CN118319987A - 皱皮木瓜提取物多酚在制备治疗骨关节炎药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种皱皮木瓜多酚在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。所述皱皮木瓜多酚在制备减少原代软骨细胞中促炎细胞因子和炎症介质NO的释放、和/或降低炎症相关酶的mRNA表达、和/或抑制NF‑κB信号通路相关蛋白的磷酸化的药物中的应用。本发明为了试验并明确皱皮木瓜多酚抗炎作用，构建ADTC5原代软骨细胞炎症模型进行观察。结果表明皱皮木瓜多酚对IL‑1β诱导ADTC5原代软骨细胞炎症有显著抑制作用，可有效降低促炎细胞因子（IL‑6和TNF‑α）的分泌，抑制炎症介质NO的释放，下调炎症酶（iNOS和Cox‑2）的mRNA表达，减少IκBα和p65蛋白的磷酸化。
Description
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及皱皮木瓜提取物多酚在制备治疗骨关节炎药物中的应用。
背景技术
骨关节炎（OA）是一种慢性退行性骨关节疾病，病因复杂，以关节软骨的破坏与退化为主要病理特征，以关节疼痛和运动障碍为主要临床症状，其多发于膝、髋、手和足等关节，常见于肥胖老年人，是危害中老年人健康的重要因素。该病发病主要与年龄、肥胖和遗传等因素有关。该病的发病机制尚不明确，其主要原因为病损关节软骨细胞的炎症损伤，具体表现为软骨细胞中促炎细胞因子的高分泌和炎症酶的高表达以及NF-κB 信号通路相关蛋白的高磷酸化。因此，有充分理由证明减轻关节软骨细炎症损伤同时发挥软骨细胞保护作用，其双重作用使其预防或治疗骨关节炎的功效显著增强。
目前在临床上常见的骨关节炎治疗方案包括手术治疗和非手术治疗，非手术治疗以药物治疗为主，旨在缓解症状，但尚无特效药。当下治疗骨关节炎的常见药物包括非甾体抗炎药（NSAIDS）、激素类药物和麻醉镇静剂等药物。以上药物虽已广泛应用于临床，但因长期使用毒副作用较大，会影响到机体的功能，所以需要一种长期使用无毒副作用的药物来代替经典药物治疗临床上骨关节炎。
木瓜，属于蔷薇科木瓜属植物，包括皱皮木瓜、光皮木瓜、毛叶木瓜等，上述木瓜在我国均有广泛种植，主要分布于湖北省和安徽省等华中地区，具有悠久的种植历史。皱皮木瓜又名资木瓜，为贴梗海棠的干燥果实，味香而酸，性微寒，含有多酚、黄酮、多糖、皂苷、有机酸、萜类化合物等多种活性成分，其中多酚是木瓜中最有效的活性成分，而皱皮木瓜中多酚的含量又明显高于其他种属，因此皱皮木瓜常用做提取木瓜多酚最优质的原料。皱皮木瓜归脾、肺、肝、肾四经，其提取物多酚在中医上具有化湿、消痰、镇痛、消肿、舒筋的功效。同时，其提取物多酚作为天然植物提取物，毒副作用较小，药物残留少，安全性高。迄今为止，尚无皱皮木瓜提取物多酚预防或治疗骨关节炎中的相关报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种皱皮木瓜多酚在制备治疗骨关节炎药物中的应用，皱皮木瓜多酚对骨关节炎有较好的抑制作用，可用于制备治疗骨关节炎药物。
本发明的技术方案是，一种皱皮木瓜多酚在制备治疗骨关节炎药物中的应用。
本发明的第一个目的是提供一种皱皮木瓜多酚在制备治疗骨关节炎药物中的的应用。
所述皱皮木瓜多酚在制备减少原代软骨细胞中促炎细胞因子和炎症介质NO的释放、和/或降低炎症相关酶的mRNA表达、和/或抑制NF-κB 信号通路相关蛋白的磷酸化的药物中的应用。
所述的促炎细胞因子为TNF-α和IL-1，炎症相关酶为iNOS和Cox-2，NF-κB 信号通路相关蛋白为IκBα和 p65。
所述的皱皮木瓜多酚是皱皮木瓜干粉经乙醇溶液浸渍提取、烘干后再经纤维素酶酶解后得到的皱皮木瓜多酚。
所述的乙醇溶液的质量浓度为95%及以上。
纤维素酶的添加量为皱皮木瓜多酚经乙醇浸提后得到的干粉质量的1.0~2.0%；所述酶解温度为50-60℃，酶解pH为4.5-6.0，酶解时间为2-4h。
本发明的第二个目的是提供一种治疗骨关节炎的药物，该药以皱皮木瓜多酚作为活性成分，以及包含所有药学上可接受的辅料或载体。
进一步地，所述药物剂型常为混悬液、胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂、注射剂、气雾剂或其他药学上已被接受的剂型。一般地，口服用药常为胶囊、片剂、丸剂、粉剂等固体制剂，或者是混悬液和糖浆等液体制剂；鼻吸入用药常为气雾剂等气体制剂；静脉注射和肌肉注射常为混悬液和注射剂等液体制剂。
本发明有以下益处：
IL-1β、TNF-α和IL-6是常见的炎症因子，而据报道，IL-1β在患有骨关节炎的动物和人中高表达。IL-1β能刺激原代软骨细胞ADTC5中的促炎细胞因子（TNF-α和IL-6）和炎症介质NO高分泌，且上调炎症酶（iNOS和Cox-2）的mRNA表达，同时促进IκBα和 p65 蛋白的磷酸化，造成原代软骨细胞炎症损伤，从而建造体外骨关节炎模型。因此，我们用IL-1β刺激原代软骨细胞ADTC5，构建体外骨关节炎模型。
目前在临床上常见的骨关节炎治疗方案包括手术治疗和非手术治疗，非手术治疗以药物治疗为主，旨在缓解症状，但尚无特效药。当下治疗骨关节炎的常见药物包括非甾体抗炎药（NSAIDS）、激素类药物和麻醉镇静剂等药物。以上药物虽已广泛应用于临床，但因长期使用毒副作用较大，会影响到机体的功能，所以需要一种长期使用无毒副作用的药物来代替经典药物治疗临床上骨关节炎。基于目前的研究证实，作为一种长期使用无毒副作用且无药物残留的新药物，皱皮木瓜多酚通过减少ADTC5原代软骨细胞中促炎细胞因子（IL-6和TNF-α）和炎症介质ＮＯ的释放，下调炎症酶（iNOS和Cox-2）的mRNA表达，抑制IκBα和 p65蛋白的磷酸化从而发挥良好的抗炎效应，进一步缓解骨关节炎症状。
迄今为止，尚无皱皮木瓜提取物多酚预防或治疗骨关节炎中的相关报道。
本发明为了试验并明确皱皮木瓜多酚抗炎作用，构建ADTC5原代软骨细胞炎症模型进行观察。结果表明皱皮木瓜多酚对IL-1β诱导ADTC5原代软骨细胞炎症有显著抑制作用，可有效降低促炎细胞因子（IL-6和TNF-α）的分泌，抑制炎症介质NO的释放，下调炎症酶（iNOS和Cox-2）的mRNA表达，减少 IκBα和 p65 蛋白的磷酸化。
附图说明
图1是实施例1提取得到皱皮木瓜提取物多酚的氢谱图。
图2是实施例2中皱皮木瓜提取物多酚对细胞细胞活力的影响图。
图3是实施例3中不同浓度IL-1β对ADTC5细胞释放NO的影响图。
图4是实施例4中皱皮木瓜提取物多酚对IL-1β诱导ADTC5细胞释放NO的影响图；其中，与空白对照组相比，####P＜0.0001；与模型组相比，*P＜0.05，****P＜0.0001。
图5是实施例5中皱皮木瓜提取物多酚对IL-1β诱导ADTC5细胞释放TNF-α的影响图；其中，与空白对照组相比，####P＜0.0001；与模型组相比，****P＜0.0001。
图6是实施例5中皱皮木瓜提取物多酚对IL-1β诱导ADTC5细胞释放IL-6的影响图；其中，与空白对照组相比，####P＜0.0001；与模型组相比，***P＜0.005，****P＜0.0001。
图7是实施例6中皱皮木瓜提取物多酚对IL-1β诱导ADTC5细胞iNOS mRNA表达的影响图；其中，与空白对照组相比，####P＜0.0001；与模型组相比，***P＜0.005，****P＜0.0001。
图8是实施例6中皱皮木瓜提取物多酚对IL-1β诱导ADTC5细胞Cox-2 mRNA表达的影响图；其中，与空白对照组相比，####P＜0.0001；与模型组相比，**P＜0.01，****P＜0.0001。
图9是实施例7中皱皮木瓜提取物多酚对IL-1β诱导ADTC5细胞磷酸化p65（p-p65）蛋白水平影响的结果分析图；其中，与空白对照组相比，####P＜0.0001；与模型组相比，***P＜0.005，****P＜0.0001。
图10是实施例7中皱皮木瓜提取物多酚对IL-1β诱导ADTC5细胞磷酸化IκBα（p-IκBα）蛋白水平影响的结果分析图；其中，与空白对照组相比，####P＜0.0001；与模型组相比，**P＜0.01，****P＜0.0001。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明进行详细阐述，下列实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的限定。
实施例1皱皮木瓜多酚的制备与提取
皱皮木瓜干粉的制备：采自湖北省宜昌市长阳县的皱皮木瓜在电热鼓风干燥箱中40℃干燥12h后，用粉碎机粉碎后，过50目筛，得皱皮木瓜干粉备用。
皱皮木瓜干粉的脱脂：取皱皮木瓜干粉 50.00 g，按料液比 1 ∶10加入 95%乙醇，回流 2 h后抽滤除去乙醇，烘干后称重得35.0g脱脂皱皮木瓜粉。
酶解法提取皱皮木瓜多酚：称取5.0 g 上述脱脂皱皮木瓜干粉，按照料液比1:30加入蒸馏水，调节pH值至5，加入1.5%的纤维素酶，在52℃的温度下酶解2.5h后将温度升至80℃，使酶失活，然后冷却后抽滤得到滤液，所得即为皱皮木瓜多酚提取物（并进行如下实施例的试验），该方法获得的皱皮木瓜多酚的含量为150.48 mg /g，得率为15.05%。如图1为提取得到的多酚氢谱图，经验证本实施例提取得到的多酚化学式如下：
式1。
实施例2CCK8法检测皱皮木瓜提取物多酚对ADTC5细胞活性的影响。
用 10%胎牛血清 DMEM 高糖培养基培养ADTC5原代软骨细胞，将其放入含5% CO2的 37°C 细胞培养箱中培养，每天进行一次换液，每1-2天传代一次。以1×104个/孔接种细胞于 96 孔板，每个组设置三个复孔，用0、5、10、20、40、50、100μg/mL皱皮木瓜多酚提取物的基础培养基处理 ADTC5原代软骨细胞。培养细胞 24 h 后，向培养基中加入 10µL CCK-8溶液，置于 37°C 细胞培养箱中培养 1h后，用酶标仪分别在 450 nm 处测量吸光度。根据以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率（%）=（OD实验组-OD空白组/OD对照组-OD空白组）×100
使用不同浓度的皱皮木瓜提取物多酚（结构式如式1所示）处理ADTC5原代软骨细胞24h后，CCK8检测结果如图2所示，皱皮木瓜多酚浓度低于40μg/mL时，细胞的存活率均在95%以上，未见明显细胞毒性；当浓度高于40μg/mL时，细胞存活率明显降低20%左右，对ADTC5原代软骨细胞有较强的毒性作用（图2）。因此，本发明后选择5、10、20μg/mL的实施例1皱皮木瓜提取物多酚进行后续相关实验。
实施例3
用IL-1β处理ADTC5原代软骨细胞建立骨关节炎损伤模型
以1×104个/孔接种细胞于 96 孔板中，5% CO2的 37°C 细胞培养箱中培养24h后，每个组设置三个复孔，用不同浓度IL-1β（3,6,9,12,15,18和21 ng/ml）处理ADTC5细胞，对照组加入等量的基础培养基。培养12h之后，用Griess 试剂盒测定 NO 释放量，比较各组NO生成量，进而确定最佳诱导浓度。
使用不同浓度处理ADTC5原代软骨细胞12h后，检测NO释放量，其结果如图3所示，IL-1β浓度低于12 ng/mL时，NO释放量随着浓度增加而增多；当IL-1β浓度高于12 ng/mL时，过量的IL-1β损伤了ADTC5原代软骨细胞，使其NO释放量出现较为明显的下降趋势。此外，与未经IL-1β处理的对照组相比，12 ng/mLIL-1β处理使ADTC5细胞NO释放量显著增加（图3）。基于以上实验结果证明，12 ng/mL IL-1β为ADTC5细胞炎症损伤模型最佳诱导浓度。
实施例4
皱皮木瓜提取物多酚对ADTC5细胞释放NO的影响
以1×104个/孔接种细胞于 96 孔板中，5% CO2的 37°C 细胞培养箱中培养 24 h后，每组设置三个复孔，药物组加5、10、20μg/mL皱皮木瓜提取物多酚（每组均加入12 ng/mLIL-1β），模型组加入 12 ng/mL IL-1β ，对照组加入等量的基础培养基。培养12h后，收集上清液，用Griess 试剂盒测定 NO 释放量，比较各组NO生成量。
使用不同浓度皱皮木瓜多酚（结构式如式1所示）处理ADTC5细胞24h之后，检测NO释放量，其结果如图4所示，与空白对照组相比，模型组的NO释放量明显升高，说明本实验炎症损伤造模成功；与模型组相比，药物组的NO释放量呈现出显著下降的趋势，且随着皱皮木瓜多酚浓度升高，NO释放量逐渐减少（图4）。以上实验结果说明，皱皮木瓜多酚有效抑制IL-1β诱导ADTC5原代软骨细胞释放NO。
实施例5
皱皮木瓜提取物多酚对ADTC5原代软骨细胞释放促炎细胞因子的影响
以1×104个/孔接种细胞于 96 孔板中，5% CO2的 37°C 细胞培养箱中培养 24 h后，每组设置三个复孔，药物组加入5、10、20μg/mL实施例1 提取得到的皱皮木瓜多酚提取物（每组均加入12 ng/mL IL-1β ），模型组加入 12 ng/mL IL-1β，对照组加入等量的基础培养基。培养12h后，收集上清液。根据 ELISA 试剂盒的说明测定 TNF-α和IL-6 的含量。
使用不同浓度皱皮木瓜多酚（结构式如式1 所示）处理ADTC5原代软骨细胞24h之后，检测促炎细胞因子浓度，其结果如图5和6所示，与空白对照组相比，模型组ADTC5细胞分泌的促炎细胞因子TNF-α和IL-6 的含量均显著升高，这也表明本实验炎症损伤模型建造成功；与模型组相比，药物组ADTC5细胞分泌的促炎细胞因子含量呈明显下降趋势，其中20μg/mL皱皮木瓜多酚对促炎细胞因子释放的抑制率最显著，表现出最理想的抗炎效果（图5和图6）。基于以上实验，本发明得到皱皮木瓜多酚有效抑制IL-1β诱导ADTC5细胞分泌促炎细胞因子。
实施例6
皱皮木瓜提取物多酚对炎症相关酶mRNA表达的影响
以1×104个/孔接种细胞于 96 孔板中，5% CO2的 37°C 细胞培养箱中培养 24 h后，每组设置三个复孔，药物组加入5、10、20μg/mL皱皮木瓜多酚提取物（每组均加入12 ng/mL IL-1β ），模型组加入 12 ng/mL IL-1β，对照组加入等量的基础培养基。培养24h后，弃掉上清液，4°C、2000 r/min 离心10 min ，收集细胞。用 RNA 提取试剂盒提取总 RNA，再使用逆转录试剂盒根据提取的RNA合成 cDNA。该体系PCR 反应条件为：95 ℃ 预变性 30 s，95 ℃ 变性 5 s，60 ℃ 退火延伸 30 s，40 个循环。本发明以GAPDH为内参，采用比较Ct法：2-ΔΔCT计算炎症相关酶mRNA相对表达量。
使用不同浓度的皱皮木瓜提取物多酚（结构式如式1所示）处理ADTC5细胞24h之后，RT-qPCR法检测炎症酶mRNA的相对表达量，其结果如图8和9与空白对照组相比，模型组ADTC5细胞的炎症酶iNOS和Cox-2 mRNA表达量有大幅度的上升，这表明在IL-1β刺激下，ADTC5细胞炎症酶活性显著增加，从而促进炎症的发展，也充分证实了本发明炎症损伤模型建造成功；与模型组相比，药物组ADTC5细胞的炎症酶iNOS和Cox-2 mRNA表达量呈现明显下调趋势，其中20μg/mL皱皮木瓜多酚对炎症酶iNOS和Cox-2 mRNA表达抑制作用最显著，这也表明20μg/mL可能是抗炎效果最明显的药物浓度（图7和图8）。基于上述实验结果，皱皮木瓜提取物多酚有效抑制炎症酶mRNA的表达。
实施例 7
皱皮木瓜提取物多酚对NF-κB 信号通路相关蛋白的影响
以1×104个/孔接种细胞于 96 孔板中，5% CO2的 37°C 细胞培养箱中培养 24 h后，每组设置三个复孔，药物组加入5、10、20μg/mL皱皮木瓜多酚提取物（每组均加入12 ng/mL IL-1β），模型组加入12 ng/mL IL-1β，对照组加入等量的基础培养基。培养24h后，弃掉上清液，4°C、5000 r/min 离心10min，收集细胞。向细胞中加入合适体积的细胞裂解液，4℃裂解 40min，4℃、10000 r/min离心 20min，收集上清液后，用 BCA 蛋白试剂盒对提取蛋白的总量进行定量测定。再采用Western Blot方法检测 IκBα和p65两种蛋白及磷酸化蛋白的表达水平。
使用不同浓度皱皮木瓜提取物多酚（结构式如式1所示）处理ADTC5细胞24h之后，Wetern Blot法检测NF-κB 信号通路相关蛋白表达量，其结果如图10所示，与空白对照组相比，模型组ADTC5细胞在IL-1β刺激下，IκBα和 p65 的磷酸化水平分别增加了 4.4 和 5.1倍；与模型组相比，药物组ADTC5细胞IκBα和 p65 的磷酸化水平显著下降，其中20μg/mL皱皮木瓜多酚对IκBα和 p65 的磷酸化水平的抑制效果最明显（图9和图10），与上述实施例中抗炎最佳浓度一致。基于以上实验，本发明得到皱皮木瓜提取物多酚有效抑制NF-κB 信号通路相关蛋白的表达。
综上，本发明提供了一种皱皮木瓜提取物多酚在治疗骨关节炎药物制备中的应用。该皱皮木瓜提取物多酚能有效减少原代软骨细胞中促炎细胞因子（TNF-α和IL-1）和炎症介质NO的释放，降低炎症相关酶（iNOS和Cox-2）的mRNA表达，抑制NF-κB 信号通路相关蛋白（IκBα和 p65）的磷酸化，减轻软骨细胞炎症损伤，保护软骨细胞，可有效预防和治疗骨关节炎。本发明提供的皱皮木瓜提取物多酚在制备安全且活性高的治疗骨关节炎药物方面前景广阔。
以上实施例为本发明效果较佳的实施方式，但上述实施例并不限制本发明的实施方式，其他任何合理且未脱离本发明的原理和实质的实施方法均在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种皱皮木瓜多酚在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述皱皮木瓜多酚在制备减少原代软骨细胞中促炎细胞因子和炎症介质NO的释放、和/或降低炎症相关酶的mRNA表达、和/或抑制NF-κB 信号通路相关蛋白的磷酸化的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的促炎细胞因子为TNF-α和IL-1，炎症相关酶为iNOS和Cox-2，NF-κB 信号通路相关蛋白为IκBα和 p65。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述的皱皮木瓜多酚是皱皮木瓜干粉经乙醇溶液浸渍提取、烘干后再经纤维素酶酶解后得到的皱皮木瓜多酚。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的乙醇溶液的质量浓度为95%及以上。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，纤维素酶的添加量为皱皮木瓜多酚经乙醇浸提后得到的干粉质量的1.0~2.0%；所述酶解温度为50-60℃，酶解pH为4.5-6.0，酶解时间为2-4h。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，皱皮木瓜多酚的浓度为5-20μg/mL。
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