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CN116376826A - 用来在过继性免疫疗法中进行免疫细胞调节的组合物和方法 - Google Patents

用来在过继性免疫疗法中进行免疫细胞调节的组合物和方法 Download PDF

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CN116376826A
CN116376826A CN202310345522.4A CN202310345522A CN116376826A CN 116376826 A CN116376826 A CN 116376826A CN 202310345522 A CN202310345522 A CN 202310345522A CN 116376826 A CN116376826 A CN 116376826A
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cell
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immune cells
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J·罗森
B·雷茨纳
B·瓦拉梅尔
R·比乔戴尔
E·佩拉尔塔
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Fate Therapeutics Inc
Original Assignee
Fate Therapeutics Inc
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Abstract

本申请涉及用来在过继性免疫疗法中进行免疫细胞调节的组合物和方法。已鉴定出产生较高比例或绝对数量较大的表型已鉴定的初始T细胞、干细胞记忆性T细胞、中央记忆性T细胞、适应性NK细胞以及I型NKT细胞的化合物。提供了用于调节过继性细胞疗法用的免疫细胞以改进功效的组合物和方法，所述免疫细胞包括T、NK、以及NKT细胞。

Description

用来在过继性免疫疗法中进行免疫细胞调节的组合物和方法
本申请是分案申请，原申请的申请日为2017年1月20日、申请号为2017800071210、发明名称为“用来在过继性免疫疗法中进行免疫细胞调节的组合物和方法”。
相关申请
本申请要求2016年1月20日提交的美国临时申请序列号62/281,064和2016年5月13日提交的美国临时专利申请号62/336,339的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开广泛涉及过继性免疫细胞疗法领域。更特别地，本公开涉及小分子用来对适合过继性细胞疗法的免疫细胞进行调节的用途。
背景技术
过继性免疫疗法涉及给患有癌症、肿瘤、或感染的患者施用免疫细胞，而所施用的免疫细胞则为患者提供治疗益处。通常来说，适合免疫疗法的免疫细胞包括(但不限于)B细胞、树突细胞(DC)、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT(自然杀伤T)细胞、以及造血干细胞或祖细胞。在患者中介导完全且持久的疾病响应是这些基于细胞的免疫疗法的中心目标。
我们对包括(但不限于)CAR-T细胞、TCR-T细胞、病毒特异性T细胞(VST)以及肿瘤浸润性T细胞(TIL)在内的过继性T细胞疗法的功效背后的生物机制的认识的进展已经强调了与转移T细胞相关的某些特性的重要性，并展示出由宿主细胞和肿瘤细胞产生的抑制屏障的复杂性，其需要被克服以成功进行癌症治疗。在相关研究中已经显示，在T细胞因子中，T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的亲合力、增殖能力和存活能力、到肿瘤部位的迁移、以及在肿瘤内维持效应物功能的能力是触发恶性细胞的根除的关键决定因素。但是会增加另一层复杂性的是，尽管已经了解这些期望的特性中的一些，但是驱动这些特性的途径或参与者仍不明，这会限制介入和获得针对其治疗用途具有期望的数量和质量的细胞的能力。
使用CAR-T细胞疗法为例，该疗法必须克服多种问题，包括CAR-T效力和持久性、向肿瘤的迁移、免疫抑制肿瘤微环境、肿瘤异质性以及患者安全性。正在采用多种方法来克服这些问题。例如选择特定的T细胞亚群用于治疗用途，并且可使用CAR的进一步工程化来改进肿瘤靶向、CAR效力以及在靶/脱肿瘤安全性问题。但是，改进CAR-T治疗功效(包括CAR-T的持久性和迁移)仍有待于解决。已经显示，T细胞疗法的体内功效可能会受到制造过程的强烈影响，制造过程依赖于进入所述过程或原料中的起始T细胞群，以及所采用的离体扩增和激活方法。已经证明，所施用的T细胞的分化状态可显著影响体内持久性和抗肿瘤活性。其特征在于表达CCR7和CD62L标记的辅助性T细胞(CD4+T细胞)和细胞毒性T细胞(CD8+)，特别是初始(Tn)T细胞、干细胞记忆性(Tscm)T细胞以及中央记忆性(Tcm)T细胞，在小鼠模型中(Sommermeyer等人2015)和在非人类灵长类动物模型两者中(Berger等人2008)均会介导优异的抗肿瘤活性。
在制造过程中，治疗细胞(或者细胞群)通常被激活和扩增。该过程通常驱动细胞分化，并引起处于更分化状态的细胞的比例的增加——在T细胞的情况下，更分化的细胞在表型上被表征为效应记忆性T细胞或效应T细胞。一旦输入患者，这些更分化的细胞与处于更低分化状态的细胞相比具有更低的增殖能力，以及更低的作为长寿群或持久群持续存在的能力。因此，本领域不仅迫切需要可用于维持和扩增期望的免疫细胞亚群的组合物和方法，而且还迫切需要在扩增过程中减少细胞分化，以及将细胞去分化为更低分化程度更低的细胞，从而获得增殖和持续存在的能力更大的期望的免疫细胞亚群，以便改进各种过继性免疫疗法的功效。
在基于NK细胞的疗法中同样存在类似的功效问题。自然杀伤细胞在传统上被归类为先天性免疫细胞，其被表征为具有较短的寿命，并且在对二次暴露于刺激物做出响应时展现出最小变化，即显示出有限的靶标记忆性响应。但是，最近的研究已经揭露了关于激活的和抑制的NK细胞受体两者的信息，所述受体起重要的作用，包括自身耐受性以及维持NK细胞活性。数据显示，NK细胞容易针对临近环境进行调节并形成抗原特异性的免疫记忆的能力，这是对二次暴露于相同抗原做出响应的基础。NK细胞(现在称作适应性NK细胞或记忆性NK细胞)亚群被识别为几个种类。这些细胞具有许多与CD8+T细胞类似的功能特征，包括长寿，以及在初始暴露后对刺激物具有增强的响应。这些特性与标准的NK细胞相比可产生更有效的细胞疗法策略。对持久的体内抗原特异性识别进行介导的适应性/记忆性NK细胞进行扩增和维持将会是对基于NK细胞的过继性免疫疗法进行改进的关键。
进一步地，据信与T细胞和NK细胞类似，可进行改进以分离更有效的NKT细胞，一种在先天性和适应性免疫系统两者中均起作用的CDld受限的T细胞，可靶向它进行调节从而产生改进的细胞疗法。
由于进入患者中的细胞、或者特别是细胞亚型的最终状态在很大程度上可由制造过程确定，因此该过程的重要性无论怎么强调都不为过。优选地，在细胞培养和扩增过程中维持或扩增具有期望的分化状态和/或适应性免疫细胞特征的细胞亚群，可能对于增强基于细胞的疗法的功效极其有益。因此，可在数量和质量两方面均增强期望的T、NK细胞或NKT细胞亚群型的制造方法可提供显著增强其治疗功效的显著增强。
本领域需要大量具有改进的治疗功效的免疫细胞亚群。然而，尽管某些期望的治疗性免疫细胞的特性是已知的，但是获得这些特性涉及到的途径和/或参与者在很大程度上仍然是未知的。本发明的方法和组合物解决这一需要，并提供免疫细胞疗法领域中的其它相关优势。
发明内容
本发明提供组合物和方法，用来对一种或多种免疫细胞群或亚群进行调节，以改进其对于过继性免疫疗法的治疗潜力。本发明的目的是提供单独的或者组合的一种或多种化合物，以便通过(例如)增加在预期产生更好的免疫治疗结果的以下性质中的至少一种中显示出改进的细胞亚群的数量或比例来改进治疗性免疫细胞的增殖、持久性、细胞毒性、和/或细胞回忆/记忆：迁移、归巢、细胞毒性、维持、扩增、持久性、长寿、期望的分化状态。
本发明的一个方面提供一种组合物，其用来改进适合过继性的基于细胞的疗法的免疫细胞的治疗潜力，所述组合物包含一种或多种选自由表1所列化合物组成的群组的药剂：AMPK抑制剂Dorsomorphin；萜烯七脂酸；1-吡咯烷二硫代甲酸铵盐；2-脱氧葡萄糖(2-DG)；GSK3抑制剂；Rho激酶抑制剂；MEK抑制剂；PDK1激动剂；TGFP抑制剂；6-巯基嘌呤；AC-93253碘化物；替拉曲考；PI-103；氟维司群；毒胡萝卜素；SU4312；替米沙坦；环孢菌素A；1,3,5-三(4-羟基苯基)-4-丙基-1H-吡唑；BAY61-3606；原卟啉IX二钠；雷帕霉素；HS173；LY294002；PI3K抑制剂匹替昔布(Pictilisib)；5-氮杂胞苷；氟达拉滨；核抑制剂罗斯考汀(Roscovitine)，(S)-异构体；PAC-1；5,7-二氯-8-羟基喹啉；呋喃妥因；5-氯-7-碘-8-羟基喹啉；7-氯-4-(二甲基氨基)-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢-2-并四苯甲酰胺；硝呋酚酰肼；盐酸托氟沙星；舍曲林；二乙烯三胺五醋酸五钠；依酚氯铵；BIX01294；特非那定；以及dmPGE2。选自由表1所列化合物组成的群组的一种或多种药剂通过使用所述一种或多种药剂对免疫细胞进行调节来改进免疫细胞或其一种或多种亚群的治疗潜力。在一些实施例中，免疫细胞的调节离体进行。
在一些实施例中，一种或多种表1所列化合物调节细胞的扩增、维持和/或分化，从而改进免疫细胞或其一种或多种亚群的增殖、细胞毒性、细胞因子响应和分泌、细胞回忆和/或持久性。
在一个实施例中，一种或多种表1所列化合物改进免疫细胞或其一种或多种亚群的离体和体内细胞存活率。
在一个实施例中，一种或多种表1所列化合物增加一种或多种期望的免疫细胞的细胞亚群的比例。
在一些实施例中，本发明提供一种或多种本文所选药剂以改进免疫细胞(包括(但不限于)T细胞、NK细胞以及NKT细胞)群或亚群的治疗功效。在一些实施例中，适合过继性的基于细胞的疗法的免疫细胞包含T细胞、NKT细胞、或NK细胞。在一些实施例中，进行处理的免疫细胞包含T细胞，照此，一种或多种期望的细胞亚群具有增加的比例，包含初始T细胞、干细胞记忆性T细胞、和/或中央记忆性T细胞。在一些实施例中，使用药剂进行处理的免疫细胞包含NKT细胞，照此，一种或多种期望的细胞亚群具有增加的比例，包含I型NKT细胞。在一些其它实施例中，使用药剂进行处理的免疫细胞包含NK细胞，并且其中一种或多种期望的细胞亚群具有增加的比例，包含适应性NK细胞。
在一些实施例中，所述组合物包含一种或多种选自由表1所列化合物、或其衍生物、类似物或药学上可接受的盐组成的群组的药剂。所述化合物、或其衍生物、类似物或药学上可接受的盐进一步包含表1化合物的酯、醚、溶剂化物、水合物、立体异构体、以及前药。
在一些实施例中，用来改进免疫细胞治疗潜力的组合物包含至少一种选自第I类的药剂，以及一种或多种选自第II类、第III类、第IV类、和/或第V类的药剂。
第I类包含：AMPK抑制剂dorsomorphin、萜烯七脂酸、1-吡咯烷二硫代甲酸、以及2-DG。不受理论的束缚，第I类药剂除了其它可能的作用之外还影响细胞的新陈代谢和营养感应。
第II类包含：GSK3抑制剂、ROCK抑制剂、TGFP受体抑制剂、MEK抑制剂、PDK1激动剂、6-巯基嘌呤、AC-93253碘化物、替拉曲考、PI-103、氟维司群、毒胡萝卜素、SU4312、U0126、替米沙坦、环孢菌素A、1,3,5-三(4-羟基苯基)-4-丙基-1H-吡唑、BAY61-3606、原卟啉IX二钠、雷帕霉素、TWS119、HS173、LY294002、以及PI3K抑制剂匹替昔布。不受理论的束缚，第II类药剂除了其它可能的作用之外还影响各种功能途径中的信号转导。
第III类包含：5-氮杂胞苷、氟达拉滨、核抑制剂罗斯考汀、以及PAC-1。不受理论的束缚，第III类药剂除了其它可能的作用之外还影响细胞增殖和细胞凋亡。
第IV类包含：5,7-二氯-8-羟基喹啉、7-氯-4-(二甲基氨基)-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢-2-并四苯甲酰胺、硝呋酚酰肼、以及盐酸托氟沙星。不受理论的束缚，第IV类药剂除了其它可能的作用之外还可能影响与感染过程相关的细胞特性。
第V类包含：舍曲林、二乙烯三胺五醋酸、依酚氯铵、BIX01294、特非那定、以及dmPGE2。不受理论的束缚，第V类药剂除了其它可能的作用之外通常还影响与扩增、维持、分化、去分化、存活率、增殖、细胞毒性、细胞回忆、和/或持久性相关的其它细胞特性
在一些其它实施例中，用来改进免疫细胞治疗潜力的组合物包含至少一种选自第II类的药剂，以及一种或多种选自第I类、第III类、第IV类、和/或第V类的药剂。
在再其它的实施例中，用来改进免疫细胞治疗潜力的组合物包含至少一种选自第III类的药剂，以及一种或多种选自第I类、第II类、第IV类、和/或第V类的药剂。
在另外其它的实施例中，用来改进免疫细胞治疗潜力的组合物包含至少一种选自第IV类的药剂、以及一种或多种选自第I类、第II类、第III类、和/或第V类的药剂。
在再其它的一些实施例中，用来改进免疫细胞治疗潜力的组合物包含至少一种选自第V类的药剂、以及一种或多种选自第I类、第II类、第III类、和/或第IV类的药剂。
在一些实施例中，用来改进免疫细胞治疗潜力的组合物包含一种组合，其包含至少一种选自由TWS119、HS173、LY294002、PI3K抑制剂匹替昔布、以及2-DG组成的群组的药剂；以及一种或多种另外的选自由表1所列化合物组成的群组的药剂。在一些特定实施例中，组合物包含两种或更多种选自由以下组成的群组的药剂的协同组合：TWS119、HS173、LY294002、PI3K抑制剂匹替昔布、以及2-DG。
在一些实施例中，包含一种或多种选自包含表1所列化合物的群组的药剂的组合物进一步包含至少一种选自由以下组成的群组的有机溶剂：二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲氧基乙烷(DME)、二甲基乙酰胺、乙醇及其组合。
本发明的另一个方面提供一种组合物，其包含免疫细胞群或亚群，以及一种或多种选自由表1所列化合物及其衍生物和类似物组成的群组的药剂。在一些实施例中，免疫细胞与一种或多种药剂接触，以便与不进行这种处理的免疫细胞相比改进免疫细胞对于过继性细胞疗法的治疗潜力。在一些实施例中，免疫细胞与一种或多种药剂接触，以便与不进行相同处理的免疫细胞相比改进细胞的扩增、维持、分化、去分化、和/或存活率。在又一些其它实施例中，免疫细胞与一种或多种药剂接触，以便与不进行相同处理的免疫细胞相比改进细胞增殖、细胞毒性、持久性、和/或回忆。
在一些实施例中，与一种或多种药剂接触的免疫细胞与不进行相同处理的免疫细胞相比，期望的免疫细胞亚群的数量或比例增加。在一些实施例中，免疫细胞包含T、NK或NKT细胞。在一个实施例中，组合物包含T细胞群，照此，期望的免疫细胞亚群在与(一种或多种)药剂接触之后包含初始T细胞、干细胞记忆性T细胞、和/或中央记忆性T细胞。在一些实施例中，组合物包含NKT细胞群，照此，期望的免疫细胞亚群在与药剂接触之后包含I型NKT细胞。在又一些其它实施例中，免疫细胞包含NK细胞群。在一些其它实施例中，NK细胞包含CD57-NK细胞或CD57-NKG2C+NK细胞。照此，期望的免疫细胞亚群在与药剂接触之后包含CD57+NK细胞。在一些实施例中，CD57+NK细胞包含适应性NK细胞。在其它实施例中，适应性NK细胞包含CD57+，以及NKG2C+、低PLZF、低SYK、低FcεRγ、低EAT-2、低TIGIT、低PD1、低CD7、低CD161、高LILRB1、高CD45RO、以及低CD45RA中的至少一种。
在一些实施例中，组合物的免疫细胞群或亚群从以下分离或者包含在以下中：受检者的外周血液、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位组织、腹水、胸腔积液、脾组织、或肿瘤。受检者可以是健康的，可患有自体免疫性疾病、造血系统恶性肿瘤、病毒感染或实体瘤，或者可在以前已经被施用过基因修饰的免疫细胞。在一些实施例中，受检者可以是CMV血清阳性的。在一些其它实施例中，所分离的用于调节的免疫细胞被基因修饰(由重排、突变、基因印记和/或表观基因修饰被基因工程化，或者天然衍生自重排、突变、基因印记和/或表观基因修饰)。在一些实施例中，所分离的用于调节的免疫细胞包含至少一种基因修饰形态。在一些实施例中，所分离的免疫细胞群被基因组工程化并包含插入、缺失、和/或核酸置换。在一些特定实施例中，免疫细胞包含对T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、和/或CD16或其变体的过表达进行编码的外源核酸。照此，基因修饰的免疫细胞被分离，以便使用如所公开的本发明组合物和方法进行离体调节。在一些实施例中，在调节之后，从受检者分离的基因修饰的免疫细胞可给相同供体或不同患者施用。
在又一个实施例中，免疫细胞从干细胞、造血干细胞或祖细胞、或者祖细胞体外分化；或者从造血或非造血系的非多能细胞体外转分化。在一些特定实施例中，组合物的免疫细胞包含对T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、和/或CD16及其变体的过表达进行编码的外源核酸。在一个实施例中，CD16为hnCD16(高亲和性不可切割CD16)。
在再其它的一些实施例中，组合物的免疫细胞从干细胞、造血干细胞或祖细胞、或者祖细胞体外分化。在一个实施例中，干细胞为诱导性多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。在一个实施例中，祖细胞为CD34+血原性内皮细胞、多能祖细胞、T细胞祖细胞、NK祖细胞、或NKT祖细胞。在一些实施例中，干细胞、造血干细胞或祖细胞、或者祖细胞被基因组工程化并包含插入、缺失、或核酸置换，或者包含至少一种基因修饰形态。在一个特定实施例中，干细胞、造血干细胞或祖细胞、或者祖细胞包含对T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、和/或CD16的过表达进行编码的外源核酸。在一些其它实施例中，组合物的免疫细胞从造血或非造血系的非多能细胞体外转分化。在一些实施例中，期望的免疫细胞亚群在调节之后包含具有至少一种基因修饰形态的免疫细胞。在一个实施例中，期望的免疫细胞亚群包含具有至少一种基因修饰形态的CD57+NK细胞。在一些实施例中，基因修饰形态包含以下中的至少一种：安全开关蛋白、靶向形态、受体、信号传导分子，转录因子、药学活性的蛋白和肽、药物目标候选物；或者促进免疫细胞的植入、运输、归巢、活力、自我更新、持久性、免疫响应调节和调控、和/或存活的蛋白。在一些其它实施例中，基因修饰形态包含以下中的一种或多种：(i)B2M、TAPI、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、或RFXAP、以及染色体6p21区中的任何基因的缺失或表达减少；以及(ii)用来与双特异性或多特异性接合体或者通用接合体偶联的HLA-E、HLA-G、HACD16、hnCD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、Fc受体、或表面触发受体的表达引入或增强。在一个特定实施例中，CD57+NK细胞包含hnCD16的表达。在又一个实施例中，包含hnCD16的表达的CD57+NK细胞为适应性NK细胞。在另一个实施例中，包含hnCD16的表达的CD57+NK细胞进一步包含NKG2C+、低PLZF、低SYK、低FcεRγ、低EAT-2、低TIGIT、低PD1、低CD7、低CD161、高LILRB1、高CD45RO、以及低CD45RA中的至少一种。
在一些实施例中，组合物包含GSK3抑制剂、TGFP受体抑制剂、ROCK抑制剂、MEK抑制剂、PDK1激动剂、以及雷帕霉素中的一种或多种。在一些实施例中，组合物包含GSK3抑制剂。在一些实施例中，包含免疫细胞以及一种或多种选自由表1所列化合物组成的群组的药剂的组合物进一步包含一种或多种另外的选自由以下组成的群组的添加剂：肽、细胞因子、有丝分裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或置换因子、包含一种或多种目标多核酸的载体；抗体或抗体片段；以及化疗剂、放射性部分、或免疫调节药物(IMiD)。在这些实施例的一些中，抗体或抗体片段特异性地与病毒抗原结合。在其它实施例中，抗体或抗体片段特异性地与肿瘤抗原结合。在一些实施例中，另外的添加剂包含。化疗剂是指细胞毒性抗肿瘤剂，即化学药剂，其优选杀伤瘤细胞或破坏迅速增殖的细胞的细胞周期，或者被发现清除癌干细胞，并在治疗上用于预防或减少瘤细胞的生长。化疗剂有时还被称作抗肿瘤药物或细胞毒性药物或者抗肿瘤剂或细胞毒性剂，并且在本领域中是众所周知的。
在一个特定实施例中，组合物包含免疫细胞群或亚群与GSK3抑制剂、TGFP受体抑制剂、ROCK抑制剂、MEK抑制剂、PDK1激动剂、以及mTOR抑制剂中的一种或多种的混合物，其中所述免疫细胞包含NK细胞。在一些实施例中，mTOR抑制剂选自雷帕霉素及其类似物或衍生物。在一些实施例中，mTOR抑制剂选自雷帕霉素及其类似物或衍生物，其包含西罗莫司、西罗莫司衍生物、坦罗莫司、40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素(依维莫司)、40-O-(3-羟基)丙基-雷帕霉素、40-O-[2-(2-羟基)乙氧基]乙基-雷帕霉素、40-O-四唑-雷帕霉素、以及其它O-烷基化的或O-甲基化的雷帕霉素衍生物。在一个实施例中，组合物包含GSK3抑制剂。在另一个实施例中，组合物包含GSK3抑制剂、MEK抑制剂以及雷帕霉素。在又一个实施例中，组合物包含GSK3抑制剂。在一个实施例中，包含GSK3抑制剂的组合物进一步包含包括IL2、IL15、IL12、IL18以及IL21的刺激性细胞因子中的至少一种。在一个实施例中，包含GSK3抑制剂的组合物进一步包含MEK抑制剂、雷帕霉素、以及STING激动剂中的一种或多种。在一些实施例中，STING激动剂包含环二核苷酸(CDN)、或者氧杂蒽酮、或者其类似物或衍生物。在一些实施例中，CDN可以是合成的，或者来源于原核细胞或哺乳动物细胞。在一些其它实施例中，STING激动剂包含至少一种选自由以下组成的群组的分子：cGAMP、c-di-GMP、c-di-AMP、c-di-IMP、c-di-UMP、cAMP-GMP、R,R-二硫代修饰的CDA化合物(ML RR-S2CDA和RR-S2 CDA)、MLRR-S2 cGAMP、DMXAA(5,6-二甲基氧杂蒽酮-4-乙酸)、及其类似物和衍生物。
本发明的一个方面提供用来改进适合过继性的基于细胞的疗法的免疫细胞的治疗潜力的组合物，其包含一种或多种选自由表1所列化合物及其衍生物和类似物组成的群组的药剂，其中所述一种或多种药剂通过调节免疫细胞来改进其免疫细胞治疗潜力。在所述组合物的一些实施例中，所述药剂能够调节细胞的扩增、维持和/或分化；改进细胞增殖、细胞毒性、细胞因子响应和分泌、回忆、和/或持久性；改进细胞存活率；并且/或者增加一种或多种期望的免疫细胞的细胞亚群的比例。在一些实施例中，所述衍生物和类似物包含表1药剂的盐、酯、醚、溶剂化物、水合物、立体异构体、以及前药。
在一些实施例中，适合通过所述药剂调节的免疫细胞包含T细胞、NKT细胞、和/或NK细胞。在一些实施例中，用于调节的NK细胞包含CD57-NK细胞和/或CD57-NKG2C+NK细胞。在一些实施例中，经调节的免疫细胞包含一种或多种比例增加的期望的细胞亚群，并且所述亚群可以是初始T细胞、干细胞记忆性T细胞、和/或中央记忆性T细胞；I型NKT细胞；或者CD57+NK细胞。在一些实施例中，CD57+NK细胞包含适应性NK细胞。在一些实施例中，所述适应性NK细胞被表征为CD57+以及NKG2C+、低PLZF、低SYK、低FcεRγ、低EAT-2、低TIGIT、低PD1、低CD7、低CD161、高LILRB1、高CD45RO和低CD45RA中的至少一种。在一些实施例中，适应性NK细胞被表征为CD57+NKG2C+。
在一些实施例中，适合通过所述药剂调节的免疫细胞从以下分离或者包含在以下中：外周血液、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位组织、腹水、胸腔积液、脾组织、或肿瘤。在一个实施例中，免疫细胞分离自健康受检者；患有自体免疫性疾病、造血系统恶性肿瘤、病毒感染或实体瘤的受检者；以前被施用过基因修饰的免疫细胞的受检者；或者CMV血清阳性受检者。在一些其它实施例中，所分离的用于调节的免疫细胞被基因修饰(由重排、突变、基因印记和/或表观基因修饰被基因工程化，或者天然衍生自重排、突变、基因印记和/或表观基因修饰)。在一些实施例中，所分离的用于调节的免疫细胞包含至少一种基因修饰形态。在一些实施例中，所分离的免疫细胞群被基因组工程化并包含插入、缺失、和/或核酸置换。在一些特定实施例中，免疫细胞包含对T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、和/或CD16或其变体的过表达进行编码的外源核酸。照此，基因修饰的免疫细胞被分离，以便使用如所公开的本发明组合物和方法进行离体调节。在一些实施例中，在调节之后，从受检者分离的基因修饰的免疫细胞可给相同的供体或者不同的患者施用。
在一些其它实施例中，适合通过所述药剂进行调节的免疫细胞从干细胞、造血干细胞或祖细胞、或者祖细胞体外分化；或者从造血或非造血系的非多能细胞体外转分化。在一些实施例中，所述干细胞包含诱导性多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。在其它实施例中，祖细胞为CD34+血原性内皮细胞、多能祖细胞、T细胞祖细胞、NK祖细胞、或NKT祖细胞。
在一些实施例中，用来分化包括T细胞、NK细胞、NKT细胞的各种免疫细胞的干细胞、造血干细胞或祖细胞、或者祖细胞被基因组工程化并包含插入、缺失、或核酸置换；或者包含至少一种基因修饰形态。照此，调节的衍生自干细胞、造血干细胞或祖细胞、或者祖细胞的免疫细胞的期望亚群还包含至少一种基因修饰形态。在一个特定实施例中，期望的免疫细胞亚群包含具有至少一种基因修饰形态的CD57+NK细胞。在一些实施例中，基因修饰形态包含以下中的至少一种：安全开关蛋白、靶向形态、受体、信号传导分子，转录因子、药学活性的蛋白和肽、药物目标候选物；或者促进免疫细胞的植入、运输、归巢、活力、自我更新、持久性、免疫响应调节和调控、和/或存活的蛋白。在一些其它实施例中，基因修饰形态包含B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、OITA、RFX5、或RFXAP、以及染色体6p21区中的任何基因的缺失的或表达减少中的一种或多种。在一些实施例中，基因修饰形态包含用来与双特异性或多特异性接合体或者通用接合体偶联的HLA-E、HLA-QHACD16、hnCD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、Fc受体、或表面触发受体的表达引入或增强中的一种或多种。在一个特定实施例中，从免疫细胞调节获得的期望的亚群中包含的CD57+NK细胞包含hnCD16的表达。在另一个实施例中，表达hnCD16的CD57+NK细胞进一步包含NKG2C+、低PLZF、低SYK、低FcεRγ、低EAT-2、低TIGIT、低PD1、低CD7、低CD161、高LILRB1、高CD45RO、以及低CD45RA中的至少一种。
在一些实施例中，免疫细胞被包含GSK3抑制剂的组合物调节。在一些实施例中，包含GSK3抑制剂的组合物进一步包含包括IL2、IL15、IL12、IL18以及IL21的刺激性细胞因子中的至少一种。在一些实施例中，包含GSK3抑制剂的组合物进一步包含MEK抑制剂、雷帕霉素、以及STING激动剂中的一种或多种。照此，在一些实施例中，组合物包含NK细胞群和GSK3抑制剂。在一些实施例中，组合物包含NK细胞群、GSK3抑制剂、以及IL15。在一些其它实施例中，组合物包含NK细胞群、GSK3抑制剂、IL15、以及STING激动剂。在一些实施例中，免疫细胞被包含调节剂和至少一种选自由以下组成的群组的有机溶剂的组合物调节：二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲氧基乙烷(DME)、二甲基乙酰胺、乙醇及其组合。
本发明的又一个方面提供组合物，所述组合物包含分离的免疫细胞群，其已经被包含一种或多种表1所列药剂、或其衍生物或类似物的组合物接触或调节。在一些实施例中，所提供的组合物为治疗组合物，其具有经处理的分离的包括(但不限于)T细胞、NK细胞、以及NKT细胞的免疫细胞的群或亚群。治疗组合物可使用基本上不含调节剂的缓冲液洗涤。
在一些实施例中，调节的细胞群包含免疫细胞，其与未调节的细胞群相比针对过继性细胞疗法具有改进的治疗潜力。在一些实施例中，所分离的免疫细胞群与未经一种或多种药剂处理的免疫细胞相比具有改进的细胞扩增、维持、分化、去分化、和/或存活率。在一些实施例中，所分离的免疫细胞群与未经一种或多种药剂处理的免疫细胞相比具有改进的细胞增殖、细胞毒性、细胞因子响应和分泌、细胞回忆、以及持久性。在一些其它实施例中，所分离的免疫细胞群与未进行相同处理的免疫细胞相比具有增加的一种或多种期望的免疫细胞亚群的数量或比例。
在一些实施例中，经一种或多种选自由表1所列化合物组成的群组的药剂处理的所分离的免疫细胞群包含T细胞，照此，所获得的一种或多种期望的免疫细胞亚群包含初始T细胞、干细胞记忆性T细胞、和/或中央记忆性T细胞。在一些实施例中，经一种或多种药剂处理的所分离的免疫细胞群包含NKT细胞，照此，所获得的一种或多种期望的免疫细胞亚群包含I型NKT细胞。在又一些其它实施例中，经一种或多种药剂处理的所分离的免疫细胞群包含NK细胞，照此，所述一种或多种期望的免疫细胞亚群包含适应性NK细胞。
在如所提供的组合物的一些实施例中，所分离的免疫细胞群可从受检者的外周血液、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位组织、腹水、胸腔积液、脾组织、或肿瘤分离。受检者可以是健康的，可患有自体免疫性疾病、造血系统恶性肿瘤、病毒感染或实体瘤，或者可在以前已经被施用过基因修饰的免疫细胞。在一些实施例中，受检者可以是CMV血清阳性的。在一些其它实施例中，所分离的用于调节的免疫细胞被基因修饰(由重排、突变、基因印记和/或表观基因修饰被基因工程化，或者天然衍生自重排、突变、基因印记和/或表观基因修饰)。在一些实施例中，所分离的用于调节的免疫细胞包含至少一种基因修饰形态。在一些实施例中，所分离的免疫细胞群被基因组工程化并包含插入、缺失、和/或核酸置换。在一些特定实施例中，免疫细胞包含对T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、和/或CD16或其变体的过表达进行编码的外源核酸。照此，基因修饰的免疫细胞被分离，以便使用如所公开的本发明组合物和方法进行离体调节。在一些实施例中，在调节之后，从受检者分离的基因修饰的免疫细胞可给相同的供体或者不同的患者施用。
在如所提供的组合物的一些实施例中，所分离的免疫细胞群可从干细胞、造血干细胞或祖细胞、或祖细胞分化。在一些实施例中，所分离的免疫细胞群可在被药剂处理之前或者期间从干细胞、造血干细胞或祖细胞、或祖细胞分化。在一些实施例中，干细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。在一些实施例中，祖细胞是CD34+血原性内皮细胞、多能祖细胞、T细胞祖细胞、NK祖细胞、或NKT祖细胞。在一些进一步的实施例中，干细胞、造血干细胞或祖细胞、祖细胞、衍生的用于调节的免疫细胞、或者调节的衍生的免疫细胞被基因组工程化，例如包含插入、缺失、和/或核酸置换。在一个特定实施例中，干细胞、造血干细胞或祖细胞、或者祖细胞包含对T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、和/或CD16的过表达进行编码的外源核酸。
在如所提供的组合物的一些其它实施例中，所分离的免疫细胞群可从造血或非造血系的非多能细胞转分化。在一些实施例中，所分离的免疫细胞群可在被药剂处理之前或者期间从造血或非造血系的非多能细胞转分化。
本发明的另一个方面提供调节免疫细胞的方法，其包含将免疫细胞与足够量的组合物接触，所述组合物包含至少一种选自由表1所列化合物、及其衍生物和类似物组成的群组的药剂，接触时间足以获得与未调节的免疫细胞相比针对过继性细胞疗法具有改进的治疗潜力的调节的免疫细胞群。在一些实施例中，衍生物和类似物包含表1药剂的盐、酯、醚、溶剂化物、水合物、立体异构体、以及前药。
在所述方法的一些实施例中，调节的免疫细胞包含这样的细胞：其与未与一种或多种表1药剂接触的免疫细胞相比具有改进的增殖、细胞毒性、细胞因子响应、细胞因子释放、细胞回忆、和/或持久性；改进的细胞扩增、维持、分化、去分化、和/或存活率；和/或增加的一种或多种期望的免疫细胞亚群的数量或比例。在所述方法的一些实施例中，所述方法进一步包含从调节的免疫细胞分离一种或多种期望的亚群。在一个实施例中，用于调节的免疫细胞包含T细胞、NKT细胞、或NK细胞。在另一个实施例中，用于调节的NK细胞包含CD57-NK细胞或CD57-NKG2C+NK细胞。在一个实施例中，在使用所述方法对免疫细胞进行调节之后，调节的免疫细胞中的一种或多种期望的亚群可包含初始T细胞、干细胞记忆性T细胞、和/或中央记忆性T细胞；I型NKT细胞；或CD57+NK细胞。在一个实施例中，在调节之后获得的CD57+NK细胞包含适应性NK细胞。在一些实施例中，适应性NK细胞被表征为CD57+以及NKG2C+、低PLZF、低SYK、低FcεRγ、低EAT-2、低TIGIT、低PD1、低CD7、低CD161、高LILRB1、高CD45RO和低CD45RA中的至少一种。
在所述通用方法的一些实施例中，用于调节的免疫细胞从以下分离或者包含在以下中：外周血液、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位组织、腹水、胸腔积液、脾组织、或肿瘤。在一些实施例中，用于调节的免疫细胞从以下分离：健康受检者；患有自体免疫性疾病、造血系统恶性肿瘤、病毒感染或实体瘤的受检者；以前被施用过基因修饰的免疫细胞的受检者；或者CMV血清阳性受检者。在一些其它实施例中，所分离的用于调节的免疫细胞被基因修饰(由重排、突变、基因印记和/或表观基因修饰被基因工程化，或者天然衍生自重排、突变、基因印记和/或表观基因修饰)。在一些实施例中，所分离的用于调节的免疫细胞包含至少一种基因修饰形态。在一些实施例中，所分离的免疫细胞群被基因组工程化并包含插入、缺失、和/或核酸置换。在一些特定实施例中，免疫细胞包含对T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、和/或CD16或其变体的过表达进行编码的外源核酸。照此，基因组修饰的免疫细胞被分离，以便使用如所公开的本发明组合物和方法进行离体调节。在一些实施例中，在调节之后，从受检者分离的基因组修饰的免疫细胞可给相同的供体或者不同的患者施用。
在一些实施例中，用于调节的免疫细胞从干细胞、造血干细胞或祖细胞、或者祖细胞体外分化。在一些实施例中，用于调节的免疫细胞从造血或非造血系的非多能细胞体外转分化。在一些实施例中，所述干细胞包含诱导性多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。在一些实施例中，所述祖细胞是CD34+血原性内皮细胞、多能祖细胞、T细胞祖细胞、NK祖细胞、或NKT祖细胞。在又一些其它实施例中，干细胞、造血干细胞或祖细胞、或者祖细胞被基因组工程化并包含插入、缺失、或核酸置换，并且/或者包含至少一种基因修饰形态。照此，从其衍生的期望的调节的免疫细胞亚群包含具有至少一种基因修饰形态的免疫细胞。在一个实施例中，期望的免疫细胞亚群包含具有至少一种基因修饰形态的CD57+NK细胞。
在一些实施例中，所述基因修饰形态包含安全开关蛋白、靶向形态、受体、信号传导分子，转录因子、药学活性的蛋白和肽、药物目标候选物；或者促进免疫细胞的植入、运输、归巢、活力、自我更新、持久性、免疫响应调节和调控、和/或存活的蛋白中的至少一种。在一些其它实施例中，基因修饰形态包含B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、OITA、RFX5、或RFXAP、以及染色体6p21区中的任何基因的缺失或表达减少中的一种或多种。在一些其它实施例中，基因修饰形态包含用来与双特异性或多特异性接合体或者通用接合体偶联的HLA-E、HLA-G、HACD16、hnCD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、Fc受体、或表面触发受体的表达引入或增强中的一种或多种。在一个实施例中，调节的免疫细胞的期望亚群中包含的CD57+NK细胞包含hnCD16的表达。在另一个实施例中，表达hnCD16的CD57+NK细胞进一步包含NKG2C+、低PLZF、低SYK、低FcεRγ、低EAT-2、低TIGIT、低PD1、低CD7、低CD161、高LILRB1、高CD45RO、以及低CD45RA中的至少一种。
在所述调节免疫细胞的方法的一些实施例中，组合物包含GSK3抑制剂作为调节剂。在一些实施例中，组合物进一步包含包括IL2、IL15、IL12、IL18以及IL21的刺激性细胞因子中的至少一种。在一些实施例中，包含GSK3抑制剂的组合物进一步包含MEK抑制剂、雷帕霉素、以及STING激动剂中的一种或多种。在一些实施例中，包含调节剂的组合物进一步包含至少一种选自由以下组成的群组的有机溶剂：二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲氧基乙烷(DME)、二甲基乙酰胺、乙醇及其组合。
在调节免疫细胞的方法的一些实施例中，所述“足够的时间”或“足够长的时间”不小于16小时、14小时、12小时、10小时、8小时、6小时、4小时、2小时、或者其间任意长度的时间。照此，所述足够长的时间(例如)不小于15、13、11、9、7、5、3、或1小时。在所述方法的一些其它实施例中，所述足够长的时间不小于24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、或者其间任意长度的时间。照此，所述足够长的时间(例如)不小于30、42、54、66、78、90小时。
在所述方法的一些实施例中，免疫细胞在调节期间和/或之后处于无饲养细胞的环境中。无饲养细胞的条件包括无饲养细胞，以及无经饲养细胞调理的培养基。在所述方法的一些实施例中，免疫细胞在调节期间与饲养细胞一起共培养。
本发明的另一个方面提供调节免疫细胞的方法，所述方法包含将免疫细胞与足够量的包含GSK3抑制剂的组合物接触，接触时间足以获得与未调节的免疫细胞相比针对过继性细胞疗法具有改进的治疗潜力的调节的免疫细胞群。
本发明的一个进一步的方面提供调节NK细胞的方法，所述方法包含将NK细胞与足够量的包含GSK3抑制剂的组合物接触，接触时间足以获得与未调节的NK细胞相比针对过继性细胞疗法具有改进的治疗潜力的调节的NK细胞。在所述通用方法的一些实施例中，调节的NK细胞具有改进的增殖、细胞毒性、细胞因子响应、细胞因子释放、细胞回忆、和/或持久性。在一些实施例中，调节的NK细胞具有改进的细胞扩增、维持、分化、去分化、和/或存活率。在一些实施例中，调节的NK细胞与未与包含GSK3抑制剂的组合物接触的NK细胞相比具有增加的一种或多种期望的NK细胞亚群的数量或比例。在一些实施例中，调节的NK细胞的改进特性是体外的。在一些实施例中，调节的NK细胞的改进特性是体内的。在一些实施例中，用于调节的NK细胞包含CD57-NK细胞。在一些实施例中，用于调节的NK细胞包含CD57-NKG2C+NK细胞。
在用GSK3抑制剂调节NK细胞的方法的一个实施例中，所述方法进一步包含从调节的NK细胞分离一种或多种期望的亚群。在一些实施例中，所述一种或多种期望的NK细胞亚群包含CD57+NK细胞。在一些实施例中，所述CD57+NK细胞包含适应性NK细胞。在一些实施例中，所述适应性NK细胞包含CD57+以及NKG2C+、低PLZF、低SYK、低FcεRγ、低EAT-2、低TIGIT、低PD1、低CD7、低CD161、高LILRB1、高CD45RO和低CD45RA中的至少一种。
在所述调节NK细胞的方法的一些实施例中，用于调节的NK细胞从以下分离或者包含在以下中：外周血液、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位组织、腹水、胸腔积液、脾组织、或肿瘤。在一个实施例中，NK细胞从健康受检者分离。在另一个实施例中，NK细胞从患有自体免疫性疾病、造血系统恶性肿瘤、病毒感染或实体瘤的受检者分离。在一个实施例中，NK细胞从以前被施用过基因修饰的免疫细胞的受检者分离；在又一个实施例中，用于调节的NK细胞从CMV血清阳性受检者分离。在一些其它实施例中，所分离的用于调节的免疫细胞被基因修饰(由重排、突变、基因印记和/或表观基因修饰被基因工程化，或者天然衍生自重排、突变、基因印记和/或表观基因修饰)。在一些实施例中，所分离的用于调节的免疫细胞包含至少一种基因修饰形态。在一些实施例中，所分离的免疫细胞群被基因组工程化并包含插入、缺失、和/或核酸置换。在一些特定实施例中，免疫细胞包含对T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、和/或CD16或其变体的过表达进行编码的外源核酸。照此，基因修饰的免疫细胞被分离，以便使用如所公开的本发明组合物和方法进行离体调节。在一些实施例中，在调节之后，从受检者分离的基因修饰的免疫细胞可给相同的供体或者不同的患者施用。
在一些其它实施例中，用于调节的NK细胞被基因组工程化并包含插入、缺失、或核酸置换。在一个实施例中，用于调节的NK细胞包含至少一种基因修饰形态。在另一个实施例中，用于调节的NK细胞从干细胞、造血干细胞或祖细胞、或者祖细胞体外分化；或者从造血或非造血系的非多能细胞体外转分化。在一些实施例中，以上所述干细胞包含诱导性多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。在一些实施例中，所述祖细胞是CD34+血原性内皮细胞、多能祖细胞、或NK祖细胞。在一些特定实施例中，以上所述干细胞、造血干细胞或祖细胞、或者祖细胞被基因组工程化并包含插入、缺失、或核酸置换。在一个实施例中，以上所述干细胞、造血干细胞或祖细胞、或者祖细胞包含至少一种基因修饰形态。包含至少一种基因修饰形态的所述干细胞、造血干细胞或祖细胞、或者祖细胞可用来产生包括NK细胞的分化免疫细胞。
在一个实施例中，调节的和衍生的NK细胞的期望亚群包含具有至少一种基因修饰形态的NK细胞。在一个实施例中，调节的NK细胞的期望亚群包含具有至少一种基因修饰形态的CD57+NK细胞。在一些实施例中，基因修饰形态包含以下中的至少一种：安全开关蛋白、靶向形态、受体、信号传导分子，转录因子、药学活性的蛋白和肽、药物目标候选物；或者促进免疫细胞的植入、运输、归巢、活力、自我更新、持久性、免疫响应调节和调控、和/或存活的蛋白。在一些其它实施例中，基因修饰形态包含以下中的一种或多种：(i)B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、或RFXAP、以及染色体6p21区中的任何基因的缺失或表达减少；以及(ii)用来与双特异性或多特异性接合体或者通用接合体偶联的HLA-E、HLA-QHACD16、hnCD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、Fc受体、或表面触发受体的表达引入或增强。在一个特定实施例中，CD57+NK细胞包含hnCD16的表达。在另一个实施例中，表达hnCD16的CD57+NK细胞进一步包含NKG2C+、低PLZF、低SYK、低FcεRγ、低EAT-2、低TIGIT、低PD1、低CD7、低CD161、高LILRB1、高CD45RO、以及低CD45RA中的至少一种。
在所述方法的某个实施例中，包含GSK3抑制剂的组合物进一步包含包含IL2、IL15、IL12、IL18以及IL21的刺激性细胞因子中的至少一种。在一个实施例中，包含GSK3抑制剂的组合物进一步包含MEK抑制剂、雷帕霉素、以及STING激动剂中的一种或多种。在所述方法的某个实施例中，包含GSK3抑制剂的组合物进一步包含至少一种选自由以下组成的群组的有机溶剂：二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲氧基乙烷(DME)、二甲基乙酰胺、乙醇及其组合。
在一些实施例中，GSK3抑制剂为CHIR99021、BIO、TWS119、或坎帕罗酮。在一个实施例中，GSK3抑制剂为CHIR99021。在一些实施例中，对于GSK3抑制剂调节足够的时间不小于16小时。在一些实施例中，调节的NK细胞具有增加至少2倍的扩增。在一些其它实施例中，调节的NK细胞具有增加的包含IFNγ和/或TNFα的一种或多种细胞因子的产生。在又一些其它实施例中，一种或多种数量或比例增加的NK细胞的亚群包含适应性NK细胞；表达CD57的NK细胞；或者表达CD57和NKG2C的细胞。在一个实施例中，该方法在无饲养细胞的环境中进行。在所述方法的一些实施例中，免疫细胞在添加过程中与饲养细胞一起共培养。
还提供培养免疫细胞群的方法，其包含将所述群与包含GSK3抑制剂的组合物接触，从而在所述群中获得选择性扩增的NK细胞。所述方法进一步包含在免疫细胞与包含GSK3抑制剂的组合物接触之前从受检者获得免疫细胞群，其中所述免疫细胞包含外周血单核细胞；并从外周血单核细胞的群去除CD3和CD19细胞。在一些实施例中，受检者是健康的；是患有自体免疫性疾病、造血系统恶性肿瘤、vims感染或实体瘤的受检者；或是CMV血清阳性受检者，或者可在以前被施用过基因修饰的免疫细胞。在一些实施例中，在与未与包含GSK3抑制剂的组合物接触的NK细胞相比时，扩增的NK细胞具有改进的细胞毒性和细胞因子响应和分泌；具有改进的增殖、细胞回忆、和/或持久性；具有改进的细胞扩增和/或维持；具有增加的亚型变为成熟的倾向；在细胞群中具有增加数量或比例的一种或多种亚群；和/或维持类似适应性/记忆性细胞的状态。在一些实施例中，调节的NK细胞具有增加至少2倍的扩增。在一些其它实施例中，调节的NK细胞具有增加的包含IFNγ和/或TNFα的一种或多种细胞因子的产生。在又一些其它实施例中，一种或多种数量或比例增加的NK细胞的亚群包含：适应性NK细胞；表达CD57的NK细胞；或表达CD57和NKG2C的细胞。在一个实施例中，该方法在无饲养细胞的环境中进行。在一些实施例中，该方法在与饲养细胞共培养的情况下进行。在一些其它实施例中，包含GSK3抑制剂的组合物进一步包含IL15、IL12、IL18、MEK抑制剂、以及雷帕霉素中的一种或多种。在一个实施例中，GSK3抑制剂为CHIR999021。
进一步提供包含免疫细胞群的组合物和包含GSK3抑制剂的组合物，其中在用包含GSK3抑制剂的组合物对所述群进行调节时所述群包含针对过继性细胞疗法具有改进的免疫细胞治疗潜力的免疫细胞。
本申请的又一个方面提供调节适应性NK细胞的方法，其包含将包含适应性NK细胞的免疫细胞群与足够量的包含GSK3抑制剂的组合物接触，接触时间足以获得调节的适应性NK细胞的群。所述方法可进一步包含从受检者获得免疫细胞群，并在免疫细胞与包含GSK3抑制剂的组合物接触之前从所获得的免疫细胞群去除CD3和/或CD19细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包含在免疫细胞与包含GSK3抑制剂的组合物接触的步骤之前或期间激活免疫细胞群。在一些实施例中，调节的适应性NK细胞与未与包含GSK3抑制剂的组合物接触的适应性NK细胞相比具有：改进的细胞毒性和细胞因子响应和分泌；改进的增殖、细胞回忆、和/或持久性；和/或改进的细胞扩增和/或维持。在一些实施例中，免疫细胞群中包含的调节的适应性NK细胞在与包含GSK3抑制剂的组合物接触之后具有增加至少2倍的扩增。在一个实施例中，该方法在无饲养细胞的环境中进行。在一个实施例中，该方法使用饲养细胞进行。在一些其它实施例中，包含GSK3抑制剂的组合物进一步包含IL15、IL12、IL18、IL21、MEK抑制剂、雷帕霉素、以及STING激动剂中的一种或多种。在一个实施例中，GSK3抑制剂是CHIR999021。还提供调节的NK细胞群，其与未调节的NK细胞相比在CD107a、NKG2C、NKG2D、CD16、KIR、CD2、NKp30、NKp44以及NKp46中的一种或多种中具有增加的表达，其中它们的表达被增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
本发明的一个进一步的方面提供使用以上免疫细胞调节方法来制备用于细胞疗法的包含调节的免疫细胞的治疗组合物。在一些实施例中，调节的免疫细胞包含T细胞、NK细胞和/或NKT细胞。在一些实施例中，调节的NK细胞包含适应性NK细胞。本发明的一个另外的方面提供调节的免疫细胞的群，其包含通过本文所提供的方法制备的选择性扩增的NK细胞。
本发明的又一个方面提供一种治疗组合物，其包含使用本文所公开的方法和组合物获得的调节的细胞和药学上可接受的介质。在治疗组合物的一些实施例中，所述组合物进一步包含一种或多种选自由以下组成的群组的另外的添加剂：肽、细胞因子、有丝分裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或置换因子、包含一种或多种目标多核酸的载体、抗体、化疗剂或放射性部分、以及免疫调节药物(IMiD)。
进一步提供通过给需要过继性细胞疗法的受检者施用治疗足够量的以上所述治疗组合物来治疗受检者的方法。在一些实施例中，细胞疗法是同种自体的。在一些其它实施例中，细胞疗法是同种异体的。在一些实施例中，需要所述疗法的受检者患有自身免疫性疾病、血液系统恶性肿瘤、实体瘤、癌症、或者与HIV、RSV、EBV、CMV、腺病毒、或BK多瘤病毒相关的感染。在一些实施例中，使用调节的免疫细胞治疗受检者的方法通过与抗体治疗、化疗、或放疗一起组合施用所述治疗组合物来进行，其中所述抗体治疗、化疗、或放疗在施用治疗组合物之前、期间或之后进行。
本发明的再一个方面提供一种混合物用来根据本文所提供的方法制造用于细胞疗法的治疗组合物的用途，并且用于制造的混合物包含分离的免疫细胞群，以及包含GSK3抑制剂的用于免疫细胞调节的组合物，
该用途的各种目的和优势从以下描述结合所给出的附图以及通过说明和实例的方式给出的本发明的某些实施例将变得显而易见。
附图说明
图1是(A)活CD8+细胞群和(B)活CD4+细胞群中共表达CCR7和CD62L两者的细胞的百分比的Z分数、以及初始T细胞、干细胞记忆性T细胞、或中央记忆性T细胞的绝对数量的相对量度的图示。
图2是显示多天培养方法选择性地扩增源自PBMC的NK细胞而不是T细胞的图示。示出了来自单采血液成分术产物的CD56+和CD3+细胞在去除之前(左侧)和去除之后(中间)以及用IL-15(10ng/mL)加5μM CHIR99021培养7天之后(右侧)的百分比。
图3是显示多天GSK3i培养方法相对于目前的方法增加完全NK细胞的纯度、数量和适应性NK细胞的数量的图示。
图4是显示GSK抑制是7天培养中的关键试剂的图示，其有效扩大NK细胞扩增，将所述群变为适应性(NKG2C+/CD57+)和完全CD57+亚群。A.细胞数量增加倍数。B.细胞百分比。
图5是显示GSK3抑制驱动未成熟的NK细胞成熟的图示。A.门控策略以及7天的GSK3i培养时段之后的细胞象限。B.每个细胞象限中的细胞增殖和细胞表面标记的表达。
图6A-G是显示GSK3抑制增强细胞的细胞毒性的图示。A.K562细胞特异性杀伤。B.Raji细胞特异性杀伤。C.和D.用GSK3抑制剂培养的NK细胞具有增加的杀伤SKOV-3细胞的动力学。E.GSK抑制扩增的适应性NK增强对SKOV3的杀伤，其进一步被Her2ADCC协同杀伤。F.和G.7天的GSK3抑制剂处理增强ADCC介导的A549细胞的杀伤。
图7是显示GSK3抑制增强NK细胞的细胞因子响应的图示。A.IFNγ。B.TNFα。
图8是显示GSK3抑制和GSK3i/MEKi/雷帕霉素组合在K562饲养细胞的存在下增强NK增殖并扩大NK亚型的倾向性的图示。A.NK细胞总数。B.CD57+NK细胞总数。C.NKG2C+NK细胞总数。
图9是显示用GSK3i体外培养7天的NK细胞在被转移之后并且在不存在小分子的情况下在至少1周内保持其体内表型变化的图示。A.CD57+细胞群的百分比。B.NK细胞亚群的群的百分比。
图10是显示经GSK3抑制剂培养的NK细胞的体内肿瘤清除能力的图示。
图11显示GSK3抑制剂处理在短期内不导致更高发生率的CD56+CD57+细胞。A.在使用和不使用GSK3抑制剂的情况下培养16小时的培养物中的CD57+NK部分。B.在使用和不使用GSK3抑制剂的情况下培养0至7天的培养物中的CD57+NK部分。
图12显示经GSK3抑制剂处理多天的NK细胞针对SKOV-3细胞在体内是高效的。A.NK细胞ADCC杀伤化验，使用：单独的赫赛汀、过夜激活的NK细胞加赫赛汀、经载体处理7天的NK细胞加赫赛汀、或者经GSK3抑制剂处理7天的NK细胞加赫赛汀。B.在不同的处理下使用细胞进行ADCC杀伤的作用的对比。
图13显示经GSK3抑制剂处理多天的NK细胞相对于过夜激活的NK细胞针对初级AML胚细胞的细胞毒性：A.AML供体1；B.AML供体2；C.AML供体3。
图14显示在K562肿瘤细胞与PBMC混合的双靶标细胞毒性化验中GSK3i调节的NK细胞针对恶性细胞但不是同种异体的PBMC的细胞毒性：A.PBMC供体1；B.PBMC供体2；C.PBMC供体3；D.PBMC供体4。
图15显示STING激动剂ML RR-S2 CDA对(A)完全CD57+NK的数量，和(B)CD57+NKG2C+NK表型具有有限的影响。
图16显示与GSK3i一起添加STING激动剂在使用IL-12细胞+IL-18细胞或K562细胞刺激4小时之后增加A.IFNy；和B.TNFa NK细胞的产生。STING激动剂与GSK3i一起在刺激之后还增加CD107a+NK细胞的发生率(C)。
图17显示在使用A.K562、B.Nalm6、以及C.KG-1作为靶细胞的直接杀伤化验中添加STING激动剂增强GSK3抑制剂处理的NK的细胞毒性。
图18显示STING激动剂与GSK3抑制剂协同增强对目标细胞的杀伤。GSK3抑制剂与STING激动剂的组合在使用抗Her2抗体的ADCC化验中增强NK细胞针对A.A549和B.SKOV-3目标细胞的细胞毒性。
图19显示GSK3抑制剂与STING激动剂的组合增强NK细胞上NKp30的表达。
具体实施方式
本发明提供调节免疫细胞群或亚群以便针对过继性免疫疗法获得改进的治疗潜力的组合物和方法。本发明还提供使用具有改进的治疗潜力的调节的免疫细胞的方法。一般而言，具有改进的治疗潜力的免疫细胞展现出以下中的至少一种：改进的增殖、持久性、细胞毒性、和/或细胞回忆/记忆。本发明提供通过改进免疫细胞的质量来改进免疫细胞治疗潜力的方法——例如，在以下特质中的至少一种中显示出改进的细胞亚群的数量或比例的增加预期会产生更好的免疫治疗结果：相同细胞的迁移、归巢、细胞毒性、维持、扩增、持久性、长寿、分化、和/或去分化。
定义
除非本文中另外定义，否则关于本申请使用的科学术语和技术术语应具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。
应理解，本发明并不局限于本文所述的特定的方法、方案、以及试剂等，因此可有所变化。本文使用的术语仅仅是为了说明特定实施例的目的，并非旨在限制本发明的范围，本发明的范围只由权利要求书界定。
如本文所使用，冠词“a”、“an”、以及“the”是指一种(或一个)或多于一种(或一个)的该冠词的语法受检者。举例来说，“a”T细胞意思是一种T细胞或多于一种的T细胞。
如本文所使用，术语“T淋巴细胞”和“T细胞”可互换使用，并且是指一种主要类型的白细胞，其在胸腺中成熟，并在免疫系统中起各种作用，包括识别身体中特定的外部抗原，以及对其它免疫细胞进行激活和去活。T细胞可以是任何T细胞，比如培养的T细胞，例如原代T细胞，或者来自培养的T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupT1等，或者从哺乳动物获得的T细胞。T细胞可以是CD3+细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞，并且可处于任何发育阶段，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助性T细胞(例如Th1和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如细胞毒性T细胞)、外周血单核细胞(PBMC)、外周血白细胞(PBL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、记忆性T细胞、初始T细胞、调节性T细胞、伽马德尔塔T细胞(γδT细胞)等。其它类型的辅助性T细胞包括像Th3、Thl7、Th9、或Tfh细胞这样的细胞。其它类型的记忆性T细胞包括像中央记忆性T细胞(Tcm细胞)、效应记忆性T细胞(Tern细胞和TEMRA细胞)这样的细胞。T细胞还可以指基因工程化的T细胞，比如被修饰为表达T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。T细胞还可从干细胞或祖细胞分化。
如本文所使用，术语“初始T细胞”或Tn是指成熟的T细胞，其与激活的T细胞或记忆性T细胞不同，尚未与周围的其同源抗原接触。初始T细胞通常被表征为表面表达L-选择素(CD62L)；缺少激活标记CD25、CD44或CD69；并且缺少记忆性CD45RO异构体。它们还表达功能性IL-7受体，其由亚基IL-7受体-α、CD127、以及共用-γ链CD132组成。在初始状态中，T细胞被认为是静止的和非分裂的，需要共用-γ链细胞因子IL-7和IL-15进行内稳态存活机制。
如本文所使用，术语“中央记忆性T细胞”或Tcm是指这样的T细胞小群或亚群：其与效应记忆性T细胞或Tern相比具有更低的表达或促细胞凋亡的信号转导基因，例如Bid、Bnip3以及Bad，并具有与向二级淋巴器官运输相关的基因的更高表达，所述基因包括CD62L、CXCR3、CCR7。
如本文所使用，术语“干记忆性T细胞”或“干细胞记忆性T细胞”或Tscm是指这样的T细胞小群或亚群：其能够自体更新并能够产生Tcm、Tern以及Teff(效应T细胞)，并表达CD27和淋巴归巢分子，比如CCR7和CD62L，这是对于介导长期免疫重要的特性。
如本文所使用，术语“NK细胞”或“自然杀伤细胞”是指外周血淋巴细胞亚群，其被界定为表达CD56或CD16并缺少T细胞受体(CD3)。如本文所使用，术语“适应性NK细胞”和“记忆性NK细胞”可互换，并且是指NK细胞亚群，其在表型上是CD3-和CD56+，并且具有CD57+、NKG2C+、低PLZF、低SYK、低FcεRγ、低EAT-2、低TIGIT、低PD1、低CD7、低CD161、高LILRB1、高CD45RO、以及低CD45RA中的至少一种。在一些实施例中，分离的CD56+NK细胞亚群包含NKG2C和CD57的表达。在一些其它实施例中，分离的CD56+NK细胞亚群包含CD57、CD16、NKG2C、CD57、NKG2D、NCR配体、NKp30、NKp40、NKp46、激活性和抑制性KIRs、NKG2A和/或DNAM-1的表达。CD56+可以是暗表达或明表达。
如本文所使用，术语“NKT细胞”或“自然杀伤T细胞”是指CD1d受限的T细胞，其表达T细胞受体(TCR)。与检测由常规主要组织相容性(MHC)分子提供的肽抗原的常规T细胞不同，NKT细胞识别由CD Id(一种非典型的MHC分子)呈现的脂类抗原。目前已经识别两种类型的NKT细胞。不变性NKT细胞或I型NKT细胞表达非常有限的TCR库——与有限系列的β链(人类中的Vβ11)相关的标准α-链(人类中的Vα24-Jα18)。第二种NKT细胞群被称作非典型性或非不变性的II型NKT细胞，显示出更异质性的TCRαβ使用。目前认为I型NKT细胞适合免疫疗法。适应性或不变性(I型)的NKT细胞可通过以下标记中的至少一种或多种的表达来识别：TCR Va24-Jal8、Vb11、CDld、CD3、CD4、CD8、aGalCer、CD161以及CD56。
如本文所使用，术语“分离的”等是指细胞或细胞群已经从其原始环境分离，即分离的细胞的环境基本上不含“未分离的”参照细胞存在于其中的环境中发现的至少一种组分。该术语包括在其天然环境(例如组织、活检组织)中发现的从一些组分或全部组分除去的细胞。该术语还包括在非天然存在的环境(例如培养物、细胞悬浮液)中发现的从至少一种、一些或全部组分除去的细胞。因此，分离的细胞部分或全部从至少一种组分除去，包括自然中发现的或非天然存在的环境中生长、储存或给养的其它物质、细胞或细胞群。分离的细胞的特定实例包括部分纯的细胞、基本上纯的细胞以及非天然存在的培养基中培养的细胞。分离的细胞可通过将期望的细胞或其群从环境中的其它物质或细胞分离来获得，或者通过将一种或多种其它细胞群或亚群从环境除去来获得。如本文所使用，术语“纯化”等是指增加纯度。例如，纯度可被增加至至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％.
如本文所使用，术语“群”当关于T、NK或NKT细胞使用时分别是指包括两种或更多种T、NK、或NKT细胞的一组细胞。使用T细胞作为实例，分离的或富集的T细胞群可包括仅一种类型的T细胞，或者可包括两种或更多种类型的T细胞的混合物。分离的T细胞群可以是一种类型的T细胞的同质群或者两种或更多种类型的T细胞的异质群。分离的T细胞群还可以是具有T细胞和至少一种T细胞之外的细胞(例如B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、红血细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌细胞、脑细胞等)的异质群。异质群可具有从0.01％至约100％的T细胞。因此，分离的T细胞群可具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、或99％的T细胞。分离的T细胞群可包括一种或多种或者全部不同类型的T细胞，包括但不限于本文公开的那些。在包括多于一种类型的T细胞的分离的T细胞群中，每种类型的T细胞的比例范围可从0.01％至99.99％。分离的群还可以是克隆的T细胞群，其中群中的所有T细胞都是单一T细胞的克隆。
分离的T、NK或NKT细胞的群可从像人类外周血或脐带血这样的天然来源获得。本领域中已经开发了将细胞从组织或细胞混合物解离以分离各种细胞类型的各种方法。在一些情况下，这些操控产生相对同质的细胞群。T细胞可通过如本文所述的分选或选择方法或通过本领域已知的其它方法分离。T细胞在分离的群中的比例可比T细胞在天然来源中的比例高至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、或约95％。分离的T细胞群可针对总体上的T细胞，或者针对一种或多种特定类型的T细胞。
如本文所使用，术语“亚群”当关于T、NK或NKT细胞使用时是指T、NK或NKT细胞的群，其分别包括少于所有类型的自然中发现的T、NK、或NKT细胞。
如本文所使用，术语“多能的”是指细胞形成身体或躯体(即胚体)的所有谱系的能力。例如，胚胎干细胞是一种类型的多能干细胞，其能够从外胚层、中胚层、以及内胚层这三个胚层中的每一层形成细胞。多能性是从不能产生完整生物体的不完全多能的或部分多能的细胞(例如外胚层干细胞或EpiSC)至能够产生完整生物体的更原始、更多能的细胞(例如胚胎干细胞)的发育能力连续体。
如本文所使用，术语“诱导性多能干细胞”或者“iPSC”是指从分化的成体细胞产生的干细胞，其已经被诱导或改变(即重编码)为能够分化成所有三个胚层或真皮层(中胚层、内胚层、以及外胚层)组织的细胞。
如本文所使用，术语“胚胎干细胞”是指天然存在的胚胎胚泡的内细胞团的多能干细胞。胚胎干细胞是多能的，并且在发育过程中产生三个初级胚层(外胚层、内胚层以及中胚层)的所有衍生物。它们不促成胚外膜或胎盘，因此不是全能的。
如本文所使用，术语“祖细胞”是指具有更大发育潜能的细胞，即比可通过将其分化产生的细胞更原始的(例如处于发育途径或发育进程中更早的阶段)细胞表型。祖细胞经常具有显著的或非常高的增殖潜能。祖细胞可产生多种不同的具有更低发育潜能的细胞，即分化的细胞类型，或者产生单一分化的细胞类型，这取决于发育途径，并取决于细胞发育和分化的环境。
如本文所使用，术语“重编码”或“去分化”或“增加细胞潜能”或“增加发育能力”是指增加细胞的潜能或者将细胞去分化为更低分化状态的方法。例如，具有增加的细胞潜能的细胞与处于非重编码状态的相同细胞相比具有更大的发育可塑性(即可分化为更多的细胞类型)。也就是说，重编码的细胞是与处于非重编码状态的相同细胞相比处于更低分化状态的细胞。
如本文所使用，术语“分化”是这样的方法，通过其非特化的(“未定型的”)或更低特化的细胞获得像(例如)血细胞或肌细胞这样的特化细胞的特征。分化的或分化诱导的细胞是处于细胞谱系中更特化的(“定型的”)位置的细胞。术语“定型的”当应用于分化方法时是指在分化途径中已经进行到某一点的细胞，到所述点时，在正常情况下它会继续分化为特定的细胞类型或细胞类型的亚群，但在正常情况下不能分化为不同的T细胞类型或返回到更低分化的细胞类型。
如本文所使用，术语“编码”是指多聚核苷酸中特定的核苷酸序列(比如基因、cDNA、或mRNA)充当在生物过程中用于合成具有确定顺序的核苷酸(即rRNA、tRNA以及mRNA)或者确定顺序的氨基酸、以及从其产生的生物特性的其它聚合物和大分子的模板的固有特性。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白，那么基因就编码蛋白。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同，并且通常在序列列表中给出)和非编码链(用作转录基因或cDNA的模板)两者可被称为编码该蛋白或该基因或cDNA的其它产物。
如本文所使用，术语“外源性的”旨在表示提及的分子或提及的活性被引入宿主细胞。可(例如)通过将编码核酸引入宿主基因物质中(比如通过整合到宿主染色体中或者整合到像质粒这样的非染色体基因物质中)来引入分子。因此，当关于表达编码核酸使用时该术语是指将可表达形式的编码核酸引入细胞中。术语“内源性的”是指提及的分子或活性，其存在于宿主细胞中。类似地，当关于表达编码核酸使用时该术语是指表达细胞中含有的而不是外源性引入的编码核酸。
如本文所使用，术语“多聚核苷酸”是指任何长度的聚合形式的核苷酸，不管是去氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或是其类似物。多聚核苷酸的序列由四个核苷酸碱基构成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；当多聚核苷酸是RNA时用尿嘧啶(U)替代胸腺嘧啶。多聚核苷酸可包括基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标志)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多聚核苷酸、支化的多聚核苷酸、质粒、载体、任何顺序的分离的DNA、任何顺序的分离的RNA、核酸探针以及引物。多聚核苷酸还指双链和单链分子两者。
如本文所使用，术语“肽”、“多肽”、以及“蛋白”可互换使用，并且是指具有通过肽键共价连接的氨基酸残基的分子。多肽必须含有至少两个氨基酸，而对于多肽的氨基酸的最大数量则没有限制。如本文所使用，该术语是指短链，其在本领域中通常被称作(例如)肽、寡肽以及低聚物，还指长链，其在本领域中通常称作被多肽或蛋白。“多肽”包括(例如)生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然多肽、重组多肽、合成多肽、或其组合。
如本文所使用，术语“离体”是指在生物体外面发生的活动，例如在生物体外的人工环境(优选对自然条件的改变最小)中的活组织中或活组织上进行的试验或测量。“离体”步骤可涉及从生物体获取的以及在实验室设备中培养的活细胞或组织，通常在无菌条件下，并且通常进行几个小时或高达约24小时，但是包括高达2至28天，这要随情况而定。这种组织或细胞还可被收集和冷冻，并在之后融化以进行离体处理。使用活细胞或组织进行的持续几天以上的组织培养试验或步骤通常被看作是“体外”的，尽管在某些实施例中该术语可与离体互换使用。同时，“体内”活动在生物体内发生，例如细胞植入、细胞归巢、细胞自我更新、以及细胞扩增。
如本文所使用，术语“体外”是指在试管、培养盘、或者活生物体外的其它地方中执行或发生的活动。
如本文所使用，术语“药剂”、“调节试剂”、以及“调节剂”在本文中可互换使用，是指能够修改基因表达方案或细胞(包括免疫细胞)生物特性的化合物或分子。所述药剂可以是单独的化合物或分子，或者多于一种的化合物或分子的组合。
如本文所使用，术语“接触”、“处理”、或“调节”当关于免疫细胞使用时在本文中可互换使用，是指用一种或多种本文所公开的药剂培养、孵育或曝露免疫细胞。
如本文所使用，“非接触的”或“未处理的”细胞是尚未被处理(例如用对照药剂之外的药剂培养、接触、或孵育)的细胞。与像DMSO这样的对照药剂接触、或者与另一种载体接触的细胞是非接触细胞的实例。
如本文所使用，“饲养细胞(feeder cell)”或“饲养细胞(feeder)”是描述一种类型的细胞的术语，所述细胞与第二种类型的细胞共培养以便提供第二种类型的细胞可在其中生长的环境，这是因为饲养细胞提供刺激、生长因子以及营养物以支持第二种细胞类型。饲养细胞任选地来自与它们支持的细胞不同的种类。例如，某些类型的人类细胞，包括干细胞，可由小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养物、或永生化的小鼠胚胎成纤维细胞支持。在另一个实例中，来源于外周血的细胞或转化的白血病细胞支持自然杀伤细胞的扩增和成熟。当与其它细胞共培养时，饲养细胞通常可通过用像丝裂霉素这样的抗有丝分裂剂辐射或处理来去活，以防止它们长得比它们支持的细胞更快。饲养细胞可包括内皮细胞、基质细胞(例如上皮细胞或成纤维细胞)、以及白血病细胞。不对以上进行限制，一种特定的饲养细胞类型可以是人类饲养细胞，比如人类皮肤成纤维细胞。另一种饲养细胞类型可以是小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。一般而言，各种饲养细胞可部分用来维持多能性，直接分化为某些谱系，增强增殖能力，并促进成熟为像效应细胞这样的特化细胞类型。
如本文所使用，“无饲养细胞的”(FF)环境是指像培养条件、细胞培养物或培养基这样的环境，其基本上不含饲养细胞或基质细胞，并且/或者尚未通过培养饲养细胞预调理。“预调理的”培养基是指饲养细胞在培养基中培养一段时间(比如至少1天)之后收集的培养基。预调理的培养基含有许多介体物质，包括由培养基中培养的饲养细胞分泌的生长因子和细胞因子。在一些实施例中，无饲养细胞的环境不含饲养细胞或基质细胞两者，并且也未通过培养饲养细胞进行预调理。
如本文所使用，术语“类似物”是指在结构和功能上与另一种化学物质类似的化学分子，如果它保持与母化学体相同的化学骨架和功能，那么在结构上的不同在于一个单独的元素或基团、或多于一个基团(例如2个、3个、或4个基团)。这种修饰对于本领域技术人员而言是常规的，并且包括(例如)另外的或取代的化学基团，比如酸的酯或酰胺，保护基团，比如用于醇或硫醇的苄基，以及用于胺的叔丁氧羰基。还包括对烷基侧链的修饰(比如烷基取代(例如甲基、二甲基、乙基等)、对侧链的饱和度或不饱和度的修饰、以及添加修饰的基团(比如取代的苯基和苯氧基)。类似物还可包括缀合物，比如生物素或抗生物素蛋白基团，酶(比如辣根过氧化酶等)，并且包括放射性标记的、生物发光的、化学发光的、或荧光的基团。还可将多个基团加入本文所述的药剂中以改变其药动学特性，比如在其它期望的特性之外增加体内或离体半衰期，或增加其细胞渗透特性。还包括前药，已知其会增强许多期望的药物特质(例如溶解性、生物利用度、制造等)。
如本文所使用，术语“增加”是指与由载体或对照分子/组合物引起的响应相比药剂在细胞中产生或引起更大的生理响应(即下游作用)的能力，例如通过分离的T细胞群增加白细胞介素4或白细胞介素10的产生。所述增加可以是由于通过某些细胞信号转导通路增加信号转导而引起的基因表达的增加。“增加的”量通常是统计上显著的量，并且与由载体(缺少药剂)或对照组合物产生的响应相比可包括1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如500、1000倍)(包括所有整数和其间的小数点并且高于1，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加。
如本文所使用，术语“降低”是指与由载体或对照分子/组合物引起的响应相比药剂在细胞中产生或引起更小的生理响应(即下游作用)的能力。降低可以是基因表达的降低、细胞信号转导的降低、或细胞增殖的降低。“降低的”量通常是“统计上显著的”量，并且与由载体(缺少药剂)或对照组合物引起的响应相比可包括1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如500、1000倍)(包括所有整数和其间的小数点并且高于1，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的降低。
如本文所使用，与“拮抗性的”(当两种或更多种实体组合时抵消或中和彼此的作用时使用)相比，并且与“加成的”(当两种或更多种实体组合时产生几乎等于其单独作用的总和的作用时使用)相比，术语“协同作用”或“协同性的”是指两种或更多种实体组合时产生增强的作用，从而使得两种或更多种实体的共同作用会产生大于其单独作用的总和的作用。
如本文所使用，术语“基本上不含”在用来描述像细胞群或培养基这样的组合物时是指不含所指定的任何来源的物质的组合物，例如95％不含、96％不含、97％不含、98％不含、99％不含所指定的物质，或者通过常规方式测量是探测不到的。类似的含义在提到缺少组合物的特定物质或组分时可应用于术语“缺少”。
如本文所使用，术语“约”或“大约”是指量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的改变最多是基准量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的15％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％或1％。量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的范围可以是基准量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的范围的约±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％、或±1％。
如本文所使用，术语“受检者”是指哺乳动物。受检者可以是人类或非人类哺乳动物，比如狗、猫、牛、马、小鼠、大鼠、兔、或其转基因物种。
如本文所使用，术语“治疗”等当关于受检者使用时是指获得期望的药理作用和/或生理作用，包括但不限于获得疾病症状的改善或消除。所述作用在完全或部分预防疾病或其症状方面可以是预防性的，并且/或者在达到症状的改善或消除方面，或者在针对疾病和/或由疾病引起的副作用提供部分或完全治愈方面可以是治疗性的。术语“治疗”包括对哺乳动物中(特别是人类中)任何疾病的治疗，并且包括：(a)防止疾病在可能容易患上所述疾病但尚未诊断患有所述疾病的受检者中发生；(b)抑制疾病，或阻止其进展；(c)缓解疾病，或者引起疾病消退，或者完全或部分消除疾病症状；以及(d)使个体恢复至疾病前状态，例如重建造血系统。
如本文所使用，“基因修饰”是指基因编辑，包括(1)天然衍生自重排、突变、基因印记和/或表观基因修饰的那些，(2)或者通过在细胞的基因组中插入、缺失或取代进行基因组工程化而获得的那些。如本文所使用，基因修饰还包括供体特异性的、疾病特异性的、或治疗响应特异性的来源特异性的免疫细胞的一种或多种可保持的治疗特性。
如本文所使用，术语“基因印记”是指在来源细胞中促成优选的治疗特性的基因或表观遗传信息。在从特定选择的供体、疾病或治疗环境获得的来源细胞方面，促成优选的治疗特性的基因印记可包括任何环境特异性的基因或表观基因修饰，其显现出可保持的表型，即优选的治疗特性，不管潜在的分子事件被确认还是未被确认。供体特异性的、疾病特异性的、或治疗响应特异性的来源细胞可包含可在iPSC和衍生的造血谱系细胞中保持的基因印记，所述基因印记包括但不限于，预先准备的单特异性的TCR，例如来自病毒特异性的T细胞或不变性的自然杀伤T(iNKT)细胞；可跟踪的且期望的基因多态性，例如在所选供体中针对高亲和性CD16受体进行编码的点突变是纯合的；以及预定的HLA要求，即所选匹配HLA的供体细胞通过增加的群展现出单倍体。如本文所使用，优选的治疗特性包括衍生细胞的改进的植入、运输、归巢、活力、自我更新、持久性、免疫响应调节和调控、存活、以及细胞毒性。优选的治疗特性还可涉及抗原靶向受体表达；HLA呈递或HLA呈递的缺少；对肿瘤微环境的抗性；旁观免疫细胞和免疫调节的诱导；在靶特异性改进，脱肿瘤作用降低；对像化疗这样的治疗的抗性。
如本文所使用，术语“安全开关蛋白”是指被设计成预防细胞疗法潜在的毒性或另外的副作用的工程化蛋白。在一些情况下，对安全开关蛋白的表达进行有条件的控制，以解决移植的工程化细胞的安全性问题，所述移植的工程化细胞已经与将安全开关蛋白编码到其基因组中的基因永久结合。该有条件的调节可能是多变的，并且可能包括通过小分子介导的翻译后激活以及组织特异性的和/或暂时的转录调节进行控制。安全开关可介导细胞凋亡的诱导、蛋白合成的抑制、DNA复制、生长抑制、转录和转录后的基因调节和/或抗体介导的去除。在某个情况下，安全开关蛋白通过外源性的分子(例如前药)激活，安全开关蛋白在被激活时触发治疗性细胞的细胞凋亡和/或细胞死亡。安全开关蛋白的实例包括但不限于自杀基因，比如半胱天冬酶9(或者半胱天冬酶3或7)、胸腺嘧啶核苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、B-细胞CD20、修饰的EGFR、及其任意组合。在这种策略中，在发生不良事件的情况下施用的前药通过自杀基因产物激活并杀伤转导细胞。
如本文所使用，“治疗足够量”在其含义内包括非毒性但是足够量的和/或有效量的其所涉及的特定治疗组合物和/或药物组合物，以提供期望的治疗作用。所需的确切量会随受检者而变化，这要取决于像患者的总体健康状况、患者的年龄以及病情的阶段和严重程度这样的因素。在特定实施例中，治疗足够量足以并且/或者有效缓解、减小、和/或改善与正在被治疗的受检者的疾病或病情相关的至少一种症状。
I.用来改进基于细胞的过继性免疫疗法的功效的药剂
本发明提供一种组合物，所述组合物包含一种或多种药剂，其量足以改进适合过继性的基于细胞的疗法的免疫细胞的治疗潜力。具有改进的治疗潜力的免疫细胞呈现改进的增殖、持久性、细胞毒性、和/或细胞回忆/记忆。免疫细胞可具有特定改进的体内增殖、体内持久性、体内细胞毒性、和/或体内细胞回忆/记忆。改进免疫细胞的治疗潜力通常需要更佳的免疫细胞质量——例如在T细胞群中，通过其维持、扩增、分化、和/或去分化增加的初始T细胞、干细胞记忆性T细胞、和/或中央记忆性T细胞的数量或比例表明对于改进的体内过继性治疗潜力更佳的T细胞质量。例如，关于NK细胞群，通过其维持、亚型切换、扩增、分化、和/或去分化，增加的适应性NK细胞的数量或比例表明对于改进的体内过继性治疗潜力更佳的NK细胞质量。例如，关于NKT细胞群，通过其维持、亚型切换、扩增、分化、和/或去分化，增加的I型NKT细胞的数量或比例表明对于改进的体内过继性治疗潜力更佳的NKT细胞质量。
适合过继性的基于细胞的疗法的免疫细胞用一种或多种表1中包括的药剂接触、处理、或调节。用所述(一种或多种)药剂处理可调整细胞或细胞亚群的生物特性，包括调节细胞扩增、维持、分化、去分化、和/或存活率，和/或增加增殖、细胞毒性、持久性、和/或细胞回忆/记忆，并因此增加所处理的细胞的治疗潜力。例如，处理可改进治疗性免疫细胞的体外存活率和体内存活率两者。此外，处理可改变处理的细胞群的不同亚群的比例。例如，在一个实施例中，分离的T细胞群中初始T细胞、干细胞记忆性T细胞、和/或中央记忆性T细胞的数量和比例在使用一种或多种从表1选择的药剂进行处理时增加。在另一个实施例中，在使用选自表1的一种或多种药剂对NK细胞群进行处理时，所述群中适应性NK细胞的数量和百分比被增加。
表1—用来在过继性细胞疗法中进行免疫细胞调节的药剂
Figure SMS_1
Figure SMS_2
不受理论的束缚，通过借助于调节细胞新陈代谢、营养感应、增殖、细胞凋亡、信号转导、与感染过程相关的特性、和/或细胞功能的其它方面对细胞扩增、新陈代谢、和/或细胞分化进行调节，表1的药剂改进免疫细胞对于过继性疗法的治疗潜力。如本领域技术人员所理解的，本发明的范围还包括类似物或衍生物，包括但不限于表1中列出的药剂的盐、酯、醚、溶剂化物、水合物、立体异构体或前药。例如，表1的药剂dmPGE2(16,16-二甲基前列腺素E2)的类似物和衍生物的说明性实例非限制性地包括PGE2、16,16-二甲基PGE2 p-(p-乙酰氨基苯甲酰氨基)苯基酯、11-脱氧-16,16-二甲基PGE2、9-脱氧-9-亚甲基-16,16-二甲基PGE2、9-脱氧-9-亚甲基PGE2、9-酮基氟前列醇、5-反式PGE2、17-苯基-ω-失三碳PGE2、PGE2丝氨醇酰胺、PGE2甲基酯、16-苯基失四碳PGE2、15(S)-15-甲基PGE2、15(R)-15-甲基PGE2、8-异-15-酮基PGE2、8-异PGE2异丙基酯、8-异-16-环己基-失四碳PGE2、20-羟基PGE2、20-乙基PGE2、11-脱氧PGEi、诺氯前列素、硫前列酮、布他前列素、15-酮基PGE2、以及19(R)羟基PGE2。还包括具有与PGE2类似的结构的PG类似物或衍生物，其在9位被卤素取代(参见(例如)WO2001/12596，其公开内容通过引用整体并入本文)，以及2-脱羧基-2-磷酸亚基前列腺素衍生物，比如美国公开号2006/0247214中描述的那些，其公开内容通过引用整体并入本文)。
GSK3(糖原合成酶激酶3)抑制剂可包括与GSK3的显性阴性变体结合的抗体，以及靶向GSK3的siRNA、微RNA、反义核酸、以及其它多聚核苷酸。用于本文考虑的组合物的合适的GSK3抑制剂(GSK3i)包括(但不限于)：坎帕罗酮、1-氮杂坎帕罗酮、CHIR99021、CHIR98014、AR-A014418、CT99021、CT20026、SB216763、AR-A014418、锂、TDZD-8、BIO、BIO-丙酮肟、(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-(2-苯基喹唑啉-4-基)胺、吡啶瞳巴唑-环戊二烯基钌复合物、TDZD-84-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮、2-硫代(3-碘苄基)-5-(1-吡啶基)-[1,3,4]-恶二唑、OTDZT、α-4-二溴苯乙酮、AR-AO144-18、3-(l-(3-羟基丙基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2,5-二酮、TWS119、L803H-KEAPPAPPQSpP-NH2或其豆蔻酰化形式、2-氯-1-(4,5-二溴-噻吩-2-基)-乙酮、GF109203X、R0318220、TDZD-8、TIBPO、以及OTDZT。在一个实施例中，GSK-3抑制剂是CHIR99021、BIO、TWS119、或坎帕罗酮。在一个实施例中，GSK3抑制剂是TWS119。在另一个实施例中，GSK-3抑制剂是CHIR99021。在又一个实施例中GSK3抑制剂是BIO。
MEK/ERK途径抑制剂是指MEK或ERK丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂，所述MEK或ERK丝氨酸/苏氨酸激酶是Raf/MEK/ERK途径的一部分。适合用于本文考虑的组合物的ERK/MEK抑制剂包括(但不限于)：PD0325901、PD98059、U0126、SL327、ARRY-162、PD184161、PD184352、舒尼替尼、索拉非尼、凡德他尼、帕唑帕尼、阿西替尼、GSK1 120212、ARRY-438162、R05126766、XL518、AZD8330、RDEA1 19、AZD6244、FR180204、PTK787、6-(4-溴-2-氯-苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-甲酸(2,3-二羟基-丙氧基)-酰胺、6-(4-溴-2-氯-苯基氨基)-7-氟-3-(四氢-吡喃-2-亚甲基)-3H-苯并咪唑-5-甲酸(2-羟基-乙氧基)-酰胺、1-[6-(4-溴-2-氯-苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-基]-2-羟基-乙酮、6-(4-溴-2-氯-苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-甲酸(2-羟基-1,1-二甲基-乙氧基)-酰胺、6-(4-溴-2-氯-苯基氨基)-7-氟-3-(四氢呋喃-2-亚甲基)-3H-苯并咪唑-5-甲酸(2-羟基-乙氧基)-酰胺、6-(4-溴-2-氟-苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-甲酸(2-羟基-乙氧基)-酰胺、6-(2,4-二氯-苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-甲酸(2-羟基-乙氧基)-酰胺、6-(4-溴-2-氯-苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-甲酸(2-羟基-乙氧基)-酰胺、2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-N-(2-羟基乙氧基)-1,5-二甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺；下文中称作MEK抑制剂2；以及4-(4-溴-2-氟苯基氨基)-N-(2-羟基乙氧基)-1,5-二甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺或其药学上可接受的盐。另外的说明性MEK/ERK抑制剂包括国际公开专利申请WO99/01426、WO02/06213、WO03/077914、WO05/051301以及W02007/044084中公开的那些化合物。在一个实施例中，MEK抑制剂是PD0325901。在另一个实施例中，MEK抑制剂是U0126。
ROCK(Rho相关的激酶)抑制剂是指Rho-鸟苷三磷酸酶/ROCK途径的抑制剂。该途径包括下游蛋白肌凝蛋白II，其处于ROCK的更下游(Rho-ROCK-肌凝蛋白II形成该途径/轴线)。因此，可使用Rho鸟苷三磷酸酶抑制剂、ROCK抑制剂、或肌凝蛋白II抑制剂中的任一种或全部以获得本文所述的作用。适合用于本文考虑的组合物的ROCK抑制剂包括(但不限于)：thiazovivin、Y27632、法舒地尔、AR122-86、Y27632H-1152、Y-30141、Wf-536、HA-1077、羟基-HA-1077、GSK269962A、SB-772077-B、N-(4-吡啶基)-N'-(2,4,6-三氯苯基)脲、3-(4-吡啶基)-1H-吲哚、(R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-氨基乙基)-环己烷甲酰胺、以及美国专利号8,044,201中公开的ROCK抑制剂，美国专利号8,044,201通过引用整体并入本文。在一个实施例中，ROCK抑制剂是thiazovivin、Y27632、或pyrintegrin。在一个实施例中，ROCK抑制剂是thiazovivin。
激活素受体类激酶5(ALK5)是最重要的TGFP受体，其介导对TGFP的细胞响应。在配体结合时，组成上活性的TpRII激酶磷酰化ALK5，其继而激活下游信号转导级联。TGFP受体/ALK5抑制剂可包括针对TGFP/ALK5受体的显性阴性变体的抗体，以及抑制TGFP/ALK5受体的表达的siRNA、微RNA、反义核酸、以及其它多聚核苷酸。适合用于本文考虑的组合物的TGFP受体/ALK5抑制剂包括(但不限于)：SB431542；A-83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺；2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶、Wnt3a/BIO、GW788388(-{4-[3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]吡啶-2-基}-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)苯甲酰胺)、SM16、IN-1130(3-((5-(6-甲基吡啶-2-基)-4-(喹啉-6-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)苯甲酰胺)、GW6604(2-苯基-4-(3-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-基)吡啶)、SB-505124(2-(5-苯并[1,3]间二氧杂环戊烯-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸盐)；SU5416；2-(5-苯并[1,3]间二氧杂环戊烯-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸盐(SB-505124)；乐德木单抗(lerdelimumb)(CAT-152)；美替木单抗(metelimumab)(CAT-192)；GC-1008；ID11；AP-12009；AP-11014；LY550410；LY580276；LY364947；LY2109761；SD-208；SM16；NPC-30345；Ki26894；SB-203580；SD-093；格列卫；3,5,7,2',4'-五羟基黄酮(桑黄素)；激活素-M108A；P144；可溶TBR2-Fc；以及嘧啶衍生物(参见(例如)Stiefl等人W02008/006583中列出的那些，其通过引用并入本文)。而且，尽管“ALK5抑制剂”并非旨在包括非特异性的激酶抑制剂，但是“ALK5抑制剂”应被理解为包括抑制ALK4和/或ALK7加ALK5的抑制剂，比如(例如)SB-431542(参见(例如)Inman等人的《分子药理学杂志(J,Mol.Pharmacol.)》62(1):65-74(2002)。另外还认为，对TGFp/激活素途径的抑制会具有与抑制ALK5类似的作用。因此，任何TGFp/激活素途径的抑制剂(例如上游或下游)可与如本文中每段所描述的ALK5抑制剂组合使用，或者可替代其而使用。示例性的TGFp/激活素途径抑制剂包括但不限于：TGFP受体抑制剂、SMAD2/3磷酰化抑制剂、SMAD2/3与SMAD4相互作用的抑制剂、以及SMAD6和SMAD7的激活剂/激动剂。此外，本文所述的分类仅为了组织目的，本领域技术人员应理解，化合物可能会影响途径中的一个或多个点，因此化合物可在多于一个的所定义的类别中起作用。在一个实施例中，TGFP受体抑制剂包含SB431542。
PDK1或3'-磷酸肌醇依赖性激酶-1是与AKT/PKB和许多其它AGC激酶(包括PKC、S6K、SGK)的激活相关的主激酶(master kinase)。PDK1的一个重要作用在由几种生长因子和激素激活的信号转导通路(包括胰岛素信号转导)中实现。示例性的PDK1激动剂包括鞘胺醇(King等人，《生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)》，275:18108-18113,2000)。PDK1的示例性变构激活剂包括PS48((Z)-5-(4-氯苯基)-3-苯基戊-2-烯酸)、PS08((Z)-5-(4-溴-2-氟苯基)-3-苯基戊-2-烯酸)、l-(2-(3-(4-氯苯基)-3-氧代-1-苯丙基硫基)乙酸；3,5-二苯基戊-2-烯酸，比如化合物12Z(2-(3-(4-氯苯基)-3-氧代-1-苯丙基硫基)乙酸,(Z)-5-(萘-2-基)-3-苯基戊-2-烯酸)、以及化合物13Z((Z)-5-(1H-吲哚-3-基)-3-苯基戊-2-烯酸)。在一个实施例中，PDK1激动剂包含PS48。
雷帕霉素(mTOR)抑制剂的哺乳动物靶标阻断雷帕霉素的哺乳动物靶标的活性。mTOR是一种蛋白激酶，其调节刺激细胞生长和血管生成的生长因子。适合本发明的组合物和方法的mTOR抑制剂包括(但不限于)雷帕霉素，以及其类似物和衍生物，包含西罗莫司、西罗莫司衍生物、坦罗莫司、40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素(依维莫司)、40-O-(3-羟基)丙基-雷帕霉素、40-O-[2-(2-羟基)乙氧基]乙基-雷帕霉素、40-O-四唑-雷帕霉素、以及其它O-烷基化的或O-甲基化的雷帕霉素衍生物。
在一些实施例中，用来改进适合过继性的基于细胞的疗法的免疫细胞的治疗潜力的组合物包含至少一种选自表1的药剂。在一个实施例中，用来改进免疫细胞治疗潜力的组合物包含至少2、3、4、5、或6种、或者任何数量的选自表1的药剂的组合。
在一个实施例中，包含至少一种选自表1的药剂的组合物进一步包含有机溶剂。在某些实施例中，有机溶剂基本上不含乙酸甲酯。在某些实施例中，有机溶剂选自由以下组成的群组：二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲氧基乙烷(DME)、二甲基乙酰胺、乙醇、及其组合。在一些实施例中，有机溶剂是DMSO。在一些实施例中，有机溶剂是乙醇。在一些其它实施例中，有机溶剂是DMSO和乙醇的混合物。
在一些实施例中，用来改进适合过继性的基于细胞的疗法的免疫细胞的治疗潜力的组合物包含至少一种选自第I类的药剂：AMPK抑制剂dorsomorphin、萜烯七脂酸、1-吡咯烷二硫代甲酸、以及2-DG。不受理论的束缚，第I类药剂除了其它可能的作用之外还可能影响细胞的新陈代谢和营养感应。
在一些实施例中，用来改进适合过继性的基于细胞的疗法的免疫细胞的治疗潜力的组合物包含至少一种选自第II类的药剂：GSK3抑制剂、ROCK抑制剂、TGFP受体抑制剂、MEK抑制剂、PDK1激动剂、6-巯基嘌呤、AC-93253碘化物、替拉曲考、PI-103、氟维司群、毒胡萝卜素、SU4312、U0126、替米沙坦、环孢菌素A、1,3,5-三(4-羟基苯基)-4-丙基-1H-吡唑、BAY61-3606、原卟啉IX二钠、mTOR抑制剂、TWS119、HS173、LY294002、以及PI3K抑制剂匹替昔布。不受理论的束缚，第II类药剂除了其它可能的作用之外还可能影响各种功能途径中的信号转导。
在一些实施例中，用来改进适合过继性的基于细胞的疗法的免疫细胞的治疗潜力的组合物包含至少一种选自第III类的药剂：5-氮杂胞苷、氟达拉滨、核抑制剂罗斯考汀、以及PAC-1。不受理论的束缚，第III类药剂除了其它可能的作用之外还可能影响细胞增殖和细胞凋亡。
在一些实施例中，用来改进适合过继性的基于细胞的疗法的免疫细胞的治疗潜力的组合物包含至少一种选自第IV类的药剂：5,7-二氯-8-羟基喹啉、7-氯-4-(二甲基氨基)-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢-2-并四苯甲酰胺、硝呋酚酰肼、以及盐酸托氟沙星。不受理论的束缚，第IV类药剂除了其它可能的作用之外还可能影响与感染过程相关的细胞特性。
在一些实施例中，用来改进适合过继性的基于细胞的疗法的免疫细胞的治疗潜力的组合物包含至少一种选自第V类的药剂：舍曲林、二乙烯三胺五醋酸、依酚氯铵、BIX01294、特非那定、以及dmPGE2。不受理论的束缚，第V类药剂除了其它可能的作用之外通常可能还影响与扩增、维持、分化、去分化、存活率、增殖、细胞毒性、细胞回忆、和/或持久性相关的其它细胞特性。
在又一些其它实施例中，用来改进适合过继性的基于细胞的疗法的免疫细胞的治疗潜力的组合物包含至少一种选自第I类的药剂，以及一种或多种选自第II类、第III类、第IV类、和/或第V类的药剂。
在一些其它实施例中，适合过继性的基于细胞的疗法的、用来改进免疫细胞治疗潜力的组合物包含至少一种选自第II类的药剂，以及一种或多种选自第I类、第III类、第IV类、和/或第V类的药剂。
在又一些其它实施例中，用来改进适合过继性的基于细胞的疗法的免疫细胞的治疗潜力的组合物包含至少一种选自第III类的药剂，以及一种或多种选自第I类、第II类、第IV类、和/或第V类的药剂。
在再其它的一些实施例中，用来改进适合过继性的基于细胞的疗法的免疫细胞的治疗潜力的组合物包含至少一种选自第IV类的药剂，以及一种或多种选自第I类、第II类、第III类、和/或第V类的药剂。
在再其它的一些实施例中，用来改进适合过继性的基于细胞的疗法的免疫细胞的治疗潜力的组合物包含至少一种选自第IV类的药剂，以及一种或多种选自第I类、第II类、第III类、和/或第IV类的药剂。
在一些实施例中，用来改进适合过继性的基于细胞的疗法的免疫细胞的治疗潜力的组合物包含至少一种选自由以下组成的群组的药剂：GSK3抑制剂、MEK抑制剂、ROCK抑制剂、TGFP抑制剂、PDK1激动剂、以及mTOR抑制剂。
在一些实施例中，组合物包含两种或更多种选自表1的药剂的组合，其中所述药剂在组合中具有加成作用。如所定义的，“加成的”是指组合中的两种或更多种药剂产生几乎等于其单独作用的总和的作用。在一些实施例中，组合中的一种或多种药剂来自相同的种类：第I、II、III、IV、或V类。在一些实施例中，组合中的一种或多种药剂来自不同的种类。
在一些实施例中，组合物包含两种或更多种选自表1的药剂的协同组合。如所定义的，“协同作用”是一种增强的作用，从而使得两种或更多种药剂的共同作用产生大于其单独作用的总和的作用。在一个实施例中，包含协同组合的组合物包含至少一种选自由以下组成的群组的药剂：TWS119、HS173、LY294002、PI3K抑制剂匹替昔布、以及2-DG。在一个实施例中，组合物包含一种组合，其包含至少一种选自由TWS119、HS173、LY294002、PI3K抑制剂匹替昔布、以及2-DQ组成的群组的药剂，以及一种或多种另外的选自表1所列化合物的群组的药剂。在一个实施例中，包含TWS119的组合物进一步包含两种或更多种另外的选自表1的药剂。在一个实施例中，包含HS173的组合物进一步包含两种或更多种另外的选自表1的药剂。在一个实施例中，包含LY294002的组合物进一步包含两种或更多种另外的选自表1的药剂。在一个实施例中，包含PI3K抑制剂匹替昔布的组合物进一步包含两种或更多种另外的选自表1的药剂。在一个实施例中，包含2-DQ的组合物进一步包含两种或更多种另外的选自表1的药剂。
在一些实施例中，包含一种或多种选自由表1所列化合物组成的群组的药剂的组合物进一步包含一种或多种另外的选自由以下组成的群组的添加剂：肽、细胞因子、有丝分裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或置换因子、包含一种或多种目标多核酸的载体、抗体及其抗体片段、和/或化疗剂或放射性部分。在一些实施例中，另外的添加剂包含抗体或抗体片段。在这些实施例的一些中，抗体或抗体片段特异性地与病毒抗原结合。在其它实施例中，抗体或抗体片段特异性地与肿瘤抗原结合。
在一些实施例中，细胞因子和生长因子包含一种或多种以下细胞因子或生长因子：表皮生长因子(EGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)、肝细胞生长因子(HGF)、类胰岛素生长因子1(IGF-1)、类胰岛素生长因子2(IGF-2)、角质细胞生长因子(KGF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-P)、血管内皮生长因子(VEGF)运铁蛋白、各种白细胞介素(例如IL-1至IL-18)、各种集落刺激因子(比如颗粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))、各种干扰素(比如IFN-γ)、干细胞因子(SCF)以及红细胞生成素(Epo)。在一些实施例中，细胞因子至少包含白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-15、白细胞介素18(IL-18)、白细胞介素21(IL-21)、或其任意组合。在一些实施例中，组合物的生长因子包含成纤维细胞生长因子。这些细胞因子可商购获得，例如从R&D Systems(明尼苏达州明尼阿波利斯市)获得，还可以是天然的或重组的。在特定实施例中，生长因子和细胞因子可以本文考虑的浓度添加。在某些实施例中，生长因子和细胞因子可以根据经验确定的浓度或者由所确定的细胞因子技术指导的浓度添加。
在一些实施例中，组合物的有丝分裂原包含伴刀豆球蛋白A。在一些其它实施例中，饲养细胞被基因修饰。在一些实施例中，饲养细胞包含以下中的一种或多种：单核血细胞、胸腺上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、白血病细胞K562、Raji细胞、或者饲养细胞组分或其置换因子。
在一些实施例中，小RNA包含siRNA、shRNA、miRNA以及反义核酸中的一种或多种。在一些其它实施例中，小RNA包含以下中的一种或多种：miR-362-5p、miR-483-3p、miR-210以及miR-598。
在一些实施例中，包含一种或多种目标多核酸的载体是完整的或非完整的。在一些实施例中，包含一种或多种目标多核酸的载体进一步包含腺病毒载体、质粒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体、附加型载体等的骨架。在一些实施例中，用于在动物细胞中进行表达的质粒载体包括(例如)pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等。在一些实施例中，载体中包含的一种或多种多核酸对一种或多种蛋白或多肽进行编码。在一些实施例中，一种或多种多核酸对Delta-like1(DLL1)、Delta-like3(DLL3)、Delta-like4(DLL4)、Jaggedl(Jag1)、或Jagged2进行编码。在一些实施例中，一种或多种多核酸对Jagged1进行编码。
II.用于过继性细胞疗法的免疫细胞
本发明提供一种组合物，其包含已经与一种或多种选自表1的药剂接触的分离的免疫细胞群或亚群。在一个实施例中，所分离的免疫细胞群或亚群已经与一种或多种选自表1的药剂接触，所述药剂的量足以改进免疫细胞的治疗潜力。在一些实施例中，处理的免疫细胞用于基于细胞的过继性疗法。本发明进一步提供免疫细胞群或亚群，以及一种或多种选自表1所列药剂的药剂，其中使用一种或多种选自表1所列药剂的药剂对免疫细胞群或亚群进行的处理改进免疫细胞对于过继性疗法的治疗潜力。处理可调整免疫细胞的生物特性，以改进细胞增殖、细胞毒性、以及持久性，并且/或者降低细胞疗法的复发率。
在一些实施例中，免疫细胞群包含T细胞。在一些实施例中，免疫细胞群包含NK细胞。在一些实施例中，免疫细胞群包含NKT细胞。
在一些实施例中，与一种或多种选自表1的药剂接触的T细胞群或亚群与未经同样处理的T细胞相比包含增加数量或比例的初始T细胞(Tn)、干细胞记忆性T细胞(Tscm)、和/或中央记忆性T细胞(Tcm)，和/或改进的细胞增殖、细胞毒性、细胞回忆、和/或持久性。在一些实施例中，Tn、Tscm、和/或Tcm的数量与未使用一种或多种选自表1的药剂进行相同处理的细胞群中的Tn、Tscm、和/或Tcm的数量相比增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或者增加至少5、10、15、或20倍。
在一些实施例中，与一种或多种选自表1的药剂接触的NK细胞群或亚群与未经同样处理的NK细胞相比包含增加数量或比例的适应性(或者记忆性)NK细胞，和/或改进的细胞增殖、细胞毒性、细胞回忆、和/或持久性。在一些实施例中，适应性NK细胞的数量与未使用一种或多种选自表1的药剂进行相同处理的细胞群中的适应性NK细胞的数量相比增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或者增加至少5、10、15、或20倍。在一个实施例中，与GSK3抑制剂、MEK抑制剂、ROCK抑制剂、TGFP抑制剂、PDK1激动剂、和/或雷帕霉素接触的NK细胞群或亚群包含增加数量或比例的适应性NK细胞。在一个实施例中，适应性NK细胞的特征在于CD3-和CD56+，以及CD57+、NKG2C+、低PLZF、低SYK、低FcεRγ、低EAT-2、低TIGIT、低PD1、低CD7、低CD161、高LILRB1、高CD45RO和低CD45RA中的至少一种。在一些实施例中，适应性NK细胞是CD57+、NKG2C+、低PLZF、低SYK、低FcεRγ、低EAT-2、低TIGIT、低PD1、低CD7、低CD161、高LILRB1、高CD45RO、以及低CD45RA中的至少两种。例如，适应性NK细胞可以是CD57+和NKG2C+。在一些实施例中，适应性NK细胞是CD57+、NKG2C+、低PLZF、低SYK、低FcεRγ、低EAT-2、低TIGIT、低PD1、低CD7、低CD161、高LILRB1、高CD45RO、以及低CD45RA中的至少三种。例如，适应性NK细胞可以是SYK-、FcεRγ-、以及EAT-2-。在一个实施例中，GSK-3P抑制剂是CHIR99021、BIO、TWS119、或坎帕罗酮。在一个实施例中，GSK-3P抑制剂是TWS119。在另一个实施例中，GSK-3P抑制剂是CHIR99021。在又一个实施例中，GSK-3P抑制剂是BIO。
在一些其它实施例中，与一种或多种选自表1的药剂接触的NKT细胞群或亚群与未使用一种或多种选自表1的药剂进行处理的分离的NKT细胞群或亚群相比包含增加数量或比例的I型NKT细胞与II型NKT细胞，和/或改进的细胞增殖、细胞毒性、细胞回忆、和/或持久性。在一些实施例中，I型NKT细胞的数量与未使用一种或多种选自表1的药剂进行相同处理的细胞群中的I型NKT细胞的数量相比增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或者增加至少5、10、15、或20倍。
在一些实施例中，初始T细胞(Tn)、干细胞记忆性T细胞(Tscm)、中央记忆性T细胞(Tern)、适应性NK细胞、和/或I型NKT细胞增加的数量或比例归因于这些细胞亚型改进的维持和扩增，和/或增加的从更成熟的细胞亚型向期望分化状态的细胞亚型的去分化/重编码。
在一些实施例中，在将免疫细胞群与一种或多种表1中包括的药剂接触之后，所述群中的初始T细胞(Tn)、干细胞记忆性T细胞(Tscm)、中央记忆性T细胞(Tcm)的数量与未处理的免疫细胞群相比被增加，其中Tn、Tscm以及Tcm的特征在于CCR7和/或CD62L的共表达。
在一些实施例中，在将免疫细胞群与一种或多种表1中包括的药剂接触之后，所述群中的适应性NK细胞的数量与未处理的免疫细胞群相比被增加，其中适应性NK细胞的特征在于CD3-、CD56+、CD16+、NKG2C+、以及CD57+。在一些其它实施例中，适应性NK细胞的特征在于CD3-、CD56+，以及CD57+、NKG2C+、低PLZF、低SYK、低FcεRγ、低EAT-2、低TIGIT、低PD1、低CD7、低CD161、高LILRB1、高CD45RO和低CD45RA中的至少一种、两种或三种。
在一些实施例中，在将免疫细胞群与一种或多种表1中包括的药剂接触之后，所述群中的I型NKT细胞的数量与未处理的免疫细胞群相比被增加，其中I型NKT细胞的特征在于表面抗原CD3+、CD56+、TCR Vα24+、和/或TCR Vβ11+。
在一些实施例中，用来使用本文所公开的药剂进行处理的T、NK或NKT细胞的群或亚群可从人类或非人类哺乳动物分离。这种非人类哺乳动物的实例包括(但不限于)兔、马、牛、羊、猪、狗、猫、小鼠、大鼠、以及其转基因物种。
T细胞群或亚群可从许多来源获得或分离，包括但不限于外周血、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、以及来自感染部位、腹水、胸腔积液、脾组织、以及肿瘤的组织。骨髓可从股骨、骼脊、髋骨、肋骨、胸骨、以及其它骨头获得。另外，还可使用本领域中可用的T细胞系，比如Jurkat、SupT1、以及其它。
NK细胞群或亚群可从许多来源获得或富集，包括但不限于外周血、脐带血、以及肿瘤。
完全成熟的NKT细胞可从外周血获得或富集，更小的成熟NKT细胞群可能会在骨髓、淋巴结组织以及脐带血、胸腺组织中找到。
在本发明的某些实施例中，分离的或富集的T、NK、NKT细胞的群或亚群可使用任何数量的技术人员已知的技术(例如FicollTM分离)从一单位的血液获得。在一个实施例中，来自个体的循环血液的T、NK或NKT细胞通过血液成分单采术获得。血液成分单采术产物通常含有细胞，包括T细胞、单核细胞、颗粒细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、其它有核白细胞、红细胞、以及血小板。在一个实施例中，可将通过血液成分单采术收集的细胞洗涤，以除去血浆部分，并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中，以进行随后的处理步骤。在本发明的一个实施例中，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在一个替代的实施例中，洗涤溶液缺少钙，并且可能缺少镁或者可能缺少许多，即使不是全部二价阳离子。本领域普通技术人员将容易理解，洗涤步骤可通过本领域人员已知的方法完成，比如根据制造商的说明书使用半自动的“流经(flow-through)”离心机(例如Cobe 2991细胞处理机、Baxter CytoMate、或Haemonetics Cell Saver 5)。洗涤之后，细胞可悬浮于各种生物相容的缓冲液中，例如不含钙、不含镁的PBS、PlasmaLyte A、或者具有或不具有缓冲液的其它盐水溶液。可替代地，血液成分单采术样品的不希望组分可被除去，并且将细胞直接悬浮于培养基中。
在另一个实施例中，T、NK或NKT细胞的群或亚群通过溶解红细胞并去除单核细胞而从外周血淋巴细胞分离或富集，单核细胞的去除(例如)通过经由PERCOLLTM梯度的离心分离或者通过逆流离心淘选进行。
在一个实施例中，对特定的T细胞亚群可通过正选择或负选择技术(比如CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CD62L、CCR7、CD27、和/或CD122抗体)进一步进行分离或富集。例如，在一个实施例中，分离或富集的T细胞群或亚群通过使用抗CD3/抗CD28(即3×28)缀合的珠粒(比如免疫磁珠
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M-450CD3/CD28 T)孵育持续足以对期望的T细胞进行正选择的时间段而被扩增和激活。在一个实施例中，所述时间段为约30分钟。在一个进一步的实施例中，所述时间段范围为30分钟至72小时或更久以及其间的所有整数值。在一个进一步的实施例中，所述时间段为至少1、2、3、4、5、或6小时。在又一个优选实施例中，所述时间段为10至72小时。在一个优选实施例中，孵育时间段为24小时。对于来自患有白血病的患者的T细胞的分离，使用更久的孵育时间(比如24小时)可增加细胞产率。更久的孵育时间可用来在与其它细胞类型相比T细胞很少的任何情况下分离T细胞，比如从肿瘤组织或从免疫受损个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。此外，使用更久的孵育时间可增加CD8+T细胞的俘获效率。因此，通过简单地缩短或延长容许T细胞与CD3/CD28珠粒结合的时间，并且/或者通过增加或降低珠粒与T细胞的比例(如本文进一步所述)，可在培养开始时或在该过程中的其它时间点进一步选取或不选取特定的T细胞群或亚群。另外，通过增加或降低珠粒或其它表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比例，可在培养开始时或在其它期望的时间点进一步选取或不选取特定的T细胞群或亚群。技术人员应认识到，在本发明的情况中还可使用多轮选择。在某些实施例中，可期望进行选择步骤并在激活和扩增过程中使用“未选择的”细胞。对“未选择的”细胞还可进行更多轮的选择。
通过负选择对T、NK或NKT细胞的群或亚群进行分离或富集可使用指向对于负选细胞独特的表面标记的各抗体的组合来进行。一种方法是通过负磁免疫粘附或荧光激活的细胞分选(其使用指向负选细胞上存在的细胞表面标记的单克隆抗体的混合物)进行细胞分选和/或选择。例如，为了通过负选择对CD3+细胞进行富集，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、以及HLA-DR的抗体。在某些实施例中，可期望对通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+、以及FoxP3+的调节性T细胞进行富集或正选择。可替代地，在某些实施例中，通过抗CD25缀合的珠粒或其它类似选择方法将调节性T细胞去除。在一些实施例中，期望的用于免疫疗法的T细胞亚群通过CCR7和CD62L从包含T细胞的调节的免疫细胞富集或选择。可替代地，对目标细胞可根据包括差分尺寸、密度、粒度、变形度、抗性或容量的物理参数进行选择。
在一个实施例中，对适应性NK细胞群或亚群通过使用比如包括CD16、NKG2C、以及CD57的正表达的识别符在包含NK细胞的调节的免疫细胞内选择表型上为CD3-和CD56+的那些来进行富集。此外，适应性亚群的负选择可基于缺少NKG2C和/或CD57的表达、并且另外还缺乏以下中的一种或多种的表达：低PLZF、低SYK、低FcεRγ、低EAT-2、低TIGIT、低PD1、低CD7、低CD161、高LILRB1、高CD45RO、以及低CD45RA。
在一个实施例中，NKT细胞群或亚群通过在NK细胞群内选择表型上表达不变性TCRa链的那些、特别是以下标记的组合来进行富集：CD3+、CD56+、TCRVa24+、和/或TCRVβ1l+。可替代地，对NKT细胞可基于与不变性TCRa链的表达结合的表型的组合进行选择。
来自受检者的血液样品或血液成分单采术产物可在如本文所述的免疫细胞被分离之前的一个时间段收集。照此，待调节细胞的来源可在任何必要的时间点收集，并将期望的细胞(比如T细胞、NK细胞以及NKT细胞)分离和冷冻，以便后续用于基于细胞的免疫疗法(其针对任何数量的、会受益于这种细胞疗法的疾病或病情(例如本文所述的那些))。在一个实施例中，血液样品或单采血液成分术产物从大体上健康的受检者收集。在某些实施例中，血液或血液成分术单采产物从面临产生疾病风险但尚未产生疾病的大体上健康的受检者收集，目标细胞被分离并冷冻用于后续使用。在其它实施例中，血液样品或血液成分单采术产物从以前被施用过基因修饰的免疫细胞(由重排、突变、基因印记和/或表观基因修饰被基因工程化，或者天然衍生自重排、突变、基因印记和/或表观基因修饰)的受检者收集。在某些实施例中，T、NK、NKT或其它免疫细胞可被扩增、冷冻、处理并稍后使用。在某些实施例中，样品在其被诊断患有如本文所述的特定疾病之后不久但是未接受任何治疗的患者收集。在一些实施例中，细胞从显示CMV(巨细胞病毒)血清阳性的受检者分离。在一个进一步的实施例中，细胞在任何数量的相关治疗形式之前从受检者的血液或血液成分单采术产物分离，所述相关治疗形式包括但不限于使用像那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒剂、化疗剂、放射剂、免疫抑制剂(比如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲胺喋呤、霉酚酸酯、以及FK506)这样的药剂、抗体、或其它免疫毁灭剂(比如CAMPATH、抗CD3抗体、癌得星、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦可酚酸、类固醇、FR901228、以及辐射)进行治疗。在一个进一步的实施例中，细胞从患者分离并冷冻，以便后续用于与(例如在其之前、同时或之后)骨髓或干细胞移植、使用像氟达拉滨这样的化疗剂、外部光束辐射疗法(XRT)、环磷酰胺、或者像OKT3或CAMPATH这样的抗体的T细胞剥括疗法结合使用。在另一个实施例中，细胞在B-细胞剥括疗法(比如与CD20反应的药剂，例如利妥昔单抗)后进行的治疗之前分离，并且可冷冻，以便后续用于所述治疗。
在一些实施例中，T、NK或NKT细胞的群或亚群被基因组工程化，其包括插入、缺失、或核酸置换。修饰的免疫细胞可表达细胞因子转基因，沉默的抑制性受体；或者过表达激活受体，或者用来重靶向免疫细胞的CAR。在一些实施例中，从受检者或供体分离以用于调节的、或者从受检者/供体的外周血液、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位组织、腹水、胸腔积液、脾组织、肿瘤分离的、或者受检者/供体的外周血液、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位组织、腹水、胸腔积液、脾组织、肿瘤中包含的免疫细胞群可被基因修饰。在一些实施例中，所分离的免疫细胞群被基因组工程化并包含插入、缺失、和/或核酸置换。在一些特定实施例中，免疫细胞包含对T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、和/或CD16或其变体的过表达进行编码的外源核酸。
基因组工程化的免疫细胞包含包括以下中的一种或多种的基因修饰形态：安全开关蛋白、靶向形态、受体、信号传导分子、转录因子、药学活性的蛋白和肽、药物目标候选物；或者促进免疫细胞的植入、运输、归巢、活力、自我更新、持久性、免疫响应调节和调控、和/或存活的蛋白。在一些其它实施例中，基因修饰形态包括以下中的一种或多种：(i)B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、或RFXAP、以及染色体6p21区中的任何基因的缺失或表达减少；(ii)用来与双特异性或多特异性接合体或者通用接合体偶联的HLA-E、HLA-G、HACD16、hnCD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、Fc受体、或表面触发受体的表达引入或增强。在一些实施例中，T、NK或NKT细胞包含外源核酸。在一些实施例中，外源核酸通过细胞的直接基因组编辑被引入免疫细胞。在一些其它实施例中，外源核酸通过保留来自基因组工程化的造血干细胞或祖细胞或iPSC(其通过分化产生免疫细胞)的外源核酸被引入免疫细胞。在一些实施例中，T细胞的外源核酸可编码TCR(T细胞受体)、CAR(嵌合抗原受体)、双特异性T细胞接合体(BiTE)、三特异性T细胞接合体、多特异性T细胞接合体、或者与多种免疫细胞类型相容的通用接合体。在一些实施例中，NK细胞的外源核酸可编码TCR、CAR、CD16或其变体、NY-ESO、双特异性杀伤细胞接合体(BiKE)、三特异性杀伤细胞接合体(TriKE)、多特异性杀伤细胞接合体、或者与多种免疫细胞类型相容的通用接合体。在一些实施例中，NKT细胞的外源核酸可以是改变的TCR或CAR。在一些实施例中，外源核酸编码CAR19。在一些实施例中，CD16变体包含高亲和性CD16(HACD16)、不可切割的CD16、以及高亲和性不可切割CD16(hnCD16)。因此，鉴于用来使用GSK3i调节免疫细胞的方法和组合物，本发明的一些方面提供GSK3i调节的基因工程化的T、NK、或NKT细胞。本发明的一个方面提供GSK3i调节的NK细胞，其包含hnCD16。本发明的另一个方面提供GSK3i调节的免疫细胞，其具有修饰的I类和/或II类HLA。在一些实施例中，具有修饰的I类和/或II类HLA的GSK3i调节的免疫细胞包含B2M、HLA-E/G、PDL1、A2AR、CD47、LAG3、TIM3、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、RFKANK、CIITA、RFX5、以及RFXAP中的至少一种的空表达或低表达。
在一些实施例中，用于调节的免疫细胞群或亚群从干细胞或祖细胞体外分化。在一些实施例中，分离的T、NK或NKT细胞的群或亚群可从干细胞、造血干细胞或祖细胞(HSC)、或祖细胞分化。祖细胞可以是CD34+血原性内皮细胞、多能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、或NKT细胞祖细胞。干细胞可以是多能干细胞，比如诱导性多能干细胞(iPSC)和胚胎干细胞(ESC)。iPSC是非天然存在的重编码的多能细胞。一旦受检者的细胞被重编码为多能状态，那么细胞便可被编码或分化为期望的细胞类型或亚型，比如T、NK、或NKT细胞。在一些实施例中，iPSC通过多阶段分化平台分化为T、NK或NKT细胞，其中各个发育阶段的细胞可被诱导为造血表型，其范围从中胚层干细胞至完全分化的T、NK或NKT细胞，参见(例如)美国申请62/107,517和62/251,016，其公开内容整体并入本文)。
在一些实施例中，用来分化T、NK或NKT细胞的iPSC、HSC、或祖细胞被基因组工程化，其包括插入、缺失、或核酸置换。在一些实施例中，基因组工程化的iPSC、HSC或造血祖细胞包含包括以下中的一种或多种的基因修饰形态：安全开关蛋白、靶向形态、受体、信号传导分子、转录因子、药学活性的蛋白和肽、药物目标候选物；或者促进iPSC、HSC、祖细胞、或其衍生细胞的植入、运输、归巢、活力、自我更新、持久性、免疫响应调节和调控、和/或存活的蛋白。在一些其它实施例中，基因修饰形态包括以下中的一种或多种：(i)B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、或RFXAP、以及染色体6p21区中的任何基因的缺失或表达减少；(ii)用来与双特异性或多特异性接合体或者通用接合体、TCR(T细胞受体)、或CAR(嵌合抗原受体)偶联的HLA-E、HLA-G、HACD16、hnCD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、Fc受体、表面触发受体的表达引入或增强。在一些实施例中，用来分化为T、NK或NKT细胞的iPSC、HSC、或祖细胞包含修饰的I类和/或II类HLA。在一些实施例中，用来分化T、NK或NKT细胞的具有修饰的I类和/或II类HLA的iPSC、HSC、或祖细胞包含B2M、HLA-E/QPDL1、A2AR、CD47、LAG3、TIM3、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、RFKANK、CIITA、RFX5、以及RFXAP中的至少一种的空表达或低表达。在一些实施例中，用来分化T、NK或NKT细胞的iPSC、HSC、或祖细胞具有外源核酸。在一些实施例中，外源核酸可对双特异性T细胞接合体(BiTE)、三特异性T细胞接合体、多特异性T细胞接合体、CD16或其变体、NY-ESO、双特异性杀伤细胞接合体(BiKE)、三特异性杀伤细胞接合体(TriKE)、多特异性杀手细胞接合体、或者与多种免疫细胞类型相容的通用接合体进行编码。在一些实施例中，外源核酸在用来分化T、NK或NKT细胞的iPSC、HSC、或祖细胞中对hnCD16进行编码。在一些实施例中，外源核酸在用来分化T、NK或NKT细胞的iPSC、HSC、或祖细胞中对CAR19进行编码。
在一些实施例中，免疫细胞群或亚群从非造血命运的非多能细胞体外转分化为造血系细胞，或者从第一造血细胞类型的非多能细胞体外转分化为不同的造血细胞类型，其可以是T、NK、或NKT祖细胞或者完全分化的特定类型的免疫细胞，比如T、NK、或NKT细胞(参见(例如)美国专利号9,376,664和美国申请15/072,769，其公开内容整体并入本文)。在一些实施例中，非造血命运的非多能细胞是体细胞，例如皮肤成纤维细胞、脂肪组织衍生的细胞以及人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)。可用于转分化的体细胞可以是永生化的体细胞。
正在采取各种策略在细胞中诱导多能性或增加效力(Takahashi,K.和Yamanaka,S.，《细胞(Cell)》126,663-676(2006)；Takahashi等人，《细胞(Cell)》131,861-872(2007)；Yu等人，《科学(Science)》318,1917-1920(2007)；Zhou等人，《细胞干细胞(Cell StemCell)》4,381-384(2009)；Kim等人，《细胞干细胞(Cell Stem Cell)》4,472-476(2009)；Yamanaka等人，2009；Saha,K.、Jaenisch,R.，《细胞干细胞(Cell Stem Cell)》5,584-595(2009))，并改进重编码的效率(Shi等人，《细胞干细胞(Cell Stem Cell)》2,525-528(2008a)；Shi等人，《细胞干细胞(Cell Stem Cell)》3,568-574(2008b)；Huangfu等人，《自然生物技术(Nat Biotechnol)》26,795-797(2008a)；Huangfu等人，《自然生物技术(NatBiotechnol)》26,1269-1275(2008b)；Silva等人，《公共科学图书馆生物学6(Plos Bio6)》，e253.Doi：10.1371/journal.Pbio.0060253(2008)；Lyssiotis等人，《美国科学院院报(PNAS)》106,8912-8917(2009)；Ichida等人，《细胞干细胞(Cell Stem Cell)》5，491-503(2009)；Maherali，N.、Hochedlinger，K.，《当代生物学(Curr Biol)》19，1718-1723(2009b)；Esteban等人，《细胞干细胞(Cell Stem Cell)》6,71-79(2010)；以及Feng等人，《细胞干细胞(Cell Stem Cell)》4,301-312(2009))，其公开内容通过引用整体并入本文。
III.对用于过继性疗法的免疫细胞进行调节的方法
本发明提供对适合基于细胞的过继性疗法的免疫细胞群或亚群进行调节的方法，所述方法包含将免疫细胞与包含至少一种选自表1的药剂的组合物接触。
在一个实施例中，对适合基于细胞的过继性疗法的免疫细胞群或亚群进行调节的方法包含将免疫细胞与包含至少一种选自表1的药剂的组合物接触，其中接触的免疫细胞与未接触表1药剂的免疫细胞相比具有增加的细胞扩增、增加的一种或多种期望的细胞亚群的数量或比例、和/或改进的增殖、细胞毒性、细胞回忆、和/或持久性。
在一些实施例中，对适合基于细胞的过继性疗法的免疫细胞群或亚群进行调节的方法包含将免疫细胞与包含至少一种选自表1的药剂的组合物接触，其中一种或多种期望的细胞亚群的维持和扩增与未接触表1药剂的免疫细胞相比被改进。
在一些实施例中，对适合基于细胞的过继性疗法的免疫细胞群或亚群进行调节的方法包含将免疫细胞与包含至少一种选自表1的药剂的组合物接触，其中在被重编码为期望的分化状态的群中的免疫细胞的数量或比例与未接触表1药剂的免疫细胞相比被增加。
在一些实施例中，对适合基于细胞的过继性疗法的免疫细胞群或亚群进行调节的方法包含将免疫细胞与包含至少一种选自表1的药剂的组合物接触，与未接触表1药剂的免疫细胞相比所述组合物的量足以增加细胞的扩增，增加一种或多种期望的免疫细胞亚群的数量或比例，并且/或者改进免疫细胞的增殖、细胞毒性、细胞回忆、和/或持久性。在一个实施例中，用于免疫细胞处理的药剂为约0.1nM至约50μM。在一个实施例中，用于免疫细胞处理的药剂为约0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nM、500nM、1μM、5μM、10μM、20μM、或25μM、或其间的任何浓度。在一个实施例中，用于免疫细胞处理的药剂为约0.1nM至约5nM、约1nM至约100nM、约50nM至约250nM、约100nM至约500nM、约250nM至约1μM、约500nM至约5μM、约3μM至约10μM、约5μM至约15μM、约12μM至约20μM、或约18μM至约25μM。
在一些实施例中，对适合基于细胞的过继性疗法的免疫细胞群或亚群进行调节的方法包含将免疫细胞与包含至少一种选自表1的药剂的组合物接触，与未接触表1药剂的免疫细胞相比接触时间足以增加细胞的扩增，增加一种或多种期望的免疫细胞亚群的数量或比例，并且/或者改进免疫细胞的增殖、细胞毒性、细胞回忆、和/或持久性。在一个实施例中，免疫细胞与一种或多种表1药剂接触至少30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、16小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、15天、20天、25天、30天、或者其间的任意时间长度。在一个实施例中，免疫细胞与一种或多种表1药剂接触约0.5小时至约2小时、约1小时至约12小时、约10小时至约2天、约1天至约3天、约2天至约5天、约3天至约6天、约5天至约8天、约7天至约14天、约12天至约22天、约14天至约25天、约20天至约30天。在一些实施例中，免疫细胞与一种或多种表1药剂接触不小于16小时、14小时、12小时、10小时、8小时、6小时、4小时、2小时、或者其间的任意时间长度。照此，例如，所述足够长的时间不小于15、13、11、9、7、5、3、或1小时。在所述方法的一些其它实施例中，所述足够长的时间不小于24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、或者其间的任意时间长度。照此，例如，所述足够长的时间不小于30、42、54、66、78、90小时。
对适合基于细胞的过继性疗法的免疫细胞群或亚群进行调节的方法包含将免疫细胞与包含至少一种选自表1的药剂的组合物接触，还可进一步包含在接触之后从免疫细胞富集或分离一种或多种期望的亚群，其中所述一种或多种期望的亚群选自由以下组成的群组：初始T细胞、干细胞记忆性T细胞、中央记忆性T细胞、适应性NK细胞、以及I型NKT细胞。适应性NK细胞可具有CD57+NKG2C+表型或进一步成熟的CD57+群。在一些实施例中，足够量的包含GSK3抑制剂的组合物、以及包含IL2、IL15、IL12、IL18以及IL21的刺激性细胞因子中的至少一种、或者MEK抑制剂、雷帕霉素、以及STING激动剂中的一种或多种可用来进行处理/调节。在一些实施例中，包含GSK3抑制剂的组合物可进一步包含一种或多种另外的选自由以下组成的群组的添加剂：肽、细胞因子、有丝分裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或置换因子、包含一种或多种目标多核酸的载体、以及抗体或其片段。在一些实施例中，GSK3抑制剂为CHIR99021。在一些实施例中，另外的添加剂包含抗体或抗体片段。在这些实施例的一些中，抗体或抗体片段特异性地与病毒抗原结合。在其它实施例中，抗体或抗体片段特异性地与肿瘤抗原结合。
待处理或待调节的免疫细胞群可从受检者或供体分离，或者从以下分离或者包含在以下中：受检者/供体的外周血液、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位组织、腹水、胸腔积液、脾组织、肿瘤分离。受检者可以是健康的，或者可患有自体免疫性疾病、造血系统恶性肿瘤、病毒感染或实体瘤。在一些实施例中，受检者是CMV血清阳性的，或者可在以前被施用过基因修饰的免疫细胞。在一些实施例中，受检者可以是CMV血清阳性的。在一些其它实施例中，所分离的用于调节的免疫细胞被基因修饰(由重排、突变、基因印记和/或表观基因修饰被基因工程化，或者天然衍生自重排、突变、基因印记和/或表观基因修饰)。在一些实施例中，所分离的用于调节的免疫细胞包含至少一种基因修饰形态。在一些实施例中，所分离的免疫细胞群被基因组工程化并包含插入、缺失、和/或核酸置换。在一些特定实施例中，免疫细胞包含对T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、和/或CD16或其变体的过表达进行编码的外源核酸。照此，基因修饰的免疫细胞被分离，以便使用如所公开的本发明组合物和方法进行离体调节。在一些实施例中，在调节之后，从受检者分离的基因修饰的免疫细胞可给相同的供体或者不同的患者施用。
可替代地，用于调节的免疫细胞群可从干细胞、造血干细胞或祖细胞、或者祖细胞体外分化；或从造血或非造血系的非多能细胞转分化。在一些实施例中，衍生用于调节的免疫细胞的干细胞、造血干细胞或祖细胞、祖细胞、或非多能细胞被基因组工程化并包含插入、缺失、和/或核酸置换，照此，衍生的用于调节的免疫细胞包含通过在来源细胞中进行基因组工程化而引入的相同基因形态。
在使用GSK3抑制剂对NK细胞群进行调节的方法中，NK细胞群用足够量的包含GSK3抑制剂的组合物培养，培养时间足以改进NK细胞对于过继性细胞疗法的治疗潜力。为了获得用于调节的NK细胞群，可从受检者分离外周血单核细胞(PBMC)。PBMC由淋巴细胞(T细胞，大约30％至70％；B细胞，大约10％至20％；NK细胞，大约5％至20％)和单核细胞组成。受检者可以是健康的；可患有自体免疫性疾病、造血系统恶性肿瘤、病毒感染或实体瘤；或者可以是CMV血清阳性的，或者可在以前被施用过基因修饰的免疫细胞。
在所述方法的一些实施例中，可(例如)使用CD3和CD19抗体、或本领域已知的其它分选方法将去除分离的PBMC的T细胞和B细胞。在一些实施例中，对分离的PBMC可不进行任何持久的去除前培养或扩增，或者进行最低限度的去除前培养或扩增。通过“不进行任何持久的去除前培养或扩增，或者进行最低限度的去除前培养或扩增”，它的意思是PBMC的去除前培养小于48小时、36小时、24小时、12小时、8小时、6小时、或小于2小时。在一些实施例中，PBMC的去除前培养不大于2、4、6、8、10、12、24、48小时。在一个实施例中，PBMC的去除前培养不比过夜更久。在一些实施例中，在去除之前PBMC根本未被培养。通过“去除前培养”，它的意思是在去除T细胞和B细胞之前使用细胞因子、饲养细胞、阻断抗体或激活抗体、重组激活配体、和/或同种自体白血球但是不使用如本文所公开的小分子对PBMC进行培养，以维持或扩增PBMC。在典型的细胞因子培养条件下，T和B细胞可比其它亚群(比如NK细胞，特别是一些NK细胞亚型，包括(但不限于)CD57+和CD57+NKG2C+NK细胞)扩增得更快。这可能是由于T和B细胞可能在这些培养条件下更容易生长；可能具有更快的生长速率；可能在起始细胞群中具有更大的百分比；并且/或者由于条件不适合这些NK细胞亚群生长和扩增。因此，随着这些NK细胞亚群过度生长，延长的去除前培养可能会在培养的细胞群中产生更小的NK细胞亚群百分比。已经显示CD57+细胞和适应性NK细胞的增殖性比其它NK亚群更低，即使在常规细胞因子培养下没有来自T和B细胞的生长压力/竞争的情况下亦是如此。照此，在开始时不去除T和B细胞的情况下对具有小于约0.1％、约1％、约5％、或小于约10％的CD57+或适应性NK细胞的PBMC进行培养，会从PBMC群减少或者甚至消除CD57+和CD57+NKG2C+NK亚群。
因此，本发明的一个方面提供使用GSK3i对包含PBMC的样品进行多天培养，以选择性地扩增PBMC样品中的NK亚群。在一些实施例中，PBMC已经被去除T细胞和B细胞。在一些实施例中，对PBMC在使用GSK3抑制剂进行培养之前未进行缺失前培养。在其它实施例中，去除前培养是最小限度的，并且小于24小时、16小时、8小时或2小时、或者其间的任意时间长度。在一个实施例中，在GSK3抑制剂的存在下进行的多天培养在无饲养细胞的条件下进行。在一个实施例中，在GSK3抑制剂的存在下进行的多天培养使用饲养细胞进行。
根据本公开，在一个实施例中，对细胞群未进行持久的去除前培养，并且在去除T细胞和B细胞之后，所述细胞群包含CD57-、CD57-NKG2C+、CD57+和/或CD57+NKG2C+NK细胞。在一些实施例中，在去除之后但是未进行去除前培养的群中的NK细胞的百分比为约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、或约30％。在一些实施例中，在去除之后但是未进行去除前培养的群中的NK细胞的百分比为至多约10％、至多约20％、至多约30％、至多约40％、至多约40％、至多约50％、至多约60％、或至多约70％。在一些实施例中，在去除之后但是未进行去除前培养的群中的CD57+NK细胞或CD57+NKG2C+细胞的百分比为约0.1％、约0.5％、约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、30％、35％、40％、45％、50％、以及其间的任何百分比。
然后在本文提供的小分子的存在下，对从已经被去除T细胞和B细胞并且已经经历最小限度的去除前培养或未经历去除前培养的PBMC分离的以上NK细胞群(称作“过夜激活的”NK细胞)进行调节，调节时间足以调节NK细胞及其亚群的表型和功能。在一些实施例中，调节NK细胞包含使NK细胞成熟。在一个实施例中，调节NK细胞包含将CD57-NK细胞变为CD57+NK细胞以驱使NK细胞成熟。在一些实施例中，调节NK细胞包含将CD57-NKG2C+NK细胞变为CD57+NKG2C+NK细胞。在一些实施例中，调节NK细胞包含增加NK细胞的细胞毒性，并且/或者改进细胞因子的响应。在一些实施例中，调节NK细胞包含将CD57-NK细胞变为CD57+NK细胞以驱使NK细胞成熟，从而增加细胞毒性，并改进细胞因子的响应。在一些其它实施例中，调节NK细胞包含增加CD107a、NKG2C、NKG2D、CD16、KIR、CD2、以及天然细胞毒性受体(NCR)中的一种或多种的细胞表达。NCR包括NKp30、NKp44以及NKp46。在一些其它实施例中，调节NK细胞包含增加NKp30的表达。在一些其它实施例中，调节NK细胞包含增加CD107a。因此，本发明还提供与未调节的NK细胞相比在CD107a、NKG2C、NKG2D、CD16、KIR、CD2、NKp30、NKp44以及NKp46中的一种或多种中具有增加的表达的调节的NK细胞的群，其中它们的表达被增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高。在又一些其它实施例中，调节NK细胞包含改进NK细胞或其亚群的增殖、细胞因子释放、细胞回忆、和/或持久性。在又一些其它实施例中，调节NK细胞包含改进NK细胞或其亚群的细胞扩增、维持、分化、去分化、和/或存活率。
足以调节NK细胞的表型和/或功能的时间可包含(例如)至少0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、2天、或者其间的任意时间长度。在一些实施例中，本发明的方法中获得的NK细胞在GSK3抑制剂的存在下被调节至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28、或者其间的任意时间长度。在一些实施例中，足以调节NK细胞的时间不小于12小时、16小时、24小时、48小时、3天、4天、5天、6天、或7天。在一些实施例中，本发明的方法中获得的NK细胞在GSK3抑制剂的存在下被调节不小于24小时、48小时、3天、4天、5天、6天、或7天。在一些实施例中，足以调节NK细胞的时间为1至28天、1至21天、1至14天、1至7天、2至12天、3至11天、4至10天、5至9天、6至8天、7至14天、14至21天、21至28天、或者包括在其中的任何范围。在一些实施例中，本发明的方法中获得的NK细胞在GSK3i的存在下被调节1至28天、1至21天、1至14天、1至7天、2至12天、3至11天、4至10天、5至9天、6至8天、7至14天、14至21天、21至28天、或者包括在其中的任何范围。在一些实施例中，足以调节NK细胞的时间为约3天、约5天、约7天、或约9天。在一些实施例中，本发明的方法中获得的NK细胞在GSK3i的存在下被调节约3天、5天、约7天、或约9天。
在一些实施例中，对免疫细胞进行足够时间的调节在小于30μM、25μM、20μM、15μM、10μM、或1μM的小分子的存在下进行。在一些实施例中，对免疫细胞进行足够时间的调节使用的小分子不大于25μM、20μM、15μM、10μM、5μM、或1μM。在一些实施例中，在GSK3抑制剂的存在下被调节足够时间的NK细胞群具有增加的NK细胞扩增，在数量或百分比上增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、或10倍。在一些实施例中，在GSK3抑制剂的存在下调节的NK细胞群具有至少约80％、85％、90％、95％、或至少约99％的NK细胞纯度。在一些实施例中，在GSK3抑制剂的存在下调节的NK细胞群具有增加的CD57+NK细胞扩增，在数量或百分比上增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、或10倍。在一些实施例中，调节之后的群中的CD57+NK细胞或CD57+NKG2C+细胞的百分比为至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％或80％、以及其间的任何百分比。在一些实施例中，在GSK3抑制剂的存在下调节的NK细胞群具有增加的CD57+NKG2C+NK细胞扩增，在数量或百分比上增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、或10倍。
根据本文所公开的方法使用GSK3抑制剂调节NK细胞群的方法提供用于细胞疗法的调节的NK细胞，其具有增加的NK亚群(比如CD57+NK细胞和CD57+NKG2C+NK细胞)的数量或比例；改进的细胞扩增、维持以及成熟；增强的NK细胞亚群的适应性/记忆性类状态，其会引起改进的增殖、细胞回忆、和/或持久性；以及改进的细胞毒性和细胞因子响应以及分泌。因此，本发明的不同方面进一步提供选择性地扩增NK细胞及其(一个或多个)亚群的方法；扩增和调节适应性NK细胞的方法；改进NK细胞的扩增、维持或成熟的方法；增强NK细胞的适应性/记忆性类状态的方法；改进NK细胞治疗潜力(包括(但不限于)细胞增殖、细胞回忆、以及细胞持久性)的方法；改进NK细胞的细胞毒性的方法；以及增加NK细胞的细胞因子分泌和响应的方法，其包含为了进行调节在不进行去除前培养的情况下将经去除的PBMC样品与包含足够量的GSK3抑制剂的组合物接触，接触时间足以获得调节的细胞，其对于细胞疗法具有改进的潜力。
在另一个实施例中，以上方法包含从受检者获得PBMC样品；在不对该样品进行去除前培养的情况下，(例如)使用包含CD3和CD19的抗体对PBMC样品进行去除；以及将经去除的PBMC样品与包含足够量的GSK3i的组合物接触，接触时间足以获得调节的细胞，其对于细胞疗法具有改进的潜力。
在又一个实施例中，以上方法包含从受检者获得PBMC样品；在不对该样品进行去除前培养的情况下，使用包含CD3和CD19或其它非NK特异性的标记的抗体对PBMC样品进行去除；为了进行调节，将经去除的PBMC样品与包含足够量的GSK3i的组合物接触，接触时间足以获得调节的细胞；以及从调节的细胞分离CD57+NK细胞。
在以上方法的一些实施例中，所述方法可进一步包含在将NK细胞与包含GSK3抑制剂的组合物接触的步骤之前或期间激活NK细胞群。
在以上方法的一些实施例中，与包含足够量的GSK3i的组合物接触足够的时间可在无饲养细胞的条件下进行，即没有饲养细胞或其组分，以及没有经饲养细胞调理的培养基。
在以上方法的一些实施例中，与包含足够量的GSK3i的组合物接触足够的时间可在饲养细胞的存在下进行。在一些实施例中，对饲养细胞通过基因组编辑进行修饰，以表达外源性的表面蛋白。
IV.经处理的免疫细胞、免疫细胞群或亚群的治疗用途
本发明提供一种组合物，其包含分离的免疫细胞群或亚群，所述免疫细胞已经与一种或多种选自表1的药剂接触，当用于基于细胞的过继性疗法时所述药剂的量足以改进免疫细胞的治疗潜力。在一个实施例中，已经被处理过的所分离的免疫细胞群或亚群包含增加的初始T细胞、干细胞记忆性T细胞、和/或中央记忆性T细胞的数量或比例。在一个实施例中，已经被接触的所分离的免疫细胞群或亚群包含增加的I型NKT细胞的数量或比例。在另一个实施例中，已经被接触的所分离的免疫细胞群或亚群包含增加的适应性NK细胞的数量或比例。本文考虑使用NK细胞疗法产物与靶向肿瘤细胞或调节NK细胞的细胞毒性活性的其它药物一起进行组合治疗。在组合物的一些实施例中，组合物进一步包含一种或多种另外的选自由以下组成的群组的添加剂：肽、细胞因子、有丝分裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或置换因子、包含一种或多种目标多核酸的载体、抗体、化疗剂或放射性部分、以及免疫调节药物(IMiD)。
本发明还提供组合物和组合治疗的方法，其包含用一种或多种包含表1所列化合物的药剂和另外的治疗剂调节的免疫细胞。在一些实施例中，所述另外的治疗剂包含抗体或抗体片段。在一些实施例中，所述抗体可以是人源化的抗体、人源化的单克隆抗体、嵌合抗体。在一些实施例中，抗体或抗体片段特异性地与病毒抗原结合。在其它实施例中，抗体或抗体片段特异性地与肿瘤抗原结合。在一些实施例中，肿瘤或病毒特异性的抗原激活调节的NK细胞，使其利用抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)和目标细胞的溶解。单克隆抗体(mAb)与目标细胞以及NK细胞和其它细胞类型上衔接的CD16结合，从而通过ADCC对肿瘤细胞进行体内和体外杀伤。mAb还可通过阻断NK细胞抑制来增强ADCC并刺激NK细胞。在一些实施例中，NK细胞介导的ADCC通过由调节的NK细胞表达的CD16及其基因工程化的变体进行。CD16的基因工程化变体包括(但不限于)不可切割的CD16、高亲和性CD16(haCD16)、以及高亲和性不可切割CD16(hnCD16)。照此，本发明的以上方面提供GSK3i调节的NK细胞，其能够在抗体组合癌症治疗中发挥ADCC。在一些实施例中，适合与本文提供的抗癌NK细胞一起进行组合治疗的抗体包括(但不限于)抗CD20(利妥昔单抗(retuximab)、维妥珠单抗、奥法木单抗、乌布妥昔单抗(ublituximab)、奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)、阿托珠单抗)、抗Her2(曲妥珠单抗)、抗CD52(阿仑单抗)、抗EGFR(西妥昔单抗)、以及抗CD38(达雷木单抗)，以及它们人源化的和Fc修饰的变体。另外，双特异性和三特异性抗体的设计将靶向肿瘤细胞抗原的抗体(比如抗CD19，CD20，和CD33抗原)的Fab区与识别NK细胞上的CD16的另一个Fab区一起融合，引起对NK细胞的刺激以及随后的肿瘤细胞杀伤。
在一些实施例中，所述另外的治疗剂包含一种或多种化疗剂或放射性部分。化疗剂是指细胞毒性抗肿瘤剂，即优选杀伤瘤细胞或者破坏迅速增殖的细胞的细胞周期的化学药剂，或者发现根除癌干细胞的化学药剂，以及治疗性地用来防止或减少瘤细胞生长的化学药剂。化疗剂有时还被称作抗肿瘤药物或细胞毒性药物或者抗肿瘤剂或细胞毒性剂，并且在本领域中是众所周知的。
在一些实施例中，化疗剂包含蒽环霉素、烷基化药剂、烷基磺酸酯、氮丙啶、乙烯亚胺、甲基蜜胺、氮芥，亚硝基脲、抗生素、抗代谢物、叶酸类似物、嘌呤类似物、嘧啶类似物、酶、足叶草毒素、含铂药剂、干扰素、以及白细胞介素。示例性的化疗剂包括(但不限于)烷基化药剂(环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、六甲三聚氰胺、塞替派、白消安、亚硝脲氮芥、洛莫司汀、司莫司汀)、抗代谢物(氨甲喋呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁)、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、长春地辛)、鬼臼乙叉甙(依托泊苷、依托泊苷邻醌、以及替尼泊苷)、抗生素(柔红霉素、阿霉素、米托蒽醌、双蒽烯(bisanthrene)、放线菌素D、普卡霉素、嘌呤霉素、以及短杆菌肽D)、紫杉醇、秋水仙碱、松胞菌素B、吐根碱、美登素、以及安吖啶。另外的药剂包括氨鲁米特、顺铂、卡铂、丝裂霉素、六甲蜜胺、环磷酰胺、洛莫司汀(CCNU)、卡莫司汀(BCNU)、依立替康(CPT-11)、阿仑单抗、六甲蜜胺、阿那曲唑、L-天门冬酰胺酶、阿扎胞苷、贝伐单抗、贝沙罗汀、博莱霉素、硼替佐米、白消安、卡普睾酮、卡培他滨、塞来考昔、西妥昔单抗、克拉屈滨、克罗拉滨、阿糖胞苷、达卡巴嗪、地尼白介素、己烯雌酚、多西他赛、屈他雄酮、表柔比星、厄洛替尼、雌莫司汀、依托泊苷、乙炔雌二醇、依西美坦、氟尿苷、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、氟他胺、氟维司群、吉非替尼、吉西他滨、戈舍瑞林、羟基脲、替依莫单抗、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素α(2a,2b)、依立替康、来曲唑、甲酰四氢叶酸、亮丙瑞林、左旋咪唑、氮芥、甲地孕酮、美法仑(melphalin)、巯基嘌呤、氨甲喋呤、甲氧沙林、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、诺龙、诺非单抗(nofetumomab)、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸盐、培美曲塞、培加酶、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、聚苯丙生、卟吩姆钠、甲基苄肼、阿的平、利妥昔单抗、沙格司亭、链脲霉素、它莫西芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睾丸内脂、硫鸟嘌呤、噻替派、拓扑替康、托瑞米芬、托西莫单抗、曲妥珠单抗、维甲酸、乌拉莫司汀、戊柔比星、长春瑞滨、以及唑来膦酸。其它合适的药剂是批准用于人类使用的那些，包括将会作为化疗剂或放疗剂被批准并且是本领域中已知的那些。对这种药剂可通过许多标准的内科医生和肿瘤医生参考文献中的任一个(例如Goodman&Gilman的《治疗学的药理学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics)》，第9版，McGraw-Hill，纽约，1995年)或通过美国国家癌症研究所网站(fda.gov/cder/cancer/druglistframe.htm)进行引用，两者均不时进行更新。
像沙利度胺、来那度胺、以及泊马度胺这样的免疫调节药物(IMiD)刺激NK细胞和T细胞两者。如本文所提供，IMiD可与调节的治疗性免疫细胞一起用于癌症治疗。
可通过给适合过继性细胞疗法的受检者施用本发明的细胞来缓解多种疾病。疾病的实例包括：各种自身免疫性疾病，包括但不限于斑秃、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、皮肤肌炎、糖尿病(I型)、一些形式的幼年特发性关节炎、血管球性肾炎、格雷夫氏症、吉兰-巴雷综合症、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力症、一些形式的心肌炎、多发性硬化症、天疱疮/类天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、类风湿性关节炎、硬皮病/系统性硬化症、修格兰氏症候群、系统性狼疮、红斑性症、一些形式的甲状腺炎、一些形式的眼色素层炎、白斑病、具有多血管炎的肉芽肿症(韦格纳氏)；血液恶性肿瘤，包括但不限于急性和慢性白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征；实体瘤，包括但不限于脑部、前列腺、乳腺、肺部、结肠、子宫、皮肤、肝脏、骨头、胰脏、卵巢、睾丸、膀胱、肾脏、头部、颈部、胃部、子宫颈、直肠、喉部、或食道的肿瘤；以及感染，包括但不限于与HIV(人类免疫缺陷性病毒)、RSV(呼吸道合胞病毒)、EBV(EB病毒)、CMV(巨细胞病毒)、腺病毒以及BK多瘤病毒相关的疾病。
实例
以说明性的方式而不是以限制性的方式提供以下实例。
实例1-方法和材料
体外T细胞培养。新制的leukopaks(AllCells，加利福尼亚州阿拉米达)从健康供体获得，使用EasySep人类T细胞富集试剂盒(Stem Cell Technologies，加拿大温哥华)从其负选择T细胞。将新近分离的T细胞分成等份并冷藏。在开始筛选的那天，将T细胞融化并洗入具有5％人类AB血清、IL-2、青霉素/链霉素、以及另外的补充物的X-Vivo15中。使用抗CD3/抗CD28免疫磁珠(ThermoFisher，马萨诸塞州沃尔瑟姆)以3:1的珠粒:细胞比将细胞以5xl05个细胞/ml布置到平底384孔板中。以10μM的最终浓度将单独的化合物添加到每个板第3列至第22列的每个孔中。将阳性对照和阴性对照添加到另外的孔中。在37度和5％CO2下将细胞孵育约6天。
流式细胞术。在培养的第6天，细胞用可固定的活力标记和荧光基团缀合的抗体染色：CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CD62L、CCR7、CD27、以及CD122(BD Biosciences，加利福尼亚州圣何塞；BioLegend，加利福尼亚州圣地亚哥)。刚好在获取之前添加荧光绝对计数珠粒(Spherotech，伊利诺伊州莱克福里斯特)。数据获取在BD Fortessa X-20(BDBiosciences)上进行，并使用Treestar软件(FlowJo，俄勒冈州阿什兰)和Spotfire(Tibco，马萨诸塞州波士顿)对数据进行分析。
NK细胞的分离。健康成年供体血液从商业来源获得，或者从加利福尼亚州拉荷亚斯克利普斯研究所的GCRC中心实验室获得。使用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare：LifeSciences)通过密度梯度离心分离将外周血单核细胞(PBMC)分离，然后去除B和T细胞，根据制造商的用法说明书在24至36小时内不使用CD19 Microbeads(Miltenyi Biotec，#130-050-301)和CD3 Microbeads(Miltenyi Biotec，#130-050-101)对PBMC进行培养。
NK细胞的培养：将去除CD3/CD19的PBMC(0.5-1x 10E6/mL)在B0培养基(2:1的DMEM(Corning Cell-Gro#10-017-CV)和Ham's F12(Corning Cell-Gro#10-080-C)的混合物，并具有10％人类AB血清(Valley Biomedical，#HP1022)、100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素(Corning，30-002-CI)、20uM 2-巯基乙醇(Sigma，M3148)、50uM乙醇胺(Sigma，E0135)、10ug/mL抗坏血酸(Sigma，A4544)、以及1.6ng/mL亚硒酸钠(Sigma，S5261)中培养。在存在或不存在GSK3抑制剂CHIR99021(BioVision#1677-5)、组蛋白赖氨酸甲基转移酶抑制剂BIX01294(Tocris，3364)、TGF-β1受体抑制剂SB-431542(BioVison，1674-5)、或人类干扰素α(R&D Systems，11200-1)的情况下将细胞在含有10ng/mL重组人类IL-15(LifeTechnologies，PHC9154)的培养基中培养7至8天(至多4周)。在培养之后，使用锥虫蓝或通过Cellometer(Nexcelom)对细胞进行计数，并将细胞用于流式细胞术和功能性化验。流式细胞术在BD LSRFortessa上进行，并通过FlowJo软件对结果进行分析。流式细胞术使用可商购的针对以下表面标记的抗体：CD3、CD14、CD16、CD19、CD56、CD57以及NKG2C(BDBiosciences、Biolegend、或R&D Systems)。在指示的情况下使用K562饲养细胞。在指示的情况下添加其它调节剂和培养剂。
NK细胞的分选：去除CD3/CD19的PBMC用10uM的e450增殖染料(eBioscience)标记，并用FITC缀合的抗CD57、PE缀合的抗NKG2C、APC缀合的抗CD56、以及Percp-Cy5.5缀合的抗CD3抗体(BD Biosciences和R&DSystems)染色。根据CD57和NKG2C；CD57+NKG2C-、CD57+NKG2C+、CD57-NKG2C+、以及CD57-NKG2C-的表达分选出CD3-CD56+NK细胞的四个群。对所分选的NK细胞群使用10ng/ml IL-15和CHIR99021或载体对照以2:1的NK:单核细胞比在BO培养基中进行培养。经染色但未分选的细胞与对照平行培养。
NK细胞的细胞毒性化验。细胞毒性根据以前公布的方法(Kim等人《免疫方法杂志(J Immunol Methods)》.2007年8月31日；325(1-2):51-66)使用基于流式细胞术的方法来测定。NK细胞与经e450增殖染料标记的目标共培养4小时。使用CellEventTM半胱天冬酶-3/7Green流式细胞术化验试剂盒(Lifer Technologies)来化验目标细胞中的细胞死亡，并在BD LSRFortessa血细胞计数器上读取样品。对SKOV-3目标的杀伤使用Incucyte Zoom仪器进行定量。对SKOV-3细胞用NucLight-Red BacMam试剂(Essen Biosciences)进行瞬时转导，并将其与所指示的NK细胞群共培养74小时，在2小时的间隔摄取图像。使用CellEventTM半胱天冬酶-3/7Green检测试剂来监控半胱天冬酶3/7的活性，以指示经受细胞凋亡的目标细胞。将目标细胞的数量归一化为单独培养的SKOV-3细胞，并根据半胱天冬酶3/7的活性对经受细胞凋亡的目标进行定量。
NK细胞的细胞内细胞因子染色：对去除CD3/CD9的PBMC用10ng/ml IL-15和5uMCHIR99021或载体对照培养7天。在培养的第7天，将细胞洗涤，并分别用IL-12和IL-18(分别为10ng/ml和50ng/ml)(Life Technologies)或者用K562细胞以1:1的比例培养。培养基中包括Golgistop(BD Biosciences)以帮助细胞因子的细胞内检测。在4小时的培养时段之后，对细胞针对细胞表面抗原进行染色，并在细胞内染色之前用IFN-γ和TNF-α的抗体(BDBiosciences)固定。染色根据制造商的说明书使用BD Cytofix/CytopermTM试剂盒进行。
调节NK细胞的化合物的筛选：对去除CD3/CD19的PBMC在存在或不存在饲养细胞的情况下用10ng/ml IL-15和5uM CHIR99021培养7天。在第0天以多种剂量添加各种小分子和/或细胞因子，以评估其对增殖和表型的影响。在整个7天期间对培养物监控培养基的酸化或细胞的过度生长。在培养之后，对细胞进行收集和染色，以便通过流式细胞术进行表型分析。对数据进行分析，以分析增殖和标记表达的改变。流式细胞术在BD LSRFortessa上进行，并通过FlowJo软件对结果进行分析。流式细胞术使用可商购的、针对以下表面标记的抗体：CD3、CD14、CD16、CD19、CD56、CD57以及NKG2C(BD Biosciences、Biolegend、或R&DSystems)。
使用调节的NK细胞进行体内肿瘤清除：在腹膜内移植2xl05个表达荧光素酶的SKOV-3细胞之前以300rads将NSG小鼠辐射一天。移植卵巢癌细胞之后5天，不对小鼠进行处理，仅用赫赛汀处理，或者使用赫赛汀、IL-15、以及经IL-15和CHIR99021培养7天的NK细胞处理。对表达荧光素酶的SKOV-3细胞使用IVIS成像系统在第21天进行成像。
实例2-用于免疫细胞调节的药剂
对数据进行分析，以便识别出产生更高比例或更大绝对数量的表型上确认的初始细胞、干细胞记忆性细胞、或中央记忆性T细胞的化合物。这些细胞由CCR7和CD62L的表达表征。因此对共表达这两种识别标志的细胞进行了评估。在活的CD4+群和活的CD8+群中，对共表达CCR7和CD62L的细胞的百分比进行测定。如期望的T细胞亚型所表明，CD62L或CCR7在T细胞上的表达被描述为具有对于CAR-T细胞疗法和可能的其它过继性T细胞疗法有利的功能特征。在AMPK抑制剂dorsomorphin、萜烯七脂酸、GSK3抑制剂、6-巯基嘌呤、AC-93253碘化物、替拉曲考、PI-103、5-氮杂胞苷、5,7-二氯-8-羟基喹啉、呋喃妥因、5-氯-7-碘-8-羟基喹啉、或二乙烯三胺五醋酸的处理下，共表达CCR7和CD62L的细胞的数量或比例在活的CD4+群和活的CD8+群两者中均增加(表2)。在氟维司群、毒胡萝卜素、SU4312、氟达拉滨、7-氯-4-(二甲基氨基)-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢-2-并四苯甲酰胺、硝呋酚酰肼、依酚氯铵的处理下，共表达CCR7和CD62L的细胞的数量或比例至少在活的CD8+群中增加(表2)。在1-吡咯烷二硫代甲酸铵盐、U0126、替米沙坦、环孢菌素A、1,3,5-三(4-羟基苯基)-4-丙基-1H-吡唑、BAY61-3606、原卟啉IX二钠、雷帕霉素、核抑制剂罗斯考汀、PAC-1、盐酸托氟沙星、BIX01294、以及特非那定的处理下，共表达CCR7和CD62L的细胞的数量或比例至少在活的CD8+群中增加(表2)。
另外还显示，基于包括(但不限于)CD57+和NKG2C+的表达在内的观察结果，GSK3(糖原合成酶激酶3)抑制剂保留CD3-CD19-CD56+NK细胞，并通过影响细胞成熟和亚型改变来增加适应性NK细胞亚群。
对相对于每个样品中的绝对计数珠粒的数量的这些门的每一个中的事件的数量进行计算，从而定义CD4+和/或CD8+群中的初始细胞、干细胞记忆性细胞、或中央记忆性T细胞的绝对数量的相对度量。对相对于每个384孔板中筛选的化合物样品的Z分数针对这4个值的每一个进行计算：1)CD4+中CCR7+CD62L+的百分比，2)CD8+中CCR7+CD62L+的百分比，3)CD4+中CCR7+CD62L+的绝对相对数量，以及4)CD8+中CCR7+CD62L+的绝对相对数量(图1)。对Z分数还针对每个样品中所有细胞的存活百分比和每个样品中细胞的相对绝对数量进行计算。“Z分数”是分数与一组分数中的中数之间的关系的统计学度量。Z分数为0意味着该分数与中数相同。Z分数还可以是正的或负的，表示它比中值高还是低，以及标准偏差是多少。
排除对T细胞的增殖或活力具有不利影响的化合物，将力度集中在最可能适合T细胞制造策略的化合物。对主要的命中化合物通过以下标准进行选择：‘存活百分比’Z分数大于-1，‘细胞的相对绝对数量’Z分数大于-1，4个值中的1个的Z分数大于+2。选择了34个化合物(表2)，这是由于它们对于4个主值中多于1个的主值具有高得多的Z分数并满足以上标准。还包括另外的5个化合物，这是由于它们调节T细胞的能力(表3)
表2—过继性细胞疗法中用于T细胞调节的药剂
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表3-过继性细胞疗法中用于T细胞调节的其它另外的药剂
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实例3-所选化合物的体外鉴别分类试验
进行体外试验以优化暴露化合物的方法并对其对T细胞功能有不利影响的化合物进行鉴别分类。初始测试确定单独化合物的最佳剂量，同时还评估之前观察到的对初始细胞、干细胞记忆性细胞、以及中央记忆性T细胞的影响是否可在另外的供体中重复。为了对其对T细胞有可能不利的功能影响的化合物进行鉴别分类，进行了对CAR转导的T细胞的增殖能力、极化为Th1和Th17的能力、通过低温保存/融化循环的存活率、转导效率、以及杀肿瘤活性的体外评估。对在扩增过程中可重复地改进初始细胞、干细胞记忆性细胞、或中央记忆性T细胞的比例或数量同时对T细胞功能没有显著不利影响的各化合物进行组合测试并评估加成作用或协同作用。通过这些评估，先导候选物或组合优先用于另外的体内测试。
实例4-使用所选化合物的过继性细胞疗法的体内模型
为了对体外筛选和随后的体外鉴别分类试验的结果进行转化，所选化合物的先导候选物被应用到过继性细胞疗法的体内模型。特别地，针对植入、杀肿瘤活性、次级杀肿瘤响应、迁移、细胞持久性、以及移植物抗宿主病对小分子调节对过继性细胞疗法的影响进行了研究。发现本身是持久性的过继性细胞疗法的特征的其它读数与临床中的有效响应相关联，也对这些读数进行研究。
这些试验在人源化的系统中进行，或者在替代鼠类模型中进行，在人源化的系统中人类细胞被过继性地转移到带有人类肿瘤的免疫缺陷的NSG小鼠中，在替代鼠类模型中免疫活性的动物带有同基因肿瘤并通过同基因细胞疗法对其进行治疗。
在替代模型系统或人源化模型系统中，给小鼠注入荧光素酶化的(luciferized)淋巴瘤或其它目标肿瘤。不久以后施用经载体或本文所公开的调节化合物预处理的过继性细胞疗法。细胞疗法和肿瘤两者的剂量均被优化，从而使得能够得到其中化合物治疗的有利或不利影响均可被观察到的窗口。在实验期间对动物重量、血浆细胞因子浓度、外周血、二级淋巴器官以及肿瘤团中的肿瘤和过继性细胞疗法的丰度、肿瘤负担、肿瘤转移、以及细胞疗法的表型进行监控。
能够缓解一种或许多种与肿瘤有关的体内参数的化合物具有预期的作用，包括(但不限于)降低有效清除肿瘤需要的细胞疗法剂量、增加外周血中过继性细胞疗法的持久性、增强向肿瘤部位的迁移、和/或增加针对高肿瘤剂量挑战的存活率。
实例5-使用GSK3抑制剂选择性扩增NK细胞及其亚群
本发明的一个方面是提供培养、扩增和/或调节用于过继性细胞疗法的NK细胞的方法和系统。在一些实施例中，用来培养、扩增和/或调节NK细胞的方法和系统未使用饲养细胞、或者经饲养细胞调理的培养基。外周血单核细胞(PBMC)从健康成年供体分离。分离的血液成分单采术产物(第0天，去除前；图2(左图))在不进行去除前培养的情况下使用抗CD19和CD3抗体去除的T和B细胞(第0天，去除后；图2(中图))。然后将去除后的细胞群在无饲养细胞的条件下在重组人类IL-15(10ng/mL)和5μMCHIR99021(一种GSK3抑制剂)的存在下培养约3至7天。如所显示的，用IL-15和GSK3抑制剂进行培养在第7天培养时似乎会选择性地且显著地驱使NK细胞(CD56+CD3-)从约20％(图2(中图))扩增至约99％(图2(右图))。相比而言，去除后的群中剩余的T细胞(CD56-CD3+)(约1％；图2(中图))未被扩增，从而导致在群中的百分比降低(至0.25％；图2(右图))。
在去除且过夜培养之后(第0天，去除后；仅使用IL15过夜培养；还称作“激活的(primed)”)，细胞群含有大约10至40％的(由于供体变化性)NK细胞。在用细胞因子和GSK3抑制剂培养7天之后，选择性的和显著的NK细胞扩增产生高度改进的NK细胞纯度：约80％至大于约99％(图3A)，代表平均约8倍的NK细胞数量增加(图3B)，一些样品具有更大的增加，约18倍。注意供体变化和方法变化可能会引起变化性。
对过夜激活的细胞群中的NK细胞亚群和第7天经GSK3i培养的细胞群中的NK细胞亚群进一步进行分析并进行对比。这些分析显示，在用GSK3抑制剂培养之后CD57+NKG2C+和CD57+NK亚群的细胞数量平均增加了约5至6倍(图3C和3D)。通常，CD57+和CD57+NKG2C+NK亚群以较小的数量存在于供体衍生的样品中。另外还显示，在仅使用细胞因子培养时CD57+和CD57+NKG2C+NK亚群未被良好维持(在不使用GSK3i的情况下培养7天；图4A)，这进一步表现为NK群中CD57+NK细胞的百分比降低(图4B)。相比而言，与在不使用GSK3i的情况下进行培养时的那些细胞数量相比，CD57+和CD57+NKG2C+NK细胞的数量在使用GSK3抑制剂培养的情况下显著增加，平均增加7至8倍(图4A)。此外，与在不使用GSK3i的情况下培养7天相比，使用GSK3i培养7天还使得完全NK群中的CD57+细胞的百分比增加(图4B)。本文的数据表明，常规的NK细胞群培养方法(即使用细胞因子但不使用GSK3抑制剂)，特别是当NK细胞包含在未进行T和/或B细胞去除的来自供体的PBMC群中时，会将CD57+和CD57+NKG2C+NK亚群从群中减少或者甚至消除。
实例6-GSK3抑制驱使NK细胞成熟
去除CD3/CD19的PBMC用e450增殖染料标记，将CD56+CD3-NK细胞成批地分选，或者根据CD57表达和NKG2C表达分选为4个群(图5A)。对未分离的完全NK细胞与CD57+NKG2C-(Q1)、CD57+NKG2C+(Q2)、CD57-NKG2C+(Q3)、CD57-NKG2C-(Q4)分选的NK细胞一起使用(1)细胞因子(10ng/ml IL15)和5μM CHIR99021，或者(2)单独的细胞因子加载体对照(例如单独的DMSO)(图5B)并以1:1的NK细胞:单核细胞比使用同种自体的CD14+单核细胞进行培养。在7天的培养时段之后，对每个分选群的培养物进行染色以进行流式细胞术，并分析增殖和细胞表面标记的表达。据显示，在使用GSK3抑制剂培养7天之后在完全NK细胞中存在CD57表达的显著增加(图5B，未分选的下部区块)。当分析每个细胞象限时，增加的CD57表达似乎未仅仅通过观察到的CD57+细胞增殖的增强来说明(图5B，Q1和Q2)。进一步发现，Q3和Q4分选的细胞(在使用GSK3抑制剂培养之前是CD57-)中上调的CD57的表达经历成熟过程，并大大促成增加的CD57水平(图5B，Q3和Q4)。因此得出结论，如CD57-细胞中CD57表达的上调所表明，GSK3抑制剂驱使NK细胞成熟，所述上调还会促成使用GSK3i调节的群中CD57+和CD57+NKG2C+NK细胞的百分比的显著增加。
进一步观察到，当对相同的去除CD3/CD19的PBMC样品使用GSK3抑制剂进行短期处理(例如，16小时的时段)时，GSK3抑制剂在培养物中未产生更高出现率的CD57+细胞(图11A)，其与载体处理类似。对具有或不具有GSK3i的培养物中的CD57+NK细胞部分的定量在图11B中做了进一步的展示，图11B显示，当对NK细胞群使用GSK3i处理足够的时间(大于16小时)时GSK3i驱使产生CD57+部分出现率更高的调节的NK细胞群。
高度稳定的CD57的表达很可能是NK细胞成熟中的后期阶段。与CD57-细胞相比，CD57+NK细胞响应于IL-2和IL-15的增殖性可能更低，并且被认为响应于IL-12和IL-18而产生更少的IFN-γ。因此惊讶地发现，使用包含GSK3抑制剂的组合物将NK细胞调节足够长的时间，会驱使CD57-变为CD57+，同时CD57+NK细胞的数量和比例两者在调节之后均被改进，并且具有增强的NK细胞的细胞毒性和细胞因子响应，这会在以下进一步进行说明。
实例7-GSK3抑制增强NK细胞的细胞毒性和细胞因子响应
对GSK3抑制增强直接从供体分离的NK细胞的细胞毒性的能力使用体外杀伤化验进行评估。对去除C3/C19的PBMC群仅使用10ng/mL IL-15处理过夜(激活的)，或者使用10ng/mL IL-15和5μM CHIR99021的组合培养7天。用于杀伤化验的目标细胞包括K562细胞、CD20+Raji细胞、HER2+SKOV3细胞以及HER2+A549细胞。应用到每个化验的E:T(效应物:目标)比的范围从0.1、0.5、1、5至10。在对目标细胞用经不同处理的NK细胞孵育4小时之后，计算各自的特异性杀伤(目标细胞溶解)百分比。在K562杀伤化验中，仅使用IL15处理的NK细胞的E:T50(50％的目标细胞溶解时的E:T比)为约10，而经GSK3i和IL15处理的NK细胞的E:T50则被降到约1，代表大大改进的细胞毒性活性(图6A)。Raji细胞更不易于产生NK介导的细胞毒性。图6B显示，尽管Raji细胞仍然对经IL-15处理过夜的NK细胞相当具有抗性，E:T50几乎高达100，但是当对NK细胞在GSK3i的存在下用IL15处理7天之后，E:T50被剧烈降到1至2，表明IL15和GSK3抑制剂的组合在增加NK细胞的细胞毒性从而甚至杀死抗性细胞方面的显著作用。
以类似的方式将SKOV3细胞使用以下进行处理：用IL15培养过夜得到的NK细胞、用IL15培养7天得到的NK细胞、以及用IL15和GSK3i培养7天得到的NK细胞。数据显示，根据由SKOV3细胞的消除(图6C)和半胱天冬酶3/7事件(细胞凋亡)最前面的最高峰(图6D)所表明的细胞杀伤，用GSK3i处理的NK细胞在SKOV3细胞的杀伤中在杀伤速率和杀伤效率两方面都是最有效的。
还显示与使用经IL15培养过夜得到的NK和经IL15培养7天得到的NK的ADCC杀伤相比，当使用HER2抗体(赫赛汀)来介导SKOV3的杀伤时用IL15和GSK3i培养7天的NK细胞的抗体导向的细胞毒性(ADCC)被增强(图6E)。为了进一步进行说明，具有HER2抗原的高表达的A549细胞系(小细胞肺癌系)(其可被赫赛汀抗体靶向以测试ADCC介导的杀伤)被用来测试NK细胞杀伤。在A549细胞杀伤的杀伤速率(图6F)和效率(图6G)两方面均观察到类似的增强的ADCC介导的经GSK3i培养7天的NK细胞的细胞杀伤。总之，数据显示，通过对在IL15+GSK3i中培养多天的NK培养物进行调节，适应性和CD57+成熟细胞被维持和扩增，从而使得NK细胞的细胞毒性作用显著增加。
还对GSK3抑制剂处理对NK细胞的细胞因子响应的影响进行了分析。对直接从供体获得的PBMC在去除CD3/CD9之后使用10ng/ml IL-15和5uM CHIR99021、或者仅使用IL15培养7天。在第7天，将细胞洗涤，并分别使用IL-12(10ng/ml)和IL-18(50ng/ml)、或者以1:1的刺激比例使用K562细胞进行培养。在4小时的培养时段之后，对细胞进行细胞表面抗原染色，并在细胞内染色之前分别用IFNγ和TNFα的抗体将细胞固定。图7显示，与激活的(去除，并用IL15培养过夜)样品相比或与仅使用IL15处理7天的样品相比，经GSK3i和IL15处理的NK细胞中IFNγ和TNFα的产生在IL12+IL18和K562两者的刺激下均被增加。经GSK3i和IL15处理的NK细胞中增加的细胞因子的产生由与对照NK细胞(用IL15培养过夜)和用IL15培养7天的NK细胞相比，图7A(IFNy)和7B(TNFa)所示的显著的百分比增加证明。此外，由于对IL-12和IL-18的响应通常与不成熟的NK细胞相关，因此以上所观察到的增强的IFNγ和TNFα响应证明，本文所公开的组合物和方法在直接从供体获得的去除CD3/19的PBMC中引起与成熟的NK(细胞毒性)和不成熟的NK(细胞因子响应性)两者均有关的功能的增强。
实例8-GSK3抑制剂在修饰的K562饲养细胞的存在下实现NK增殖和亚型变化
观察到使用本文公开的方法(即在第0天对PBMC进行去除，然后在GSK3i的存在下将NK细胞培养多天)将NK细胞与K562饲养细胞共培养，使得与无饲养细胞的培养相比显著增加选择性的NK细胞亚群的扩增，并增强功能。通过不进行去除前培养而是对供体样品立即进行去除接着用GSK3i培养多天，对未修饰的和修饰的K562细胞(例如利用转基因介导的某些蛋白的表面表达)进行了测试，并在选择性的NK增殖和亚型变化上显示出类似的结果。
对去除CD3/19的PBMC在DMSO(载体)、单独的0.1uM GSK3i CHIR99021(C)、或者0.1uM GSK3i CHIR99021、40nM MEKi PD0325901、以及1nM雷帕霉素的组合(CPR)的存在下用修饰的K562饲养细胞培养7天。图8A显示，与仅使用修饰为表达IL21和41BBL的K562系进行培养相比，添加小分子(C或CPR)增加了激活的NK细胞总体上的增殖。相比而言，通过GSK3i得到最高的CD57+NK细胞数量增加，而CPR则产生比载体对照更低的CD57+NK细胞数量(图8B)。但是当对NK细胞用修饰的K562饲养细胞培养时，使用CPR进行处理增加了NKG2C+NK细胞的数量(图8C)。
数据显示，当根据当前公开的方法应用时，饲养细胞、独特组合的小分子的存在可增强扩增的NK群的各种特征，包括如CD57+群的增加所表明变为成熟状态，或者如NKG2C+群的增加所表明变为适应性状态。
实例9-调节的NK细胞表型的体内维持
分别将用IL15培养过夜的NK细胞、用IL15和载体培养7天的NK细胞、以及用IL15和GSK3i培养7天的NK细胞转移到NSG小鼠中。7天后，对小鼠外周血的NK细胞进行表型分析(n＝3每组)。小鼠仅接受IL-15，未使用GSK3i。据显示，用GSK3i体外培养7天的NK细胞在转移后的至少1周内并且在不存在小分子的情况下维持其体内表型变化。CD57保持高水平，代表NK细胞的成熟，而当在不使用GSK3i的情况下培养细胞时则并非如此(图9A和9B)。此外，CD16(依赖于抗体的杀伤能力的标记)和NKG2C+/CD57+在体内保持(图9B)。
此外，还对使用本文提供的方法用GSK3i培养的NK细胞进行体内肿瘤清除的能力进行了测试。在腹膜内移植表达荧光素酶的SKOV-3细胞1天前以300rads辐射NSG小鼠。移植卵巢癌细胞5天后，不对小鼠进行处理，仅使用赫赛汀处理，或者使用赫赛汀、IL-15、以及用IL-15和CHIR99021培养7天的NK细胞处理。对表达荧光素酶的SKOV-3细胞在移植后的第21天(或者在处理16天之后)使用IVIS成像系统进行成像。图10显示，添加经GSK3i处理的NK细胞增强赫赛汀抗体处理的肿瘤抑制效果，表明经GSK3i处理的NK细胞能够介导抗体依赖性的细胞的体内细胞毒性。这些数据表明，使用IL-15和GSK3i进行多天培养的作用是持久的，并且在撤掉小分子CHIR99021之后的至少1周内仍在NK细胞上保留印记。
然后将使用本文提供的方法用GSK3i培养的NK细胞的体内肿瘤清除能力与过夜激活的去除CD3/CD19的PBMC和使用IL-15和DMSO培养7天的去除CD3/CD19的PBMC进行对比。将表达荧光素酶的SKOV-3细胞腹膜内注入NSG小鼠中。5天之后，用100ug赫赛汀抗体以及来自过夜激活的去除CD3/CD19的细胞、使用IL-15和DMSO(载体)培养7天的去除CD3/CD19的PBMC、或使用IL-15和GSK3i(GSK3i调节的NK细胞)培养7天的去除CD3/CD19的PBMC的2.5xl06个细胞对小鼠进行处理。对表达荧光素酶的SKOV-3细胞通过使用IVIS成像系统测量荧光素酶活性来定量。图12A显示，使用IL-15和GSK3i培养多天的NK细胞对于SKOV-3细胞始终高度体内有效。图12B显示经不同处理的NK细胞的体内SKOV-3ADCC杀伤作用的量化对比，其进一步确认图12A中的观察结果。
使用IL-15和GSK3i(GSK3i调节的NK细胞)培养多天的去除CD3/CD19的PBMC相对于过夜激活的NK细胞针对初级AML胚细胞的细胞毒性也进行了对比。对来自多个患者的初级AML胚细胞的特异性杀伤百分比通过基于流式细胞术的细胞毒性化验进行测量。图13显示，使用IL-15和GSK3i培养多天的NK细胞针对AML胚细胞始终高度有效。
对经GSK3i调节的NK细胞针对同种异体的PBMC的细胞毒性与K562肿瘤细胞一起在双靶标细胞毒性化验中进行了评估。对PBMC+K562+过夜激活的NK细胞或PBMC+K562+GSK3i调节的NK细胞中的特异性杀伤百分比进行了测量。每个健康PBMC目标供体的4个(图14A-C)或3个(图14D)NK细胞供体的代表平均值±SEM的数据表明GSK3i调节的NK细胞排斥恶性细胞并选择性地靶向正常细胞中的那些细胞的能力。
实例10-STING激动剂增强GSK3i调节的NK细胞的细胞因子产生和细胞毒性
STING(干扰素基因的刺激物)复合物在检测肿瘤细胞的存在以及促进身体先天性免疫系统的攻击性抗肿瘤响应方面起重要的作用。STING复合物作为直接胞质DNA传感器(CDS)和接头蛋白两者在I型干扰素的信号转导中通过不同的分子机制起作用。STING在外周淋巴组织中的造血细胞(包括T淋巴细胞、NK细胞、骨髓细胞以及单核细胞)中表达。对胞质DNA的检测引起一系列相互作用，其引起对STING通路的激活。激活所述通路触发干扰素β和干扰素α的产生。STING激动剂激活STING通路。STING激动剂包括与STING结合并将其激活的STING配体。已知的STING激动剂包括环二核苷酸(CDN)和氧杂蒽酮、及其类似物和衍生物。CDN可以是合成的，或者可来源于原核细胞或哺乳动物细胞。示例性的STING激动剂包括(但不限于)cGAMP、c-di-GMP、c-di-AMP、c-di-IMP、c-di-UMP、cAMP-GMP、R,R二硫代修饰的CDA化合物(ML RR-S2CDA和RR-S2 CDA)、ML RR-S2 cGAMP、DMXAA(5,6-二甲基氧杂蒽酮-4-乙酸)。另外的CDN类似物、衍生物、以及细菌CDN产物会继续被鉴定为STING配体。
去除CD3/CD19的PBMC在10ng/ml IL15以及(1)DMSO(载体)；(2)5μM GSK3i(CHIR99021)；(3)1μM STING激动剂(ML RR-S2 CDA)；或(4)5μM GSK3i+1μMSTING激动剂的存在下培养7天。在第7天，对NK细胞的功能和表型通过细胞内细胞因子染色、细胞毒性化验、以及流式细胞术进行评估。显示STING激动剂ML RR-S2 CDA对适应性NK表型和总的NK数量具有有限的作用。图15显示，将STING激动剂添加到GSK3i+IL-15NK细胞培养物中导致CD57+部分的持续维持，并且相对于使用IL-15+GSK3i进行培养略微增加。但是如图16所示，添加STING激动剂和GSK3i，对于使用IL-12+IL-18或使用相等数量的K562细胞进行的4小时刺激增加IFNγ(图16A)和TNFα(图16B)的NK细胞产生。与仅使用IL-15+GSK3i培养的细胞相比，使用K562细胞孵育之后CD107a+NK细胞的出现率对于使用IL-15+GSK3i+STING激动剂培养7天的细胞而言被增加(图16C)。增加的细胞表面CD107a表达与增强的脱粒以及NK细胞在STING激动剂和GSK3i的存在下的细胞毒性潜力相关。
对STING激动剂增强经GSK3i调节多天的NK细胞的细胞毒性的能力使用体外杀伤化验进行评估。对去除CD3/C19的PBMC群仅使用10ng/mL IL-15处理过夜(激活)，仅使用10ng/mL IL-15培养7天，使用10ng/mL IL-15和5μM CHIR99021的组合培养7天，或者使用10ng/mL IL-15、5μM CHIR99021以及lμM STING激动剂的组合培养7天。杀伤化验的目标细胞包括K562细胞、Nalm6细胞、以及KG-1细胞。每个化验应用的E:T(效应物:目标)比范围为从0.1、0.3、1、3、至10。在目标细胞用不同处理的NK细胞孵育4小时之后，对各自的特异性杀伤(目标细胞溶解)百分比进行计算，并示于图17中。在所有化验中，添加STING激动剂均增强了经GSK3i调节的NK细胞的细胞毒性，尽管增强程度不同。
还显示与使用经GSK3i培养7天得到的NK进行的ADCC杀伤相比，当使用赫赛汀来介导SKOV3或A549的杀伤时，经STING激动剂和GSK3i培养7天的NK细胞也增强抗体导向的细胞毒性(ADCC)。将NK细胞以3:1的比例添加到目标。图18显示，在使用抗Her2抗体进行的ADCC化验中GSK3i和STING激动剂的组合在多天培养中增强NK细胞针对A549(图18A)和SKOV-3(图18B)目标细胞的细胞毒性。图18B还显示，STING激动剂和GSK3i的组合在增强NK细胞的细胞毒性方面比任一单独使用的调节剂更有效。
自然杀伤(NK)细胞识别并以不依赖于抗体的方式摧毁肿瘤和病毒感染的细胞。NK细胞的调节通过激活和抑制NK细胞表面上的抗体来介导。一类重要的激活受体是天然细胞毒性受体(NCR)，其包括NKp30、NKp44以及NKp46。NCR通过识别其在癌细胞上的特定配体启动肿瘤靶向。如图19所示，显示与仅由STING激动剂或GSK3i调节的NK细胞相比，GSK3i和STING激动剂的组合协同性地增强调节的NK细胞上的NKp30表达，在其它机制之外这也可能会引起增强的NK细胞功能。
本领域技术人员应容易理解，本文所述的方法、组合物、以及产物代表示例性的实施例，并非旨在对本发明的范围进行限制。对于本领域技术人员将是显而易见的是，可在不偏离本发明的范围和精神的情况下对本文公开的本公开进行不同的替换和修改。
说明书中提到的所有专利和公开物表明本公开所属领域的技术人员的水平。所有专利和公开物均通过引用并入本文，并入的程度就如同每个单独的公开物被特定地且分别地通过引用并入本文一样。
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Claims (21)

1.一种调节免疫细胞群的方法，其包括：
将所述免疫细胞与足够量的包含至少一种选自由表1所列化合物及其衍生物和类似物组成的群组的药剂的组合物接触足以获得经调节的免疫细胞群的时间，与未调节的免疫细胞相比，所述经调节的免疫细胞群具有改进的治疗潜力。
2.根据权利要求1所述的方法，其中
(a)与未接触所述至少一种药剂的免疫细胞相比，所述经调节的免疫细胞包含的细胞具有
(i)改进的增殖、细胞毒性、细胞因子响应、细胞因子释放、细胞回忆、和/或持久性；
(ii)改进的细胞扩增、维持、分化、去分化、和/或存活率；和/或
(iii)增加的一种或多种期望的免疫细胞亚群的数量或比例；
(b)在接触所述至少一种药剂之前，所述免疫细胞具有以下特性中的至少一种：
(i)包含：
(1)T细胞、NKT细胞和/或NK细胞；
(2)NK细胞；
(3)CD57-NK细胞；或
(4)CD57-NKG2C+NK细胞；
(ii)分离自或者包含在外周血液、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位组织、腹水、胸腔积液、脾组织、或肿瘤中；
(iii)分离自：
(1)健康受检者；
(2)患有自体免疫疾病、造血系统恶性肿瘤、病毒感染或实体瘤的受检者；
(3)以前被施用过基因修饰的免疫细胞的受检者；或者
(4)CMV血清阳性受检者；
(iv)被基因组工程化并包含插入、缺失、或核酸置换；或者
(v)包含至少一种基因修饰形态；
(vi)从干细胞、造血干细胞或祖细胞、或者祖细胞体外分化；或者
(vii)从造血或非造血系的非多能细胞体外转分化；
(c)包含所述至少一种药剂的所述组合物进一步包含一种或多种添加剂；和/或
(d)所述方法进一步包括：
(i)在接触足够量的用于调节的所述组合物的步骤之前，激活所述免疫细胞；以及任选地，在所述激活步骤之前，
(ii)使CD3和CD19细胞从用于激活和调节的所述免疫细胞中耗竭。
3.根据权利要求2所述的方法，其具有以下特性中的至少一种：
(a)其中所述干细胞包含诱导性多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESCs)；
(b)其中所述祖细胞是CD34+血原性内皮细胞、多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK祖细胞、或NKT祖细胞；
(c)其中所述干细胞、造血干细胞或祖细胞、或者祖细胞
(i)被基因组工程化并包含插入、缺失、或核酸置换，或者
(ii)包含至少一种基因修饰形态；
(d)其中所述免疫细胞的所述基因修饰形态包含以下中的至少一种：安全开关蛋白、靶向形态、受体、信号传导分子、转录因子、药学活性的蛋白和肽、药物目标候选物；或者促进所述免疫细胞的植入、运输、归巢、活力、自我更新、持久性、免疫响应调控和调节、和/或存活的蛋白质；
(e)其中所述免疫细胞的至少一种基因修饰形态包含以下中的一种或多种：
(i)B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、或RFXAP、以及染色体6p21区中的任何基因的缺失或表达减少；以及
(ii)与双特异性或多特异性接合体或者通用接合体偶联的HLA-E、HLA-G、HACD16、hnCD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、Fc受体、或表面触发受体的表达引入或增强；
(f)其中所述一种或多种添加剂包括：
(i)肽、抗体、抗体片段、细胞因子、有丝分裂原、生长因子、小RNA、dsRNA、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或置换因子、包含一种或多种所关注多聚核酸的载体、化学治疗剂或放射性部分、以及免疫调节药物(IMiD)中的至少一种；
(ii)包括IL2、IL15、IL12、IL18以及IL21的刺激性细胞因子中的至少一种；或
(iii)MEK抑制剂、雷帕霉素、以及STING激动剂中的一种或多种；或
(g)其中所述组合物包含：
(i)GSK3抑制剂、TGFβ受体抑制剂、ROCK抑制剂、MEK抑制剂、PDK1激动剂、以及雷帕霉素中的一种或多种；
(ii)GSK3抑制剂；
(iii)CHIR99021；
(iv)GSK3抑制剂和IL15；
(v)GSK3抑制剂、IL15、以及STING激动剂；或
(vi)至少一种选自由以下组成的群组的有机溶剂：二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲氧基乙烷(DME)、二甲基乙酰胺、乙醇及其组合；
(h)其中所述经调节的免疫细胞或所述一种或多种期望的免疫细胞亚群在接触所述一种或多种药剂后具有增加的数量或比例，所述经调节的免疫细胞或所述一种或多种期望的免疫细胞亚群包括：
(i)初始T细胞、干细胞记忆性T细胞、中央记忆性T细胞、I型NKT细胞、CD57+NK细胞、或适应性NK细胞；
(ii)适应性NK细胞，其包含CD57+以及NKG2C+、低PLZF、低SYK、低FcεRγ、低EAT-2、低TIGIT、低PD1、低CD7、低CD161、高LILRB1、高CD45RO和低CD45RA中的至少一种；或
(iii)表达hnCD16的CD57+NK细胞；
其中所述经调节的免疫细胞或所述一种或多种期望的免疫细胞亚群任选地包含至少一种基因修饰形态；
(j)其中所述方法进一步包括从所述经调节的免疫细胞中分离所述一种或多种期望的亚群；
(k)其中所述足够的时间不小于16小时；
(l)其中所述用于调节的免疫细胞处于无饲养细胞的环境中；
(m)其中所述经调节的免疫细胞包括NK细胞，其中所述经调节的NK细胞
(i)与未调节的NK细胞相比，对CD107a、NKG2C、NKG2D、CD16、KIR、CD2、NKp30、NKp44以及NKp46中的一种或多种的表达增加，其中其表达增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多；
(ii)增加扩增至少2倍；和/或
(iii)具有改进的细胞因子响应，包含一种或多种细胞因子的产生的增加，所述细胞因子包含IFNγ和/或TNFα。
4.一种调节NK细胞群的方法，包含：
(a)从以下获得免疫细胞群：
(i)健康受检者；
(ii)患有自体免疫疾病、造血系统恶性肿瘤、病毒感染或实体瘤的受检者；
(iii)以前被施用过基因修饰的免疫细胞的受检者；或者
(iv)CMV血清阳性受检者；
(b)使CD3和CD19细胞从所述免疫细胞群中耗竭，以及
(c)将从步骤(ii)得到的所述免疫细胞群与足够量的包含GSK3抑制剂的组合物接触足以获得经调节的NK细胞群的时间，与未调节的NK细胞相比，所述经调节的NK细胞群对于过继性细胞疗法具有改进的治疗潜力，
其中在耗竭CD3和CD19细胞之前，所述NK细胞群在不存在GSK3抑制剂的情况下未使用细胞因子培养；和
其中所述经调节的NK细胞：与未调节的NK细胞相比，对CD107a、NKG2C、NKG2D、CD16、KIR、CD2、NKp30、NKp44以及NKp46中的一种或多种的表达增加，其中其表达增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多；增加扩增至少2倍；和/或具有改进的细胞因子响应，包含一种或多种细胞因子的产生的增加，所述细胞因子包含IFNγ和/或TNFα。
5.一种组合物，其包含免疫细胞群和一种或多种选自由表1所列化合物及其衍生物和类似物组成的群组的药剂，其中所述一种或多种药剂能够调节所述免疫细胞以获得经调节的免疫细胞，与没有通过所述一种或多种药剂调节的所述免疫细胞相比，所述经调节的免疫细胞具有改进的治疗潜力。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中
(a)所述一种或多种药剂能够调节所述免疫细胞
(i)以改进免疫细胞扩增、维持、分化、去分化、和/或存活率；
(ii)以改进免疫细胞增殖、细胞毒性、持久性、细胞因子响应和分泌和/或细胞回忆；和/或
(iii)以增加期望的免疫细胞亚群的数量或比例；
(b)所述免疫细胞具有以下特性中的至少一种：
(i)包含：
(1)T细胞、NKT细胞、和/或NK细胞；
(2)CD57-NK细胞；或
(3)CD57-NKG2C+NK细胞；
(ii)分离自或者包含在外周血液、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位组织、腹水、胸腔积液、脾组织、或肿瘤中；
(iii)分离自：
(1)健康受检者；
(2)患有自体免疫疾病、造血系统恶性肿瘤、病毒感染或实体瘤的受检者；
(3)以前被施用过基因修饰的免疫细胞的受检者；或者
(4)CMV血清阳性受检者；
(iv)被基因组工程化并包含插入、缺失、或核酸置换；或者
(v)包含至少一种基因修饰形态；
(vi)从干细胞、造血干细胞或祖细胞、或者祖细胞体外分化；或者(vii)从造血或非造血系的非多能细胞体外转分化。
7.根据权利要求6所述的组合物，
(a)其中所述经调节的免疫细胞或所述期望的免疫细胞亚群具有增加的数量或比例，所述经调节的免疫细胞或所述期望的免疫细胞亚群包括：
(i)初始T细胞、干细胞记忆性T细胞、或中央记忆性T细胞、I型NKT细胞、CD57+NK细胞、或适应性NK细胞；
(ii)适应性NK细胞，其包含CD57+以及NKG2C+、低PLZF、低SYK、低FcεRγ、低EAT-2、低TIGIT、低PD1、低CD7、低CD161、高LILRB1、高CD45RO和低CD45RA中的至少一种；
(iii)表达hnCD16的CD57+NK细胞；或
(iv)至少一种基因修饰形态；
(b)其中所述干细胞包含诱导性多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESCs)；
(c)其中所述祖细胞是CD34+血原性内皮细胞、多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK祖细胞、或NKT祖细胞；
(d)其中所述干细胞、造血干细胞或祖细胞、或者祖细胞
(i)被基因组工程化并包含插入、缺失、或核酸置换，或者
(ii)包含至少一种基因修饰形态；
(e)其中所述基因修饰形态包含以下中的至少一种：安全开关蛋白、靶向形态、受体、信号传导分子、转录因子、药学活性的蛋白和肽、药物目标候选物；或者促进所述免疫细胞的植入、运输、归巢、活力、自我更新、持久性、免疫响应调控和调节、和/或存活的蛋白质；
(f)其中所述至少一种基因修饰形态包含以下中的一种或多种：
(i)B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、或RFXAP、以及染色体6p21区中的任何基因的缺失或表达减少；以及
(ii)与双特异性或多特异性接合体或者通用接合体偶联的HLA-E、HLA-G、HACD16、hnCD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、Fc受体、或表面触发受体的表达引入或增强；
(g)其中所述添加剂包括：
(i)肽、抗体、抗体片段、细胞因子、有丝分裂原、生长因子、小RNA、dsRNA、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或置换因子、包含一种或多种所关注多聚核酸的载体、化学治疗剂或放射性部分、以及免疫调节药物(IMiDs)中的至少一种；
(ii)包括IL2、IL15、IL12、IL18以及IL21的刺激性细胞因子中的至少一种；或
(iii)MEK抑制剂、雷帕霉素、以及STING激动剂中的一种或多种；或
(h)其中所述组合物包含：
(i)GSK3抑制剂、TGFβ受体抑制剂、ROCK抑制剂、MEK抑制剂、PDK1激动剂、以及雷帕霉素中的一种或多种；
(ii)GSK3抑制剂；
(iii)NK细胞群和GSK3抑制剂；
(iv)NK细胞群、GSK3抑制剂和IL15；
(v)NK细胞群、GSK3抑制剂、IL15、以及STING激动剂；或
(vi)至少一种选自由以下组成的群组的有机溶剂：二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲氧基乙烷(DME)、二甲基乙酰胺、乙醇及其组合。
8.一种根据权利要求1至4中的任一项制备治疗组合物的方法，所述治疗组合物包含用于细胞疗法的经调节的免疫细胞，所述免疫细胞包含T、NK或NKT细胞。
9.一种经调节的免疫细胞群，其通过权利要求1至4中的任一项所述的方法来制备。
10.一种经调节的NK细胞群，其通过权利要求1至4中的任一项来制备。
11.一种经调节的适应性NK细胞群，其通过权利要求1至4中的任一项来制备。
12.一种包含经选择性扩增的NK细胞的经调节的免疫细胞群，所述免疫细胞群通过权利要求1至4中的任一项制备。
13.一种经调节的NK细胞群，与未调节的NK细胞相比，所述经调节的NK细胞群对CD107a、NKG2C、NKG2D、CD16、KIR、CD2、NKp30、NKp44以及NKp46中的一种或多种的表达增加，其中其表达增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
14.一种组合物，其包括从权利要求1-4中任一项获得的经调节的免疫细胞。
15.一种组合物，其包含根据权利要求9所述的经调节的细胞以及治疗学上可接受的介质。
16.根据权利要求15所述的组合物，其进一步包含一种或多种选自由以下组成的群组的额外添加剂：肽、细胞因子、有丝分裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或置换因子、包含一种或多种所关注多聚核酸的载体、抗体、化学治疗剂或放射性部分、以及免疫调节药物(IMiDs)。
17.一种治疗上足够量的根据权利要求15所述的组合物在制造用于治疗需要过继性细胞疗法的受检者的药物中的应用，其中所述细胞疗法是同种自体的或同种异体的；并且其中所述受检者患有自身免疫疾病、血液系统恶性肿瘤、实体瘤、癌症、或者与HIV、RSV、EBV、CMV、腺病毒、或BK多瘤病毒相关的感染。
18.一种治疗上足够量的根据权利要求15所述的组合物在制造用于与抗体、化学治疗或放射性治疗组合治疗受检者的药物中的应用，其中抗体治疗、化学治疗或放射性治疗在施用所述组合物之前、期间或之后进行。
19.一种根据权利要求1至4中任一项制备的混合物，其用于制造供细胞疗法用的治疗组合物，其中所述混合物包含：
(a)分离的免疫细胞群，以及
(b)包含GSK3抑制剂的组合物，
其中所述GSK3抑制剂能够调节(a)的所述细胞。
20.根据权利要求19所述的混合物，其中所述分离的免疫细胞群包含NK细胞。
21.根据权利要求20所述的混合物，其中与尚未被调节的包含NK细胞的分离免疫细胞群相比，所述分离的免疫细胞群在被调节后包含具有以下中的至少一种的NK细胞：
(a)至少CD57的基因表达增加；
(b)CD57+细胞亚群增加；
(c)适应性NK细胞亚群增加，其包含CD57+以及NKG2C+、低PLZF、低SYK、低FcεRγ、低EAT-2、低TIGIT、低PD1、低CD7、低CD161、高LILRB1、高CD45RO和低CD45RA中的至少一种；
(d)改进的增殖、细胞毒性、细胞因子响应、细胞因子释放、细胞回忆、和/或持久性；和/或
(e)改进的细胞扩增、维持、分化、去分化、和/或存活率。
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