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CN117447593B - 一种抗Siglec-15单克隆抗体 - Google Patents

一种抗Siglec-15单克隆抗体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体提供了一种抗Siglec‑15单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，单克隆抗体选自A‑Ⅰ、A‑Ⅱ、A‑Ⅲ或A‑Ⅳ中的一种。本发明提供的抗Siglec‑15单克隆抗体能够与Siglec‑15特异性结合，阻断Siglec‑15与细胞表面受体的结合，发挥抗肿瘤活性，用于治疗癌症或免疫性疾病，癌症包括但不限于脑胶质瘤、黑色素瘤、结直肠癌、肾癌、肺癌、淋巴癌或白血病等。免疫性疾病包括但不限于银屑病、克罗恩病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化和系统性红斑狼疮和多发性硬化症。

Description

一种抗Siglec-15单克隆抗体
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种抗Siglec-15单克隆抗体。
背景技术
根据世界卫生组织IARC发布的《2020世界癌症报告》数据显示，2020年全球新发癌症病例1929万例，仅中国新发癌症就有457万人，占全球23.7％，中国癌症新发人数远超世界其他国家，为此，癌症药物的研发尤为紧迫。
癌症细胞有时能够通过减低其表面上的肿瘤抗原表达而避免被免疫系统检测及破坏，使得免疫系统对其检测更为困难。同时，癌症细胞也可在其表面上表达诱导免疫细胞失活的蛋白质，或诱导周围环境中的细胞释放抑制免疫反应并促进肿瘤细胞增殖和存活的物质。随着抗PD-1抗体在肿瘤免疫治疗领域的巨大成功，如何改变肿瘤微环境，激活免疫系统对肿瘤的杀伤成为研究的热点。
唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-15(Sialic acid-binding Ig-like lectin15，Siglec-15)，是SIGLEC基因家族的一员，也是一种DAP12相关免疫受体，属于免疫球蛋白超家族和唾液酸结合Ig样凝集素家族。Siglec家族分为两类:一类是序列保守的Siglecs，包括唾液酸黏附素、CD22、MAG和Siglec-15；另一类是与CD33相关的序列可变的Siglecs。Siglecs是结合唾液酸的细胞表面蛋白，它们主要存在于免疫细胞表面，是I型凝集素的一个子集，在结构上具有非常典型和保守的结构特征，其穿膜区由2～17个胞外Ig结构域组成，N端由一个结合唾液酸的V-set Ig结构域和一定数目的C2-set Ig结构域组成。大多数Siglecs胞内段含有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-basedactivation motifs，ITAMs)，从而发挥免疫抑制功能；少数Siglecs如Siglec-14-16和Siglec-H通过其跨膜区正电荷的精氨酸与ITAMs的转化子DAP12相结合发挥免疫调控作用。Siglec-15由免疫球蛋白(Ig)样结构域、跨膜结构域和短胞质尾组成。Siglec-15分为外源性和内源性两种。通常，外源性Siglec-15高表达于肿瘤细胞表面，内源性Siglec-15主要表达在巨噬细胞及树突状细胞表面，而在人和小鼠组织以及各种细胞类型中最低限度表达。研究发现，Siglec-15具有抑制T细胞活性的功能，巨噬细胞表达的Siglec-15可直接抑制人和小鼠T细胞的增殖和活性，并抑制IFN-γ和TNF-α的分泌；小鼠体内对Siglec-15的基因敲除和抗体封闭，均可以增强微环境中的肿瘤免疫，抑制某些小鼠模型中的肿瘤生长。因此，Siglec-15是一个全新的广泛存在于多种肿瘤中的免疫抑制分子，具有潜在的临床相关性。
目前现有的通过PD-1/PD-L1途径的肿瘤免疫疗法，只对约40％的患实体瘤的病人有效。在实际治疗过程中，当PD-L1上调时，许多其他分子和细胞机制会导致微环境中免疫功能削弱，这些机制包括缺少有效的免疫细胞浸润、缺少调节性T的富集、缺少肿瘤相关巨噬细胞，以及缺乏骨髓来源的抑制性细胞等，与此同时，PD-1疗法的成功，强调了修复免疫缺陷的重要性，并将其作为修复癌症免疫疗法中免疫系统正常化功能的重要准则。Siglec-15虽与PD-L1具有一定的同源性，但是两者之间的表达没有关联性，且研发靶向Siglec-15的药物是一种与抗PD-1药物互补的免疫检查点抗癌新药，所以，抗Siglec-15单克隆抗体药物的研发具有重要的临床意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，满足国内市场需求，本发明通过对免疫文库的筛选，得到了能够与Siglec-15特异性结合，阻断Siglec-15与细胞表面受体结合的抗Siglec-15单克隆抗体。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种抗Siglec-15单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括3个分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示的重链互补决定区，轻链可变区包括3个分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示的轻链互补决定区，所述抗Siglec-15单克隆抗体选自以下任意一种：
A-Ⅰ：所述重链互补决定区HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，所述重链互补决定区HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，所述重链互补决定区HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示，所述轻链互补决定区LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示，所述轻链互补决定区LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示，所述轻链互补决定区LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示；
A-Ⅱ：所述重链互补决定区HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:7所示，所述重链互补决定区HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:8所示，所述重链互补决定区HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:9所示，所述轻链互补决定区LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:10所示，所述轻链互补决定区LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:11所示，所述轻链互补决定区LCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNo:12所示；
A-Ⅲ：所述重链互补决定区HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:13所示，所述重链互补决定区HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:14所示，所述重链互补决定区HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:15所示，所述轻链互补决定区LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:16所示，所述轻链互补决定区LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:17所示，所述轻链互补决定区LCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNo:18所示；
A-Ⅳ：所述重链互补决定区HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:19所示，所述重链互补决定区HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:20所示，所述重链互补决定区HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:21所示，所述轻链互补决定区LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:22所示，所述轻链互补决定区LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:23所示，所述轻链互补决定区LCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNo:24所示。
进一步的，所述抗Siglec-15单克隆抗体为鼠源抗体分子，所述鼠源抗体分子选自以下任意一种：
MA-Ⅰ：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:25所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:26所示；
MA-Ⅱ：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:27所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:28所示；
MA-Ⅲ：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:29所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:30所示；
MA-Ⅳ：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:31所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:32所示。
进一步的，所述鼠源抗体分子还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区为鼠的IgG1型、IgG2a型、IgG2b型或IgG3型的恒定区的一种，所述轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:33所示的鼠源Ck型的恒定区，所述IgG1型的恒定区的氨基酸序列如SEQ IDNo:34所示，所述IgG2a型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:35所示，所述IgG2b型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:36所示，所述IgG3型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:37所示。
进一步的，所述抗Siglec-15单克隆抗体为嵌合抗体分子，所述嵌合抗体分子包括所述鼠源抗体分子的重链可变区、所述鼠源抗体分子的轻链可变区和人源化抗体恒定区。
进一步的，所述抗Siglec-15单克隆抗体为人源化抗体分子，所述人源化抗体分子选自以下任意一种：
HA-Ⅰ：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:42所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:43所示；
HA-Ⅱ：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:42所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:44所示。
进一步的，所述人源化抗体分子还包括人源化抗体恒定区。
进一步的，所述人源化抗体恒定区包括人源化抗体重链恒定区和人源化抗体轻链恒定区，所述人源化抗体重链恒定区为人的IgG1型、IgG2型或IgG4型的恒定区的一种，所述IgG1型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:38所示，所述IgG2型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:39所示，所述IgG4型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:40所示，所述人源化抗体轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ IDNo:41所示的人Ck型的恒定区。
进一步的，所述人源化抗体分子为全长抗体或抗体片段，所述人源化抗体分子包括Fab、F(ab)2、Fv或ScFv中的一种或几种组合。
本发明还提供了一种蛋白，其包含所述的抗Siglec-15单克隆抗体。
本发明还提供了一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码所述的抗Siglec-15单克隆抗体。
本发明还提供了一种重组DNA表达载体，所述重组DNA表达载体包含所述的多核苷酸分子。
本发明还提供了一种转染所述的重组DNA表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；
优选的，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为HEK293细胞、CHO细胞或NS0细胞。
本发明还提供了一种药物，所述药物包含所述的抗Siglec-15单克隆抗体。
本发明还提供了所述的抗Siglec-15单克隆抗体在制备治疗免疫性疾病或癌症药物中的应用；
优选的，所述癌症包括脑胶质瘤、黑色素瘤、结直肠癌、肾癌、肺癌、淋巴癌或白血病；
所述免疫性疾病包括银屑病、克罗恩病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、溃疡性结肠炎或自身免疫性肝炎。
本发明进一步的还提供了所述的抗Siglec-15单克隆抗体与抗PD-1单克隆抗体联合用于治疗癌症或免疫性疾病药物中的应用。
本发明的有益效果如下：本发明提供的抗Siglec-15单克隆抗体能够与Siglec-15特异性结合，阻断Siglec-15与细胞表面受体的结合，抑制胞内信号通路的传导，并达到抑制肿瘤生长的作用，用于治疗癌症或免疫性疾病，癌症包括但不限于脑胶质瘤、黑色素瘤、结直肠癌、肾癌、肺癌、淋巴癌或白血病等，免疫性疾病包括但不限于银屑病、克罗恩病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、溃疡性结肠炎和自身免疫性肝炎等。
附图说明
图1为本发明实施例2中pScFv-Disb-HS载体的质粒图谱；
图2为本发明实施例3中梯度稀释ELISA抗Siglec-15噬菌体单克隆抗体的亲和力的比较图；
图3为本发明实施例5中载体pTSE的图谱；
图4为本发明实施例5中鼠源抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图5为本发明实施例6中鼠源抗体分子与Siglec-15的结合能力比较图；
图6为本发明实施例7中鼠源抗体抑制Siglec-15与Jurkat细胞表面受体的结合能力比较图；
图7为本发明实施例8中鼠源抗体分子抑制Siglec-15与CHOSLV-LRRC4C细胞表面受体的结合能力比较图；
图8为本发明实施例9中鼠源抗体分子促进人TNF-α细胞因子释放曲线图；
图9为本发明实施例9中鼠源抗体分子促进人IFN-γ细胞因子释放曲线图；
图10为本发明实施例9中鼠源抗体分子促进T细胞激活及增殖曲线图；
图11为本发明实施例10中鼠源抗体分子生物学活性检测图；
图12为本发明实施例15中人源化抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图13为本发明实施例18中人源化抗体分子与Siglec-15的结合能力比较图；
图14为本发明实施例19中人源化抗体与不同种属的Siglec-15交叉结合实验图；
图15为本发明实施例20中人源化抗体分子抑制Siglec-15与Jurkat细胞表面受体的结合能力图；
图16为本发明实施例21中人源化抗体分子的生物学活性检测图；
图17为本发明实施例22中抗Siglec-15单克隆抗体HA-I对小鼠体内MC38-Siglec-15结直肠癌模型中肿瘤体积生长曲线图；
图18为本发明实施例23中抗Siglec-15单克隆抗体HA-I热稳定性评价图。
具体实施方式
为了更加容易理解本发明，描述实施例之前，先对本发明某些技术和科学术语作以下说明：
本文所使用的术语“抗体”，包含全抗体及其任一抗原结合片段，抗体包括鼠源抗体、人源化抗体、双特异抗体或嵌合抗体，抗体也可以是Fab、F(ab)2、Fv或ScFv(单链抗体)，抗体可以是天然存在的抗体也可以是通过改变(例如突变、缺失、置换等)的抗体。
本文所使用的术语“可变区”和“恒定区”，即为抗体重链和轻链靠近N段的序列区为可变区(V区)，靠近C段的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)，可变区包括3个互补性决定区(CDR)和4个框架区(FR)，每条轻链可变区和重链可变区均有3个CDR区和4个FR区组成，重链的3个CDR区分别通过HCDR1、HCDR2和HCDR3表示，轻链的3个CDR区分别通过LCDR1、LCDR2和LCDR3表示。
本文所使用的术语“鼠源抗体分子”，其来源是用Siglec-15抗原免疫注射小鼠后得到的抗体。
本文所使用的术语“嵌合抗体分子”，是将鼠源抗体的可变区与人源化抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源抗体在人体内诱发的免疫应答反应。嵌合抗体是利用DNA重组技术，将鼠源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，这样表达的抗体分子中轻重链的可变区是鼠源的，而恒定区是人源的，整个抗体分子的近2/3部分都是人源的，这样产生的抗体，减少了鼠源抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。
本文所使用的术语“人源化抗体分子”，其是将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区，替代人源抗体CDR，使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。
术语“CHO细胞”为中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary cell)；术语“HEK293E细胞”为人胚肾293E细胞(human embryonic kidney 293E cell)，术语“NS0细胞”为小鼠NS0胸腺瘤细胞。
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本发明实施例1提供了一种抗Siglec-15单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区包括3个分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示的重链互补决定区，轻链可变区包括3个分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示的轻链互补决定区，具体的，抗Siglec-15单克隆抗体选自以下任意一种。
实施例2鼠源抗体分子筛选
本发明通过用Siglec-15抗原(Siglec-15蛋白胞外段，后续实验所使用的Siglec-15抗原、蛋白均为Siglec-15胞外段)免疫小鼠，优化免疫方法，创建噬菌体展示库并建立抗原位点筛选方法，具体噬菌体展示库的构建与筛选鉴定如下：
步骤一：Siglec-15抗原免疫小鼠
1、实验动物：
种属品系：BALB/c，雌性，小鼠；
体重：18-20g；
实验动物提供商：北京华阜康生物科技股份有限公司。
2、免疫：对小鼠进行免疫，免疫抗原为人Siglec-15(南京金斯瑞生物科技有限公司合成基因，本公司构建载体并表达纯化)。
步骤二：噬菌体抗体库的构建
取效价较高的小鼠脾细胞，利用Trizol试剂(购买自Ambion，货号：15596026)，提取小鼠脾细胞中的总RNA，RT-PCR获得cDNA，以cDNA为模板，采用简并引物(所用简并引物参考文献：Journal of Immunological Methods233(2000)167-177)进行PCR扩增，从而获得免疫小鼠抗体重链可变区基因库(VH)及轻链可变区基因库(VL)，轻重链分别双酶切，连接至同样分步骤酶切处理过的载体上，构建pScFv-Disb-HS-VH-VL基因库，pScFv-Disb-HS载体是采用一系列基因克隆的方法对载体pComb3载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)进行改造，使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达。改造后的载体命名pScFv-Disb-HS载体，获得其质粒图谱如图1所示，并以此载体为基础，构建小鼠免疫噬菌体抗体库。
步骤三：以Siglec-15为抗原包被免疫管，抗原包被量为5μg/500μL/管，4℃包被过夜，再用4％脱脂奶粉/PBST分别封闭免疫管和免疫噬菌体抗体库，室温封闭1h。封闭后的免疫噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗原抗体结合，噬菌体投入量约为109～1012个，室温反应1h后，使用PBST-PBS洗去未结合的噬菌体，通过0.1MpH2.2的Glycine-HCl洗脱，最后使用1.5M pH 8.8的Tris-HCl中和洗脱下来的噬菌体抗体溶液至pH7.0左右。
步骤四：将上述中和后的噬菌体感染10ml生长至对数期的TG1菌液，37℃培养箱中静置30min，取出部分菌液进行梯度稀释，涂布于2YTAG平板上，用于计算噬菌体产出量。剩余的菌液离心弃上清，将菌体沉淀重悬于少量培养基，吸出后涂布于2YTAG大平板，为下一轮筛选做准备。
步骤五：将上述感染后涂板的菌体从大平板上刮下，接菌至2YTAG液体培养基，摇至对数期后加入M13KO7辅助噬菌体超感染，在28℃条件下，220rpm培养过夜制备噬菌体，PEG/NaCl沉降纯化噬菌体用于下一轮筛选，共进行一轮噬菌体库富集筛选。
步骤六：Siglec-15噬菌体单链抗体阳性克隆的筛选：经过一轮筛选后，挑取分隔良好的单克隆菌落，接种于加有2YTAG液体培养基的96孔深孔板，在37℃的温度下，220rpm的条件下培养至其对数生长期，每孔加入约1010的辅助噬菌体M13KO7，在37℃的温度条件下静止感染30min。4000rpm，离心15min，弃去上清，菌体用2YTAK重悬沉淀，在28℃且220rpm的条件下培养过夜。4000rpm，4℃的条件下离心15min后，吸取扩增后的噬菌体上清进行ELISA鉴定，最终筛选得到四个亲和力较高的抗Siglec-15的鼠源抗体分子，分别命名为MA-I，MA-II，MA-III和MA-IV，将上述得到的单克隆抗体进行基因测序确定为正确的抗体序列，经过测序，上述筛选到的4个单克隆抗体序列如下：
具体的，SEQ ID No:25(MA-I的重链可变区的氨基酸序列)
EVKLEQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMFWVKQSHGKTLEWIGYI YPDNGGTGYNQNFKSKATLTVDNSSSSAYMELRSLTSEDSAVYYCARSEYDYFD YWGQGTTLTVSS；
SEQ ID No:26(MA-I的轻链可变区的氨基酸序列)
DIVLTQSTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTS RLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPLTFGAGTKLELK；
SEQ ID No:27(MA-II的重链可变区的氨基酸序列)
EVKLEQSGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQSPEKRLEWVAEII SGGSHTYYPDTVTGRFTISRDDAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYCARDGNYGYA MDYWGQGTSVTVSS；
SEQ ID No:28(MA-II的轻链可变区的氨基酸序列)
DIVITQTPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGASPKLWIYST SNLASGVPARFSGGGSGTSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSGYPWTFGGGTKLEI K；
SEQ ID No:29(MA-III的重链可变区的氨基酸序列)
QVKLEESGPELVKPGASVKMSCKASGYIFTSYVMHWVRQKPGQGLEWIGY IDPYNDRTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARSGDYGSS FDYWGQGTTLTVSS；
SEQ ID No:30(MA-III的轻链可变区的氨基酸序列)
DIVMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQEISGYLSWLQQKPDGTIKRLIYAAST LDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYASYPYTFGGGTKLEIK；
SEQ ID No:31(MA-IV的重链可变区的氨基酸序列)
EVKLQESGAELVKPGASVKLSCIASGFNIKDTFIHWVKQRPEQGLEWIGRID PASGYTKYDPKFQGKATITTDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTRSGSYVSFVY WGQGTLVTVSA；
SEQ ID No:32(MA-IV的轻链可变区的氨基酸序列)
DIVMTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLL IYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGT KLEIK。
实施例3梯度稀释ELISA比较抗Siglec-15噬菌体单克隆抗体的亲和力
将实施例2中获得的4个鼠源抗体分子(MA-I，MA-II，MA-III和MA-IV)进行单克隆噬菌体的展示和纯化，然后进行噬菌体梯度稀释ELISA实验鉴定亲和力，对照抗体为奈斯科尔公司的抗SIGLEC-15的单克隆抗体(又名5G12，专利申请号为201780067999.3，专利名称为针对SIGLEC-15的抗体及其使用方法)，具体方法如下：
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被Siglec-15抗原，100ng/孔/100μL，在4℃温度条件下包被过夜，使用PBST洗涤三次，将实施例2中筛选得到的4个噬菌体单克隆抗体分别用PBST五倍梯度稀释，每孔加入100μl稀释后的样品，在室温下静置1小时。用PBST洗涤ELISA板，将PBST稀释后的HRP-anti-M13(购买自Bio-viewshine，货号：GE27-9421-01)单克隆抗体加入ELISA板中，在室温放置1h。TMB显色试剂盒显色，室温显色10分钟，用2M H2SO4终止后，酶标仪在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
通过上述数据及如图2所示，实施例2筛选出的4个不同的鼠源抗体分子均能够与Siglec-15结合，本发明提供的单克隆抗体与Siglec-15均具有较高的亲和力。
实施例4
本发明实施例4在实施例2的基础上进一步限定了鼠源抗体分子还包括重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区为鼠的IgG1型、IgG2a型、IgG2b型或IgG3型的恒定区的一种，轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:33所示的鼠源Ck型的恒定区，IgG1型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:34所示，IgG2a型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:35所示，IgG2b型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:36所示，IgG3型的恒定区的氨基酸序列如SEQID No:37所示；具体序列如下：
SEQ ID No:33(鼠Ck型的轻链恒定区氨基酸序列)：
ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVL NSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC；SEQ ID No:34(鼠的IgG1型的重链恒定区氨基酸序列)：
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPG；
SEQ ID No:35(鼠的IgG2a型的重链恒定区氨基酸序列)：
AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK；
SEQ ID No:36(鼠的IgG2b型的重链恒定区氨基酸序列)：
AKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK；
SEQ ID No:37(鼠的IgG3型的重链恒定区氨基酸序列)：
ATTTAPSVYPLVPGCSDTSGSSVTLGCLVKGYFPEPVTVKWNYGALSSGVRTVSSVLQSGFYSLSSLVTVPSSTWPSQTVICNVAHPASKTELIKRIEPRIPKPSTPPGSSCPPGNILGGPSVFIFPPKPKDALMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVHVSWFVDNKEVHTAWTQPREAQYNSTFRVVSALPIQHQDWMRGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGRAQTPQVYTIPPPREQMSKKKVSLTCLVTNFFSEAISVEWERNGELEQDYKNTPPILDSDGTYFLYSKLTVDTDSWLQGEIFTCSVVHEALHNHHTQKNLSRSPELELNETCAEAQDGELDGLWTTITIFISLFLLSVCYSASVTLFKVKWIFSSVVQVKQTAIPDYRNMIGQGA。
实施例5抗Siglec-15单克隆抗体鼠源抗体分子制备
本发明实施例5在实施例4的基础上优选的限定了鼠源抗体分子包括鼠的IgG1型的重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:34所示)和鼠Ck型的轻链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:33所示)。抗体制备方法具体如下：
1、在将实施例2筛选出来的4个单克隆抗体的重链VH和轻链VL的编码基因分别克隆至装有重链和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)，优选的重链恒定区为鼠的IgG1型恒定区(氨基酸序列如SEQ ID No:34所示)，轻链恒定区为鼠源Ck链(氨基酸序列如SEQID No:33所示)，pTSE载体结构如图3所示(pTSE载体制备过程参见CN103525868A说明书第3页第[0019]段)。
2、瞬时转染HEK293E细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所，货号为GNHu43)，进行抗体表达，使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得4个单克隆抗体，同时使用BCA试剂盒(购买自：北京汇天东方科技有限公司，货号：BCA0020)进行蛋白浓度测定，之后通过SDS-PAGE鉴定蛋白大小，结果如图4所示，从左侧到右侧依次为非还原MA-I，MA-II，MA-III和MA-IV，蛋白质分子量Marker1，蛋白分子量Marker2，以及还原MA-I，MA-II，MA-III和MA-IV鼠源抗Siglec-15单克隆抗体，每条带的分子量大小与理论一致。
实施例6鼠源抗体与Siglec-15的结合实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被Siglec-15抗原，100ng/孔/100μL，在4℃的温度条件下包被过夜。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1h，加入不同稀释浓度的MA-I，MA-II，MA-III和MA-IV鼠源抗体分子，4种抗体分子的起始最高浓度均是5μg/ml，分别经过5倍梯度稀释，每个抗体共稀释8个梯度，在37℃温度条件下孵育1h。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入用1％BSA-PBST 1:2000稀释的Goat Anti-MouseIgG-HRP(购买自solarbio，货号：SE131)，在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μL/孔，室温显色8min，然后用2M H2SO4终止显色。酶标仪在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
通过上述数据及如图5所示，筛选出的4个不同的鼠源抗体分子均能与Siglec-15进行结合。
实施例7鼠源抗体抑制Siglec-15与Jurkat细胞表面受体的结合
首先，分别将四种鼠源抗体(MA-I、MA-II、MA-III、MA-IV)及对照抗体5G12，配制成浓度为600μg/mL的蛋白溶液，加入96孔板中，每孔25μL。其次，配制Siglec-15配体蛋白，配制浓度200μg/mL，每孔25μL，加入96孔板中。再次，对Jurkat细胞株进行计数，取一定数目细胞，离心后用PBS缓冲液重悬，调整细胞密度至2E+6cells/mL，每孔50μL加入96孔板中。所有样品及蛋白的稀释，均使用PBS缓冲液进行。最后，将加样完成的96孔板，置于4℃放置，孵育1h。取出后每孔加100μLPBS缓冲液，3000rpm离心清洗细胞一次，收集细胞沉淀。在细胞沉淀中加入提前配制的AF488-anti human IgG-Fc抗体(购买自SouthernBiotech，货号为2048-30)稀释液，4℃孵育1h。取出后3000rpm清洗一次，200μLPBS重悬后，流式上机检测，收集FL1-A通道内的荧光信号。
结果如图6所示，本发明实施例2筛选得到的四个鼠源抗体分子均可以抑制Siglec-15与Jurkat细胞表面受体的结合，且在同一作用浓度下，与对照抗体5G12相当。
实施例8鼠源抗体抑制Siglec-15与CHOSLV-LRRC4C细胞表面受体的结合
梯度稀释四种鼠源抗体分子(MA-I、MA-II、MA-III、MA-IV)及对照抗体5G12，配制浓度为200μg/mL，3x梯度稀释，共计8个梯度，每孔25μL加入96孔板相应位置。稀释Siglec-15-Fc配体蛋白，配制浓度40μg/mL，每孔25μL加入96孔板相应位置。对CHOSLV-LRRC4C细胞株进行计数，取一定数量细胞，离心后用PBS缓冲液重悬，调整细胞密度至2E+6cells/mL，每孔50μL加入96孔板中。所有样品及蛋白的稀释，均使用PBS缓冲液进行。将加样完成的96孔板，置于4℃放置，孵育1h。取出后每孔加100μLPBS缓冲液，3000rpm离心清洗细胞一次，收集细胞沉淀。在细胞沉淀中加入提前配制的AF488-anti human IgG-Fc抗体(购买自SouthernBiotech，货号为2048-30)，4℃孵育1h后3000rpm清洗一次，200μLPBS重悬后，流式上机检测，收集FL1-A通道内的荧光信号。绘制剂量效应曲线，计算候选分子抑制Siglec-15配体蛋白与细胞表面LRRC4C受体的结合。
结论：通过上述数据及图7可以看出，四个鼠源候选分子(MA-I、MA-II、MA-III、MA-IV)均能够阻断Siglec-15与其受体的结合。
实施例9鼠源抗体促进T细胞激活及增殖
复苏人PBMC细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，离心后收集细胞沉淀，用RPMI1640完全培养基重悬并计数，并调整细胞密度至2E+6cells/mL，每孔50μL加入96孔板中。Siglec-15配体蛋白，配制浓度为20μg/mL，每孔50μL加入96孔板相应位置。Anti-CD3抗体的作用终浓度为0.5μg/孔，配制浓度为10μg/mL，每孔50μL加入96孔板中相应位置。四种鼠源分子(MA-I、MA-II、MA-III、MA-IV)及对照抗体5G12，配制起始浓度为100μg/mL，3x梯度稀释，共计8个梯度。每孔50μL加入96孔板中相应位置。蛋白及抗体的稀释，均使用RPMI1640完全培养基进行，混匀96孔板，37℃避光孵育3天。取细胞培养上清，稀释10倍后，用于细胞因子检测。抗Siglec-15鼠源抗体分子对天然T细胞的激活，从以下三个角度进行评价考量：人TNF-α细胞因子释放、人IFN-γ细胞因子释放以及T细胞增殖，具体操作如下：
人IFN-γ检测试剂盒(购买自依科赛生物科技有限公司，货号为H008-96)：将稀释上清及标准品加入样本孔中，每孔100μL，盖上封板膜，室温孵育1.5h。孵育结束后洗板3次。加入人IFN-γ检测试剂盒内的Biotinylated antibody稀释液，每孔100μL，盖上封板膜室温孵育1h。孵育结束后洗板3次。加入Streptavidin-HRP工作液，每孔100μL，盖上封板膜，室温孵育30min。孵育结束后洗板3次。加入TMB显色液，每孔100μL，避光室温孵育约15分钟，每孔加入100μL Stop solution终止反应。酶标仪读取OD值后，绘制剂量效应曲线。
人TNF-α检测试剂盒(购买自依科赛生物科技有限公司，货号为EM008-96)：将稀释上清及标准品加入样本孔中，每孔100μL，盖上封板膜，室温孵育1.5h。孵育结束后洗板3次。加入Biotinylated antibody稀释液，每孔100μL，盖上封板膜室温孵育1h。孵育结束后洗板3次。加入人IFN-γ检测试剂盒内的Streptavidin-HRP工作液，每孔100μL，盖上封板膜，室温孵育30min。孵育结束后洗板3次。加入TMB显色液，每孔100μL，避光室温孵育约15分钟，每孔加入100μL Stop solution终止反应。酶标仪读取OD值后，绘制剂量效应曲线。
收集细胞沉淀，用CD3e Monoclonal Antibody(购买自赛默飞世尔科技有限公司，货号为MA1-10177)对细胞进行染色，室温避光孵育15min后，洗板一次，100μLPBS缓冲液重悬，流式上机进行绝对计数，绘制剂量效应曲线。
人TNF-α细胞因子释放
人IFN-γ细胞因子释放
T细胞增殖(绝对计数)
通过上述数据及图8-10可知，四个鼠源抗体分子(MA-I、MA-II、MA-III、MA-IV)均可以通过结合Siglec-15，阻断Siglec-15配体蛋白与天然T细胞表面受体的结合，阻断胞内抑制信号通路，激活T细胞，促使T细胞增殖并激活(释放TNF-α及IFN-γ)。
实施例10鼠源抗体分子生物学活性检测(报告基因法)
对Jurkat-NFAT-Luc工程细胞株计数，利用样品稀释液(其成分包括90％RPMI1640、10％FBS、0.5μg/ml Puromycin)调整细胞密度至2E+6cells/mL，轻轻混匀后将细胞液加入96孔板，50μL/孔。四种鼠源分子(MA-I、MA-II、MA-III、MA-IV)分别利用样品稀释液稀释至初始浓度为800μg/mL，5倍梯度稀释，共8个梯度，50μL/孔，加入96孔板相应位置，每个样品浓度设置两个复孔。配制Siglec-15抗原，每孔50μL加入96孔板中，使其作用终浓度至16μg/mL。配制Human CD3 antibody(购买自义翘神州生物技术有限公司，货号为10977-H001)，每孔50μL加入96孔板中，使其作用浓度至1μg/mL。轻轻混匀细胞培养板，置于37℃CO2培养箱孵育6h。离心弃上清，加入裂解液，每孔取10μL加入384孔板中，加入等量的荧光素酶反应底物(购买自普洛麦格生物技术有限公司，货号为E2610)，室温反应5min，在酶标仪下读荧光数值，并计算对应的IC50值，具体数据如下：
通过上述数据及图11所示，筛选出的4个不同的鼠源抗体及对照抗体均能结合Siglec-15，并抑制Siglec-15与Jurkat细胞表面受体的结合，阻断胞内的抑制信号通路，重新激活T细胞。工程细胞株Jurkat-NFAT-Luc的构建，可以模拟T细胞。Siglec-15通过与T细胞表面受体的结合，抑制并下调细胞内激活信号通路(NFAT-Luc)。这4个鼠源抗体分子能够有效阻断Siglec-15与细胞表面受体的结合作用，重新激活T细胞内信号通路。
实施例11
本发明实施例11进一步的限定了抗Siglec-15单克隆抗体为嵌合抗体分子，嵌合抗体分子包括实施例2中鼠源抗体分子的重链可变区、鼠源抗体分子的轻链可变区和人源化抗体恒定区。人源化抗体恒定区包括人源化抗体重链恒定区和人源化抗体轻链恒定区，人源化抗体重链恒定区为人的IgG1型、IgG2型或IgG4型的恒定区的一种，IgG1型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:38所示，IgG2型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:39所示，IgG4型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:40所示，人源化抗体轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:41所示的人Ck型的恒定区；
SEQ ID No:38(人的IgG1型的重链恒定区氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
SEQ ID No:39(人的IgG2型的重链恒定区氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
SEQ ID No:40(人的IgG4型的重链恒定区氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK；
SEQ ID No:41(人的Ck链的轻链恒定区氨基酸序列)：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE C。
实施例12嵌合抗体分子抗体的制备
本发明实施例12在实施例11的基础上进一步限定了人源化抗体恒定区包括人的IgG1型的重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:38所示)和人Ck型的轻链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:41所示)。
具体的制备方法：
将实施例2中免疫噬菌体抗体库筛选得到的抗体分子MA-I的重链可变区VH(SEQID No:25)和轻链可变区VL基因(SEQ ID No:26)保持鼠源序列不变，分别克隆至装有重链恒定区和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)上，重链恒定区为人的IgG1型(氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示)，轻链恒定区为人的Ck型(氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示)。瞬时转染HEK293E细胞(购买自：中国医学科学院基础医学研究所，货号为：GNHu43)，进行抗体表达，得到嵌合抗体CA-I。
实施例13鼠源抗体分子进行人源化
首先，选择实施例2中鼠源抗体分子MA-1的序列和人抗体种系数据库(v-base)比较，寻找同源性较高的人抗体轻、重链种系作为候选序列，然后将鼠源抗体分子MA-I的CDR的序列移植到人源候选序列上进行同源建模。然后通过三维结构模拟计算可能对于维持CDR环状结构起重要作用的关键框架氨基酸残基，从而设计人源化抗体的回复突变。将设计好的包含回复突变的人源化抗体的轻、重链可变区序列分别由南京金斯瑞生物科技有限公司优化合成，然后再连接到瞬时表达载体上，对人源化得到的轻重链组合分析，得到如下人源化抗体分子：HA-I，HA-II，上述筛选到的2个单克隆抗体序列如下：
具体的，SEQ ID No:42(HA-I和HA-II的重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMFWVRQAPGQRLEWIG YIYPDNGGTGYNQNFKSKATLTVDNSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSEYDY FDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID No:43(HA-I的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLIYYTS RLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYFCQQGNTLPLTFGQGTKVELK；
SEQ ID No:44(HA-II的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTS RLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYFCQQGNTLPLTFGQGTKVELK。
实施例14
本发明实施例14在实施例13的基础上进一步的限定了人源化抗体分子还包括人源化抗体恒定区；人源化抗体恒定区包括选自人的IgG1型、IgG2型或IgG4型的重链恒定区和人Ck型的轻链恒定区，IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:38所示，IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:39所示，IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ IDNo:40所示，人Ck型的轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:41所示。
上述人源化抗体恒定区具体序列与实施例11相同。
实施例15人源化抗体分子的制备
本发明实施例15在实施例10的基础上进一步的限定了人源化抗体恒定区包括人的IgG1型的重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:38所示)和人Ck型的轻链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:41所示)。
将实施例13人源化得到的2个人源化抗体分子的重链VH和轻链VL的编码基因分别克隆至装有重链恒定区和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)，重链恒定区为人的IgG1型(氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示)，轻链恒定区为Ck链(氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示)。
将人源化抗体分子HA-I、HA-II，分别瞬时转染HEK293细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所，货号为GNHu43)，进行抗体表达，使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得单克隆抗体，同时使用BCA试剂盒(购买自：北京汇天东方科技有限公司，货号：BCA0020)进行蛋白浓度测定，之后通过SDS-PAGE鉴定蛋白大小，结果如图12所示，从左侧到右侧依次为非还原蛋白质分子量HA-I、HA-II、实施例12中制备的嵌合抗体CA-I、非还原蛋白质分子量Marker1和还原蛋白质分子量Marker2、HA-I、HA-II、嵌合抗体CA-I，每条带的分子量大小与理论一致。
实施例16
本发明实施例16进一步的限定了人源化抗体分子为全长抗体或抗体片段，人源化抗体分子包括Fab、F(ab)2、Fv或ScFv中的一种或几种组合。
实施例17
本发明还提供了一种蛋白，其包含上述实施例限定的抗Siglec-15单克隆抗体。
本发明还提供了一种多核苷酸分子，多核苷酸分子编码上述实施例限定的抗Siglec-15单克隆抗体。
本发明还提供了一种重组DNA表达载体，重组DNA表达载体包含上述的多核苷酸分子。
本发明还提供了一种转染上述重组DNA表达载体的宿主细胞，宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；
优选的，宿主细胞为哺乳动物细胞，哺乳动物细胞为HEK293细胞、CHO细胞或NS0细胞。
本发明还提供了一种药物，药物包含本发明上述实施例限定的抗Siglec-15单克隆抗体。
本发明还提供了抗Siglec-15单克隆抗体在制备治疗免疫性疾病或癌症药物中的应用；
本发明还提供了一种治疗患有免疫性疾病或癌症的对象的方法，方法包括向对象施用治疗有效量的抗Siglec-15单克隆抗体；
优选的，上述癌症包括脑胶质瘤、黑色素瘤、结直肠癌、肾癌、肺癌、淋巴癌或白血病等；
上述免疫性疾病包括银屑病、克罗恩病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、溃疡性结肠炎或自身免疫性肝炎等。
本发明进一步的还提供了抗Siglec-15单克隆抗体与抗PD-1单克隆抗体联合用于治疗癌症或免疫疾病药物中的应用。
抗PD-1单克隆抗体选自Nivolumab、Pembrolizumab、特瑞普利单抗、信迪利单抗、替雷利珠单抗、卡瑞利珠单抗或专利号为ZL201510312910.8，专利名称为一种抗PD-1的单克隆抗体及其获得方法的专利文件中公开的DFPD1-9、DFPD1-10、DFPD1-11、DFPD1-12或DFPD1-13抗PD-1单克隆抗体，这里不仅限于上述对抗PD-1单克隆抗体的限定，还可以为其他商业化用于实验中的抗PD-1单克隆抗体，只要靶点为PD-1的单克隆抗体均可以，在此不具体限定其他的抗PD-1单克隆抗体。
实施例18人源化抗体分子与Siglec-15结合实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被Siglec-15抗原，200ng/孔/100μL，在4℃的温度条件下过夜包被。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1h，加入不同稀释浓度的人源化抗体HA-I、HA-II和实施例12中制备的嵌合抗体CA-I，3个抗体的起始最高浓度均是50μg/mL，分别经过3倍稀释后每个抗体均做10个梯度，在37℃温度条件下孵育1h。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入用1％BSA-PBST 1:5000稀释的Goat AntiHuman IgG-HRP(购买自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZB-2304)，在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μL/孔，室温显色5min，然后用2M H2SO4终止显色。酶标仪在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
通过上述数据及实验结果如图13所示，2个不同的人源化抗体分子均能与Siglec-15进行结合，且2个人源化抗体分子的EC50值均与嵌合抗体CA-I接近，说明人源化后的抗体分子保留了鼠源亲本抗体MA-I与Siglec-15的高结合能力。
实施例19人源化抗体与不同种属的Siglec-15交叉结合实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液分别包被人Siglec-15、鼠Siglec-15-His(购买自近岸蛋白质科技有限公司，货号：CW71)、食蟹猴Siglec-15-His(购买自近岸蛋白质科技有限公司，货号：CW70)100ng/孔/100μL，在4℃的温度条件下过夜包被。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1h，加入不同稀释浓度的人源化抗体HA-I、HA-II，2个人源化抗体的起始最高浓度均是25μg/mL，分别经过5倍稀释后每个抗体均做8个梯度，在37℃温度条件下孵育1h。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入用1％BSA-PBST 1:5000稀释的Goat Anti Human IgG-HRP，在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μL/孔，室温显色5min，然后用2M H2SO4终止显色。酶标仪在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
通过上述数据及如图14所示，筛选出的2个不同的人源化抗体分子均能与人Siglec-15、食蟹猴Siglec-15、鼠Siglec-15进行结合。
实施例20人源化抗体分子抑制Siglec-15与Jurkat细胞表面受体的结合
梯度稀释两种人源化抗体分子(HA-I、HA-II)及对照抗体5G12，配制浓度为200μg/mL，5梯度稀释，共计8个梯度，每孔25μL加入96孔板相应位置。利用FITC荧光标记蛋白试剂盒(购买自赛默飞世尔科技有限公司，货号为F6434)对Siglec-15蛋白进行荧光标记，制备Siglec-15-FITC蛋白。利用PBS缓冲液调整Siglec-15-FITC蛋白浓度，配制浓度为40μg/mL，每孔25μL加入96孔板相应位置。对Jurkat细胞株进行计数，取一定数量细胞，离心后用PBS缓冲液重悬，调整细胞密度至2E+6cells/mL，每孔50μL加入96孔板中。所有样品及蛋白的稀释，均使用PBS缓冲液进行。将加样完成的96孔板，置于4℃放置，孵育1h。取出后每孔加100μLPBS缓冲液，3000rpm离心清洗细胞一次，收集细胞沉淀，200μLPBS重悬后，流式上机检测，收集FL1-A通道内的荧光信号。绘制剂量效应曲线，计算候选分子抑制Siglec-15配体蛋白与Jurkat细胞表面受体的结合。
通过上述数据及图15可知，两个人源化候选分子(HA-I、HA-II)均能够阻断Siglec-15与Jurkat细胞表面的受体的结合。
实施例21人源化抗体分子的生物学活性检测(报告基因)
对Jurkat-NFAT-Luc工程细胞株计数，利用样品稀释液(其成分包括90％RPMI1640、10％FBS、0.5μg/ml Puromycin)调整细胞密度至2E+6cells/mL，轻轻混匀后将细胞液加入96孔板，50μL/孔。两种人源化抗体分子(HA-I、HA-II)分别利用样品稀释液稀释至初始浓度为800μg/ml，5倍梯度稀释，共8个梯度，50μL/孔，加入96孔板相应位置，每个样品浓度设置两个复孔。配制Siglec-15抗原，每孔50μL加入96孔板中，使其作用终浓度至16μg/mL。配制anti-CD3抗体(购买自义翘神州生物技术有限公司，货号为10977-H001)，每孔50μL加入96孔板中，使其作用浓度至1μg/mL。轻轻混匀细胞培养板，置于37℃CO2培养箱孵育6h。离心弃上清，加入裂解液，每孔取10μL加入384孔板中，加入等量的荧光素酶反应底物(购买自普洛麦格生物技术有限公司，货号为E2610)，室温反应5min，在酶标仪下读荧光数值，并计算对应的IC50值，具体数据如下：
通过上述数据及图16所示，筛选出的2个人源化抗体分子均能结合Siglec-15，并抑制Siglec-15与Jurkat细胞表面受体的结合，阻断胞内的抑制信号通路，重新激活T细胞。
实施例22抗Siglec-15单克隆抗体HA-I对小鼠体内MC38-Siglec-15结直肠癌的抑制实验
1、实验动物：
种属品系：C57BL/6JGpt，小鼠；
周龄：6-8周；
实验动物提供商:江苏集萃药康生物科技有限公司。
2、细胞培养：
MC38肿瘤细胞(YK-CL-256-02)(购自：普如汀生物技术(北京)有限公司(Biovector NTCC Inc.)，货号：NTCC-MC38)为原始细胞，构建MC38-Siglec-15肿瘤细胞株。用含有灭活的10％胎牛血清(ExCell Bio,货号：FND500)，100U/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素，250μg/mL的Hygromycin B(购自：赛默飞世尔科技(中国)有限公司(Gibco)，货号：10687010)以及2mM谷氨酰胺的DMEM培养基(购自：赛默飞世尔科技(中国)有限公司(Gibco)，货号：10566-016)在37℃、5％ CO2的培养箱中培养肿瘤细胞，每隔3至4天待细胞长满后分瓶传代，将处于对数生长期的肿瘤细胞用于体内肿瘤的接种。
骨髓源性巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophage，BMDM)分离自C57BL/6小鼠。用含有灭活的10％胎牛血清(ExCell Bio,货号：FND500)，100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素以及20ng/mL mouse M-CSF(购自：北京义翘神州科技股份有限公司，货号：51112-MNAH)和20ng/mL mouse IL-10(购自：北京义翘神州科技股份有限公司，货号：50245-MNAE)的RPMI 1640培养基(购自：赛默飞世尔科技(中国)有限公司(Gibco)，货号：A10491-01)在37℃、5％ CO2的培养箱中培养4天后，可用于体内肿瘤模型的使用。
3、肿瘤细胞的接种与分组：
PBS重悬的MC38-Siglec-15肿瘤细胞，细胞密度为1.0×106/mL，与一定量的BMDMs细胞悬液混合均匀，接种于实验动物的右侧胁肋部皮下，100μL/只，在肿瘤生长至43mm3左右时分组给药，共2组，每组5只，分别为溶媒对照组(Vehicle，i.p，tiw×3w)、HA-1(10mg/kg，i.p.，tiw×3w)。
4、检测指标：每周使用游标卡尺对肿瘤体积进行2次的测量，测量肿瘤的长径和短径，其体积计算公式为：体积＝0.5×长径×短径2；记录肿瘤体积的变化与给药时间的关系，实验结果如图17所示。
通过图17数据显示，抗Siglec-15单克隆抗体HA-1能够抑制肿瘤的生长，且呈现剂量依赖性反应。
实施例23抗Siglec-15单克隆抗体HA-I热稳定性评估
使用多功能蛋白热稳定性分析系统(购买自Unchained Labs)对抗Siglec-15单克隆抗体HA-I的热稳定性进行评估。通过监测蛋白内源性荧光随温度变化(从25℃开始，以0.3℃/min的升温速度升温至95℃)检测蛋白构象的变化，从而确定蛋白熔解温度Tm，评估蛋白构象稳定性。样品发生聚集时，会导致散射光波发生干涉，散射光信号增加，通过静态光散射测定蛋白的胶体稳定性(以Tagg进行表征)，结果参考如下表和附图18所示。
抗Siglec-15单克隆抗体HA-I的温度为72.9℃，平均Tagg为72.0℃，显示出较好的构象稳定性和胶体稳定性。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种抗LAG-3的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括3个重链互补决定区，3个所述重链互补决定区分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示，所述轻链可变区包括3个轻链互补决定区，3个所述轻链互补决定区分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示，所述重链互补决定区HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:15所示，所述重链互补决定区HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:16所示，所述重链互补决定区HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:17所示，所述轻链互补决定区LCDR1的氨基酸序列如SEQID No:18所示，所述轻链互补决定区LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:19所示，所述轻链互补决定区LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:20所示。
2.如权利要求1所述的抗LAG-3的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体分子，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:26所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:27所示。
3.如权利要求2所述的抗LAG-3的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述鼠源抗体分子还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区为鼠的IgG1型、IgG2a型、IgG2b型、IgG3型中的一种，所述IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:29所示，所述IgG2a型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:30所示，所述IgG2b型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:31所示，所述IgG3型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:32所示；所述轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:28所示的鼠源Ck链。
4.如权利要求2所述的抗LAG-3的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体分子，所述嵌合抗体分子包括所述鼠源抗体分子的重链可变区、所述鼠源抗体分子的轻链可变区和人源抗体恒定区；所述人源抗体恒定区包括人源抗体重链恒定区和人源抗体轻链恒定区，所述人源抗体重链恒定区为人的IgG1型、IgG2型或IgG4型中的一种，所述IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:39所示，所述IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:40所示，所述IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:41所示；所述人源抗体轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ IDNo:42所示的人的Ck链。
5.一种多肽或蛋白，其特征在于，所述多肽或所述蛋白包含权利要求1-4任一项所述的抗LAG-3的单克隆抗体或其抗原结合片段。
6.一种多核苷酸序列或组合，其特征在于，所述多核苷酸序列或组合编码权利要求1-4任一项所述的抗LAG-3的单克隆抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列。
7.一种重组DNA表达载体，其特征在于，所述重组DNA表达载体包含权利要求6所述的多核苷酸序列或组合。
8.一种转染如权利要求7所述的重组DNA表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为HEK293E细胞、CHO细胞或NS0细胞。
10.一种药物或药物组合物，其特征在于，所述药物或所述药物组合物包含权利要求1-4任一项所述的抗LAG-3的单克隆抗体或其抗原结合片段。
11.权利要求1-4任一项所述的抗LAG-3的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备治疗癌症或免疫疾病药物中的应用；
所述癌症选自白血病、肺癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、头颈癌、黑色素瘤、肾癌、乳腺癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌或膀胱癌；
所述免疫疾病选自银屑病、克罗恩病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、溃疡性结肠炎和自身免疫性肝炎。
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