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CN117247456A - 靶向her2，pd-l1和vegf的三特异性抗体 - Google Patents

靶向her2，pd-l1和vegf的三特异性抗体 Download PDF

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CN117247456A CN202210656224.2A CN202210656224A CN117247456A CN 117247456 A CN117247456 A CN 117247456A CN 202210656224 A CN202210656224 A CN 202210656224A CN 117247456 A CN117247456 A CN 117247456A
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符智祥
刘婵娟
郎国竣
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Sanyou Biopharmaceuticals Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一种靶向HER2，PD‑L1和VEGF的三特异性抗体，所述三特异性抗体包含两条相同的第一多肽和两条相同的第二多肽，其中1)第一多肽从N端到C端包含：VHH1‑(X)n‑VH‑CH1‑Hinge‑Fc‑(Y)m‑VHH2；第二多肽从N端和C端包含：VL‑CL；或2)第一多肽从N端到C端包含：VHH1‑(X)n‑VH‑CH1‑Hinge‑Fc；第二多肽从N端和C端包含：VHH2‑(Y)m‑VL‑CL；其中，VHH1表示结合第一表位的第一VHH结构域、VHH2表示结合第二表位的第二VHH结构域、VH和VL组合结合第三表位；其中，X和Y表示连接子，且n＝0或1，m＝0或1；其中，Fc表示免疫球蛋白重链Fc结构域，CH1表示免疫球蛋白重链CH1结构域，CL表示免疫球蛋白轻链CL结构域，其中，两条第一多肽的Fc结构域相互配对同二聚化，VH‑CH1和VL‑CL相互配对形成Fab，由此形成类似天然IgG免疫球蛋白的4聚体结构；其中，VHH1和VHH2分别结合选自PD‑L1或VEGF的不同靶标，VH和VL配对结合HER2。此外，本发明还涉及所述三特异性抗体的治疗用途。

Description

靶向HER2，PD-L1和VEGF的三特异性抗体
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种靶向HER2，PD-L1和VEGF的三特异性抗体及其制备方法和应用。
背景技术
面对涉及多种信号通路的复杂疾病，针对单一靶点的单克隆抗体治疗方法通常疗效有限。因此，开发能够同时结合多个不同靶点的多特异性抗体成为抗体药物发展的新趋势。这些多特异性抗体提供了新的治疗策略，例如在免疫疗法背景下的多种细胞受体的协同靶向，因而提供了更好的治疗控制的希望。例如，美国公开号2006/0193852描述了一种抗CD3×CD19双特异性抗体，其通过T细胞标志物和肿瘤细胞标志物的双特异性结合来靶向并杀死特异性肿瘤细胞群体。
HER2(也称为Neu、ErbB-2、CD340或p185)属于人表皮生长因子受体酪氨酸激酶家族成员，自身无胞外配体，可通过自身二聚化或与其他人表皮生长因子受体家族成员发生异源二聚化而激活胞内信号途径，促进细胞的增殖(Wang,Z.(2017)，“ErbB Receptors andCancer”，Methods Mol Biol 1652:3-35)。在包括乳腺癌和胃癌在内的多种实体肿瘤中，HER2存在基因扩增、蛋白质表达水平升高等情况，导致肿瘤细胞恶性程度增加。因此，HER2已成为HER2+实体瘤治疗的重要靶点，多款靶向HER2的单抗药物已获批上市，包括罗氏制药和基因泰克联合开发的曲妥珠单抗(Trastuzumab)、基因泰克开发的帕妥珠单抗(Pertuzumab)以及靶向HER2的ADC药物T-DM1和DS-8201(Oh,D.Y.和Y.J.Bang(2020)，“HER2-targeted therapies-a role beyond breast cancer”，Nat Rev Clin Oncol 17(1):33-48)。此外，国内外多款靶向HER2的生物类似药也已获批上市。但是靶向HER2的单克隆抗体往往反应率低且容易产生耐药性，例如90％的患者会在1年内对曲妥珠单抗产生耐药性。
血管内皮生长因子(VEGF)为血管生成的关键调控因子，能够促进血管出芽及新生血管形成。VEGF的表达受缺氧及炎症等多种因子控制，当VEGF表达上调时，血管出现异常增生。VEGF是存在病理性血管生成相关疾病的重要药物靶点，如实体肿瘤和眼病(包括糖尿病眼病、年龄相关黄斑变性等)(Apte,R.S.等人(2019)，“VEGF in Signaling and Disease:Beyond Discovery and Development”，Cell 176(6):1248-1264)。
程序细胞死亡1配体1蛋白(PD-L1)是重要的免疫检查点PD-1的配体，PD-1/PD-L1的结合能够促进T细胞的凋亡，同时抑制T细胞发挥抗肿瘤活性，多种肿瘤细胞通过表达PD-L1来逃避免疫系统的监视(Jiang,Y.等人(2020)，“Progress and Challenges in PreciseTreatment of Tumors With PD-1/PD-L1Blockade”，Front Immunol 11:339)。因此，阻断PD-L1与PD-1相互作用的抗体可激活适应性免疫系统来对抗肿瘤，在肿瘤治疗中具有非常广泛的适应性。
目前，国内外已有多款针对HER2、PD-L1和VEGF的单克隆抗体药物获批上市。然而，由于肿瘤的异质性，这些药物在临床治疗中存在应答率偏低，治疗耐受和易复发等现象。多特异性抗体可以同时靶向多个抗原，在提高抗肿瘤药物安全性和解决现有单克隆抗体药物应答不足及耐药方面具有非常大的潜力(Zhang,J.等人(2020)，“Development ofbispecific antibodies in China:overview and prospects”，Antib Ther 3(2):126-145)。因此，开发新的具有多重抗肿瘤活性的双特异性抗体或多特异性抗体以提高治疗应答率或克服治疗耐受在肿瘤的临床治疗中具有重要的意义。
尽管多特异性抗体具有前景，但它们的生产和使用受到许多实际因素的限制。例如目前制备多特异性抗体的平台/方法常面临相关联重链和轻链对之间的高保真配对难题、组装的抗体稳定性较差、抗体链的表达和折叠不良、亲和力降低、产生免疫原性肽、脱靶效应和/或复杂的体外组装反应或纯化方法等问题。这些问题限制了多特异性抗体的开发和应用。此外，不同抗体组件的组合和排布方式对于抗体平台的可生产性具有影响，并且与简单分子不同，这种影响常常难于进行理论预测。不仅如此，超出两链的抗体分子的制备也常常会对表达系统和下游工艺提出额外的要求。
目前制备的多特异性抗体，由于其抗原结合位点较少，往往影响该抗体与抗原的结合能力。例如，赛诺菲(Sanofi)公司最近开发了针对HER2/CD3/CD28的三特异性抗体，发现该三特异性抗体会通过CD4免疫细胞抑制乳腺癌细胞的生长。但是，该三特异性抗体对每个靶点只有一个结合位点，而经典抗体对每个靶点有两个结合位点，因此，该三特异性的总结合强度或亲和力比典型抗体药物低数千倍，这影响了该三特异性抗体效用的发挥。
来自重链抗体的VHH结构域，由于具有小尺寸(15kD)、易于操作和良好稳定性等多种独特优势，已经被提出用作多特异性抗体构件。但由于VHH与常规抗体可变区在结构上的差异，在基于VHH的抗体平台设计中，常常会遇到不同于常规可变区为构件时的影响因素。例如，Lukas Pekar等人提出，可以以VHH替换常规IgG抗体的可变结构域VH和VL，来产生多特异性抗体分子(Lukas Pekar等人(2020)，Biophysical and biochemicalcharacterization of a VHH-based IgG-like bi-and trispecific antibodyplatform,mAbs 12(1),1812210)。然而，在研究中，Lukas等人发现，尽管该平台样式在应用于形成单价双/三特异性抗体时总体的生产性能较好，但随着抗原结合位点和/或特异性的增加，该平台抗体的生产性能受到不同程度的影响，尤其是基于该平台的多价三特异性抗体，在许多情况下，表现出了显著下降的可生产性质，在表达和蛋白A纯化后一半以上测试抗体的SEC纯度甚至低于65％，这就为后期的抗体下游生产工艺带来困难。
截止目前，依然鲜有报道同时靶向HER2、PD-L1和VEGF的多特异性抗体。因此，迫切存在同时靶向HER2、PD-L1和VEGF，通过多重机制发挥协同抗肿瘤功能的三特异性抗体的需求。
本申请解决了上述问题。本申请构建了同时靶向HER2、PD-L1和VEGF的三特异性抗体，其利用肿瘤的微环境递送精准的免疫调节信号组合，从而有效地提高了治疗应答率并克服现有治疗面临的治疗耐受难题，比由三种单特异性抗体构成的组合疗法更为安全和有效。
发明内容
本发明提供了一种新型的同时靶向HER2、PD-L1和VEGF的三特异性抗体，所述抗体的每个特异性结合抗原的臂(简称抗原臂)与同源的单抗抗原臂具有相似的亲和力，表明构建的三特异性抗体各个臂之间干扰很小，由此该三特异性抗体同时保留了各抗原结合位点的良好的抗原结合特异性、选择性以及良好的生物活性。相比单一疗法和联合用药，靶向HER2、PD-L1和VEGF的三特异性抗体具有多重优势：一方面，三特异性抗体可以协同发挥ADCC、肿瘤细胞增殖抑制、PD-1/PD-L1阻断以及VEGF中和等多重抗肿瘤活性，提高对HER2阳性肿瘤的治疗效果；另一方面，有望解决单药或联合用药治疗中的治疗耐受难题。
本发明提供的三特异性抗体分子是包含6个抗原结合位点的对称分子。其对称结构使得该抗体的组装可以采用类似于天然IgG分子的方式，避免了多特异性抗体生产中常见的链错配现象，从而提高了组装效率和产率，因而简化了抗体生产和纯化的操作，提高了效率，降低了费用。本发明提供的三特异性抗体具有良好的溶解度、纯度和热稳定性，这些都是进一步下游开发的关键特征。此外，本发明抗体分子针对每个靶点具有两个相同的抗原结合位点，因此基本上保留了相应天然2价抗体对靶点的结合能力，从而避免了现有技术公开的三特异性抗体低亲和力的问题。
在第一方面，本发明提供了同时靶向HER2、PD-L1和VEGF的三特异性抗体，所述抗体包含两条相同的第一多肽和两条相同的第二多肽，其中所述三特异性抗体包含以下结构：
1)第一多肽从N端到C端包含：VHH1-(X)n-VH-CH1-Hinge-Fc-(Y)m-VHH2；
第二多肽从N端到C端包含：VL-CL；
或
2)第一多肽从N端到C端包含：VHH1-(X)n-VH-CH1-Hinge-Fc；
第二多肽从N端到C端包含：VHH2-(Y)m-VL-CL；
其中，VHH1表示结合第一靶点的第一VHH结构域、VHH2表示结合第二靶点的第二VHH结构域、VH和VL组合结合第三靶点；
其中，X和Y表示连接子，且n＝0或1，m＝0或1；
其中，Fc表示免疫球蛋白重链Fc结构域，CH1表示免疫球蛋白重链CH1结构域，CL表示免疫球蛋白轻链CL结构域，
其中，两条第一多肽的Fc结构域相互配对同二聚化，VH-CH1和VL-CL相互配对形成Fab，由此形成类似天然IgG免疫球蛋白的4聚体结构；
其中，VHH1和VHH2结合互不相同的靶点。
在一个实施方案中，CH1与VH来源于相同类型的免疫球蛋白分子。在另一个实施方案中，CH1、Hinge和Fc来源于相同类型的免疫球蛋白分子。在一个优选的实施方案中，包含CH1结构域和Fc结构域的重链恒定区结构域来源于IgG型免疫球蛋白，尤其来源于人IgG免疫球蛋白，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白。在一个更优选的实施方案中，包含CH1结构域和Fc结构域的重链恒定区结构域来源于IgG1型免疫球蛋白，尤其来源于人IgG1。
在一个实施方案中，包含CH1结构域和Fc结构域的IgG1重链恒定区结构域包含SEQID NO:26的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。
在一个实施方案中，VL和CL来源于相同类型的免疫球蛋白分子。在一个实施方案中，CL是κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。
在一些实施方案中，n＝1，m＝1。在一些实施方案中，X与Y可以相同或不同。在一个实施方案中，X和Y分别独立地为长度8-30个氨基酸的连接子。在一个优选实施方案中，X和Y包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，VH和VL来源于靶向HER2的单克隆抗体。在一个优选的实施方案中，VH和VL来源于曲妥珠单抗。在进一步优选的实施方案中，VH包含如SEQ ID NO:2所示的序列或由其组成、VL包含如SEQ ID NO:3所示的序列或由其组成。
在一个实施方案中，VHH1和VHH2分别结合PD-L1或VEGF。
在一个实施方案中，在具有VHH1-(X)n-VH-CH1-Hinge-Fc-(Y)m-VHH2结构的第一多肽和具有VL-CL结构的第二多肽的三特异性抗体中，所述VHH1和VHH2分别结合PD-L1或VEGF。在一个优选的实施方案中，所述VHH1来源于靶向PD-L1的抗体，所述VHH2来源于靶向VEGF的抗体。在进一步优选的实施方案中，所述VHH1来源于靶向PD-L1的D21-4抗体，所述VHH2来源于靶向VEGF的P30-10-26抗体。在一个优选的实施方案中，所述VHH1包含如SEQ IDNO:1所示的序列或由其组成，所述VHH2包含如SEQ ID NO:4所示的序列或由其组成。
在一个实施方案中，在具有VHH1-(X)n-VH-CH1-Hinge-Fc-(Y)m-VHH2结构的第一多肽和具有VL-CL结构的第二多肽的三特异性抗体中，所述VHH1和VHH2分别结合PD-L1或VEGF。在一个优选的实施方案中，所述VHH1来源于靶向VEGF的抗体，所述VHH2来源于靶向PD-L1的抗体。在进一步优选的实施方案中，所述VHH1来源于靶向VEGF的P30-10-26抗体，所述VHH2来源于靶向PD-L1的D21-4抗体。在一个优选的实施方案中，所述VHH1包含如SEQ IDNO:4所示的序列或由其组成，所述VHH2包含如SEQ ID NO:1所示的序列或由其组成。
在一个实施方案中，在具有VHH1-(X)n-VH-CH1-Hinge-Fc结构的第一多肽和具有VHH2-(Y)m-VL-CL结构的第二多肽的三特异性抗体中，所述VHH1和VHH2分别结合PD-L1或VEGF。在一个优选的实施方案中，所述VHH1来源于靶向PD-L1的抗体，所述VHH2来源于靶向VEGF的抗体。在进一步优选的实施方案中，所述VHH1来源于靶向PD-L1的D21-4抗体，所述VHH2来源于靶向VEGF的P30-10-26抗体。在一个优选的实施方案中，所述VHH1包含如SEQ IDNO:1所示的序列或由其组成，所述VHH2包含如SEQ ID NO:4所示的序列或由其组成。
在一个实施方案中，在具有VHH1-(X)n-VH-CH1-Hinge-Fc结构的第一多肽和具有VHH2-(Y)m-VL-CL结构的第二多肽的三特异性抗体中，所述VHH1和VHH2分别结合PD-L1或VEGF。在一个优选的实施方案中，所述VHH1来源于靶向VEGF的抗体，所述VHH2来源于靶向PD-L1的抗体。在进一步优选的实施方案中，所述VHH1来源于靶向VEGF的P30-10-26抗体，所述VHH2来源于靶向PD-L1的D21-4抗体。在一个优选的实施方案中，所述VHH1包含如SEQ IDNO:4所示的序列或由其组成，所述VHH2包含如SEQ ID NO:1所示的序列或由其组成。
在一个实施方案中，本发明提供了靶向HER2、PD-L1和VEGF的三特异性抗体，其具有结构为VHH1-(X)n-VH-CH1-Hinge-Fc-(Y)m-VHH2的2条第一多肽和结构为VL-CL的2条第二多肽，其中VHH1结合PD-L1，包含如SEQ ID NO:12-14所示的3个CDR，VHH2结合VEGF，包含如SEQ ID NO:15-17所示的3个CDR，VH结合HER2序列，包含如SEQ ID NO:18-20所示的3个重链CDR，VL结合HER2，包含如SEQ ID NO:21-23所示的3个轻链CDR。
在一个实施方案中，本发明提供了靶向HER2、PD-L1和VEGF的三特异性抗体，其具有结构为VHH1-(X)n-VH-CH1-Hinge-Fc-(Y)m-VHH2的2条第一多肽和结构为VL-CL的2条第二多肽，其中第一多肽中的VHH1包含如SEQ ID NO:1所示的序列或由其组成，VH包含如SEQID NO:2所示的序列或由其组成，VHH2包含如SEQ ID NO:4所示的序列或由其组成，第二多肽中的VL包含如SEQ ID NO:3所示的序列或由其组成。
在一个实施方案中，本发明提供了靶向HER2、PD-L1和VEGF的三特异性抗体，其具有结构为VHH1-(X)n-VH-CH1-Hinge-Fc的2条第一多肽和结构为VHH2-(Y)m-VL-CL的2条第二多肽，其中VHH1结合PD-L1，包含如SEQ ID NO:12-14所示的3个CDR，VH结合HER2，包含如SEQ ID NO:18-20所示的3个重链CDR，第二多肽中的VHH2结合VEGF，包含如SEQ ID NO:15-17所示的3个CDR，VL结合HER2，包含如SEQ ID NO:21-23所示的3个轻链CDR。
在一个实施方案中，本发明提供了靶向HER2、PD-L1和VEGF的三特异性抗体，其具有结构为VHH1-(X)n-VH-CH1-Hinge-Fc的2条第一多肽和结构为VHH2-(Y)m-VL-CL的2条第二多肽，其中VHH1结合VEGF，包含如SEQ ID NO:15-17所示的3个CDR，VH结合HER2，包含如SEQ ID NO:18-20所示的3个重链CDR，第二多肽中的VHH2结合PD-L1，包含如SEQ ID NO:12-14所示的3个CDR，VL结合HER2，包含如SEQ ID NO:21-23所示的3个轻链CDR。
在一个实施方案中，本发明提供了靶向HER2、PD-L1和VEGF的三特异性抗体，其具有结构为VHH1-(X)n-VH-CH1-Hinge-Fc的2条第一多肽和结构为VHH2-(Y)m-VL-CL的2条第二多肽，其中第一多肽中的VHH1包含如SEQ ID NO:1或4所示的序列或由其组成，VH包含如SEQ ID NO:2所示的序列或由其组成，第二多肽中的VHH2包含如SEQ ID NO:4或1所示的序列或由其组成，VL包含如SEQ ID NO:3所示的序列或由其组成。
在一个实施方案中，本发明提供了靶向HER2、PD-L1和VEGF的三特异性抗体，其具有结构为VHH1-(X)n-VH-CH1-Hinge-Fc-(Y)m-VHH2的2条第一多肽和结构为VL-CL的2条第二多肽，其中第一多肽包含如SEQ ID NO:6所示的序列或由其组成或包含与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性且包含相同CDR的序列，第二多肽包含如SEQ ID NO:7所示的序列或由其组成或包含与SEQ ID NO:7具有至少90％同一性且包含相同CDR的序列。
在一个实施方案中，本发明提供了靶向HER2、PD-L1和VEGF的三特异性抗体，其具有结构为VHH1-(X)n-VH-CH1-Hinge-Fc的2条第一多肽和结构为VHH2-(Y)m-VL-CL的2条第二多肽，其中第一多肽包含如SEQ ID NO:8所示的序列或由其组成或包含与SEQ ID NO:8具有至少90％同一性且包含相同CDR的序列，第二多肽包含如SEQ ID NO:9所示的序列或由其组成或包含与SEQ ID NO:9具有至少90％同一性且包含相同CDR的序列。
在一个实施方案中，本发明提供了靶向HER2、PD-L1和VEGF的三特异性抗体，其具有结构为VHH1-(X)n-VH-CH1-Hinge-Fc的2条第一多肽和结构为VHH2-(Y)m-VL-CL的2条第二多肽，其中第一多肽包含如SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成或包含与SEQ ID NO:10具有至少90％同一性且包含相同CDR的序列，第二多肽包含如SEQ ID NO:11所示的序列或由其组成或包含与SEQ ID NO:11具有至少90％同一性且包含相同CDR的序列。
第二个方面，本发明提供了编码本发明抗体分子的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体，优选地表达载体。
第三个方面，本发明提供了包含本发明多核苷酸或载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是本领域通用的原核细胞和真核细胞。
第四个方面，本发明提供了一种用于产生本发明三双特异性抗体的方法，包括步骤(i)在适于表达本发明第一方面的三特异性抗体的条件下培养本发明第三方面的宿主细胞，任选地，(ii)回收本发明的三特异性抗体。
第五个方面，本发明提供了一种包含本发明三特异性抗体的药物组合物。在一个实施方案中，本发明提供的药物组合物还包含其它治疗剂，以及任选的药用辅料；优选地，所述其它治疗剂选自化疗剂、细胞毒性剂。
第六个方面，本发明提供了本发明三特异性抗体、药物组合物的用途，用于治疗、预防和/或诊断癌症。
在一个实施方案中，本发明提供了第一方面所述的抗体、第二方面所述的多核苷酸和载体、第三方面所述的宿主细胞、第五方面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防和/或诊断癌症。
第七个方面，本发明提供了治疗、预防和/或诊断癌症的方法，包括将有效量的本发明的三特异性抗体，或本发明的药物组合物施用给有需要的患者。在一个实施方案中，所述癌症例如是乳腺癌，胃癌，卵巢癌，胃食管交界处癌，膀胱癌，小肠癌和壶腹癌，食道癌、肺癌和宫颈癌。
附图说明
图1A-1C显示了本申请所述三特异性抗体的示意性结构。
图2A-2C为三特异性抗体的SEC-HPLC单体检测图谱，图2A为TsAb1的检测结果，图2B为TsAb2的检测结果，图2C为TsAb3的检测结果。
图3A-3C显示了三特异性抗体与重组人PD-L1蛋白(图3A)、重组人HER2蛋白(图3B)和重组人VEGF蛋白(图3C)的结合活性的ELISA检测结果。
图4A-4B显示了三特异性抗体与表达PD-L1的huPD-L1-CHO-S细胞(图4A)，和表达HER2的SK-BR-3细胞(图4B)结合的FACS结果。
图5显示了三特异性抗体阻断PD-1与huPD-L1-CHO-S细胞表面PD-L1相互作用的结果。
图6A显示了三特异性抗体逆转PD-L1对PD-1下游信号通路的抑制作用的结果，图6B显示了三特异性抗体抑制VEGF/VEGFR下游信号通路的结果。
图7A-7E显示了三特异性抗体介导的ADCC活性，图7A为在SK-BR-3细胞上的检测结果，图7B为在BT-474细胞上的检测结果，图7C为在NCI-N87细胞上的检测结果，图7D显示在SK-BR-3细胞上的PBMC杀伤检测结果，图7E为在NCI-N87细胞上的PBMC杀伤检测结果。
图8A-8B显示了三特异性抗体抑制SK-BR-3细胞(图8A)和HUVEC细胞(图8B)增殖的结果。
图9A-9B显示了三特异性抗体在MLR中刺激PBMC细胞分泌IFNγ(图9A)和IL-2(图9B)的活性。
图10A-10C显示了三特异性抗体在huPD-L1 NCI-N87小鼠模型中的体内抗肿瘤活性。
发明详述
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。
I.定义
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用，指包含抗原结合位点的蛋白质。
术语“免疫球蛋白”指具有天然存在抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是由二硫键键合的两条轻链和两条重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条免疫球蛋白重链具有一个重链可变区(VH)，也称作重链可变结构域，随后是三个重链恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条免疫球蛋白轻链具有一个轻链可变区(VL)，也称作轻链可变结构域，随后是一个轻链恒定结构域(CL)。在IgG分子中，通常重链的VH-CH1与轻链的VL-CL配对形成特异性结合抗原的Fab片段。因此，一个IgG免疫球蛋白基本上由借助免疫球蛋白铰链区(Hinge)连接的两个Fab分子和两个二聚化的Fc区组成。免疫球蛋白的重链可以基于其恒定区的类型，归属5个类别之一，称作α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中某些类别可以进一步划分成亚类，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链也可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ和λ。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。在重链抗体例如来自骆驼科重链抗体的情况下，单个VH结构域可以足以给予抗原结合特异性。天然重链抗体的VHH与天然的IgG抗体的重链可变区一样，具有相似的结构，即包含四个保守的框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。
术语“抗原结合位点”与“抗原结合结构域”可以互换使用，表示抗体分子中与抗原实际结合的区域。
术语“单特异性”抗体指具有一个或多个结合位点的抗体，所述位点中的每一个位点与相同表位结合。如本文所用，术语“多特异性”抗体指具有至少两个抗原结合位点的抗体，所述至少两个抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。
与抗体相关的表述“价”是指，抗体分子中的抗原结合位点的总数，或具有相同抗原结合特异性的抗原结合位点的数目。例如，6价抗体是指不论结合的表位是否相同，该抗体分子包含总共6个抗原结合位点，优选地，在本发明中，所述6价抗体具有三种不同的抗原结合特异性，其中针对每一种抗原结合特异性，分别存在2个相同的抗原结合位点。
“免疫球蛋白重链恒定区结构域”是指来自或获自或衍生自免疫球蛋白重链的恒定区结构域，包括从N端至C端顺序共价连接的重链恒定区CH1，CH2，CH3，和任选地重链恒定区CH4。在大多数情况下，重链恒定区CH1和CH2之间通过重链铰链区连接，但在适宜时，也可以通过柔性连接肽连接。在本发明的一些优选实施方案中，本发明抗体分子的重链恒定区包含CH1-Hinge-CH2-CH3。在本文中，免疫球蛋白重链恒定区结构域可以根据抗体分子的预期功能进行选择。例如，恒定结构域可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域，尤其是人IgG的免疫球蛋白恒定结构域，例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定结构域，优选人IgG1的恒定结构域。作为一个例子，抗体的CH1和Fc结构域可以均来自IgG1。
在本发明的抗体中，包含Fc结构域的链为第一多肽，也称作重链，而不含Fc结构域的链为第二多肽，也称作轻链。在本发明的一些实施方案中，本发明的抗体分子由两条重链和两条轻链组成。
“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”或“高变区”，是抗体可变结构域中在序列上高度可变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。在本发明抗体的VHH结构域中，CDR从N-端开始顺序编号，通常称作CDR1、CDR2和CDR3。可以采用本领域公知的方案，确定一个确定的VHH结构域中的CDR序列。
术语“Fc结构域”或“Fc区”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。天然的免疫球蛋白“Fc结构域”包含两个或三个恒定结构域，即CH2结构域、CH3结构域和可选的CH4结构域。可用于本发明抗体中的Fc结构域包括但不限于，具有天然序列或变体序列的IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的Fc结构域。人IgG重链Fc结构域通常定义为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至竣基末端的区段，Fc结构域的C末端447位的赖氨酸残基(依照EU编号系统)可以存在或者缺失。因而，完整抗体组合物可以包括所有K447残基都被消除的抗体群、无K447残基被消除的抗体群、或者混合了有K447残基的抗体和没有K447残基的抗体的抗体群。除非本文中另外说明，否则Fc区或重链恒定区中的氨基酸残基编号根据如Kabat等人,Sequences of Proteinsof Immunological Interes,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号体系(也称作EU索引)进行编号。
在一些实施方案中，Fc突变体包含与天然序列Fc结构域的氨基酸序列相差一处或多处氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc突变体与野生型Fc结构域和/或亲本Fc结构域具有至少约80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
可以利用现有技术中已经公开的多种方法，对本申请提供的Fc突变体、包含Fc突变体的融合蛋白(例如抗体)等进行进一步的修饰，例如以用于降低免疫原性、提高稳定性、溶解性、功能和临床益处的其他修饰。此类修饰包括但不限于下列修饰，例如可以延长血清半衰期的在位置252，254和256处的修饰。
术语“效应子功能”指随免疫球蛋白同种型变动的归因于免疫球蛋白Fc区的那些生物学活性。免疫球蛋白效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞摄取抗原、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)和B细胞活化。根据抗体分子的预期用途，本发明的抗体分子可以相对于具有野生型Fc区的抗体分子可以具有改变的效应子功能，例如降低或消除的ADCC活性等。
术语“抗原”是指引发免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体产生或特异性免疫细胞的活化，或两者兼有。技术人员将理解，任何大分子，包括基本上所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA。
术语“免疫检查点”意指免疫系统中存在的一类抑制性信号分子，通过调节外周组织中免疫反应的持续性和强度避免组织损伤，并参与维持对于自身抗原的耐受(PardollDM.,The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.Nat RevCancer,2012,12(4):252-264)。研究发现，肿瘤细胞能够逃避体内免疫系统而失控增殖的原因之一是利用了免疫检查点的抑制性信号通路，由此抑制了T淋巴细胞活性，使得T淋巴细胞不能有效发挥对肿瘤的杀伤效应(Yao S,Zhu Y和Chen L.，Advances in targetingcell surface signaling molecules for immune modulation.Nat Rev Drug Discov,2013,12(2):130-146)。免疫检查点分子包括但不限于程序性死亡1(PD-1)、PD-L1、PD-L2、细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、LAG-3和TIM-3。
血管内皮生长因子(VEGF)，包括例如VEGF-A(例如，登录号UniProt NO.:P15692下的人VEGF-A蛋白)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子(PIGF)。血管发生是实体肿瘤包括胃癌的进展和转移中的关键过程。肿瘤通过分泌促血管发生分子例如VEGF-A来诱导血管发生。几种抗VEGF-A策略，例如抗VEGF抗体，已经被提出用于癌症和血管生成相关疾病的治疗。在本文中，“针对VEGF的抗原结合特异性”由VHH结构域提供。
PD-L1是指程序细胞死亡1配体1蛋白(例如UniProtKB登录号Q9NZQ7下的人PD-L1蛋白)。作为免疫检查点分子，PD-L1参与调解T细胞的激活阈值和限制T效应细胞反应。已经提出抗PD-L1抗体在多种癌症中的治疗应用。然而，PD-L1的治疗疗效在一定程度上依赖于应答人群的选择。在本发明的抗体中，“针对PD-L1的抗原结合特异性”由VHH结构域提供。
术语“VHH”在本文中用于指，从缺乏轻链的重链抗体衍生的重链可变结构域，也称作单可变域片段(sVD)。因此，VHH与四链免疫球蛋白的常规VH不同，其无需与轻链可变结构域配对来形成抗原结合位点。这种VHH分子可以衍生自骆驼科物种(例如骆驼、羊驼、单峰驼、驼羊和原驼)中产生的抗体。除骆驼科之外的其他物种也可以产生天然缺乏轻链的重链抗体，这类VHH也处于本发明的范围内。在一些情况下，对于VHH的治疗应用，期望的是降低其免疫原性。因此，优选地，在一个实施方案中，本发明的抗体包含人源化的VHH结构域。
术语“EC50”，也被称为“半数有效浓度”，是指在特定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间的50％的应答的药物、抗体或毒剂的浓度。在本申请的上下文中，EC50的单位为“nM”。
术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指是细胞介导的免疫反应，其中某些细胞毒性细胞表面上存在的Fc受体识别靶细胞上结合的抗体，使得细胞毒性细胞可以特异性结合携带抗原的靶细胞，并激活免疫系统的效应细胞从而裂解靶细胞的作用。经典的ADCC作用由自然杀伤细胞(NK)介导，巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞(嗜酸性球)也能介导ADCC作用。比如嗜酸性粒细胞(嗜酸性球)能通过ADCC作用杀死某些特定的寄生虫。
在本文中，术语“柔性连接肽”或“连接子”或“连接肽”可互换使用，是指由氨基酸组成的短氨基酸序列，例如单独或组合使用的甘氨酸(G)和/或丝氨酸(S)和/或苏氨酸残基(T)，或来自免疫球蛋白的铰链区。
如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗原结合位点与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域已知的常规结合测定法测定。
氨基酸序列的“同一性百分数(％)”是指将候选序列与本说明书中所示的具体氨基酸序列进行比对并且如有必要的话为达到最大序列同一性百分数而引入空位后，并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分时，候选序列中与本说明书中所示的具体氨基酸序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分数。在一些实施方案中，本发明考虑本发明抗体分子的变体，所述变体相对于在本文中具体公开的抗体分子及其序列而言具有相当程度的同一性，例如同一性为至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％或更高。所述变体可以包含保守性修饰。
对于多肽序列，“保守性修饰”包括对多肽序列的置换、缺失或添加，它们导致某个氨基酸置换为化学上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。这类保守性修饰的变体相对于本发明的多态性变体、物种间同源物和等位基因而言是附加的并且不排斥它们。以下8组含有互为保守替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参阅例如，Creighton,Proteins(1984))。在一些实施方案中，术语“保守序列修饰”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。
术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的子代。宿主细胞是可以用来产生本发明抗体分子的任何类型的细胞系统，包括真核细胞，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；和原核细胞，例如，大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞，也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，其包含有效连接要表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括被掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
术语“个体”或“受试者”可互换地使用，是指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，个体是人。
术语“抗肿瘤作用”指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于例如，肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活减少。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和液体肿瘤。
术语“癌症”和“癌性”指哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。在某些实施方案中，适合于通过本发明的抗体来治疗的癌症包括乳腺癌，胃癌，卵巢癌，胃食管交界处癌，膀胱癌，小肠癌和壶腹癌，食道癌、肺癌和宫颈癌。包括那些癌症的转移性形式。在一些实施方案中，本发明尤其提供了可用于肿瘤/癌症治疗的多特异性抗体、及其在所述肿瘤/癌症中的治疗应用。
术语“治疗”指意欲改变正在接受治疗的个体中疾病之天然过程的临床介入。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体分子用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。
术语“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有癌症家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常，在癌症的背景中，术语“预防”是指在癌症的病征或症状发生前，特别是在具有癌症风险的受试者中发生前的药物施用。
术语“有效量”指本发明的抗体或组合物的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；体重、年龄和一般健康状况；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。
术语“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。抗体或抗体片段或组合物的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体或抗体部分在个体中激发所需反应的能力而变动。治疗有效量也是这样的一个量，其中抗体或抗体片段或组合物的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤生长率、肿瘤体积等)至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约50％、60％或70％和仍更优选地至少约80％或90％。可以在预示人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价化合物抑制可度量参数(例如，癌症)的能力。
术语“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量将小于治疗有效量。
术语“药物组合物”指这样的组合物，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
II.本发明的抗体分子
本发明提供了一种新型的同时靶向HER2、PD-L1和VEGF、包含6个抗原结合位点的对称三特异性抗体分子，其包含以下结构：
1)所述第一多肽从N端到C端包含：VHH1-(X)n-VH-CH1-Hinge-Fc-(Y)m-VHH2；
所述第二多肽从N端到C端包含：VL-CL；
或
2)所述第一多肽从N端到C端包含：VHH1-(X)n-VH-CH1-Hinge-Fc；
所述第二多肽从N端到C端包含：VHH2-(Y)m-VL-CL。
以下对本发明抗体分子的各组件进行描述，即(i)VHH抗原结合位点；(ii)抗体重链可变区/轻链可变区；(iii)免疫球蛋白恒定区结构域；以及(iv)连接子。
A.VHH抗原结合位点
本发明抗体分子中的VHH抗原结合位点是能够以高亲和力特异性结合靶抗原表位的单个重链可变结构域，例如，衍生自骆驼科重链抗体的重链可变结构域、骆驼化的人VH结构域、或人源化的骆驼科抗体重链可变结构域、和它们的经重组的单结构域。在一个实施方案中，本发明抗体分子的VHH抗原结合位点是人源化的骆驼科抗体重链可变结构域。
现有技术中已经对从骆驼科物种(例如骆驼、羊驼、单峰驼、驼羊和原驼)获得的抗体蛋白的大小、结构和针对人类受试者的抗原性进行了表征。在自然界中来自骆驼科哺乳动物家族的某些IgG抗体缺少轻链，并且因此在结构上区别于来自其他动物的具有两条重链和两条轻链的常见四链抗体结构。参见PCT/EP 93/02214。
可以通过基因工程方法获得骆驼科重链抗体的对靶抗原具有高亲和力的重链可变结构域(即VHH结构域)。参见1998年6月2日授予的美国专利号5,759,808。与其他非人源抗体片段一样，骆驼科VHH的氨基酸序列可以重组地改变以获得更逼真模仿人序列的序列，即，“人源化”，由此降低骆驼科VHH对人类的抗原性。另外，也可以将衍生自骆驼科VHH的关键元件转移到人VH结构域上，获得骆驼化的人VH结构域。
VHH由于其分子量仅是人IgG分子的分子量的十分之一，并且具有仅数纳米的物理直径，因此具有极高的热稳定性、对极端pH和蛋白酶解消化稳定和抗原性低，因此，基于VHH的本发明抗体分子，至少在一个方面，由于包含VHH作为构建模块，而具有良好的稳定性和可生产性能。
在一些实施方案中，本发明的抗体分子具有免疫检查点分子结合特异性，并由此抑制相应免疫检查点分子的信号传导通路，例如，本发明的抗体分子具有至少一个针对免疫检查点分子的结合特异性，例如，在一些实施方案中，针对PD-L1的结合特异性。
在一些实施方案中，本发明的抗体分子具有血管生成因子结合特异性，并由此抑制相应血管生成因子的信号传导通路，例如，本发明的抗体分子具有至少一个针对血管生成因子的结合特异性，例如，在一些实施方案中，针对血管内皮生长因子(VEGF)的结合特异性。
在一些实施方案中，本发明的抗体分子具有肿瘤相关抗原结合特异性，并由此靶向表达所述抗原的肿瘤细胞，例如，本发明的抗体分子具有至少一个针对肿瘤相关抗原的结合特异性。例如，在一些实施方案中，本发明的抗体分子具有针对HER2的结合特异性。
在一些实施方案中，本发明的抗体分子抑制免疫检查点分子的信号传导通路、抑制异常血管生成，并靶向肿瘤相关抗原，例如，本发明的抗体分子具有针对PD-L1的第一结合特异性、针对VEGF或VEGF受体的第二结合特异性、和针对肿瘤相关抗原HER2的第三结合特异性。
在一些实施方案中，本发明的抗体分子包含特异性结合PD-L1、VEGF的VHH结构域。
B.抗体分子的免疫球蛋白结构域
作为本发明抗体分子一部分的免疫球蛋白结构域可以来自任何天然免疫球蛋白分子或其衍生物，但优选地来自IgG免疫球蛋白，尤其是人IgG1免疫球蛋白分子。在优选的实施方案中，本发明抗体分子的免疫球蛋白重链结构域包括从N端至C端顺序共价连接的VH、IgG重链恒定区CH1，IgG重链铰链区，IgG重链恒定区CH2，和IgG重链CH3结构域。更优选地，抗体分子通过两条重链的铰链区(例如，EPKSCDKTHTCPPC)处的二硫键稳定缔合，以利于抗体分子的生产性能。
在本发明的抗体分子中，免疫球蛋白结构域可以直接或通过连接子的方式与VHH结构域融合。优选地，免疫球蛋白重链结构域通过连接子在VH的N端与VHH连接，或通过连接子在CH3结构域的C末端与VHH连接，或者免疫球蛋白轻链结构域通过连接子在VL的N端与VHH连接。
在本发明的多特异性抗体中，适用的CH1结构域和CL结构域可以是来自任何天然免疫球蛋白分子的CH1和CL结构域或其衍生物。在一些实施方案中，CH1结构域包含来自免疫球蛋白IgG，尤其是IgG1的CH1区的氨基酸序列。在再一些实施方案中，抗体分子的轻链CL结构域包含来自免疫球蛋白kapa轻链或lamda轻链的CL区的氨基酸序列。
适用于本发明抗体分子的Fc结构域可以是任何抗体Fc结构域。例如，本发明抗体的Fc结构域可以包含两个或三个恒定结构域，即CH2结构域、CH3结构域和可选的CH4结构域。优选地，本发明抗体的Fc结构域从N端到C端包含:CH2-CH3，更优选地从N端到C端包含：Hinge-CH2-CH3。在一些的实施方案中，抗体分子的Fc结构域为来自IgG的Fc结构域，例如，IgG1、IgG2或IgG4的Fc结构域，优选地来自人IgG1的Fc结构域。
如本领域技术人员理解的，根据本发明抗体分子的预期用途，本发明抗体分子可以在Fc结构域中包含改变效应子功能的修饰。
C.连接子
可以用于本发明的抗体中的连接子并无特定限制。本领域技术人员可以根据待连接的组件和连接位置容易地确定可用的连接子序列。在一个实施方案中，连接子为5-50个氨基酸的柔性连接肽，优选地包含甘氨酸(G)和/或丝氨酸(S)和/或苏氨酸残基(T)的连接肽。在一个实施方案中，所述连接子具有5-50个氨基酸长度，例如，8、10、15、20、25或30个氨基酸长度，或具有落入任何两个整数之间的氨基酸长度。在一个实施方案中，连接子包含氨基酸序列(G4S)n，其中n是等于或大于1的整数，例如，n是2、3、4、5、6或7的整数。在一个优选实施方案中，连接子由氨基酸序列(G4S)3组成。在另一个实施方案中，连接子包含氨基酸序列TS(G4S)n,其中n是等于或大于1的整数，例如，n是2,3,4,5,6或7的整数。在再一实施方案中，连接子为来自免疫球蛋白的铰链区。可以用于本发明抗体分子的连接子还可以是，例如但不限于，如下氨基酸序列：(Gly3Ser)2,(Gly4Ser)2,(Gly3Ser)3,(Gly4Ser)3,(Gly3Ser)4,(Gly4Ser)4,(Gly3Ser)5,(Gly4Ser)5,(Gly3Ser)6,(Gly4Ser)6；GGG；DGGGS；TGEKP；GGRR；EGKSSGSGSESKVD；KESGSVSSEQLAQFRSLD；GGRRGGGS；LRQRDGERP；LRQKDGGGSERP；和GSTSGSGKPGSGEGSTKG。或者，可以使用计算机程序模拟蛋白和肽的三维结构，或通过噬菌体展示方法，来合理地设计合适的柔性连接肽。
III.本发明的抗体的生产和纯化
再一方面，本发明提供用于生产本发明抗体的方法。为了产生本发明的抗体，可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得本发明的抗体的多肽链，并在适宜条件下使其装配。
为了重组生产，可以将编码所述抗体的任意一条多肽链和/或多条多肽链的多核苷酸分离并插入一个或多个载体中以便进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。使用常规方法，可以轻易地分离所述多核苷酸并将其测序。在一个实施方案中，提供了编码本发明抗体的一条或多条多肽链的多核苷酸。在再一实施方案中，本发明提供了包含本发明的一种或多种多核苷酸的载体，优选地表达载体。因此，在一个实施方案中，本发明提供用于生产本发明抗体的方法，所述方法包括：在适于表达所述抗体的多肽链的条件下培养包含编码所述多肽链的宿主细胞；和在适于所述多肽链装配为所述抗体的条件下使多肽链装配产生所述抗体。
可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建表达载体。表达载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。
在一个实施方案中，本发明也提供了包含一种或多种本发明多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了包含本发明表达载体的宿主细胞。合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌，真核微生物如丝状真菌或酵母，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。可以使用适于悬浮培养的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)、人胚肾系(HEK293或293F细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝脏细胞(BRL3A)、人肺细胞(W138)、人肝脏细胞(HepG2)、CHO细胞、NSO细胞、骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0等。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是CHO、HEK293或NSO细胞。
通过本文所述方法制备的抗体，可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。在纯化后，可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的抗体的纯度，所述熟知分析方法包括大小排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。可以通过本领域已知的多种测定法，鉴定、筛选或表征本文提供的抗体的物理/化学特性和/或生物学活性。
IV.药物组合物、药物联合和试剂盒
在一个方面，本发明提供了组合物，例如，药物组合物，所述组合物包含与可药用载体配制在一起的本文所述的抗体。如本文所用，“可药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。本发明的药物组合物适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、直肠、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。在一些实施方案中，本发明抗体是药物组合物中的唯一活性成分。在另一些实施方案中，药物组合物可以包含本文所述的抗体与一种以上治疗剂。
在另一方面，本发明也提供包含本文所述的抗体与一种以上治疗剂的药物联合。
适用于本发明的药物组合物和药物联合中的治疗剂可以为选自以下类别(i)-(iv)中任一类别的治疗剂：(i)增强抗原呈递(例如，肿瘤抗原呈递)的药物；(ii)增强效应细胞反应(例如，B细胞和/或T细胞活化和/或动员)的药物；(iii)减少免疫抑制的药物；(iv)具有抑制肿瘤作用的药物。
本发明的组合物可以处于多种形式。这些形式例如包括液体、半固体和固体剂型，如液态溶液剂(例如，可注射用溶液剂和可输注溶液剂)、分散体剂或混悬剂、脂质体剂和栓剂。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗用途。常见的优选组合物处于可注射用溶液剂或可输注溶液剂形式。
本发明的药物组合物可以包含“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明所述抗体。“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量等变动治疗有效量。治疗有效量是任何有毒或有害作用不及治疗有益作用的量。相对于未治疗的受试者，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤生长率)至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约60％和仍更优选地至少约80％。可以在预示人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价本发明的抗体抑制可度量参数(例如，肿瘤体积)的能力。“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在受试者中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量小于治疗有效量。
包含本文所述抗体的试剂盒也处于本发明的范围内。试剂盒可以包含一个或多个其他要素，例如包括：使用说明书；其他试剂，例如标记物或用于偶联的试剂；可药用载体；和用于施用至受试者的装置或其他材料。
V.本发明分子的用途和方法
根据本发明的抗体由于其赋予了多个抗原结合位点和多个抗原结合特异性，因此尤其适于用作抗肿瘤、抗血管发生、抗炎、抗自身免疫病药物。在一些实施方案中，根据本发明的抗体用于癌症治疗，例如乳腺癌，胃癌，卵巢癌，胃食管交界处癌，膀胱癌，小肠癌和壶腹癌，食道癌、肺癌和宫颈癌。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体可以用于治疗HER2+的癌症。在另一些实施方案中，根据本发明的抗体用于血管发生相关疾病的治疗，例如，涉及的新生血管异常的眼科疾病，例如，湿性或新生血管性年龄相关性黄斑变性(AMD)和糖尿病黄斑水肿(DME)。
实施例
以下实施例旨在仅对本发明进行举例说明，因此并不应被视为以任何方式限制本发明。
实施例1原材料制备
1.1抗原制备
人重组蛋白PD-L1(UniProtKB-Q9NZQ7)、PD-1(UniProtKB-Q15116)、HER2(UniProtNO-P04626)和VEGF(UniProtKB-P15692)的DNA编码序列由安徽通用生物科技有限公司通过全基因合成获得。PCR扩增目的片段并通过引物在编码序列C端引入His标签，采用同源重组的方法将目的片段分别构建至真核表达载体pcDNA3.4(Invitrogen)中。同时，通过同源重组的方法将目的片段分别构建至包含人IgG1 Fc片段(以下简写为Fc)或鼠Fc片段(以下简写为mFc)的真核表达载体pcDNA3.4中。将构建好的重组蛋白表达载体分别转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养，然后使用无内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA，D6950-01)进行质粒提取，得到目的质粒以供真核表达使用。
重组人PD-L1-His、重组人PD-L1-mFc、重组人PD-1-His、重组人HER2-His和重组人VEGF-His、重组人VEGF-Fc均通过Expi293瞬转表达系统(ThermoFisher，A14635)制备，瞬转方法参见Expi293TMExpression System USER GUIDE。转染7天后，收集细胞悬液于15000g离心10min，然后使用Ni Smart Beads 6FF(常州天地人和生物科技有限公司，SA036050)和MabSelect SuRe(Cytiva，17543802)对获得的表达上清液分别进行亲和纯化，分别用梯度浓度的咪唑溶液和100mM甘氨酸盐酸(pH 3.0)洗脱目的蛋白。洗脱获得的各蛋白质分别通过超滤浓缩管(Millipore，UFC901096)置换至PBS缓冲液中。经SDS-PAGE鉴定和活性检测合格后分装并冻存于-80℃。
1.2对照抗体制备
在本实施例中，抗人PD-L1抗体D21-4源自专利申请WO2021083335A1，为自研的来源于羊驼的抗体，其重链可变结构域序列如SEQ ID NO:1所示。抗人HER2抗体曲妥珠单抗(Trastuzumab)源自专利申请WO2003087131A2，其重链序列如SEQ ID NO:27所示，轻链序列如SEQ ID NO:7所示。抗人VEGF抗体P30-10-26源自专利申请CN202110995278.7,为自研抗体。抗PD-L1抗体Avelumab为商购的上市抗体药物(购自辉瑞公司)。抗VEGF抗体贝伐珠单抗(Bevacizumab)，源自专利US6884879B1。
完整对照抗体D21-4、P30-10-26、曲妥珠单抗和贝伐珠单抗均采用瞬转系统(ExpiCHO)进行表达，瞬转方法参见ExpiCHOTMExpression System Kit User Guide。培养结束后将细胞混悬液进行高速离心并收集上清，所得上清经0.22μm滤膜过滤后，采用ProteinA/G柱进行亲和层析纯化。获得的目的蛋白使用100mM甘氨酸盐酸(pH 3.0)进行洗脱，浓缩，缓冲液置换，分装，SDS-PAGE鉴定和活性检测后入库冻存。
实施例2抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体的构建
本实施例描述了示例性抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体(TsAb)的结构和表达载体的构建。其中抗人PD-L1抗体的VHH结构域(VHH PD-L1)来自抗体D21-4，氨基酸序列如SEQID NO:1所示；抗HER2抗体的氨基酸序列来自曲妥珠单抗，其重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；抗人VEGF抗体VHH结构域(VHHVEGF)来自P30-10-26，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。示例性连接子的序列为GGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO:5)；抗VEGF单抗贝伐珠单抗(Bevacizumab)，其轻重链可变区氨基酸序列分别如SEQID NO:24和SEQ ID NO:25所示。
构建体TsAb1(简称TsAb1，在下文中TsAb1也指具有这种结构的抗体)：含有两条相同的第一多肽和两条相同的第二多肽，其结构如图1A所示。其中，所述第一多肽从N末端到C末端包含抗人PD-L1单抗的VHH结构域、连接子、曲妥珠单抗的重链可变区、人IgG1重链恒定区、连接子和抗人VEGF单抗VHH结构域；所述第二多肽从N末端到C末端包含曲妥珠单抗的轻链可变区和κ轻链恒定区。示例性的TsAb1第一多肽和第二多肽的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:6和SEQ ID NO:7所示。
构建体TsAb2(简称TsAb2，在下文中TsAb2也指具有这种结构的抗体)：含有两条相同的第一多肽和两条相同的第二多肽，其结构如图1B所示。其中，所述第一多肽从N末端到C末端包含抗人PD-L1抗体的VHH结构域、连接子、曲妥珠单抗的重链可变区、人IgG1重链恒定区；所述第二多肽从N末端到C末端包含抗人VEGF抗体的VHH结构域、连接子、曲妥珠单抗的轻链可变区和κ轻链恒定区。示例性的TsAb2第一多肽和第二多肽的氨基酸序列分别如SEQID NO:8和SEQ ID NO:9所示。
构建体TsAb3(简称TsAb3，在下文中TsAb3也指具有这种结构的抗体)：含有两条相同的第一多肽和两条相同的第二多肽，其结构如图1C所示。其中，所述第一多肽从N末端到C末端包含抗人VEGF抗体的VHH结构域、连接子、曲妥珠单抗的重链可变区和人IgG1重链恒定区；所述第二多肽从N末端到C末端包含抗PD-L1抗体的VHH结构域、连接子、曲妥珠单抗的轻链可变区和κ轻链恒定区。示例性的TsAb3第一多肽和第二多肽的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:11所示。
根据构建体的结构，通过PCR方法扩增获取各个片段的编码序列，通过重叠延伸PCR法将各个编码序列连接起来，再通过同源重组分别构建至经过改造的真核表达载体质粒pcDNA3.4(Invitrogen)上，组成完整的构建体多肽表达载体。将构建好的载体分别转化到大肠杆菌DH5α中，37℃过夜培养。利用无内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA，D6950-01)进行质粒提取，得到无内毒素的构建体多肽表达质粒以供真核表达使用。
表1示出了本申请获得的三种示例性的三特异性构建体的分子构成/结构。
表1抗HER2&PD-L1&VEGF三特异性抗体构建体的结构
实施例3抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体的表达、纯化和理化性质分析
3.1抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体的表达、纯化
实施例2的构建体通过ExpiCHO瞬转表达系统(Thermo Fisher，A29133)进行表达，具体操作如下：转染当天，确认细胞密度约为7×106至1×107个活细胞/mL，细胞存活率>98％，此时，用37℃预热的新鲜ExpiCHO表达培养基将细胞密度调整到终浓度为6×106个细胞/mL。用4℃预冷的OptiPROTM SFM稀释目的质粒(向1mL所述培养基中加入1μg质粒，第一多肽：第二多肽的编码质粒摩尔比＝1：2)，同时用OptiPROTMSFM稀释ExpiFectamineTMCHO，再将两者等体积混合并轻轻吹打混匀制备成ExpiFectamineTMCHO/质粒DNA混合液，室温孵育5min，缓慢加入到准备好的细胞悬液中并同时轻轻摇晃，最后置于细胞培养摇床中，在37℃、8％CO2条件下培养。在转染后18-22h，向培养液中添加ExpiCHOTMEnhancer和ExpiCHOTMFeed，摇瓶放置于32℃摇床和5％CO2条件下继续培养。在转染后第5天，添加相同体积的ExpiCHOTM Feed，缓慢加入的同时轻轻混匀细胞混悬液。在转染10天后，将表达有目的蛋白的细胞培养上清于15000g高速离心10min，所得上清用MabSelect SuRe(Cytiva，17543802)进行亲和纯化，然后用100mM乙酸钠(pH3.0)洗脱目的蛋白，接着用1M Tris-HCl中和，最后通过超滤浓缩管(Millipore，UFC901096)将所得蛋白置换至PBS缓冲液中。
3.2抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体的浓度测定
将实施例3.1经纯化获得的三特异性抗体使用超微量分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司，Nano-300)通过测定280nm波长处的光密度进行浓度测定，将经测定的A280读值除以抗体基于氨基酸序列计算的理论消光系数后所得数值作为后续研究的抗体浓度，质检合格后，分装并保存于-80℃。
3.3抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体的SEC-HPLC单体纯度鉴定
通过SEC-HPLC方法检测制备的三特异性抗体的单体纯度。首先将待测三特异性抗体分别用流动相溶液(150mmol/L磷酸缓冲液，pH 7.4)稀释到0.5mg/mL。在Agilent HPLC1100色谱柱(XBridge BEH SEC 3.5μm,7.8mm I.D.×30cm,Waters)，流速0.8mL/min，进样体积20μL，VWD检测器波长为280nm和214nm的条件下进行检测。
基于获得的SEC-HPLC峰形图谱，按照面积归一法计算样品中高分子聚合物、抗体单体和低分子物质百分比，结果显示在图2A-2C和表2中，从中可知本申请制备的三特异性抗体TsAb1、TsAb2和TsAb3的单体纯度都大于90％。
3.4抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体的热稳定性研究
差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry；DSF)能够根据蛋白质图谱中的荧光变化过程提供有关蛋白质结构稳定性的信息，检测蛋白质的构型变化，获得蛋白质的熔解温度(Tm)。在本实施例中，采用DSF法检测了三特异性抗体的Tm值。
分别将获得的抗体TsAb1和TsAb3制备成0.2mg/mL的PBS溶液，每个供试品以19μL/孔加入96孔板(Nunc)中，设置三个平行孔，并以PBS和曲妥珠单抗作为参比，然后在每个孔中加入1μL浓度为100×的SYPRO orange染料，混匀后准备上机。样品热稳定测试采用ABI7500FAST RT-PCR仪器，试验类型选择熔解曲线，采用连续模式，扫描温度范围为25～95℃，升温速率为1％，25℃平衡5min，在升温过程中采集数据，报告基团选择“ROX”，淬灭基团选择“None”，反应体积20μL，以熔解曲线一阶导数的第一个峰谷对应的温度确定为抗体的熔解温度Tm。
实验结果显示在表2中，结果表明，三特异性抗体的TsAb1和TsAb3的Tm均大于49℃，表明其具有较好的热稳定性。
表2抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体的制备、理化数据
实施例4抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体的亲和活性分析
4.1 ELISA法检测三特异性抗体对人重组蛋白PD-L1的结合能力
在96孔ELISA板上包被人重组蛋白PD-L1-mFc，4℃过夜。次日，将孔板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭2h，用PBST洗板3次后，加入梯度稀释的三特异性抗体、对照抗体D21-4后孵育1h。之后，用PBST清洗3次后加入二抗Anti-human-IgG-Fc-HRP(abcam，ab 97225)并孵育1h。孵育完成后，PBST洗板六次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)显色。根据显色结果，加入2M HCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)在OD450下读板。利用PRISMTM(GraphPad Software,San Diego,CA)分析数据，并且计算EC50值。
ELISA结合测定结果如图3A和表3所示，三特异性抗体TsAb1、TsAb2和TsAb3与PD-L1蛋白的结合能力与亲本抗体D21-4相当或略弱。
4.2 FACS法检测三特异性抗体对huPD-L1-CHO-S细胞的结合能力
通过将编码PD-L1的基因(Gene ID:29126)稳定转染CHO-S(Thermo，A1461801)细胞，获得过表达人PD-L1蛋白的稳定转染细胞株(huPD-L1-CHO-S)。收集指数生长期的细胞，300g离心去上清，将细胞用FACS缓冲液(含有1％BSA的PBS)重悬，计数并将细胞悬液密度调整为2×106个活细胞/mL。随后，将huPD-L1-CHO-S细胞以每孔100μL加入96孔圆底板中，300g离心去上清。向对应孔中加入梯度稀释的三特异性抗体、对照抗体D21-4和人IgG1同型抗体(作为同型对照)，将细胞重悬后放置于4℃孵育30min。将孵育后的细胞混合液洗涤3次后加入PE标记的anti-human-IgG-Fc流式抗体(Abcam，98596)，重悬后放置于4℃孵育30min。将孵育后的细胞混合液洗涤3次后加入200μL的FACS缓冲液重悬细胞，通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX AOO-1-1102)上机检测分析。利用PRISMTM(GraphPad Software,SanDiego,CA)分析数据，并且计算EC50值。
FACS结合测定结果如图4A和表3所示，三特异性抗体TsAb1和TsAb3与细胞表面PD-L1的结合能力与亲本抗体D21-4相当，虽然三特异性抗体TsAb2与细胞表面PD-L1的结合能力略弱于亲本抗体D21-4，但依然保留了对PD-L1的良好结合活性。
4.3 ELISA法检测三特异性抗体对重组人HER2-His蛋白的结合能力
在96孔ELISA板上包被人重组蛋白HER2-His，4℃过夜。次日，将孔板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭2h，用PBST洗板3次后，分别加入梯度稀释的三特异性抗体、对照抗体曲妥珠单抗孵育1h。之后，用PBST清洗3次后加入二抗Anti-human-IgG-Fc-HRP(Abcam，ab97225)并孵育1h。孵育完成后，PBST洗板六次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)显色。根据显色结果，加入2M HCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)在OD450下读板。利用PRISMTM(GraphPad Software,San Diego,CA)分析数据，并且计算EC50值。
ELISA结合测定结果如图3B和表3所示，三特异性抗体TsAb1、TsAb2和TsAb3与HER2蛋白的结合活性与亲本抗体Trastuzumab相当或略微弱于亲本，说明抗体依然保留了对HER2蛋白的良好结合活性。
4.4 FACS法检测三特异性抗体对SK-BR-3细胞的结合能力
收集指数生长期的内源表达HER2的人乳腺癌细胞SK-BR-3细胞(ATCC，HTB-30)，300g离心去上清，将细胞用FACS缓冲液(含有1％BSA的PBS)重悬，计数并将细胞悬液密度调整为2×106个活细胞/mL。随后，将SK-BR-3细胞以每孔100μL加入96孔圆底板中，300g离心去上清。向对应孔中加入梯度稀释的三特异性抗体、对照抗体曲妥珠单抗和人IgG1同型抗体(作为同型对照)，将细胞重悬后放置于4℃孵育30min。将孵育后的细胞混合液洗涤3次后加入PE标记的anti-human-IgG-Fc流式抗体(Abcam,98596)，重悬后放置于4℃孵育30min。将孵育后的细胞混合液洗涤3次后加入200μL的FACS缓冲液重悬细胞，最后通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX AOO-1-1102)上机检测分析。利用PRISMTM(GraphPad Software,SanDiego，CA)分析数据，并且计算EC50值。
FACS结合测定结果如图4B和表3所示，三特异性抗体TsAb1与细胞表面HER2的结合活性与亲本抗体Trastuzumab相当，三特异性抗体TsAb2和TsAb3与细胞表面HER2的结合活性略弱于亲本抗体，但依然保留了对HER2的良好结合活性。
表3抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体的抗原结合能力数据
4.5 ELISA法检测三特异性抗体对重组人VEGF-His蛋白的结合能力
在96孔ELISA板上包被人重组蛋白VEGF-His，4℃过夜。次日，将孔板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭2h，用PBST洗板3次后，分别加入梯度稀释的三特异性抗体、对照抗体P30-10-26单抗、贝伐珠单抗孵育1h。之后，用PBST清洗3次后加入二抗Anti-human-IgG-Fc-HRP(Abcam，ab97225)并孵育1h。孵育完成后，PBST洗板六次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)显色。根据显色结果，加入2M HCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)在OD450下读板。利用PRISMTM(GraphPad Software,San Diego,CA)分析数据，并且计算EC50值。
ELISA结合测定结果如图3C和表3所示，三特异性抗体TsAb1、TsAb2和TsAb3均保留了对VEGF的良好结合活性。
4.6基于Biacore检测三特异性抗体对HER2、VEGF和PD-L1的亲和力
在本实施例中，采用Biacore T200(Cytiva)仪器，根据制造商的说明，检测了获得的三特异性抗体对人重组蛋白HER2-His、PD-L1-His和VEGF-His的亲和力。
首先将三特异性抗体用1×HBS-EP(pH7.4)缓冲液稀释至30nM/L，然后采用Protein A芯片的2,3通道捕获三特异性抗体，流速设置为10μL/min，芯片捕获三特异性抗体20s。以1×HBS-EP缓冲液(pH7.4)作为运行缓冲液，并将运行缓冲液作为对照测试样品，以1×HBS-EP缓冲液(pH 7.4)对抗原蛋白HER2-His、PD-L1-His和VEGF-His进行稀释稀释，获得浓度分别为30、15、7.5、3.75、1.875、0.938nM/L的溶液，然后以流速30μL/min将抗原溶液流经芯片，分别以结合时间120s，解离时间180s运行。解离结束之后，采用10mM Gly-HCl(pH 2.0)再生芯片20s以完全去除与芯片结合的抗体。实验采用多循环运行，其响应信号以分析时间为横坐标，响应值为纵坐标。所得数据进行双参比扣减后，通过BIAcore T200分析软件进行拟合，所采用的拟合模型为1:1Langmuir结合模型，确定其结合解离常数等亲和力指标。
结果如表4所示，结果显示三特异性抗体TsAb1保留了与亲本PD-L1抗体D21-4、亲本HER2抗体Trastuzumab和VEGF亲本抗体P30-10-26相当的抗原结合活性。
表4抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体的亲和力测定数据表
实施例5抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体阻断活性分析
本实施例采用FACS方法检测三特异性抗体对PD-1/PD-L1相互作用的阻断活性，具体方法如下：收集huPD-L1-CHO-S细胞，300g离心去上清，将细胞用FACS缓冲液重悬，计数并将细胞悬液密度调整为2×106个活细胞/mL。将huPD-L1-CHO-S细胞以100μL每孔加入96孔圆底板，300g离心去上清后向对应孔中加入不同浓度的三特异性抗体、对照抗体D21-4和人IgG1同型抗体(同型对照)，重悬细胞后放置于4℃孵育30分钟。将孵育后的细胞混合液洗涤3次后加入生物素标记的重组人PD-1-His蛋白稀释液(1μg/mL)100μL，4℃孵育30分钟。洗涤3次后加入PE标记的streptavidin(eBioscience，12-4317-87)，4℃孵育30分钟，将孵育后的细胞混合液洗涤3次后加入200μL的FACS缓冲液重悬细胞，最后通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX AOO-1-1102)上机检测。利用PRISMTM(GraphPad Software,San Diego，CA)分析数据，并且计算IC50值。
阻断检测结果如图5和表5所示，三特异性抗体TsAb1和TsAb3对PD-1与PD-L1相互作用的阻断活性与亲本抗体D21-4相当，TsAb2对PD-1与PD-L1相互作用的阻断活性略弱于D21-4，但依然保留了良好的阻断活性。
表5抗HER2&PD-L1&VEGF三特异性抗体的阻断活性
实施例6抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体对PD1/PD-L1及VEGF/VEGFR信号途径的影响
6.1抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体对PD-1/PD-L1信号途径的影响
本实施例采用荧光素酶报告基因系统检测本申请获得的抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体对PD-1/PD-L1下游信号途径的影响，具体方法如下：取对数期PD-1-NF-AT-Jurkat细胞(Jurkat细胞(TIB-152)稳定表达PD-1(UniProtKB-Q15116)和荧光素酶)和CD3L-PD-L1-CHO细胞(在CHO细胞中稳定表达PD-L1(UniProtKB-Q9NZQ7)和抗-CD3-scFv)，将两种细胞按1:5混合并使其密度分别为4×106和2×107个活细胞/mL。梯度稀释待检抗体，向96孔透明底白板(Corning，3610)每孔加入50μL抗体稀释液，随后以50μL/孔加入混合细胞悬液，放置于37℃细胞培养箱中静置培养6h。每孔加入50μL Bright-Lite(Vazyme，DD1204-03)，避光孵育10min，检测荧光信号。
荧光素酶报告基因检测结果如图6A所示，三特异性抗体TsAb1可以逆转PD-L1结合对PD-1下游信号途径的抑制且其功能与亲本抗体D21-4相当。
6.2抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体对VEGF/VEGFR2下游信号途径的影响
本实施例采用荧光素酶报告基因系统检测本申请获得的抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体对VEGF/VEGFR2下游信号途径的活性，具体方法如下：取对数期VEGFR2-NF-AT-HEK293细胞(HEK293T细胞(CRL-1573)稳定表达VEGFR2(UniProtKB-P35968)和荧光素酶)，将细胞密度调整为4×105个活细胞/mL并以50μL/孔接种至96孔透明底白板(Corning，3610)。使用含60ng/mL VEGF-Fc的培养基梯度稀释待检抗体，向已加有细胞的96孔板每孔加入50μL抗体稀释液，轻轻混匀后放置于37℃细胞培养箱中静置培养6h。每孔加入50μL Bright-Lite(Vazyme，DD1204-03)，避光孵育10min，检测荧光信号。
荧光素酶报告基因系统检测结果如图6B所示，三特异性抗体TsAb1、TsAb2和TsAb3可抑制VEGF对VEGFR2下游信号途径的激活且其功能与亲本VEGF抗体P30-10-26或贝伐珠单抗相近。
实施例7抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体介导的ADCC活性分析
7.1荧光素酶报告基因系统检测抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体介导的ADCC活性
本实施例采用荧光素酶报告基因系统检测抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体介导的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性，具体方法如下：取对数期的靶细胞(SK-BR-3，人乳腺导管癌细胞BT474或人胃癌细胞NCI-N87细胞)和效应细胞CD16a(V158)-NF-AT-Jurkat细胞(稳定转染了CD16a(V158)序列(UniProtKB-P08637)和含有NF-AT-re核酸序列的pGL4.30质粒(Promega，E8481)的Jurkat细胞(TIB-152))，将效应细胞和靶细胞按1:10混合并使其密度分别为4×106和4×105个活细胞/mL。梯度稀释待检抗体，向96孔透明底白板(Corning，3610)每孔加入50μL抗体稀释液，随后以50μL/孔加入混合细胞悬液，放置于37℃细胞培养箱中静置培养6h。向每孔加入50μL Bright-Lite(Vazyme，DD1204-03)，避光孵育10min，检测荧光信号。
ADCC检测结果如图7A-7C所示，其中图7A-7C分别为抗体在SK-BR-3、BT-474和NCI-N87细胞上的ADCC活性结果，三特异性抗体TsAb1在SK-BR-3、BT-474和NCI-N87细胞上均可介导与对照抗体Trastuzumab相当的ADCC活性。
7.2 PBMC杀伤检测抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体介导的ADCC活性
取对数生长期SK-BR-3细胞或huPD-L1 NCI-N87细胞(过表达人PD-L1的NCI-N87细胞)，使用含2％FBS培养基将细胞密度调整为2×105个活细胞/ml，以50μL/孔接种至96孔平底细胞培养板，于37℃培养箱中培养过夜。使用含2％FBS培养基梯度稀释待检抗体和对照抗体，将稀释后抗体以50μL/孔对应加入已接种有细胞的96孔板中，于培养箱中静置孵育30min。提前将PBMC复苏，于37℃培养箱中静置孵育2h。轻轻吸取PBMC细胞培养瓶中上清，离心去除培养基，使用含10％FBS完全培养基重悬细胞并将细胞密度调整为4×106个活细胞/ml，以100μL/孔接种至上述96孔细胞培养板。使用LDH检测试剂盒(Takara,MK401)检测抗体介导的PBMC对肿瘤细胞的杀伤，杀伤结果显示为靶细胞的裂解率。
PBMC杀伤检测结果如图7D-7E所示，其中图7D和图7E分别为SK-BR-3和huPD-L1NCI-N87细胞上的ADCC活性结果，可见，三特异性抗体TsAb1在SK-BR-3和huPD-L1 NCI-N87细胞上介导的ADCC活性与对照抗体Trastuzumab相当。
实施例8抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体抑制SK-BR-3细胞增殖活性分析
取对数生长期SK-BR-3细胞，使用RPMI 1640(含1％FBS)培养基将细胞密度调整为2×104个活细胞/ml，以100μL/孔接种至96孔平底细胞培养板，于37℃细胞培养箱中培养过夜。使用RPMI 1640(含1％FBS)培养基梯度稀释待检抗体，以50μL/孔加至过夜培养的SK-BR-3细胞的96孔细胞培养板中并将其放置于37℃培养箱中培养72h。提前将MTS检测试剂放置于室温化冻并平衡至室温。将细胞培养板放置于室温15min使其平衡至室温，以30μL/孔向96孔细胞培养板加入MTS检测试剂，于酶标仪上振荡1min后，然后37℃避光孵育3h，取出细胞培养板并平衡至室温，读取OD492。
增殖抑制活性检测结果如图8A所示，三特异性抗体TsAb1对SK-BR-3的增殖抑制活性与对照抗体Trastuzumab相当。
实施例9抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体抑制VEGF诱导的HUVEC增殖活性分析
使用EBM-2完全培养基提前一周复苏人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞,ATCC:PCS-100-010)，每隔3天对HUVEC细胞传代，用于增殖抑制实验的HUVEC细胞传代不超过5代。使用含0.5％FBS的EBM-2培养基将细胞密度调整为5×104个活细胞/ml，以50μL/孔接种至96孔平底细胞培养板并于37℃培养箱中培养过夜。使用含800ng/mL VEGF-Fc的EBM-2基础培养基梯度稀释待检抗体及对照抗体并以50μL/孔对应加入已接种有HUVEC细胞的96孔板中，轻轻拍打混匀，于37℃培养箱中培养3天。向96孔板每孔加入20μL MTS，轻轻拍打混匀，于37℃培养箱中孵育5h，将96孔板平衡至室温后于酶标仪中读取OD492。
HUVEC增殖抑制实验结果如图8B所示，三特异性抗体TsAb1可显著抑制VEGF诱导的HUVEC细胞增殖且其增殖抑制率与亲本单抗P30-10-26相当。
实施例10抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体在混合淋巴细胞反应(MLR)中的活性分析
首先使用美天旎CD4+T分选试剂盒(Miltenyi,130-096-533)从PBMC细胞中分选出CD4+T细胞。同时使用美天旎CD14 MicroBeads试剂盒(Miltenyi,130-050-201)从PBMC细胞中分选获得CD14+单核细胞，用RPMI 1640完全培养基调整细胞密度后，加入rhGM-CSF和rhIL-4诱导单核细胞形成DC细胞。使用RPMI 1640完全培养基对待检抗体和对照抗体Avelumab进行4倍梯度稀释。使用RPMI 1640完全培养基复苏CD4+T细胞，将细胞密度调整为2×106个活细胞/mL。使用RPMI 1640完全培养基将DC细胞密度调整为2×105个活细胞/mL，并将CD4+T细胞和DC细胞按1:1混合，充分混匀。取细胞混合液6mL，加入3mL完全培养基，充分混匀后以150μL/孔接种至96孔平底细胞培养板中。向96孔板每孔对应加入50μL梯度稀释的抗体，轻轻混匀后，置于培养箱中培养48h后取上清检测IL-2分泌，培养5天后取上清检测IFNγ分泌。
混合淋巴细胞实验结果如图9A和9B所示，三特异性抗体TsAb1能够以浓度依赖的方式诱导CD4+T细胞分泌IFNγ和IL-2且优于已上市PD-L1单抗Avelumab，表明其可解除树突状细胞表面PD-L1对T细胞的抑制效应。
实施例11抗HER2/PD-L1/VEGF三特异性抗体的体内药效
选择8周龄雌性NCG小鼠(购自维通利华)，将对曲妥珠单抗有应答的外源表达PD-L1的人胃癌细胞huPD-L1 NCI N87以1×107个细胞/只进行皮下荷瘤，荷瘤7天后根据小鼠肿瘤体积以8只/组进行随机分组，共7组。分组后，通过尾静脉向每只小鼠注射5×106个人PBMC细胞以对小鼠免疫系统进行免疫重建。4h后，分别以腹腔注射方式向小鼠注射等摩尔剂量的Trastuzumab(35nM/kg)，Avelumab(35nM/kg)，Bevacizumab(35nM/kg)，Trastuzumab+Avelumab(35+35nM/kg)，Avelumab+Bevacizumab(35+35nM/kg)以及高剂量(87.5nM/kg，即17.8mpk)和低剂量(35nM/kg，即7.1mpk)的三特异性抗体TsAb1，给药频率为2次/周，共给药8次。每周对小鼠肿瘤体积和体重进行两次测量和记录。按照公式(长*宽2)/2计算肿瘤体积(单位：mm3)。实验结束时，通过颈椎脱臼法处死小鼠，剥离小鼠肿瘤组织并对其肿瘤进行测量和记录。
体内药效实验结果如图10所示，其中如图10A-C所示，Avelumab和Bevacizumab单独用药仅能微弱地抑制肿瘤生长，而Trastuzumab单独用药、Trastuzumab与Avelumab以及Avelumab与Bevacizumab的联合用药均能够显著抑制小鼠肿瘤的生长。相比单独用药对照组以及联合用药对照组，三特异性抗体TsAb1在高剂量(87.5nM/kg)和低剂量(35nM/kg)下均能更加显著有效地抑制肿瘤生长，表明由于三特异性抗体TsAb1可以同时识别3个靶点(HER2/PD-L1/VEGF)，有效促进/激活基于各个靶点的抗肿瘤机制，从而获得高效的抗肿瘤协同作用，因而在肿瘤的治疗中发挥重要的价值。
序列表
<110> 三优生物医药（上海）有限公司
<120> 靶向HER2，PD-L1和VEGF的三特异性抗体
<130> PF 220278CNI
<160> 27
<170> PatentIn version 3.3
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435 440 445
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
450 455 460
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
465 470 475 480
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
485 490 495
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
500 505 510
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
515 520 525
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
530 535 540
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
545 550 555 560
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
565 570 575
Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
580 585 590
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
595 600 605
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gly
610 615 620
Leu Asp Tyr Tyr Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu
625 630 635 640
Arg Glu Gly Val Ser Cys Ile Gly Ser Ser Ser Lys Glu Thr Asn Tyr
645 650 655
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
660 665 670
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
675 680 685
Val Tyr Tyr Cys Thr Ala Gly Ser Pro Leu Cys Leu Ile Ser Leu Gln
690 695 700
Asp His Tyr Gly Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
705 710 715 720
Val Thr Val Ser Ser
725
<210> 7
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建的
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 8
<211> 581
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建的
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Thr Asp Arg Asn Ile Asn
20 25 30
Thr Met His Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Trp Val
35 40 45
Gly Thr Ile Phe Ile Asp Leu Asn Thr Ile Val Thr Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Asp Val Ser Gly Tyr Gly Arg Ala Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
130 135 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile
145 150 155 160
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
180 185 190
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
195 200 205
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
260 265 270
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
275 280 285
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
290 295 300
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
305 310 315 320
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
325 330 335
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340 345 350
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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
370 375 380
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
385 390 395 400
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
405 410 415
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
420 425 430
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
435 440 445
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
450 455 460
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
465 470 475 480
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
485 490 495
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
500 505 510
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
515 520 525
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
530 535 540
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
545 550 555 560
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
565 570 575
Leu Ser Pro Gly Lys
580
<210> 9
<211> 358
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建的
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gly Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Gly Ser Ser Ser Lys Glu Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
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Thr Ala Gly Ser Pro Leu Cys Leu Ile Ser Leu Gln Asp His Tyr Gly
100 105 110
Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
145 150 155 160
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
165 170 175
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
210 215 220
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225 230 235 240
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
245 250 255
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
260 265 270
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
305 310 315 320
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
325 330 335
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
340 345 350
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
355
<210> 10
<211> 594
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建的
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gly Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Gly Ser Ser Ser Lys Glu Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ala Gly Ser Pro Leu Cys Leu Ile Ser Leu Gln Asp His Tyr Gly
100 105 110
Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
145 150 155 160
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
165 170 175
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
180 185 190
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
195 200 205
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
210 215 220
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
260 265 270
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
275 280 285
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
290 295 300
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
305 310 315 320
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
325 330 335
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
340 345 350
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
355 360 365
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
370 375 380
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
385 390 395 400
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
405 410 415
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
420 425 430
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
435 440 445
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
450 455 460
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
465 470 475 480
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
485 490 495
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
500 505 510
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
515 520 525
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
530 535 540
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
545 550 555 560
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
565 570 575
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
580 585 590
Gly Lys
<210> 11
<211> 345
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建的
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Thr Asp Arg Asn Ile Asn
20 25 30
Thr Met His Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Trp Val
35 40 45
Gly Thr Ile Phe Ile Asp Leu Asn Thr Ile Val Thr Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Asp Val Ser Gly Tyr Gly Arg Ala Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
130 135 140
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val
145 150 155 160
Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
165 170 175
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg
180 185 190
Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
195 200 205
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr
210 215 220
Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
225 230 235 240
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
245 250 255
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
260 265 270
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
275 280 285
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
290 295 300
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
305 310 315 320
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
325 330 335
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
340 345
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建的
<400> 12
Arg Thr Asp Arg Asn Ile Asn Thr Met His
1 5 10
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建的
<400> 13
Thr Ile Phe Ile Asp Leu Asn Thr Ile
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建的
<400> 14
Asp Val Ser Gly Tyr Gly Arg Ala
1 5
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建的
<400> 15
Gly Phe Gly Leu Asp Tyr Tyr Ala Ile Gly
1 5 10
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建的
<400> 16
Cys Ile Gly Ser Ser Ser Lys Glu Thr Asn
1 5 10
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建的
<400> 17
Gly Ser Pro Leu Cys Leu Ile Ser Leu Gln Asp His Tyr Gly Leu Tyr
1 5 10 15
Glu Tyr Asp Tyr
20
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建的
<400> 18
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建的
<400> 19
Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg
1 5 10
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建的
<400> 20
Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建的
<400> 21
Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建的
<400> 22
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建的
<400> 23
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 24
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建的
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 25
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建的
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 26
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建的
<400> 26
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
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100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 27
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建的
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450

Claims (15)

1.一种靶向HER2、PD-L1和VEGF的三特异性抗体，所述抗体包含两条相同的第一多肽和两条相同的第二多肽，其中所述三特异性抗体包含以下结构：
1)第一多肽从N端到C端包含：VHH1-(X)n-VH-CH1-Hinge-Fc-(Y)m-VHH2；
第二多肽从N端和C端包含：VL-CL；或
2)第一多肽从N端到C端包含：VHH1-(X)n-VH-CH1-Hinge-Fc；
第二多肽从N端和C端包含：VHH2-(Y)m-VL-CL；
其中，VHH1表示结合第一靶点的第一VHH结构域、VHH2表示结合第二靶点的第二VHH结构域、VH和VL组合结合第三靶点；
其中，X和Y表示连接子，且n＝0或1，m＝0或1；
其中，Fc表示免疫球蛋白重链Fc结构域，CH1表示免疫球蛋白重链CH1结构域，CL表示免疫球蛋白轻链CL结构域，
其中，两条第一多肽的Fc结构域相互配对同二聚化，VH-CH1和VL-CL相互配对形成Fab，由此形成类似天然IgG免疫球蛋白的4聚体结构；
其中，VHH1和VHH2分别结合选自PD-L1或VEGF的不同靶点，VH和VL配对结合HER2。
2.权利要求1所述的三特异性抗体，其中
所述VHH1包含如SEQ ID NO:12-14所示的3个CDR，VHH2包含如SEQ ID NO:15-17所示的3个CDR，VH包含如SEQ ID NO:18-20所示的3个重链CDR，VL包含如SEQ ID NO:21-23所示的3个轻链CDR，或
所述VHH1包含如SEQ ID NO:15-17所示的3个CDR，VHH2包含如SEQ ID NO:12-14所示的3个CDR，VH包含如SEQ ID NO:18-20所示的3个重链CDR，VL包含如SEQ ID NO:21-23所示的3个轻链CDR。
3.权利要求1或2所述的三特异性抗体，其中
VHH1包含如SEQ ID NO:1所示的序列或由其组成，VHH2包含如SEQ ID NO:4所示的序列或由其组成，VH包含如SEQ ID NO:2所示的序列或由其组成，VL包含如SEQ ID NO:3所示的序列或由其组成，或
VHH1包含如SEQ ID NO:4所示的序列或由其组成，VHH2包含如SEQ ID NO:1所示的序列或由其组成，VH包含如SEQ ID NO:2所示的序列或由其组成，VL包含如SEQ ID NO:3所示的序列或由其组成。
4.权利要求1-3中任一项所述的三特异性抗体，其中所述CH1、Hinge和Fc来源于相同或者不同类型的免疫球蛋白分子，优选地来自相同的免疫球蛋白分子，更优选地，所述CH1、Hinge和Fc来源于IgG型免疫球蛋白，尤其来源于人IgG免疫球蛋白，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白。
5.权利要求1-4中任一项所述的三特异性抗体，其中所述VL和CL来源于相同或者不同类型的免疫球蛋白分子，优选地来自相同的免疫球蛋白分子，其中CL是κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。
6.权利要求1-5中任一项所述的三特异性抗体，其中所述连接子X与Y相同或不同，n＝1，m＝1，例如X和Y分别独立地为长度8-30个氨基酸的连接子，优选X和Y包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由其组成。
7.权利要求1-6中任一项所述的三特异性抗体，其中
所述第一多肽包含如SEQ ID NO:6所示的序列或包含与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性且包含相同CDR的序列，第二多肽包含如SEQ ID NO:7所示的序列或包含与SEQ ID NO:7具有至少90％同一性且包含相同CDR的序列，或
所述第一多肽包含如SEQ ID NO:8所示的序列或包含与SEQ ID NO:8具有至少90％同一性且包含相同CDR的序列，第二多肽包含如SEQ ID NO:9所示的序列或包含与SEQ ID NO:9具有至少90％同一性且包含相同CDR的序列，或
所述第一多肽包含如SEQ ID NO:10所示的序列或包含与SEQ ID NO:10具有至少90％同一性且包含相同CDR的序列，第二多肽包含如SEQ ID NO:11所示的序列或包含与SEQ IDNO:11具有至少90％同一性且包含相同CDR的序列。
8.一种编码如权利要求1-7中任一项所述三特异性抗体的多核苷酸。
9.一种包含权利要求8所述的多核苷酸的载体，优选表达载体。
10.一种包含权利要求8所述的多核苷酸或包含权利要求9所述的载体的宿主细胞，例如，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
11.一种用于生产三特异性抗体的方法，所述方法包括：
在适于表达抗体的多肽链的条件下培养包含编码所述多肽链的宿主细胞；和在适于所述多肽链装配为所述抗体的条件下使多肽链装配产生所述抗体。
12.药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项所述的三特异性抗体和可药用载体。
13.根据权利要求1-7中任一项所述的三特异性抗体或权利要求12所述的药物组合物在制备用于在受试者中治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
14.一种治疗受试者疾病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1-7中任一项所述的三特异性抗体或权利要求12所述的药物组合物。
15.权利要求13所述的用途或权利要求14所述的方法，其中所述疾病为癌症，例如，乳腺癌，胃癌，卵巢癌，胃食管交界处癌，膀胱癌，小肠癌和壶腹癌，食道癌、肺癌和宫颈癌。
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