CN116947982B - 三条优势表位肽序列及其在流感病毒疫苗的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫学技术领域，涉及包含用于预防和治疗流感病毒介导的疾病的肽免疫原的组合物，公开了三条流感病毒HA2的优势表位肽序列及其在流感病毒疫苗研发的应用。本发明的三条优势表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1‑3所示。本发明通过对流感病毒HA2进行免疫信息学预测和动物实验验证相结合筛选出三条具有免疫原性的优势表位肽，这三条优势表位肽具有T/B细胞表位，能够诱导细胞免疫和体液免疫；作为鼻内疫苗的免疫原能够诱导强效的黏膜免疫，可诱导针对流感病毒的高滴度的sIgA。相比同样针对该抗原区的其他多肽，本发明的优势表位肽具有高效价和高保守性，可作为流感疫苗的候选免疫原。

Description

三条优势表位肽序列及其在流感病毒疫苗的应用

技术领域

本发明涉及免疫学技术领域，具体的说是涉及三条优势表位肽序列及其在流感病毒疫苗的应用。

背景技术

流感病毒持续威胁着全球公共卫生安全，接种季节性流感疫苗仍是目前预防和控制流感流行的最有效措施。由于流感病毒的抗原漂移和抗原转变，季节性流感疫苗必须每年重新配制和重新接种以匹配流行毒株，因此，季节性流感疫苗提供的保护范围非常有限，其有效性很大程度上取决于疫苗覆盖毒株和流行毒株的匹配度。常规的季节性流感疫苗一般是在鸡胚或细胞中培养病毒，经处理后制成疫苗，生产复杂、耗时、依赖性强。因此，亟需开发一种对大多数流感病毒有效的、不依赖鸡胚与细胞的、生产速度快的“通用”流感疫苗。“通用”流感疫苗的研发需要将免疫反应集中于保守表位，从而提高免疫的广度。表位疫苗有可能诱导出对自然免疫过程中的非显性或隐性表位的强烈免疫应答，且其制造工艺简单，在大肠杆菌中即可快速制备，成本低，更适合大规模生产。血凝素(HA)蛋白是是介导病毒入侵宿主细胞的关键蛋白，其茎部区(HA2)在同亚型的IAV中高度保守，并且靶向HA2的抗体具有广泛的交叉反应性，可通过阻止病毒与宿主细胞之间的膜融合来中和病毒感染。但是目前仍缺少已知的可诱导保护性免疫的HA2表位。

当前流感疫苗技术存在的缺点和问题主要包括以下几点：

1.有限的保护范围：传统季节性流感疫苗的保护范围受限于疫苗覆盖毒株与流行毒株的匹配度。流感病毒的抗原漂移和抗原转变导致病毒株不断变化，使得疫苗的保护效果受到限制。

2.生产复杂和耗时：常规的季节性流感疫苗生产过程需要在鸡胚或细胞中培养病毒，经过处理后制成疫苗。这种生产方法复杂、耗时且依赖性强，不利于快速应对流感病毒的变异。

3.需每年重新配制和接种：由于流感病毒的变异，季节性流感疫苗必须每年重新配制和接种，给公共卫生体系带来较大的负担。

4.通用流感疫苗研发面临挑战：“通用”流感疫苗需要将免疫反应集中于保守表位，以提高免疫广度。然而，目前仍缺少已知的可诱导保护性免疫的HA2表位，使得通用流感疫苗的研发面临挑战。

5.表位疫苗的不确定性：虽然表位疫苗具有制造工艺简单、成本低等优点，但其在诱导对自然免疫过程中的非显性或隐性表位的强烈免疫应答方面的效果仍存在不确定性，需要进一步研究和验证。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的目的之一在于针对流感病毒HA2保守区筛选出三条优势表位肽序列，所述表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-3所示，由SEQ ID NO:1-3任一多肽序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或插入且具有相同功能的由SEQID NO:1-3任一多肽衍生的多肽。

本发明的目的之二是提供编码所述优势表位肽的基因。

本发明的目的之三是提供所述的优势表位肽在制备抗流感病毒疫苗、抗体、药物中的应用。

本发明的目的之四是提供所述优势表位肽的基因在制备抗流感病毒疫苗、抗体、药物中的应用。

本发明的目的之五是提供一种流感表位疫苗，其免疫原来自于所述优势表位肽的一种或多种以及不同拷贝数的组合。

本发明的目的之六是提供一种流感表位疫苗，其载体为KLH载体、诺如病毒P颗粒载体、Ferritin纳米载体，但不限于这些载体。

本发明的目的之七是提供一种流感表位疫苗，其免疫途径为肌肉注射、皮下注射、鼻喷式、吸入式，但不限于这些途径。

本发明的目的之八是提供一种流感表位疫苗，可不含佐剂或包含佐剂，所述佐剂为AS03、Al(OH)₃，但不限于这些佐剂。

结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

第一、本发明提供了三条可诱导保护性免疫的HA2表位肽序列，提高了现有流感疫苗的保护范围。由于目前缺少已知的可诱导保护性免疫的HA2表位，本发明以H3N2的高度保守HA2序列为基础，首先使用免疫信息学进行表位的预测，接着将预测得到的多个表位与蛋白载体进行融合并在大肠杆菌内表达，然后在动物模型上验证融合蛋白的免疫原性和保护性，最终获得三条具有高保守性和广谱中和活性的B细胞表位、Th表位以及CTL表位。本发明的优势表位肽可视为能有效刺激机体体液免疫和细胞免疫的病毒亚单位可将免疫反应精准靶向至保守表位，进一步提高保护的效力和范围，明显优于已有的流感疫苗。所述的优势表位肽由大肠杆菌制备，生产简便迅速，使用安全有效，在抗流感病毒疫苗、抗体、药物研发中有着广泛的应用前景。本发明的研究方法同样适用于筛选其他高度变异性的致病病原体的优势表位。

第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：

本发明提供了三条优势表位肽序列，以所述的表位肽为抗原组分可在大肠杆菌内制备，可激发有效的适应性免疫应答并提高疫苗保护的范围，具备传统疫苗不可比拟的优点。

第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：

(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：

本发明提供了三条优势表位肽序列，可依托大肠杆菌进行制备，生产成本、生产速度、安全性、保护范围等方面明显优于传统的流感疫苗。

(2)本发明的技术方案是否解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：

本发明提供了三条优势表位肽序列，改善了现有的HA2表位的数目不足的缺陷，扩大了流感疫苗的保护广度。本发明基于抗原表位预测分析技术、蛋白表达技术、动物实验技术筛选出特异性抗原表位肽，在病毒感染性疾病的快速免疫诊断和预防及治疗类疫苗开发中具有重要的意义。

(4)本发明的技术方案是否克服了技术偏见：。

本技术方案克服了现有的流感疫苗的生产不能脱离鸡胚或细胞的问题。

附图说明

图1为H3N2的HA2序列分析；其中，A.1968-2020年9532条H3N2病毒的HA2各位点氨基酸保守性分析；B.高保守的HA2序列，即A/Nicaragua/8774_10/2016的HA2序列；C.各亚型甲型流感病毒HA2的序列比对；

图2为优势表位肽序列；其中，A.H3N2的三维结构图(PDB:6BKP)；B.根据免疫信息学预测与动物实验验证相结合获得的优势表位肽序列；

图3为优势表位肽与Ferritin载体的融合蛋白的透射电镜观察图；

图4为融合蛋白免后血清的抗体结合活性检测图，Ferritin为阴性对照组，H3Vaccine为H3单价裂解疫苗组；其中，A.表位特异性结合抗体；B和C.H3N2特异性结合抗体；D.H1N1特异性结合抗体；E.乙型流感病毒特异性结合抗体；F.抗体分型检测；

图5为融合蛋白免后血清的抗体中和活性检测图；

图6为融合蛋白免后的细胞免疫评价图；其中，A和B.免后小鼠的CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺T细胞增殖检测；C.肽特异性的体内CTL检测；

图7为攻毒后小鼠的体重变化与生存曲线；

图8为多表位疫苗经滴鼻接种后的免疫原性检测图；其中，A.血清中表位特异性结合抗体；B.免后小鼠的CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺T细胞增殖检测；C.血清中表位特异性结合抗体的长效性检测；D.鼻洗液(NLF)和肺泡灌洗液(BALF)中的sIgA滴度。

图9为滴鼻接种的多表位疫苗和H3裂解疫苗的保护性评价图；其中，A.攻毒后小鼠的体重变化；B.攻毒后小鼠的生存曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：抗原保守性分析

从NCBI流感数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html)下载了1968-2020年9532条H3N2亚型病毒的HA2序列，经BioEdit软件进行各位点氨基酸保守性分析以及病毒循环性分析，获得高保守的HA2序列(A/Nicaragua/8774_10/2016)，除了第18、32、46、57、77、121、123、149、155、160位点外，其余位点的氨基酸保守性均在95％以上。异亚型的HA2除了融合肽区域(HA2第1-24位)外，其余位点的氨基酸差异性较大(图1)。

实施例2：表位预测与验证

以H3N2的保守HA2序列为基础，首先使用IEDB数据库进行B细胞表位的预测(http://tools.iedb.org/main/bcell/)，Kolaskar&Tongaonkar法预测抗原表位，默认阈值为1；Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0预测线性B细胞表位，默认阈值为0.5；然后使用ABCpred(https://webs.iiitd.edu.in/cgibin/abcpred/)预测B细胞表位，默认阈值为0.5、16肽；接着使用IEDB数据库进行MHCⅡ类和MHCⅠ类分子结合位点的预测(http://tools.iedb.org)，使用IEDB推荐的综合预测方法和默认阈值；同时使用两种直接的CTL表位预测方法，一种是基于共识和组合ANN/SVM算法的CTL PRED(https://webs.iiitd.edu.in/cgibin/ctlpred/ctlpred.pl)，另一种是基于ANN的NetCTLpan(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetCTLpan-1.1)。经动物实验验证，最终获得三条能有效刺激机体体液免疫和细胞免疫的优势表位肽，命名为E1～E3(图2)。

实施例3：单表位疫苗的制备

本实施例采用Ferritin载体，该载体通过吉林大学艾滋病疫苗国家工程实验室构建表达获得，但不限于此载体。将编码幽门螺旋杆菌的Ferritin(NCBI ReferenceSequence:WP_000949190.1)与本发明的优势表位肽的基因插入至原核表达载体pET-20b(+)中，N端为His-tag，之后转化入表达感受态BL21(DE3)内，待菌处于对数生长期时，加0.5mM IPTG于18℃过夜诱导，经离心收菌、超声破碎后，上清液依次经过亲和层析纯化和透析等步骤即可获得表位与Ferritin载体的融合蛋白，命名为E1-Ferritin～E3-Ferritin(图3)。

实施例4：单表位疫苗的皮下免疫与免疫原性和保护性评价

动物免疫：免疫对象为6～8周龄的BALB/c雌鼠，免疫三次，间隔两周，皮下免疫剂量为20μg/只，免疫佐剂为铝佐剂(Thermo Fisher Scientific)3:1体积混合。

结合活性检测：应用间接ELISA法检测单表位疫苗免疫后的结合抗体效价，结果表明，单表位疫苗可诱导高水平的抗多肽、抗H3病毒的结合抗体，E1多肽可诱导对H1病毒的交叉结合抗体(图4.A-E)。

抗体分型检测：包被、封闭、一抗同结合活性的检测方法，二抗加入兔抗分型抗体(Sigma)，三抗加入HRP-山羊抗兔抗体，显色、终止检测同上。结果显示，E3表位诱导的IgG1/IgG2a比较趋向于1，即诱导了相对平衡的Th1和Th2免疫倾向性；E1和E2表位倾向于诱导Th2型免疫应答(图4.F)。

中和活性检测：于8个1.5mL EP管中加入50μL病毒培养基，将50μL血清加入第一个管中，依次倍比稀释至第8个管，最后弃去50μL，将50μL100×TCID₅₀的流感病毒加入各管中，缓慢吹打混匀，在37℃培养箱内共孵育1h；取上述血清-病毒混合液加入96孔板中，随后每孔加入MDCK细胞(1.5×10⁴个/孔)，置于37℃培养箱内培养；孵育48h后，使用细胞病变效应(CPE)的可视化来计算ID₅₀值。50％抑制剂量(ID₅₀)定义为中和50％病毒的血清稀释倍数。结果显示，单表位疫苗可诱导高水平的抗H3病毒的中和抗体，E1表位可诱导对H1病毒的交叉中和抗体(图5)。

淋巴细胞检测：使用红细胞裂解液(Biolegend)分离出免疫后小鼠的脾淋巴细胞，用FITC标记的抗鼠-CD3抗体、PE标记的抗鼠-CD4抗体和APC标记的抗鼠-CD8a抗体染色；冰上避光孵育20min后，350×g离心5min，弃去上清；用cell staining buffer洗涤两次后，于细胞中加入500μL cell staining buffer悬浮细胞，随后加入5μL 7-AAD，冰上避光孵育5min后，立即使用流式细胞仪检测。结果显示，单表位疫苗可刺激免疫小鼠的CD3⁺CD4⁺及CD3⁺CD8⁺T细胞增殖(图6.A-B)。

体内CTL检测：使用红细胞裂解液分离出空白小鼠的脾淋巴细胞，一半与多肽共孵育2h后染高浓度的CFSE(5μM)作为靶细胞，另一半与BSA共孵育2h后染低浓度的CFSE(0.5μM)作为对照细胞，将相同数量的两组细胞混合之后尾静脉注射于免后小鼠体内，10h后分离脾细胞，使用流式细胞仪检测两组细胞的比例。结果显示，E2、E3表位可诱导小鼠产生肽特异性的CTL(图6.C)。

攻毒保护性检测：第三次免疫两周后对小鼠进行鼻腔攻毒，攻毒剂量为20μL10⁸EID₅₀ A/Wisconsin/67/2005(H3N2)。攻毒后每天记录小鼠的体重变化和存活率，体重减轻25％以上的小鼠视为死亡，共计检测14天。结果显示，E3组小鼠在攻毒后体重下降超过20％，最终的存活率为67％。E1、E2组小鼠在攻毒后体重下降15％左右，E2组小鼠的存活率为83％，E1组小鼠全部存活(图7)。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

所述Ferritin载体疫苗的制备方法与诺如病毒P颗粒载体疫苗的制备方法相同。

所述序列表

二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。

实施例5：多表位疫苗的黏膜免疫评价

黏膜免疫是机体抵御呼吸道病毒入侵的首道屏障，可以模拟自然感染途径。将三条优势表位肽以串联的形式与Ferritin进行融合表达，其质粒构建、蛋白表达纯化方式同上所述，制备的多表位疫苗(E1-E2-E3-F)经滴鼻形式进行动物免疫，其体液免疫、细胞免疫、攻毒保护性检测方法同上所述。

黏膜免疫检测小鼠鼻洗液(NLF)和肺泡灌洗液(BALF)中的分泌性IgA(sIgA)滴度。结果显示，多表位疫苗经滴鼻接种可直接刺激呼吸道黏膜产生大量sIgA，可有效地阻止病毒在呼吸道上皮黏附和定植，同时还诱导广泛持久的体液免疫和细胞免疫，可保护小鼠免受H3N2病毒的攻击(图8)。本发明提供了三条优势表位肽序列，并以此序列为基础依托大肠杆菌生产制备的多表位疫苗经滴鼻接种可产生同依托鸡胚制备的、肌肉注射的单价裂解疫苗(H3 vaccine)一致的保护效果(图9)。本发明的实施在生产成本、接种方式上明显优于现有技术，本发明在病毒感染性疾病的快速免疫诊断和预防及治疗类疫苗开发中具有重要的意义。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表信息:

DTD版本:V1_3

文件名:三条优势表位肽序列及其在流感病毒疫苗的应用.xml

软件名称:WIPO Sequence

软件版本:2.3.0

生成日期:2023-07-12

基本信息:

当前申请/知识产权局:CN

当前申请/申请人档案名:Jilin University

申请人姓名或名称:吉林大学

申请人姓名或名称/语言:zh

申请人姓名或名称/拉丁名称:Jilin University

发明人姓名:单亚明、石玉华、聂娇娇、王清豫

发明人姓名/语言:zh

发明人姓名/拉丁名称:Shan Yaming,Shi Yuhua,Nie Jiaojiao,Wang Qingyu

发明名称:三条优势表位肽序列及其在流感病毒疫苗的应用(zh)

序列总量:3

序列:

序列号(ID):1

序列号(ID):2

序列号(ID):3

Claims (8)

1.流感病毒HA2的优势表位肽，其特征在于，所述优势表位肽的氨基酸序列如 SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3所示。

2.一种基因，其特征在于，所述基因编码如权利要求1所述优势表位肽。

3.一种优势表位肽在制备抗H3N2流感病毒疫苗中的应用，其特征在于，使用如权利要求1所述的流感病毒HA2的优势表位肽。

4.一种基因在制备抗H3N2流感病毒疫苗中的应用，其特征在于，使用如权利要求2所述的基因。

5.一种流感表位疫苗，其特征在于，其免疫原来自于权利要求1所述优势表位肽的一种或多种以及不同拷贝数的组合。

6.如权利要求5所述的流感表位疫苗，其特征在于，所述流感表位疫苗的载体为血蓝蛋白KLH载体、诺如病毒P颗粒载体、Ferritin纳米载体。

7.根据权利要求5所述的流感表位疫苗，其特征在于，所述流感表位疫苗的免疫途径为肌肉注射、皮下注射、鼻喷式、吸入式。

8.根据权利要求5所述的流感表位疫苗，其特征在于，不含佐剂或包含佐剂，所述佐剂为AS03、Al(OH)₃。