Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN116462666A - 细胞保护性化合物及其用途 - Google Patents

细胞保护性化合物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN116462666A
CN116462666A CN202310126451.9A CN202310126451A CN116462666A CN 116462666 A CN116462666 A CN 116462666A CN 202310126451 A CN202310126451 A CN 202310126451A CN 116462666 A CN116462666 A CN 116462666A
Authority
CN
China
Prior art keywords
methyl
benzodioxol
phenyl
pyrrol
compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310126451.9A
Other languages
English (en)
Inventor
J.阿布德阿拉
S.沃夫
U.契特瑞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Original Assignee
Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ filed Critical Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Publication of CN116462666A publication Critical patent/CN116462666A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/04—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4025—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. cromakalim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • A61K31/416—1,2-Diazoles condensed with carbocyclic ring systems, e.g. indazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4184—1,3-Diazoles condensed with carbocyclic rings, e.g. benzimidazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/54—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame
    • A61K31/541—Non-condensed thiazines containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/06—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
    • G01N2440/14—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material phosphorylation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Pyrrole Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Abstract

本发明涉及细胞保护性化合物及其用途。本发明涉及细胞保护性、特别是心脏和肾脏保护性有机化合物，优选有机化合物，其抑制G蛋白偶联受体激酶2(GRK2，ADRBK1)导致的底物磷酸化。优选地，有机化合物抑制GRK2介导的丝氨酸/精氨酸丰富的剪接因子1(SRSF1、ASF‑1、SF2)和/或光传感因子的磷酸化，以用于治疗高血压、心脏病、心脏功能紊乱或衰竭和心脏病相关病状，例如心肌细胞坏死、缺血性心脏病和/或缺血性心脏损伤或衰老。此外，本发明涉及鉴定(GRK2)介导的(SRSF1)和/或光传感因子磷酸化的抑制剂的方法。

Description

细胞保护性化合物及其用途
本申请是申请日为2018年1月10日、申请号为201880017149.7、发明名称为“细胞保护性化合物及其用途”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及细胞保护性、特别是心脏和肾脏保护性有机化合物，优选涉及抑制G蛋白偶联受体激酶2(GRK2，ADRBK1)导致的底物磷酸化的有机化合物。优选地，有机化合物抑制GRK2介导的丝氨酸/精氨酸丰富的剪接因子1(SRSF1、ASF-1、SF2)和/或光传感因子的磷酸化，以用于治疗心脏病、高血压、心脏功能障碍或衰竭和心脏病相关病状，例如心肌细胞坏死、缺血性心脏病和/或缺血性心脏损伤和衰老。此外，本发明涉及鉴定GRK2介导的SRSF1和/或光传感因子的磷酸化抑制剂的方法。
背景技术
心血管疾病和心力衰竭是最常见的死亡原因，因此迫切需要新的治疗方法。用于心血管疾病的已建立的药理学疗法包括，例如，β-受体阻滞剂、血管紧张素II AT1系统的抑制剂、ACE抑制剂、盐皮质激素受体阻滞剂和组合的脑啡肽酶-AT1受体阻滞剂沙库比曲-缬沙坦。尽管有这些可用的治疗方法，但终末期心力衰竭患者的预后比大多数癌症患者的预后差。
在心脏病和心力衰竭的实验模型中，G蛋白偶联受体激酶2(GRK2、ADRBK1、βARK)的抑制与心脏保护有关(Hullmann等人，Pharmacol.Res.110，52-64(2016)；Abd Alla等人，J.Biol.Chem.291，2583-2600(2016))，并且GRK2在患有心血管疾病和高血压的患者中上调(Ungerer等人，Circulation 87，454-463(1993)；Gros等人，J.Clin.Invest.99，2087-2093(1997))。
一种方法使用βARK-C-末端，其通过清除异源三聚体G蛋白的活化βγ亚基来抑制GRK2介导的受体磷酸化(Koch等人，Science 268，1350-1353(1995)；US 7,060,871)。
然而，βARK-C-末端没有达到临床研究，因为它是194个氨基酸的大蛋白，难以给药并且需要基因治疗方法来达到其细胞内靶标GRK2。此外，βATRK-C-末端还抑制G-βγ亚基的活性，所述亚基在体内具有多种其他相关功能。与该陈述一致，体内βARK-C-末端的心脏保护作用还涉及GRK2抑制非依赖性机制(Volkers M等人，Circ.Res.108，27-39(2011))。
通过计算机筛选鉴定的与异源三聚体G蛋白的Gβ亚基相互作用的化合物也显示出与βARK-C-末端类似地增加心肌收缩性(WO 2004/101495 A1)。但是这种方法对于GRK2也不是特异性的，并且预期会与βARK-C-末端类似地干扰其他Gβ-γ介导的功能。这些化合物没有被进一步表征，并且也没有达到临床研究。
另一项科学研究涉及GRKInh，一种GRK2的肽抑制剂(18个氨基酸)，其衍生自β2-肾上腺素能受体的第一个细胞内环(Winstel等人，Biochem.Pharmacol.70，1001-1008(2005))。GRKinh是体内心脏保护性的(Abd Alla等人，J.Biol.Chem.291，2583-2600(2016)；Fu等人，J.Biol.Chem.288，7739-7755(2013))。然而，到目前为止，GRKInh在GRK2上的结合位点尚未确定，并且GRKInh是一种肽，其难以给药并且需要基因治疗方法来达到其细胞内靶标GRK2。此外，GRKInh是一种免疫原性肽，其可引发针对β2-肾上腺素能受体的自身免疫应答。
帕罗西汀是GRK2的ATP位点定向的激酶抑制剂(Thal等人，ACS Chem.Biol.7，1830-1839(2012)；Schumacher等人，Sci.Transl.Med.7，277ra31(2015))。帕罗西汀(i)对GRK2无特异性，(ii)对GRK2具有低抑制活性，(iii)具有不同的主要高亲和力靶标，5-羟色胺转运蛋白，和(iv)引起体重增加的事实使帕罗西汀不适用于心脏保护疗法(Uguz等人，Gen Hosp Psychiatry 46-48，37(2015))。
其他ATP位点定向的GRK2抑制剂，例如，对GRK2具有高亲和力和选择性的Takeda化合物(WO 2007/034846 A1)未在体内进行测试，并且心脏保护性质未知。此外，Waldschmidt等人(J.Med.Chem.59，3793-3807(2016))报道了GRK2抑制剂。然而，所有这些高亲和力GRK2特异性ATP位点定向激酶抑制剂阻断了GRK2的所有功能，并可能具有主要副作用，因为GRK2在体内发挥不可或缺的作用，这是无法补偿的，即GRK2的敲除是致命的(Jaber等人，PNASUSA 93，12974-12979(1996))。此外，未记载Takeda或Waldschmidt化合物的体内作用，并且不知道化合物的脱靶效应以及生物利用度。
总之，到目前为止，没有新的心脏保护性治疗方法达到临床研究。缺乏合适的靶标、缺乏对于给定靶标的特异性和/或可用抑制剂副作用的发生是主要问题。此外，为许多治疗方法基础的机制，例如，GRK2抑制的心脏保护作用以及其对心脏保护性治疗的实际适用性仍然在现有技术中有争议地讨论。
基于本发明的问题是提供新的和/或改进的细胞保护性，优选心脏和肾脏保护性化合物，该化合物优选用于医学和/或细胞保护，优选心脏和/或肾脏保护性治疗。
发明内容
在第一方面，通过用于医学治疗，优选细胞保护、更优选心脏和/或肾脏保护性治疗的根据式(I)或(II)的化合物及其药学上可接受的盐或溶剂化物解决了基于本发明的问题：
其中：
式(I)中(2)、(3)、(4)和(5)位之间以及式(II)中(1)、(2)、(3)、(4)、(5)和(6)位之间的虚线表示各个位置之间的单键或双键；
X选自N和C；
Y选自S和C，条件是当Y是C时，X是N；
a是0-15的整数，优选0-10，更优选0-5，最优选0或1；
R1选自
(i)氢、羟基、F、Cl、Br和氧代，优选地，如果X不是N，或者如果X是N并且a不是0，则R1选自羟基、F、Cl、Br和氧代；
(ii)直链或支链的取代或未取代的(C1-10)烷基醚、(C2-10)烯基醚、(C2-10)炔基醚和(C4-10)碳环醚；
(iii)直链或支链的取代或未取代的(C1-10)烷基，优选(C1-5)烷基，更优选甲基、乙基和丙基，最优选甲基、(C2-10)烯基和(C2-10)炔基；
(iv)取代或未取代的选自(C3-10)碳环的碳环，优选(C3)碳环和(C5-6)碳环，优选芳族(C6)碳环，更优选未取代的苯基和在对位被取代基取代的苯基，所述取代基选自Cl、F、Br、取代或未取代的甲基，优选-(CF3)、乙基、丙基和环丙基；和
(v)取代或未取代的(C3-6)杂环和(C7-C10)碳二环或杂二环，其中所述杂环和杂二环具有1-3个各自独立地选自N、O和S的杂原子，优选具有2个选自N和S的杂原子的取代或未取代的(C7)杂二环，更优选取代或未取代的吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基，优选通过(5)或(6)位连接的吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基，更优选通过吲唑基或苯并二氧杂环戊烯基的(6)位或者通过苯并咪唑基的(5)位连接；
R2选自
(i)氢、羟基、O-R14、-O-C(＝O)-R14、F、Cl、Br和氧代，其中R14选自
(aa)直链或支链的取代或未取代的(C1-10)烷基，优选(C1-5)烷基，更优选甲基、乙基和丙基，最优选甲基、(C2-10)烯基和(C2-10)炔基；
(bb)取代或未取代的芳族或非芳族(C3-10)碳环，优选(C3-6)环烷基，更优选(C3)碳环和(C6)碳环，优选(C6)碳环，更优选在对位被(C3)碳环或-(CF3)单取代的苯基或者在间位被(C3)碳环或-(CF3)二取代的苯基；和
(cc)取代或未取代的芳族或非芳族(C3-6)杂环，优选芳族(C3-6)杂环，其具有1-3个各自独立地选自N、O和S的杂原子；
(ii)直链或支链的取代或未取代的(C1-10)烷基，优选(C1-5)烷基，更优选甲基、乙基和丙基，最优选甲基、(C2-10)烯基、(C2-10)炔基和(C3-10)碳环，优选(C3-6)环烷基；
(iii)直链或支链的取代或未取代的(C1-10)烷基醚、(C2-10)烯基醚、(C2-10)炔基醚和(C4-10)碳环醚；和
(iv)取代或未取代的(C3-6)杂环和(C7-C10)碳二环或杂二环，其中所述杂环和杂二环具有1-3个各自独立地选自N、O和S的杂原子，优选具有2个选自N和S的杂原子的取代或未取代的(C7)杂二环，更优选取代或未取代的吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基，优通过吲唑基、苯并二氧杂环戊烯基或苯并咪唑基的(5)或(6)位连接的吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基；
R3和R4独立地选自
(i)氢、-O-R14、-O-C(＝O)-R14、F、Cl、Br和氧代，其中R14选自
(aa)直链或支链的取代或未取代的(C1-10)烷基，优选(C1-5)烷基，更优选甲基、乙基和丙基，最优选甲基、(C2-10)烯基和(C2-10)炔基；
(bb)取代或未取代的芳族或非芳族(C3-10)碳环，优选(C3-6)环烷基，更优选(C3)碳环和(C6)碳环，优选(C6)碳环，更优选在对位被(C3)碳环或-(CF3)单取代的苯基或者在间位被(C3)碳环或-(CF3)二取代的苯基；和
(cc)取代或未取代的芳族或非芳族(C3-6)杂环，优选芳族(C3-6)杂环，其具有1-3个各自独立地选自N、O和S的杂原子；
(ii)直链或支链的取代或未取代的(C1-10)烷基，优选(C1-5)烷基，更优选甲基、乙基和丙基，最优选甲基、(C2-10)烯基、(C2-10)炔基和(C3-10)碳环，优选取代或未取代的(C3-6)环烷基和具有1-3个各自独立地选自N、O和S的杂原子的(C3-6)杂环；
(iii)直链或支链的取代或未取代的(C1-10)烷基醚、(C2-10)烯基醚、(C2-10)炔基醚和(C4-10)碳环醚；
(iv)其中R12选自
(aa)氢、羟基、取代或未取代的N、F、Cl和Br；
(bb)直链或支链的取代或未取代的(C1-10)烷基，优选(C1-5)烷基，更优选甲基、乙基和丙基，最优选甲基、(C2-10)烯基和(C2-10)炔基；
(cc)取代或未取代的芳族或非芳族(C3-10)碳环，优选(C3-6)环烷基，更优选(C3)碳环和(C6)碳环，优选(C6)碳环，更优选在对位被(C3)碳环或-(CF3)单取代的苯基或者在间位被(C3)碳环或-(CF3)二取代的苯基；和
(dd)取代或未取代的芳族或非芳族(C3-6)杂环，优选芳族(C3-6)杂环，其具有1-3个各自独立地选自N、O和S的杂原子；和
(v)其中X是N或C，a是0-15的整数，优选0-10，更优选0-5，最优选0或1，和R13选自
(aa)氢、羟基、F、Cl和Br；
(bb)直链或支链的取代或未取代的(C1-10)烷基，优选(C1-5)烷基，更优选甲基、乙基和丙基，最优选甲基、(C2-10)烯基和(C2-10)炔基；
(cc)取代或未取代的(C3-10)碳环，优选(C3-6)环烷基、(C7-C10)碳二环或杂二环和(C3-6)杂环，其中所述杂二环和杂环具有1-3个各自独立地选自N、O和S的杂原子，
对于R3更优选地是，R13是具有2个选自N和S的杂原子的(C7)杂二环，最优选取代或未取代的吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基，优选通过(5)或(6)位连接的吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基，更优选通过吲唑基和苯并二氧杂环戊烯基的(5)位或苯并咪唑基的(6)位连接，和
对于R4更优选地是，R13是取代或未取代的芳族(C6)碳环，优选在间位被(C3)-碳环或-(CF3)单或二取代的(C6)碳环，或者在对位被(C3)-碳环或-(CF3)单取代的(C6)碳环；和
(dd)直链或支链的取代或未取代的(C1-10)烷基醚、(C2-10)烯基醚、(C2-10)炔基醚和(C4-10)碳环醚；
其中，如果式(I)的环的(2)、(3)和/或(4)位是sp3-杂化的，R2和R4和/或R3和R4优选彼此呈顺式或反式构型，更优选呈反式构型，优选地，R2是(R)-或(S)-构型，R3是(R)-或(S)-构型和/或R4是(R)-或(S)-构型，更优选地，R2是(R)-构型，R3是(R)-构型和/或R4是(R)-构型，或者R2是(S)-构型，R3是(S)-构型和/或R4是(S)-构型；
R5和R9选自
(i)氢、羟基、F、Cl、Br和氧代，条件是如果X是N且Y是C，则R9不是氧代；
(ii)直链或支链的取代或未取代的(C1-10)烷基醚、(C2-10)烯基醚、(C2-10)炔基醚和(C4-10)碳环醚；
(iii)直链或支链的取代或未取代的(C1-10)烷基，优选(C1-5)烷基，更优选甲基、乙基和丙基，最优选甲基、(C2-10)烯基和(C2-10)炔基；
(iv)取代或未取代的(C3-10)碳环，优选取代或未取代的(C3)碳环、取代或未取代的芳族(C5-6)碳环，更优选环戊-2，4-二烯-1-基和芳族(C6)碳环，最优选未取代的或在对位被取代基取代的苯基，所述取代基选自Cl、F、Br、取代或未取代的甲基，优选-(CF3)、乙基、丙基和环丙基；和
(v)具有1-3个各自独立地选自N、O和S的杂原子的(C3-6)杂环，优选取代或未取代的咪唑基和吡唑基，更优选通过咪唑基-/吡唑基-位置-(1)-氮与式(I)的环连接的咪唑基和吡唑基；
其中，如果式(I)的环的(5)位是sp3-杂化的，则R5优选是(S)-或(R)-构型，更优选(R)-构型；
并且其中，如果式(II)的环的(3)位是sp3-杂化的，则R9优选是(S)-或(R)-构型，更优选(S)-构型；
R6和R11独立地选自
(i)直链或支链的取代或未取代的(C1-10)烷基醚、(C2-10)烯基醚、(C2-10)炔基醚和(C4-10)碳环醚；
(ii)直链或支链的取代或未取代的(C1-10)烷基，优选(C1-5)烷基，更优选甲基、乙基和丙基，最优选甲基、(C2-10)烯基和(C2-10)炔基；
(iii)取代或未取代的碳环，其选自(C3-10)碳环，优选(C3)碳环和(C5-6)碳环，更优选芳族(C6)碳环，最优选未取代的或者在间和对位被取代基单或二取代的苯基，所述取代基选自Cl、F、Br、取代或未取代的甲基、乙基、丙基和环丙基；和
(iv)取代或未取代的(C3-6)杂环和(C7-C10)碳二环或杂二环，其中所述杂环和杂二环具有1-3个各自独立地选自N、O和S的杂原子，优选具有2个选自N和S的杂原子的取代或未取代的(C7)杂二环，最优选取代或未取代的吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基，优选通过(5)或(6)位连接的吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基，更优选通过吲唑基或苯并二氧杂环戊烯基的(6)位或苯并咪唑基的(5)位连接，
其中如果Y是S，则R6不存在；和/或
其中如果式(II)的环具有在式(II)的环的(4)和(5)位之间或(3)和(4)位之间的双键，则R11不存在，
并且条件是如果X是N，Y是C并且式(II)的环是芳族的，则R6不是1，2，4-三唑基；
R7选自
(i)氢、羟基、F、Cl、Br和氧代；
(ii)直链或支链的取代或未取代的(C1-10)烷基，优选(C1-5)烷基，更优选甲基、乙基和丙基，最优选甲基、(C2-10)烯基、(C2-10)炔基和(C3-10)碳环，优选(C3-6)环烷基和具有1-3个各自独立地选自N、O和S的杂原子的(C3-6)杂环；
(iii)直链或支链的取代或未取代的(C1-10)烷基醚、(C2-10)烯基醚、(C2-10)炔基醚和(C4-10)碳环醚；和
(iv)其中R12选自
(aa)氢、羟基、取代或未取代的N、F、Cl和Br；
(bb)直链或支链的取代或未取代的(C1-10)烷基，优选(C1-5)烷基，更优选甲基、乙基和丙基，最优选甲基、(C2-10)烯基、(C2-10)炔基和芳族或非芳族(C3-10)碳环，优选(C3-6)环烷基，更优选(C3)碳环，最优选在对位被(C3)碳环或-(CF3)单取代或在间位被(C3)碳环或-(CF3)二取代的芳族(C6)碳环；和
(cc)取代或未取代的芳族或非芳族(C3-6)杂环，优选芳族(C3-6)杂环，其具有1-3个各自独立地选自N、O和S的杂原子；
R8选自上面对R7定义的组，该组还包括
(i)其中X是N或C，a是0-15的整数，优选0-10，更优选0-5，最优选0或1，和R13选自
(aa)氢、羟基、F、Cl和Br；
(bb)直链或支链的取代或未取代的(C1-10)烷基，优选(C1-5)烷基，更优选甲基、乙基和丙基，最优选甲基、(C2-10)烯基和(C2-10)炔基；
(cc)取代或未取代的(C3-10)碳环，优选(C3-6)环烷基、(C7-C10)碳二环或杂二环和(C3-6)杂环，其中所述杂二环和杂环具有1-3个各自独立地选自N、O和S的杂原子，
更优选取代或未取代的具有2个选自N和S的杂原子的(C7)杂二环，最优选取代或未取代的吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基，优选通过(5)或(6)位连接的吲唑基和苯并二氧杂环戊烯基，更优选通过吲唑基和苯并二氧杂环戊烯基的(5)位或苯并咪唑基的(6)位连接，
最优选取代或未取代的芳族(C6)碳环，优选在间位被(C3)-碳环或-(CF3)单或二取代的或在对位被(C3)-碳环或-(CF3)单取代的(C6)碳环；和
(dd)直链或支链的取代或未取代的(C1-10)烷基醚、(C2-10)烯基醚、(C2-10)炔基醚和(C4-10)碳环醚；
条件是如果X是N，Y是C并且式(II)的环是芳族的，则R8不是1，2，4-三唑基，并且其中如果式(II)的环的(5)位是sp3-杂化的，则R8优选是(R)-或(S)-构型，更优选(R)-构型；
R10不存在或选自
(i)氢；
(ii)甲基；和
(iii)环丙基或在对位被取代基单取代的苯基，所述取代基选自H、Cl、F、Br、甲基、-(CF3)和环丙基；
其中R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10和R11中的一个或多个直接与式(I)或(II)的环连接，或者与在R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10和/或R11和式(I)或(II)的环之间的连接基连接，其中所述连接基选自直链或支链的取代或未取代的(C1-10)烷基醚、(C2-10)烯基醚、(C2-10)炔基醚、(C4-10)碳环醚、直链或支链的取代或未取代的(C1-10)烷基、(C2-10)烯基和(C2-10)炔基。
上述化合物靶向GRK2介导的非受体底物SRSF1的活化磷酸化，SRSF1是一种在细胞保护，特别是心脏和/或肾脏保护和心脏治疗中之前未被考虑过的靶标。SRSF1是非受体GRK2底物，其促进心力衰竭的病征，并且GRK2介导的SRSF1的磷酸化导致不可逆的心肌细胞坏死和心脏功能障碍。下面用转基因动物模型进一步描述的实施例1至3和图1至3证明GRK2介导的SRSF1磷酸化促进心力衰竭和心肌细胞坏死的病征，这是不可逆心脏损伤的主要原因。本发明的化合物干扰由GRK2触发的这种先前未被认识的主要心力衰竭促进机制(参见下面的实施例9至12和图9至12)。GRK2在患有心血管疾病和高血压的患者中上调(参见上文)。模拟患者心脏中发现的GRK2的上调的具有人GRK2过表达的转基因小鼠发展出增强的SRSF1介导的心肌细胞坏死和心脏功能障碍，例如，这是由于促进心肌细胞坏死和心力衰竭的CAMK2D同种型B/C的强化剪接(参见下面的实施例3和图3)。值得注意的是，不可逆的坏死性心肌细胞死亡是心肌梗塞和缺血性心脏病的主要特征，心肌梗塞和缺血性心脏病由主要的心血管危险因素引发，例如，原发性高血压和其他高血压病症、动脉粥样硬化、慢性心力衰竭、高脂血症、糖尿病、中风、抑郁症、压力、衰老。例如，通过本发明的化合物抑制GRK2介导的促进心力衰竭的SRSF1磷酸化对体内心力衰竭的慢性压力超负荷诱导的病征发挥心脏保护作用(参见实施例11、12和图11、12)，例如通过延缓心肌细胞坏死(参见下面的实施例9至12和图9至12)、心脏功能障碍(参见实施例11、12和图11、12)和心血管疾病诱导的衰老(参见实施例12和图12)的发展发挥心脏保护作用。值得注意的是，帕罗西汀还在体外和体内抑制GRK2介导的SRSF1磷酸化(参见实施例8和图8)，但是以非特异性方式抑制，且具有上述使帕罗西汀不适合于患者的心脏保护疗法的所有缺点(Uguz等人，Gen Hosp Psychiatry46-48，37(2015))。
具体实施方式
在第一方面，本发明涉及上面公开的化合物本身，即在物质权利要求的范围内。在另一方面，本发明涉及用于医学治疗，优选用于细胞保护，特别是用于心脏和肾脏保护性治疗的这些化合物。
如本文所用，术语心脏保护疗法是指影响心脏的任何疾病或病症的预防或治疗，即保护心脏免受疾病或治疗现有心脏疾病的治疗。心脏保护疗法包括，例如，降低心血管死亡率和/或发病率的风险，预防和治疗由例如以下疾病引起的不可逆的坏死性心肌细胞死亡：心肌梗塞、缺血性心血管疾病、心绞痛、动脉粥样硬化、高血压病症、慢性心力衰竭、慢性肾功能衰竭、脑血管疾病、失代偿性心力衰竭、压力、衰老和/或抑郁。不可逆的坏死性心肌细胞死亡可能或通常是心脏重塑的主要原因，最终导致心脏功能障碍、心肌肥厚伴扩张、心肌变薄和终末期心力衰竭。
在一个优选的实施方案中，用于根据本发明的用途的化合物是以下化合物，其中在式(I)中，在(3)和(4)位之间，或者在(2)和(3)位之间和在(4)和(5)位之间存在双键，或者在环中不存在双键；并且在式(II)中，环中不存在双键或环是芳族的；
和/或
a是0或1；和/或
R1选自
(i)氢；
(ii)直链或支链的取代或未取代的(C1-5)烷基，更优选甲基、乙基和丙基，最优选甲基；
(iii)取代或未取代的环丙基和苯基，优选取代的苯基，更优选在对位被取代基单取代的苯基，所述取代基选自H、Cl、F、Br、甲基、-(CF3)和环丙基；和
(iv)取代或未取代的，优选未取代的通过(5)或(6)位连接的吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基，优选通过吲唑基和苯并二氧杂环戊烯基的(6)位或苯并咪唑基的(5)位连接。
在进一步优选的实施方案中，用于根据本发明的用途的化合物是以下化合物，其中
R2选自
(i)氢或氧代；
(ii)直链或支链的取代或未取代的(C1-5)烷基，更优选甲基、乙基和丙基，最优选甲基；和
(iii)取代或未取代的吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基，优选通过吲唑基、苯并二氧杂环戊烯基和苯并咪唑基的(5)或(6)位连接的吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基；和/或
R3选自
(i)氢；
(ii)直链或支链的取代或未取代的(C1-5)烷基，更优选甲基、乙基和丙基，最优选甲基；
(iii)其中R12选自
(aa)N；和
(bb)取代或未取代的环丙基和苯基，优选在对位被环丙基或-(CF3)单取代或在间位被环丙基或-(CF3)在各间位二取代的苯基；和
(iv)其中X是N，a是1和R13选自取代或未取代的，优选未取代的通过吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基的(6)或(5)位连接的吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基，优选通过吲唑基和苯并二氧杂环戊烯基的(5)位或苯并咪唑基的(6)位连接；
和/或
R4选自
(i)氢和羟基；
(ii)直链或支链的取代或未取代的(C1-5)烷基，更优选甲基、乙基和丙基，最优选甲基；
(iii)其中R12选自
(aa)N；和
(bb)取代或未取代的环丙基和苯基，优选在对位或间位被环丙基或-(CF3)单取代或在间位被环丙基或-(CF3)在各间位二取代的苯基；和
(iv)其中X是N，a是1和R13是在各间位被环丙基或-(CF3)单或二取代或在对位被环丙基或-(CF3)单取代的苯基；
其中，如果式(I)的环的(2)、(3)和/或(4)位是sp3-杂化的，R2和R4和/或R3和R4优选彼此呈顺式或反式构型，更优选呈反式构型，优选地，R2是(R)-或(S)-构型，R3是(R)-或(S)-构型和/或R4是(R)-或(S)-构型，更优选地，R2是(R)-构型，R3是(R)-构型和/或R4是(R)-构型，或R2是(S)-构型，R3是(S)-构型和/或R4是(S)-构型；和/或
R5选自
(i)氢；
(ii)直链或支链的取代或未取代的(C1-5)烷基，更优选甲基、乙基和丙基，最优选甲基；
(iii)取代或未取代的环丙基和苯基，优选取代的苯基，更优选在对位被取代基单取代的苯基，所述取代基选自H、Cl、F、Br、甲基、-(CF3)和环丙基；
(iv)环戊-2，4-二烯-1-基；和
(v)取代或未取代的，优选未取代的通过咪唑基-/吡唑基-位置-(1)-氮与式(I)的环连接的咪唑基和吡唑基；
其中，如果式(I)的环的(5)位是sp3-杂化的，R5优选是(R)-或(S)-构型，更优选(R)-构型；和/或
R6和R11独立地选自取代或未取代的，优选未取代的通过(6)或(5)位连接的吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基，优选通过吲唑基和苯并二氧杂环戊烯基的(6)位或苯并咪唑基的(5)位连接；
其中如果Y是S，则R6不存在；和/或
其中如果式(II)的环具有在式(II)的环的(4)和(5)位之间或者在(3)和(4)位之间的双键，则R11不存在；和/或
R7和R8独立地选自下组
(i)氢；
(ii)直链或支链的取代或未取代的(C1-5)烷基，更优选甲基、乙基和丙基，最优选甲基；和
(iii)其中R12选自
(aa)N；和
(bb)取代或未取代的环丙基和苯基，优选在对位被环丙基或-(CF3)单取代或在间位被环丙基或-(CF3)在各间位二取代的苯基；
其中，对于R8，该组还包括
其中X是N，a是1和R13选自取代或未取代的，优选未取代的通过(6)或(5)位连接的吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基，优选通过吲唑基和苯并二氧杂环戊烯基的(5)位或苯并咪唑基的(6)位连接；和
其中，如果式(II)的环的(5)位是sp3-杂化的，则R8优选是(R)-或(S)-构型，更优选(R)-构型；和/或
R9选自
(i)氢、甲基和环丙基；和
(ii)取代或未取代的苯基，优选在对位被取代基取代的苯基，所述取代基选自H、Cl、F、Br、甲基、-(CF3)和环丙基；和
其中，如果式(II)的环的(3)位是sp3-杂化的，则R9优选是(R)-或(S)-构型，更优选(S)-构型；和/或
R10不存在或选自
(i)氢；
(ii)甲基；和
(iii)环丙基和在对位被取代基单取代的苯基，所述取代基选自H、Cl、F、Br、甲基、-(CF3)和环丙基，
其中如果X是C和/或如果式(II)的环具有在式(II)的环的(1)和(2)位之间或者在(2)和(3)位之间的双键，则R10不存在。
在进一步优选的实施方案中，用于根据本发明的用途的化合物是其中双键位于(3)和(4)位之间的式(I)的化合物(式Ia)
其中X是N和a是0，并且其中
R1选自通过(6)或(5)位连接的吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基，优选通过吲唑基和苯并二氧杂环戊烯基的(6)位或苯并咪唑基的(5)位连接；和/或
R2是氧代；和/或
R3选自
(i)氢；
(ii)甲基；和
(iii)其中R12选自
(aa)N；和
(bb)环丙基和在对位被环丙基或-(CF3)单取代或在间位被环丙基或-(CF3)在各间位二取代的苯基；和/或
R4是羟基；和/或
R5选自
(i)氢；
(ii)甲基；
(iii)环丙基和在对位被取代基单取代的苯基，所述取代基选自H、Cl、F、Br、甲基、-(CF3)和环丙基；
(iv)环戊-2，4-二烯-1-基；和
(v)通过咪唑基-/吡唑基-位置-(1)-氮与式(I)的环连接的咪唑基和吡唑基；
其中R5优选是(R)-或(S)-构型，更优选(R)-构型。
在进一步优选的实施方案中，用于根据本发明的用途的化合物是其中两个双键分别位于(2)和(3)位之间以及(4)和(5)位之间的式(I)的化合物(式Ib)
其中X是N或C，优选N，a是0或1，优选地，如果X是C，则a是0，并且其中
R1选自通过(5)或(6)位连接的吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基，优选通过吲唑基和苯并二氧杂环戊烯基的(6)位或苯并咪唑基的(5)位连接；和/或
R2选自
(i)氢；和
(ii)甲基；和/或
R3选自
(i)氢；
(ii)甲基；和
(iii)其中R12选自
(aa)N；和
(bb)环丙基和在对位被环丙基或-(CF3)单取代或在间位被环丙基或-(CF3)在各间位二取代的苯基；和/或
R4是氢；和/或
R5选自
(i)氢；
(ii)甲基；和
(iii)环丙基和在对位被取代基单取代的苯基，所述取代基选自H、Cl、F、Br、甲基、-(CF3)和环丙基。
在进一步优选的实施方案中，用于根据本发明的用途的化合物是其中式(I)的五元环中的键是完全饱和的式(I)的化合物(式Ic)
其中X是N，a是0，并且其中
R1选自
(i)氢；
(ii)甲基；和
(iii)环丙基和在对位被取代基单取代的苯基，所述取代基选自H、Cl、F、Br、甲基、-(CF3)和环丙基；和/或
R2选自
(i)氢；和
(ii)吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基，优选通过(5)或(6)位连接的吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基，如果R3不是甲基，则更优选通过吲唑基和苯并二氧杂环戊烯基的(5)位或苯并咪唑基的(6)位连接，如果R3是甲基，则最优选通过吲唑基和苯并二氧杂环戊烯基的(6)位或苯并咪唑基的(5)位连接；和/或
R3选自
(i)氢或甲基；和
(ii)其中X是N，a是1和R13选自通过吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基的(6)或(5)位连接的吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基，优选通过吲唑基和苯并二氧杂环戊烯基的(5)位或苯并咪唑基的(6)位连接；和/或
R4选自
(i)氢；
(ii)甲基；
(iii)其中R12选自
(aa)N；和
(bb)环丙基和在对位被环丙基或-(CF3)单取代或在间位被环丙基或-(CF3)在各间位二取代的苯基；和
(iv)其中X是N，a是1和R13是在间位被环丙基或-(CF3)单取代或在各间位被环丙基或-(CF3)二取代或在对位被环丙基或-(CF3)单取代的苯基；
其中，R2和R4和/或R3和R4优选彼此呈反式构型，优选地，R2是(S)-构型，R3是(S)-构型和R4是(R)-构型；和/或
R5是氢。
在进一步优选的实施方案中，用于根据本发明的用途的化合物是其中式(II)的环内的键是完全饱和的式(II)的化合物(式IIa)
其中X是C，Y是S，并且其中
R6不存在；和/或
R7选自
(i)氢；
(ii)甲基；和
(iii)其中R12选自
(aa)N；和
(bb)环丙基或在对位被环丙基或-(CF3)单取代或在间位被环丙基或-(CF3)在各间位二取代的苯基；和/或
R8选自
(i)氢和甲基；和
(ii)其中X是N，a是1和R13选自通过(6)或(5)位连接的吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基，优选通过吲唑基和苯并二氧杂环戊烯基的(5)位或苯并咪唑基的(6)位连接；
其中R8优选是(R)-或(S)-构型，更优选(R)-构型；和/或
R9选自
(i)氢、甲基和环丙基；和
(ii)在对位被取代基单取代的苯基，所述取代基选自H、Cl、F、Br、甲基、-(CF3)和环丙基；
其中R9优选是(R)-或(S)-构型，更优选(S)-构型；和/或
R10是氢；和/或
R11是氢或选自通过(6)或(5)位连接的吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基，优选通过吲唑基和苯并二氧杂环戊烯基的(6)位或苯并咪唑基的(5)位连接。
在进一步优选的实施方案中，用于根据本发明的用途的化合物是其中式(II)的环是芳族的式(II)的化合物(式IIb)
其中X是N，Y是C，并且其中
R6选自通过(6)或(5)位连接的吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基，优选通过吲唑基和苯并二氧杂环戊烯基的(6)位或苯并咪唑基的(5)位连接；和/或
R7和R8独立地选自
(i)氢；
(ii)甲基；和
(iii)其中R12选自
(aa)N；和
(bb)环丙基和在对位被环丙基或-(CF3)单取代的苯基或在间位被环丙基或-(CF3)在各间位二取代的苯基；
和/或
R9是氢；和/或
R10和/或R11不存在。
在进一步优选的实施方案中，用于根据本发明的用途的化合物是其中两个双键分别位于(1)和(6)位之间以及(4)和(5)位之间的式(II)的化合物(式IIc)
其中X是N，Y是C，并且其中
R6选自通过(6)或(5)位连接的吲唑基、苯并咪唑基和苯并二氧杂环戊烯基，优选通过吲唑基和苯并二氧杂环戊烯基的(6)位或苯并咪唑基的(5)位连接；和/或
R7和R8独立地选自氢和甲基；
和/或
R9是氢；和/或
R10选自
(i)氢；
(ii)甲基；和
(iii)环丙基和在对位被取代基单取代的苯基，所述取代基选自H、Cl、F、Br、甲基、-(CF3)和环丙基；和/或
R11不存在。
在进一步优选的实施方案中，用于根据本发明的用途的化合物是以下化合物，其中
R1选自氢、甲基、
和/或
R2选自氢、氧代、甲基、
和/或
R3选自氢、甲基、
和/或
R4选自氢、羟基、甲基、
其中，R4和/或R3和R4优选彼此呈顺式或反式构型，更优选呈反式构型，优选地，R2是(R)-或(S)-构型，R3是(R)-或(S)-构型和/或R4是(R)-或(S)-构型，更优选地，R2是(R)-构型，R3是(R)-构型和/或R4是(R)-构型，或R2是(S)-构型，R3是(S)-构型和/或R4是(S)-构型，和/或
R5和R9选自氢、甲基、环戊-2，4-二烯-1-基、
其中R9优选不是环戊-2，4-二烯-1-基，
其中，如果式(I)的环的(5)位是sp3-杂化的，则R5优选是(R)-或(S)-构型，更优选(R)-构型，和
其中R9优选是(R)-或(S)-构型，更优选(R)-构型，和/或
如果Y是S，则R6不存在，并且如果Y是C，则R6选自
和/或
R7和R8选自氢、甲基、
其中R8另外选自
其中R8优选是(R)-或(S)-构型，更优选(R)-构型；和/或
R10不存在或选自氢、甲基、
其中如果X是C，和/或如果式(II)的环具有在式(II)的环的(1)和(2)位之间或者在(2)和(3)位之间的双键，则R10不存在，和/或
R11不存在或选自氢、
其中如果式(II)的环具有在式(II)的环的(4)和(5)位之间或在(3)和(4)位之间的双键，则R11不存在。
在进一步优选的实施方案中，用于根据本发明的用途的化合物是选自以下的化合物：
(i)与第二残基共价结合的第一残基，所述第一残基选自
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-3-羟基-5-氧代-2-甲基-2H-吡咯-4-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2-环丙基-3-羟基-5-氧代-2H-吡咯-4-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-3-羟基-5-氧代-2H-吡咯-4-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2-(环戊-2，4-二烯-1-基)-5-氧代-3-羟基-2H-吡咯-4-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-3-羟基-5-氧代-2-(吡唑-1-基)-2H-吡咯-4-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-3-羟基-5-氧代-2-(咪唑-1-基)-2H-吡咯-4-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-3-羟基-5-氧代-2-苯基-2H-吡咯-4-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-3-羟基-5-氧代-2-(对甲苯基)-2H-吡咯-4-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2-(4-氯苯基)-3-羟基-5-氧代-2H-吡咯-4-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2-(4-氟苯基)-3-羟基-5-氧代-2H-吡咯-4-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2-(4-溴苯基)-3-羟基-5-氧代-2H-吡咯-4-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2-(4-环丙基苯基)-3-羟基-5-氧代-2H-吡咯-4-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-3-羟基-5-氧代-2-[4-(三氟甲基)苯基]-2H-吡咯-4-基，
3-羟基-1-(1H-吲唑-6-基)-5-氧代-2-[4-(三氟甲基)苯基]-2H-吡咯-4-基，
3-羟基-1-(1H-吲唑-6-基)-5-氧代-2-苯基-2H-吡咯-4-基，
3-羟基-1-(1H-吲唑-6-基)-5-氧代-2-(对甲苯基)-2H-吡咯-4-基，
2-(4-氯苯基)-3-羟基-1-(1H-吲唑-6-基)-5-氧代-2H-吡咯-4-基，
2-(4-氟苯基)-3-羟基-1-(1H-吲唑-6-基)-5-氧代-2H-吡咯-4-基，
2-(4-溴苯基)-3-羟基-1-(1H-吲唑-6-基)-5-氧代-2H-吡咯-4-基，
2-(4-环丙基苯基)-3-羟基-1-(1H-吲唑-6-基)-5-氧代-2H-吡咯-4-基，
2-环丙基-3-羟基-1-(1H-吲唑-6-基)-5-氧代-2H-吡咯-4-基，
3-羟基-1-(1H-吲唑-6-基)-5-氧代-2-甲基-2H-吡咯-4-基，
3-羟基-1-(1H-吲唑-6-基)-5-氧代-2H-吡咯-4-基，
3-羟基-1-(1H-吲唑-6-基)-5-氧代-2-(吡唑-1-基)-2H-吡咯-4-基，
2-(环戊-2，4-二烯-1-基)-3-羟基-1-(1H-吲唑-6-基)-5-氧代-2H-吡咯-4-基，
3-羟基-2-(咪唑-1-基)-1-(1H-吲唑-6-基)-5-氧代-2H-吡咯-4-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-3-羟基-5-氧代-2-二甲基-2H-吡咯-4-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-2-环丙基-3-羟基-5-氧代-2H-吡咯-4-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-3-羟基-5-氧代-2-(吡唑-1-基)-2H-吡咯-4-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-3-羟基-5-氧代-2H-吡咯-4-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-3-羟基-5-氧代-2-(咪唑-1-基)-2H-吡咯-4-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-2-(环戊-2，4-二烯-1-基)-3-羟基-5-氧代-2H-吡咯-4-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-2-(4-氟苯基)-3-羟基-5-氧代-2H-吡咯-4-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-3-羟基-5-氧代-2-[4-(三氟甲基)苯基]-2H-吡咯-4-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-3-羟基-5-氧代-2-苯基-2H-吡咯-4-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-3-羟基-5-氧代-2-(对甲苯基)-2H-吡咯-4-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-2-(4-氯苯基)-3-羟基-5-氧代-2H-吡咯-4-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-2-(4-溴苯基)-3-羟基-5-氧代-2H-吡咯-4-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-2-(4-环丙基苯基)-3-羟基-5-氧代-2H-吡咯-4-基，
其中2H-吡咯环的编号如下：
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-2-甲基-5-(对甲苯基)吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-氯苯基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-氟苯基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-2-甲基-5-[4-(三氟甲基)苯基]吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-溴苯基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-环丙基苯基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-2-甲基-5-苯基-吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-苯基-吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(对甲苯基)吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-氟苯基)吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-[4-(三氟甲基)苯基]吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-氯苯基)吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-溴苯基)吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-环丙基苯基)吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-2，5-二甲基-吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-环丙基-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-甲基-吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-环丙基-吡咯-3-基，
1-(1H-吲唑-6-基甲基)-2-甲基-5-苯基-吡咯-3-基，
1-(1H-吲唑-6-基甲基)-2-甲基-5-(对甲苯基)吡咯-3-基，
5-(4-氯苯基)-1-(1H-吲唑-6-基甲基)-2-甲基-吡咯-3-基，
5-(4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-6-基甲基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-吲唑-6-基甲基)-2-甲基-5-[4-(三氟甲基)苯基]吡咯-3-基，
5-(4-溴苯基)-1-(1H-吲唑-6-基甲基)-2-甲基-吡咯-3-基，
5-(4-环丙基苯基)-1-(1H-吲唑-6-基甲基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-吲唑-6-基甲基)-5-苯基-吡咯-3-基，
1-(1H-吲唑-6-基甲基)-5-(对甲苯基)吡咯-3-基，
5-(4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-6-基甲基)吡咯-3-基，
1-(1H-吲唑-6-基甲基)-5-[4-(三氟甲基)苯基]吡咯-3-基，
5-(4-氯苯基)-1-(1H-吲唑-6-基甲基)吡咯-3-基，
5-(4-溴苯基)-1-(1H-吲唑-6-基甲基)吡咯-3-基，
5-(4-环丙基苯基)-1-(1H-吲唑-6-基甲基)吡咯-3-基，
5-环丙基-1-(1H-吲唑-6-基甲基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-吲唑-6-基甲基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-吲唑-6-基甲基)-2，5-二甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-吲唑-6-基甲基)吡咯-3-基，
5-环丙基-1-(1H-吲唑-6-基甲基)吡咯-3-基，
1-(1H-吲唑-6-基甲基)-5-甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基甲基)-2-甲基-5-苯基-吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基甲基)-2-甲基-5-(对甲苯基)吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基甲基)-2-甲基-5-(对甲苯基)吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基甲基)-5-(4-氟苯基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基甲基)-5-(4-环丙基苯基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基甲基)-5-(4-溴苯基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基甲基)-2-甲基-5-[4-(三氟甲基)苯基]吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基甲基)-5-苯基-吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基甲基)-5-(对甲苯基)吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基甲基)-5-[4-(三氟甲基)苯基]吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基甲基)-5-(4-氯苯基)吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基甲基)-5-(4-氟苯基)吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基甲基)-5-(4-溴苯基)吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基甲基)-5-(4-环丙基苯基)吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基甲基)-2，5-二甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基甲基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基甲基)-5-环丙基-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基甲基)-5-甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基甲基)吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基甲基)-5-环丙基-吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(对甲苯基)吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-苯基-吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(4-氟苯基)吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-[4-(三氟甲基)苯基]吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(4-溴苯基)吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(4-氯苯基)吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(4-环丙基苯基)吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2-甲基-5-(对甲苯基)吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2-甲基-5-苯基-吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(4-氟苯基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2-甲基-5-[4-(三氟甲基)苯基]吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(4-氯苯基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(4-溴苯基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(4-环丙基苯基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2，5-二甲基-吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-环丙基-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-甲基-吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)吡咯-3-基，
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-环丙基-吡咯-3-基，
1-(1H-吲唑-6-基)-5-(对甲苯基)吡咯-3-基，
5-(4-氯苯基)-1-(1H-吲唑-6-基)吡咯-3-基，
5-(4-溴苯基)-1-(1H-吲唑-6-基)吡咯-3-基，
5-(4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-6-基)吡咯-3-基，
1-(1H-吲唑-6-基)-5-苯基-吡咯-3-基，
5-(4-环丙基苯基)-1-(1H-吲唑-6-基)吡咯-3-基，
1-(1H-吲唑-6-基)-5-[4-(三氟甲基)苯基]吡咯-3-基，
1-(1H-吲唑-6-基)-2-甲基-5-(对甲苯基)吡咯-3-基，
5-(4-氯苯基)-1-(1H-吲唑-6-基)-2-甲基-吡咯-3-基，
5-(4-溴苯基)-1-(1H-吲唑-6-基)-2-甲基-吡咯-3-基，
5-(4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-6-基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-吲唑-6-基)-2-甲基-5-苯基-吡咯-3-基，
5-(4-环丙基苯基)-1-(1H-吲唑-6-基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-吲唑-6-基)-2-甲基-5-[4-(三氟甲基)苯基]吡咯-3-基，
1-(1H-吲唑-6-基)-2，5-二甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-吲唑-6-基)-2-甲基-吡咯-3-基，
5-环丙基-1-(1H-吲唑-6-基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-吲唑-6-基)-5-甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-吲唑-6-基)吡咯-3-基，
5-环丙基-1-(1H-吲唑-6-基)吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-(对甲苯基)吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-(4-氯苯基)吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-(4-溴苯基)吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-(4-氟苯基)吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-苯基-吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-(4-环丙基苯基)吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-[4-(三氟甲基)苯基]吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-2-甲基-5-(对甲苯基)吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-(4-氯苯基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-(4-溴苯基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-(4-氟苯基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-2-甲基-5-苯基-吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-(4-环丙基苯基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-2-甲基-5-[4-(三氟甲基)苯基]吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-2，5-二甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-环丙基-2-甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-甲基-吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)吡咯-3-基，
1-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-环丙基-吡咯-3-基，
其中吡咯环的编号如下：
(3R)-3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基氨基甲酰基)-5-苯基-硫代吗啉-2-基，
(3R)-3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基氨基甲酰基)-5-(对甲苯基)硫代吗啉-2-基，
(3R)-3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基氨基甲酰基)-5-(4-氟苯基)硫代吗啉-2-基，
(3R)-3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基氨基甲酰基)-5-(4-溴苯基)硫代吗啉-2-基，
(3R)-3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基氨基甲酰基)-5-(4-氯苯基)硫代吗啉-2-基，
(3R)-3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基氨基甲酰基)-5-(4-环丙基苯基)硫代吗啉-2-基，
(3R)-3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基氨基甲酰基)-5-[4-(三氟甲基)苯基]硫代吗啉-2-基，
(3R)-3-(1H-吲唑-5-基甲基氨基甲酰基)-5-苯基-硫代吗啉-2-基，
(3R)-3-(1H-吲唑-5-基甲基氨基甲酰基)-5-(对甲苯基)硫代吗啉-2-基，
(3R)-5-(4-氟苯基)-3-(1H-吲唑-5-基甲基氨基甲酰基)硫代吗啉-2-基，
(3R)-5-(4-溴苯基)-3-(1H-吲唑-5-基甲基氨基甲酰基)硫代吗啉-2-基，
(3R)-5-(4-氯苯基)-3-(1H-吲唑-5-基甲基氨基甲酰基)硫代吗啉-2-基，
(3R)-5-(4-环丙基苯基)-3-(1H-吲唑-5-基甲基氨基甲酰基)硫代吗啉-2-基，
(3R)-3-(1H-吲唑-5-基甲基氨基甲酰基)-5-[4-(三氟甲基)苯基]硫代吗啉-2-基，
(3R)-3-(3H-苯并咪唑-5-基甲基氨基甲酰基)-5-苯基-硫代吗啉-2-基，
(3R)-3-(3H-苯并咪唑-5-基甲基氨基甲酰基)-5-(对甲苯基)硫代吗啉-2-基，
(3R)-3-(3H-苯并咪唑-5-基甲基氨基甲酰基)-5-(4-氟苯基)硫代吗啉-2-基，
(3R)-3-(3H-苯并咪唑-5-基甲基氨基甲酰基)-5-[4-(三氟甲基)苯基]硫代吗啉-2-基，
(3R)-3-(3H-苯并咪唑-5-基甲基氨基甲酰基)-5-(4-溴苯基)硫代吗啉-2-基，
(3R)-3-(3H-苯并咪唑-5-基甲基氨基甲酰基)-5-(4-氯苯基)硫代吗啉-2-基，
(3R)-3-(3H-苯并咪唑-5-基甲基氨基甲酰基)-5-(4-环丙基苯基)硫代吗啉-2-基，
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(4-氟苯基)硫代吗啉-2-基，
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(4-溴苯基)硫代吗啉-2-基，
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(4-氯苯基)硫代吗啉-2-基，
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-甲基-硫代吗啉-2-基，
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-环丙基-硫代吗啉-2-基，
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(4-环丙基苯基)硫代吗啉-2-基，
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(对甲苯基)硫代吗啉-2-基，
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-苯基-硫代吗啉-2-基，
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-[4-(三氟甲基)苯基]硫代吗啉-2-基，
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)硫代吗啉-2-基，
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(4-氟苯基)-3-甲基-硫代吗啉-2-基，
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(4-溴苯基)-3-甲基-硫代吗啉-2-基，
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(4-氯苯基)-3-甲基-硫代吗啉-2-基，
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-3，5-二甲基-硫代吗啉-2-基，
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-环丙基-3-甲基-硫代吗啉-2-基，
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(4-环丙基苯基)-3-甲基-硫代吗啉-2-基，
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-3-甲基-5-(对甲苯基)硫代吗啉-2-基，
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-3-甲基-5-苯基-硫代吗啉-2-基，
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-3-甲基-5-[4-(三氟甲基)苯基]硫代吗啉-2-基，
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-3-甲基-硫代吗啉-2-基，
5-(4-氟苯基)-4-(1H-吲唑-6-基)硫代吗啉-2-基，
5-(4-溴苯基)-4-(1H-吲唑-6-基)硫代吗啉-2-基，
5-(4-氯苯基)-4-(1H-吲唑-6-基)硫代吗啉-2-基，
4-(1H-吲唑-6-基)-5-甲基-硫代吗啉-2-基，
5-环丙基-4-(1H-吲唑-6-基)硫代吗啉-2-基，
5-(4-环丙基苯基)-4-(1H-吲唑-6-基)硫代吗啉-2-基，
4-(1H-吲唑-6-基)-5-(对甲苯基)硫代吗啉-2-基，
4-(1H-吲唑-6-基)-5-苯基-硫代吗啉-2-基，
4-(1H-吲唑-6-基)-5-[4-(三氟甲基)苯基]硫代吗啉-2-基，
4-(1H-吲唑-6-基)硫代吗啉-2-基，
5-(4-氟苯基)-4-(1H-吲唑-6-基)-3-甲基-硫代吗啉-2-基，
5-(4-溴苯基)-4-(1H-吲唑-6-基)-3-甲基-硫代吗啉-2-基，
5-(4-氯苯基)-4-(1H-吲唑-6-基)-3-甲基-硫代吗啉-2-基，
4-(1H-吲唑-6-基)-3，5-二甲基-硫代吗啉-2-基，
5-(4-环丙基苯基)-4-(1H-吲唑-6-基)-3-甲基-硫代吗啉-2-基，
4-(1H-吲唑-6-基)-3-甲基-5-(对甲苯基)硫代吗啉-2-基，
4-(1H-吲唑-6-基)-3-甲基-5-苯基-硫代吗啉-2-基，
5-环丙基-4-(1H-吲唑-6-基)-3-甲基-硫代吗啉-2-基，
4-(1H-吲唑-6-基)-3-甲基-硫代吗啉-2-基，
4-(1H-吲唑-6-基)-3-甲基-5-[4-(三氟甲基)苯基]硫代吗啉-2-基，
4-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-(4-氟苯基)硫代吗啉-2-基，
4-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-(4-溴苯基)硫代吗啉-2-基，
4-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-(4-氯苯基)硫代吗啉-2-基，
4-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-甲基-硫代吗啉-2-基，
4-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-环丙基-硫代吗啉-2-基，
4-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-(4-环丙基苯基)硫代吗啉-2-基，
4-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-(对甲苯基)硫代吗啉-2-基，
4-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-苯基-硫代吗啉-2-基，
4-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-[4-(三氟甲基)苯基]硫代吗啉-2-基，
4-(1H-苯并咪唑-5-基)硫代吗啉-2-基，
4-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-(4-氟苯基)-3-甲基-硫代吗啉-2-基，
4-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-(4-溴苯基)-3-甲基-硫代吗啉-2-基，
4-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-(4-氯苯基)-3-甲基-硫代吗啉-2-基，
4-(1H-苯并咪唑-5-基)-3，5-二甲基-硫代吗啉-2-基，
4-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-环丙基-3-甲基-硫代吗啉-2-基，
4-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-(4-环丙基苯基)-3-甲基-硫代吗啉-2-基，
4-(1H-苯并咪唑-5-基)-3-甲基-5-(对甲苯基)硫代吗啉-2-基，
4-(1H-苯并咪唑-5-基)-3-甲基-5-苯基-硫代吗啉-2-基，
4-(1H-苯并咪唑-5-基)-3-甲基-5-[4-(三氟甲基)苯基]硫代吗啉-2-基，
4-(1H-苯并咪唑-5-基)-3-甲基-硫代吗啉-2-基，
其中硫代吗啉环的编号如下：
6-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)嘧啶-4-基，
6-(1H-苯并咪唑-5-基)嘧啶-4-基，
6-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-甲基-嘧啶-4-基，
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)嘧啶-5-基，
6-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-甲基-嘧啶-4-基，
4-(1H-苯并咪唑-5-基)嘧啶-5-基，
6-(1H-吲唑-6-基)嘧啶-4-基，
6-(1H-吲唑-6-基)-4-甲基-嘧啶-5-基，和
6-(1H-吲唑-6-基)嘧啶-5-基；
第二残基选自氢，甲基，
和
(ii)与第二残基共价结合的第一残基，所述第一残基选自
6-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2H-嘧啶-1-基，
6-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-甲基-2H-嘧啶-1-基，
6-(1H-苯并咪唑-5-基)-2H-嘧啶-1-基，
6-(1H-苯并咪唑-5-基)-4-甲基-2H-嘧啶-1-基，
6-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4，5-二甲基-2H-嘧啶-1-基，
6-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-甲基-2H-嘧啶-1-基，
6-(1H-苯并咪唑-5-基)-4，5-二甲基-2H-嘧啶-1-基，
6-(1H-吲唑-6-基)-2H-嘧啶-1-基，
6-(1H-吲唑-6-基)-4-甲基-2H-嘧啶-1-基，
6-(1H-苯并咪唑-5-基)-5-甲基-2H-嘧啶-1-基，
6-(1H-吲唑-6-基)-4，5-二甲基-2H-嘧啶-1-基，
6-(1H-吲唑-6-基)-5-甲基-2H-嘧啶-1-基，
其中2H-嘧啶环的编号如下：
(4R)-3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基氨基甲酰基)-4-[[3-(三氟甲基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基氨基甲酰基)-4-[[3，5-双(三氟甲基)苯基]-甲基氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基氨基甲酰基)-4-[[4-(三氟甲基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基氨基甲酰基)-4-[[3-(环丙基苯基)苯基]-甲基氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基氨基甲酰基)-4-[[3，5-双(环丙基苯基)苯基]-甲基氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基氨基甲酰基)-4-[[4-(环丙基苯基)苯基]-甲基氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-3-(1H-吲唑-5-基甲基氨基甲酰基)-4-[[3-(三氟甲基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-3-(1H-吲唑-5-基甲基氨基甲酰基)-4-[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-3-(1H-吲唑-5-基甲基氨基甲酰基)-4-[[4-(三氟甲基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-3-(1H-吲唑-5-基甲基氨基甲酰基)-4-[[3-(环丙基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-3-(1H-吲唑-5-基甲基氨基甲酰基)-4-[[3，5-双(环丙基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-3-(1H-吲唑-5-基甲基氨基甲酰基)-4-[[4-(环丙基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-3-(3H-苯并咪唑-5-基甲基氨基甲酰基)-4-[[3-(三氟甲基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-3-(3H-苯并咪唑-5-基甲基氨基甲酰基)-4-[[3，5-双(三氟甲基)苯基]-甲基氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-3-(3H-苯并咪唑-5-基甲基氨基甲酰基)-4-[[4-(三氟甲基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-3-(3H-苯并咪唑-5-基甲基氨基甲酰基)-4-[[3-(环丙基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-3-(3H-苯并咪唑-5-基甲基氨基甲酰基)-4-[[3，5-双(环丙基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-3-(3H-苯并咪唑-5-基甲基氨基甲酰基)-4-[[4-(环丙基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-[[3-(三氟甲基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基氨基甲酰基]-吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-[[4-(三氟甲基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-甲基-吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-[[3-(环丙基)苯基]甲基氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-[[3，5-双(环丙基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-[[4-(环丙基)苯基]甲基氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1H-吲唑-5-基)-4-[[3-(三氟甲基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1H-吲唑-5-基)-4-[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1H-吲唑-5-基)-4-[[4-(三氟甲基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1H-吲唑-5-基)-3-甲基-吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1H-吲唑-5-基)-4-[[3-(环丙基)苯基]甲基氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1H-吲唑-5-基)-4-[[3，5-双(环丙基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1H-吲唑-5-基)-4-[[4-(环丙基)苯基]甲基氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(3H-苯并咪唑-5-基)-4-[[3-(三氟甲基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(3H-苯并咪唑-5-基)-4-[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基氨基甲酰基]-吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(3H-苯并咪唑-5-基)-4-[[4-(三氟甲基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(3H-苯并咪唑-5-基)-3-甲基-吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(3H-苯并咪唑-5-基)-4-[[3-(环丙基)苯基]甲基氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(3H-苯并咪唑-5-基)-4-[[3，5-双(环丙基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(3H-苯并咪唑-5-基)-4-[[4-(环丙基)苯基]甲基氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-3-甲基-4-[[3-(三氟甲基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-3-甲基-4-[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-3-甲基-4-[[4-(三氟甲基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基]，
(4R)-2-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-3-甲基-吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-3-甲基-4-[[3-(环丙基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-3-甲基-4-[[3，5-双(环丙基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-3-甲基-4-[[4-(环丙基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1H-吲唑-6-基)-3-甲基-4-[[3-(三氟甲基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1H-吲唑-6-基)-3-甲基-4-[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1H-吲唑-6-基)-3-甲基-4-[[4-(三氟甲基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1H-吲唑-6-基)-3-甲基-吡咯烷-1-基
(4R)-2-(1H-吲唑-6-基)-3-甲基-4-[[3-(环丙基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1H-吲唑-6-基)-3-甲基-4-[[3，5-双(环丙基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1H-吲唑-6-基)-3-甲基-4-[[4-(环丙基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1H-苯并咪唑-5-基)-4-[[3-(三氟甲基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1H-苯并咪唑-5-基)-4-[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1H-苯并咪唑-5-基)-4-[[4-(三氟甲基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1H-苯并咪唑-5-基)-3-甲基-吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1H-苯并咪唑-5-基)-4-[[3-(环丙基)苯基]甲基氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
(4R)-2-(1H-苯并咪唑-5-基)-4-[[3，5-双(环丙基)苯基]甲基-氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，和
(4R)-2-(1H-苯并咪唑-5-基)-4-[[4-(环丙基)苯基]甲基氨基甲酰基]吡咯烷-1-基，
其中吡咯烷环的编号如下：
所述第二残基选自氢、甲基、
其中第一残基在第一残基的-基位与第二残基共价结合；
优选为选自以下的化合物：
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4一(环丙烷羰基)-3一羟基-2一苯基-2H-吡咯-5-酮；
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-氟苯基)-2-甲基-吡咯-3-甲酰胺；
(3R)-N-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-氟苯基)硫代吗啉-3-甲酰胺；
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)嘧啶；
(4R)-N3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-N4-[[3-(三氟甲基)苯基]甲基]吡咯烷-3，4-二甲酰胺；
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-2-甲基-5-苯基-吡咯-3-甲酰胺；
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-2-甲基-5-(对甲苯基)吡咯-3-甲酰胺；和
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-氯苯基)-2-甲基-吡咯-3-甲酰胺。
在进一步的方面中，本发明涉及选自以下的化合物：
其中R4选自羟基、-O-R14和-O-C(＝O)-R14，其中R14选自
(aa)直链或支链的取代或未取代的(C1-10)烷基，优选(C1-5)烷基，更优选甲基、乙基和丙基，最优选甲基、(C2-10)烯基和(C2-10)炔基；
(bb)取代或未取代的芳族或非芳族(C3-10)碳环，优选(C3-6)环烷基，更优选(C3)碳环和(C6)碳环，优选(C6)碳环，更优选在对位被(C3)碳环或-(CF3)单取代或在间位被(C3)碳环或-(CF3)二取代的苯基；和
(cc)取代或未取代的芳族或非芳族(C3-6)杂环，优选芳族(C3-6)杂环，其具有1-3个各自独立地选自N、O和S的杂原子；
优选选自以下的化合物：
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-(环丙烷羰基)-3-羟基-2-苯基-2H-吡咯-5-酮；
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-氟苯基)-2-甲基-吡咯-3-甲酰胺；
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)嘧啶；和
(4R)-N3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-N4-[[3-(三氟甲基)苯基]甲基]吡咯烷-3，4-二甲酰胺。
本文所述的化合物通常通过使用由Advanced Chemistry Development，Inc.，Canada提供的软件ACD/Chemsketch 2015和由BIOVIA，USA提供的BIOVIA Draw 2016基于结构图计算的命名法命名。对于本文所述的每个分子，该描述提供了结构式，其为了命名的目的明确地对式I和II的环的残基进行了编号。进一步注意到结构式对化学名称具有约束力，而不是由化学名称估算的；换句话说，如果名称和结构式相互矛盾，则以结构式为准。
对于具有不对称中心的化合物，应理解，除非另有说明，否则涵盖所有光学异构体及其混合物。如果没有不同地指出，则每个立体异构碳可以呈(R)-或(S)-构型或构型的组合。而且，具有两种或更多种不对称元素的化合物可以作为非对映异构体的混合物存在。此外，本发明化合物优选具有至少50％，优选至少60％、70％、80％、85％，更优选至少90％、95％、96％、97％，最优选至少98％、99％或100％的非对映异构体纯度。此外，具有碳-碳双键的化合物可以以Z-和E-形式存在，除非另有说明，否则化合物的所有异构形式都包括在本发明中。当化合物以各种互变异构形式存在时，所列举的化合物不限于任何一种特定的互变异构体，而是旨在包括所有互变异构形式。
例如，如下描述的化合物：
涵盖互变异构形式：
所列举的化合物还旨在包括其中一个或多个原子被同位素(即具有相同原子序数但质量数不同的原子)替代的化合物。作为一般实例，但不限于，氢的同位素包括氚和氘，碳的同位素包括11C、13C和14C。
具有一个或多个立体异构中心的根据本文提供的式的化合物具有至少50％的对映体过量。例如，此类化合物可具有至少60％、70％、80％、85％，优选至少90％、95％或98％的对映体过量。化合物的一些实施方案具有至少99％的对映体过量。显而易见的是，单一对映异构体(光学活性形式)可以通过以下方式获得：不对称合成，从光学纯前体合成，生物合成，例如使用修饰的CYP102(CYP BM-3)，或拆分外消旋体，例如酶促拆分或通过常规方法进行的拆分，如在拆分试剂存在下的结晶，或使用例如手性HPLC柱进行的色谱法。
如本文所用，“取代基”或“残基”或“R”是指与目标分子内的原子共价结合的分子部分。例如，“取代基”、“R”或“残基”可以是部分，例如卤素、烷基、卤代烷基或本文所述的与原子(优选碳或氮原子)共价结合的构成目标分子的一部分的任何其他取代基。如本文所用的术语“取代的”是指指定原子上的任何一个或多个氢被选自指定取代基的取代基替代，条件是不超过指定原子的正常价，并且取代导致稳定化合物，即可以使用常规方法分离和表征的化合物。例如，取代可以是与不是碳的任何其他化学原子结合的氧的形式，例如羟基，或氧阴离子。当取代基是氧代，即＝O时，则原子上的2个氢被替代。作为芳族碳原子的取代基的氧代基团导致-CH-转化为-C(＝O)-并且丧失芳香性。例如，被氧代取代的吡啶基是吡啶酮。
如本文所用的术语“杂原子”应理解为是指除碳和氢以外的原子，例如并且优选O、N、S和P。
如果第一化合物、取代基或残基例如以名称“-3-基”结尾，则该结尾表示第一化合物、取代基或残基在第一化合物的3位原子处与第二化合物、取代基或残基共价结合。当然，这个定义适用于化合物、取代基或残基名称的“-基”末端之前的任何给定整数。例如，如果选择1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)吡咯-3-基作为与第二残基共价结合的第一残基，则形成以下化合物：
在本发明的上下文中，应当理解，在先术语如“直链或支链的”、“取代或未取代的”表示后续术语中的每一个将被解释为被所述在先术语修饰。例如，术语“直链或支链的取代或未取代的烷基、烯基、炔基、碳环”的范围包括直链或支链的取代或未取代的烷基；直链或支链的取代或未取代的烯基；直链或支链的取代或未取代的炔基；直链或支链的取代或未取代的亚烷基；和直链或支链的取代或未取代的碳环。例如，术语“(C2-10)烯基、炔基或亚烷基”表示具有2至10个碳和烯基、炔基或亚烷基官能团的化合物的基团。
表述“烷基”是指饱和的直链或支链烃基，其含有所示碳原子数，例如“(C1-10)烷基”表示含有1至10个碳原子的烃残基，例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、2，2二甲基丁基等。
表述“烯基”是指至少部分不饱和的、取代或未取代的直链或支链烃基，其含有所示的碳原子数，例如“(C2-10)烯基”表示含有2-10个碳原子的烃残基，例如乙烯基(ethenyl或vinyl)、丙烯基(烯丙基)、异丙烯基、丁烯基、异戊二烯基或己-2-烯基，或例如包含被一个双键中断的亚甲基链的烃基，例如，在单不饱和脂肪酸中发现的烃基，或包含亚甲基中断的多烯的烃基，例如，包含两个或多个下列结构单元-[CH＝CH-CH2]-的烃基，例如，在多不饱和脂肪酸中发现的烃基。烯基具有一个或多个，优选1、2、3、4、5或6个双键。
表述“炔基”是指至少部分不饱和的、取代或未取代的直链或支链烃基，其含有所示的碳原子数，例如“(C2-10)炔基”表示含有2至10个碳原子的烃残基，例如乙炔基(ethinyl)、丙炔基、丁炔基、乙炔基(acetylenyl)或炔丙基。优选地，炔基具有一个或两个(尤其优选一个)三键。
此外，术语“烷基”、“烯基”和“炔基”是指其中一个或多个氢原子已被例如卤素原子，优选F或Cl替代的基团，例如2，2，2-三氯乙基或三氟甲基。
术语“碳环”应理解为意指取代或未取代的脂族烃环，其含有所示的碳原子数，例如“(C3-10)碳环”，或3至20，优选3至12个碳原子，更优选5或6个碳原子。这些碳环可以是芳族或非芳族系统。非芳族环系统可以是单不饱和或多不饱和的。
术语“碳二环”是指如上定义的碳环，其包含多于1个环，优选两个环。优选的碳环和碳二环包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环庚烯基、苯基、茚满基、茚基、苯并环丁基、二氢萘基、四氢萘基、萘基、十氢萘基、苯并环庚基、苯并环庚烯基、螺[4，5]癸基、降冰片基、十氢萘基、双环[4.3.0]壬基、四氢化萘或环戊基环己基。碳-和/或碳二环残基可以通过环的任何原子与完整分子的剩余结构结合，从而产生稳定的结构。
术语“碳环”还应包括“环烷基”，其应理解为是指优选具有3-12个碳原子的含脂族烃的环。这些非芳族环系统可以是单不饱和或多不饱和的，即该术语包括环烯基和环炔基。
术语“杂环”是指稳定的取代或未取代的、芳族或非芳族、优选3至20元、更优选3-12元、最优选5或6元、单环的、含杂原子的环。每个杂环由碳原子和一个或多个，优选1至4个，更优选1至3个杂原子组成，所述杂原子优选选自氮、氧和硫。除了所示的非碳原子外，杂环还可含有碳原子数：“(C3-6)杂环”是指除给定数目的杂原子外还具有3至6个碳原子。
术语“杂二环”是指如上定义的杂环，其包含多于1个环，优选两个环。
杂-和/或杂二环残基可以通过环的任何原子与完整分子的剩余结构结合，从而产生稳定的结构。示例性杂环和杂二环包括但不限于吡咯烷基、吡咯啉基、吗啉基、硫代吗啉基、硫代吗啉基亚砜、硫代吗啉基砜、二氧杂环戊烷基、哌啶基、哌嗪基、四氢呋喃基、1-氧代-λ4-硫代吗啉基、13-氧杂-11-氮杂-三环[7.3.1.0-2，7]三癸-2，4，6-三烯、四氢吡喃基、2-氧代-2H-吡喃基、四氢呋喃基、1，3-二氧杂环戊酮、1，3-二氧杂环己酮、1，4-二氧杂环己烷基、8-氧杂-3-氮杂-双环[3.2.1]-辛基、2-氧杂-5-氮杂-双环[2.2.1]庚基、2-硫杂-5-氮杂-双环[2.2.1]庚基、哌啶酮基、四氢-嘧啶酮基、五亚甲基硫化物、五亚甲基亚砜、五亚甲基砜、四亚甲基硫化物、四亚甲基亚砜和四亚甲基砜、吲唑基、苯并咪唑基、苯并二氧杂环戊烯基、咪唑基、1，3-苯并二氧杂环戊烯基和吡唑基。
表述“烷基/烯基/炔基醚”是指饱和或非饱和的直链或支链烃基，其含有所示碳原子数。例如，“(C1-10)烷基醚”表示含有1至10个碳原子以及任何合适数量的氧原子的烃残基，其将产生醚结构。如本文所用的烷基/烯基/炔基醚基团应理解是指包含氧原子作为醚基元(即通过两个碳结合的氧)的任何直链或支链的取代或未取代的烷基/烯基/炔基链。醚残基可以通过碳原子或通过醚残基的氧原子与本发明提供的式连接。
如本文所用的“取代基”或“残基”或“R”，优选R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10和/或R11可以直接或通过连接基连接到本发明提供的式上。所述连接基也可以是聚乙二醇的形式。如本文所用的术语聚乙二醇是指取代或未取代的环氧乙烷单体链。
如本文所用，术语“氮”或“N”和“硫”或“S”包括氮和硫的任何氧化形式以及任何碱性氮的季铵化形式，只要所得化合物是化学稳定的。例如，对于-S-C1-6烷基，应理解为包括-S(O)-C1-6烷基和-S(O)2-C1-6烷基。
通过给定位置与第二目标化合物连接的残基应理解为在指定的原子位置处与第二化合物共价结合的残基。例如，通过吲唑基的(5)位连接的吲唑基表示下列残基：在这种情况下，编号开始-如本领域的惯例-于1H-氮上。然而，应注意，一些命名法可为编号提供不同的起始点。例如，如本领域技术人员所理解的，1H-苯并咪唑-6-基残基与3H-苯并咪唑-5-基残基相同。
如本文所用，定义了长度范围界限的词语，例如，“从1至5”或“(C1-5)”表示从1至5的任何整数，即1、2、3、4和5。换句话说，由明确提及的两个整数定义的任何范围旨在包括和公开定义所述界限的任何整数和包括在所述范围内的任何整数。
举例来说，如本文所用，术语“在间位单或二取代或在对位单取代”是指化合物在所述化合物与另一化合物或残基连接的位置的对位被至少一个给定取代基取代，或在其两个间位被至少一个取代基取代。例如，术语“在间位被(C3)碳环或-(CF3)二取代”表示化合物在每个间位被一个(C3)碳环或-(CF3)取代，或在一个间位被(C3)碳环取代且在另一个间位被-(CF3)取代。优选地，该术语表示化合物在每个间位被一个(C3)碳环取代或在每个间位被一个-(CF3)取代，即在两个间位被相同的取代基取代。如上文对于对位所示，间位表示所述化合物与另一种化合物或残基连接的位置的间位。
例如，术语“苯基，优选在对或间位被环丙基或-(CF3)单取代，或者在间位被环丙基或-(CF3)在每个间位二取代”优选表示以下结构：
用于本发明的残基R1、R5和/或R9优选为在对位被由Cl、F、Br、取代或未取代的甲基，优选-(CF3)、乙基、丙基和环丙基组成的组单取代的苯基。用于本发明的残基R12和R13优选为(C6)碳环，更优选在对位被(C3)碳环优选环丙基或-(CF3)单取代的苯基，或在间位被(C3)碳环优选环丙基或(-CF3)二取代的苯基。进一步优选地，R1、R5、R9、R12和/或R13是在邻位、间位和/或对位被由Cl、F、Br、取代或未取代的甲基优选-(CF3)、乙基、丙基和环丙基组成的组单、二或三取代的苯基。代表R1、R5、R9、R12和/或R13的二取代或三取代的苯基可以是二取代或三取代的苯基，其在相应的邻位、间位和对位被相同的取代基取代或在相应的邻位、间位和/或对位被不同的取代基取代，其中所述取代基选自Cl、F、Br、取代或未取代的甲基优选-(CF3)、乙基、丙基和环丙基。本文明确公开了在代表R1、R5、R9、R12和/或R13的苯基的邻位、间位和/或对位的选自Cl、F、Br、取代或未取代的甲基优选-(CF3)、乙基、丙基和环丙基的取代基的每个组合和数量。
本发明的范围包括如上所述和权利要求中的化合物的那些类似物，例如出于代谢稳定性的原因，其特征在于将一个或多个碳键合的氢，优选一个或多个芳族碳键合的氢与卤素原子如F、Cl或Br，优选F交换。例如，化合物-1的特征可以在于用一个或多个卤素原子优选F代替苯环中的芳族碳键合的氢或代替1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基-部分中的芳族或非芳族碳键合的氢。此外，例如，化合物-4的特征可以在于用一个或多个卤素原子优选F代替嘧啶环中的芳族碳键合的氢或代替苯并二氧杂环戊烯部分中的芳族或非芳族碳键合的氢。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及用于上述用途的化合物或上述化合物本身，其中该化合物抑制丝氨酸/精氨酸丰富的剪接因子1(SRSF1、ASF-1、SF2)或光传感因子的磷酸化，优选通过G蛋白偶联受体激酶2(GRK2，ADRBK1)。
在另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含作为活性物质的用于上述用途的化合物或上述化合物本身或其药学上可接受的衍生物，任选与赋形剂和/或载体组合。
本发明包括本发明的式(I)和(II)的化合物的药学上可接受的盐或溶剂化物。“药学上可接受的盐或溶剂化物”是指任何药学上可接受的盐、溶剂化物或酯或任何其他化合物，其在向患者施用时能够(直接或间接)提供本发明的化合物或其药理活性代谢物或药理活性残留物。药理活性代谢物应理解为意指能够被酶促或化学代谢的任何本发明化合物。这包括，例如，本发明的羟基化或氧化的衍生化合物。
药学上可接受的盐包括衍生自药学上可接受的无机和有机酸和碱的盐。合适的酸的实例包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯硫酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-硫酸和苯磺酸。其它酸，例如草酸，虽然本身不是药学上可接受的，但可用于制备盐，该盐可用作获得化合物及其药学上可接受的酸加成盐时的中间体。衍生自适当碱的盐包括碱金属(例如钠)、碱土金属(例如镁)、铵和N-(C1-C4烷基)4 +盐。
此外，本发明的范围还包括本发明化合物的前药。前药包括那些在简单的化学转化后被修饰以产生本发明化合物的化合物。简单的化学转化包括水解、氧化和还原。具体地，当向患者施用前药时，可以将前药转化为上文公开的化合物，从而赋予所需的药理学效果。
在一个优选的实施方案中，用于根据本发明用途的化合物用于选自以下的心脏保护性治疗
(i)在原发性高血压和/或慢性高血压的病况下降低心血管死亡率和/或发病率的风险；
(ii)降低心血管疾病引起的衰老的风险；
(iii)在近期心肌梗塞后左心室功能紊乱和心力衰竭体征的病况下降低心血管死亡率和/或发病率的风险
(iv)在慢性心力衰竭和左心室功能紊乱的病况下降低心血管死亡率和/或发病率的风险；
(v)在扩张型心肌病的病况下降低心血管死亡率和/或发病率的风险；
(vi)在左心室功能紊乱的病况下降低心血管死亡率和/或发病率的风险；
(vii)在心肌细胞坏死的病况下降低心血管死亡率和/或发病率的风险；
(viii)在心肌纤维化的病况下降低心血管死亡率和/或发病率的风险；
(ix)预防、优选一级预防心肌细胞坏死和/或扩张型心肌病，优选在缺血性心脏病和缺血性心脏损伤风险增加的病况下，所述风险增加优选由于选自高血压、动脉粥样硬化、慢性和急性应激、抑郁、糖尿病、慢性心力衰竭、心绞痛、心房颤动、慢性肾功能衰竭和衰老的心血管危险因素；
(x)预防、优选二级预防具有选自急性心血管疾病、心肌梗塞、缺血性心脏病、心绞痛、心房颤动、失代偿性和慢性心力衰竭以及脑血管性卒中的先前事件的患者的心肌细胞坏死和/或扩张型心肌病；和
(xi)治疗心血管疾病的急性疾病状态，所述心血管疾病优选选自心肌梗塞、心绞痛、缺血性心脏病、脑血管疾病和失代偿性心力衰竭；
其中如上所述的化合物或药物组合物用于治疗动物或人，优选哺乳动物，更优选人。
而且，本发明的化合物抑制人肾细胞中的细胞损伤性SRSF1磷酸化，导致例如对人肾细胞的促生存活性。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的化合物可用于治疗患有各种形式的肾脏疾病和肾病的患者，例如由高血压、肾动脉狭窄、心力衰竭、缺血、糖尿病和/或毒剂引起的肾病。
对于治疗用途，本发明化合物可以任何常规方式以任何常规剂型施用。施用途径包括口服、静脉内、肌肉内和皮下注射。优选的施用方式是口服、静脉内或皮下施用。
所述化合物可以单独施用或与佐剂(包括其他活性成分)组合施用，所述佐剂增强化合物稳定性，在某些实施方案中促进含有它们的药物组合物的施用，提供增加的溶出或分散，增加活性，提供辅助治疗(例如β-肾上腺素能受体拮抗剂、ACE抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂、盐皮质激素受体拮抗剂、伊伐布雷定、钙通道拮抗剂和/或利尿剂)等。有利地，这种组合疗法使用较低剂量的常规治疗剂，从而避免当那些药剂用作单一疗法时可能产生的毒性和不良副作用。上述化合物可以与常规治疗剂或其他佐剂物理结合成单一药物组合物。关于这方面可以参考Cappola等人的美国专利申请号09/902,822、PCT/US 01/21860和美国临时申请号60/313,527，各自通过引用整体并入本文。有利地，然后可以以单一剂型一起施用化合物。在一些实施方案中，包含此类化合物组合的药物组合物含有至少约5％，但更优选至少约20％的本发明化合物(w/w)。本发明化合物的最佳百分比(w/w)可以变化，并且在本领域技术人员的能力范围内。或者，化合物可以分开(连续或并行)施用。分开给药使得给药方案具有更大的灵活性。
如上所述，本文所述化合物的剂型包括药学上可接受的载体和本领域普通技术人员已知的佐剂。制备此类剂型的方法是已知的(参见，例如，H.C.Ansel和N.G.Popovish，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，5th ed.，Lea and Febiger(1990))。剂量水平和要求在本领域中是公认的，并且可由本领域普通技术人员从适合于特定患者的可用方法和技术中选择。在一些实施方案中，对于70kg患者，剂量水平范围为1-300mg/剂。虽然每天一剂可能是足够的，但每天可给予最多5剂。对于口服剂量，可能需要高达2000mg/天。关于这方面也可以参考美国临时申请号60/339,249。如技术人员将理解的，取决于特定因素，可能需要更低或更高的剂量。例如，具体剂量和治疗方案将取决于诸如患者的一般健康状况、患者病症的严重程度和病程或其处置以及治疗医师的判断等因素。
另一方面，本发明涉及一种用于患者、优选哺乳动物患者、更优选人类患者的细胞保护性、优选心脏或肾脏保护性治疗的方法，该方法包括向需要这种治疗的患者施用治疗有效量的根据本发明的化合物或有效量的根据本发明的药物组合物的步骤。
另一方面，本发明涉及鉴定G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)抑制剂的方法，优选通过测定GRK2介导的丝氨酸/精氨酸丰富的剪接因子1(SRSF1)和/或光传感因子的磷酸化来鉴定，该方法包括以下步骤
(i)在存在和不存在目标化合物的情况下，在适于SRSF1或光传感因子的磷酸化的生理条件下提供和孵育GRK2和SRSF1或光传感因子；
(ii)在存在和不存在目标化合物的情况下测定SRSF1或光传感因子的磷酸化；
(iii)相对于在不存在目标化合物的情况下SRSF1或光传感因子的磷酸化，基于在存在目标化合物的情况下的SRSF1或光传感因子的磷酸化，将目标化合物鉴定为抑制剂或非抑制剂。
在优选实施方案中，如上所述的用于鉴定的方法是这样的方法，其中
(a)在步骤(i)中，在放射性标记的ATP、优选[γ-32P]ATP的存在下，优选在约25至40℃下进行孵育约30至90分钟；和/或
(b)通过在低于30℃的温度下、优选在约0至10℃的温度下稀释来停止步骤(i)的孵育；和/或
(c)通过(A)将(i)的产物通过过滤器、优选玻璃纤维过滤器过滤；(B)洗涤过滤器；和(C)优选用β-计数器测定过滤器结合的放射性来进行步骤(ii)中SRSF1或光传感因子的磷酸化的测定。
用于鉴定(GRK2)介导的(SRSF1)和(光传感因子)的磷酸化的抑制剂的方法的非限制性和代表性实例提供于下文实施例13和实施例5中。例如，为了鉴定(GRK2)介导的(SRSF1)和(光传感因子)的磷酸化的小分子抑制剂，可以在补充有ATP、优选约5μM的[γ-32P]-ATP(例如，1x10 6DPM，约3000Ci/mmol的比活度))和约300-500nM的SRSF1(或光传感因子)的反应缓冲液(例如，20mM Tris、2mM EDTA、5mM MgCl2、0.05％BSA，pH 7.5或20mMHepes、2mM MgCl2、0.025％DDM(＝正十二烷基-β-D-麦芽糖苷)，pH 7.4)中进行磷酸化测定。将反应混合物加入到GRK2或GRK2-S670A(例如约60nM，在不含或含有增加浓度的小分子化合物的反应缓冲液中)中以得到例如约50μL的最终反应体积。在约30℃下孵育例如约30-60分钟后，可通过加入冰冷的反应缓冲液、优选约5体积反应缓冲液来终止磷酸化。立即将反应混合物施加到过滤器、优选玻璃纤维过滤器上。在例如使用约5ml反应缓冲液的三次洗涤步骤之后，可以在β-计数器中测定过滤器结合的放射性。
而且，本发明化合物可用作GRK2活性改变的标志物。
附图简述
以下附图和实施例用于说明本发明，而不意图限制所附权利要求中描述的本发明的范围。
在附图和实施例中，以下名称归属于本发明的各个化合物和对照化合物：
化合物-1：1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-(环丙烷-羰基)-3-羟基-2-苯基-2H-吡咯-5-酮；
化合物-2：1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-氟苯基)-2-甲基-吡咯-3-甲酰胺；
化合物-3：(3R)-N-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-氟苯基)硫代吗啉-3-甲酰胺；
化合物-4：4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)嘧啶；
化合物-5：(4R)-N3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-N4-[[3-(三氟甲基)苯基]-甲基]吡咯烷-3，4-二甲酰胺；
化合物-22：1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-2-甲基-5-苯基-吡咯-3-甲酰胺；
化合物-23：1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-2-甲基-5-(对甲苯基)吡咯-3-甲酰胺；
化合物-24：1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-氯苯基)-2-甲基-吡咯-3-甲酰胺；
化合物-6：布洛芬((±)-2-(4-异丁基苯基)丙酸)(参照化合物，Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)；
图1A-E：将SRSF1鉴定为新的非受体GRK2底物
A，左图：通过免疫亲和色谱法富集来自心力衰竭患者的心脏活组织检查样本的GRK2，以及在免疫印迹中检测富集的GRK2和共富集的SRSF1。右图：Nano-LC-ESI-MS/MS分析将SRSF1(丝氨酸/精氨酸丰富的剪接因子1，ASF/SF2，SEQ ID NO：7)鉴定为来自心力衰竭患者的心脏活组织检查样本的先前未识别的GRK2相互作用蛋白。B，GRK2在体外激酶测定中磷酸化SRSF1。Nano-LC-ESI-MS/MS分析鉴定含磷酸肽，其中丝氨酸199/201为GRK2磷酸化位点(SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9)。C，帕罗西汀抑制GRK2介导的SRSF1磷酸化，半数最大抑制浓度(IC50值)为2.38μM(n＝4)。D，另一种心脏保护性GRK2抑制剂GRKInh抑制GRK2介导的SRSF1磷酸化。E，用磷酸特异性SR抗体1H4(p-SRSF1)对GRK2激活的SRSF1磷酸化进行免疫印迹检测。
图2A-J：GRK2在体内诱导激活Srsf1磷酸化
A，B，在α-MHC启动子控制下产生具有GRK2的心肌特异性表达的Tg-GRK2小鼠(A)和相对于非转基因B6对照，免疫印迹检测来自Tg-GRK2小鼠的心脏裂解物中增加的GRK2蛋白(B；n＝4颗心脏/组)。C，Tg-GRK2小鼠具有如通过超声心动图测定的降低的左心室射血分数(±s.d.，n＝6)。D，E，相对于非转基因对照，来自Tg-GRK2小鼠的心脏裂解物中增加的p-Srsf1(右)和Camk2d同种型B和C含量的免疫印迹检测(n＝4/组)。F，通过von Kossa染色测定Tg-GRK2心脏中的心肌坏死(n＝6；±S.d.)，条形：100μm。G，H，用对照慢病毒或通过miRNA(+miSrsf1)靶向Srsf1的慢病毒转导的Tg-GRK2心脏中的pSrsf1(G)和Camk2d同种型B/C(H)的免疫印迹检测。I，miSrsf1对Srsf1的下调延缓了Tg-GRK2小鼠中心脏功能紊乱的发展(n＝4，±s.d.)。J，用von Kossa染色测定心肌坏死(n＝6；±s.d.)。
图3A-F：SRSF1的转基因过表达诱导增强的Camk2d剪接和心力衰竭体征
A，在心肌特异性α-MHC启动子的控制下产生具有心肌特异性SRSF1表达的转基因小鼠。B，在免疫印迹中检测到Tg-SRSF1小鼠的心脏SRSF1/Srsf1蛋白增加(n＝4颗心脏/组)。C，在Tg-SRSF1小鼠中Camk2d蛋白同种型B和C的心脏剪接增强(n＝4颗心脏/组)。D，用von Kossa染色测定Tg-SRSF1心脏中的心肌坏死(n＝5，±s.d.)。E，Tg-SRSF1心脏的组织学评估显示相对于非转基因B6对照具有扩张的心脏肥大。心脏切片用苏木精-伊红(HE)染色并且代表4只小鼠/组。F，通过超声心动图测定Tg-SRSF1小鼠相对于非转基因B6对照的心脏功能紊乱(n＝5；±s.d.)。
图4A-D：体内GRK2的抑制延迟心脏功能紊乱的慢性压力超负荷模型中的激活Srsf1磷酸化以及心力衰竭体征
A，具有显性阴性GRK2-K220R的心肌特异性表达的转基因小鼠的产生和Tg-GRK2-K220R心脏中的GRK2-K220R的免疫印迹检测(n＝3(B6对照)和n＝5(Tg-GRK2-K220R心脏))。B，通过腹主动脉缩窄(AAC)给予慢性压力超负荷8周的4月龄B6对照(B6)、Tg-GRK2-K220R和Tg-GRKInh小鼠心脏中心脏pSrsf1和Camk2d同种型B/C的免疫印迹检测；n＝4只小鼠/组。C，通过von Kossa染色确定心肌坏死(n＝6/组；±s.d.)。D，通过用GRK2-K220R或GRKInh导致的GRK2抑制延迟8周AAC的B6小鼠的心脏功能紊乱(n＝6/组；±s.d.)。
图5A-G：GRK2抑制剂RKIP不抑制激活Srsf1磷酸化并在体内诱导心力衰竭体征
A，人RKIP在体外不抑制GRK2对SRSF1的磷酸化。相反，人RKIP通过GRK2抑制光传感因子的磷酸化(IC50＝950nM，n＝6-7)。B，C，具有人RKIP的心肌特异性表达的Tg-RKIP2和Tg-RKIP3品系中的心脏RKIP的免疫印迹检测(B；n＝3只小鼠/组)，以及Tg-RKIP2和Tg-RKIP3品系的左心室射血分数降低(n＝5/组；±s.d.)。D，相对于B6和Tg-GRK2-K220R心脏(左)的8月龄Tg-RKIP2心脏的组织学评估和心脏重量/体重测定(n＝6，±s.d)。组织切片代表4颗心脏/组。E，F，用天狼猩红染色(E)测定心脏纤维化，并通过Tg-RKIP2心脏、B6和Tg-GRK2-K220R心脏中的von Kossa染色(F)测定坏死。G，来自不同组小鼠的心脏裂解物中的心脏Srsf1(总Srsf1)和激活的磷酸化p-Srsf1的免疫印迹检测(n＝3/组)。
图6A-G：FVB背景中的Tg-RKIP小鼠品系也出现心力衰竭体征
A，在FVB背景中产生的Tg-RKIP小鼠品系中的人/小鼠RKIP的免疫印迹检测(n＝8/组，±s.d.)。B，相对于非转基因FVB对照，Tg-RKIP1心脏中RKIP蛋白的免疫组织学检测。免疫组织学代表4颗心脏/组。C，D，相对于非转基因FVB对照，Tg-RKIP1和Tg-RKIP2小鼠的左心室射血分数(C；n＝5)和心脏重量/体重比(n＝6；±s.d.)。E，相对于非转基因FVB对照的Tg-RKIP心脏的组织学分析。组织切片代表四只小鼠/组。F，G，相对于非转基因FVB对照的Tg-RKIP1和TgRKIP2小鼠的左心室射血分数，以及通过miRKIP的慢病毒转导的RNAi介导的人RKIP下调(F；n＝5；±s.d.)。通过实时qRT-PCR证实人RKIP的下调(G；n＝5；±s.d.)。
图7A-F：转基因RKIP表达诱导GRK2抑制相关的基因表达特征
A，Tg-RKIP和B6对照心脏中RKIP的丝氨酸-153磷酸化(pS153)的免疫印迹检测(n＝5只小鼠/组)。B，通过亲和纯化(AP)用固定的RKIP特异性抗体除去RKIP从Tg-RKIP心脏裂解物中耗尽GRK2蛋白。用无关抗体进行的对照亲和纯化既不耗尽RKIP也不耗尽GRK2。上图显示代表性实验，下图显示定量数据评估(±s.d.，n＝4；*，p＝0.0286；Mann Whitney检验)。C，来自Tg-RKIP和Tg-GRK2-K220R小鼠的新生心肌细胞中异丙肾上腺素刺激的cAMP反应(n＝6；±s.d.)。D，相对于B6对照，显著增加cAMP诱导型基因Ttc14在Tg-RKIP和Tg-GRK2-K220R心脏中的表达(n＝3；±s.d.)。E，F，全基因组基因表达谱显示Tg-RKIP和Tg-GRK2-K220R心脏之间45％显著改变的探针组的一致调节。图F显示Tg-RKIP和Tg-GRK2-K220R心脏中的一致调节的探针组(两个基因芯片/组；**，p＜0.01和***，p＜0.001，相对于B6对照的t-检验)。
图8A-F：心脏保护性GRK2抑制剂帕罗西汀延缓Tg-RKIP小鼠的心力衰竭表型
A-C，帕罗西汀(5mg/kg体重，于饮用水中，每天)处理8周降低了5月龄Tg-RKIP心脏中的Srsf1和激活的Srsf1磷酸化的心脏含量(A)以及Camk2d同种型B/C的剪接(B)，如通过免疫印迹(B，n＝5颗心脏/组)和实时qRT-PCR(C，n＝6；±s.d)测定。D，通过von Kossa染色在心脏切片上测定伴有钙超负荷的心肌坏死(n＝6颗心脏/组；±s.d.)。E，通过超声心动图测定左心室射血分数(n＝6只小鼠/组；±s.d.)。F，通过用磷酸丝氨酸-273-Pparg-特异性抗体的免疫印迹测定心力衰竭促进转录因子Pparg在丝氨酸273上的失活磷酸化(pS273-Pparg)(IB：pS273-Pparg；左图)。帕罗西汀治疗增强了Tg-RKIP小鼠心脏中Pparg的失活(左图)，而帕罗西汀治疗没有改变心脏Pparg总含量(右图)(n＝4只小鼠/组)。
图9：抑制GRK2介导的SRSF1磷酸化的小分子化合物的开发。
在递增浓度的帕罗西汀或不同的小分子化合物存在下，用纯化的蛋白测定GRK2介导的SRSF1的磷酸化。SRSF1磷酸化以对照的％表示，所述对照是在不存在抑制剂的情况下的SRSF1磷酸化。1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-(环丙烷-羰基)-3-羟基-2-苯基-2H-吡咯-5-酮(“化合物-1”)的IC50值(0.45μM)不到帕罗西汀IC50值的1/5(±s.d.，n＝4)。
图10A-B：小分子化合物抑制完整Tg-SRSF1心肌细胞和人HEK细胞中GRK2介导的SRSF1磷酸化。
A，通过用10μM帕罗西汀、1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-(环丙烷-羰基)-3-羟基-2-苯基-2H-吡咯-5-酮(“化合物-1”)或4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)嘧啶(“化合物-4”)孵育60小时后的Tg-SRSF1小鼠的分离的新生心肌细胞的裂解物中的免疫印迹测定GRK2介导的SRSF]/Srsf1磷酸化，与媒介物处理的对照(“C”)心肌细胞相比。B，用来自HEK(人胚胎肾)细胞的裂解物进行GRK2介导的SRSF1磷酸化(pSRSF1)的免疫印迹检测，所述细胞用10μM的4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)嘧啶(″化合物-4″)、1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-氯苯基)-2-甲基-吡咯-3-甲酰胺(″化合物-24″)或(4R)-N3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-N4-[[3-(三氟甲基)苯基]-甲基]吡咯烷-3，4-二甲酰胺(″化合物-5″)孵育60小时，与媒介物处理的对照(“C”)相比。
图11A-B：小分子化合物在体内的心脏保护作用。
A，通过用10mg/kg的1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-(环丙烷-羰基)-3-羟基-2-苯基-2H-吡咯-5-酮(″化合物-1”)、4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)嘧啶(″化合物-4″)、1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-氟苯基)-2-甲基-吡咯-3-甲酰胺(″化合物-2″)或(4R)-N3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-N4-[[3-(三氟甲基)苯基]-甲基]吡咯烷-3，4-二甲酰胺(″化合物-5″)(i.p.)处理5小时后的非转基因B6小鼠心脏制备的心脏裂解物中的免疫印迹测定GRK2介导的Srsf1磷酸化，与媒介物处理的B6对照(“con”)相比。右图显示定量免疫印迹评估。B，左图：在进行AAC的用5mg/kg/d的1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-(环丙烷-羰基)-3-羟基一2-苯基-2H-吡咯-5-酮(″化合物-1″)或(4R)-N3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-N4-[[3-(三氟甲基)苯基]-甲基]吡咯烷-3，4-二甲酰胺(″化合物-5″)处理7天后的B6小鼠的心脏裂解物中测定AAC诱导的心脏p-Srsf1含量，与媒介物处理的进行AAC的B6对照(“AAC-con”)相比。中图显示定量免疫印迹评估。右图和下图：通过进行AAC的用“化合物-1”或“化合物-5”处理7天后的B6小鼠的超声心动图测定心脏功能参数，与媒介物处理的进行AAC的B6对照相比((±s.d.；n＝5(A)和n＝3(B)；与con(A)或AAC-con(B)的Dunnett多重比较检验)。
图12A-D：化合物-1和化合物-4的口服处理消解了由心血管疾病引起的心力衰竭和衰老。
A，在6月龄的雄性B6小鼠中测定左心室射血分数，该小鼠具有3个月AAC施加的慢性压力超负荷并且用化合物-1(AAC+化合物-1)和化合物-4(AAC+化合物-4)进行口服处理，与未处理的AAC对照相比。在AAC诱导后一个月开始处理，并持续2个月。只有心力衰竭的小鼠(AAC一个月后射血分数＜34％)被纳入研究(±s.d.，n＝5/组，***p＝0.0006，**p＝0.0051，与未处理AAC相比，Dunnett多重比较检验)。B，对有3个月AAC且无(对照，上图)或有2个月的化合物-1处理(下图)的心脏进行的组织学评估显示化合物-1延缓慢性压力超负荷引起的心脏肥大(n＝4颗心脏/组)。C，D，用化合物-1处理也延缓了心血管疾病引起的衰老，例如由慢性压力超负荷引起的衰老，即在用化合物-1处理2个月后明显延迟毛发出现灰色(左(D)和右(D)图，n＝5只不同的小鼠)。
图13A-J：鉴定根据本发明的测试化合物分子和示例性化学合成途径
A-H，通过电喷雾质谱和HPLC分析来分析化合物-1至化合物-5和化合物-22至化合物-24。I，J，化合物-1和化合物-4的示例性化学合成途径。
实施例
实施例1：将SRSF1鉴定为新的非受体GRK2底物
鉴于GRK2的病理生理学重要性及其尚未知晓的靶标，已寻找新的GRK2相互作用蛋白。GRK2特异性抗体与亲和基质共价偶联。应用来自心力衰竭患者的活组织检查样本的蛋白裂解物，洗脱结合的蛋白，并通过SDS-PAGE分离富集的GRK2和共富集的蛋白。切出染色的蛋白条带，并且Nano-LC-ESI-MS/MS分析将SRSF1(丝氨酸/精氨酸丰富的剪接因子1，ASF/SF2)鉴定为先前未识别的GRK2相互作用蛋白(图1A，右图)。作为对照，免疫印迹检测证实了GRK2的蛋白富集和SRSF1的共富集(图1A，左图)。发现SRSF1是GRK2的激酶底物。在体外激酶测定中，GRK2磷酸化重组SRSF1蛋白(图1B)。Nano-LC-ESI-MS/MS分析鉴定了含磷酸肽，其中丝氨酸199/201为GRK2磷酸化位点(图1B)。GRK2对SRSF1在丝氨酸199/201上的磷酸化具有相关性，因为这些残基和这些残基的磷酸化基本上与SRSF1的剪接功能有关(Zuo P和Manley JL，EMBO J 12，4727-4737(1993)；Xiao SH和Manley JL，Genes Dev 11，334-344(1997))。作为体外磷酸化测定的GRK2特异性的对照，应用心脏保护性ATP位点定向的GRK2抑制剂帕罗西汀(Thal DM等人，ACS Chem Biol 7，1830-1839(2012)；Schumacher SM等人，Sci.Transl.Med.7，277ra31(2015))。帕罗西汀抑制GRK2介导的SRSF1磷酸化，半数最大抑制浓度(IC50值)为2.38μM(图1C)。该值与帕罗西汀介导的对其他GRK2底物的抑制相当(ThalDM等人，ACS Chem Biol 7，1830-1839(2012)；Schumacher SM等人，Sci.Transl.Med.7，277ra31(2015))。此外，另一种心脏保护性GRK2抑制剂GRKInh(6，7)也抑制了GRK2对SRSF1的体外磷酸化(图1D)。GRK2激活SRSF1的磷酸化也在磷酸化特异性SR抗体1H4的免疫印迹中得到证实(图1E)，其检测SRSF1的羧基末端结构域中的磷酸化RS重复(Neugebauer KM等人，Genes Dev.11，1148-1159(1997))。
实施例2：GRK2在体内诱导激活Srsf1磷酸化
研究了GRK2是否在体内磷酸化Srsf1并且在心肌特异性α-MHC启动子控制下用心肌特异性人GRK2(ADRBK1)表达产生Tg-GRK2小鼠(图2A)。Tg-GRK2小鼠的心脏具有增加的GRK2蛋白水平(是非转基因B6对照的2倍，图2B)。与增加的心脏GRK2蛋白水平的病理生理学作用(Hullmann J等人，Pharmacol.Res.110，52-64(2016))一致，Tg-GRK2小鼠随着年龄的增加而发生心脏功能紊乱，如8月龄Tg-GRK2小鼠的心脏射血分数显著降低所证明的(图2C)。测定活化的磷酸-Srsf1的心脏含量以分析转基因Tg-GRK2小鼠中增加的GRK2蛋白水平是否导致Srsf1磷酸化和活化增加。免疫印迹检测显示Tg-GRK2心脏具有增加的激活Srsf1磷酸化水平(图2D)。激活的Srsf1的剪接因子活性是Camk2d(钙/钙调素依赖性激酶II同种型δ)同种型B和C剪接所必需的(Xu X等人，Cell 120，59-72(2005))。与增强的Srsf1活化一致，Tg-GRK2心脏具有增加的心脏特异性Camk2d同种型B和C，如在免疫印迹中检测到的(图2E)。Camk2d同种型B和C的增加足以促进心脏功能紊乱和心力衰竭(Zhang T等人，Circ.Res.92，912-919(2003)；Zhang T等人，J.Biol.Chem.277，1261-1267(2002))。
此外，Camk2d促进心脏坏死(Zhang T等人，Nat.Med.22，175-182(2016))。如用vonKossa染色所测定的，Tg-GRK2心脏显示出具有钙超负荷的坏死区域的增加(图2F)。GRK2介导的Srsf1激活与Tg-GRK2心脏的心脏表型之间的因果关系也通过靶向Srsf1的miRNA的慢病毒转导通过RNAi下调Srsf1来证明(图2G)。Srsf1的下调延缓了Camk2d同种型B和C的诱导、Tg-GRK2心脏中伴有钙超负荷的心力衰竭和心脏坏死体征的发展(图2H-J)。
实施例3：SRSF1的转基因过表达诱导增强的Camk2d剪接和心力衰竭体征
在心肌特异性α-MHC启动子的控制下产生由于心肌特异性SRSF1表达而具有增加的心脏SRSF1蛋白的Tg-SRSF1小鼠(图3A)。Tg-SRSF1小鼠具有增加的心脏SRSF1蛋白(图3B)并且显示Camk2d同种型B和C的增强剪接(图3C)。同时，Tg-SRSF1小鼠发生伴有钙超负荷的心肌坏死，伴有扩张的心脏肥大(指示心肌细胞损失)和心脏功能紊乱(图3D-F)。
实施例4：体内GRK2的抑制延迟心脏功能紊乱的慢性压力超负荷模型中激活Srsf1磷酸化以及心力衰竭体征
Srsf1和GRK2在压力超负荷诱导的心脏功能紊乱的实验模型中上调(Hullmann J等人，Pharmacol.Res.110，52-64(2016)；Kim T等人，Mol Cells 37，81-87(2014))。利用显性阴性的GRK2-K220R突变体的转基因表达通过GRK2抑制延迟压力超负荷引发的激活Srsf1磷酸化的诱导(图4B)。产生具有GRK2-K220R的心肌特异性表达的转基因Tg-GRK2-K220R小鼠(图4A)。心脏保护性GRK2抑制剂GRKInh(Abd Alla，J等人，J.Biol.Chem.291，2583-2600(2016)；Fu X等人，J.Biol.Chem.288，7738-7755(2013))(其在体外抑制SRSF1磷酸化(参见图1))也延缓压力超负荷诱导的GRK2激活Srsf1磷酸化。同时，GRK2抑制的两种不同模式延缓了Camk2d同种型B/C剪接、伴有钙超负荷的心肌坏死和心力衰竭体征(图4C，D)。因此，心脏保护性GRK2抑制减弱了压力超负荷诱导的Srsf1激活、心肌细胞死亡和心力衰竭体征。
实施例5：GRK2抑制剂RKIP不抑制激活Srsf1磷酸化并诱导体内心力衰竭体征
分析了另一种GRK2抑制剂，即raf激酶抑制剂蛋白RKIP(Lorenz K等人，Nature426，574-579(2003))的作用，其是双特异性GRK2和Raf激酶抑制剂。RKIP显示在心力衰竭患者的心脏活组织检查样本中上调(Schmid E等人，Nat.Med.21，1298-1306(2015))。人RKIP在体外不抑制GRK2对SRSF1的磷酸化(图5A)。作为对照，人RKIP是有效的GRK2抑制剂并且抑制光传感因子的磷酸化(图5A)，光传感因子是GRK2的另一种非受体底物(Ruiz-Gomez A等人，J.Biol.Chem.275，29724-29730(2000))。人RKIP介导的GRK2诱导的光传感因子磷酸化抑制的IC50值为950nM(图5A)，与报道的RKIP介导的GPCR磷酸化抑制的IC50值460nM相当(Lorenz K等人，Nature 426，574-579(2003))。具有人RKIP的心肌特异性表达的Tg-RKIP小鼠以剂量依赖性方式产生心力衰竭体征(图5B，C)。同时，伴有扩张的心脏肥大、心脏纤维化和坏死是明显的(图5D-F)。与证明了人RKIP不能抑制GRK2对SRSF1磷酸化的激活(参见图5A)的体外实验一致，激活的Srsf1磷酸化在Tg-RKIP心脏中的心脏含量高于在非转基因B6对照中的心脏含量(图5G)。
实施例6：FVB背景中的Tg-RKIP小鼠品系也出现心力衰竭体征
在FVB背景中产生的表达人RKIP的转基因小鼠品系中，以剂量依赖性方式类似地检测到由转基因人RKIP表达诱导的心力衰竭表型(图6A-D)。组织学分析显示FVB背景中的Tg-RKIP小鼠发生强烈的伴有扩张的心脏肥大和心肌细胞损失(图6E)。通过靶向RKIP(PEBP1)的miRNA的慢病毒转导通过RNAi下调转基因RKIP(PEBP1)来部分逆转Tg-RKIP小鼠的心脏功能紊乱(图6F，G)。因此，Tg-RKIP小鼠的心力衰竭表型归因于转基因RKIP表达。
实施例7：转基因RKIP与GRK2相互作用并诱导GRK2抑制相关的基因表达特征
转基因RKIP(人RKIP～PEBP1)的GRK2抑制活性在体内受到控制。RKIP在丝氨酸-153上的磷酸化将RKIP从Raf1抑制转变为GRK2抑制(Lorenz K等人，Nature 426，574-579(2003))。通过Tg-RKIP心脏中的免疫印迹检测证明了RKIP的大量丝氨酸-153磷酸化(图7A)。丝氨酸-153磷酸化的RKIP足以结合并中和Tg-RKIP心脏中90.4％(±3.6％，n＝4)的GRK2蛋白(图7B)。我们测定了GRK2抑制介导的新生心肌细胞中异丙肾上腺素刺激的cAMP反应的重新敏化分别作为RKIP和GRK2-K220R对GRK2抑制的读数(Abd Alla，J等人，J.Biol.Chem.291，2583-2600(2016)；Kong KC等人，Biochemistry 47，9279-9288(2008))。来自Tg-RKIP和Tg-GRK2-K220R小鼠的新生心肌细胞显示出相当的GRK2抑制迹象，如通过显著增强的β-肾上腺素能受体介导的cAMP反应所证明的(图7C)。通过在Tg-RKIP和Tg-GRK2-K220R心脏中cAMP诱导基因Ttc14的显著增加的表达在体内证实了重新敏化的cAMP信号传导(图7D)。全基因组微阵列基因表达谱进一步揭示了Tg-RKIP心脏中GRK2抑制相关的基因表达特征(图7E，F)。值得注意的是，在Tg-RKIP和Tg-GRK2-K220R心脏之间存在45％显著改变的探针组的一致调节(图7E，F)。
实施例8：心脏保护性GRK2抑制剂帕罗西汀延缓Tg-RKIP小鼠的心力衰竭表型
分析了RKIP不能抑制GRK2对Srsf1磷酸化的激活是否导致Tg-RKIP小鼠的心力衰竭表型。用GRK2抑制剂帕罗西汀处理Tg-RKIP小鼠，帕罗西汀在心肌梗塞的实验模型中是具有心脏保护性的(Schumacher SM等人，Sci.Transl.Med.7，277ra31(2015))。帕罗西汀还在体外抑制SRSF1磷酸化(参见图1C)。用帕罗西汀处理8周降低了激活Srsf1磷酸化的心脏含量和Tg-RKIP心脏中Camk2d同种型B/C的剪接(图8A-C)。同时，延缓了发生心肌坏死和心力衰竭体征(图8D-F)。总之，转基因小鼠和不同GRK2抑制剂的数据显示，心脏保护性GRK2抑制依赖于GRK2对激活Srsf1磷酸化的抑制。
实施例9：抑制GRK2介导的SRSF1磷酸化的小分子化合物的开发。
开发了抑制GRK2介导的SRSF1磷酸化的小分子化合物(图9)。1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-(环丙烷-羰基)-3-羟基-2-苯基-2H-吡咯-5-酮(“化合物-1”)抑制GRK2介导的SRSF1磷酸化，IC50值为0.45μM。1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-(环丙烷-羰基)-3-羟基-2-苯基-2H-吡咯-5-酮(“化合物-1”)的IC50值不到帕罗西汀IC50值的1/5(图9)，帕罗西汀是唯一可用的小分子GRK2抑制剂，在体内实验条件下具有已证明的心脏保护活性(Schumacher SM等人，Sci.Transl.Med.7，277ra31(2015))。四个化合物1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-氟苯基)-2-甲基-吡咯-3-甲酰胺、(3R)-N-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-氟苯基)硫代吗啉-3-甲酰胺、4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)嘧啶和(4R)-N3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-N4-[[3-(三氟甲基)苯基]-甲基]吡咯烷-3，4-二甲酰胺(“化合物2-5”)抑制SRSF1磷酸化，IC50值范围为1.87μM(4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)嘧啶，“化合物-4”)至12.87μM((3R)-N-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-氟苯基)硫代吗啉-3-甲酰胺，“化合物-3”)(图9)。未处理对照化合物布洛芬((±)-2-(4-异丁基苯基)丙酸(“化合物-6”，Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)在高达1mM时没有抑制作用(图9)。
实施例10：小分子化合物抑制完整心肌细胞和人肾细胞中GRK2介导的SRSF1/Srsf1磷酸化。
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-(环丙烷-羰基)-3-羟基-2-苯基-2H-吡咯-5-酮(“化合物-1”)和4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)嘧啶(“化合物-4”)也降低了分离的Tg-SRSF1心肌细胞中促进心力衰竭的SRSF1/Srsf1磷酸化(图10A)。GRK2抑制促进人肾细胞的存活(Fu X等人，J.Biol.Chem.288，7738-7755(2013))。4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)嘧啶(“化合物-4”)、1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-氯苯基)-2-甲基-吡咯-3-甲酰胺(“化合物-24”)和(4R)-N3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-N4-[[3-(三氟甲基)苯基]-甲基]吡咯烷-3，4-二甲酰胺(“化合物-5”)抑制人肾细胞中的损伤细胞的SRSF1磷酸化(图10B)。
实施例11：小分子化合物在体内的心脏保护作用。
用小分子化合物(1-((1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-(环丙烷-羰基)-3-羟基-2-苯基-2H-吡咯-5-酮(“化合物-1”)、4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)嘧啶(“化合物-4”)、1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-氟苯基)-2-甲基-吡咯-3-甲酰胺(″化合物-2″)和(4R)-N3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-N4-[[3-(三氟甲基)苯基]甲基]吡咯烷-3，4-二甲酰胺(″化合物-5″)短期处理5小时在体内基础条件下降低了促进心力衰竭的GRK2介导的Srsf1磷酸化(图11A)。用“化合物-1”或“化合物-5”处理还延缓了慢性压力超负荷诱导的心脏p-Srsf1含量，并改善了AAC施加的慢性压力超负荷后B6小鼠的心脏性能(图11B)。
实施例12：用化合物-1和化合物-4口服处理消解心血管疾病引起的心力衰竭和衰老
我们研究了新的小分子GRK2抑制剂化合物-1(1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-(环丙烷羰基)-3-羟基-2-苯基-2H-吡咯-5-酮))和化合物-4(4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)嘧啶)是否可以延缓腹主动脉缩窄(AAC)施加的心力衰竭的慢性压力超负荷模型中的心力衰竭症状。在AAC诱导的心力衰竭模型中口服施用化合物-1(3mg/kg/d)和化合物-4(5mg/kg/d)。化合物-1和化合物-4的口服处理在具有由四周AAC诱导的心力衰竭症状(左心室射血分数＜34％)的B6小鼠中开始。分别用化合物-1和化合物-4处理两个月消解了AAC诱导的心脏功能紊乱，如与未处理的AAC对照的28.6％±3.5％的射血分数相比，分别用化合物-1和化合物-4处理后41.4±4.8％和38.2±3.7％的左心室射血分数显著改善所证明的(图12A)。除了改善的心脏功能之外，组织学分析显示在用化合物-1口服处理后AAC诱导的心脏肥大减少(图12B)。同时，由于心脏功能的改善，小鼠的心血管疾病引起的衰老明显受到延缓，即与未处理的B6对照动物相比，用化合物-1处理8周后，明显延缓黑发出现灰色(图12C，D)。
实施例13：材料和方法
转基因小鼠的产生
该研究使用以下转基因小鼠品系，其由我们的团队产生：B6(C57BL/6J)和FVB背景中的Tg-RKIP(PEBP1)小鼠，B6背景中的Tg-GRK2(ADRBK1)小鼠，B6背景中的Tg-SRSF1小鼠，B6背景中的Tg-GRK2-K220R和Tg-GRKInh小鼠。所有转基因在心肌特异性α-MHC启动子的控制下表达(MyHC质粒由James Gulick，Gulick J等人，J.Biol.Chem.266，9180-9185(1991)友情提供)。根据标准程序产生转基因小鼠。简而言之，将编码所示蛋白/肽的DNA插入到α-MHC(MyHC)质粒中，通过Not I消化除去质粒序列，并将纯化的DNA(2ng/μL)注射到超排卵B6(C57BL/6J)和FVB(FVB/N)小鼠的受精卵母细胞中。根据标准程序将注射的胚胎输卵管转移到假孕CD-1小鼠中。从3-4周龄时采集的耳钻孔活组织检查分离F0代的基因组DNA，并通过PCR分析转基因的整合(Fu X等人，J.Biol.Chem.288，7738-7755(2013))。
慢性压力超负荷诱导的实验性心力衰竭模型和经胸壁超声心动图
腹主动脉缩窄(AAC)施加的慢性压力超负荷被用作诱导心脏肥大和心力衰竭体征的实验模型。如所述的(AbdAlla S等人，Cardiovasc.Hematological Agents Med.Chem.9，190-206(2011))，在三溴乙醇麻醉的8-12周龄转基因小鼠或非转基因B6对照中进行腹主动脉的主动脉缩窄。通过将7-0丝线缝合结扎线绑在钝的26号针上，将腹主动脉收缩在肾上腺上动脉上方。对年龄匹配的对照进行相同的外科手术，除了主动脉结扎(假手术小鼠)。
心脏功能参数通过经胸壁超声心动图测定，经胸壁超声心动图使用Vivid 7超声心动图设备(GE Healthcare，Glattbrugg，Schweiz)和12MHz线性阵列换能器对麻醉的小鼠进行。使用Teichholz公式在M模式的胸骨旁长轴视图中计算左心室射血分数。根据适用于小鼠的美国心脏病学会的建议(Sahn DJ等人，Circulation 58，1072-1083(1978))进行M-模式成像。使用EchoPac Pc 3.0软件(GE Healthcare，Glattbrugg，Schweiz)离线解释记录。
动物实验根据NIH指南进行，并由当地动物护理和使用委员会(苏黎世大学)审查和批准。
Nano-LC-ESI-MS/MS
为了富集与人心脏GRK2蛋白相互作用的蛋白，从经历二尖瓣置换的具有心力衰竭体征的患者的小心肌活组织检查样本制备蛋白裂解物。从所有参与者获得了知情同意。该研究是根据赫尔辛基宣言的原则进行的，并且方案得到了Ain Shams大学伦理委员会的批准。先前公布了研究参与者的患者表征(AbdAlia S等人，Cardiovasc.HematologicalAgents Med.Chem.9，190-206(2011))。GRK2的富集和GRK2相互作用蛋白的共富集如所述类似地进行(Fu X等人，J.Biol.Chem.288，7738-7755(2013))。简言之，将心肌蛋白在4℃下用增溶缓冲液(1％脱氧胆酸钠，0.05％SDS，0.05％Tween 20的PBS溶液，pH 7.4，补充有蛋白酶抑制剂)溶解30分钟，通过离心除去不溶物质，上清液在补充有蛋白酶抑制剂的PBS中1：5稀释，并与抗GRK2抗体经受亲和色谱法(将6mg亲和纯化的IgG偶联于1ml Affigel 10，Bio-Rad Gmbh，München，Germany；针对在Sf9昆虫细胞中表达的全长重组GRK2蛋白，在兔中产生多克隆抗GRK2抗体)。在4℃孵育过夜后，通过用PBS(20柱体积)洗涤除去未结合的蛋白，并用0.25M NH4OH，10％二氧杂环己烷，pH 11洗脱结合的蛋白。立即将洗脱液的pH调节至pH7.4，通过丙酮沉淀浓缩洗脱的蛋白，溶解在8M尿素中，并在还原条件下进行含8％尿素的SDS-PAGE。在考马斯亮蓝染色后，切割富集的蛋白条带并进行nano-LC-ESI-MS/MS。在包含30-40kDa蛋白范围的凝胶切片中鉴定了SRSF1蛋白。通过nano-LC-ES-MS/MS(ProteomeFactory AG，Berlin)进行蛋白鉴定。MS系统由Agilent 1100nano-LC系统(Agilent，Boeblingen，Germany)、PicoTip发射器(New Objective，Woburn，MA)和Esquire 3000plus离子阱MS(Bruker，Bremen，Germany)组成。切割的蛋白条带通过胰蛋白酶(Promega，Mannheim，Germany)进行凝胶内消化，并应用于non-LC-MS/MS。在富集柱(Zorbax SB C18，0.3x5mm，Agilent Boeblingen，Germany)上使用1％乙腈、0.5％甲酸溶液捕获肽和使其脱盐5分钟后，在Zorbax 300SB C18，75μm x 150mm柱(Agilent Boeblingen，Germany)上使用乙腈、0.1％甲酸梯度(在40分钟内从5％至40％乙腈)分离肽。根据制造商对nan-LC-MS/MS分析的仪器设置，由Esquire 3000plus自动采集MS谱。使用Mascot搜索引擎(MatrixScience，London，England)的MS/MS离子搜索和nr蛋白数据库(National Center forBiotechnology Information，Bethesda，MD)鉴定蛋白。根据仪器和方法的共同电荷状态分布，将离子形式ESI-MS/MS数据采集的搜索参数中的离子电荷设置为“1+、2+或3+”(Fu X等人，J.Biol.Chem.288，7738-7755(2013))。
为了鉴定被GRK2磷酸化的SRSF1中的残基，在体外磷酸化测定后用纯化的重组SRSF1进行nano-LC-ES-MS/MS分析。该程序如上所述进行，但MS系统由Agilent 1100nanoLC系统(Agilent，Waldbronn，Germany)、Nanomate 100电喷雾系统(Advion，Ithaca，USA)和Finnigan LTQ-FT质谱仪(ThermoFisher，Bremen，Germany)组成。调整Mascot搜索引擎的设置以识别可变修饰，即脱酰胺化(NQ)、氧化(M)、磷酸化(ST)和磷酸化(Y)。
重组蛋白的表达和纯化
通过杆状病毒表达系统在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)细胞中表达并纯化重组人GRK2蛋白和GRK2-S670A蛋白。使用Sal I/Hind III限制性位点将编码六组氨酸标记的人GRK2(ADRBK1)GRK2-S670A的cDNA亚克隆到pFastBac1表达质粒(InvitrogenTM，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)中，通过Bac-To-Bac杆状病毒表达系统(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)产生重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染Sf9细胞，MOI为2-3，感染后48小时，通过离心收获细胞，用裂解缓冲液(300mMNaCl，50mM HEPES，pH 7.5，补充有1％NP40、1mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物)裂解并应用于Ni-NTA色谱法。在4℃孵育过夜后，通过用裂解缓冲液(20x柱体积)洗涤，然后用1x柱体积的30mM含咪唑的裂解缓冲液洗涤，除去未结合的蛋白。结合的GRK2用300mM咪唑/裂解缓冲液洗脱，通过PD10柱色谱法脱盐，补充20％甘油并储存在-80℃供进一步使用。
在T7启动子的控制下，分别将编码人His6-SRSF1和光传感因子-His6以及GRK2的羧基末端结构域(SEQ ID NO：10，His-6标记)的cDNA亚克隆到PET-3d表达质粒(EMD Millipore，Merck KGaA，Darmstadt，Germany)中，这允许在BL21(DE3)pLysS细菌中用IPTG通过T7 RNA聚合酶诱导蛋白表达。通过离心收集表达蛋白的细菌，在液氮中冷冻并在冰上在于使用前新补充有2-巯基乙醇(0.7ml/L)的裂解缓冲液(8M尿素，300mM NaCl，50mM HEPES，10mM咪唑，pH7.5)中解冻(将10ml裂解缓冲液用于来自200ml培养基的细菌团块)。将细菌裂解物在室温下孵育1小时，超声处理并在4℃下以4000×g离心15分钟。将上清液应用于用20ml裂解缓冲液预洗涤的Ni-NTA柱基质。在4℃孵育过夜后，弃去流出物，用洗涤缓冲液-1(4M尿素，300mM NaCl，50mM HEPES，20mM咪唑，pH 7.5，新补充有0.7ml/l 2-巯基乙醇)、洗涤缓冲液-2(2M尿素，300mM NaCl，50mM Hepes，20mM咪唑，pH7.5，新补充有0.7ml/L 2-巯基乙醇)和洗涤缓冲液-3(300mM NaCl，50mM HEPES，20mM咪唑，pH 7.5，新补充有0.7ml/L 2-巯基乙醇)对Ni-NTA亲和基质进行3个不同的洗涤步骤(在4℃孵育30分钟，其中将20ml的各洗涤缓冲液用于1ml的5％Ni-NTA基质)。最后，用洗脱缓冲液(300mM NaCl，50mM HEPES，500mM咪唑，pH7.5，新补充有0.7ml/L 2-巯基乙醇)洗脱蛋白。通过PD10柱色谱法将洗脱的蛋白的缓冲液更换为150mM NaCl，50mM HEPES(pH7.5)。
体外磷酸化测定
使用重组蛋白进行GRK2和GRK2-S670A的体外磷酸化测定。GRK2和GRK2-S670A通过杆状病毒表达系统在草地贪夜蛾(Sf9)细胞中表达并纯化。在存在所示增加浓度的GRK2抑制剂的情况下，在分别补充有50μM或5μM的ATP和[γ-32P]-ATP(1×10 6DPM，比活度3000Ci/mmol)以及300-500nM底物(SRSF1，光传感因子)的反应缓冲液(50μL的20mM Tris，2mM EDTA，5mM MgCl2 pH 7.5；或20mM Hepes，2mM MgCl2，0.025％DDM(正十二烷基-β-D-麦芽糖苷)，pH 7.4)中进行底物磷酸化。通过添加GRK2-S670A或GRK2(50nM或130nM)开始反应。在30℃孵育30分钟后，通过加入5×SDS-Laemmli缓冲液终止反应。通过SDS-PAGE分离蛋白并进行放射自显影。对于小分子抑制剂的分析，在补充有5μM的ATP、[γ-32P]-ATP(1×106DPM，比活度3000Ci/mmol)和300-500nM底物(SRSF1，光传感因子)(＝反应混合物)的反应缓冲液(20mM Tris，2mM EDTA，5mM MgCl2，0.05％BSA，pH 7.5；或20mM Hepes，2mMMgCl2，0.025％DDM(正十二烷基-β-D-麦芽糖苷)，pH 7.4)中进行磷酸化测定。将反应混合物加入到GRK2-S670A或GRK2(50nM或60nM，于不含或含有增加浓度的小分子化合物的反应缓冲液中)中，得到最终反应体积为50μL。在30℃孵育30-60分钟后，通过加入5体积的冰冷的反应缓冲液终止磷酸化。立即将反应混合物施加到玻璃纤维过滤器(GF/C，Whatman，GEHealthcare Life Sciences，Glattbrugg，Switzerland)上。在用5ml反应缓冲液进行三个洗涤步骤后，在β-计数器中测定过滤器结合的放射性。
蛋白的免疫印迹检测
对于蛋白的免疫印迹检测，将心脏组织在液氮中粉碎，并用补充有蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液提取，如前所述(Fu X等人，J.Biol.Chem.288，7738-7755(2013))并进行少量修改。通过在4℃下以20,000xg离心15分钟除去颗粒材料。将溶解的蛋白沉淀并用丙酮/甲醇(12：2；终浓度83％)在4℃下脱脂90分钟。通过离心(5000×g，10分钟，4℃)收集沉淀物，然后用0.2ml冷丙酮进行三个洗涤步骤。将团块在室温下溶于含有2％SDS、0.1M DTT和6M尿素的SDS-样品缓冲液中90分钟。加入碘乙酰胺(10mM)后，将样品储存在-70℃下供进一步使用。在通过SDS-PAGE(＜100kDa的蛋白为10％凝胶；＞100kDa的蛋白为7.5％凝胶)分离蛋白后，用亲和纯化的抗体或各抗体的F(ab)2片段进行蛋白检测，然后通过半干印迹(SD Semi-Dry Transfer Cell，Bio-Rad GmbH，M ünchen，Germany)将电泳蛋白转移至PVDF膜。对于Fasn蛋白的电泳转移，使用tank转移细胞(Minicell，Bio-Rad GmbH，M ünchen，Germany)。用酶偶联二抗的F(ab)2片段(Dianova GmbH，Hamburg，Germany)或适当时通过酶偶联蛋白A(Calbiochem，EMDMillipore，Merck KGaA，Darmstadt，Germany)显示结合的抗体，然后进行增强的化学发光检测(ECL Prime，Amersham，GE Healthcare Life Sciences，Glattbrugg，Switzerland)。
抗体
以下抗体用于蛋白的免疫印迹检测：针对纯化的Gnb，在兔中产生抗Gnb抗体(AbdAlla，J等人，J.Biol.Chem.291，2583-2600(2016))；针对在Sf9细胞中表达的重组GRK2，在兔中产生抗GRK2抗体(Abd Alla，J等人，J.Biol.Chem.291，2583-2600(2016))；针对来自含有磷酸化丝氨酸-153的人RKIP的短氨基酸序列，在兔中产生抗pRKIP抗体(sc-32623，SantaCruz Biotechnology Inc.，Dallas，TX，USA)；抗SRSF1抗体是映射在SF2/ASF蛋白的N-末端附近的小鼠单克隆抗体表位(sc-33652，Santa Cruz Biotechnology Inc.USA)；SR(1H4)抗体是针对非洲爪蟾属来源的全长SR产生的小鼠单克隆抗体(来自Santa CruzBiotechnology Inc.USA的sc-13509)；针对全长人蛋白，在兔中产生抗CAMK2D多克隆抗体(纯化的多克隆抗体，编号H00000817-D01P；Abnova，Taipei，Taiwan)，和将针对具有GST标签的CAMK2D(氨基酸301-410)部分重组蛋白在小鼠中产生的单克隆抗CAMK2D抗体(WH0000817M2；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)用于检测CAMK2D/Camk2d同种型B/C。
化合物合成
化合物由EMC microcollections GmbH，T übingen，Germany和ChiroBlock GmbH，Wolfen，Germany合成。通过固相化学合成方法以小规模进行化合物的合成，该方法改编自已建立的方案(对于″化合物-1″：Poncet J等人，J.Chem.Soc.Perkin Trans I.，611-616(1990)；对于″化合物-2″、″化合物-22″、″化合物-23″和″化合物-24″：Trautwein AW等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.8，2381-2384(1998)；对于化合物-3：Sakai K等人，Chem.Pharm.Bull.29(6)1554-1560(1981)；对于″化合物-4”：Coombs TC等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.23，3654-3661(2013)；和对于″化合物-5″：Baber JC等人，Bioorg.Med.Chem.20，3565-3574(2012))。另外，如下所详细描述的，以更大的规模合成化合物-1和化合物-4。
化合物-1的合成
化合物-1(1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-(环丙烷羰基)-3-羟基-2-苯基-2H-吡咯-5-酮)的合成由6步化学反应过程进行(ChiroBlock GmbH，Wolfen，Germany)。步骤-1包括2-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基氨基)-2-苯基-乙酸甲酯的合成。将2-氧代-2-苯基-乙酸甲酯(96g，584mmol，4.0当量)、1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-胺(20g，146mmol，1.0当量)和Na2SO4/环己烷(800ml)的混合物在N2下回流21小时。加入5％Pd/C(7.8g)，并将获得的悬浮液在20巴和20℃下氢化48小时。将得到的不均匀混合物用EtOAc(约800ml)稀释，并通过硅藻土过滤。将滤液真空浓缩(40℃，100毫巴)，得到棕色油状物(135g)，将其通过快速色谱法(硅胶，乙酸乙酯-石油醚12∶88至30∶70)纯化以得到目标3，其为灰白色固体(18.46g；纯度95％，收率44％)。
步骤-2是硫代乙酸S-叔丁酯的合成。将吡啶(87.0g，1.1mol，1.1当量)的氯仿(800ml)溶液在冰浴中冷却，并用乙酰氯(86.4g，1.1mol，1.1当量)处理，同时反应温度不超过11℃。历经40分钟向得到的橙色悬浮液中滴加2-甲基丙烷-2-硫醇(90.2g，1.0mol，1.0当量)，搅拌混合物48小时，然后用水(500ml)淬灭。分离各相，水相用氯仿(400ml)萃取。将合并的有机萃取物用各400ml水、10％H2SO4、饱和NaHCO3和水洗涤，随后用Na2SO4干燥。将得到的氯仿溶液进行分馏，得到目标硫代乙酸S-叔丁酯，为透明液体(55.8g，纯度95％，收率45％)。
在步骤-3中，进行环丙烷硫代甲酸S-(2-吡啶基)酯的合成。在20℃下，将环丙烷碳酰氯(23.5g，225mmol，1.0当量)滴加到吡啶-2-硫醇(25.0g，225mmol，1.0当量)的THF(250ml)溶液中。将混合物搅拌10分钟，过滤，滤饼用1∶4 Et2O/石油醚(250ml)洗涤。将由此获得的固体溶于水(250ml)中并用NaHCO3(19g，225mmol，1.0当量)处理，水溶液用2*250mlEtOAc萃取。将合并的有机级分经Na2SO4干燥并真空浓缩，得到环丙烷硫代甲酸S-(2-吡啶基)酯，为黄色油状物(37g，纯度95％；收率92％)。
步骤-4是3-环丙基-3-氧代-硫代丙酸S-叔丁酯的合成。向2L的3颈圆底烧瓶中装入HMDS(83.3g，516mmol，2.5当量)和新蒸馏的THF(800ml)。将得到的混合物在丙酮/干冰浴中冷却，并滴加1.6M nBuLi/己烷(323ml，516mmol，2.5当量)，同时保持温度低于-50℃。然后，相继用环丙烷硫代甲酸S-(2-吡啶基)酯(37.0g，206mmol，1.0当量)和硫代乙酸S-叔丁酯(23.4g，214mmol，1.04当量)处理所得混合物。将所得溶液在-30℃下搅拌1小时，并通过1N H2SO4(800ml)淬灭反应(在TLC过程控制下)。将得到的悬浮液用EtOAc(3*900ml)萃取，并合并有机部分，用盐水(2L)洗涤，用Na2SO4干燥，并真空浓缩。通过快速色谱法(硅胶，乙酸乙酯-石油醚25∶75)纯化粗产物，得到目标3-环丙基-3-氧代-硫代丙酸S-叔丁酯，为棕色油状物(29.5g，纯度83％，收率：59％)。
在步骤-5中，进行2-[1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基-(3-环丙基-3-氧代-丙酰基)氨基]-2-苯基-乙酸甲酯的合成。向1L圆底烧瓶中装入2-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基氨基)-2-苯基-乙酸甲酯(18.5g，61mmol，1.0当量)、3-环丙基-3-氧代-硫代丙酸S-叔丁酯(15.9g，66mmol，1.073当量)、CF3COOAg(814.6g，66mmol，1.073当量)和蒸馏的THF(400ml)，将所得混合物在20℃下搅拌36小时(通过TLC控制该过程)。将深棕色反应混合物真空浓缩，并通过快速色谱法(硅胶，乙酸乙酯-石油醚25：75至50：50)纯化，得到目标2-[1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基-(3-环丙基-3-氧代-丙酰基)氨基]-2-苯基-乙酸甲酯，为棕色油状物(21.0g，纯度：90％，收率：78％)。
最终的步骤-6得到最终的目标1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-(环丙烷羰基)-3-羟基-2-苯基-2H-吡咯-5-酮(化合物-1)。向500ml圆底烧瓶中装入2-[1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基-(3-环丙基-3-氧代-丙酰基)氨基]-2-苯基-乙酸甲酯(20.0g；45.5mmol，1.0当量)、CsF(6.9g，45.5.mmol，1.0当量)和DMF(140ml)，并将所得混合物在60℃搅拌20小时(通过TLC控制该过程)。将深棕色反应混合物真空浓缩，残余物用1N H2SO4(400ml)处理。所得混合物用EtOAc(500ml)萃取，有机相用盐水(2*300ml)洗涤，用Na2SO4干燥，真空浓缩，以得到粗1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-(环丙烷羰基)-3-羟基-2-苯基-2H-吡咯-5-酮，为棕色固体(19g)。将上述固体在过滤器上用EtOAc洗涤直至变为无色，得到目标化合物-1(1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-(环丙烷羰基)-3-羟基-2-苯基-2H-吡咯-5-酮)，为灰白色固体(5.0g，纯度：98％，收率：30％)。
化合物-4的合成
化合物-4(4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)嘧啶)通过以下程序合成(ChiroBlock GmbH，Wolfen，Germany)。向250ml圆底烧瓶中加入1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)乙酮(10.0g，60.9mmol，1.0当量)、(EtO)3CH(27g，183mmol，3.0当量)、ZnCl2(0.83g，6.1mmol，0.1当量)、NH4CH3COO(0.4g，122mmol，2.0当量)和甲苯(120ml)，并将所得混合物在回流下搅拌48g，随后在20℃下搅拌48小时(通过TLC控制该过程)。将反应混合物用饱和NaHCO3(400ml)淬灭并用氯仿(400ml)萃取。有机相经Na2SO4干燥并真空浓缩，得到的粗产物通过快速色谱法(硅胶，MeOH-CHCl3(0∶100至5∶95))纯化，得到目标化合物-4(4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)嘧啶)，为灰白色固体(3.0g，纯度97％；收率25％)。
新生心肌细胞的分离和细胞实验
如所述(Fu X等人，J.Biol.Chem.288，7738-7755(2013)；Lorenz K等人，Nature426，574-579(2003))分离新生小鼠和大鼠心肌细胞。简言之，从2-3日龄小鼠中解剖出心脏，除去心房和主动脉，将心脏转移到无菌缓冲液A(137mM NaCl，5.36mM KCl，0.81mMMgSO4，5.55mM右旋糖，0.44mM KH2PO4，0.34mM Na2HPO4，20mM HEPES，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，pH 7.4)中。将心脏切成小块并用补充有150mg/L胰蛋白酶(Becton&Dickinson，Franklin Lakes，NJ，USA)的缓冲液A孵育(在磁力搅拌器上)15分钟。弃去上清液，重复该过程一次。此后，在室温下通过用胰蛋白酶补充的缓冲液A连续5分钟孵育来消化心脏组织直至心脏组织被完全消化。通过离心(10分钟，700×g，室温)收集上清液中的细胞，将细胞悬浮在含有5％FCS的MEM中，并通过尼龙网(40微米)过滤。通过在37℃下预铺板1小时除去成纤维细胞。收集非贴壁心肌细胞并在MEM(补充有5％FCS和25mg/l BrdU)中培养。与所述(Abd Alla，J等人，J.Biol.Chem.291，2583-2600(2016))的类似，在用100nM异丙肾上腺素刺激β-肾上腺素能受体后，用cAMP酶免疫测定试剂盒(CA200，Sigma Aldrich，St.Louis，MO，USA)测定分离的心肌细胞的细胞cAMP水平。如所述(Fu X等人，J.Biol.Chem.288，7738-7755(2013))培养人胚肾细胞。
组织学技术
对于组织学分析，使用小鼠心脏样本的石蜡切片。用针对重组RKIP在兔中产生的亲和纯化的多克隆抗体进行RKIP的免疫组织学检测。在抗原修复后，将切片与一抗(1：200稀释)在封闭缓冲液[PBS，pH 7.4，补充有5％(w/v)牛血清白蛋白，0.05％Tween-20]中在37℃一起孵育1小时。用补充有0.05％Tween-20的PBS通过三个洗涤步骤除去未结合的抗体。与过氧化物酶缀和的二抗(Dianova，Dianova GmbH，Hamburg，Germany；1∶500稀释)一起孵育、接着进行洗涤步骤后，进行酶底物反应(DAB Enhanced Liquid Substrate System，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)。免疫组织切片用配备有DFC420照相机的LeicaDMI6000显微镜成像。用von Kossa染色(钙染色试剂盒，改良的Von Kossa No.KT028Diagnostic Biosystems Pleasanton，CA，USA)测定心肌坏死。
在体内通过RNAi的慢病毒介导的Srsf1下调
对于体内Srsf1表达的下调，通过i.p.施用复制缺陷性慢病毒(于PBS中，1x108个拷贝/小鼠)转导Tg-GRK2小鼠，所述慢病毒通过靶向Srsf1 RNA的miRNA前体的聚合酶II(Pol II)-依赖性表达通过RNAi下调Srsf1。通过将指定的双链寡核苷酸(miSrsf上游链(top strand)5’-TGC TGT TTA AGT CCT GCC AGC TTC CAG TTT TGG CCA CTG ACT GACTGG AAG CTC AGG ACT TAA A-3`(SEQ ID NO：1)；和miSrsf1下游链(bottome strand)5′-CCT GTT TAA GTC CTG AGC TTC CAG TCA GTC AGT GGC CAA AAC TGG AAG CTG GCA GGACTT AAA C-3′(SEQ ID NO：2))插入pLenti6/V5-Dest载体(InvitrogenInvitrogenTM，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)中来产生慢病毒表达质粒，所述双链寡核苷酸编码通过RNAi干扰靶向鼠Srsf1基因的工程化miRNA前体序列。通过用慢病毒质粒和包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG(InvitrogenTM，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)的混合物共转染293FT细胞产生假型慢病毒。在用miSrsf1-慢病毒转导小鼠后通过免疫印迹检测证实了Srsf1蛋白表达的下调。
全基因组微阵列基因表达分析
基本如所述(Abd A1la，J等人，J.Biol.Chem.291，2583-2600(2016))，使用Affymetrix GeneChip小鼠基因组MG430 2.0Arrays进行来自Tg-RKIP和Tg-GRK2-K220R小鼠的心脏组织的全基因组微阵列基因表达分析。使用GeneSpring GX软件(Agilent，SantaClara，CA，USA)，用GCOS和/或RMA处理的数据进行微阵列数据的GO分析。使用未配对的双尾学生t检验比较两组之间的数据。将显著上调(相对于各自对照组的倍数变化≥2，P≤0.01)的探针组用于GO分类。如所述(Abd Alla，J等人，J.Biol.Chem.291，2583-2600(2016)；Fu X等人，J.Biol.Chem.288，7738-7755(2013))，用LightCycler 480(Roche MolecularDiagnostics，Pleasanton，CA，USA)进行Camk2d同种型剪接的实时qRT-PCR。使用下列引物：Camk2d-正向5`-ACG AGA AAT TTT TCA GCA GCC-3`(SEQ ID NO：3)；Camk2d-反向-A 5`-ACAGT AGT TTG GGG CTC CAG C-3`(SEQ ID NO：4)；Camk2d-反向-B 5`-T CAT CTG AAC ACTCGA ACT GG-3`(SEQ ID NO：5)；Camk2d-反向-C 5`-CTC AGT TGA CTC CTT TAC CCC-3`(SEQ ID NO：6)。
统计分析
除非另有规定，否则结果表示为平均值±s.d.。用学生t检验计算P值。对于多于两组之间的比较进行方差分析，然后进行事后检验，除非另有说明，否则将统计学显著性设定为P值＜0.05。

Claims (6)

1.化合物及其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备用于心脏和/或肾脏保护性治疗的药物中的用途，其中所述化合物选自：
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-(环丙烷羰基)-3-羟基-2-苯基-2H-吡咯-5-酮；
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-氟苯基)-2-甲基-吡咯-3-甲酰胺；
(3R)-N-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-氟苯基)硫代吗啉-3-甲酰胺；
4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)嘧啶；
(4R)-N3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-N4-[[3-(三氟甲基)苯基]甲基]吡咯烷-3，4-二甲酰胺；
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-2-甲基-5-苯基-吡咯-3-甲酰胺；
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-2-甲基-5-(对甲苯基)吡咯-3-甲酰胺；和
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-5-(4-氯苯基)-2-甲基-吡咯-3-甲酰胺。
2.根据下式的化合物：
1-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-4-(环丙烷羰基)-3-羟基-2-苯基-2H-吡咯-5-酮。
3.根据权利要求1所述的化合物的用途或根据权利要求2所述的化合物，其中所述化合物抑制G蛋白偶联受体激酶2(GRK2，ADRBK1)导致的底物磷酸化，即丝氨酸/精氨酸丰富的剪接因子1(SRSF1、ASF-1、SF2)和/或光传感因子的磷酸化。
4.药物组合物在制备用于心脏和/或肾脏保护性治疗的药物中的用途，所述药物组合物包含作为活性物质的如权利要求1中限定的化合物或根据权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的衍生物，任选与赋形剂和/或载体组合。
5.根据权利要求1或4所述的化合物或药物组合物的用途，其中所述心脏保护性治疗选自
(i)在原发性高血压和/或慢性高血压的病况下降低心血管死亡率和/或发病率的风险；
(ii)降低心血管疾病引起的衰老的风险；
(iii)在近期心肌梗塞后左心室功能紊乱和心力衰竭体征的病况下降低心血管死亡率和/或发病率的风险；
(iv)在慢性心力衰竭和左心室功能紊乱的病况下降低心血管死亡率和/或发病率的风险；
(v)在扩张型心肌病的病况下降低心血管死亡率和/或发病率的风险；
(vi)在左心室功能紊乱的病况下降低心血管死亡率和/或发病率的风险；
(vii)在心肌细胞坏死的病况下降低心血管死亡率和/或发病率的风险；
(viii)在心肌纤维化的病况下降低心血管死亡率和/或发病率的风险；
(ix)预防、任选一级预防心肌细胞坏死和/或扩张型心肌病，任选在缺血性心脏病和缺血性心脏损伤风险增加的病况下，所述风险增加任选由于选自高血压、动脉粥样硬化、慢性和急性应激、抑郁、糖尿病、慢性心力衰竭、心绞痛、心房颤动、慢性肾功能衰竭和衰老的心血管危险因素；
(x)预防、任选二级预防具有选自急性心血管疾病、心肌梗塞、缺血性心脏病、心绞痛、心房颤动、失代偿性和慢性心力衰竭以及脑血管性卒中的先前事件的患者的心肌细胞坏死和/或扩张型心肌病；和
(xi)治疗心血管疾病的急性疾病状态，所述心血管疾病任选选自心肌梗塞、心绞痛、缺血性心脏病、脑血管疾病和失代偿性心力衰竭；
其中所述化合物或药物组合物用于治疗动物、人和/或哺乳动物。
6.根据权利要求1或4所述的化合物或药物组合物的用途，其中所述肾脏保护性治疗是治疗肾病；由高血压、肾动脉狭窄、缺血、糖尿病和/或毒剂引起的肾病。
CN202310126451.9A 2017-01-10 2018-01-10 细胞保护性化合物及其用途 Pending CN116462666A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17150829.4 2017-01-10
EP17150829 2017-01-10
PCT/EP2018/050504 WO2018130537A1 (en) 2017-01-10 2018-01-10 Cell-protective compounds and their use
CN201880017149.7A CN110494136A (zh) 2017-01-10 2018-01-10 细胞保护性化合物及其用途

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880017149.7A Division CN110494136A (zh) 2017-01-10 2018-01-10 细胞保护性化合物及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116462666A true CN116462666A (zh) 2023-07-21

Family

ID=57758541

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310126451.9A Pending CN116462666A (zh) 2017-01-10 2018-01-10 细胞保护性化合物及其用途
CN201880017149.7A Pending CN110494136A (zh) 2017-01-10 2018-01-10 细胞保护性化合物及其用途

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880017149.7A Pending CN110494136A (zh) 2017-01-10 2018-01-10 细胞保护性化合物及其用途

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11628159B2 (zh)
EP (1) EP3568133B1 (zh)
JP (1) JP6928096B2 (zh)
KR (1) KR102446529B1 (zh)
CN (2) CN116462666A (zh)
AU (1) AU2018208458B2 (zh)
CA (1) CA3049728A1 (zh)
WO (1) WO2018130537A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3543231A1 (en) * 2018-03-19 2019-09-25 ETH Zurich Compounds for treating cns- and neurodegenerative diseases

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR0179401B1 (ko) * 1994-02-28 1999-03-20 송택선 신규한 5-피롤릴-2-피리딜메틸설피닐벤즈이미다졸 유도체
US6436908B1 (en) 1995-05-30 2002-08-20 Duke University Use of exogenous β-adrenergic receptor and β-adrenergic receptor kinase gene constructs to enhance myocardial function
EE04310B1 (et) * 1995-04-21 2004-06-15 Neurosearch A/S Bensimidasooli ühendid, neid ühendeid sisaldavad farmatseutilised kompositsioonid ja nende kasutamine
MXPA03004245A (es) * 2000-12-12 2003-09-22 Neurogen Corp Espiro[isobenzofuran-1,4'piperidin]-3-onas y 3h-espiroisobenzofuran-1,4'-piperidinas.
GB2372986A (en) * 2001-01-17 2002-09-11 Xenova Ltd 2-oxo, 4-hydroxy pyrroles and quinolines
WO2003073999A2 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Pintex Pharmaceuticals, Inc. Pini-modulating compounds and methods of use thereof
EP1477475A1 (en) 2003-05-16 2004-11-17 Procorde GmbH Compounds for use as a medicine increasing the contractility of a heart, a heart muscle or cells of a heart muscle
NZ550534A (en) * 2004-03-25 2009-07-31 Memory Pharm Corp Indazoles, benzothiazoles, benzoisothiazoles, benzisoxazoles, and preparation and uses thereof
CA2567977A1 (en) 2004-04-22 2006-01-05 Memory Pharmaceutical Corporation Indoles, 1h-indazoles, 1,2-benzisoxazoles, 1,2-benzoisothiazoles, and preparation and uses thereof
US7932394B2 (en) * 2004-11-02 2011-04-26 Msd K.K. Aryloxy-substituted benzimidazole derivatives
JP2008303145A (ja) 2005-09-22 2008-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Ｇｒｋ阻害剤からなる強心薬
EP1963332A1 (en) * 2005-11-09 2008-09-03 Memory Pharmaceuticals Corporation 1 h-indazoles, benzothiazoles, 1,2-benzoisoxazoles, 1,2-benzoisothiazoles, and chromones and preparation and uses thereof
JP2007145786A (ja) 2005-11-30 2007-06-14 Toray Ind Inc ピラジン誘導体及びそれを有効成分とする腎炎治療薬
JP4824092B2 (ja) * 2005-12-01 2011-11-24 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 新規なビニル様酸誘導体
US20080194557A1 (en) * 2007-01-18 2008-08-14 Joseph Barbosa Methods and compositions for the treatment of pain, inflammation and cancer
WO2008089310A2 (en) * 2007-01-18 2008-07-24 Lexicon Pharmaceuticals, Inc. Delta 5 desaturase inhibitors for the treatment of obesity
US20080255200A1 (en) * 2007-04-11 2008-10-16 Auspex Pharmaceuticals, Inc. Substituted benzimidazoles
BRPI0814958B8 (pt) * 2007-08-17 2021-05-25 Lg Chemical Ltd compostos de indol, e, composição
US20110052562A1 (en) * 2007-12-19 2011-03-03 The Scripps Research Institute Benzimidazoles and analogs as rho kinase inhibitors
WO2010114921A1 (en) * 2009-04-02 2010-10-07 Burnham Institute For Medical Research Eph receptor ligands and methods of use
ES2553610T3 (es) * 2010-12-14 2015-12-10 Electrophoretics Limited Inhibidores de la caseína cinasa 1 delta (CK1delta)
WO2012123563A1 (en) * 2011-03-16 2012-09-20 Probiodrug Ag Benz imidazole derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
US9580409B2 (en) * 2011-11-07 2017-02-28 Sunovion Pharmaceuticals, Inc. Modulators of opioid receptors and methods of use thereof
EP2858983B1 (en) 2012-06-11 2018-04-18 UCB Biopharma SPRL Tnf-alpha modulating benzimidazoles
JP5843182B2 (ja) * 2012-07-30 2016-01-13 大正製薬株式会社 部分的に飽和された含窒素複素環化合物
WO2014026327A1 (en) 2012-08-15 2014-02-20 Merck Sharp & Dohme Corp. 4-heteroaryl substituted benzoic acid compounds as rorgammat inhibitors and uses thereof
FR3008978A1 (fr) * 2013-07-23 2015-01-30 Servier Lab "nouveaux derives d'indole et de pyrrole, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent"
GB201510758D0 (en) * 2015-06-18 2015-08-05 Ucb Biopharma Sprl Novel TNFa structure for use in therapy
EP3390387B1 (en) * 2015-12-18 2021-11-17 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Heteroarylbenzimidazole compounds
WO2017207534A1 (en) * 2016-06-03 2017-12-07 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Substituted heteroarylbenzimidazole compounds
TW201813963A (zh) * 2016-09-23 2018-04-16 美商基利科學股份有限公司 磷脂醯肌醇3-激酶抑制劑

Also Published As

Publication number Publication date
KR102446529B1 (ko) 2022-09-23
CN110494136A (zh) 2019-11-22
AU2018208458B2 (en) 2020-07-16
US20190343802A1 (en) 2019-11-14
JP2020505340A (ja) 2020-02-20
KR20190104054A (ko) 2019-09-05
EP3568133B1 (en) 2023-12-13
WO2018130537A1 (en) 2018-07-19
EP3568133A1 (en) 2019-11-20
AU2018208458A1 (en) 2019-07-04
JP6928096B2 (ja) 2021-09-01
CA3049728A1 (en) 2018-07-19
US11628159B2 (en) 2023-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. Senolytic activity of piperlongumine analogues: synthesis and biological evaluation
CA3026700A1 (en) Apoptosis signal-regulating kinase inhibitor
JP7349046B2 (ja) Ｓａｒｍ１の阻害剤
CN112442013B (zh) 一种作为甲状腺激素β受体激动剂的化合物及其用途
EA015516B1 (ru) Ингибиторы 11-бета-гидроксистероид дегидрогеназы 1
JP7478142B2 (ja) Ｓａｒｍ１阻害剤
JP2022536518A (ja) Ｓａｒｍ１の阻害剤
JP7478252B2 (ja) Ｓａｒｍ１の阻害剤
TW201102375A (en) Hedgehog pathway antagonists and therapeutic applications thereof
US20040229916A1 (en) Anti-diabetic agents
KR101278383B1 (ko) 퀴놀론 화합물 및 제약 조성물
WO2004054617A1 (ja) 中枢疾患の予防および／または治療剤
US20220073880A1 (en) Natural killer cells
JP2023553426A (ja) Ｓａｒｍ１のベンゾピラゾール阻害剤
WO2014178653A1 (ko) 지방세포 분화 과정에서 인간 작은 류신 지퍼 단백질의 용도
CN116462666A (zh) 细胞保护性化合物及其用途
WO2013183718A1 (ja) スクリーニング方法、タンパク質の不安定性及び／又は安定性を誘導する物質、及び、タンパク質の活性評価
US10669266B2 (en) Oxadiazole inhibitors of HIPK2 for treating kidney fibrosis
JP2009514865A (ja) 有糸分裂キネシン阻害剤
US20200308144A1 (en) Multimeric piperidine derivatives
KR102647513B1 (ko) Fxr 활성효과를 가지는 시나믹아마이드 유도체, 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 및 이의 제조방법
CA3094261C (en) Compounds for treating cns- and neurodegenerative diseases
JP4623604B2 (ja) 新規なオキシインドール誘導体
JP2022525293A (ja) 貧血の処置におけるムスカリン性アセチルコリン受容体サブタイプ４アンタゴニスト
CN115745955A (zh) 嘧啶酮类化合物、其制备方法及其在医药上的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination