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CN118359711B - 一种抗脊髓灰质炎病毒1型抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

一种抗脊髓灰质炎病毒1型抗体及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗体领域，特别是涉及一种抗脊髓灰质炎病毒1型抗体及其制备方法和用途，所述抗PV1抗体具有如下技术特征：重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR‑H1、氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR‑H2、氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的CDR‑H3；轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的CDR‑L1、氨基酸序列如SEQ ID No.9所示的CDR‑L2、氨基酸序列如SEQ ID No.10所示的CDR‑L3。所述抗PV1抗体可以识别两种类型的PV1抗原，且其识别的表位为构象表位，可用于PV1抗病毒药物的开发，亦可在感染PV1的临床诊断以及疫苗生产中作为高效灵敏的检测试剂。

Description

一种抗脊髓灰质炎病毒1型抗体及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及抗体领域，特别是涉及一种抗脊髓灰质炎病毒1型抗体及其制备方法和用途。
背景技术
脊髓灰质炎病毒(Poliovirus，PV)为无囊膜的小RNA病毒，属于肠道病毒属，为无囊膜的二十面体结构，其基因组为单股正链RNA，编码一个开放阅读框，含有结构蛋白P1及非结构蛋白P2和P3。结构蛋白P1可被蛋白酶3CD切割为衣壳蛋白VP0（VP2+VP4）、VP3和VP1，这些衣壳蛋白可与病毒RNA一起组装为成熟病毒颗粒并伴随VP0切割为VP4和VP2。PV其天然培养物中存在两种颗粒，具有感染性成熟病毒颗粒，其免疫原性良好(称为D抗原)和不具感染性的空颗粒，其免疫原性较差（称为C抗原）。PV主要通过粪口途径感染5岁以下儿童，可引起发热、疲乏、头痛、呕吐、颈部僵硬以及四肢疼痛等症状，严重的可导致瘫痪甚至呼吸麻痹死亡。针对脊髓灰质炎尚无有效的治疗手段，只能通过疫苗进行预防。脊灰减毒口服疫苗(Live-attenuated oral PV vaccine，OPV)和脊灰灭活疫苗(Inactivated-PV vaccine，IPV)已用于大规模的全球免疫计划，并最终形成了可行的根除脊髓灰质炎的终极计划。据报道，OPV可通过回复突变或者重组重新获得毒力，从而引起疫苗相关麻痹性脊髓灰质炎(VAPP)或疫苗衍生株相关的脊髓灰质炎流行(cVDPV)。cVDPV的慢性携带者又可作传染源引起进一步的传播。PV可分为3个血清型，即PV1、PV2和PV3，其中野生型PV2和PV3分别于1999年及2020年宣布消灭。近年来，仍有野生型PV1的感染报道，且PV1和PV2的疫苗衍生株的流行亦呈上升趋势。虽然IPV可以避免这一问题，但IPV涉及大量病毒的培养，存在意外释放的风险。因此，需要寻找新的可替代的疫苗来实现全球消灭脊髓灰质炎的计划。因此，为了彻底消灭PV的感染亟需开发不具感染性的新型疫苗。
PV热稳定性较差，加热处理可以使其从紧实的D抗原扩张转换为C抗原，而D抗原含量是PV疫苗的关键质控标准，因此如何鉴定两种类型的抗原，在PV疫苗的研发和生产过程中十分重要。
近年来，制备高效、价廉、副反应小的被动免疫制剂成为预防和治疗该类病毒的研究热点。单克隆抗体的体外抗病毒中和活性和体内保护机体抵抗病毒攻击的能力证明其可以预防和治疗病毒感染，这对推动脊髓灰质炎的临床研究有重要意义，对进一步的流行病学调研以及被动治疗也有极其重要的价值。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种抗脊髓灰质炎病毒1型抗体及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种抗脊髓灰质炎病毒1型（PV1）抗体，所述抗PV1抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述抗PV1抗体具有如下技术特征：
<1> 重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-H1；
<2> 重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-H2；
<3> 重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的CDR-H3；
<4> 轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的CDR-L1；
<5> 轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.9所示的CDR-L2；
<6> 轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.10所示的CDR-L3。
本发明另一方面提供一种分离的多核苷酸，编码所述抗PV1抗体的重链可变区或轻链可变区。
本发明还提供一种核酸构建体，含有所述的分离的多核苷酸。
本发明还提供一种工程化细胞，所述工程化细胞中含有所述的核酸构建体或基因组中整合有外源的所述的多核苷酸。
本发明还提供所述的抗PV1抗体的制备方法，包括如下步骤：培养所述的工程化细胞，使其表达出所述抗PV1抗体，纯化分离出所述抗PV1抗体。
本发明还提供一种用于检测PV1抗原的试剂盒，包含所述抗PV1抗体或其免疫偶联物。
本发明还提供所述抗PV1抗体、所述的分离的多核苷酸、所述的核酸构建体、所述的工程化细胞或所述试剂盒在药物筛选、药物质控或制备诊断或治疗药物中的用途。
本发明还提供所述抗PV1抗体、所述的分离的多核苷酸、所述的核酸构建体、所述的工程化细胞或所述试剂盒在检测PV1的C抗原或D抗原含量中的非疾病诊断的用途。
如上所述，本发明的抗脊髓灰质炎病毒1型抗体及其制备方法和用途，具有以下有益效果：单克隆抗体5C6可以识别两种类型的PV1抗原，5C6单抗不能识别变性后的PV1sVLP，即其识别的表位为构象表位。假病毒中和试验显示其有中和活性，可用于PV1抗病毒药物的开发，亦可在感染PV1的临床诊断以及疫苗生产中作为高效灵敏的检测试剂。
附图说明
图1显示为SDS-PAGE分析单抗5C6的结果图。
图2显示为单抗5C6特异性分析结果。
图3显示为Western blot分析单抗5C6的结果图。
图4显示为PV1单抗小量表达转染上清的结合活性检测。
具体实施方式
本发明提供一种抗脊髓灰质炎病毒1型（PV1）抗体，所述抗PV1抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述抗PV1抗体具有如下技术特征中的一个或多个；
<1> 重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-H1；
<2> 重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-H2；
<3> 重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的CDR-H3；
<4> 轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的CDR-L1；
<5> 轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.9所示的CDR-L2；
<6> 轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.10所示的CDR-L3。
所述抗PV1抗体能够中和脊髓灰质炎病毒1型的D抗原和C抗原。
CDR(互补决定区，complementarity determining region)通常指抗体中在空间结构上可以与抗原决定簇形成互补的区域。抗体中的可变性通常并不均匀地分布在整个抗体的可变区中，单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区通常均具有3 个超变区(hypervariable region，HVR)，这些区域在空间结构上通常可以与抗原决定簇形成互补，所以超变区也被称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)，即重链可变区通常包括三个互补决定区，即CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，轻链可变区通常包括三个互补决定区，即CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在本发明某些实施方式中，所述抗PV1抗体的重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-H2和氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的CDR-H3。
在本发明某些实施方式中，所述抗PV1抗体的轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的CDR-L1、氨基酸序列如SEQ ID No.9所示的CDR-L2和氨基酸序列如SEQ ID No.10所示的CDR-L3。
在本发明某些实施方式中，重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ IDNo.5所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-H2和氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的CDR-H3，轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的CDR-L1、氨基酸序列如SEQ ID No.9所示的CDR-L2和氨基酸序列如SEQ ID No.10所示的CDR-L3。
所述抗PV1抗体为抗体片段，和/或单克隆抗体。进一步的，所述单克隆抗体为IgG2b抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区或可变区。例如，抗体片段包括单链抗体（scFv）、Fab、Fab'、F（ab'）或F（ab'）2。
单链抗体通常可以为包括抗体的VH(重链可变区)和VL(轻链可变区)的多肽链。通常来说，单链抗体还可以包括连接肽(linker)，连接肽通常位于VH和VL之间，以使scFv形成能与抗原结合的期望结构。例如，所述抗PV1抗体可以包括VH和VL，VH和VL之间可以设有连接肽，所述单链抗PV1抗体自N端至C端可以依次包括 VL、连接肽和VH，所述抗PV1单链抗体自N端至C端也可以依次包括VH、连接肽和VL。所述连接肽可以是本领域中各种适用于形成scFv的连接肽，例如，所述连接肽可以是G4S3 linker，所述G4S3 linker的选择或设计可以参考文献Michel Sadelain etc，Science Translational Medicine，2013；Carl H .June etc,Science Translational Medicine ,2015。
“Fab”片段包括轻链的可变区和恒定区，重链的可变区和第一恒定区（CH1）。一个F（ab’）抗体片段包括一对Fab片段，它们通常通过它们之间的铰链半胱氨酸在羧基末端附近共价连接。
在本发明某些实施方式中，所述抗PV1抗体为单克隆抗体，所述单克隆抗体包括恒定区，恒定区可以为天然序列恒定区（例如人天然序列恒定区）或其氨基酸序列变体。
本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即构成该群体的各种抗体是相同的，除了通常以极少量存在的可能的天然存在的突变体。单克隆抗体具有高度特异性，即针对抗原上的单个表位。此外，不同于包含针对不同决定区（表位）的不同抗体的多克隆抗体制剂，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定区。除了它们的特异性外，单克隆抗体的一个优点是，它们现在可以在合成时不受其他抗体的污染。修饰词“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体中获得的抗体的性质，不应解释为需要任何特定的方法来产生抗体。
本文中的单克隆抗体明确地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类型或亚型的相应序列相同或同源，剩余部分与衍生自另一特定物种或属于另一特定抗体类型或亚型的相应序列相同或同源，以及这些抗体的片段，只要它们表现出所需的生物活性即可。
在本发明某些实施方式中，所述抗PV1抗体从杂交瘤细胞株筛选得到，其重链可变区和轻链可变区核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示，重链可变区和轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示。
在本发明某些实施方式中，重链可变区和轻链可变区中还可以包括框架区FR，所述框架区可以位于互补决定区之间，也可以位于互补决定区的两端。在本发明某些具体实施方式中，所述框架区的序列为人源单抗可变区，或为鼠源单抗可变区的框架区序列经过取代、缺失或者添加一个或多个（具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的框架区序列，该框架区序列与人源单抗可变区序列的框架区序列可以具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的同源性。
本发明另一方面提供一种分离的多核苷酸，编码所述抗PV1抗体的重链可变区或轻链可变区。
在本发明的某些实施方式中，所述分离的多核苷酸包括如核苷酸序列SEQ IDNO.11~16所述的核苷酸。
在本发明的某些实施方式中，编码所述抗PV1抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的某些实施方式中，编码所述抗PV1抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供一种核酸构建体，含有所述的分离的多核苷酸。
所述“核酸构建体”是指可以被引入靶细胞或组织中的人工构建的核酸区段，所述核酸构建体可以为各种表达载体, 所述表达载体包括载体骨架即空载体与表达框架。术语“表达框架”是指具有编码蛋白质潜能的序列。
表达载体种类不做具体限定。表达载体是指允许插入外源核苷酸而不破坏载体在宿主细胞中复制和/或整合能力的核酸分子。表达载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。表达载体也可包括一种或多种选择性标记物基因和其他遗传因子。表达载体是包含必需的调控序列以使插入的一个基因或多个基因转录和翻译的载体。表达载体选自真核表达载体或原核表达载体。
原核表达载体选自大肠杆菌表达载体、枯草芽孢杆菌表达载体或链霉菌表达载体。在一较佳实施方式中，所述原核表达载体选自大肠杆菌表达载体。
所述真核表达载体选自酵母表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物表达载体。所述哺乳动物表达载体为非病毒表达载体或病毒表达载体。病毒表达载体选自逆转录病毒表达载体、慢病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体。
所述宿主细胞选自真核宿主细胞或原核宿主细胞。真核宿主细胞选自真菌例如酵母、昆虫、鸟类、植物、秀丽线虫(C.elegans)或线虫类(nematode)或哺乳动物宿主细胞。昆虫细胞的非限制性例子是草地夜蛾(Spodopterafrugiperda,Sf)细胞。酵母宿主细胞的例子是酿酒酵母(S.cerevisiae)，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis,K.lactis)或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。哺乳动物细胞的例子是COS细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠L细胞、LNCaP细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞、非洲绿猴细胞、CV1细胞、Vero或Hep-2细胞。原核宿主细胞的例子包括细菌细胞，例如大肠杆菌、链霉菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)或分枝杆菌(mycobacteria)。
本领域技术人员可根据本领域所熟知的方法将表达载体转染至宿主细胞中获得包含本发明抗体的编码基因的细胞。例如，将表达载体引入真核细胞能通过脂质体转染来进行。
本发明还提供一种工程化细胞，所述工程化细胞中含有所述的核酸构建体或基因组中整合有外源的所述的多核苷酸。
本发明还提供所述的抗PV1抗体的制备方法，包括如下步骤：培养所述的工程化细胞，使其表达出所述抗PV1抗体，纯化分离出所述抗PV1抗体。
本发明还提供一种用于检测PV1抗原的试剂盒，包含所述抗PV1抗体或其免疫偶联物。
所述试剂盒通常以PV1抗原作为靶标进行检测。所述试剂盒还可以包括抗PV1抗体的标记物，所述抗PV1抗体的标记物通常可以用于标记抗PV1抗体，可选用的标记物的种类包括但不限于荧光标记物、放射性标记物、酶标标记物、化学发光性标记物等中的一种或多种的组合。根据试剂盒的检测原理，所述试剂盒通常还可包含检测所需的一种或多种试剂。此外，所述试剂盒中还可根据需要包括：容器、对照物(阴性或阳性对照)、缓冲剂、助剂等，本领域技术人员可根据具体情况对其进行选择。
在一种实施方式中，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒。
在一种实施方式中，所述试剂盒为双抗夹心酶联免疫试剂盒。
本发明还提供所述抗PV1抗体、所述的分离的多核苷酸、所述的核酸构建体、所述的工程化细胞或所述试剂盒在药物筛选、药物质控或制备诊断或治疗药物中的用途。
所述药物可以是以PV1抗原为作用靶标，结合或作用于所述PV1抗原，从而治疗和/或预防适应症的药物。
在本发明某些实施方式中，所述药物筛选、药物质控中的药物可以是脊髓灰质炎治疗药物、脊髓灰质炎诊断药物或脊髓灰质炎预防药物。所述诊断、治疗或预防药物可以是以PV1病毒表面功能性表面的抗原为靶标，结合或作用于抗原，从而诊断、治疗和/或预防脊髓灰质炎的药物。
在本发明某些实施方式中，所述脊髓灰质炎预防药物为疫苗。
所述药物筛选为体外筛选。
所述药物质控例如为药物的体外药效测定。
本发明还提供所述抗PV1抗体、所述的分离的多核苷酸、所述的核酸构建体、所述的工程化细胞或所述试剂盒在检测PV1的C抗原或D抗原含量中的非疾病诊断的用途。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
以下阐述了一种利用重组PV1病毒样颗粒（sVLP）作为免疫原来制备PV1中和性单克隆抗体的方法。经筛选、纯化和鉴定分析，单克隆抗体5C6可以识别两种类型的PV1抗原。Western blots试验显示，5C6单抗不能识别变性后的PV1 sVLP，表明单抗识别的表位为构象表位。假病毒中和试验显示有中和活性。综上，5C6单抗可用于PV1抗病毒药物的开发，亦可在感染PV1的临床诊断以及疫苗生产中作为高效灵敏的检测试剂。
实施例
1.材料与方法
1.1 抗原制备及小鼠免疫
利用毕赤酵母表达系统，采用PV1 Mahoney株、PV2 MEF-1株和PV3 Saukett株的结构蛋白P1（VP0+VP3+VP1）制备表达wtVLP031（以下称wtVLP，为C抗原），并参考文献（PMID:28103317）引入突变位点得到sVLP031（以下称sVLP，为D抗原），具体制备方法可参考专利CN115707778B。
将5μg的PV1 sVLP与60μg铝佐剂混合，混合后的制剂共100μl腹腔免疫6周龄雌性Balb/c小鼠，共免疫3次，两次免疫之间间隔2周。最后一次免疫后2周，尾静脉注射7μg PV1sVLP进行加强免疫。
1.2 杂交瘤细胞株的制备和筛选
小鼠尾静脉加强免疫3天后，将小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0使用PEG1450进行融合以制备杂交瘤细胞。杂交瘤细胞培养9天之后，采用ELISA和假病毒中和实验筛选特异性分泌针对PV1 sVLP的抗体。取单克隆化的杂交瘤细胞上清50μl，根据亚型鉴定试剂盒说明书进行抗体亚型鉴定。
1.3 腹水制备和抗体纯化
雌性Balb/c小鼠腹腔注射500μl液体石蜡油，两周后每只小鼠腹腔注射80万个杂交瘤细胞。1-2周后，用针头收集腹水，4,000rpm 离心10min，去除上层油脂和下层沉淀，取澄清的腹水进行抗体纯化。根据说明书，利用iProtein G Purose 4 Fast Flow亲和柱(千纯生物)纯化腹水获得抗体。
1.4 间接ELISA
用 PV1、PV2和PV3 sVLP或wtVLP包被96孔酶标板酶标板（200ng/孔），4℃孵育过夜；加入5%脱脂牛奶的PBST，37℃封闭1~2个小时；加入待测抗体样品，37℃孵育2小时；接着加入HRP标记的二抗，孵育1小时，最后读取吸光值OD450nm。
1.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳和western blot分析
将蛋白样品与聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）上样缓冲液混合后，煮沸处理5min，经12%聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白样品。通过考马斯亮蓝染色显示蛋白条带或者将蛋白转移到PVDF膜上进行western blot分析。单克隆抗体浓度5μg/mL，兔抗VP1及VP3多克隆抗体1:5000稀释使用，接着用HPR标记的二抗进行孵育，最后用发光图像分析仪进行记录。
1.6 中和实验
假病毒包装：将病毒PV1 Mahoney病毒株（Gene Bank ID：V01149.1）中P1序列替换为GFP并在5‘UTR前加上T7启动子序列，合成后连到pUC57simple中，获得复制子质粒pUC57-PV1M-eGFP（金斯瑞）；Sabin 1病毒株P1序列（Gene Bank ID：AY184219）和dsRed基因序列于金斯瑞合成，将Sabin 1 P1基因连入pcDNA3.3（thermo）中后，再将dsRed连接到P1 N端即得pcDNA3.3-dsRed-Sabin 1 P1；将T7聚合酶（Gene Bank ID：M38308）合成后连接到pcDNA3.3中即得pcDNA3.3-T7。将3μg pcDNA3.3-dsRed-Sabin 1 P1与lipo 3000（Thermo）混合后加到含50~60% 293T细胞6孔板中；1天后再加入1μg pcDNA3.3-T7及2μg pUC57-PV1M-eGFP与lipo 3000（Thermo）的混合物；4天后收获转染物，于-80℃反复冻融3次，离心取上清。取包装的病毒感染293T细胞，19h后计数GFP数，计算出假病毒毒价。
中和滴度测定：将待测样品用含2%FBS的DMEM进行2倍比稀释，取50μl稀释后的血清与等体积含220个PV1假病毒的稀释液混合，设置复孔；37℃孵育2h后，向每孔中加入100ul 1.5×105/mL的293T细胞，37℃、5% CO2培养20h后观察GFP数；将样品可以中和50%假病毒的最高稀释度的倒数定为中和滴度。
1.7单抗可变区基因分离和序列测定
单抗杂交瘤细胞离心收集后，Trizol法抽提RNA，反转录后，利用鼠抗基因调取体系进行可变区基因扩增，正确的扩增产物送测序公司进行测序。
1.8单克隆抗体基因的重组表达鉴定
设计引物采用overlap方法将抗体重链可变区和轻链可变区分别插入pcDNA3.4-mIgG2b-3C-hFc和pcDNA3.4-mIgκ载体中，构建嵌合抗体表达质粒（含可变区和hFc）。
利用脂质体的方法共转染重链和轻链的嵌合抗体表达质粒（各2μg）到293T细胞，48h后收取培养上清进行分析，采用间接ELISA确定培养上清中的抗体的表达。
用PV1 sVLP包板（100ng/孔），4度过夜。细胞转染上清从原液开始2倍梯度稀释，共6个梯度；转染空载上清作为阴性对照；一抗室温孵育2h；二抗G-α-H-HRP （1:8000）或G-α-M-HRP（1:10000），室温孵育1h；显色5min后终止。
2.结果
2.1 分泌PV1特异抗体的杂交瘤细胞的筛选
将免疫了PV1 sVLP小鼠的脾脏细胞与SP2/0细胞融合后制备杂交瘤细胞。通过ELISA筛选杂交瘤细胞上清，从而获得能够分泌具有PV1 sVLP结合能力的杂交瘤细胞株。最终5C6被筛选出来，鉴定信息如表1所示。
表1 分泌单抗的杂交瘤细胞株鉴定
杂交瘤细胞株 重链 轻链 PV1 sVLP结合能力 PV1 wtVLP结合能力 假病毒IC50（μg/mL）
5C6 IgG2b kappa +++ +++ 4.133
注：—：OD450<0.15；+：0.3＞OD450≥0.15； ++：0.5＞OD450≥0.3；+++：OD450≥0.5。
2.2 抗PV1单抗的特异性分析
使用聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）方法鉴定从腹水中纯化的PV1单抗的纯度和完整性。如图1所示，单抗5C6显示了两个条带，大小分别为50kDa和25kDa左右，对应重链和轻链。采用ELISA方法检测了单抗识别PV1 sVLP（D抗原）和wtVLP（C抗原）的特异性，如表1所示，5C6两种抗原均可识别。同时检测了抗体与PV1、PV2和PV3 sVLP反应的特异性，如图2所示，5C6可以特异性识别PV1 sVLP，而不能识别PV2及PV3 sVLP。最后，通过Western blot分析单抗与PV1、PV2和PV3 sVLP的结合情况，如图3所示，5C6单抗不能识别变性后的PV1、PV2和PV3sVLP，提示抗体识别的表位均为构象表位。
2.3 单克隆抗体的中和活性
通过假病毒中和试验对5C6单抗的中和活性进行检测，结果如表1所示，5C6的中和浓度为4.133μg/mL，具有成为PV1抗病毒药物开发、疫苗生产中的检测试剂等的能力。
2.4 5C6单克隆抗体的基因序列分析
经5’RACE技术获得的5C6单抗的重链可变区和轻链可变区序列如下：
5C6单抗重链可变区核苷酸序列：
CAAGTTACTCTAAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGAAGCCCTCACAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGGATGATGATAAGTATTATAACCCATCCCTGAAGAGCCAACTCACAATCTCCAAGGATACATCCAGAAACCAGGTATTCCTCAAAATCACCAGTGTGGGCACTGCAGATACTGCCACTTACTACTGTGCTCGAAGTGAAGGTAACTCCCTCTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA（SEQ IDNO.1）
5C6单抗重链可变区氨基酸序列：
QVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSQLTISKDTSRNQVFLKITSVGTADTATYYCARSEGNSLYYAMDYWGQGTSVTVSS（SEQ ID NO.2）
5C6单抗轻链可变区核苷酸序列：
AGTATTGTGATGACCCAGACTCCCAAATTCCTGCTTGTATCAGCAGGAGACAGGGTTACCATAACCTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTTGATTGGTACCAACAGAAGCCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATATATTATGCATCCAATCGCTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGCTATGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCACTGTGCAGGCTGAGGACCTGGCAGTTTATTTCTGTCACCACCATTATAGCTCTCCGTTCACGTTCGGTGGGGGGACCAAGCTGGAAATG（SEQ ID NO.3）
5C6单抗轻链可变区氨基酸序列：
SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVDWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCHHHYSSPFTFGGGTKLEM（SEQ ID NO.4）
重链可变区属于IGHV8家族，轻链可变区属于IGKV6家族。
各CDR区氨基酸序列和核苷酸序列总结如下：
重链CDR1：
GFSLSTSGMG（SEQ ID NO.5）
GGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGT（SEQ ID NO.11）
重链CDR2：
IWWDDDK（SEQ ID NO.6）
ATTTGGTGGGATGATGATAAG（SEQ ID NO.12）
重链CDR3：
ARSEGNSLYYAMDY（SEQ ID NO.7）GCTCGAAGTGAAGGTAACTCCCTCTACTATGCTATGGACTAC（SEQ ID NO.13）
轻链CDR1：
QSVSND（SEQ ID NO.8）
CAGAGTGTGAGTAATGAT（SEQ ID NO.14）
轻链CDR2：
YAS（SEQ ID NO.9）
TATGCATCC（SEQ ID NO.15）
轻链CDR3：
HHHYSSPFT（SEQ ID NO.10）
CACCACCATTATAGCTCTCCGTTCACG（SEQ ID NO.16）
2.5单抗5C6的重组表达验证
为验证抗体可变区基因是否正确，将5C6的重链和轻链表达质粒共转293T，以空质粒转染作为阴性对照，收集上清用于检测对PV1 sVLP的结合。如图4所示，重组表达的5C6抗体可特异识别PV1 sVLP，说明扩增的5C6序列正确。
本发明成功筛选获得了PV1特异性单克隆抗体5C6，其识别的表位为构象表位。综上，本研究获得的5C6可灵敏的检测PV1 D抗原，可用于临床诊断和疫苗研发和生产的质量控制。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (12)

1.一种抗脊髓灰质炎病毒1型抗体，其特征在于，所述抗脊髓灰质炎病毒1型抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述抗脊髓灰质炎病毒1型抗体具有如下技术特征：
<1> 重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-H1；
<2> 重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-H2；
<3> 重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的CDR-H3；
<4> 轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的CDR-L1；
<5> 轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.9所示的CDR-L2；
<6> 轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.10所示的CDR-L3。
2.根据权利要求1所述的抗脊髓灰质炎病毒1型抗体，其特征在于，所述抗脊髓灰质炎病毒1型抗体为单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的抗脊髓灰质炎病毒1型抗体，其特征在于，所述抗脊髓灰质炎病毒1型抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，和/或，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述分离的多核苷酸编码权利要求1~3任一所述的抗脊髓灰质炎病毒1型抗体。
5.根据权利要求4所述的分离的多核苷酸，其特征在于，所述分离的多核苷酸包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11~16所述的核苷酸。
6.根据权利要求4所述的分离的多核苷酸，其特征在于，所述分离的多核苷酸包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的核苷酸。
7.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体含有权利要求4~6任一所述的分离的多核苷酸。
8.一种工程化细胞，其特征在于，所述工程化细胞中含有权利要求7所述的核酸构建体或基因组中整合有外源的权利要求4~6任一所述的多核苷酸。
9.权利要求1~3任一所述的抗脊髓灰质炎病毒1型抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：培养权利要求8所述的工程化细胞，使其表达出所述抗脊髓灰质炎病毒1型抗体，纯化分离即得到所述抗脊髓灰质炎病毒1型抗体。
10.一种用于检测脊髓灰质炎病毒1型抗原的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1~3任一所述的抗脊髓灰质炎病毒1型抗体或其免疫偶联物。
11.权利要求1~3任一所述的抗脊髓灰质炎病毒1型抗体、权利要求4~6任一所述的分离的多核苷酸、权利要求7所述的核酸构建体、权利要求8所述的工程化细胞或权利要求10所述的试剂盒在制备检测脊髓灰质炎病毒1型的C抗原或D抗原含量的试剂中的用途。
12.权利要求1~3任一所述的抗脊髓灰质炎病毒1型抗体、权利要求4~6任一所述的分离的多核苷酸、权利要求7所述的核酸构建体、权利要求8所述的工程化细胞或权利要求10所述的试剂盒在制备诊断或治疗脊髓灰质炎的药物中的用途。
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