CN117586359A - 一种具有免疫原性的呼吸道合胞病毒（rsv）多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有免疫原性的呼吸道合胞病毒（RSV）多肽，涉及生物医药技术领域。本发明利用RSV F蛋白重组的胞外域，成功构建表达了稳定的融合前F蛋白，通过不同二硫键的突变设计加强融合前构象的F蛋白的稳定性，本发明所获得的抗原及其制备的疫苗表达量高，稳定性好，免疫原性强。
Description
技术领域
本申请属于生物医药技术领域，特别涉及一种具有免疫原性的呼吸道合胞病毒（RSV）多肽及其制备方法和在制备预防RSV感染的疫苗中的应用。
背景技术
呼吸道病毒感染是全球最重要的公共卫生负担之一，每年导致全世界数百万人住院治疗。呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）是2岁以下儿童和65岁以上成人急性下呼吸道感染的主要原因。尽管RSV感染引起的呼吸道疾病危害严重，但目前尚无专门针对RSV的有效治疗方法和预防性疫苗。纵观全球进入临床阶段的RSV疫苗，研发的主要方向集中在减毒活疫苗、重组亚单位疫苗和病毒载体疫苗。RSV疫苗开发主要针对3种目标人群，包括婴幼儿、孕妇和老年人（≥60岁）。年龄小于6个月的婴儿，主要通过mAbs实现被动免疫保护，或由孕妇接种RSV疫苗后经胎盘转移抗体来获得被动保护；对于年龄大于6个月的婴幼儿则可以通过主动免疫RSV减毒活疫苗来获得保护；针对孕妇和老年人，RSV疫苗的开发以亚单位疫苗为主。
主流疫苗抗原的选择主要集中在F蛋白，尤其是融合前构象的F蛋白（PreF）。融合前构象的F蛋白相比融合后构象的F蛋白可以暴露更多具有中和活性的潜在表位，如仅在PreF中存在的表位Φ和表位V。针对表位Φ和表位V产生的抗体具有优秀的中和活性，与融合前构象的F蛋白结合后，可以阻断通过F蛋白构象变化介导的病毒膜融合。尽管已有大量关于RSV F蛋白融合前构象稳定性的研究，但其作为疫苗使用的安全性和有效性仍面临巨大的挑战。
因此，提供一种安全性高且具有增强的免疫原性和改善的稳定性的RSV抗原，以及包含其的疫苗成为本领域技术人员急需解决的技术问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种具有免疫原性的呼吸道合胞病毒（RSV）多肽。
一方面，本发明公开一种具有免疫原性的呼吸道合胞病毒（RSV）多肽，包含RSV F蛋白重组胞外域，对应于SEQ ID NO:1所示野生型RSV F蛋白序列的26-513位氨基酸残基，相比于野生型RSV F蛋白包含分子间半胱氨酸取代突变，其中分子间半胱氨酸取代突变选自K75C+E218C、S146C+N460C和A149C+Y458C中的1对或2对，优选分子间半胱氨酸取代突变K75C+E218C。
本发明公开一种具有免疫原性的呼吸道合胞病毒（RSV）多肽，包含RSV F蛋白重组胞外域，对应于SEQ ID NO:1所示野生型RSV F蛋白序列的26-513位氨基酸残基，其中所述重组胞外域可以优选包含3类半胱氨酸取代突变，所述半胱氨酸取代突变使得在引入的半胱氨酸残基之间形成二硫键，该二硫键用于稳定蛋白的构型或寡聚状态，诸如融合前构型，其中至少一类为分子间半胱氨酸取代突变，选自K75C+E218C、S146C+N460C和A149C+Y458C中的1对或2对，优选K75C+E218C。另一类是N类半胱氨酸取代突变，所述N类半胱氨酸取代的位点在野生型RSV F蛋白氨基酸序列的残基1-300之间，包括1对或2对半胱氨酸取代；第三类是C类半胱氨酸取代突变，所述C类半胱氨酸取代的位点在野生型RSV F蛋白氨基酸序列的残基320-500之间，包括1对或2对半胱氨酸取代。
本发明技术方案中所述N类半胱氨酸取代突变选自I148C+Y286C、S55C+L188C、H159C+I291C和G151C+I288C中一对或两对。
本发明技术方案中所述C类半胱氨酸取代突变选自K399C+S485C、S443C+S466C、T323C+I475C、I332C+P480C或F387C+I492C。
本发明技术方案中所述的多肽，其中所述重组胞外域包含如下半胱氨酸取代突变的组合方案之一：
A、K75C+E218C、I148C+Y286C和F387C+I492C；
B、K75C+E218C、I148C+Y286C、T323C+I475C；
C、K75C+E218C、I148C+Y286C、S433C+S466C；
D、K75C+E218C、I148C+Y286C、K399C+S485C；
E、K75C+E218C、G151C+I288C、K399C+S485C；
F、K75C+E218C、H159C+I291C、K399C+S485C。
本发明技术方案中所述的多肽，其中所述重组胞外域还包含空腔填充突变，所述空腔填充突变位点选自野生型RSV F蛋白氨基酸序列的67、495、296和190位中的一个、两个、三个或四个。
在一些实施方式中，优选的空腔填充突变是N67F，在另一些实施方式中，优选的空腔填充突变是N67F+S190V+V296F+V495L。
本发明技术方案中所述的多肽，其中所述重组胞外域还包含增加表达量的突变P102A+I379V+M447V、S46G或G184N。
本发明中所述的重组胞外域包含只存在于融合前构象中的表位，所述表位包含以SEQ ID NO: 1所示的野生型RSV F蛋白序列的残基62-69和196-209。
本发明技术方案中所述的多肽，其中所述重组胞外域包括至少包含RSV F蛋白的26-105位氨基酸残基的重组F2域和至少包含RSV F蛋白的145-513位氨基酸残基的重组F1域。
本发明技术方案中所述的多肽，其中所述重组F2域与重组F1域直接或通过linker连接。
在一些实施方式中，其中所述重组F2域与重组F1域通过linker连接是指F2域C端与F1域N端被linker连接，例如将F蛋白重组胞外域的106-144位残基被选自GGPGGS、GAPEPGE或GGSGGSG的linker序列取代。
在一些实施方式中，其中所述多肽的C端包括多聚化结构域。
在一些实施方式中，其中所述多聚化结构域位于所述重组胞外域的C端，与重组胞外域的C端直接相连或通过接头序列相连。
在一些实施方式中，可选地，所述接头序列为GGGSSGS、GSGSG或G与S组成的4-10个氨基酸序列。
在一些实施方式中，其中所述多聚化结构域是三聚化结构域，三聚化结构域促进形成3个F1/F2异二聚体的三聚体。
在一些实施方案中，其中所述多聚化结构域是可实现更多聚的结构域，例如可自组装形成二十四聚体的铁蛋白。
在一些实施方式中，多聚化结构域优选foldon结构域或ferritin结构域。
在本申请中，“ferritin”是指粉纹夜蛾铁蛋白或幽门螺旋杆菌铁蛋白。在本申请中，幽门螺旋杆菌铁蛋白具有单链结构。在本申请中，铁蛋白可以是粉纹夜蛾或幽门螺旋杆菌铁蛋白的突变体。在本申请中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。示例性的，本申请中使用的ferritin氨基酸序列为ESQVRQQFSKDIEKLLNEQVNKEMQSSNLYMSMSSWCYTHSLDGAGLFLFDHAAEEYEHAKKLIIFLNENNVPVQLTSISAPEHKFEGLTQIFQKAYEHEQHISESINNIVDHAIKSKDHATFNFLQWYVAEQHEEEVLFKDILDKIELIGNENHGLYLADQYVKGIAKSRKS。
在一些实施方式中，其中所述重组胞外域包括RSV F蛋白的F2域或其功能活性片段以及F1域或其功能活性片段。
在一些实施方式中，所述F2域包含与SEQ ID NO:1的氨基酸26-105对应的RSV F蛋白多肽，所述F1域包含与SEQ ID NO:1的氨基酸137-516对应的RSV F蛋白多肽。
在一些实施方式中，其中所述重组胞外域包括至少包含RSV F蛋白的26-105位氨基酸残基的重组F2域和至少包含RSV F蛋白的145-513位氨基酸残基的重组F1域。
在一些实施方式中，其中所述重组胞外域包括包含RSV F蛋白的26-105位氨基酸残基的重组F2域和包含RSV F蛋白的145-513位氨基酸残基的重组F1域。
在一些实施方式中，其中所述重组F2域和重组F1域之间通过接头序列相连。
在一些实施方式中，其中所述重组F2域和重组F1域之间通过GGGSSGS、GSGSG、GGPG或G与S组成的4-10个氨基酸残基的接头序列相连。
在一些实施方式中，其中所述G与S组成的4-10个氨基酸残基的接头序列，可选的为GGSGGSG。
在一些实施方式中，其中所述重组胞外域包括至少包含RSV F蛋白的26-103位氨基酸残基的重组F2域和至少包含RSV F蛋白的146-513位氨基酸残基的重组F1域。
在一些实施方式中，其中所述重组胞外域包括包含RSV F蛋白的26-103位氨基酸残基的重组F2域和包含RSV F蛋白的145-513位氨基酸残基的重组F1域。
在一些实施方式中，其中所述重组胞外域包括包含RSV F蛋白的26-103位氨基酸残基的重组F2域和包含RSV F蛋白的147-513位氨基酸残基的重组F1域。
在一些实施方式中，其中所述重组F2域和重组F1域之间通过由甘氨酸G、脯氨酸P以及选自丝氨酸S、丙氨酸A、谷氨酸E和赖氨酸K中一种或多种氨基酸组成的5-8个氨基酸残基的接头序列连接。
在一些实施方式中，其中所述接头序列是由甘氨酸G、脯氨酸P和丝氨酸S组成的5-8个氨基酸残基的接头序列。
在一些实施方式中，所述接头序列是由甘氨酸G、脯氨酸P和丝氨酸S组成的6个氨基酸残基长度的接头序列，其中所述接头序列为GGPGGS。
在一些实施方式中，其中所述接头序列是由甘氨酸G、脯氨酸P、丝氨酸S和丙氨酸A组成的5-8个氨基酸残基的接头序列。
在一些实施方式中，所述接头序列是由甘氨酸G、脯氨酸P、丝氨酸S和丙氨酸A组成的5个氨基酸残基长度的接头序列，其中所述接头序列为GAPGS。
在一些实施方式中，其中所述接头序列是由甘氨酸G、脯氨酸P、丙氨酸A和谷氨酸E组成的5-8个氨基酸残基的接头序列。
在一些实施方式中，所述接头序列是由甘氨酸G、脯氨酸P、丙氨酸A和谷氨酸E组成的7个氨基酸残基长度的接头序列，其中所述接头序列为GAPEPGE。
在一些实施方式中，其中所述接头序列是由甘氨酸G、脯氨酸P、丙氨酸A、谷氨酸E和赖氨酸K组成的5-8个氨基酸残基的接头序列。
在一些实施方式中，所述接头序列是由甘氨酸G、脯氨酸P、丙氨酸A、谷氨酸E和赖氨酸K组成的7个氨基酸残基长度的接头序列，其中所述接头序列为GKPAPGE。
在一些实施方式中，其中所述空腔填充突变选自N67F，S190V，V296F和V495L中的一种或多种。在一些实施方式中，其中所述空腔填充突变为N67F。在一些实施方式中，其中所述空腔填充突变优选为N67F，S190V，V296F和V495L的组合。
在一些实施方式中，其中所述增加表达量的取代选自P102A+I379V+M447V、S46G、L95M、I221M和/或E218A。在一些实施方式中，其中所述静电突变选自G184N、同时在另一些实施方式中，G184N也有增加表达的作用。
在一些实施方式中，本发明设计了分子间二硫键，是指单体与单体之间相连接的二硫键，可以协助将F蛋白锁定在融合前构象，例如K75C+E218C、V144C+I407C或S150C+Y458C等。在一些实施方式中，本发明设计了固定膜远端区域的二硫键突变——N类二硫键，例如I148C+Y286C、S55C+L188C、H159C+I291C或G151C+I288C。在一些实施方式中，本发明设计了固定膜近端区域的二硫键突变——C类二硫键，例如K399C+S485C、S443C+S466C、T323C+I475C、I332C+P480C或F387C+I492C。
在一些实施方式中，其中所述增加表达量的突变包括S46G。
在一些实施方式中，其中所述增加表达量的突变包括G184N、S46G、L95M、和I221M。
本发明公开的多肽包含表达所需要的信号肽序列或者与纯化标签相连接的接头序列，这些信号肽序列或者与纯化标签相连接的接头序列可以在最终产物中除去。
在一些实施方式中，所述多肽在构建时进一步包含异源信号肽。
在一些实施方式中，所述异源信号肽是IgG信号肽，氨基酸序列为MGWSCIILFLVATATGVHS。
在一些实施方式中，所述多肽在载体构建时还引入了便于后续纯化的亲和标签，如strep tag（氨基酸序列：WSHPQFEK）、Monoclonal Flag-Tag（氨基酸序列：DYKDDDDK）和His tag（氨基酸序列：HHHHHHHH），这些标签序列可以在最终产物中除去。
本发明还提供所述的多肽在制备预防RSV感染的疫苗中的应用。
本发明还提供一种预防RSV感染的疫苗，包含上述任一种的多肽；所述疫苗针对RSV A亚型和/或B亚型中的至少一种感染提供保护。
本发明公开一种预防RSV感染的疫苗组合物，进一步包含免疫佐剂，所述免疫佐剂包含铝佐剂、角鲨烯、生育酚、MPL、LPA、CpG、poly(I:C)以及QS-21中的至少一种。
在一些实施方式中，本发明公开预防RSV感染的疫苗，包含脂质体形式的佐剂，脂质体形式的佐剂的主要成分包括MPL、QS-21、DOPC和胆固醇。佐剂的剂量可以是每剂为0.5ml，含50µg MPL、50µg QS-21、1mg DOPC、0.25mg胆固醇、4.835mg氯化钠、0.15mg无水磷酸氢二钠、0.54mg磷酸二氢钾和注射用水，也可以是上述剂量的二分之一、四分之一或更少，例如主要成分包括25µg MPL、25µg QS-21、0.5mg DOPC、0.125mg胆固醇。
本发明还提供制备所述多肽的方法，包括如下步骤：
S1、合成所述多肽对应的DNA序列，并克隆到质粒载体中；
S2、用重组质粒载体转染宿主细胞、并进行表达，所述宿主细胞为真核细胞；
S3、对培养产物进行纯化，得到所述多肽。
在一些实施方式中，本发明所述疫苗通常还包含药学可接受载体和/或赋形剂诸如缓冲剂。药学可接受载体和赋形剂是公知的，并且可以由本领域技术人员进行选择。任选地，药学可接受载体或赋形剂还含有至少一种稳定溶解度和/或稳定性的成分。增溶剂/稳定剂的例子包括去污剂，例如月桂树肌氨酸和/或吐温。另有一些增溶剂/稳定剂的例子包括精氨酸、蔗糖、海藻糖等。因此，本领域技术人员可以选择合适的赋形剂和载体以产生适合于通过选定的使用途径向受试者施用的配制剂。合适的赋形剂包括但不限于甘油、聚乙二醇、KCl、钙离子、镁离子、锰离子、锌离子和其他二价阳离子相关盐等。
通常在佐剂选择时应能够在接受疫苗施用的受试者或受试者群体中增强Th1偏向性免疫应答，且在受试者或受试者群体中是安全且有效的。
本发明还提供制备上述预防RSV感染的疫苗的方法，其包括：
S1、培养哺乳动物宿主细胞以表达所述多肽；
S2、纯化经步骤（1）表达的多肽；
S3、将纯化的多肽与免疫佐剂按比例充分混合。
在一些实施方式中，还包括基因合成、表达载体的构建、纯化蛋白的冻干等额外步骤。可以通过本领域公知的许多方法的任一种或几种来从重组细胞培养物回收和纯化所表达的融合多肽，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、过滤、超滤、离心、阴/阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水性相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。最后，可以在最终的纯化步骤中采用高效液相层析HPLC。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明通过对野生型RSV F蛋白进行稳定化修饰和多聚化（例如三聚化）等设计，获得了表达量高，且能够保留对Pre-F具有特异性表位的具有免疫原性的RSV多肽，在维持稳定的融合前构象的同时确保了其可引起对呼吸道合胞病毒的有效中和抗体反应和结合抗体反应。
附图说明
以下附图仅旨在于对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。其中：
图1（A）：DS-Cav1A的收集流出峰、层析图谱；
图1（B）：DS-Cav1B的收集流出峰、层析图谱；
图2（A）：DS-Cav1A的电泳结果；
图2（B）：DS-Cav1B的电泳结果。
具体实施方式
下面将通过非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围，因为实施方案必然是多样的。本说明书中使用的用语仅是为了阐述特定的实施方案，而非作为限制，本发明的范围已界定在所附的权利要求中。
除非特别说明，本说明书中所使用的所有技术和科学用语均和本案所属技术领域的技术人员所普遍明了的意义相同。下面就本发明的优选方法和材料加以叙述，但是与本说明书中所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用以实施或测试本发明。下述实验方法如无特别说明，均为常规方法或产品说明书所描述的方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
术语定义
在本申请中，术语“DS-Cav1”是参照CN105473604B的PreF设计思路，包括通过残基155和290(“DS”)之间的二硫键、空腔填充突变S190F和V207L(“Cav1)和附加的C端fibritin(即 foldon)三聚化结构域稳定的pre-F三聚体，实施例中给出具体序列。
在本申请中，术语“D25”是指 CN200880023301.9中所述的抗体，其具体的氨基酸序列参考说明书中SEQ ID NO:1-8。
在本申请中，术语“101F”是指US11261356中所述的抗体，其重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列参考说明书中SEQ ID NO:3-6。
在本申请中，术语“AM14”是参照CN200880023301.9中所述的抗体，具体序列参考专利说明书实施例4中AM14的氨基酸序列。
在本申请中，术语“Mota”或“motavizumab”是指WO2007002543A2中所述的抗体，其具体序列参考专利说明书中A4B4L1FR-S28R抗体的氨基酸序列SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:11。
在本申请中，本发明的各突变体是基于SEQ ID NO: 1中所述的野生型（简称WT）RSV F蛋白氨基酸序列来设计和制备的。F2多肽包含至少SEQ ID NO: 1的氨基酸26-106的一部分或全部，例如26-100、26-102、26-104、26-105或26-106，除了如所述的引入的突变。F1多肽至少SEQ ID NO: 1的氨基酸残基136-513的一部分或全部，例如136-500、140-500、136-510、136-512或136-513，除了如所述的引入的突变。
F2域C端可以是SEQ ID NO: 1序列中的第100位、101位、102位、103位、104位、105位或106位。F2域C端直接或通过Linker与F1域的N端连接。F1域的N端可以是SEQ ID NO: 1中第136位、137位、138位、140位、141位、142位、143位、144位、145位或146位。F1域的C端可以是SEQ ID NO: 1中第499位、500位、502位、503位、504位、505位、506位、508位、510位或513位。F1域C端可以直接或通过Linker与三聚化结构域或多聚化结构域连接。
术语“多聚化结构域”和“多聚化”是指多肽或多肽的结构域形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体和/或二十四聚体与其它更多聚化结构域形成聚体。三聚化结构域例如foldon、GCN4或MTQ。
在本申请中，术语“GCN4”是指酵母的转录激活因子GCN4，是一种通过亮氨酸拉链(bZIP)结构结合DNA的蛋白质，本申请中GCN4的氨基酸序列是IKRMKQIEDKIEEIESKQKKIENEIARIKKIK。
在本申请中，术语“MTQ”是一种三聚化模序，本申请中MTQ的氨基酸序列是IKEEIAKIKEEQAKIKEKIAEIEKRIAEIEKRIAGGCC。
实施例1. 质粒构建、转化及制备
按照如下表1设计具有免疫原性的RSV多肽序列，包括野生型（WT）序列、铁蛋白序列、F ecto-Ferritin组序列（F蛋白的胞外域+铁蛋白序列）以及DS-Cav1B组序列，另外设计DS-Cav1A组，是在WT序列的基础上进行二硫键突变S155C和S290C，以及空腔填充突变S190F和V207L获得的，对DS-Cav1A组的序列进行进一步的P102A、I379V和M447V氨基酸取代突变获得DS-Cav1B组序列。
氨基酸序列按照宿主CHO细胞进行密码子优化确定核酸序列进行基因合成。
表1 构建体氨基酸序列设计
将合成的目的基因插入真核质粒pCHO3.1载体，用于转染和表达。将构建的各重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，将转入含有目的基因的质粒的甘油菌转接到150mL LB液体培养基（Amp终浓度为100μg/ml）中，在37℃、2000rpm下摇床培养过夜，用无内毒素质粒大提试剂盒进行质粒提取，对提取物测定质粒浓度、并进行酶切鉴定，具体的反应体系如表2所示。
表2 酶切反应体系
质粒扩增后测定浓度，测得各质粒均能获得较高的扩增浓度，约600~900μg/ml，总量为1.0μg左右。用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，在相应大小的位置可见清晰的条带。对所有质粒的进行测序，经鉴定，所有质粒目的基因序列完全正确。载有目的基因的重组质粒载体已被成功转入宿主细胞中，并已成功获得扩增。
质粒扩增后考察具有分子间半胱氨酸取代突变（也称“分子间二硫键突变”）的质粒的扩增浓度，结果如下表。
表3 质粒浓度测定结果
结果显示，质粒扩增浓度较高的主要是pCHO3.1-F46、pCHO3.1-F47、pCHO3.1-F48、pCHO3.1-F49和pCHO3.1-F50，质粒浓度最优选的分子间二硫键突变是K75C+E218C的组合。
实施例2. 蛋白表达
通过瞬时转染的方法将得到的质粒导入CHO细胞中，经过培养后收集蛋白上清液。
将ExpiCHO-S细胞(Thermo)在补充有6mM L-谷氨酰胺(sigma/G5146)的EmCD CHO-S 203(Eminence/L20301)培养基中培养，提前一天按0.25E5 cells/孔密度铺96孔板（补加10% FBS），37℃、8%CO2的培养箱中静置培养。转染当天将铺有细胞的96孔板更换新鲜的含L-谷氨酰胺的EmCD CHO-S 203培养基。用含L-谷氨酰胺的EmCD CHO-S 203培养基配制转染孵育体系(体积为转染体积的50%)，其中DNA用量1μg/ml，转染试剂PEI(Polysciences/24765-1)与DNA的比为3，将PEI与DNA混合静置孵育5min后加入铺有细胞的96孔板中，将培养物于37℃、8%CO2的培养箱中静置培养。转染24h后降温至32℃培养，按5%体积比添加Advanced Feed1(sigma/24368-1L)补料。转染后第7天停止培养收取上清。
实施例3. 关于增加蛋白表达的评价实验
以4℃保存的DS-Cav1A蛋白上清样品和DS-Cav1B蛋白上清样品为两组平行待测样品，进行分子筛层析。分子筛层析柱高径比40:1，填料为Superdex200；流动相为2.5％巯基乙醇、20mmol/L pH8.0 Tris-HCl；流速50cm/hr；样品上样量小于柱床体积的5％(v/v)，分步收集流出峰（层析图谱见附图1（A）、1（B），电泳结果见附图2（A）、2（B））。
申请人意外的发现，相比之下，DS-Cav1B具有的P102A、I379V和M447V这三个天然取代能够大大提高蛋白的表达量。以下实施例的对照实验中使用的DS-Cav1即指优化的DS-Cav1B。
实施例4. F蛋白单独突变方案设计
本发明的各突变体是基于SEQ ID NO: 1中所述的野生型（简称WT）RSV F蛋白氨基酸序列来设计和制备的。本实施例说明各种F蛋白单突变体的设计，所述F蛋白单突变体以三聚体的形式提供，包括foldon结构域和引入的氨基酸突变，例如空腔填充突变。这些F蛋白单突变体包含IgG信号肽（MGWSCIILFLVATATGVHS）、两个单独多肽链。多肽链之一，F2多肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸26-106，除了如所述的引入的突变。另一多肽链包含连接至foldon结构域N-端的F1多肽（残基136-513），除了如所述的引入的突变，它们通用引入的修饰还包括del_P27替换为ARGSGSG、R106Q和F137S。另外还包含纯化标签His-Tag（HHHHHHHH）、亲和标签Monoclonal Flag-Tag（DYKDDDDK）和接头序列（例如GSGSG）。SEQ IDNO: 1的信号肽（残基1-25）和pep27（残基110-136）在表达过程期间从F0前体切割。
按下表设计各个RSV F蛋白单独突变体及对照组蛋白的氨基酸酸序列，氨基酸序列按照宿主CHO细胞进行密码子优化确定核酸序列并进行基因合成。
表4 仅含空腔填充突变的突变体
另外还设计了仅含下表所示接头序列的F蛋白单突变体，通过接头序列取代模板氨基酸序列中104-144位残基进行构建，氨基酸序列按照宿主CHO细胞进行密码子优化确定核酸序列并进行基因合成。
模板氨基酸序列：
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIATVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK。
表5 接头序列设计
参照实施例1的方法进行质粒转化、制备及酶切鉴定，质粒扩增后测定浓度，各质粒均能获得较高的扩增浓度。对所有质粒的进行测序，经鉴定，所得质粒目的基因序列完全正确。载有目的基因的重组质粒载体已被成功转入宿主细胞中，并已成功获得扩增。
实施例5.分子间二硫键突变方案的筛选
通过瞬时转染的方法将得到的质粒导入CHO细胞中，经过培养后收集蛋白上清液。使用PBS稀释包被抗体D25或包被抗体motavizumab（简称mota），至5ng/μL，96孔板每孔加入200μL，4℃过夜孵育。PBST洗1次。用250μL 2% BSA / PBS封闭ELISA检测板，室温封闭1小时，用PBST清洗1次。每孔加入200 μL蛋白上清液，室温孵育1h。用PBST清洗3次。用0.2% BSA/ PBS中稀释HRP标记抗体到适应稀释度（D25-1:8000，mota-1:16000），每孔加入200 μL，室温孵育1小时。用PBST清洗4次。加入100 μL底物溶液（TMB双组份溶液A:B=1:1混合），室温反应15-20min，添加100μL终止液，并读数OD值。
表6 不同分子间二硫键突变设计的突变体与D25和Mota的结合情况
不同分子间的二硫键设计方案的选择优先参考D25抗体OD值，比较优选的是F49、F54、F56，同时参考mota抗体OD值，F50、F51、F54、F56、F49同样是在优选之列，进一步结合质粒构建中具有分子间二硫键突变的质粒的扩增浓度测定结果，优选的突变设计包括F49、F54、F50和F56，最优选的分子间二硫键突变方案是K75C+E218C。
实施例6. N类半胱氨酸取代突变方案的筛选
关于N类半胱氨酸取代突变方案的筛选，将下列单突变质粒通过瞬时转染的方法将得到的质粒导入CHO细胞中，经过培养后收集蛋白上清液在4℃放置7天后进行检测。
使用PBS稀释包被抗体D25或包被抗体motavizumab（简称mota），至5ng/μL，96孔板每孔加入200μL，4℃过夜孵育。PBST洗1次。用250μL 2% BSA / PBS封闭ELISA检测板，室温封闭1小时，用PBST清洗1次。每孔加入200 μL蛋白上清液，室温孵育1h。用PBST清洗3次。用0.2% BSA / PBS中稀释HRP标记抗体到适应稀释度（D25-1:8000，mota-1:16000），每孔加入200 μL，室温孵育1小时。用PBST清洗4次。加入100 μL底物溶液（TMB双组份溶液A:B=1:1混合），室温反应15-20min，添加100μL终止液，并读数OD值，并根据回归分析方程计算样品浓度。计算蛋白在4℃条件下放置7天后的PreF构象占比，以D25与Mota的活性浓度比值表示。
表7 具有N类半胱氨酸取代的蛋白放置7天后的PreF构象占比
结果显示，F27、F25、F26和F30蛋白上清在4℃放置7天后，仍能够检测出更高的PreF构象占比，说明他们具有的N类半胱氨酸取代突变方案更有利于在一般疫苗储存环境中维持F蛋白融合前构象，因此优先选择的N类半胱氨酸取代突变是V151C+I288C、H159C+I291C、I148C+Y286C和S55C+V188C。
实施例7. C类半胱氨酸取代突变方案的筛选
关于C类半胱氨酸取代突变方案的筛选，将下列单突变质粒通过瞬时转染的方法将得到的质粒导入CHO细胞中，经过培养后收集蛋白上清液进行检测。
使用PBS稀释包被抗体motavizumab（简称mota），至5ng/μL，96孔板每孔加入200μL，4℃过夜孵育。PBST洗1次。用250μL 2% BSA / PBS封闭ELISA检测板，室温封闭1小时，用PBST清洗1次。每孔加入200 μL蛋白上清液，室温孵育1h。用PBST清洗3次。用0.2% BSA /PBS中稀释HRP标记抗体到适应稀释度（mota-1:16000），每孔加入200 μL，室温孵育1小时。用PBST清洗4次。加入100 μL底物溶液（TMB双组份溶液A:B=1:1混合），室温反应15-20min，添加100μL终止液，并读数OD值。
表8 具有C类半胱氨酸取代的蛋白结合mota抗体的能力
结果显示，相较而言，F39、F42、F44、F41和F45能够更多的与Mota抗体（一个结合融合前和融合后F两者的位点II特异性抗体）结合，因此优选的C类半胱氨酸取代突变方案是L321C+I475C、I332C+S485C、F387C+I492C、I332C+P480C和K399C+S485C。
实施例8. 分子间二硫键突变的组合筛选与构象热稳定性评价
参考分子间二硫键设计方案、进一步设计在RSV F ecto（胞外域）中引入组合突变的多肽，重点考察分子间二硫键突变的组合筛选。
大量制备表达的候选蛋白，使用镍柱亲和层析和分子筛层析两步纯化方法纯化后，将蛋白浓度稀释至检测浓度，再使用Pre-F融合前构象特异性单抗D25鉴定纯化的蛋白在60℃、70℃孵育1h的融合前构象稳定性。
结合蛋白单独突变的设计，首先进一步考察分子间二硫键（inter二硫键）突变K75C+E218C对F蛋白融合前构象热稳定性的影响。构象热稳定性参考值使用不同批次蛋白经热处理一小时后与4℃时的D25浓度比值之和表征。下表中的构象热稳定性参考值主要是二个批次、三次D25浓度比值之和，包括0512批次蛋白60℃处理一小时后与4℃时的D25浓度比值，0512批70℃处理一小时后与4℃时的D25浓度比值，和0509批70℃处理一小时后与4℃时的D25浓度比值，结果如下表所示。
表9 inter二硫键突变的组合筛选及构象热稳定性评价
在PreF构象热稳定性方面，经历60℃或70℃孵育1小时，相比较于没有分子间二硫键设计的F蛋白，具有inter二硫键的设计中K75C+E218C突变设计与其它组合的F蛋白的融合前构象是相对最稳定的，而如果没有分子间二硫键设计PreF构象热稳定性非常差，与分子间K75C+E218C突变设计组合使用的N类半胱氨酸取代突变优选I148C+Y286C、G151C+I288C，C类半胱氨酸取代突变优选F387C+I492C，三对二硫键的组合设计对蛋白的稳定性具有实质的有益帮助。
实施例9. 二硫键突变组合方案的二次筛选
按下表设计各个RSV F蛋白组合突变体及对照组蛋白的氨基酸酸序列，氨基酸序列按照宿主CHO细胞进行密码子优化确定核酸序列并进行基因合成。
通过瞬时转染的方法将得到的质粒导入CHO细胞中，经过培养后收集蛋白上清液。使用PBS稀释包被抗体D25或AM14，至5ng/μL，96孔板每孔加入200μL，4℃过夜孵育。PBST洗1次。用250μL 2% BSA / PBS封闭ELISA检测板，室温封闭1小时，用PBST清洗1次。每孔加入200 μL蛋白上清液，室温孵育1h。用PBST清洗3次。用0.2% BSA / PBS中稀释HRP标记抗体到适应稀释度（D25-1:8000），每孔加入200 μL，室温孵育1小时。用PBST清洗4次。加入100 μL底物溶液（TMB双组份溶液A:B=1:1混合），室温反应15-20min，添加100μL终止液，并读数OD值，并根据回归分析方程计算样品在60℃放置1h后的浓度。
表10 不同组合突变体的融合前构象评价
注：“/”表示未测定或未检出
结果显示，设计的各组合突变体均能与D25抗体或AM14抗体结合，说明这些蛋白具有不同程度的融合前构象，其中相比于阳性对照DS-Cav1，样品在60℃放置1h后两种抗体的浓度之和均大于DS-Cav1，证明分子间半胱氨酸取代突变K75C+E218C具有非常突出的保护融合前构象的作用，K75C+E218C与N类半胱氨酸取代突变S55C+L188C或I148C+Y286C，C类半胱氨酸取代突变S443C+S466C、K399C+S485C或F387C+I492C的组合非常有利于对融合前构象的获得。
实施例10. 结合抗体检测的免疫评价
选择6-8周龄的雌性BALB/C小鼠进行免疫，随机分组，每组6只，在0天、21天通过肌肉注射对小鼠进行疫苗双点免疫，左、右腿各50μL，免疫原包括候选抗原F179、F188，DS-Cav1、pXCS847（SEQ ID NO:11）和PreF-1345（SEQ ID NO:12）阳性对照组；以及PBS阴性对照组。抗原剂量为12μg/只小鼠，AS01佐剂剂量为每只小鼠1/20HD。
AS01佐剂为脂质体形式的佐剂，主要成分包括MPL、QS-21、DOPC和胆固醇，1HDAS01佐剂为0.5ml，含50µg MPL、50µg QS-21、1mg DOPC、0.25mg胆固醇、4.835mg氯化钠、0.15mg无水磷酸氢二钠、0.54mg磷酸二氢钾和注射用水。分别在第20天和第35天收集血清，采集的血清储存于-20℃，后续进行结合抗体和中和抗体的检测。
结合抗体检测：
（1）待检血清样本使用样本稀释液稀释；
（2）阳性对照血清使用样品稀释液1:10000倍稀释，阴性对照血清使用样品稀释液1:200倍稀释；
（3）加样：将系列稀释的待测血清样本、阴性对照血清、阳性对照血清和空白对照溶液（样品稀释液作为空白对照）以100μl/孔加至pre-F酶标板中，待测血清样本加1孔，对照溶液加2孔；IgG-UNLB标曲酶标板条以100μl/孔加入样品稀释液；
（4）温育：酶标板置于37℃温育30分钟，于自动洗板机用洗涤液洗板5次；
（5）加酶：将酶标二抗（HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)，ABclonal）以100μl/孔加至酶标板内，置于37℃温育30分钟，于自动洗板机用洗涤液洗板5次；
（6）显色：显色A液与显色B液（飞净生物）等体积混匀，100μl/孔加至酶标板内，于室温避光孵育15分钟；
（7）终止：以50μl/孔加入终止液终止反应；
（8）读板：用酶标仪在波长450nm处测定吸光度（参比波长为620nm），结果如下表所示。
表11 Pre-F特异性IgG含量（五周血清）
加强免疫后，在各组小鼠5周血清中检测到的Pre-F IgG GMC（几何平均浓度）较3周时均有不同程度的大幅提升。F179的preF IgG GMC(几何平均浓度)是最高的，高于阳性对照DS-Cav1（参照CN105473604B的PreF设计思路，包括通过残基155和290(“DS”)之间的二硫键、空腔填充突变S190F和V207L(“Cav1)和附加的C端fibritin(即 foldon)三聚化结构域稳定的pre-F三聚体）。
实施例11. 中和抗体检测的免疫评价
中和抗体是可以特异性识别病毒表面的抗原中和位点，阻止病毒入侵细胞繁殖，保护机体免受其害，具有真正抗病毒作用的评价免疫效果的指标。委托中科国邦利用RSVA2毒株通过荧光斑点减少中和试验（FRNT法）进行中和抗体检测。具体步骤为：
（1）样品准备：室温解冻-20℃储存的血清，56℃热灭活30min，30min后取出并冷却至室温，然后将每组的6份血清充分混合获得各组混合血清样品。
（2）样品加样及稀释：40倍初始稀释，后续4倍稀释，作6个稀释度。取96孔板，第2列做为细胞对照（CC），第3列做为病毒对照（VC）。于B4-B11孔中加入已稀释20倍的样品，使用多道移液器对B4-B11孔中液体轻柔的反复混匀，然后进行4倍比稀释，直至G4-G11孔中。另取阳性参考品和阴性参考品进行加样及稀释。
（3）病毒稀释：在冰盒上将病毒稀释至800~1200FFU/孔，加入除细胞对照外的各孔。
（4）将上述96孔板置于37℃、5%CO2培养箱中孵育1h。
（5）将HEp-2细胞消化计数，使用完全培养基调整至2.0×105个/mL，100 µL/孔加入到96孔板中。
（6）置于37℃、5%CO2培养箱中培养，24-28小时后用细胞成像多功能微孔板检测系统进行GFP荧光斑点计数，并记录结果。
（7）50%中和抗体抑制率（ND50）的计算：将仪器读取的荧光斑点数值输入数据分析模板，使用Reed-Muench法计算样品50%中和抗体抑制率（ND50）。
另外还委托了云菱计量进行辅助检测，主要是利用RSV long毒株通过CPENT法采用luciferase报告基因，化学发光法检测。检测结果如下表所示。
表12 中和抗体检测结果
由上述实验可以看出，本发明提供的抗原及疫苗组合物可诱导产生针对RSV病毒的高滴度的中和抗体，且对RSV的中和效果优于各阳性对照组，这也提示在病毒入侵时疫苗将提供较好的保护性效果，对RSV候选疫苗的研发具有重要意义。
实施例12. 多聚化结构域修饰样品的中和抗体检测
云菱计量进行辅助检测，主要是利用RSV long毒株通过CPENT法采用luciferase报告基因，化学发光法检测。样品稀释：首孔以30倍的初始稀释度，开始3倍系列稀释，稀释6个梯度，每个稀释度设置复孔。病毒与样品中和：定量重组病毒液，加入与稀释后的样品半量的RSV重组病毒液混合，于37℃，5% CO2细胞培养箱中中和1h。每板设定6个细胞对照孔，6个病毒对照孔。细胞培养：将一定浓度的Hep-2细胞悬液加至含有样品和病毒中和物的96孔细胞板中，37℃ 5% CO2细胞培养箱中培养24h。细胞裂解：加入荧光素酶检测试剂到细胞培养板中，室温避光反应2min。检测：用多道移液器将反应孔中的液体反复吹吸，使细胞充分裂解，从每孔中吸出150μl液体，加于对应96孔化学发光检测板中，置于化学发光检测仪中读取发光值。计算中和抑制率。
抑制率＝[1-（样品组的发光强度均值-细胞对照CC均值）/（病毒对照的发光强度VC均值-细胞对照值CC均值）]×100％。
根据中和抑制率结果，Reed-Muench法，计算ED50。检测结果如下表所示。
表13 中和抗体检测结果
实验样品的候选抗原中F179和F196是preF蛋白的C端连接三聚化foldon，而F206（SEQ ID NO:13）和F210（SEQ ID NO:14）的C端是连接多聚化结构域ferritin，证明多聚化结构域修饰的RSV F蛋白同样可诱导产生针对RSV病毒的高滴度的中和抗体，且对RSV的中和效果优于野生型的抗原和DS-Cav1、PreF-1345、PXCS847阳性对照组，这也提示在病毒入侵时本发明设计的疫苗将会提供较好的保护性效果，对RSV候选疫苗的研发具有重要意义。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (18)
1.一种具有免疫原性的呼吸道合胞病毒（RSV）多肽，包含RSV F蛋白重组胞外域，对应于SEQ ID NO:1所示野生型RSV F蛋白序列的26-513位氨基酸残基，相比于野生型RSV F蛋白包含分子间半胱氨酸取代突变，其中，所述分子间半胱氨酸取代选自K75C+E218C、S146C+N460C和A149C+Y458C中的1对或2对。
2.如权利要求1所述的多肽，相比于野生型RSV F蛋白重组胞外域还包括N类半胱氨酸取代突变，所述N类半胱氨酸取代的位点在野生型RSV F蛋白氨基酸序列的残基1-300之间。
3.如权利要求1所述的多肽，相比于野生型RSV F蛋白重组胞外域还包括C类半胱氨酸取代突变，所述C类半胱氨酸取代的位点在野生型RSV F蛋白氨基酸序列的残基320-500之间。
4.一种具有免疫原性的呼吸道合胞病毒（RSV）多肽，包含RSV F蛋白重组胞外域，对应于SEQ ID NO:1所示野生型RSV F蛋白序列的26-513位氨基酸残基，其中所述重组胞外域包含分子间半胱氨酸取代突变K75C+E218C。
5.如权利要求4所述的多肽，相比于野生型RSV F蛋白重组胞外域还包括N类半胱氨酸取代突变选自I148C+Y286C、S55C+L188C、H159C+I291C和G151C+I288C中的一对或两对；还包括C类半胱氨酸取代突变是指K399C+S485C、S443C+S466C、T323C+I475C、I332C+P480C或F387C+I492C。
6.如权利要求5所述的多肽，其中所述重组胞外域包含如下半胱氨酸取代突变的组合：
A、选自K75C+E218C的分子间半胱氨酸取代突变；
B、选自I148C+Y286C、G151C+I288C或H159C+I291C的N类半胱氨酸取代突变；
C、选自F387C+I492C、K399C+S485C或T323C+I475C的C类半胱氨酸取代突变。
7.如权利要求5所述的多肽，其中所述重组胞外域包含如下半胱氨酸取代突变的组合方案之一：
A、K75C+E218C、I148C+Y286C、F387C+I492C；
B、K75C+E218C、I148C+Y286C、K399C+S485C；
C、K75C+E218C、I148C+Y286C、S443C+S466C；
D、K75C+E218C、I148C+Y286C、T323C+I475C；
E、K75C+E218C、G151C+I288C、K399C+S485C；
F、K75C+E218C、H159C+I291C、K399C+S485C。
8.如权利要求7所述的多肽，其中所述重组胞外域还包含空腔填充突变，所述空腔填充突变的位点选自野生型RSV F蛋白氨基酸序列的67、495、296或190位。
9.如权利要求8所述的多肽，其中所述重组胞外域还包含增加表达量的突变P102A+I379V+M447V、S46G或G184N。
10.如权利要求1-9中任一项所述的多肽，其中所述重组胞外域包括至少包含RSV F蛋白的26-105位氨基酸残基的重组F2域和至少包含RSV F蛋白的145-513位氨基酸残基的重组F1域。
11.如权利要求10所述的多肽，其中所述重组F2域与重组F1域直接或通过linker连接。
12.如权利要求11所述的多肽，其中所述重组F2域与重组F1域通过linker连接是指F蛋白重组胞外域的106-144位残基被选自GGPGGS、GAPEPGE或GGSGGSG的linker取代。
13.如权利要求1-9中任一项所述的多肽，其中所述多肽的C端包括三聚化结构域或多聚化结构域。
14.如权利要求13所述的多肽，其中所述三聚化结构域是foldon、GCN4或MTQ结构域，所述多聚化结构域是ferritin结构域。
15.权利要求1-9、11、12或14中任一项所述的多肽在制备预防RSV感染的疫苗中的应用。
16.一种预防RSV感染的疫苗，包含权利要求1-14中任一项的多肽；所述疫苗针对RSV A亚型和/或B亚型中的至少一种感染提供保护。
17.如权利要求16所述的预防RSV感染的疫苗，包含脂质体形式的佐剂。
18.如权利要求17所述的预防RSV感染的疫苗，其中所述脂质体形式的佐剂包括MPL、QS-21和胆固醇成分。
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