，于-80 ℃保存备用。
（2）辅助质粒p15AK-dCas9的转化及筛选
将携带有dCas9基因的辅助质粒p15AK-dCas9电转化至步骤（1）制备好的S1电转化感受态细胞中，并涂布于LB固体平板培养基（Amp，50 µg/mL；Kan，50 µg/mL），在37 ℃培养箱过夜培养。次日，挑取单菌落并使用引物dCas9-JD-F和dCas9-JD-R进行菌落PCR验证。活化菌落PCR验证结果正确的单菌落并用甘油管保藏菌株，记为S1（p15AK-dCas9）；同样地，将空质粒p15AK电转化至S1感受态细胞中，筛选阳性克隆并用甘油管保藏菌株，记为S1（p15AK）。
（3）sgRNA质粒的构建
选取38个中心碳代谢和副产物模块相关的靶点基因：gpsA、glpK、plsX、plsY、plsB、plsC、cdsA、ynbB、pgsA、pgpA、pgpB、pgpC、glpX、fbp、pfkA、lpxC、tktA、gloA、gloB、ldhA、dld、pykF、poxB、ybiw、pflB、tdcE、ackA、pta、yccX、mhpF、adhE、entA、entB、entC、 entD、entE、entF、aldB。以质粒pLSG为模板，利用表3中相应引物进行PCR扩增以获得含有抑制上述38个靶点所用sgRNA序列的片段，然后通过Gibson组装的方式在CRISPRi系统辅助质粒pLSG上构建38个靶点基因各自相应的sgRNA表达质粒，记为pLSG-sgRNA（参见表1）。
PCR反应体系及参数均参照Takara PrimerSTAR Max DNA Polymerase使用说明书，反应程序：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性30 s，55 ℃退火15 s，75 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min；PCR产物回收后参照2×Hieff Clone Universal Enzyme Premix使用说明书进行Gibson法组装，反应程序：50 ℃，30 min。将Gibson组装产物转化至购买的DH5α感受态细胞中（转化方法参照商用DH5α感受态细胞的使用说明书），并在LB固体平板培养基（Cm，24 µg/mL）中进行筛选。使用pLSG-JD-F和pLSG-JD-R引物进行菌落PCR验证，并将PCR产物送出测序，活化测序结果正确的单菌落并进行质粒提取，质粒提取方法均参照FastPure Plasmid Mini Kit试剂盒使用说明书。
实施例3：利用CRISPRi系统构建抑制大肠杆菌碳代谢相关基因的菌株，筛选影响L-丝氨酸产量的目标基因
（1）发酵菌株制备
将实施例2获得的38个sgRNA表达质粒pLSG-sgRNA分别电转化至S1（p15AK-dCas9）中（电转化感受态细胞的制备及转化参照实施例2），并涂布于LB固体平板培养基（Cm，24 µg/mL；Kan，50 µg/mL；Amp，50 µg/mL）中进行筛选。挑取单菌落并使用引物pLSG-JD-F和pLSG-JD-R进行菌落PCR验证，挑选结果正确的38个单菌落进行活化并用甘油管保藏菌株，分别记为S1-gpsA、S1-glpK、S1-plsX、S1-plsY、S1-plsB、S1-plsC、S1-cdsA、S1-ynbB、S1-pgsA、S1-pgpA、S1-pgpB、S1-pgpC、S1-glpX、S1-fbp、S1-pfkA、S1-lpxC、S1-tktA、S1-gloA、S1-gloB、S1-ldhA、S1-dld、S1-pykF、S1-poxB、S1-ybiw、S1-pflB、S1-tdcE、S1-ackA、S1-pta、S1-yccX、S1-mhpF、S1-adhE、S1-entA、S1-entB、S1-entC、S1-entD、S1-entE、S1-entF、S1-aldB；同样地，将空质粒pLSG电转化至上述对照菌株S1（p15AK）感受态细胞中，筛选阳性克隆并用甘油管保藏菌株，记为S1（p15AK-pLSG）。
（2）摇瓶发酵测试
①从-80℃冰箱取出步骤（1）保藏的38个实验菌株以及对照菌株S1（p15AK-pLSG），先在LB固体平板培养基（Cm，24 µg/mL；Kan，50 µg/mL；Amp，50 µg/mL）中划线培养。然后挑取长势良好的单菌落若干接种于LB液体培养基（Cm，24 µg/mL；Kan，50 µg/mL；Amp，50 µg/mL）中于37 ℃摇床过夜活化培养。
②次日，将过夜活化的种子液接种于含20 mL L-丝氨酸发酵培养基的100 mL摇瓶中，使得摇瓶培养基的初始OD600=0.1，然后将摇瓶放至37 ℃，220 rpm摇床进行培养，培养至OD600=0.6-0.8时添加2 g/L阿拉伯糖继续诱导培养20小时。
L-丝氨酸发酵培养基组成：葡萄糖10 g/L、磷酸二氢钾2 g/L、酵母浸粉4 g/L、蛋白胨2 g/L、硫酸铵3 g/L、七水合硫酸镁2.0 g/L、柠檬酸1.8 g/L、硫酸锰10 mg/L、VB1 2mg/L、VB3 2 mg/L、VB5 2 mg/L、VB7 2 mg/L、VH 2 mg/L、氯化钴1.8 mg/L、硫酸锌0.5 mg/L、氯化钙10 mg/L以及相应抗生素（Cm，24 µg/mL；Kan，50 µg/mL；Amp，50 µg/mL）。
③培养结束后，取发酵液用离心机离心并取上清液，用高效液相色谱测定发酵液中L-丝氨酸的含量。
L-丝氨酸的检测采用自动进样器柱前自动化OPA衍生化的HPLC。色谱条件：色谱柱：Agilent AdvanceBio AAA, C18, (4.6×100 mm, 2.7 μm)；流动相A：10 mmol/L磷酸氢二钠和10 mM硼酸钠溶液，用盐酸将pH调节为8.2，流动相B：包含乙腈、甲醇和水（45:45:10，v:v:v）；流速：1.0 mL/min，柱温：40 °C，检测波长：338nm，进样量：2μL。
结果如图1所示，在所选取的38个靶点基因中，当entB、entD、entE、entF受到抑制时，对应菌株S1-entB、S1-entD、S1-entE、S1-entF的L-丝氨酸产量均表现出明显的增加，相比未受到抑制的对照菌株S1（p15AK-pLSG），L-丝氨酸产量分别提升了47.0%、50.6%、48.3%和28.6%。
实施例4：抑制靶点的基因工程改造及摇瓶发酵测试
根据实施例3的摇瓶发酵结果，筛选出entB、entD、entE、entF（肠杆菌素合酶编码基因）为高产L-丝氨酸的抑制靶点。为进一步验证上述几个靶点对L-丝氨酸产量的影响，在基础L-丝氨酸生产菌株S1基因组中分别对上述四个基因进行了敲除改造，并对改造后的菌株进行了摇瓶发酵测试。具体操作如下：
（1）entB、entD、entE和entF基因敲除
通过辅助质粒pKD46的λ-Red重组系统敲除S1基因组中的entB、entD、entE和entF基因。
①线性重组片段的构建
ΔentB-1234线性重组片段的构建：以S1基因组为模板，利用引物ΔentB-UF/ΔentB-UR和ΔentB-DF/ΔentB-DR分别扩增上下游同源臂，记为片段ΔentB-1和ΔentB-4。以质粒pSTC为模板，利用引物ΔentB-Tet-F/Tet-R和Tet-F/ΔentB-Tet-R分段扩增出Tet抗性基因片段，记为ΔentB-2和ΔentB-3。然后片段ΔentB-1和ΔentB-2经融合PCR得到片段ΔentB-12，片段ΔentB-3和ΔentB-4经融合PCR得到片段ΔentB-34。最后片段ΔentB-12和ΔentB-34经融合PCR得到线性重组片段ΔentB-1234。
PCR反应体系及参数均参照Takara PrimerSTAR Max DNA Polymerase使用说明书，具体地采用Touch-Down PCR程序：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性30 s，65 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min（15 s/kb，具体地按照片段大小而定），每个循环退火温度依次降低1 ℃，进行10个循环，直到55 ℃；98 ℃变性30 s，65 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，20个循环；72℃延伸10 min。
ΔentD-1234线性重组片段的构建：以S1基因组为模板，利用引物ΔentD-UF/ΔentD-UR和ΔentD-DF/ΔentD-DR分别扩增上下游同源臂，记为片段ΔentD-1和ΔentD-4；以质粒pSTC为模板，利用引物ΔentD-Tet-F/T2和T1/ΔentD-Tet-R分段扩增出Tet抗性基因片段，记为ΔentD-2和ΔentD-3；然后参照上述ΔentD-1234的构建方法经两步融合PCR得到线性重组片段ΔentD-1234。PCR反应体系及参数同上。
ΔentE-1234线性重组片段的构建：以S1基因组为模板，利用引物ΔentE-UF/entE-UR和ΔentE-DF/entE-DR分别扩增上下游同源臂，记为片段ΔentE-1和ΔentE-4；以质粒pSTC为模板，利用引物ΔentE-Tet-F/T2和T1/ΔentE-Tet-R分段扩增出Tet抗性基因片段，记为ΔentE-2和ΔentE-3；然后参照上述ΔentE-1234的构建方法经两步融合PCR得到线性重组片段ΔentE-1234。PCR反应体系及参数同上。
ΔentF-1234线性重组片段的构建：以S1基因组为模板，利用引物ΔentF-UF/entF-UR和ΔentF-DF/entF-DR分别扩增上下游同源臂，记为片段ΔentF-1和ΔentF-4；以质粒pSTC为模板，利用引物ΔentF-Tet-F/T2和T1/ΔentF-Tet-R分段扩增出Tet抗性基因片段，记为ΔentF-2和ΔentF-3；然后参照上述ΔentF-1234的构建方法经两步融合PCR得到线性重组片段ΔentF-1234。PCR反应体系及参数同上。
②重组电转感受态细胞的制备
从LB平板培养基中挑取已转入辅助质粒pKD46的S1单菌落（感受态制备及转化方法参照实施例2），接种于5 mL LB培养基（Spc，50 µg/mL；Amp，50 µg/mL）中，放至30 ℃摇床过夜活化。次日吸取1 mL过夜培养的菌液接种到装有100mL LB液体培养基（IPTG，2 mM；葡萄糖，10 g/L；Spc，50 µg/mL；Amp，50 µg/mL）的500 mL锥形瓶中，培养至OD600为0.4-0.6。将菌液在冰上预冷20 min后离心收集菌体，并用预冷的16%甘油反复重悬清洗2-3次，最后加入1 mL预冷的16%甘油溶液，吹吸重悬菌体，并分装100 µL／管，液氮速冻，于-80 ℃保存备用。
③转化及阳性克隆的筛选
将构建好的线性重组片段ΔentB-1234、ΔentD-1234、ΔentE-1234和ΔentF-1234分别电转化至上述制备好的重组电转感受态细胞的不同细胞株中，并分别涂布于LB固体平板培养基（IPTG，2 mM；Tet，10 µg/mL；Spc，50 µg/mL；Amp，50 µg/mL），放至30 ℃培养箱中培养12-16 h。挑取单菌落，分别利用引物ΔentB-UF/ΔentB-DR、ΔentD-UF/ΔentD-DR、ΔentE-UF/ΔentE-DR和ΔentF-UF/ΔentF-DR进行菌落PCR验证得到对应的四株阳性菌株。
④筛选标记（Tet）的弹出
将已验证阳性的单菌落接种5 mL LB液体培养基（IPTG，2 mM；阿拉伯糖，4 g/L；Spc，50 µg/mL；Amp，50 µg/mL）中，并放至30 ℃摇床诱导约6-8 h。诱导结束后蘸取少许菌液，在LB固体平板培养基（IPTG，2 mM；阿拉伯糖，4 g/L；Spc，50 µg/mL；Amp，50 µg/mL）中划线复筛，然后挑取平板上的单菌落在有无Tet抗性的LB平板培养基中进行对点板实验，筛选出成功弹出筛选标记Tet的菌落，即在无Tet抗性培养基中生长但在含Tet抗性的培养基中不长的菌落。
⑤辅助质粒的消除
筛选出成功弹出Tet基因的菌落，接种于LB液体培养基（Amp，50 µg/mL）中，放至42℃摇床过夜培养。取过夜培养的菌液，在LB固体平板培养基（Amp，50 µg/mL）中进行划线培养，待长出单菌落后，挑取单菌落在含50 µg/mL Spc抗性和含50 µg/mL Amp的LB固体平板培养基进行对点板实验，对比观察两个培养基中菌落的生长情况，筛选出在含Amp的LB中生长，但在含Spc的LB培养基中不长的菌落，即成功消除辅助质粒的菌落，活化并用甘油管保藏菌株，将分别成功敲除了entB、entD、entE、entF的突变菌株依次记为S1-1、S1-2、S1-3、S1-4。
（3）菌株S1-1、S1-2、S1-3、S1-4摇瓶发酵测试
对上述敲除改造的菌株S1-1、S1-2、S1-3、S1-4进行摇瓶发酵测试，方法及培养基成分均参照实施例3。
结果如图2所示，相比对照菌株S1，改造后的突变菌株S1-1、S1-2、S1-3、S1-4的L-丝氨酸产量分别提升了32.2%、40.9%、46.5%和24.5%，糖酸转化率也由S1的20.4%分别提升至26.9%、28.7%、29.8%和25.4%。
上述结果充分说明抑制entB、entD、entE、entF基因的表达对大肠杆菌L-丝氨酸的合成有促进作用，当分别敲除上述抑制靶点后，大肠杆菌的L-丝氨酸合成的产量和转化率均有较大提升。
实施例5：利用上述突变菌株进行L-丝氨酸发酵生产
（1）从-80 ℃冰箱取出实施例4中保藏的菌株S1-1、S1-2、S1-3、S1-4，先在LB固体平板培养基（Amp，50 µg/mL）中划线并放至37 ℃培养箱进行培养。次日挑取长势良好的单菌落若干再次划线进行传代培养。然后吸取10 mL无菌水到二代培养的固体平板培养基上洗掉全部菌落（无异常菌落），从而获得菌悬液。
（2）将上述菌悬液接种到含有2 L种子培养基的7 L发酵罐中进行种子培养，接种量为0.5-1.0％，培养温度为35-40℃，pH控制在6.5-7.5，溶氧控制在10-30％，残糖控制在0.1-0.3％，培养周期为10-15h。
发酵罐种子培养基组成为：葡萄糖30 g/L、磷酸二氢钾2 g/L、酵母浸粉6 g/L、蛋白胨2 g/L、硫酸铵3 g/L、柠檬酸2 g/L、硫酸镁0.8 g/L、一水合硫酸锰2 mg/L、VB1 1.5 mg/L、VH 2 mg/L、氯化钴2 mg/L、硫酸锌2 mg/L、消泡剂0.5 mL/L、Amp 50 µg/mL。
（3）种子培养完成后，接种到含有2.5 L发酵培养基的7L发酵罐中进行L-丝氨酸发酵，接种量为15-20％，培养温度为35-40℃，pH控制在6.5-7.5，溶氧控制在10-30％，残糖控制在0.1-0.3％，发酵周期为48 h。期间每隔4 h取样一次，用紫外分光光度计检测OD600，并参照实施例3中的方法用高效液相色谱仪检测发酵液中的L-丝氨酸含量。
发酵罐发酵培养基组成：葡萄糖20 g/L、磷酸氢二钾7.5 g/L、酵母浸粉4 g/L、蛋白胨6 g/L、硫酸铵4 g/L、玉米浆5 g/L、柠檬酸2 g/L、硫酸镁1.8 g/L、一水合硫酸锰10mg/L、VB1 1.5 mg/L、VH 2 mg/L、氯化钴2 mg/L、硫酸锌2 mg/L、硫酸铜0.5 mg/L、氯化钙4mg/L、消泡剂0.5 mL/L、Amp 50 µg/mL。
结果如图3和图4所示，在发酵罐放大培养时，相比对照菌株S1，突变菌株S1-1、S1-2、S1-3和S1-4的L-丝氨酸产量分别由57.9 g/L提升到了70.6 g/L、72.3 g/L、74.9 g/L和68.3 g/L，分别提升了24.7 %、27.7 %、32.3 %和20.7%。同时，突变菌株S1-1、S1-2、S1-3和S1-4的糖酸转化率也分别由S1的26.6%分别提升至28.7%、31.3%、33.5%和32.3%。另外，图3还表明，当发酵周期达到菌株生长稳定期后，对照菌株S1发酵体系中L-丝氨酸生产强度相较于突变菌株S1-1、S1-2、S1-3和S1-4呈现下降趋势。
上述结果再次说明，看似与丝氨酸合成毫不相干的肠杆菌素合酶编码基因entB、 entD、entE或entF的表达受到抑制后，大肠杆菌L-丝氨酸的合成得到显著促进，当抑制或敲除entB、entD、entE、entF后，L-丝氨酸的产量和糖酸转化率得到明显提高。这一结果是改造大肠杆菌L-丝氨酸代谢网络的常规思路所无法预测的。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.肠杆菌素合酶编码基因在促进L-丝氨酸发酵生产中的用途，其特征在于，所述促进L-丝氨酸发酵生产是通过抑制或敲除微生物的肠杆菌素合酶编码基因实现的，所述肠杆菌素合酶编码基因选自entB、entD、entE或entF，所述微生物为大肠杆菌。
2.一种促进L-丝氨酸发酵生产的方法，其特征在于，抑制或敲除微生物的肠杆菌素合酶编码基因，所述肠杆菌素合酶编码基因选自entB、entD、entE或entF，所述微生物为大肠杆菌。
3.一种提高大肠杆菌L-丝氨酸产量的方法，其特征在于，抑制或敲除大肠杆菌中的肠杆菌素合酶编码基因，所述肠杆菌素合酶编码基因选自entB、entD、entE或entF。
4.一种突变菌株在发酵生产L-丝氨酸中的用途，其特征在于，所述突变菌株是将大肠杆菌的肠杆菌素合酶编码基因抑制或敲除后而得到的，所述肠杆菌素合酶编码基因选自entB、entD、entE或entF。
5.一种发酵生产L-丝氨酸的方法，其特征在于，使用突变菌株发酵制备L-丝氨酸，所述突变菌株是将大肠杆菌的肠杆菌素合酶编码基因抑制或敲除后而得到的，所述肠杆菌素合酶编码基因选自entB、entD、entE或entF。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，以所述突变菌株作为生产菌株，先进行种子培养，再接种到发酵罐中进行L-丝氨酸发酵培养。
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