CN118112247B - 一种化学发光微流控芯片及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种化学发光微流控芯片及其检测方法，包括基片、盖片，所述基片与所述盖片围合形成微通道，所述微通道包括辅助加样区、反应区、控制区，所述辅助加样区、反应区、控制区沿所述微通道长度方向依次连通，所述控制区设置有控制阀，所述反应区包括标记区、检测区、参考区、样本加样区，所述标记区、检测区、参考区、样本加样区沿反应区长度方向依次设置，所述反应区上还设置有空白区，所述空白区、检测区、参考区均设置有微电极，使用该芯片进行检测，将化学发光应用到微流控芯片内，增加了反应的灵敏度，同时可以对反应过程产生的可见光直接进行检测，降低了检测的成本。

Description

一种化学发光微流控芯片及其检测方法

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及一种化学发光微流控芯片及其检测方法。

背景技术

微流控芯片是微流控技术实现的主要平台，可以把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块很小的芯片上。通过微通道自动完成分析全过程，用以实现常规化学或生物实验室的各种功能。微流控芯片具有体积轻巧、使用样品及试剂量少，且反应速度快、可大量平行处理及可即用即弃等优点，在生物、化学、医学等领域有巨大潜力，近年来已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。

现有的微流控芯片多采用荧光微球标记法进行检测，需要采用荧光分析仪对检测结果进行检测，而不同种类的荧光微球需要采用不同的激发光进行激发，需要采用适配的检测仪器进行检测，造成检测成本的增加，同时荧光微球标记法的灵敏度不够高，对于某些需要较高灵敏度的检测，则会产生误差，造成检测结果的不准确。

化学发光免疫分析是将化学发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术，具有选择性好、灵敏度高、特异性强、无放射性危害、分析速度快等优点，在环境、临床、食品、药物检测等领域得到了广泛应用，成为免疫分析方法的研究热点和发展趋势。

常用的化学发光反应包括化学发光酶免疫分析和直接化学发光免疫分析，化学发光酶免疫分析是利用标记酶（辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的催化作用，来标记抗原或抗体，进行的抗原抗体反应，反应后形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体的复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，计算出测定物的浓度，辣根过氧化物酶催化的发光底物为鲁米诺及其衍生物，碱性磷酸酶催化的发光底物为AMPPD；直接化学发光免疫分析是用化学发光剂(如吖啶酯)直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体一待测抗原一吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂(H₂O₂)和纠正液(NaOH)使进行发光，就可通过结合状态发光强度的测定进行定量或定性分析。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种化学发光微流控芯片，用于解决上述背景技术中提出的技术问题。

为实现上述目的，本发明的技术方案是这样实现的，一种化学发光微流控芯片，包括基片、盖片，所述基片与所述盖片围合形成微通道，所述微通道包括辅助加样区、反应区、控制区，所述辅助加样区、反应区、控制区沿所述微通道长度方向依次连通，所述控制区设置有控制阀，所述控制阀能够接触或远离所述微通道，所述控制阀控制所述反应区内的液体向控制区的流动，所述反应区包括标记区、检测区、参考区、样本加样区，所述标记区、检测区、参考区、样本加样区在反应区沿所述微通道长度方向依次设置，所述反应区上还设置有空白区，所述空白区设置在标记区与样本加样区之间，所述空白区、检测区、参考区下方均设置有微电极，所述微电极在对应位置嵌入所述基片下表面，所述标记区包被有化学发光剂标记的抗体，所述标记区抗体能够与靶分析物中的抗原结合，所述检测区包被有能够与靶分析物结合的抗体，所述参考区包被有能够与标记区抗体结合的二抗。

进一步的，所述化学发光剂为酶促发光酶、吖啶酯中的一种。

进一步的，所述盖片下表面沿其长度方向设置有凹槽，所述凹槽与所述基片上表面围合形成所述微通道。

更进一步的，所述空白区设置在所述标记区与所述检测区之间。

更进一步的，所述盖片上表面涂覆有遮光性材料，所述盖片上表面对应所述空白区、检测区、参考区的位置有不涂覆遮光性材料的透光区，所述透光区为圆形。

更进一步的，所述辅助加样区设置有将所述盖片上下表面相连通的辅助加样孔，所述样本加样区设置有将所述盖片上下表面相连通的样本加样孔。

更进一步的，所述控制阀为可移动的吸水性材料，所述吸水性材料能够接触或远离微通道。

一种化学发光微流控芯片的检测方法，应用上述的化学发光微流控芯片进行检测，采用双抗体夹心模式，包括至少如下步骤：

1）使控制阀脱离微通道，将一定体积的待测样本注入样本加样区，样本在毛细管力的作用下流入微通道并向检测区方向流动，停留3-5 min使反应充分进行，若样本中含有目标抗原，则可被检测区包被的抗体捕获，形成抗体-目标抗原复合物，反应结束后，使控制阀接触到微通道，则未反应的多余样本向控制区流动；

2）使控制阀脱离微通道，将缓冲液通过辅助加样区加入，使缓冲液向标记区方向流动并溶解标记区包被的抗体，然后带动溶解后的标记区抗体继续流动，于检测区形成抗体-目标抗原-标记抗体复合物，未结合的标记抗体随液体继续流动，至参考区被相应物质捕获，反应结束后，使控制阀接触到微通道，则多余液体持续洗涤微通道并进入控制区；

3）根据标记区标记物的类型在辅助加样区中加入对应的发光底物或氧化剂，根据反应需要用微电极调整空白区、检测区、参考区的温度，使发光底物或氧化剂依次流入空白区、检测区、参考区，则发光底物或氧化剂与标记物结合后发光；

4）通过检测仪持续收集空白区、检测区、参考区的信号值，直到反应结束；

5）获取校准函数；

6）通过校准函数获取待测样本中靶分析物的浓度。

通过上述技术方案得到的一种化学发光微流控芯片，其有益效果是：

1、将化学发光应用到微流控芯片内，增加了反应的灵敏度，同时可以对反应过程产生的可见光直接进行检测，降低了检测的成本。

2、在检测区中设置空白区，可以消除芯片内非特异性的发光的干扰，使检测结果更准确。

3、空白区、检测区、参考区下方均设置有微电极，可以根据化学发光的反应条件调节所需温度，使化学发光反应更充分。

4、通过在盖片上表面涂覆遮光性材料并留出透光区，可以对单个区域所发出的光值进行检测，挡住其他位置光的散射，提高检测结果的准确性。

附图说明

图1是本发明所述盖片下表面的结构示意图；

图2为本发明所述盖片上表面的结构示意图；

图3为本发明所述基片下表面的结构示意图；

图4是本发明所述化学发光微流控芯片的侧视剖面结构示意图；

图5是本发明的一个实施例中化学发光微流控芯片的结构示意图；

图6是本发明在图5的芯片中将待检抗原加入样本加样区的原理图；

图7是本发明在图6的芯片中将缓冲液加入缓冲液加样区的原理图；

图8是本发明在图7的芯片中将发光底物（鲁米诺）加入缓冲液加样区的原理图。

图中，1、基片；2、盖片；3、微通道；4、微电极；21、透光区；22、辅助加样孔；23、样本加样孔；31、辅助加样区；32、反应区；33、控制区；32a、标记区；32b、检测区；32c、参考区；32d、样本加样区；32e、空白区。

具体实施方式

下面结合附图来对本发明进行详细说明。

如图1、图3-4所示，一种化学发光微流控芯片，包括基片1、盖片2，所述基片1与所述盖片2围合形成微通道3，所述微通道3包括辅助加样区31、反应区32、控制区33，所述辅助加样区31、反应区32、控制区33沿所述微通道3长度方向L依次连通，所述控制区33设置有控制阀，所述控制阀能够接触或远离所述微通道3，所述控制阀控制所述反应区32内的液体向控制区33的流动，所述反应区32包括标记区32a、检测区32b、参考区32c、样本加样区32d，所述标记区32a、检测区32b、参考区32c、样本加样区32d在反应区32沿所述微通道3长度方向L依次设置，所述反应区32上还设置有空白区32e，所述空白区32e设置在标记区32a与样本加样区32d之间，所述空白区32e、检测区32b、参考区32c下方均设置有微电极4，所述微电极4在对应位置嵌入所述基片1下表面，所述标记区32a包被有化学发光剂标记的抗体，所述标记区抗体能够与靶分析物中的抗原结合，所述检测区32b包被有能够与靶分析物结合的抗体，所述参考区32c包被有能够与标记区抗体结合的二抗。

所述化学发光剂为酶促发光酶、吖啶酯中的一种，所述酶促发光酶包括但不限于辣根过氧化物酶HRP（或碱性磷酸酶AP）。

具体的，所述盖片2下表面沿其长度方向设置有凹槽，所述凹槽与所述基片1上表面围合形成所述微通道3。

具体的，所述空白区32e设置在所述标记区32a与所述检测区32b之间。

如图2所示，所述盖片2上表面涂覆有遮光性材料，所述盖片2上表面对应所述空白区32e、检测区32b、参考区32c的位置有不涂覆遮光性材料的透光区21，所述透光区21为圆形。

具体的，所述辅助加样区31设置有将所述盖片2上下表面相连通的辅助加样孔22，所述样本加样区32d设置有将所述盖片2上下表面相连通的样本加样孔23。

具体的，所述控制阀为可移动的吸水性材料，所述吸水性材料能够接触或远离微通道3，当吸水性材料接触微通道3时，微通道3内的液体流入控制区33，当吸水性材料远离微通道3时，微通道3内的液体不流入控制区33。

一种化学发光微流控芯片的检测方法，应用上述的化学发光微流控芯片进行检测，采用双抗体夹心模式，包括至少如下步骤：

1）使控制阀脱离微通道，将一定体积的待测样本注入样本加样区，样本在毛细管力的作用下流入微通道并向检测区方向流动，停留3-5 min使反应充分进行，若样本中含有目标抗原，则可被检测区包被的抗体捕获，形成抗体-目标抗原复合物，反应结束后，使控制阀接触到微通道，则未反应的多余样本向控制区流动；（此步骤需根据待测样本的类型和粘稠度等参数，对加样量进行调整，以确保样本不会流到标记区。）

2）使控制阀脱离微通道，将缓冲液通过辅助加样区加入，使缓冲液向标记区方向流动并溶解标记区包被的抗体，然后带动溶解后的标记区抗体继续流动，于检测区形成抗体-目标抗原-标记抗体复合物，未结合的标记抗体随液体继续流动，至参考区被相应物质捕获，反应结束后，使控制阀接触到微通道，则多余液体持续洗涤微通道并进入控制区；

3）根据标记区标记物的类型在辅助加样区中加入对应的发光底物（或氧化剂），根据反应需要用微电极调整空白区、检测区、参考区的温度，使发光底物（或氧化剂）依次流入空白区、检测区、参考区，则发光底物（或氧化剂）与标记物结合后发光；（酶免反应的化学发光反应加入对应的发光底物，直接化学发光反应则加入对应的氧化剂和纠正液。）

4）通过检测仪持续收集空白区、检测区、参考区的信号值，直到反应结束；

5）获取校准函数：将含有靶分析物的系列浓度标准品溶液通过上述步骤进行检测，分别获取标准品溶液在空白区信号值A、检测区信号值T、参考区信号值R，得到检测信号值：（T-A）/（R-A），以检测信号值为纵坐标、标准品溶液浓度为横坐标，获取校准函数；

6）通过校准函数获取待测样本中靶分析物的浓度。

实施例

1. 芯片制备

1）芯片盖片的制作

微流控芯片的制作采用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)材料，芯片盖片的微通道结构采用CAD软件进行设计，随后用激光刻蚀机加工制造而成。在盖片上表面对应于空白区、检测区、参考区的位置固定直径2 mm的圆形薄膜，之后对盖片上表面进行喷墨处理，最后移去空白区、检测区、参考区的圆形薄膜，则芯片上盖制备完成，它的特点是只有空白区、检测区、参考区是可透光的，而其他区域均涂覆了不透光材料。

2）芯片表面改性处理

采用常规方式，如等离子体处理方式对芯片盖片下表面及基片上表面进行改性处理，将原本较为疏水的表面改性为亲水的表面。

3）生物芯片的制作

首先在基片的检测区和参考区分别点样链霉亲和素，孵育1h后，洗去未参与反应的链霉亲和素，如图5所示，之后于检测区、参考区分别点样生物素化抗人IgE抗体、生物素化纯化人IgE，继续孵育1h，再次清洗基片后，于标记区点样HRP-抗人IgE抗体溶液，室温干化。

4）化学发光微流控芯片的组装

将生物芯片和带通道结构的芯片盖片紧密贴合，并用丙酮键合，至此芯片制备完成。

2. 检测程序

1）如图6所示，向右移动控制区的控制阀，使其远离微通道，之后将5 μl待测血清样本注入样本加样孔，样本在微通道内向左流动，反应5 min后，向左移动控制阀，使其嵌入微通道，则微通道中的液体向控制区流动。

2）如图7所示，向右移动控制区的控制阀，使其远离微通道，之后将35 μl缓冲液注入辅助加样孔，缓冲液在微通道内向右流动，反应5 min后，向左移动控制阀，使其嵌入微通道，则多余缓冲液持续洗涤微通道并进入控制区。

3）如图8所示，避光条件下，于辅助加样孔注入10 μl HRP的发光底物溶液（鲁米诺）并启动空白区、检测区、参考区下方的微电极，37℃反应3min。

4）通过检测仪内部的CCD相机捕获空白区、检测区、参考区的发光信号并成像，随后分析各区的灰度值，获取空白区信号值A、检测区信号值T、参考区信号值R最终检测信号值以(T-A) / (R-A)表示，并通过预制的校准曲线量化标本中tIgE浓度。

3. 检测结果

上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”等的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“设置”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接连接，也可以通过中间媒介间接连接，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以通过具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

Claims (7)

1.一种化学发光微流控芯片，包括基片（1）、盖片（2），所述基片（1）与所述盖片（2）围合形成微通道（3），所述微通道（3）包括辅助加样区（31）、反应区（32）、控制区（33），所述辅助加样区（31）、反应区（32）、控制区（33）沿所述微通道（3）长度方向（L）依次连通，所述控制区（33）设置有控制阀，所述控制阀能够接触或远离所述微通道（3），所述控制阀控制所述反应区（32）内的液体向控制区（33）的流动，所述反应区（32）包括标记区（32a）、检测区（32b）、参考区（32c）、样本加样区（32d），所述标记区（32a）、检测区（32b）、参考区（32c）、样本加样区（32d）在反应区（32）沿所述微通道（3）长度方向（L）依次设置，其特征在于，所述反应区（32）上还设置有空白区（32e），所述空白区（32e）设置在标记区（32a）与样本加样区（32d）之间，所述空白区（32e）、检测区（32b）、参考区（32c）下方均设置有微电极（4），所述微电极（4）在对应位置嵌入所述基片（1）下表面，所述标记区（32a）包被有化学发光剂标记的抗体，所述化学发光剂为酶促发光酶、吖啶酯中的一种，所述酶促发光酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，所述标记区（32a）抗体能够与靶分析物中的抗原结合，所述检测区（32b）包被有能够与靶分析物结合的抗体，所述参考区（32c）包被有能够与标记区（32a）抗体结合的二抗。

2.根据权利要求1所述的一种化学发光微流控芯片，其特征在于，所述盖片（2）下表面沿其长度方向设置有凹槽，所述凹槽与所述基片（1）上表面围合形成所述微通道（3）。

3.根据权利要求1所述的一种化学发光微流控芯片，其特征在于，所述空白区（32e）设置在所述标记区（32a）与所述检测区（32b）之间。

4.根据权利要求1所述的一种化学发光微流控芯片，所述盖片（2）上表面涂覆有遮光性材料，所述盖片（2）上表面对应所述空白区（32e）、检测区（32b）、参考区（32c）的位置有不涂覆遮光性材料的透光区（21），所述透光区（21）为圆形。

5.根据权利要求1所述的一种化学发光微流控芯片，所述辅助加样区（31）设置有将所述盖片（2）上下表面相连通的辅助加样孔（22），所述样本加样区（32d）设置有将所述盖片（2）上下表面相连通的样本加样孔（23）。

6.根据权利要求1所述的一种化学发光微流控芯片，所述控制阀为可移动的吸水性材料，所述吸水性材料能够接触或远离微通道（3）。

7.一种化学发光微流控芯片的检测方法，应用如权利要求1-6任一项所述的化学发光微流控芯片进行检测，采用双抗体夹心模式，包括至少如下步骤：

1）使控制阀脱离微通道，将待测样本注入样本加样区，样本在毛细管力的作用下流入微通道并向检测区方向流动，停留3-5 min使反应充分进行，若样本中含有目标抗原，则可被检测区包被的抗体捕获，形成抗体-目标抗原复合物，反应结束后，使控制阀接触到微通道，则未反应的多余样本向控制区流动；

2）使控制阀脱离微通道，将缓冲液通过辅助加样区加入，使缓冲液向标记区方向流动并溶解标记区包被的抗体，然后带动溶解后的标记区抗体继续流动，于检测区形成抗体-目标抗原-标记抗体复合物，未结合的标记抗体随液体继续流动，至参考区被相应物质捕获，反应结束后，使控制阀接触到微通道，则多余液体持续洗涤微通道并进入控制区；

3）根据标记区标记物的类型在辅助加样区中加入对应的发光底物或氧化剂，酶免反应的化学发光反应加入对应的发光底物，直接化学发光反应则加入对应的氧化剂和纠正液，根据反应需要用微电极调整空白区、检测区、参考区的温度，使发光底物或氧化剂依次流入空白区、检测区、参考区，则发光底物或氧化剂与标记物结合后发光；

4）通过检测仪持续收集空白区、检测区、参考区的信号值，直到反应结束；

5）获取校准函数：将含有靶分析物的系列浓度标准品溶液通过上述步骤进行检测，分别获取标准品溶液在空白区信号值A、检测区信号值T、参考区信号值R，得到检测信号值：（T-A）/（R-A），以检测信号值为纵坐标、标准品溶液浓度为横坐标，获取校准函数；

6）通过校准函数获取待测样本中靶分析物的浓度。