CN116874607A

CN116874607A - 一种h9亚型禽流感重组嵌合疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN116874607A
Application number: CN202310682630.0A
Authority: CN
Inventors: 仝舟; 崔庆为; 杨佳; 邢潇; 刘志达; 田文霞; 张航川
Original assignee: Shanxi Institute Of Higher Innovation; Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Institute Of Higher Innovation; Shanxi Agricultural University
Priority date: 2023-06-09
Filing date: 2023-06-09
Publication date: 2023-10-13

Abstract

本发明属于免疫学领域，具体公开一种H9亚型禽流感重组嵌合疫苗及其制备方法。在保留H9亚型禽流感主要保护性抗原HA骨架中的头部结构的同时，将疫苗H9的颈部区替换为具有广谱免疫保护的流感HA颈部区，从而构建重组嵌合HA。本发明的重组嵌合HA与天然H9三聚体蛋白在结构、分子量上保持一致，通过打破头部结构的优势，增强针对保守茎部区域的免疫反应，将免疫应答集中至免疫亚优势的茎部区域，共同作用激发产生更多的保护性抗体。本发明提供获得高纯度、高表达、有活性的H9嵌合H1蛋白的方法，成功实现了对禽流感病毒H9N2亚型毒株入侵的保护性。具有表达产量高，成本简单，工艺安全，能有效应对H9N2流感亚型毒株的传播。

Description

一种H9亚型禽流感重组嵌合疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种H9亚型禽流感重组嵌合疫苗及其制备方法。

背景技术

H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)按照致病性高低来分属于低致病性AIV，但因为其宿主范围广泛，传播速度快，流行时间长，极易与其他细菌或病毒协同感染家禽导致其生产性能降低，严重影响了禽类带来的经济价值。H9N2亚型禽流感病毒(AIV)在世界范围内广泛分布，一般分为北美谱系和欧亚谱系两大谱系。具体而言，欧亚谱系进一步繁衍成各种病毒簇，以BJ/94-like或Y280-like，G1-like、Y439-like、F/98-like等为代表。

在中国，主要在鹌鹑中传播的G1-like在南方地区具有地理优势，而在鸡群中流行的BJ/94-like和F/98-like分别在北部和东部地区占主导地位。近年来最新的流行病学研究也提示S基因型占比最高。与其他基因型相比，G57基因型(等同于S基因型)具有更强的传染性，自2010年以来在中国一直占主导地位，对家禽养殖造成严重损害。野禽中含有的AIV往往在跨物种传播时具有高致病性。研究发现我国新出现的并造成人类感染的H7N9、H10N8和H5N6亚型AIV的6个内部基因均来自H9N2亚型AIV，这也为HPAIV的爆发提供了有力的环境。因此，我们需要足够重视H9N2亚型AIV的流行潜力，研发有效的H9N2亚型AIV疫苗，有效防控该病毒的流行，为我们的公共卫生安全提供保障。

许多国家都对H9N2 AIV进行了监测，特别是在中国和其他亚洲国家。自2016年以后，我国多数研究团队在中国23个省、市、民族自治区的37个城市采样数万份，经二代测序(NGS)鉴定HxNy亚型的菌株，发现H9N2是优势亚型。血清学调查报告也显示H9N2病毒抗体在一般人群中的阳性率为1.3％～1.4％，在零售家禽工人中的阳性率超过15％，证实了人类感染H9N2病毒，发现活禽市场(LPM)是人感染禽流感病毒的重要暴露风险因素。

从2013年到2018年收集的最新样本，将H9N2分离株的系统发育和抗原分析相结合，发现最近的分离株主要聚集在subgroup II和subgroup III中，与疫苗株(主要位于subgroup I)相距甚远。分析不同抗原簇HA蛋白的同源性，以评估可能导致抗原漂移的氨基酸残基。发现在疫苗簇病毒中有11个氨基酸残基是保守的，但在subgroup II和subgroupIII谱系病毒中发生了突变；而在subgroup II和subgroup III之间的HA蛋白中有10个突变的氨基酸残基，这些突变的氨基酸可能潜在影响H9N2 AIV灭活疫苗的保护效力。

目前禽流感全病毒灭活疫苗是世界上应用最为广泛的疫苗，接种疫苗也是预防禽流感的主要措施。邵华斌等(邵华斌,温国元,罗玲,等.表达H9亚型禽流感病毒截短HA蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法,2016.)选取了HA蛋白中具有强免疫原性的HA1区域(1-1041nt)，插入到新城疫病毒耐热载体中，可针对性地增强疫苗的免疫保护效果，并极大降低对冷链系统的依赖，可用于制备H9禽流感、新城疫二联耐热活疫苗，文中也测定了重组病毒的致病性，保持了亲本株的低毒特性，外源基因的插入并没有改变重组病毒的致病性。Krammer等(Krammer F,et al.Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccineconstructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies.JVirol.2013Jun；87(12):6542-50.；Krammer F,et al.H3stalk-based chimerichemagglutinin influenza virus constructs protect mice from H7N9 challenge.JVirol.2014Feb；88(4):2340-3.)用不同流行季甲型H1N1流感病毒的H1茎部进行嵌合，再分别用H5、H6及H9流感病毒头部与该嵌合茎部构建出cHAs疫苗。研究显示，连续接受该疫苗免疫的小鼠在H5N1、H6N1及H7N9等多种病毒攻击后存活率均为100％，显著高于其各对照组，且产生了高滴度的茎部反应性抗体；其团队先后用头部为H9、H5、H6的cHA对雪貂进行免疫，在接种头部为H5、H6的cHA后，雪貂体内对大流行的H1N1病毒的血清反应性分别较前1次提高4和8倍。

常见的禽流感疫苗有全病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、基因工程亚单位疫苗、基因重组活载体疫苗、核酸疫苗、RNA复制子疫苗、通用流感疫苗、转基因植物疫苗等，但目前养殖场依然使用禽流感灭活疫苗来预防H9亚型禽流感病毒对家禽的感染，但由于其免疫压力造成的抗原漂移，H9亚型禽流感病毒还在不断的变异并流行。H9N2亚型禽流感病毒还活跃参与其他亚型流感病毒内基因重排，产生H5N2、H6N1、H7N7、H7N9、H10N8等新型流感病毒威胁着人类健康。2013年暴发的H7N9流感就是在鸡体内混合的结果，其外部基因来自于H7亚型流感病毒，而其内部基因则来自H9N2亚型的流感病毒。

此外，灭活疫苗在生产过程中存在鸡胚量大、鸡胚早死率高、平均单胚收获量小、效价不稳定、成本很高等问题。灭活苗的应用无法区分自然感染鸡和疫苗接种鸡，从而干扰禽流感疫情监测和流行病学的调查；减毒活疫苗可能会与别的流感病毒进行基因重排得到毒力恢复的重配株病毒，还发现冷适应减毒活疫苗在免疫缺陷者中使用有致病风险；基因工程疫苗被发现抗体持续时间短、成本高等缺点；重组活载体疫苗对于已经免疫过的鸡群效力只能持续很短的时间，对于已接种过或感染过病毒载体的鸡群使用有一定限制；研究人员发现核酸疫苗的载体多带有抗生素基因可能会给细菌性疾病的预防和治疗带来困难，而且核酸疫苗的内表达效率不高。理想的禽流感病毒疫苗应当是对家禽具有高度的安全性、可以区分禽流感病毒自然感染禽和疫苗免疫禽、生产安全性好、持续时间长等特点，目前还没有任何一种疫苗同时具备以上特点。流感通用疫苗的设计理念是在禽流感大流行阶段或在病毒过渡变异阶段，对各种流感亚型病毒都有效果。

此外，不断的进行疫苗免疫也会不同程度导致抗原变异发生免疫逃逸，在临床上也出现灭活疫苗毒株更替速度赶不上病毒抗原变异的步伐，导致了抗原逃逸株的持续流行与变异，这样禽流感病毒不仅没有得到有效的控制，还出现了病毒持续流行、传播范围扩大的趋势。

因此对抗原变异毒株或不同亚型禽流感病毒有交叉免疫保护效果的疫苗研发和评价对H9亚型病毒的预防和控制非常必要。

发明内容

本发明基于流感表面关键抗原HA的三聚体哺乳动物表达形式蛋白，构建了新型重组蛋白疫苗。即通过保留H9亚型禽流感主要保护性抗原HA骨架中的头部结构，同时将疫苗H9的颈部区替换为经过结构生物学设计改造后的具有广谱免疫保护的流感HA颈部区，从而构建成为重组嵌合HA(chimeric HA)。该重组嵌合HA与天然H9三聚体蛋白在结构、分子量上保持一致。本发明的嵌合苗打破头部结构的优势，增强针对保守茎部区域的免疫反应，将免疫应答集中至免疫亚优势的茎部区域，共同作用激发产生更多的保护性抗体。

因此本发明提供一种H9亚型禽流感重组嵌合疫苗，其包括H9亚型禽流感抗原HA骨架中的头部区域与具有广谱免疫保护的流感HA颈部区域。优选地，从ATG开始计算第1-921位为HA头部区；922-1548位为HA颈部区，其中922-957位为颈部区活性肽结构。

本发明首先提供一种H9亚型禽流感重组嵌合疫苗抗原蛋白，其在保留H9亚型禽流感抗原HA骨架中的头部结构区域的基础上，将其颈部区替换为具有广谱免疫保护的流感HA颈部区域而得到。

具体地，H9亚型禽流感抗原HA骨架中的头部结构区域具体是从蛋白氨基酸序列第1-307位；流感HA颈部区域具体从HA蛋白氨基酸序列的ATG开始的第308-516位。

优选地，H9亚型禽流感抗原HA骨架中的头部结构区域氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

另外优选地，具有广谱免疫保护的流感HA颈部区域的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明由此提供编码所述嵌合疫苗抗原蛋白的核酸。

优选地，H9亚型禽流感抗原HA骨架中的头部结构区域核苷酸序列为HA核苷酸序列的第1-921位；流感HA颈部区域从HA核苷酸序列的第922-1548位。

更优选地，H9亚型禽流感抗原HA骨架中的头部结构区域核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

同时优选地，流感HA颈部区域的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

进一步优选地，H9嵌合H1蛋白的全长编码核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

本发明由此还提供含有所述核酸的表达载体，优选地出发载体为PCAGGS载体。

本发进一步提供一种H9亚型禽流感重组嵌合疫苗的制备方法，其包括如下步骤：

第一步：将全序列合成的具有黏性末端(具体的，黏性末端为EcoRⅠ和XhoⅠ)的所述的核酸、NA基因核酸片段(优选地，两者融合不同的纯化标签肽)分别连接入经过双酶切(相应的EcoRⅠ和XhoⅠ)后的载体中(具体地，出发载体为PCAGGS载体)，构建成重组表达载体。

第二步：将质粒HA和NA按照1:1的比例共转染293T哺乳细胞，分泌性表达，收取上清液，根据纯化标签通过亲和层析的方法纯化得到目的HA蛋白。

第三步：将HA蛋白与佐剂按照比例(优选为体积1:1)进行乳化制备成重组嵌合疫苗。

本发明最后尤其提供一种H9亚型禽流感重组嵌合疫苗，其包括所述嵌合疫苗抗原蛋白，任选地还包括药学可接受的助剂。

本发明设计了一套获得高纯度、高表达、有活性的H9嵌合H1蛋白的方法，成功实现了H9嵌合H1疫苗对禽流感病毒H9N2亚型毒株入侵的保护性。本发明H9嵌合H1蛋白具有表达产量高，成本简单，工艺安全，能有效应对禽流感H9N2亚型毒株的传播，为实现制备高效的通用型的禽流感亚单位疫苗提供支撑。

附图说明

图1典型的H9嵌合H1蛋白分子筛图谱和SDS-PAGE胶图，箭头所指为蛋白marker72KD。

图2H1N1毒株(A)以及H3N2毒株(B)对不同组别的血凝抑制试验结果。

图3A和图3B为HI抗体检测结果。其中，图3A试验组别：1，未免疫组血清；2，阳性对照组(灭活的禽流感病毒H9亚型A/Chicken/Hebei/G/2012(H9N2株))血清；3，试验组H9嵌合H1 ISA 71疫苗组血清；4，单佐剂对照组血清。图3B试验组别设置：1，未免疫组血清；2，阳性对照组(商品化的普莱柯H9灭活苗032101001A)血清；3，试验组H9嵌合H1白油疫苗组血清；

图4A和图4B ELISA检测鸡血清中特异性的抗体。其中，图4A为C试验：阳性对照组(H9+新城疫二联苗)血清和试验组H9嵌合H1弗氏疫苗组血清对不同流感HA的免疫应答反应；包板蛋白为H1全长蛋白、H5ORI蛋白、H9ORI蛋白。图4B为D试验：单佐剂对照组血清(第1组)、阳性对照(H9+新城疫二联苗)组血清(第2组)、试验组H9嵌合H1弗氏疫苗组血清(第3组)对包板蛋白H9嵌合H1蛋白、H1 stem蛋白、H9ORI蛋白的免疫应答反应。

图5血抑试验结果。

图6抗体效价统计结果。其中：1，单佐剂对照组血清；2，阳性对照(H9+新城疫二联苗)组血清；3，实验组H9嵌合H1弗氏疫苗组血清。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例一H9亚型的HA基因和辅助HA表达的NA基因质粒构建

将设计好的HA或NA的核酸序列送去公司进行全序列合成带有黏性末端的DNA片段(黏性末端为EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切位点)。载体选用带有氨苄抗性的PCAGGS载体，将载体进行双酶切，将全序列合成的DNA片段连接入载体，将全序列合成的具有黏性末端(具体的，黏性末端为EcoRⅠ和XhoⅠ)的下述HA基因、NA基因核酸片段(两者融合了不同的纯化标签肽)分别连接入经过双酶切(相应的EcoRⅠ和XhoⅠ)后的PCAGGS载体，构建成重组表达载体。

HA基因序列结构为：EcoRI酶切位点+Kozak序列+信号肽序列+HA头部区序列+HA颈部区序列+凝血酶酶切位点序列+三聚体标签序列+组氨酸标签序列+XhoI酶切位点。

EcoRI酶切位点：GAATTC；

Kozak序列：GCCACC；

信号肽氨基酸序列：METVSLITILLVVTVSNA

信号肽核苷酸序列：ATGGAGACAGTATCACTAATAACTATACTACTAGTAGTAACAGTAAGCAATGCA；

凝血酶酶切位点氨基酸序列：LVPRGS

凝血酶酶切位点核苷酸序列：CTGGTGCCAAGAGGCTCT；

三聚体标签序列：CCTGGCAGCGGCTATATTCCTGAGGCTCCCAGAGATGGCCAGGCCTACGTTAGAAAGGATGGCGAGTGGGTGCTGCTGAGCACCTTTCTGGGA；

组氨酸标签氨基酸序列：HHHHHH；

组氨酸标签核苷酸序列：CACCACCACCATCACCAC；

XhoI酶切位点：CTCGAG。

HA头部区氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：METVSLITILLVVTVSNADKICIGYQSTNSTETVDTLTE NNVPVTHAKELLHTEHNGMLCATSLGHPLILDTCTIEGLIYGNPSCDLLLGGREWSYIVERPSAVNGLCYPGNVENLEELRSLFSSARSYQRIQIFPDTIWNVSYSGTSKACSDSFYRSMRWLTQKNNAYPIQDAQYTNNQEKNILFMWGINHPPTDTAQTNLYTRTDTTTSVATEEINRTFKPLIGPRPLVNGLQGRIDYYWSVLKPGQTLRIRSNGNLIAPWYGHILSGESHGRILKTDLKRGSCTVQCQTEKGGLNTTLPFQNVS

HA头部区核苷酸序列(SEQ ID NO：3)：ATGGAGACAGTATCACTAATAACTATACTACTAGTAGTAACAGTAAGCAATGCAGATAAAATCTGCATCGGCTATCAATCAACAAACTCCACAGAAACTGTAGACACACTAACAGAAAACAACGTCCCTGTGACACATGCCAAAGAATTGCTCCACACAGAGCATAATGGGATGCTGTGTGCAACAAGCTTGGGACACCCTCTTATTCTAGACACCTGTACCATTGAAGGACTAATCTATGGCAATCCTTCTTGTGATCTATTGTTGGGAGGAAGAGAATGGTCCTATATCGTCGAGAGACCATCAGCTGTTAACGGATTGTGTTATCCCGGGAATGTAGAAAATCTAGAAGAGCTAAGGTCACTTTTTAGTTCTGCTAGGTCTTATCAAAGGATCCAGATTTTCCCAGACACAATCTGGAATGTGTCTTACAGTGGGACAAGCAAAGCATGTTCAGATTCATTCTACAGAAGCATGAGATGGTTGACTCAAAAGAACAATGCTTACCCTATTCAAGACGCCCAATACACAAATAATCAAGAAAAGAACATTCTTTTCATGTGGGGCATAAATCACCCACCCACCGATACTGCGCAGACAAATCTGTACACAAGAACCGACACAACAACGAGTGTGGCAACAGAAGAAATAAATAGGACCTTCAAACCATTGATAGGACCAAGGCCTCTTGTCAACGGTTTGCAGGGAAGAATTGATTATTATTGGTCGGTATTGAAACCGGGTCAAACACTGCGAATAAGATCTAATGGGAATCTAATAGCTCCATGGTATGGACACATTCTTTCAGGAGAGAGCCACGGAAGAATCCTGAAGACTGATTTAAAAAGGGGTAGCTGCACAGTGCAATGTCAGACAGAAAAAGGTGGATTAAACACAACATTGCCATTCCAAAACGTAAGT

HA颈部区氨基酸序列(SEQ ID NO：2)：

KYAIGDCPKYVKQNTLKLATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGLYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAVGKEFNKSERRMENLNKKVDDGKIDLWSYNAELLVALENQHTIDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKR

HA颈部区核苷酸序列(SEQ ID NO：4)：

AAGTATGCCATCGGCGACTGCCCCAAATACGTGAAGCAGAATACCCTGAAGCTGGCCACCGGCCTGAGAAACATCCCCAGCATCCAGAGCAGAGGCCTGTTCGGAGCCATTGCCGGCTTTACTGAAGGCGGCTGGACAGGCATGGTGGATGGCCTGTATGGCTATCACCACCAGAATGAGCAAGGCAGCGGATACGCCGCTGACCAGAAGTCTACCCAGAACGCTATCAATGGCATCACCAACAAAGTGAACTCCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTACACCGCCGTGGGCAAAGAGTTCAACAAGAGCGAGCGGCGGATGGAAAACCTGAACAAGAAGGTGGACGACGGCAAGATCGACCTGTGGTCCTACAATGCCGAACTGCTGGTGGCCCTGGAAAACCAGCACACCATCGACTTCCACGACAGCAACGTGAAGAACCTGTACGAGAAAGTGAAGTCCCAGCTGAAGAACAACGCCAAAGAGATCGGCAACGGCTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCAACGACGAGTGCATGGAAAGCGTGAAGAATGGCACCTACGACTACCCCAAGTACAGCGAGGAATCCAAGCTGAACCGCGAGAAAATCGACGGCGTGAAGAGA。

H9嵌合H1蛋白的全长编码全长核苷酸序列(SEQ ID NO：5)为：

GAATTCGCCACCATGGAGACAGTATCACTAATAACTATACTACTAGTAGTAACAGTAAGCAATGCA

GATAAAATCTGCATCGGCTATCAATCAACAAACTCCACAGAAACTGTAGACACACTAACAGAAAAC

AACGTCCCTGTGACACATGCCAAAGAATTGCTCCACACAGAGCATAATGGGATGCTGTGTGCAACAA

GCTTGGGACACCCTCTTATTCTAGACACCTGTACCATTGAAGGACTAATCTATGGCAATCCTTCTTGTG

ATCTATTGTTGGGAGGAAGAGAATGGTCCTATATCGTCGAGAGACCATCAGCTGTTAACGGATTGTGTT

ATCCCGGGAATGTAGAAAATCTAGAAGAGCTAAGGTCACTTTTTAGTTCTGCTAGGTCTTATCAAAGG

ATCCAGATTTTCCCAGACACAATCTGGAATGTGTCTTACAGTGGGACAAGCAAAGCATGTTCAGATTC

ATTCTACAGAAGCATGAGATGGTTGACTCAAAAGAACAATGCTTACCCTATTCAAGACGCCCAATACA

CAAATAATCAAGAAAAGAACATTCTTTTCATGTGGGGCATAAATCACCCACCCACCGATACTGCGCAG

ACAAATCTGTACACAAGAACCGACACAACAACGAGTGTGGCAACAGAAGAAATAAATAGGACCTTC

AAACCATTGATAGGACCAAGGCCTCTTGTCAACGGTTTGCAGGGAAGAATTGATTATTATTGGTCGGT

ATTGAAACCGGGTCAAACACTGCGAATAAGATCTAATGGGAATCTAATAGCTCCATGGTATGGACACA

TTCTTTCAGGAGAGAGCCACGGAAGAATCCTGAAGACTGATTTAAAAAGGGGTAGCTGCACAGTGCA

ATGTCAGACAGAAAAAGGTGGATTAAACACAACATTGCCATTCCAAAACGTAAGTAAGTATGCCATCG

GCGACTGCCCCAAATACGTGAAGCAGAATACCCTGAAGCTGGCCACCGGCCTGAGAAACATCCCCAG

CATCCAGAGCAGAGGCCTGTTCGGAGCCATTGCCGGCTTTACTGAAGGCGGCTGGACAGGCATGGTG

GATGGCCTGTATGGCTATCACCACCAGAATGAGCAAGGCAGCGGATACGCCGCTGACCAGAAGTCTA

CCCAGAACGCTATCAATGGCATCACCAACAAAGTGAACTCCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTA

CACCGCCGTGGGCAAAGAGTTCAACAAGAGCGAGCGGCGGATGGAAAACCTGAACAAGAAGGTGG

ACGACGGCAAGATCGACCTGTGGTCCTACAATGCCGAACTGCTGGTGGCCCTGGAAAACCAGCACAC

CATCGACTTCCACGACAGCAACGTGAAGAACCTGTACGAGAAAGTGAAGTCCCAGCTGAAGAACAA

CGCCAAAGAGATCGGCAACGGCTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCAACGACGAGTGCATGGAAAG

CGTGAAGAATGGCACCTACGACTACCCCAAGTACAGCGAGGAATCCAAGCTGAACCGCGAGAAAATC

GACGGCGTGAAGAGACTGGTGCCCAGAGGCTCTCCTGGCAGCGGCTATATTCCTGAGGCTCCCAGAG

ATGGCCAGGCCTACGTTAGAAAGGATGGCGAGTGGGTGCTGCTGAGCACCTTTCTGGGACACCACCACCATCACCACTGACTCGAG。

NA基因序列结构为：EcoRI酶切位点+信号肽序列+Flag标签序列+四聚体标签序列+凝血酶酶切位点序列+09NA序列+XhoI酶切位点。

EcoRI酶切位点：GAATTC；

信号肽氨基酸序列：MGAGATGRAMDGPRLLLLLLLGVSLGGA；

信号肽核苷酸序列：ATGGGGGCAGGTGCCACCGGCCGCGCCATGGACGGGCCGCGCCTGCTGCTGTTGCTGCTTCTGGGGGTGTCCCTTGGAGGTGCC；

Flag标签氨基酸序列：DYKDDDDK；

Flag标签核苷酸序列：GATTATAAGGATGATGATGATAAG；

四聚体标签氨基酸序列：SSSDYSDLQRVKQELLEEVKKELQKVKEEIIEAFVQELRKRGS；

四聚体标签核苷酸序列：AGCTCCAGTGATTACTCGGACCTACAGAGGGTGAAACAGGAGCTTCTGGAAGAGGTGAAGAAGGAATTGCAGAAAGTGAAAGAGGAAATCATTGAAGCCTTCGTCCAGGAGCTGAGGAAGCGGGGTTCT；

凝血酶酶切位点氨基酸序列：LVPRGS；

凝血酶酶切位点核苷酸序列：CTGGTACCACGAGGTAGT；

09NA氨基酸序列(SEQ ID NO：6)：PSRSVKLAGNSSLCPVSGWAIYSKDNSVRIGSKGDVFVIREPFISCSPLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTIKDRSPYRTLMSCPIGEVPSPYNSRFESVAWSASACHDGINWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQESECACVNGSCFTVMTDGPSNGQASYKIFRIEKGKIVKSVEMNAPNYHYEECSCYPDSSEITCVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGIFGDNPRPNDKTGSCGPVSSNGANGVKGFSFKYGNGVWIGRTKSISSRNGFEMIWDPNGWTGTDNNFSIKQDIVGINEWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFWVELIRGRPKENTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDK；

09NA核苷酸序列(SEQ ID NO：7)：CCATCACGATCAGTGAAATTAGCGGGCAATTCCTCTCTCTGCCCTGTTAGTGGATGGGCTATATACAGTAAAGACAACAGTGTAAGAATCGGTTCCAAGGGGGATGTGTTTGTCATAAGGGAACCATTCATATCATGCTCCCCCTTGGAATGCAGAACCTTCTTCTTGACTCAAGGGGCCTTGCTAAATGACAAACATTCCAATGGAACCATTAAAGACAGGAGCCCATATCGAACCCTAATGAGCTGTCCTATTGGTGAAGTTCCCTCTCCATACAACTCAAGATTTGAGTCAGTCGCTTGGTCAGCAAGTGCTTGTCATGATGGCATCAATTGGCTAACAATTGGAATTTCTGGCCCAGACAATGGGGCAGTGGCTGTGTTAAAGTACAACGGCATAATAACAGACACTATCAAGAGTTGGAGAAACAATATATTGAGAACACAAGAGTCTGAATGTGCATGTGTAAATGGTTCTTGCTTTACTGTAATGACCGATGGACCAAGTAATGGACAGGCCTCATACAAGATCTTCAGAATAGAAAAGGGAAAGATAGTCAAATCAGTCGAAATGAATGCCCCTAATTATCACTATGAGGAATGCTCCTGTTATCCTGATTCTAGTGAAATCACATGTGTGTGCAGGGATAACTGGCATGGCTCGAATCGACCGTGGGTGTCTTTCAACCAGAATCTGGAATATCAGATAGGATACATATGCAGTGGGATTTTCGGAGACAATCCACGCCCTAATGATAAGACAGGCAGTTGTGGTCCAGTATCGTCTAATGGAGCAAATGGAGTAAAAGGGTTTTCATTCAAATACGGCAATGGTGTTTGGATAGGGAGAACTAAAAGCATTAGTTCAAGAAACGGTTTTGAGATGATTTGGGATCCGAACGGATGGACTGGGACAGACAATAACTTCTCAATAAAGCAAGATATCGTAGGAATAAATGAGTGGTCAGGATATAGCGGGAGTTTTGTTCAGCATCCAGAACTAACAGGGCTGGATTGTATAAGACCTTGCTTCTGGGTTGAACTAATCAGAGGGCGACCCAAAGAGAACACAATCTGGACTAGCGGGAGCAGCATATCCTTTTGTGGTGTAAACAGTGACACTGTGGGTTGGTCTTGGCCAGACGGTGCTGAGTTGCCATTTACCATTGACAAGTAA；

XhoI酶切位点：CTCGAG。

实施例二H9亚型HA蛋白的表达纯化

将重组表达载体质粒转化Top10感受态细胞，吸取适量菌液用划线法涂在带有氨苄(氨苄母液浓度：100mg/ml)抗性的固体LB平板(LB平板配方：1％NaCl，1％色氨酸Tryptone，0.5％酵母抽提物，1.5％琼脂粉；氨苄使用为1:1000)上，37℃过夜培养。挑取单克隆，5ml小摇菌液(氨苄抗性)，之后再300ml过夜中摇，用无内毒素质粒大提试剂盒(TIANGEN，DP117)获得流感病毒抗原质粒。

用含10％FBS的DMEM在37℃、5％CO₂培养箱中培养293T细胞。当293T细胞汇合度达到约70％时，用PEI转染试剂将流感病毒抗原质粒(HA:NA＝20ug:20ug/盘)转染至293T细胞中，当转染4-6小时后，用无血清的DMEM换液继续培养3天后收集细胞培养上清液，补加无血清的DMEM继续培养4天，收集细胞培养上清液。因HA在哺乳动物细胞中表达时，其上会粘附有唾液酸导致与受体没有结合能力，因此也进行了神经氨酸酶NA的表达。NA只是辅助HA蛋白的表达，选取了09NA的基因，并加上FLAG标签以便于检测。由于HA和NA的纯化标签不一样，我们选用带有His标签的亲和柱纯化HA蛋白，这样我们最后纯化得到的蛋白就只有HA蛋白，我们通过western blot来验证HA+NA共转染后比HA单转染得到的HA蛋白量更多，为了能纯化到大量的HA蛋白，之后设计的HA都采用和NA共转染方式来分泌性表达。

将收集的细胞培养上清液经0.22μm滤膜过滤后与HisTrap^TMexcel(GE)于4℃过夜结合，准备蛋白洗脱缓冲液A液(20mM Tris,150mM NaCl，pH 8.0)和缓冲液B液(20mM Tris,150mM NaCl，pH 8.0，1M imidazole)。之后用缓冲液A液洗涤His柱，以去除非特异结合的蛋白，再用缓冲液2％的B液(20mM Tris,150mM NaCl，pH 8.0,20mM imidazole)除去杂蛋白，最后将目的蛋白用30％的B液(20mM Tris,150mM NaCl，pH 8.0，300mM imidazole)从His柱上洗脱下来，并以30KD截留(30KD cutoff)的蛋白浓缩管用缓冲液A液(20mM Tris,150mMNaCl，pH 8.0)进行换液，以去除蛋白溶液里的咪唑浓度，最后将蛋白溶液浓缩至0.5ml，加入凝血酶(1mg蛋白加5ul凝血酶)4℃酶切过夜。将酶切后的蛋白溶液用分子筛进一步纯化，使用AKTA-purifier(GE)和Column Hiload 16/60superdex 200PG分子筛(GE)，分子筛用缓冲液A液(20mM Tris,150mM NaCl，pH 8.0)进行柱平衡，1ml loop环上样，同时监测280nm的紫外吸收值，收取目的蛋白，并通过SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。典型的目的蛋白的分子筛图谱和SDS-PAGE分析如图1所示。

该蛋白在Column Hiload 16/60superdex 200PG分子筛出峰位置为62.5ml，由于构建中在凝血酶切位点(LVPR↓GS，箭头所指是能识别切割这个位点的氨基酸)后加入了三聚体标签，蛋白主峰三聚体形式，三聚体标签在凝血酶切后从HA脱落，单体大小约为70KD。SDS-PAGE胶图泳道分别对应分子筛图中H9嵌合H1蛋白的三聚体和单体。

实施例三、疫苗制备

将纯化得到的H9嵌合H1蛋白与不同佐剂混合来制备疫苗，按照体积1：1比例进行乳化直至浴水不化状态用于动物免疫。H1 stem蛋白是流感H1亚型的颈部区蛋白，具有广谱免疫保护效果，在此基础上我们设计了H9嵌合H1蛋白，对不同的流感HA都有免疫应答效果，详见实施例六。具体的疫苗制备方法详见实施例三；具有广谱免疫保护的流感HA颈部区(H1stem)功能验证是通过免疫小鼠实验体现的，具体见实施例四所见；制备好的H9嵌合H1疫苗免疫SPF鸡试验详见实施例五；制备好的H9嵌合H1疫苗免疫海兰白蛋鸡试验详见实施例六。

1、H1stem疫苗的制备

H1 stem蛋白浓度为10mg/ml，PBS为稀释液，免疫佐剂为MF59。将试验组H1 stem蛋白与等体积的MF59佐剂进行混合，振荡至完全乳化至浴水不化开用于动物免疫。

H1stem疫苗的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)，其中第194位-262位为保守肽段：MYRMQLLSCIALSLALVTNSTYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGCEYNKSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEGRHHHHHHH

H1stem疫苗的核苷酸序列(SEQ ID NO:9)，其中第580位-786位为保守肽段:

ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAATTCAACCTACGCCGACACCATTTGCATCGGCTACCACGCCAACAACAGCACCGACACCGTGGACACCGTGCTGGAGAAGAACGTGACCGTGACCCACAGCGTGAATCTGCTGGAGAACGGAGGAGGCGGCAAATACGTCTGCAGCGCCAAACTGAGGATGGTGACCGGACTGAGGAACAAGCCCAGCAAGCAGAGCCAGGGACTGTTCGGAGCCATTGCCGGATTCACCGAGGGAGGTTGGACAGGAATGGTGGACGGTTGGTACGGCTACCACCACCAGAACGAGCAGGGAAGCGGATACGCCGCCGATCAGAAAAGCACCCAGAACGCCATCAACGGCATCACCAACAAGGTCAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTACACCGCCATCGGTTGCGAGTACAACAAGAGCGAGCGCTGCATGAAGCAGATCGAGGACAAGATCGAGGAGATCGAGAGCAAGATCTGGTGCTACAACGCCGAACTGCTGGTGCTGCTGGAGAACGAGAGGACCCTGGACTTCCACGACAGCAACGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTCAAGAGCCAGCTGAAGAACAACGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCAACGACGAGTGCATGGAGAGCGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCCAAGTACAGCGAGGAGAGCAAGCTGAACCGGGAGAAGATCGACGGCGTGAAGCTGGAGAGCATGGGCGTGTACCAGATCGAGGGCAGACATCACCACCACCACCATCATTAG。

2、H9嵌合H1ISA71疫苗的制备(佐剂为Montanide^TM ISA 71VG)

H9嵌合H1蛋白浓度为10mg/ml，PBS为稀释液，免疫佐剂为Montanide^TM ISA 71VG。

佐剂与水相抗原介质按照质量7:3的比例来制备疫苗，在室温或低于室温下，将水相抗原介质加入Montanide^TM ISA 71VG中，在强烈搅拌下进行混合，以获得稳定制剂进行动物接种，贴标签，置2～8℃保存。

3、H9嵌合H1白油疫苗的制备(佐剂为矿物白油)

H9嵌合H1蛋白浓度为10mg/ml，PBS为稀释液，免疫佐剂为矿物白油。油相制备：取注射用白油94份，硬脂酸铝2份，加热至80℃，再加入司本-80 6份，至温度达到116℃时维持30min，冷却后备用。水相制备：取吐温-80 4份，灭菌，冷却，加入到灭活后96份抗原液中，边加边搅拌，直至吐温-80完全溶解。乳化：取油相2份，开动电机慢速搅拌，然后徐徐加入1份水相，加完后再以2800～3200r/min乳化30min。定量分装，加盖密封，贴标签，置2～8℃保存。

4、H9嵌合H1弗氏疫苗的制备(佐剂为弗氏佐剂)

H9嵌合H1蛋白浓度为10mg/ml，PBS为稀释液，免疫佐剂为弗氏佐剂。将H9嵌合H1蛋白与等体积的弗氏完全佐剂进行完全乳化至浴水不化开用于动物接种，第一次免疫选用弗氏完全佐剂，第二次免疫选用弗氏不完全佐剂。

实施例四动物试验1：具有广谱免疫保护的流感HA颈部区(H1 stem)功能验证

1.试验动物：4-6周龄BALB/c雌鼠，每组6只，免疫方式为肌肉注射。

2.组别设置：①阴性对照(佐剂MF59)；②阳性对照(流感病毒裂解疫苗TIV)；③试验组H1stem疫苗。

3.试验步骤：

3.1动物免疫：

制备疫苗过程参考实施例三的1.H1 stem疫苗的制备。阳性组免疫剂量为每只100μL；试验组每只动物免疫剂量为20μg/100μL/只，用PBS稀释蛋白，每组6只，免疫3次，免疫间隔为14天。

3.2血清分离：

将以上免疫组别的小鼠进行眼球取血，制备血清，小鼠血清利用RED进行处理，按照1体积的血清，加入4体积的RDE，37℃水浴18h，56℃灭活30min，用于后续实验。

3.3H1N1毒株及H3N2毒株进行TCID₅₀测定

a，采用10倍连续稀释的方式稀释病毒原液。

b，提前18-24h铺好96孔板，每孔加入100μL(2×10⁵个/ml)MDCK细胞。37℃，5％的CO₂培养箱内进行培养。

c，病毒接种，用PBS洗涤细胞1次，每孔150μL，之后按照第一步稀释好的病毒液加入96孔板中，每一稀释度接种一纵排，每孔100μL，在11列和12列设定稀释液对照，37℃培养箱培养。

d，逐日观察并记录结果，72h后结果计算按照Reed-Muench法。

3.4中和实验：

a，病毒稀释：利用病毒培养液稀释到200TCID₅₀/50μL。

b，血清阴性对照(只添加细胞维持液)

血清稀释：小鼠血清起始稀释倍数为1:40，按照2倍比稀释进行中和试验。

c，病毒孵育：将稀释好的病毒(200TCID₅₀)50μl加入到50μl的血清中，混合均匀，放置37℃，孵育1h。

d，MDCK细胞吸附：MDCK细胞，利用PBS洗涤150μL洗涤一次，之后弃净，每孔添加100μL的病毒-血清混合液，平行三孔，放入细胞培养箱中培养72h。

e，利用血抑实验进行结果观察计算，结果如下图2所示。

结果显示：阳性疫苗TIV在1:40倍稀释下对流感病毒H1N1有完全中和作用，在1:160倍稀释下对流感病毒H3N2有完全中和作用，而对照组MF59组血清均不能阻止流感病毒H1N1、H3N2对红细胞的破坏，H1stem组血清在1:40倍稀释下对H1N1、H3N2有完全中和效果，在血清稀释倍数为1:1280时，部分血细胞依然保持完整，表明血清高倍稀释下的抗体依然能够防止流感毒株H1N1、H3N2对红细胞膜的破坏，说明H1stem能产生针对流感病毒H1N1和H3N2的特异性抗体，为研究通用型疫苗的研发提供参考数据。实施例五动物试验2：H9嵌合H1疫苗对SPF鸡的免疫保护试验

1.试验动物：3周龄SPF鸡，免疫方式为颈部皮下注射。

2.A试验组别设置：1，未免疫组；2，阳性对照组(灭活的禽流感病毒H9亚型A/Chicken/Hebei/G/2012(H9N2株))；3，试验组H9嵌合H1ISA71疫苗组；4，单佐剂对照组；以上每组10只；B试验组别设置：1，未免疫组；2，阳性对照组(商品化的普莱柯H9灭活苗032101001A)；3，试验组H9嵌合H1白油疫苗组。

3.试验步骤：

3.1动物免疫：

A试验：制备疫苗过程详见实施例三的2.H9嵌合H1ISA71疫苗的制备(佐剂为Montanide^TM ISA 71VG)。对照组免疫剂量按照规格使用；试验组每只动物注射剂量为20ug/羽，免疫数量每组10羽份，免疫2次，每次免疫间隔为14天，第2次免疫3周后心脏采血，分离血清，用于后续实验。

B试验：制备疫苗过程详见实施例三的3.H9嵌合H1白油疫苗的制备(佐剂为矿物白油)。对照组免疫剂量按照规格使用；试验组每只动物注射剂量为30ug/羽，免疫数量每组10羽份，免疫方式为颈部皮下注射，免疫2次，每次免疫间隔为3周，第2次免疫3周后心脏采血，分离血清，用于后续实验。

3.2血清分离：

二免3周后心脏采血，低温下离心，收集血清，分装冻存-80℃。

3.3HI抗体效价检测：

按照国家标准GB/T18936-2020规定的标准操作进行，向96孔微量血凝板上1-12孔加入25μL的PBS，再向第1孔内加入25μL免疫3周后的血清，用25μL移液器进行倍比稀释至第10孔，然后加入25μL的4HAU(四单位病毒液)，并设PBS和血凝素对照；于37℃作用10min，每空加入25μL 1％SPF鸡红细胞，混匀后室温作用30min，然后计算免疫组和未免疫组SPF鸡HI抗体效价。

结果如图3A所示A试验结果：未免疫组(第1组)和单佐剂对照组(第4组)的HI抗体检测效价为0，阳性疫苗组(第2组)的HI抗体效价约为11log2，试验组H9嵌合H1 ISA 71疫苗组(第3组)的HI抗体效价也约为11log2，与阳性疫苗组(第2组)相比本发明的嵌合苗的抗体效价均值可能略高，表明本发明设计的嵌合苗也同商品化的疫苗一样能有效诱导更多的抗体来中和H9N2毒株。图3B为B试验结果：第二次免疫后的HI抗体效价高于第一次免疫，商品化H9疫苗(第2组)两次免疫的效价均很高，H9嵌合H1白油疫苗(第3组)在第二次免疫后HI抗体效价显著升高，而且与商品化H9疫苗比较无显著差异，均能很好的中和H9N2亚型禽流感病毒的感染。

3.4试验动物免疫后攻毒

毒株为：H9亚型WD毒株。SPF鸡一免后攻毒，商品化H9疫苗对照组、未免疫组和试验组(H9嵌合H1白油疫苗)各5只，每只SPF鸡翅静脉注射1:10稀释的禽流感H9亚型毒株(0.5ml/只)，攻毒后的第5天采集每只鸡的泄殖腔及咽喉拭子，进行病毒分离，比较免疫组和未免疫组鸡病毒分离阳性数。

将同一只鸡的泄殖腔及气管拭子混合后作为1个样品，每个样品经尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml，孵育观察5日，逐胚测定鸡胚液的HA效价。每个样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚胚液的HA效价≥1∶16(微量法)，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1次后再进行判定。免疫组应至少有4只鸡病毒分离阴性，对照组应至少有4只鸡病毒分离阳性。

结果显示：按规程攻毒H9亚型WD毒株后普莱柯疫苗、H9嵌合H1白油疫苗组均可100％对免疫鸡形成保护，攻毒未免疫组符合要求。

表1：免疫组和未免疫组攻毒后结果

实施例六动物试验3：H9嵌合H1疫苗对海兰白蛋鸡的免疫保护试验

1.试验动物：7日龄海兰白蛋鸡，免疫方式为颈部皮下注射。

2.组别设置：1，单佐剂对照组；2，阳性对照(H9+新城疫二联苗)组；3，试验组H9嵌合H1弗氏疫苗组；以上每组7只。

3.实验步骤：

3.1动物免疫：

制备疫苗的过程详见实施例三的4.H9嵌合H1弗氏疫苗的制备(佐剂为弗氏佐剂)。单佐剂对照组免疫剂量每只200ul；试验组每只动物免疫剂量为60ug/200ul/羽，用PBS稀释蛋白，每组7羽份，免疫方式为颈部皮下注射，免疫2次，每次免疫间隔2周，第二次免疫3周后心脏采血，分离血清，用于后续实验。

3.2血清分离：

3.3ELISA检测蛋鸡血清中特异性的抗体：

a，按照每孔蛋白量200ng包板4℃过夜，包板蛋白为H1全长蛋白、H1 stem蛋白、H5ORI蛋白、H9ORI蛋白、H9嵌合H1蛋白；

b，洗涤：次日用含0.05％Tween-20的PBST洗涤包被板，洗4次，每次5min；

c，封闭：加封闭液(5％脱脂奶粉，用PBST配置)200ul，室温封闭3h；

d，洗涤：用PBST洗涤待检测板子，洗4次，每次5min；

e，一抗孵育：用PBST稀释待检测血清(1:50和1:100)，每孔加100ul待检测血清稀释液，37℃孵育1h；PBST做阴性对照；

f，洗涤：PBST冲洗包被板，洗涤5次，每次5min；

g，二抗孵育：以PBST(1:30000稀释)稀释HRP标记的羊抗鸡二抗，每孔加100ul，37℃孵育1h；

h，洗涤：PBST冲洗包被板，洗涤5次，每次5min；

i，显色：加入TMB底物缓冲液显色，50ul/孔，37℃避光显色3min后加ELISA终止液终止反应，50ul/孔，在OD_450nm下读数。

结果如图4A和图4B所示：H9嵌合H1蛋白与H9ORI蛋白的区别是头部区相同，颈部区不同；H1stem是流感H1亚型的颈部区蛋白，其保守序列与H9嵌合H1蛋白颈部区相同。图4A为C试验结果，显示与对照组相比，H9嵌合H1弗氏疫苗组血清对流感H1、H5、H9亚型产生免疫反应，说明H9嵌合H1弗氏疫苗免疫后激发机体产生的血清中有针对性不同流感HA的抗体，为实现通用流感疫苗设计提供理论支撑。图4B为D试验结果，显示当包板蛋白为H1stem时，H9嵌合H1弗氏疫苗组血清(第3组)比阳性对照组血清(H9+新城疫二联苗)(第2组)能激发出更多的颈部区抗体，打破了头部区结合抗体的一惯优势；H9嵌合H1弗氏疫苗组血清(第3组)对包板蛋白H9嵌合H1蛋白、H1stem蛋白的比较发现H9嵌合H1弗氏疫苗组血清(第3组)能激发出较多的头部区和颈部区抗体提高机体免疫力。

3.4血凝试验

a，在血凝板中每孔加入25ul PBS。第一孔加入灭活H9N2亚型禽流感病毒25ul，依次作2倍系列稀释，同时设立阴性对照孔。

b，每孔加入25ul 1％鸡红细胞悬浮液，水平振荡器上振荡1～2min混匀，37℃静置30min后判定结果。结果：以100％凝集(++++)的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位，H9N2亚型禽流感病毒血凝效价为1:2⁷。

3.5血凝抑制试验

根据3.4中结果制备四单位病毒液；

a，在血凝板中每孔加入25ul PBS，第一孔加入25ul待检血清(原血清)，依次作2倍梯度稀释，同时设立阴性对照孔(PBS)；

b，除阴性对照孔之外，每孔加入25ul四单位病毒液：置水平振荡器上振荡12min后，37℃静置15min；

c，每孔加入25ul 1％鸡红细胞悬浮液，水平振荡器上振荡1～2min混匀，37℃静置30min后判定结果。

结果图5所示：H9嵌合H1弗氏疫苗(第3组)免疫后血抑效价约5log2，与单佐剂对照组(第1组)相比能激发更多的抗体来中和H9N2亚型禽流感病毒，且与商品化H9+新城疫二联苗(第2组)相比无显著差异性，为实现新型重组蛋白疫苗的研发提供理论支撑。

3.5试验动物免疫后攻毒

二免3周后，滴鼻攻毒A/chicken/Shanxi/1.23TGRL003-O/2019H9N2，每只蛋鸡攻毒剂量300ul(4HAU)。用棉签对每只小鸡的口和肛进行攻毒后第7天采样，保存在1ml病毒保存液中，振荡后接种10日龄SPF鸡胚，72h后收集尿囊液检测鸡胚排毒情况。

将攻毒后第7天采集的咽肛拭子进行病毒分离。每组选6只蛋鸡样本分离好的病毒液接种10日龄SPF鸡胚，每只再设3个重复组，孵育观察72h，收集尿囊液进行HA测定，无论死胚、活胚均应测定鸡胚尿囊液血凝价，比较免疫组和对照组鸡病毒分离阳性数。每个样品接种的3枚鸡胚中只要有1枚鸡胚胚液的HA效价≥1∶16(微量法)，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1次后再进行判定。结果如表2所示。

表2：不同组别攻毒后结果

结果显示：单佐剂对照组显示样本均能检测到H9N2病毒，而试验疫苗组比起对照组均能抑制H9N2病毒在蛋鸡样本体内的繁殖，与阳性疫苗组效果一致，本发明设计的疫苗能够很好的抵御H9N2病毒入侵。

Claims

1.一种H9亚型禽流感重组嵌合疫苗抗原蛋白，其特征在于，在保留H9亚型禽流感抗原HA骨架中的头部结构区域的基础上，将其颈部区替换为具有广谱免疫保护的流感HA颈部区域而得到。

2.如权利要求1所述的嵌合疫苗抗原蛋白，其特征在于，H9亚型禽流感抗原HA骨架中的头部结构区域具体是从蛋白氨基酸序列第1-307位，流感HA颈部区域具体从HA蛋白氨基酸序列的ATG开始的第308-516位。

3.如权利要求1所述的嵌合疫苗抗原蛋白，其特征在于，H9亚型禽流感抗原HA骨架中的头部结构区域氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，具有广谱免疫保护的流感HA颈部区域的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.编码如权利要求1至3任一项所述嵌合疫苗抗原蛋白的核酸。

5.如权利要求4所述的核酸，其特征在于，H9亚型禽流感抗原HA骨架中的头部结构区域核苷酸序列为HA核苷酸序列的第1-921位；流感HA颈部区域从HA核苷酸序列的第922-1548位。

6.如权利要求5所述的核酸，其特征在于，H9亚型禽流感抗原HA骨架中的头部结构区域核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，流感HA颈部区域区域核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

7.如权利要求6所述的核酸，其特征在于，其全长核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

8.含有如权利要求5至7任一项所述核酸的表达载体，优选地出发载体为PCAGGS载体。

9.一种H9亚型禽流感重组嵌合疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步：将全序列合成的具有黏性末端（具体的，黏性末端为EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ）的如权利要求5-7任一项所述的核酸、NA基因核酸片段（优选地，两者融合不同的纯化标签肽）分别连接入经过双酶切（相应的EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ）后的载体中（具体地，出发载体为PCAGGS载体），构建成重组表达载体；

第二步：将质粒HA和NA优选按照1:1的比例共转染293T哺乳细胞，分泌性表达，收取上清液，根据纯化标签通过亲和层析的方法纯化得到目的HA蛋白；

第三步：将HA蛋白与佐剂按照比例（优选为体积1:1）进行乳化制备成重组嵌合疫苗。

10.一种H9亚型禽流感重组嵌合疫苗，其特征在，其包括如权利要求1至4任一项所述嵌合疫苗抗原蛋白，任选地，其佐剂为Montanide^TM ISA 71 VG、矿物白油或弗氏佐剂，任选地还包括药学可接受的助剂。