CN1159341C

CN1159341C - 治疗由皮质甾类诱发的骨质减少的方法

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Publication number: CN1159341C
Application number: CNB961945516A
Authority: CN
Inventors: B��H��ά��; B·H·维克里
Original assignee: Syntex USA LLC
Current assignee: Syntex USA LLC
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 2004-07-28
Anticipated expiration: 2016-06-03
Also published as: ES2197946T3; CA2223832A1; HK1010376A1; CN1187203A; WO1996040775A1; EP0835262A1; US5821225A; JPH11508234A; PT835262E; BR9608554A; DK0835262T3; ATE233787T1; JP2008024709A; EP0835262B1; AU6251596A; TR199701546T1; DE69626517D1; DE69626517T2

Abstract

甲状旁腺素PTH、甲状旁腺素相关肽PTHrp、和PTH和PTHrp的具有生理活性的截短形式同系物和类似物的合成多肽类似物和它们药学上认可的盐可用于预防和治疗哺乳动物由皮质甾类诱发的骨质减少，其中所述合成多肽类似物的氨基酸残基(22-31)形成两亲α-螺旋，所述的残基选自按以下顺序排列的亲水性氨基酸(Haa)和亲脂性氨基酸(Laa)：Haa(Laa Laa Haa Haa)₂Laa。

Description

治疗由皮质甾类诱发的骨质减少的方法

发明背景

a)发明领域

本发明涉及使用治疗有效量的某种新的甲状旁腺素和甲状旁腺素相关肽的类似物来治疗由皮质甾类诱发的骨质减少的方法。

b)相关技术的说明

骨质疏松是代谢性骨疾病的最常见形式，并且可以认为是骨流失(骨质减少)的症状、骨折阶段。虽然骨质疏松可能因许多隐性疾病而发生，但90％是自发性的。绝经后的妇女尤其易发自发性骨质疏松(绝经型或I型骨质疏松)。自发性骨质疏松的另一高发人群是高龄的男性和女性(老年型或II型骨质疏松)。骨质疏松还被发现与使用皮质甾类、活动量少或过多的卧床休息、嗜酒、糖尿病、性激素中毒(gonadotoxic)、化疗、催乳激素过多、神经性厌食、原发性和继发性闭经，以及卵巢切除有关。

在各种形式的骨质疏松中，经常发生的是由于骨流失达到了机械衰竭点而引起的骨折。绝经后骨质疏松以腕骨骨折和脊柱骨折为特征，而股骨颈骨折似乎是老年型骨折的突出特征。

骨质疏松中骨流失的机制被认为与骨骼自身更新过程中的不平衡有关。该过程被称为骨的重塑(bone remodeling)。它发生在一系列分散的活性袋中。这些袋自发地形成于给定骨表面的骨基质中，作为骨吸收位置。破骨细胞(骨溶解或吸收细胞)负责吸收通常为衡量的部分骨。在这种吸收过程之后出现了成骨细胞(骨形成细胞)，由它们用新的骨重新填补由破骨细胞留下的空穴。

在健康的成人体内，破骨细胞和成骨细胞的形成速度在骨形成和骨吸收之间形成平衡。但是在骨质疏松症患者中，骨重塑过程中的失衡逐渐发展而导致骨流失的速度大于其形成的速度。虽然在大多数个体中，这种失衡在某种程度上是随年龄的增长而发生的，但是在绝经型骨质疏松或在卵巢切除后的患者中其发病更严重而且更早。

Adachi等在《关节炎和风湿症研讨》(Seminars in Arthritis andRheumatism)22：6，375-84(1993，6)中报道，尽管许多有关皮质甾类诱发的骨质疏松的病理生理学数据不相一致，但普遍认同的是骨形成有所减少而骨吸收有所增加。皮质甾类疗法经常引起骨流失及由其导致的骨折和骨坏死。可以证明，在皮质甾类疗法的最初6至12个月内，骨流失发生迅速；而且，在骨流失速度和皮质甾类剂量之间似乎还存在着密切的关系。男性同样地易受皮质甾类的影响。骨折与骨坏死的估计发生率在30至50％之间。

已经进行了多种尝试以减慢骨的继续流失或更好的是形成骨质的净增长来治疗骨质疏松。有些药物，例如雌激素和二磷酸盐似乎减慢了骨质疏松症患者中骨的继续流失。减慢骨流失的药物可能因骨吸收和骨形成的时间不同而表现为增加了骨质(量级为3至7％)。但是这种表观增长在时间上有限，不是渐进性的，而且是因“重塑空间”的减少而发生的。此外，由于吸收和形成之间的紧密联系，抑制骨吸收的治疗也会最终抑制骨形成。

已经有人提出甲状旁腺素(PTH)疗法能同时提高骨转化和形成正向钙平衡。但是，人临床实验证明，小梁骨的任何增加都会被皮质骨的减少而抵消，所以在总的骨上没有净增。

Hefti等在《临床科学》(Clinicl Science)62：389-396(1982)中报道，每日皮下给药bPTH(1-84)或hPTH(1-34)在正常和骨质疏松的成年雌性大鼠中提高了体钙总含量和各种骨的灰分重量。

Liu等在(J.Bone Miner.Res.)6：10，1071-1080(1991)中提出，切除成年雌性大鼠的卵巢诱发了胫干骺端47％的小梁骨流失，并伴随成骨细胞和小梁破骨细胞数量的显著增加。每日皮下注射hPTH(1-34)完全逆转了小梁骨流失，使得小梁骨量超过对照组。成骨细胞数量增加而破骨细胞减少。

Hock等在(J.Bone Min.Res.)7：1，65-71(1992)中报道，给健康的成年雄性大鼠每日皮下注射hPTH(1-34)12天，提高了小梁骨和皮质骨中的钙和干重。总骨质量，小梁骨体积、小梁厚度和数量，以及成骨细胞表面增加。

哺乳动物的甲状旁腺素，例如人的(hPTH)、牛的(bPTH)、猪的(pPTH)，是84氨基酸残基的单条多肽链，其分子量约为9500。其生物活性与N末端部分有关，似乎最少需要残基(1-34)。

人PTH的N末端片段与牛和猪激素的N末端片段分别仅相差3个和2个氨基酸残基：

hPTH(1-34)：

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu

1 5 10 15

Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Asn Phe (SEQ ID NO：1)；

bPTH(1-34)：

Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Met His Asn Leu Gly Lys His Leu

1 5 10 15

Ser Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Asn Phe (SEQ ID NO：2)；

pPTH(1-34)：

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu

1 5 10 15

Ser Ser Leu Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Asn Phe (SEQ ID NO：3).

PTH的主要功能是引发维持胞外液体内Ca²⁺恒定浓度的适应性改变。PTH作用于肾以增加肾小管从尿液中对Ca²⁺的重吸收，并促进calcifediol向钙三醇转化，后者负责从肠中吸收Ca²⁺。突出的作用之一是促进骨中Ca²⁺的活化。PTH作用于骨以提高对Ca²⁺和磷酸盐的吸收速度。PTH提高破骨细胞的骨吸收速度，提高间质细胞向破骨细胞的分化速度，延长后者的半衰期。随着PTH作用的延长，成骨细胞的数量也增加；这样，骨转化和重塑的速度被加快了。但是，个别的成骨细胞活性似乎低于一般成骨细胞。

Rosenblatt等在美国专利4,423,037、4,968,669和5,001,223中公开，通过缺失N末端氨基酸(1-6)和选择性置换Phe⁷、Met^8，18和Gly¹²获得PTH拮抗剂。据报道Tyr³⁴-NH₂提高了这类化合物的活性和稳定性。

甲状旁腺素相关肽(PTHrp)，一种140+氨基酸蛋白质，及其片段产生PTH的主要生物作用。许多人和动物肿瘤和其它组织产生PTHrp，它可能在恶性高钙血症中起一定的作用。hPTHrp(1-34)的序列为：

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu

20 25 30

Ile His Thr Ala (SEQ ID NO：4).

hPTH和hPTHrp之间的序列同源性主要局限于13个N末端氨基酸残基，其中8个是相同的；hPTH受体结合区的10个氨基酸(25-34)中只有1个在hPTHrp中具有保守性。构象的类似性可能构成其共同的活性。Cohen等在《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)266：3，1997-2004(1991)中提出，许多PTH(1-34)和PTHrp(1-34)序列，尤其是(5-18)和(21-34)区域具有α-螺旋构型，同时提出对在生理条件下羧基末端是否主要为这种构型还不确定。这种二级结构对与脂类相互反应，与受体相互作用，和/或结构的稳定化可能是十分重要的。

本发明综述

本发明提供了一种治疗由皮质甾类诱发的骨质减少的方法，该方法包括给需要治疗的病人使用有效量的甲状旁腺素(PTH)、甲状旁腺素相关肽(PTHrp)、或PTH或PTHrp的生理活性截短形式同系物和类似物的合成多肽类似物，或其盐，其中的氨基酸残基(22-31)形成一个两亲α-螺旋，所述的残基(22-31)选自按以下顺序排列的亲水性氨基酸(Haa)和亲脂性氨基酸(Laa)：

Haa(Laa Laa Haa Haa)₂ Laa。

在实施方式之一中，氨基酸残基(22-31)的序列选自(SEQ ID NOS：85、86、26、27、28、29和30)。多肽的有效量约为0.002μg多肽/kg病人体重/天至约10μg多肽/kg病人体重/天。

本发明还提供了用于预防和治疗皮质甾类诱发的骨质减少的药物组合物，其中包含有效量的甲状旁腺素(PTH)、甲状旁腺素相关肽(PTHrp)、或PTH或PTHrp的生理活性截短形式同系物和类似物的合成多肽类似物，或其盐，和药学上认可的载体，其中的氨基酸残基(22-31)形成一个两亲α-螺旋，所述的残基(22-31)选自按以下顺序排列的亲水性氨基酸(Haa)和亲脂性氨基酸(Laa)：

Haa(Laa Laa Haa Haa)₂ Laa。

在实施方式之一中，药物组合物被制成用于治疗皮质甾类诱发的骨质减少的单位剂型，其中包含约1μg至约1000μg甲状旁腺素(PTH)、甲状旁腺素相关肽(PTHrp)、或PTH或PTHrp的生理活性截短形式同系物和类似物的合成多肽类似物，或其盐，和药学上认可的载体，其中的氨基酸残基(22-31)形成一个两亲α-螺旋，所述的残基(22-31)选自按以下顺序排列的亲水性氨基酸(Haa)和亲脂性氨基酸(Laa)：

Haa(Laa Laa Haa Haa)₂ Laa。

将该序列的具体的说明性实例插入PTH、PTHrp和PTH及PTHrp的生理活性截短形式同系物和类似物中时，形成的多肽是有效的骨重塑剂。

本发明内容之一提供了一种用甲状旁腺素(PTH)、甲状旁腺素相关肽(PTHrp)、和PTH及PTHrp的生理活性截短形式同系物和类似物的合成多肽类似物，或其盐来治疗皮质甾类诱发的骨质减少的方法，其中的氨基酸残基(22-31)形成一个两亲α-螺旋，所述的残基(22-31)选自：

a)Xaa¹ Xaa² Leu Xaa⁴ Xaa⁵ Leu Xaa⁷ Xaa⁸ Xaa⁹ Xaa¹⁰

1 5 10

其中Xaa¹和Xaa⁴各自是Glu、Glu(OCH₃)，His或Phe；Xaa²是Leu或Phe；Xaa⁵是Lys或His；Xaa⁷和Xaa¹⁰各自是Leu或Ile；Xaa⁸是Ala、Arg或Glu；Xaa⁹是Lys或Glu(SEQ ID NO：85)；较好的是

Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu

1 5 10

其中的Xaa是Glu或Arg(SEQ ID NO：26)；

b)Xaa¹ Xaa² Leu Xaa⁴ Arg Leu Leu Xaa⁸ Arg Leu

1 5 10

其中Xaa¹和Xaa⁴各自是Glu、Glu(OCH₃)，、His或Phe；Xaa²是Leu或Phe；Xaa⁸是Glu、Lys或Lys(COCH₂PEGX)，PEGX是分子量为100至10,000的聚(乙二醇甲基醚)基团(SEQ ID NO：86)；较好的是

Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu

1 5 10

其中的Xaa是Glu，Lys或Lys(COCH₂PEGX)，PEGX是分子量为100至10,000的聚(乙二醇甲基醚)基团(SEQ ID NO：27)；

c)Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu(SEQ ID NO：28)；

1 5 10

d)Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu(SEQ ID NO：29)；

1 5 10

e)Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu(SEQ ID NO：30)；

1 5 10

在另一方面的内容中，本发明提供(PTH)、(PTHrp)、或PTH或PTHrp的生理活性截短形式同系物和类似物的合成多肽类似物或其盐的药物组合物，其中的氨基酸残基(22-31)形成一个两亲α-螺旋，所述的残基(22-31)选自：

a)Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu

1 5 10

其中的Xaa是Glu或Arg(SEQ ID NO：26)；

b)Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu

1 5 10

其中的Xaa是Glu，、Lys或Lys(COCH₂PEGX)，PEGX是分子量为100至10,000的聚(乙二醇甲基醚)基团(SEQ ID NO：27)；

c)Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu(SEQ ID NO：28)；

1 5 10

d)Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu(SEQ ID NO：29)；

1 5 10

e)Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu(SEQ ID NO：30)；

1 5 10

本发明还提供了混合以上化合物和药学上认可的载体来制备药物组合物的方法。

附图说明

图1是编码本发明的PTHrp(1-34)类似物的合成基因的DNA序列和限制性酶位点。

图2是制备包含PTHrp(1-34)类似物基因的质粒的简图。

图3是制备包含二拷贝PTHrp(1-34)类似物基因的质粒的简图。

图4是制备包含四拷贝PTHrp(1-34)类似物基因的质粒的简图。

本发明的详细说明

缩写及定义

各种一般核苷酸碱基和氨基酸的单字母和三字母缩写根据的是《纯应用化学》(Pure Appl.Chem)31，639-645(1972)和40，277-290中以及IUPAC-IUB生物化学命名委员会的建议。单字母和三字母缩写如下所述：

氨基酸的缩写

氨基酸三字母标记单字母标记

丙氨酸 Ala A

精氨酸 Arg R

天冬酰胺 Asn N

天冬氨酸 Asp D

Asn+Asp Asx B

半胱氨酸 Cys C

谷胺酰胺 Gln Q

谷氨酸 Glu E

Gln+Glu Glx Z

甘氨酸 Gly G

组氨酸 His H

异亮氨酸 Ile I

亮氨酸 Leu L

赖氨酸 Lys K

甲硫氨酸 Met M

苯丙氨酸 Phe F

脯氨酸 Pro P

丝氨酸 Ser S

苏氨酸 Thr T

色氨酸 Trp W

酪氨酸 Tyr Y

缬氨酸 Val V

其它氨基酸 Xaa X

如果不另外加注D-或D，L-，以上缩写代表L-氨基酸。有些天然和非天然氨基酸是非手性的，例如甘氨酸。所有肽序列都按N末端在左，C末端在右表示。

本文中使用的其它氨基酸和化合物的缩写为：

hSer 高丝氨酸

hSerlac 高丝氨酸内酯

Nle 正亮氨酸

PEG2 二甘醇甲基醚基，a.k.a.甲氧基二(乙氧

基)，CH₃O(CH₂CH₂O)₂-，(分子量＝119)

PEG5000 聚乙二醇甲基醚基，a.k.a.甲氧基聚(乙

氧基)，CH₃O(CH₂CH₂O)₁₁₀-，(平均分子

量＝5000)

PEGX 聚乙二醇甲基醚基，CH₃O(CH₂CH₂O)_n-，

(平均分子量＝100至10,000)

“亲水性氨基酸”指除了形成肽键必需的官能团之外具有至少一个亲水性官能团的氨基酸，例如精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸，谷氨酸、谷胺酰胺、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸及其同系物。

“亲脂性氨基酸”指不带电的脂肪族或芳香族氨基酸，例如异亮氨酸，亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸及其同系物。

出于本发明的目的，丙氨酸被归类为“两亲”氨基酸，既具有亲水性又具有亲脂性。

“PTH或PTHrp的生理活性截短形式同系物或类似物”指这样的多肽，其序列包含的氨基酸少于PTH或PTHrp的完整片段，但可引发相似的生理应答。截短的PTH或PTHrp不需要与PTH或PTHrp完全同源才引发相似的生理应答。其中代表性的是PTH(1-34)和PTHrp(1-34)，但不排除其它多肽。

“两亲α-螺旋”指某些多肽表现出的二级结构，其中的氨基酸形成α-螺旋构型，其相对的极性和非极性平面定向于沿螺旋的长轴。在某种程度上可以通过构建一个具有正确螺距的“Schiffer-Edmundson轮”(M.Schiffer和A.B.Edmundson，《生物物理学杂志》(BioPhys.J.)7，121，(1967))和注意包围螺旋的柱的相对两平面上亲水性和亲脂性残基的分离来探测感兴趣的多肽中存在α-螺旋结构的可能性。或者，经验性证据，例如园二色性或X光衍射数据可用于证明给定多肽中α-螺旋区域的存在。理想的α-螺旋每圈具有3.6个氨基酸残基，相邻侧链分开100°弧度。Eisenberg等在《自然》(Nature)299：371-374(1982)和《美国科学院院报》(Proc.Nat.Acad.Sci USA)81：140-144(1984)中将疏水性等级和螺旋轮相结合来将两亲螺旋概念定量化。平均疏水性力矩定义为构成螺旋的各氨基酸疏水性向量的总和。以下是Eisenberg(1984)报道的氨基酸疏水性的“一致”等级：

Ile 0.73；Phe 0.61；Val 0.54；Leu 0.53；Trp 0.37；

Met 0.26；Ala 0.25；Gly 0.16；Cys 0.04；Tyr 0.02；

Pro-0.07；Thr-0.18；Ser-0.26；His-0.40；Glu-0.62；

Asn-0.64；Gln-0.69；Asp-0.72；Lys-1.10；Arg-1.76。

每圈3.6个残基(或100°弧度(＝360°/3.6))的理想α-螺旋的疏水性力矩μH，可用以下公式计算：

μ_H＝[(∑H_Nsinδ(N-1))²+(∑H_Ncosδ(N-1))²]^1/2

其中H_N是N^th氨基酸的疏水性值，总和由序列中周期率δ＝100°的N个氨基酸相加而得。可以通过将μ_H除以N将疏水性力矩表示为单个残基的平均疏水力矩<μ_H>。周期率为100°±20°的<μ_H>为约0.20或以上表明是两亲螺旋构型。hPTHrp(22-31)和hPTH(22-31)周期率为100°时的<μ_H>分别为0.19和0.37。

Cornett等在《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)195：659-685(1987)中进一步续展了对两亲α-螺旋的研究，即引入“两亲系数”作为两亲性的表征。他们推断，所有已知α-螺旋中约有半数是两亲性的，频率主要是97.5°而不是100°，每圈的残基数更接近于3.7而不是3.6。虽然这种精确化在科学上很有意义，但是Eisenberg等的基本方法已足以区分一个给定的序列是否是两亲性的，尤其是在从头设计一个形成两亲α-螺旋的序列时候。

在生理环境中，一个取代性两亲α-螺旋氨基酸序列可能与天然存在的肽中给定片段的序列不具有同源性，但却可以形成相似的二级结构，即具有相对的极性和非极性平面的α-螺旋。用替代性序列代替天然存在的氨基酸序列可能对被替换的亲本多肽的生理活性、稳定性或其它特性产生有益的影响。有关设计和选择这样的序列可参见J.L.Krstenansky等FEBS Letters 242：2，409-413(1989)和J.P.Segrest等《蛋白质：结构、功能和遗传学》(Proteins：Structure，Function，andGenetics)8：103-117(1990)。

本发明10个氨基酸的两亲α-螺旋通式为：

Haa(Laa Laa Haa Haa)₂ Laa

其中的Haa选自亲水性氨基酸，Laa选自亲脂性氨基酸。假设是一个理想化的α-螺旋，残基1、4、5、8和9沿螺旋的平面之一(A)分布，彼此间的周期率约为140°，残基2、3、6、7和10在螺旋的另一平面(B)上占据相对的140°弧度。较好的是，同一面上的所有残基极性相同，而另一面上的残基都具有相反的极性，即如果平面A都是亲水性的，平面B就都是亲脂性的，或者相反。本领域技术人员能够理解的是，虽然本发明的螺旋被描述为：

Haa(Laa Laa Haa Haa)₂ Laa

相反的描述

Laa(Haa Haa Laa Laa)₂ Haa

也符合残基分布标准，是本发明螺旋的对等体。

因为丙氨酸在两亲螺旋的两个表面都易于存在，所以可以被亲水性氨基酸取代也可以被亲脂性氨基酸取代，但是Ala₁₀并不形成两亲α-螺旋。通常，不使用脯氨酸、半胱氨酸和酪氨酸；但是只要片段中的其余氨基酸完全符合亲水性平面-亲脂性平面的区分，他们的存在和序列中的其它偶然性误差是容许的，例如亲水性残基存在于亲脂性平面上。一种确定一段序列是否具有足够的两亲性以作为本发明的序列的方法是如上所述计算平均疏水性力矩。如果周期率为100°±20°的单个氨基酸的峰值平均力矩超过约0.20，该序列将形成两亲螺旋，而且是本发明的序列。

例如，如下计算(SEQ ID NO：26)周期率为100°时单个残基的平均疏水性力矩，Xaa＝Glu：

A.A. H_N δ(N-1) Hsinδ(N-1) Hcosδ(N-1)

E -0.62 0 0 -0.62

L 0.53 100 0.52 -0.17

L 0.53 200 -0.18 -0.50

E -0.62 300 0.34 -0.3

K -1.1 400 -0.70 -0.85

L 0.53 500 0.34 -0.41

L 0.53 60 -0.46 -0.27

E -0.62 700 .21 -0.58

K -1.1 800 -1.08 -0.19

L 0.53 900 0 -0.53

∑＝0.81 ∑＝-4.43

μ_H＝[(0.81)²+(-4.43)²]^1/2＝4.50

<μ_H>＝4.50/10＝0.45

该序列的平均峰值疏水性力矩出现在周期率为92°时，其值为0.48。

将这一概念用于甲状旁腺素和甲状旁腺素相关肽，可以假设区域(7-16)和(22-31)其中之一或两者可能表现出α-螺旋二级结构，而且可以被具有相似的结构倾向性的非同源序列所替代而不丧失其生物活性或诱发免疫反应。

优选实施方式

本发明内容之一提供了PTH、PTHrp，和PTH和PTHrp的生理活性截短形式类似物和同系物的类似物或其盐，其中的氨基酸残基(22-31)形成一个两亲α-螺旋，所述的残基(22-31)选自：

a)Xaa¹ Xaa² Leu Xaa⁴ Xaa⁵ Leu Xaa⁷ Xaa⁸ Xaa⁹ Xaa¹⁰

1 5 10

其中Xaa¹和Xaa⁴各自是Glu、Glu(OCH₃)，、His或Phe；Xaa²是Leu或Phe；Xaa⁵是Lys或His；Xaa⁷和Xaa¹⁰各自是Leu或Ile；Xaa⁸是Ala、Arg或Glu；Xaa⁹是Lys或Glu(SEQ ID NO：85)；较好的是

Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu

1 5 10

其中的Xaa是Glu或Arg(SEQ ID NO：26)；

b)Xaa¹ Xaa² Leu Xaa4 Arg Leu Leu Xaa⁸ Arg Leu

1 5 10

其中Xaa¹和Xaa⁴各自是Glu、Glu(OCH₃)、His或Phe；Xaa²是Leu或Phe；Xaa⁸是Glu、Lys或Lys(COCH₂PEGX)，PEGX是分子量为100至10,000的聚(乙二醇甲基醚)基团(SEQ ID NO：86)；较好的是

Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu

1 5 10

其中的Xaa是Glu、Lys或Lys(COCH₂PEGX)，PEGX是分子量为100至10,000的聚(乙二醇甲基醚)基团(SEQ ID NO：27)；

c)Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu(SEQ ID NO：28)；

1 5 10

d)Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu(SEQ ID NO：29)；

1 5 10

e)Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu(SEQ ID NO：30)；

1 5 10

在另一方面的内容中，本发明提供(PTH)、(PTHrp)、或PTH或PTHrp的生理活性截短形式同系物和类似物的合成多肽类似物或其盐的药物组合物，它们具有以下通式：

Xaa¹ Xaa² Xaa³ Xaa⁴ Xaa⁵ Xaa⁶ Xaa⁷ Leu His Xaa¹⁰ Xaa¹¹ Gly Xaa¹³ Ser Ile GlnXaa¹⁷ Leu Xaa¹⁹ Xaa²⁰ Xaa²¹ Xaa^22-31 Xaa³² Xaa³³ Xaa³⁴ Xaa³⁵ Xaa³⁶ Xaa³⁷末端，其中

Xaa¹缺失或者是Ala；

Xaa²缺失或者是Val；

Xaa³缺失或者是Ser；

Xaa⁴缺失或者是Glu或Glu(OCH₃)；

Xaa⁵缺失或者是His或Ala；

Xaa⁶缺失或者是Gln；

Xaa⁷缺失或者是Leu；

Xaa¹⁰和Xaa¹⁷各自是Asp或Asp(OCH₃)；

Xaa¹¹是Lys、Arg或Leu；

Xaa¹³是Lys、Arg、Tyr、Cys、Leu、Cys(CH₂CONH(CH₂)₂NH(生物素酰基))、Lys(7-二甲基氨基-2-氧-2H-1-苯氧基吡喃基-4-乙酰基)或Lys(肉桂酰基)；

Xaa²⁰是Arg或Leu；

Xaa¹⁹和Xaa²¹各自是Lys、Ala或Arg；

Xaa^22-31选自(SEQ ID NO：26、27、28、29或30)；Xaa³²是His、Pro或Lys；

Xaa³³缺失或者是Pro、Thr、Glu或Ala；

Xaa³⁴缺失或者是Pro、Arg、Met、Ala、hSer、hSer内酯、Tyr、Leu或1，4-二氨基丁酰基内酰胺；

Xaa³⁵缺失或者是Pro、Glu、Ser、Ala或Gly；

Xaa³⁶缺失或者是Ala、Arg或Ile；

Xaa³⁷缺失或者是Arg、Trp或3-(-2-萘基)-L-丙氨酸；

Xaa³⁸缺失或者是Ala或hSer或Xaa^38-42是Thr Arg Ser Ala Trp；

末端是OR或NR₂，其中的R都各自是H，(C₁-C₄)烷基或苯基(C₁-C₄)烷基；及其药学上认可的盐。

本发明在另一方面内容中提供了生理活性截短形式同系物hPTH(1-34)的类似物，如结构通式(I)所示：

Ala Val Ser Glu Xaa⁵ Gln Leu Leu His Asp Xaa¹¹ Gly Xaa¹³ Ser Ile Gln Asp LeuXaa¹⁹ Arg Xaa²¹ Xaa^22-31 Xaa³² Xaa³³ Xaa³⁴末端，其中：

Xaa⁵是His或Ala；

Xaa¹¹和Xaa¹³各自为Lys，Arg或Leu；

Xaa¹⁹和Xaa²¹各自为Ala或Arg；

Xaa^22-31是选自：

a)Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu

1 5 10

其中的Xaa是Glu或Arg(SEQ ID NO：26)；

b)Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu

1 5 10

c)Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu(SEQ ID NO：28)；

1 5 10

d)Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu(SEQ ID NO：29)；

1 5 10

e)Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu(SEQ ID NO：30)；

1 5 10

Xaa³²是His或Lys；

Xaa³³是Thr、Glu或Ala；

Xaa³⁴是Ala、hSer、Tyr或Leu；

末端是G1y Arg Arg，内酯，OH或NR₂，其中的R都各自是H或(C₁-C₄)烷基；及其药学上认可的盐(结构式I)。

本发明较为具体的内容包括Xaa^22-31为(SEQ ID NO：26)的结构式(I)多肽，它们100°周期时的<μ_H>超过0.45。本发明更为具体的内容包括的结构式(I)多肽其中的Xaa^22-31为(SEQ ID NO：26)，Xaa¹¹和Xaa¹³都是Lys；Xaa¹⁹和Xaa²¹都是Arg。

代表性的多肽包括但不限于：

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Arg Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO：5)；

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO：6)；

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala NH₂(SEQ ID NO：7)；

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr hSer NH₂(SEQ ID NO：8)；

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr hSerlac(SEQ ID NO：9)；

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala Gly Arg Arg OH(SEQ ID NO：10)；和

35

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu Lys Glu Leu NH₂(SEQ ID NO：11)

本发明的另一项内容包括结构式(I)的那些多肽，其中的Xaa^22-31为(SEQ IDNO：26)，Xaa¹¹和Xaa¹³都是Lys；Xaa¹⁹和Xaa²¹其中之一为Arg，另一个为Ala。该亚属的代表性多肽包括但不限于：

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Ala Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO：12)和

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Ala Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO：13)

本发明的另一项内容包括结构式(I)的那些多肽，其中的Xaa^22-31为(SEQ IDNO：26)，Xaa¹¹和Xaa¹³其中之一为Leu，另一个为Lys；Xaa¹⁹和Xaa²¹都是Arg。该亚属的代表性多肽包括但不限于：

Ala Val Ser Glu Ala Gln Leu Leu His Asp Leu Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Ala Leu OH(SEQ ID NO：14)

本发明的另一项内容包括Xaa^22-31为(SEQ ID NO：27)的结构式(I)的那些多肽，它们100°周期时的<μ_H>超过0.50。本发明的另一项内容包括结构式(I)的那些多肽，其中的Xaa^22-31为(SEQ ID NO：27)，Xaa¹¹和Xaa¹³都是Lys或Arg；Xaa¹⁹和Xaa²¹都是Arg。该亚属的代表性多肽包括但不限于：

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg

20 25 30

Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO：15)；

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg

20 25 30

Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO：16)；

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Lys Arg

20 25 30

Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO：17)；

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu

20 25

Lys(COCH2PEG2)Arg Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO：18)；和

30

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu

20 25

Lys(COCH2PEG5000)Arg Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO：19)

30

本发明的另一项内容包括Xaa^22-31为(SEQ ID NO：28)的结构式(I)多肽，它们100°周期时的<μ_H>约为0.25。该亚属的代表性多肽包括但不限于：

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala

20 25 30

Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO：20)

本发明的另一项内容包括Xaa^22-31为(SEQ ID NO：29)的结构式(I)多肽，它们100°周期时的<μ_H>约为0.28。该亚属的代表性多肽包括但不限于：

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser

20 25 30

Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO：21)

本发明的另一项内容包括Xaa^22-31为(SEQ ID NO：30)的结构式(I)多肽，它们100°周期时的<μ_H>约为0.29。该亚属的代表性多肽包括但不限于：

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO：22).

本发明在另一方面内容中提供了生理活性截短形式同系物bPTH(1-34)的类似物，如结构通式(II)所示：

Xaa¹ Val Ser Glu Ile Gln Xaa⁷ Xaa⁸ His Asn Leu Gly Lys His Leu Xaa¹⁶ SerXaa¹⁸ Xaa¹⁹ Arg Xaa²¹ Xaa^22-31His Asn Xaa³⁴末端，其中：

Xaa¹是Ser或Ala；

Xaa⁷是Leu或Phe；

Xaa⁸是Met或Nle；

Xaa¹⁶是Asn或Ser；

Xaa¹⁸是Leu，Met或Nle；

Xaa¹⁹是Glu或Arg；

Xaa²¹是Val或Arg；

Xaa^22-31选自(SEQ ID NO：26、27、28、29和30)；

Xaa³⁴是Phe或Tyr；

末端是OH或NR₂，其中的R是H或(C₁-C₄)烷基；及其药学上认可的盐。结构式(II)的代表性多肽包括但不限于：

Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Nle His Asn Leu Gly Lys His Leu

1 5 10 15

Ser Ser Nle Glu Arg Val Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Asn Tyr NH2(SEQ ID NO：23)和

Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Nle His Asn Leu Gly Lys His Leu

1 5 10 15

Ser Ser Nle Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Asn Tyr NH2(SEQ ID NO：24).

在本发明的另一方面内容中，我们惊奇地发现少于34个氨基酸的PTH和PTHrp的同系物和类似物也是强效骨重塑剂。这类化合物的通式为：

Ala Val Ser Glu Xaa⁵ Gln Leu Leu His Asp Xaa¹¹ G1y Xaa¹³ Ser Ile Gln Asp LeuXaa¹⁹ Arg Xaa²¹ Xaa^22-31 Xaa³² Xaa³³ Xaa³⁴末端，

代表性多肽包括但不限于：

化合物41：AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHP-NH₂

(SEQ ID NO：55)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Pro NH2(SEQ ID NO：55).

物理数据

m.p.142.8-166.1℃[a]_D ²⁵-53.80(c 0.38，H₂O)

FAB(C₁₇₃H₂₉₅N₅₅O₄₉)：[M+H]⁺3929

AAA：Asx 2.0(2) Glx 5.7(6) Ser 1.8(2)

His 3.0(3) Gly 1.1(1) Ala 0.9(1)

Arg 2.8(3) Val 1.2(1) Ile 0.9(1)

Leu 7.4(8) Lys 4.4(4) Pro 0.9(1)

化合物42：AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LP-NH2

(SEQ ID NO：56)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu Pro NH2(SEQ ID NO：56).

物理数据

m.p.161.0-177.0℃[a]_D ²⁵-61.97(c 0.19，H₂O)

FAB(C₁₆₇H₂₈₈N₅₂O₄₈)：[M+H]⁺3792.0

AAA：Asx 2.2(2) Glx 5.9(6) Ser 1.9(2)

His 2.1(2) Gly 1.1(1) Ala 1.0(1)

Arg 3.0(3) Val 1.1(1) Ile 1.0(1)

Leu 7.9(8) Lys 4.3(4) Pro 0.9(1)

本领域技术人员懂得，只要在(22-31)的位置插入一段100°±20°周期时的单个残基平均疏水力矩超过约0.20的氨基酸序列就可以合成这些多肽类似物的多种置换形式，它们都具有本文所要求的特性。

多肽的经典合成法

可以利用以下方法来合成本发明的多肽：用于固相合成法的J.M.Stewart和J.D.Young，《固相肽合成法》(Solid Phase Peptide Sythesis)第2版，PierceChemical Co.，Rockford，Illinois(1984)和J.Meinhofer，《激素类蛋白质和肽》(Hormonal Protein and Peptide)，第2卷，Academic Press，New York(1973)，以及用于液相合成法的E.Schroder和K.Lubke，《肽》(The Peptides)第1卷，Academic Press，New York(1965)。

通常，以上方法涉及在一延伸肽链上依序添加被保护的氨基酸。一般而言，第一个氨基酸的氨基或羧基和任何反应性侧链基团被保护。然后，这一被保护的氨基酸或被连接到一惰性固体载体上或在溶液中使用，在适于酰胺键形成的条件下加上同样经适当保护的序列中的第二个氨基酸。全部氨基酸按正确顺序连接之后，去除保护基和任何固体载体，形成粗制多肽。将多肽脱盐并纯化，以利用色谱法为佳，生成最终产品。

一种较好的制备少于约40个氨基酸的生理活性截短形式多肽的类似物的方法涉及固相的肽合成。在这种方法中用对酸或碱敏感的基团保护α-氨基官能团(N^α)和任意反应性侧链。保护基必需在肽键形成条件下保持稳定，而且又能够方便地被去除而不影响已形成的多肽链。合适的α-氨基保护基包括但不限于：叔丁氧基羰基(Boc)、苄氧基羰基(Cbz)、邻氯苄氧基羰基、二苯基异丙氧基羰基、叔戊氧基羰基(Amoc)、异冰片氧基羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基苄氧基-羰基、邻硝基苯基亚氧硫基、2-氰基-叔丁氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)等，较好的是叔丁氧基羰基(Boc)。合适的侧链保护基包括但不限于：乙酰基、苄基(Bzl)、苄氧基甲基(Bom)、邻溴苄氧基羰基、叔丁基、叔丁基二甲基甲硅烷基、2-氯苄基(Cl-z)、2，6-二氯苄基、环己基、环戊基、异丙基、新戊基、四氢吡喃-2-基、甲苯磺酰基(Tos)、三甲基甲硅烷基和三苯甲游基。

在固相合成法中，C末端氨基酸首先与合适的树脂载体连接。合适的树脂对逐步缩合反应和去保护反应的反应剂和反应条件惰性，而且不溶于所用的介质中。市售树脂举例包括用反应性基团改性的苯乙烯/二乙烯基苯树脂，例如氯甲基化的共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)、羟基甲基化的共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)等。较好的是苄基化、羟基甲基化的苯基乙酰氨基甲基(PAM)树脂。如果化合物的C末端是酰胺，较好的树脂是对甲基二苯甲基-共聚(苯乙烯-二乙烯-基苯)树脂。

可以通过N^α-保护的氨基酸与树脂反应来完成与PAM树脂的连接，最好是Boc-氨基酸，以其铵、铯、三乙铵、1，5-二氮二环-[5.4.0]十一-5-烯、四甲基铵或类似的盐形式在乙醇、乙腈、N，N-二甲酰胺(DMF)等中，最好是铯盐在DMF中在较高的温度例如40℃至60℃，最好约50℃与树脂反应12至72小时，最好约48小时。

N^α-Boc-氨基酸可以利用N，N’-二异丙基碳化二亚胺(DIC)/1-羟基苯并三唑(HOBt)在例如二氯甲烷或二甲基甲酰胺之类溶剂，最好是二氯甲烷中，在约10℃至50℃，最好是25℃介导的偶合反应约2至约24小时，最好约2小时，来与二苯甲基胺树脂连接。

利用本领域众所周知的方法可以成功地实现被保护氨基酸的偶合，尤其是在自动肽合成仪中。在用三乙胺或类似的碱中和后，被保护氨基酸最好以约1.5至2.5倍过量引入，并在惰性、非水性、极性溶剂例如二氯甲烷、DMF或它们的混合物中，最好于环境温度下在二氯甲烷中进行偶合。代表性的偶合剂是N，N’-二环己基碳化二亚胺(DCC)、N，N’-二异丙基-碳化二亚胺(DIC)或其它碳化二亚胺，它们或者单独使用或者在1-羟基苯氧基三唑(HOBt)、O-烯丙基脲、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三(吡咯烷酮)鏻(PyBop)、N-羟基琥珀酰亚胺、其它的羟基亚胺或肟存在下使用。或者，可以使用被保护氨基酸活性酯(例如对硝基苯酯、五氟苯酯等)或对称酐。

在固相合成的最后，从树脂上分离全保护肽。当与树脂载体的连接是苄酯型时，可以在约-10℃至50℃，最好约25℃，对C末端为烷基酰胺的肽使用烷基胺或氟烷基胺或对C末端为非取代酰胺的肽使用氨/甲醇或氨/乙醇氨解约12至24小时，最好约18小时来进行分离。具有羟基C末端的肽可以利用HF或其它强酸性去保护法或利用皂化反应来分离。或者，可以先利用例如用乙醇的转酯反应然后利用氨解或皂化来从树脂上分离肽。被保护的肽可以利用硅胶色谱纯化。

从肽上去除侧链保护基可以利用苯甲醚或其它正碳离子净化剂存在下用无水液态氟化氢处理氨解产物，用氟化氢/吡啶氟化物处理，用三(三氟乙酰)硼或三氟乙酸处理，用氢和钯碳或聚乙烯吡咯烷酮还原，或用液态氨钠还原，较好的是用液态氟化氢在苯甲醚存在下在约-10℃至10℃，最好约0℃处理约15分钟至2小时，最好约1.5小时。

对于二苯甲基胺树脂上的肽，可以如上所述利用液态氟化氢和苯甲醚将与树脂的分离和去保护步骤合并成一步。

可以将溶液脱盐(例如用BioRad AG-3^_阴离子交换树脂)，并利用一系列的以下类型之一或全部的色谱步骤来纯化肽：乙酸盐型弱碱性树脂上的离子交换；非衍生共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)上的疏水性吸附色谱，例如Amberlite^_XAD；硅胶吸附色谱；羧甲基纤维素上的离子交换色谱；分配色谱，例如Sephadex^_G-25；逆流分配；或高效液相色谱(HPLC)，尤其是辛基或十八烷基甲硅烷基二氧化硅(ODS)结合相柱填料上的反相HPLC。

所以，本发明的另一方面内容涉及制备多肽及其药学上认可的盐的方法，该方法包括在合适的树脂载体上依序缩合被保护氨基酸，去除保护基和树脂载体，并纯化产物，生成PTH和PTHrp的生理活性截短形式同系物和类似物的类似物，较好的是PTH(1-34)和PTHrp(1-34)的类似物，其中(22-31)位的氨基酸形成一个两亲α-螺旋肽序列，正如前文所述。

多肽的重组合成法

或者，可以通过克隆和表达一个编码所需多肽的基因来制备本发明的多肽。在这种方法中，制备一个含有所需DNA序列的质粒并将其插入合适的宿主微生物，通常是细菌例如大肠杆菌或酿酒酵母菌之类的酵母菌，并诱导宿主微生物产生多拷贝质粒，从而产生编码本发明多肽类似物的cDNA的多拷贝。

首先，设计一段编码选定的PTH或PTHr类似物的合成基因，上面具有常规的限制性酶切位点以便以后的改变。可使用Mullis在美国专利4,683,195和4,683,202中所述的聚合酶链反应(PCR)来扩增该序列。

分离出扩增后的合成基因并将它与合适的质粒例如Trp LE质粒连接，可以串联地插入4份基因拷贝。美国专利4,738,921和欧洲专利公开No.0212532中记述了Trp LE质粒的制备方法。Trp LE质粒通常产生比Trp E质粒多8至10倍的蛋白质。然后可在合适的载体例如大肠杆菌或酿酒酵母中表达多拷贝基因。

具体使用的表达载体为Trp LE 18 Port(Ile³，Pro⁵)，它包含以下元件：一段包含氨苄青霉素抗性基因和质粒复制起始点的pBR322片段(EcoRI-BamHI)；一段包含trp启动子和trpE基因的EcoRI-SacII片段；一段HIV蛋白酶(Ile³，Pro⁵)基因片段(SacII-HindIII)；一段bGRF基因片段(HidnIII-BamHI)；和大肠杆菌rpoc基因的转录终止子。HIV蛋白酶和bGRF基因片段不是必需的，可以根据需要以其它编码序列取代。

表达的多聚体融合蛋白聚集在细胞内稳定的内含体中，可以通过离心与其它细胞蛋白分离。分离的融合蛋白被转变成单体PTH或PTHrp类似物，可以通过阳离子交换和/或反相HPLC纯化。

本领域技术人员知晓其它的克隆、扩增、表达和纯化方法。代表性的方法公开于Maniafis等的《分子克隆，实验室手册》(Molacilar Cloning，a LaboratoryManuol)第二版(Cold spring Harbor Laboratory(1989))中。

使用与剂型

本发明的多肽可用于预防和治疗多种以骨流失为表征的哺乳动物疾病。具体地说，本发明的化合物适用于预防和治疗人的骨质疏松和骨质减少。

通常，本发明多肽或其盐的用量约在每天0.002至10μg/kg体重之间，以每天约0.04μg/kg体重至约0.2μg/kg体重为佳。对于一个50kg的女性患者来说，活性成份的日用剂量在约0.1至约500μg，以约2.0至约100μg为佳。在其它哺乳动物和马、狗和牛中，可能需用较高剂量。为了获得最佳疗效，该剂量可以以常规药物组合物形式通过一次性使用、多次使用或控释方式来施予，以每日一次或多次注射为佳。

对确切剂量和组成以及最合适的释放型的选择特别受到所选多肽的药学特性、治疗病症的特点和严重程度以及病人的生理状况和精神敏度的影响。

在对皮质甾类诱发的骨质减少的治疗中，预计高剂量皮质甾类所需的多肽剂量将较高。

代表性释放型包括口服、肠外(包括皮下、肌内和静脉内)、直肠、口腔(包括舌下)、肺内、透皮和鼻内。

药学上认可的盐保留了所要求亲本多肽的生物活性而没有毒副作用。这类盐的实例是(a)与无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成的盐；和与有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、维生素C、苯甲酸、单宁酸、双羟萘酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等形成的盐；(b)与多价金属阳离子例如锌、钙、钼、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等形成的碱加成盐；或与N，N’-二苄基亚乙基胺或乙二胺形成的有机阳离子形成的盐；或(c)(a)和(b)的组合，例如单宁酸锌盐等。

本发明的另一方面内容涉及包含以本发明多肽或其药学上认可的盐为活性成份，混合以药学上认可的无毒载体的药物组合物。如上所述，这样的组合物可以制备成肠外剂型(包括皮下、肌内和静脉内)，特别是液态的溶液或悬浮液形式；口服或口腔剂型，特别是片剂或栓剂；肺内或鼻内剂型，特别是粉剂、滴鼻液或喷雾剂；和直肠或透皮剂型。

组合物可以利用制药业的常用方法，例如《Remington药物科学》(Remigton’sPharmaceutical Sciences)第17版，Mack出版公司，Easton PA(1985)中所述的方法进行制备并方便地以单位剂型使用。肠外剂型的配方包含作为赋形剂的无菌水或生理盐水、亚烷基二醇例如丙二醇、聚烷基二醇例如聚乙二醇、植物油、氢化萘等。口服剂型的配方可以通过添加胆盐或酰基肉碱来强化。鼻内剂型的配方可以是固体并包含赋形剂例如乳糖和葡聚糖，或者是以滴鼻液或定量喷剂形式使用的水溶液或油溶液。用于口腔剂型的典型赋形剂包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预凝淀粉等。

在配制鼻内剂型时，含量在约0.2至15重量百分比，以约0.5至4重量百分比，最好是约2重量百分比的表面活性酸例如甘氨胆酸、胆酸、牛黄胆酸、乙基胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氢胆酸、脱氧甘胆酸、环糊精等可能强化通过鼻粘膜的吸收。

本发明化合物对患者例如一周至一年期的长期释放可以通过一次性使用包含了对要求的释放周期来说足量的活性成份的控释剂型来进行。为此可以使用多种控释系统，例如整片系统或贮库系统微胶囊、缓释植入体、渗透泵、囊泡、胶粒、脂质体、透皮贴、离子渗透装置和其它替代形式的可注射剂型。局限在需要活性成份释放的部位是某些控释剂型的又一特点，已证明这样有利于治疗某些疾病。

控释剂型配方之一包含分散在或包含在某种缓慢降解、无毒、非抗原性聚合物例如共聚(乳酸/葡糖酸)中的多肽或其盐，这类聚合物如Kent、Lewis、Sanders和Tice在美国专利4,675,189中的开创性研究工作所述，这些化合物，或其相关的不溶性盐更好，还可以配制在甾醇或其它脂质基质的颗粒剂或硅塑料基质植入体中。其它缓释剂、缓释植入体或可注射配方对熟练技术人员来说是显而易见的，参见例如《维持和缓释药物传递系统》(Sustained and Controlled Release DrugDelivery System)，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York(1978)和R.W.Baker《生物活性药物的缓释》(Controlled Release of Biologically ActiveAgents)，John Wiley&Sons，New York(1987)。

以下具体实施例以说明本发明代表性化合物的合成和测试为目的，而不应被理解成对权利要求范围的限定。在实施例中，“m.p.”表示熔点，“[α]_D ²⁵”25℃时在所示溶剂中所示浓度下的光学活性，“FAB”快速原子轰击质谱，“AAA”是氨基酸分析，在测定值之后在括弧中给出估计值，在Hewlett-PackardAminoQuant Analyzer上按照制造商建议的程序进行氨基酸的分析。伯氨基酸用邻苯二醛衍生；仲氨基酸用Fmoc衍生。用荧光检测衍生后的氨基酸来定量。被保护的氨基酸由Applied Biosystems Inc.，提供。

实施例1

使用自动的Applied Biosystems 430A型肽合成仪，在4-甲基二苯甲胺树脂上，利用固相合成法制备0.5mmol化合物1(SEQ ID NO：7)。用叔丁氧基羰基(Boc)保护α-氨基基团。侧链保护基是：用于Asp，Glu和Ser的苄基(Bzl)；用于Arg的甲苯磺酰基(Tos)；用于His的苄氧基甲基(Bom)；和用于Lys的2-氯苄基(Cl-z)。按照Stewart和Young(同上)所述用N，N’-二环己基碳化二亚胺/1-羟基苯并三唑(DIC/HOBt)依序偶合氨基酸。每一次氨基酸偶合之后，利用乙酸酐和二异丙基乙基胺在N-甲基吡咯烷酮中形成的混合物将肽乙酰化。在苯甲醚存在下用无水HF(25ml)从树脂上分离完成后的肽，同时去保护侧链保护基，在-10℃进行30分钟，在0℃进行60分钟。真空蒸发HF后，用无水乙醚洗涤残留物，用10％乙酸萃取粗制肽。10％乙酸萃取液经冷冻干燥得900mg粗制产物。利用中压ODS反相柱色谱，使用CH₃CN在0.1％TFA中形成的22至45％梯度纯化肽。产物被洗脱在三份流份中，经浓缩和冷冻于燥后得130mg白色固体，纯度高于98％。

化合物1：

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-NH₂(SEQ ID NO：7)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO：7)

物理数据：m.p.150-159 C[a]_D ²⁵-34.88°(c 0.16，H₂O)

FAB(C₁₇₅H₃₀₀N₅₆O₅₁)：[M+H]⁺ 4005.5

AAA：Asp，1.9(2)；Glu，5.6(6)；Ser，1.6(2)；His，2.7(3)；Gly，1.0(1)；Thr，

0.9(1)；Ala，1.9(2)；Arg，2.8(3)；Val，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.3(8)；

Lys，4.0(4)。

同样，制备和鉴定化合物2、5-18、21-27、29-36、38-48、50-54、58、64和66-70，视合成羟基末端的多肽的需要替换PAM树脂。

化合物2：

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-OH(SEQ ID NO：6)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO：6)

物理数据：m.p.154-170℃[a]_D ²⁵-49.35°(c 0.46，H₂O)

FAB(C₁₇₅H₃₀₁N₅₇O₅₀)：[M+H]⁺4005.0

AAA：Asp，2.1(2)；Glu，5.9(6)；Ser，1.7(2)；His，2.9(3)；Gly 1.1(1)；Thr，

1.0(1)；Ala，1.9(2)；Arg，3.0(3)；Val，1.2(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.8(8)；

Lys，4.2(4).

化合物5：

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLERLLERLHTA-OH(SEQ ID NO：15)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg

20 25 30

Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO：15)

物理数据：m.p.147-165℃[a]D25-49.17°(c 0.66，H2O)

FAB(C175H299N59O52)：[M+H]+4061

AAA：Asp，2.1(2)；Gly，6.1(6)；Ser，1.8(2)；His，3.1(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；

Arg，5.0(5)；Val，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.7(8)；Lys，1.9(2).

化合物6：

AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLERLHTA-OH(SEQ ID NO：16)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg

20 25 30

Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO：16)

物理数据：m.p.150-170℃[a]D25-48.65°(c 0.54，H2O)

FAB(C175H299N63O52)：[M+H]+4118.0

AAA：Asp，2.1(2)；Glu，6.1(6)；Ser，1.8(2)；His，3.2(3)；Gly，1.2(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；

Arg，6.9(7)；Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.8(8).

化合物7：

AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRLHTA-OH(SEQ ID NO：17)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Lys Arg

20 25 30

Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO：17)

物理数据：m.p.177-182℃[a]D25-46.17°(c 0.14，H2O)

FAB(C176H304N64O50)：[M+H]+4117

AAA：Asp，2.0(2)；Glu，4.8(5)；Ser，1.8(2)；His，3.2(3)；Gly，1.1(1)；Thr，0.9(1)；Ala，1.9(2)；

Arg，6.7(7)；Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Lys，7.7(8)；Lys，0.9(1).

化合物8：

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLRKLHTA-OH(SEQ ID NO：5)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Arg Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO：5)

物理数据：m.p.147-165℃[a]D25-49.17°(c 0.66，H2O)

FAB(C176H305N59O49)：[M+H]+4033.0

AAA：Asp，2.0(2)；Glu，4.8(5)；Ser，1.8(2)；His，2.7(3)；Gly，1.1(1)；Thr，0.9(1)；Ala，

2.0(2)；Arg，3.9(4)；Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.9(8)；Lys，4.0(4).

化合物9：

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTAGRR-OH(SEQ ID NO：10)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala Gly Arg Arg OH(SEQ ID NO：10)

35

物理数据：m.p.158-160℃[a]D25-44.76°(c 0.1，H2O)

FAB(C189H326N64O55)：[M]+4375.0

AAA：Asp，2.0(2)；Glu，5.9(6)；Ser，1.7(2)；His，2.9(3)；Gly，2.3(2)；Thr，1.0(1)；Ala，1.9(2)；

Arg，5.0(5)；Val，1.2(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.8(8)；Lys，4.3(4).

化合物10：

AVSEAQLLHDLGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHAL-OH(SEQ ID NO：14)

Ala Val Ser Glu Ala Gln Leu Leu His Asp Leu Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Ala Leu OH(SEQ ID NO：14)

物理数据：m.p.170-175℃[a]D25-31.59°(c 0.54，H2O)

FAB(C174H300N52O51)：[M+H]+3936.0

AAA：Asp，2.0(2)；Glu，6.0(6)；Ser，1.8(2)；His，2.0(2)；Gly，1.2(1)；Ala，3.0(3)；Arg，2.8(3)；Val，

1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，9.9(10)；Lys，3.0(3).

化合物11：

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLELLKEL-NH₂(SEQ ID NO：11)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu Lys Glu Leu NH2(SEQ ID NO：11)

物理数据：m.p.172-174℃[a]D25-43.29°(c 0.2，H2O)

FAB(C179H3 11N55O52)：[M+H]+4065.8

AAA：Asp，2.2(2)；Glu，7.7(7)；Ser，1.7(2)；His，2.0(2)；Gly，1.0(1)；Ala，1.0(1)；Arg，3.0(3)；

Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，9.3(9)；Lys，5.1(5).

化合物12：

AVSEIQFXHNLGKHLSSXERVELLEKLLEKLHNY-NH₂

(X＝Nle，SEQ ID NO：23)

Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Nle His Asn Leu Gly Lys His Leu

1 5 10 15

Ser Ser Nle Glu Arg Val Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Asn Tyr NH2(SEQ ID NO：23)

物理数据：m.p.178℃[a]D25-36.88°(c 0.4，H2O)

FAB(C182H295N50O51)：[M+H]+4001.6

AAA：Asp，2.1(2)；Glu，6.5(6)；Ser，2.7(3)；His，3.1(3)；Gly，1.1(1)；Ala，1.0(1)；Arg，1.0(1)；

Tyr，0.8(1)；Val，2.0(2)；Phe，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu+Nle，8.5(7+2)；Lys，3.1(3).

化合物13：

AVSEIQFXHNLGKHLSSXRRRELLEKLLEKLHNY-NH₂

(X＝Nle，SEQ ID NO：24)

Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Nle His Asn Leu Gly Lys His Leu

1 5 10 15

Ser Ser Nle Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Asn Tyr NH2(SEQ ID NO：24)

物理数据：m.p.260℃[a]D25-37.02°(c 0.2，H2O)

FAB(C184H304N56O49)：[M+H]+4084

AAA：Asp，2.1(2)；Glu，5.5(5)；Ser，2.6(3)；His，3.1(3)；Ala，1.0(1)；Gly，1.1(1)；Arg，3.2(3)；

Tyr，1.0(1)；Val，1.0(1)；Phe，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，9.0(9)；Lys，3.0(3).

化合物14：

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRALAEALAEALHTA-NH₂(SEQ ID NO：2O)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala

20 25 30

Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO：20)

物理数据：m.p.190-225℃[a]D25-56.58°(c 0.36，H2O)

FAB(C161H272N54O49)：[M+H]+3747.0

AAA：Asp，2.1(2)；Glu，4.9(5)；Ser，1.7(2)；His，2.6(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，7.6(7)；

Arg，2.8(3)；Val，1.2(1)；Ile，1.0(1)；Leu，6.6(6)；Lys，1.9(2).

化合物15：

AVSEHQLLHDKGKSIQDLARRELLEKLLEKLHTA-NH₂(SEQ ID NO：12)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Ala Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO：12)

物理数据：m.p.170-180℃[a]D25-48.19°(c 0.2，H2O)

FAB(C172H293N53O51)：[M+H]+3919.0

AAA：Asp，2.1(2)；Glu，6.1(6)；Ser，1.7(2)；His，3.1(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，3.0(3)；

Arg，2.1(2)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.0(8)；Lys，4.4(4).

化合物16：

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRAELLEKLLEKLHTA-NH₂(SEQ ID NO：13)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Ala Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO：13)

物理数据：m.p.190-195℃[a]D25-50.50°(c 0.4，H2O)

FAB(C172H293N53O51)：[M+H]+3919.0

AAA：Asp，2.1(2)；Glu，6.0(6)；Ser，1.8(2)；His，3.1(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，3.0(3)；

Arg，2.1(2)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.5(8)；Lys，4.2(4).

化合物17：

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRSLLSSLLSSLHTA-NH₂(SEQ ID NO：21)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser

20 25 30

Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO：21)

物理数据：m.p.195-204℃[a]D25-67.11°(c 0.3，H2O)

FAB(C163H280N54O50)：[M+H]+3796.0

AAA：Asp，2.1(2)；Glu，2.9(3)；Ser，6.8(7)；His，3.1(3)；Gly，1.2(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；

Arg，3.0(3)；Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.2(8)；Lys，2.0(2).

化合物18：

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRAFYDKVAEKLHTA-NH₂(SEQ ID NO：22)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO：22)

物理数据：m.p.200-207℃[a]D25-60.26°(c 0.6，H2O)

FAB(C174H284N56O50)：[M+H]+3960.0

AAA：Asp，2.9(3)，Glu，3.5(4)；Ser，1.4(2)；His，2.6(3)；Gly，0.9(1)；Thr，1.0(1)；Ala，4.0(4)；

Arg，3.0(3)；Tyr，0.9(1)；Val，1.9(2)；Phe，1.1(1)；Ile，0.9(1)；Leu，3.6(4)；Lys，4.1(4).

化合物21：

AVSEIQFLHN LGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNY-NH₂(SEQ ID NO：35)

Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu

1 5 10 15

Ser Ser Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Asn Tyr NH2(SEQ ID NO：35)

物理数据：m.p.148-155oC[a]D25-45.97(c 0.26，H2O)

FAB(C184H304N56O49)：[M+H]+4084

AAA：Asx，2.1(2)；Glx，5.0(5)；Ser，2.7(3)；His，3.0(3)；Gly，1.0(1)；Ala，0.9(1)；Arg，3.1(3)；

Tyr，0.9(1)；Val，1.0(1)；Phe，0.9(1)；Ile，0.9(1)；Leu 9.3(9)；Lys，3.2(3).

化合物24：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLKL KELLEKLLEK LHTA-NH₂(SEQ ID NO：38)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Lys Leu Lys Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO：38)

物理数据：m.p.175-182o℃[a]D25-49.99(c 0.47，H2O)

FAB(C175H299N49O51)：[M+H]+3906.5

AAA：Asx，2.1(2)；Glx，6.5(6)；Ser，1.8(2)；His，3.1(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.1(2)；

Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，9.1(9)；Lys，6.5(6).

化合物25：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTA-NH₂(SEQ ID NO：39)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg

20 25 30

Leu His Thr Ala-NH2 (SEQ ID NO：39)

物理数据：m.p.136.5-153.5oC[a]D25-32.57(c 0.13，H2O)

FAB(C175H300N60O51)：[M+H]+4060.8

AAA：Asx，2.2(2)；Glx，6.2(6)；Ser，1.8(2)；His，3.2(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.1(2)；

Arg，5.2(5)；Val，1.1(1)；Ile，1.1(1)；Leu，8.4(8)；Lys，2.2(2).

化合物26：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAP-OH(SEQ ID NO：40)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg

20 25 30

Leu His Thr Ala Pro OH (SEQ ID NO：40)

物理数据：m.p.125.8-127.2oC[a]D25-54.62(c 0.23，H2O)

FAB(C180H306N60O53)：[M+H]+4158.0

AAA：Asx，2.1(2)；Glx，6.2(6)；Ser，1.8(2)；His，2.9(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；

Arg，5.1(5)；Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.0(8)；Lys，2.1(2)；Pro，1.1(1).

化合物27：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRR-OH(SEQ ID NO：41)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg

20 25 30

Leu His Thr Ala Gly Arg Arg OH (SEQ ID NO：41)

35

物理数据：m.p.106-137.3oC[a]D25-39.55(c 0.67，H2O)

FAB(C189H326N68O55)：[M+H]+4430.5

AAA：Asx，2.1(2)；Glx，5.9(6)；Ser，1.6(2)；His，2.7(3)；Gly，2.2(2)；Thr，1.0(1)；Ala，1.8(2)；

Arg，7.3(7)；Val，0.8(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.1(8)；Lys，2.1(2).

化合物29：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTY-NH₂(SEQ ID NO：43)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Tyr NH2(SEQ ID NO：43)

物理数据：m.p.160-172oC[a]D25-49.85(c 0.34，H2O)

FAB(C181H304N56O52)：[M+H]+4096.9

AAA：Asx，2.0(2)；Glx，5.6(6)；Ser，1.7(2)；His，3.1(3)；Gly，1.1(1)；Thr，0.9(1)；Ala，0.9(1)；

Arg，3.0(3)；Tyr，0.9(1)；Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.7(8)；Lys，4.4(4).

化合物30：

AVSEHQLLHD KGYSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH₂(SEQ ID NO：44)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Tyr Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO：44)

物理数据：m.p.130-171oC[a]D25-40.65(c 0.34，H2O)

FAB(C178H297N55O52)：[M+H]+4039.4

AAA：Asx，2.0(2)；Glx，5.5(6)；Ser，1.8(2)；His，3.4(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；

Arg，2.9(3)；Tyr，0.8(1)；Val，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.9(8)；Lys，3.4(3).

化合物31：

AVSEHQLLHD KGCSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH₂(SEQ ID NO：45)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Cys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO：45)

物理数据：m.p.140-160oC[a]D25-44.48(c 0.25，H2O)

FAB(C172H293N55O51S1)：[M+H]+3979

AAA：Asx+Cys，3.0(2+1)；Glx，5.6(6)；Ser，1.7(2)；His，3.0(3)；Gly，1.0(1)；Thr，0.9(1)；Ala，

1.9(2)；Arg，2.5(3)；Val，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.5(8)；Lys，3.3(3).

化合物32：

AVSEHQLLHD KGXSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH₂(SEQ ID NO：46)

(X＝Cys(CH₂CONH(CH₂)₂NH(生物素)))

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Xaa Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala NH2，(Xaa＝Cys(CH2CONH(CH2)2NH(生物素)))，

(SEQ ID NO：46)

物理数据：m.p.(not determined)[a]D25(not determined)

FAB(C186H316N59O54S2)：[M+H]+4306.6

AAA：Asx，2.2(2)；Glx，6.1(6)；Ser，1.8(2)；His，3.8(3)；Gly，1.0(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；

Arg，3.1(3)；Val，1.1(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.3(3)；Lys，3.3(3).

化合物33：

AVSEHQLLHD KGXSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH₂(SEQ ID NO：47)

(X＝Lys(7-二甲基氨基-2-氧-2H-1-苯氧基吡喃-4-乙酰基))

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Xaa Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala NH2，(Xaa＝Lys(7-二甲基氨基-2-氧-2H-1-苯氧基吡喃-4-乙酰基)，

(SEQ ID NO：47)

物理数据：m.p.135-205oC[a]D25-26.92(c 0.104，50％aq.HOAc)

FAB(C188H311N57O54)：[M+H]+4233

AAA：Asx，1.9(2)；Glx，6.3(6)；Ser，1.7(2)；His，3.2(3)；Gly，1.0(1)；Thr，1.1(1)；Ala，2.0(2)；

Arg，3.2(3)；Val，1.1(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.2(8)；Lys，4.5(4).

化合物34：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAG-OH(SEQ ID NO：48)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala Gly OH(SEQ ID NO：48)

35

物理数据：m.p. 92.1-1 46.6oC[a]D25-40.76(c 0.34，H2O)

FAB(C177H302N56O53)：[M+H]+4062.0

AAA：Asx，2.0(2)；Glx，5.7(6)；Ser，1.8(2)；His，3.0(3)；Gly，2.2(2)；Thr，0.9(1)；Ala，1.9(2)；

Arg，2.8(3)；Val，1.2(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.5(8)；Lys，4.2(4).

化合物35：

AVSX₁HQLLHX₂ KGKSIQX₂LRR RX₁LLX₁KLLX₁K LHA-OH(SEQ ID NO：49)

(X₁＝Glu(OCH₃)；X₂＝Asp(OCH₃))

Ala Val Ser Xaal His Gln Leu Leu His Xaa2 Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Xaa2 Leu Arg Arg Arg Xaal Leu Leu Xaal Lys Leu Leu Xaal Lys

20 25 30

Leu His Ala OH(Xaal＝Glu(OCH3)；Xaa2＝Asp(OCH3))(SEQ ID NO：49)

物理数据：m.p.(未测定) [a]D25-21.96(c 0.132，H2O)

FAB(C181H311N55O52)：[M+H]+4089.0

AAA：Asx，2.1(2)；Glx，6.3(6)；Ser，1.8(2)；His，3.3(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；

Arg，3.1(3)；Val，1.1(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.0(8)；Lys，4.2(4).

化合物36：

AVSX₁HQLLHX₂ KGKSIQX₂LRR RX₁LLX₁KLLX₁K LHA-OCH₃

(SEQ ID NO：50)

(X₁＝Glu(OCH₃)；X₂＝Asp(OCH₃))

Ala Val Ser Xaal His Gln Leu Leu His Xaa2 Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Xaa2 Leu Arg Arg Arg Xaal Leu Leu Xaal Lys Leu Leu Xaal Lys

20 25 30

Leu His Ala OCH3(Xaal＝Glu(OCH3)；Xaa2＝Asp(OCH3))(SEQ ID NO：50)

物理数据：m.p.(未测定) [a]D25-46.80(c 0.07，H2O)

FAB(C182H313N55O52)：[M+H]+4103

AAA：Asx，2.1(2)；Glx，6.2(6)；Ser，1.4(2)；His，3.0(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.1(1)；Ala，1.7(2)；

Arg，3.2(3)；Val，0.6(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.0(8)；Lys，4.1(4).

化合物38：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAP-OH(SEQ ID NO：52)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala Pro OH (SEQ ID NO：52)

35

物理数据：m.p.152.1-186.5oC[a]D25-55.91(c 0.33，H2O)

FAB(C180H306N56O53)：[M+H]+4102.6

AAA：Asx，2.0(2)；Glx，5.6(6)；Ser，1.7(2)；His，2.9(3)；Gly，1.1(1)；Thr，0.9(1)；Ala，1.9(2)；

Arg，2.9(3)；Val，1.2(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.7(8)；Lys，4.3(4).

化合物39：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTP-OH(SEQ ID NO：53)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Pro OH(SEQ ID NO：53)

物理数据：m.p.120-148.2oC[a]D25-52.78(c 0.47，H2O)

FAB(C177H301N55O52)：[M+H]+4031.0

AAA：Asx，2.0(2)；Glx，5.5(6)；Ser，1.8(2)；His，2.9(3)；Gly，1.0(1)；Thr，1.0(1)；Ala，0.9(1)；

Arg，2.9(3)；Val，1.2(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.5(8)；Lys，3.6(3)；Pro，0.9(1).

化合物40：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTP-NH₂(SEQ ID NO：54)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Pro NH2 (SEQ ID NO：54)

物理数据： m.p.133.9-155.1oC[a]D25-54.22(c 0.37，H2O)

FAB(C177H302N56O51)：[M+H]+4030.7

AAA：Asx，2.0(2)；Glx，5.6(6)；Ser，1.9(2)；His，2.9(3)；Gly，1.1(1)；Thr，0.9(1)；Ala，0.9(1)；

Arg，2.8(3)；Val，1.2(1)；Ile，1.1(1)；Leu，7.8(8)；Lys，4.2(4)；Pro，0.9(1).

化合物41：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHP-NH₂(SEQ ID NO：55)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Pro NH2(SEQ ID NO：55)

物理数据：m.p.142.8-166.1oC[a]D25-53.80(c 0.38，H2O)

FAB(C173H295N55O49)：[M+H]+3929

AAA：Asx，2.0(2)；Glx，5.7(6)；Ser，1.8(2)；His，3.0(3)；Gly，1.1(1)；Ala，0.9(1)；Arg，2.8(3)；

Val，1.2(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.4(8)；Lys，4.4(4)；Pro，0.9(1).

化合物42：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LP-NH₂(SEQ ID NO：56)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu Pro NH2(SEQ ID NO：56)

物理数据：m.p.161.0-177.0oC[a]D25-61.97(c 0.19，H2O)

FAB(C167H288N52O48)：[M+H]+3792.0

AAA：Asx，2.2(2)；Glx，5.9(6)；Ser，1.9(2)；His，2.1(2)；Gly，1.1(1)；Ala，1.0(1)；Arg，3.0(3)；

Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.9(8)；Lys，4.3(4)；Pro，0.9(1).

化合物43：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAW-OH(SEQ ID NO：57)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Arg Ser Ala Trp OH(SEQ ID NO：57)

35

物理数据：m.p.181-202oC [a]D25-45.14(c 0.19，H2O)

FAB(C195H326N62O56)：[M+H]+4435.2

AAA：Asx，2.0(2)；Glx，5.8(6)；Ser，2.8(3)；His，2.8(3)；Gly，1.1(1)；Thr，0.9(1)；Ala，1.9(2)；

Arg，3.7(4)；Ile，0.9(1)；Leu，7.5(8)；Lys，4.3(4)；Trp，0.9(1).

化合物44：

VSEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-OH

(SEQ ID NO：58)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Gly Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp OH (SEQ ID NO：58)

35 40

物理数据：m.p.130-132.2oC[a]D25-46.66(c 0.195，H2O)

FAB(C216H365N81O62)：[M+H]+5088.8

AAA：Asx，2.2(2)；Glx，6.0(6)；Ser，2.7(3)；His，3.0(3)；Gly，2.2(2)；Thr，2.1(2)；Ala，3.0(3)；

Arg，10.5(10)；Val，0.9(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.2(8)；Trp，1.0(1).

化合物45：

AVSEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-NH₂

(SEQ ID NO：59)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Gly Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp NH2 (SEQ ID NO：59)

35 40

物理数据：m.p. 158-174oC [a]D25-43.57(c 0.53，H2O)

FAB(C216H366N82O61)：[M+H]+5087.4

AAA：Asx，1.9(2)；Glx，5.6(6)；Ser，2.6(3)；His，3.3(3)；Gly，2.1(2)；Thr，2.0(2)；Ala，2.9(3)；

Arg，10.1(10)；Val，0.9(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.3(8)；Trp 1.1(1).

化合物46：

AVSEHQLLHD RGXSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-OH

(SEQ ID NO：60)

(X＝Lys(二羟基肉桂酰基))

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Xaa Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Gly Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp OH

35 40

(Xaa＝Lys(二羟基肉桂酰基)，(SEQ ID NO：60)

物理数据：m.p.165.4-175.2oC[a]D25-40.43(c 0.20，H2O)

FAB(C225H374N80O62)：[M+H]+5191

AAA：Asx，2.1(2)，Glx，6.3(6)；Ser，2.8(3)；His，3.2(3)；G1y，2.1(2)，Thr，2.0(2)；Ala，3.2(3)；

Arg，9.9(9)；Val，1.0(1)，Ile，0.9(1)；Leu，8.6(8)；Lys，1.1(1)；Trp，1.1(1).

化合物47：

AVSEIQFXHN LGKHLSSXTR SAWLRKKLQD VHNY-NH₂(SEQ ID NO：6 1)

(X＝正亮氨酸)

Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Nle His Asn Leu Gly Lys His Leu

1 5 10 15

Ser Ser Nle Thr Arg Ser Ala Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Asn Tyr NH2(SEQ ID NO：61)

物理数据：m.p.140-160oC[a]D25-56.88(c 0.16，H2O)

FAB(C180H287N55O58)：[M+H]+3989.8

AAA：Asx，3.0(3)；Glx，2.9(3)；Ser，3.7(4)；His，2.8(3)；Gly，1.1(1)；Thr，0.9(1)；Ala，1.9(2)；

Arg，2.0(2)；Tyr，1.0(1)；Val，1.7(2)；Phe，0.9(1)；Ile，0.9(1)；Leu+Nle 5.8(2+4)；Lys，

3.4(3)；Trp，1.1(1).

化合物48：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTMA-NH₂(SEQ ID NO：62)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Met Ala NH2 (SEQ ID NO：62)

35

物理数据：m.p.140-210oC[a]D25-47.75(c 0.178，H2O)

FAB(C180H309N57O52S1)：[M+H]+4135.0

AAA：Asx，2.3(2)；Glx，6.6(6)；Ser，1.4(2)；His，3.2(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；

Arg，3.1(3)；Val，0.9(1)；Met，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.8(8)；Lys，4.4(4).

化合物50：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RFFLEKLLEK LHTA-NH₂(SEQ ID NO：64)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO：64)

35

物理数据：m.p.136.5-156.8oC[a]D25-49.89(c 0.24，H2O)

FAB(C182H300N56O49)：[M+H]+4056.0

AAA：Asx，2.2(2)；Glx，5.0(5)；Ser，1.9(2)；His，3.3(3)；Gly，1.0(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.1(2)；

Arg，3.1(3)；Val，1.0(1)；Phe，2.0(2)；Ile，0.9(1)；Leu，7.2(7)；Lys，3.5(4).

化合物51：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLHKLLEK LHTA-NH₂(SEQ ID NO：65)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu His Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala NH2 (SEQ ID NO：65)

物理数据：m.p.80.7-141.0oC[a]D25-55.38(c 0.23，H2O)

FAB(C176H300N58O49)：[M+H]+4012.8

AAA：Asx，2.2(2)；Glx，4.9(5)；Ser，1.8(2)；His，4.3(4)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；

Arg，3.1(3)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.1(8)；Lys，3.9(4).

化合物52：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEHLLEK LHTA-NH₂(SEQ ID NO：66)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu His Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala NH2 (SEQ ID NO：66)

物理数据：m.p.134.3-1 57.9oC[a]D25-50.72(c 0.45，H2O)

FAB(C175H295N57O51)：[M+H]+4012.8

AAA：Asx，2.1(2)；Glx，5.9(6)；Ser，1.8(2)；His，4.2(4)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；

Arg，3.0(3)；Val，1.1(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.1(8)；Lys，3.1(3).

化合物53：

AVSEHQLLHD KGK8IQDLRR RELLEKLIAK LHTA-NH₂(SEQ ID NO：67)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Ile Ala Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO：67)

物理数据：m.p.142.7-159.8oC[a]D25-54.01(c 0.21，H2O)

FAB(C173H298N56O49)：[M+H]+3946.0

AAA：Asx，2.2(2)；Glx，4.9(5)；Ser，1.8(2)；His，3.1(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，3.1(3)；

Arg，3.1(3)；Val，1.0(1)；Ile，1.9(2)；Leu，7.0(7)；Lys，4.3(4).

化合物54：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEE IHTA-NH₂(SEQ ID NO：68)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Glu

20 25 30

Ile His Thr Ala NH2(SEQ ID NO：68)

物理数据：m.p.138-185oC[a]D25-50.17(c 0.14，H2O)

FAB(C174H295N55O53)：[M+H]+4005

AAA：Asx，2.2(2)；Glx，7.1(7)；Ser，1.7(2)；His，2.8(3)；Gly，1.0(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.1(2)；

Arg，3.1(3)；Val，1.1(1)；Ile，1.7(2)；Leu，7.1(7)；Lys，2.7(3).

化合物58：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAW-NH₂

(SEQ ID NO：72)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Arg Ser Ala Trp NH2(SEQ ID NO：72)

35

物理数据：m.p.158-163oC[a]D25-46.06(c 0.17，H2O)

FAB(C195H327N63O55)：[M+H]+4434.8

AAA：Asx，2.0(2)；Glx，5.5(6)；Ser，2.7(3)；His，3.1(3)；Gly，1.0(1)；Ala，1.8(2)；Arg，4.0(4)；

Thr，0.9(1)；Val，0.9(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.5(8)；Lys，3.9(4)；Trp，1.0(1).

化合物59：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAX-OH(SEQ ID NO：73)

(X＝Nal(2)＝3-(2-萘基)-L-A1a)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Arg Ser Ala 3-(2-萘基)-L-ala-OH (SEQ ID NO：73)

35

物理数据：m.p.156-162oC[a]D25-44.44(c 0.189，H2O)

FAB(C197H328N62O55)：[M+H]+4445.6

AAA：Asx，2.1(2)；Glx，5.5(6)；Ser，2.8(3)；His，2.9(3)；Gly，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，4.0(4)；

Thr，0.9(1)；Val，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.5(8)；Lys，4.2(4)；Nal，1.1(1).

化合物60：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTASAW-OH(SEQ ID NO：74)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala Ser Ala Trp OH(SEQ ID NO：74)

35

物理数据：m.p.159-164oC[a]D25-50.94(c 0.29，H2O)

FAB(C192H320N60O55)：[M+H]+4349.0

AAA：Asx，2.0(2)；Glx，5.6(6)；Ser，2.7(3)；His，3.2(3)；Gly，1.0(1)；Ala，3.1(3)；Arg，2.8(3)；

Thr，1.0(1)；Val，1.1(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.6(8)；Lys，4.0(4)；Trp，1.0(1).

化合物61：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEIRA-OH

(SEQ ID NO：75)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala Glu Ile Arg Ala OH(SEQ ID NO：75)

35

物理数据：m.p.155-210oC[a]D25-46.15(c 0.12，H2O)

FAB(C195H334N62O58)：[M+H]+4475.8

AAA：Asx，2.2(2)；Glx，6.9(7)；Ser，1.7(2)；His，3.2(3)；Gly，1.1(1)；Ala，3.1(3)；Arg，4.0(4)；

Thr，0.9(1)；Val，1.1(1)；Ile，1.9(2)；Leu，8.1(8)；Lys，4.1(4).

化合物62：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEIR-OH(SEQ ID NO：76)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala Glu Ile Arg OH(SEQ ID NO：76)

35

物理数据：m.p.186-218oC[a]D25-52.73(c 0.265，H2O)

FAB(C192H329N61O57)：[M+H]+4404.4

AAA：Asx，2.0(2)；Glx，6.6(7)；Ser，1.9(2)；His，3.4(3)；Gly，1.1(1)；Ala，2.0(2)；Arg，3.8(4)；

Thr，1.0(1)；Val，1.1(1)；Ile，1.7(2)；Leu，7.9(8)；Lys，4.0(4).

化合物63：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEI-OH(SEQ ID NO：77)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala Glu Ile OH(SEQ ID NO：77)

35

物理数据：m.p.169-205oC[a]D25-50.78(c 0.51，H2O)

FAB(C186H317N57O56)：[M+H]+4248.0

AAA：Asx，2.2(2)；Glx，6.8(7)；Ser，1.8(2)；His，3.3(3)；Gly，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，3.0(3)；

Thr，1.0(1)；Val，1.0(1)；Ile，1.8(2)；Leu，7.8(8)；Lys，3.6(4).

化合物64：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAE-OH(SEQ ID NO：78)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr Ala Glu OH(SEQ ID NO：78)

35

物理数据：m.p.199-205oC[a]D25-52.47(c 0.41，H2O)

FAB(C180H306N56O55)：[M+H]+4135.0

AAA：Asx，2.0(2)；Glx，6.6(7)；Ser，1.9(2)；His，3.3(3)；Gly，1.1(1)；Ala，2.0(2)；Arg，2.9(3)；

Thr，1.0(1)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.2(8)；Lys，3.8(4).

化合物66：

SEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH₂(SEQ ID NO：80)

Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln Asp

1 5 10 15

Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His

20 25 30

Thr Ala NH2(SEQ ID NO：80)

物理数据：m.p.134.2oC[a]D25-48.12(c 0.36，H2O)

FAB(C167H286N54O49)：[M+H]+3834.4

AAA：Asx，2.0(2)；Glx，5.7(6)；Ser，1.7(2)；His，2.9(3)；Gly，1.0(1)；Thr，0.9(1)；Ala，1.0(1)；

Arg，2.8(3)；Ile，0.9(1)；Leu，7.4(8)；Lys，4.3(4).

化合物67：

LLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH₂(SEQ ID NO：81)

Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln Asp Leu Arg Arg Arg

1 5 10 15

Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO：81)

20 25

物理数据：m.p.128.5-184.5oC[a]D25-6.53(c0.69，MeOH)

FAB(C148H259N47O41)：[M+H]+3353

AAA：Asx，2.0(2)；Glx，4.1(4)；Ser，0.9(1)；His，2.1(2)；Gly，1.0(1)；Thr，0.9(1)；Ala，1.0(1)；

Arg，3.0(3)；Ile，1.0(1)；Leu，8.1(8)；Lys，4.2(4).

化合物68：

LHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH₂(SEQ ID NO：82)

Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu

1 5 10 15

Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO：82)

20 25

物理数据：m.p.165-210oC[a]D25-36.05(c 0.12，H2O)

FAB(C142H248N46O40)：[M+H]+3239.0

AAA：Asx，2.0(2)；Glx，3.9(4)；Ser，0.9(1)；His，1.9(2)；Gly，1.0(1)；Thr，1.0(1)；Ala，1.0(1)；

Arg，2.9(3)；Ile，0.9(1)；Leu，6.8(7)；Lys，4.2(4).

化合物69：

SEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHAGRRTRSAW-OH

(SEQ ID NO：83)

Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile Gln Asp

1 5 10 15

Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg Leu His

20 25 30

Leu His Arg Gly Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp OH (SEQ ID NO：83)

35 40

物理数据：m.p.150-210oC[a]D25-18.0(c 0.64，H2O)

FAB(C208H35 1N79O60)：[M+H]+4918.6

AAA：Asx，2.2(2)；Glx，6.2(6)；Ser，2.8(3)；His，3.1(3)；Gly，2.2(2)；Thr，2.2(2)；Ala，2.2(2)；

Arg，10.4(10)；Ile，1.0(1)；Leu，8.0(8)；Trp，1.1(1).

化合物70：

LLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHAGRRTRSAW-OH(SEQ ID NO：84)

Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile Gln Asp Leu Arg Arg Arg

1 5 10 15

Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg Leu His Leu His Arg Gly

20 25 30

Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp OH(SEQ ID NO：84)

35

物理数据：m.p.150-210oC[a]D25-41.70(c 0.36，H2O)

FAB(C189H324N72O52)：[M+H]+4437.14

AAA：Asx，2.1(2)；Glx，4.1(4)；Ser，1.9(2)；His，2.0(2)；Gly，2.1(2)；Thr，2.0(2)；Ala，2.1(2)；

Arg，9.7(10)；Ile，0.9(1)；Leu，7.4(8).

如前所述合成侧链环化的类似物(化合物57)，但13位和37位分别是N^α-Boc-N^ε-Fmoc-Lys和N^α-Boc-N^γ-Fmoc-Asp。完成Boc氨基酸的合成后，室温下用20％的吡啶DMF溶液处理树脂30分钟。过滤出树脂用DMF、MeOH和CH₂Cl₂洗涤。将树脂(1.1g)重悬在含250mg PyBOP的10ml DMF中。用DIEA调节pH至8至9，搅拌树脂1小时。滤出树脂用DMF和二氯甲烷洗涤，然后重悬在DMF中。用125mg PyBOP重复偶合。过滤出树脂用DMF、MeOH和CH₂Cl₂洗涤并干燥。然后如前所述用HF处理树脂，并纯化肽。

化合物57：

物理数据：m.p.142.5-163.5oC[a]D25-34.31(c0.17，H2O)

FAB(C175H298N56O50)：[M+H]+3986.4

AAA：Asx，1.9(2)；Glx，5.9(6)；Ser，1.8(2)；His，3.2(3)；Gly，1.1(1)；Ala，2.0(2)；Arg，3.0(3)；

Thr，1.0(1)；Val，1.1(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.0(8)；Lys，4.0(4).

实施例II

按照实施例I的过程制备和纯化[Met³⁴，Ala³⁵]化合物 1，AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEK-LLEKLHTMA-NH₂，(SEQ ID NO：25)。如下所述将此肽转化为高丝氨酸内酯。将纯化后的肽(160mg)溶解在44％甲酸(4ml)中。在0℃，将该溶液与溴化氰(700mg)和苯酚(1.6mg)在44％甲酸(4ml)预先混合而成的溶液合并。溶液在0℃搅拌2小时，再在室温下搅拌2小时。用HPLC(Vydac^_C-18,300，4.6×250mm，流速1.2ml/min，乙腈在0.1％TFA中形成的25-45％梯度，洗脱10分钟)监测产物的生成。反应在4小时内进行完全。取一半样品浓缩并用制备RP-HPLC(Vydac^_C-18，乙腈在0.1％TFA中形成的25-45％梯度)纯化。汇集高丝氨酸内酯肽流份，冷冻干燥后得28mg白色固体，纯度高于95％，即化合物4。

化合物4

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTX(X＝hSerlac，SEQ ID NO：9)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr hSerlac(SEQ ID NO：9)

物理数据：

m.p. 138-142℃ [a]D25-50.66°(c 0.1，H2O)

FAB(C176H299N55O52)：[M+H]+4017.61

AAA：Asp，2.1(2)；Glu，6.1(6)；Ser，1.8(2)；His，3.0(3)；Thi，1.1(1)；Ala，1.1(1)；Arg，2.7(3)；

Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.2(8)；Lys，3.8(4)；Gly 1.09(1)；hSer，1.09(1).

同样，按照以上过程制备65化合物。

化合物65

AVSEIQFX₁HN KGKHLSSX₁ER VEWLRKKLQD VHNX₂(SEQ ID NO：79)

(X₁＝L-正亮氨酸；X₂＝高丝氨酸内酯)

Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Nle His Asn Lys Gly Lys His Leu

1 5 10 15

Ser Ser Nle Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Asn hSerlac (SEQ ID NO：79)

物理数据：m.p.166-176oC a]D25-52.22(c 0.25，H2O)

FAB(C180H288N54O50)：[M+H]+4008.6

AAA：Asx，3.1(3)；Glx，4.8(5)；Ser，2.9(3)；His，2.9(3)；Gly，1.1(1)；Ala，1.1(1)；Arg，2.0(2)；

Val，2.7(3)；Phe，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu+Nle 5.9(4+2)；Lys，2.8(3).

实施例III

为了制备高丝氨酸酰胺，将粗制高丝氨酸内酯类似物，化合物4浓缩并用25m1的NH₃甲醇饱和溶液处理。该溶液在0℃搅拌2小时，再在室温下搅拌16小时。用HPLC(Vydac^_C-18，300A，4.6×250mm，流速1.2ml/min，乙腈在0.1％TFA中形成的25-45％梯度，洗脱10分钟)监测反应。反应在18小时内进行完全。浓缩溶液并用制备RP-HPLC(Vydac^_C-18，乙腈在0.1％TFA中形成的25-45％梯度)纯化。汇集高丝氨酸酰胺流份，冷冻干燥后得30mg白色固体，纯度高于98％，即化合物3。

化合物3

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTX-NH₂

(X＝hSer，SEQ ID NO：8)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr hSer NH2(SEQ ID NO：8).

物理数据：

m.p. 138-142℃ [a]D25-45.97°(c 0.25，H2O)

FAB(C176H302N56O52)：[M+H]+4033.9

AAA：Asp，2.1(2)；Glu，6.1(6)；Ser，1.6(2)；His，2.8(3)；Gly，0.97(1)；hSer，0.97(1)；Thi，1.0(1)；

Ala，1.0(1)；Arg，2.9(3)；Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.6(8)；Lys，3.9(4).

同样，按照以上过程制备化合物22，23和28。

化合物22

AVSEIQFLHN LGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNX-NH₂(SEQ ID NO：36)

(X＝高丝氨酸)

Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu

1 5 10 15

Ser Ser Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Asn hSer NH2(SEQ ID NO：36)

物理数据：m.p. 69.4-128oC [a]D25-43.93(c 0.15，H2O)

FAB(C179H302N56O49)：[M+H]+4022.9

AAA：Asx，2.0(2)；Glx，4.9(5)；Ser，2.6(3)；His，2.8(3)；Gly，1.0(1)；Ala，1.0(1)；Arg，3.0(3)；

Val，1.0(1)；Phe，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.8(9)；Lys，3.4(3)；

化合物23

AVSEIQFLHN KGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNX-NH₂(SEQ ID NO：3 7)

(X＝高丝氨酸)

Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Leu His Asn Lys Gly Lys His Leu

1 5 10 15

Ser Ser Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Asn hSer NH2 (SEQ ID NO：37)

物理数据：m.p. 87.1-142.1oC [a]D25-52.14(c 0.41，H2O)

FAB(C179H303N57O49)：[M+H]+4038

AAA：Asx，2.1(2)；Glx，4.9(5)；Ser，2.7(3)；His，2.8(3)；Gly，1.0(1)；hSer，1.0(1)；Ala，1.0(1)；

Arg，3.0(3)；Val，1.1(1)；Phe，0.9(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.9(8)；Lys，3.7(4).

Compound 28：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRX-NH₂

(SEQ ID NO：42)

(X＝高丝氨酸)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg

20 25 30

Leu His Thr Ala Gly Arg Arg hSer NH2 (SEQ ID NO：42)

35

物理数据：m.p. 80oC[a] D25-48.64(c 0.09，H2O)

FAB(C193H334N70O56)：[M+H]+4530.0

AAA：Asx，2.2(2)；Glx，6.1(6)；Ser，1.7(2)；His，3.0(3)；Gly，1.9(2)；hSer，1.0(1)；Thr，1.0(1)；

Ala，2.1(2)；Arg，7.2(7)；Val，0.8(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.4(8)；Lys，2.1(2).

按照相似于制备高丝氨酸内酯的方法，将其溶解在含有过量烷基胺的DMF中，由此制备高丝氨酸烷基酰胺。在室温下搅拌数天(用分析HPLC监测反应)，将混合物蒸发干燥，用制备HPLC纯化肽。代表性高丝氨酸内酯是化合物55和56。

化合物55：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-NHCH₂CH₃

(SEQ ID NO：69)

(X＝高丝氨酸)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr hSer NHCH2CH3(SEQ ID NO：69)

物理数据：m.p.(未测定) [a]D25(未测定)

FAB(C178H306N56O52)：[M+H]+4063.0

AAA：Asx，2.1(2)；Glx，5.8(6)；Ser，1.7(2)；His，3.1(3)；Gly，0.9(1)；Thr，1.0(1)；Ala，

0.9(1)；Arg，3.0(3)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.4(8)；Lys，3.7(4)；hSer，0.9(1).

化合物56：

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-NHCH₂CH₂C₆H₅

(SEQ ID NO：70)

(X＝高丝氨酸)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr hSer NHCH2CH2C6H5(SEQ ID NO：70)

物理数据：m.p.(未测定) [a]D25(未测定)

FAB(C184H310N56O52)：[M+H]+ 4138.8

AAA：Asx，2.0(2)；Glx，5.9(6)；Ser，1.7(2)；His，2.9(3)；Gly，0.9(1)；Thr，1.0(1)；Ala，0.9(1)；

Arg，3.0(3)；Val，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.0(8)；Lys，4.1(4)；hSer，0.9(1).

实施例IV

将N^α-Boc-N^γ-Fmoc-L-2，4-二氨基丁酸与Merrifild树脂连接(DMF，50℃，48小时)，将其代替实施例1中的Boc-Ala树脂用于固相合成中。合成完毕后，肽用20％吡啶DMF溶液在室温下处理30分钟以去除侧链的Fmoc保护基。被保护的肽自动环化成内酰胺从而与树脂分离。从树脂中过滤出溶液并在真空中蒸发成油状。残留物如实施例I中所述用液态HF处理，生成粗制去保护肽。如实施例I所述处理和纯化这些肽。

化合物49

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX(SEQ ID NO：63)

(X＝L-2，4-二氨基丁内酰胺)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr L-2，4-二氨基丁内酰胺(SEQ ID NO：63)

物理数据：m.p. 161-181oC [a]D25-48.38(c 0.25，H2O)

FAB(C176H300N56O51)：[M+H]+ 4016.8

AAA：Asx，2.1(2)；Glx，6.3(6)；Ser，1.7(2)；His，3.3(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.1(2)；

Arg，2.9(3)；Val，0.9(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.0(8)；Lys，3.8(4).

实施例V

实施例II制备的高丝氨酸内酯类似物水溶液用猪肝酯酶(Sigma ChemicalCompany，St.Louis，MO)处理。用HPLC监测内酯水解成C末端高丝氨酸的反应。判断水解完全后，如实施例I所述用制备HPLC纯化产物。

化合物37

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRRRELLEKLLEK LHTX-OH(SEQ ID NO：51)

(X＝高丝氨酸)

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr hSer OH(SEQ ID NO：51)

物理数据：m.p.(未测定)[a]D25(未测定)

FAB(C176H301N55O53)：[M+H]+4035.1

AAA：Asx，2.1(2)；Glx，5.9(6)；Ser，2.0(2)；His，3.1(3)；Gly，0.8(1)；hSer，0.8(1)；Thr，1.0(1)；

Ala，1.0(1)；Arg，3.0(3)；Val，1.3(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.1(8)；Lys，3.8(4).

实施例VI

按照实施例I合成0.35mmol被保护肽-树脂BocAVS(Bzl)E(oBz)H(Bom)QLLHD(oBzl)R(Ts)GR(Ts)S(Bzl)IQD(OBz)-LR(Ts)R(Ts)E(OBz)LLE(OBzl)R(Ts)LLK(Fmoc)R(Ts)LH(Bom)T(Bzl)A-O-PAM。所有的N^α基团都用叔丁氧基羰基(Boc)保护；且表明了侧链保护基。在完成全合成后，用20％吡啶的二甲酰胺(DMF)溶液50ml在室温下处理肽树脂30分钟以去除赖氨酸上的芴基甲氧基羰基(Fmoc)保护基。依次用DMF、MeOH、CH₂C1₂洗涤树脂并干燥后得1.6g部分保护的肽。取0.8g(0.175mmol)部分保护的肽，用0.44g(0.3mmol)甲氧基二(亚乙氧基)乙酸(PEG(2)CH₂COOH)在0.16g(0.3mmol)六氟磷酸苯并三唑氧-三(吡咯烷基)磷鎓(PyBop)和0.067g(0.525mmol)二异丙基乙基胺(DIEA)存在下，在20ml DFM中，于室温下乙酰化赖氨酸5小时。5小时后，过滤出树脂并依次用DMF、MeOH、CH₂Cl₂洗涤。乙酰化步骤重复两次，直至树脂的茚三酮测试结果为阴性。如实施例I所述，将最终的肽与树脂分离同时去除侧链保护基，并纯化；由此获得100mg化合物19。

化合物19

AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRLHTA-OH(SEQ ID NO：18)

CH₃O(CH₂CH₂O)₂CH₂C＝O

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu

20 25

Lys(COCH₂PEG2)Arg Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO：18)

30

物理数据：

m.p. 145-195C [a]_D ²⁵-44.60°(c 0.2，H₂O)

FAB(C₁₈₃H₃₁₆N₆₄O₅₄)：[M+H]⁺4276.2

AAA：Asp，2.1(2)；Glu，5.0(5)；Ser，1.6(2)；His，2.9(3)；Gly，0.9(1)；Thr，

1.9(2)；Arg，7.1(7)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.0(8)；Lys，0.9(1).

实施例VII

按照实施例IV，合成、分离和纯化肽，所不同的是用2-甲氧基聚(亚乙基氧)乙酸(PEG(5000)CH₂CO₂H)作为乙酰化剂。0.8g(0.175mmol)部分被保护的肽生成300mg纯化合物20。

化合物20

AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRLHTA-OH(SEQ ID NO：19)

CH₃O(CH₂CH₂O)₁₁₀CH₂C＝O

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu

20 25

Lys(COCH2PEG5000)Arg Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO：19).

30

物理数据：

m.p.105 C [a]D25-22.95°(c 0.11，50％aq.HOAc)

AAA：Asp，2.0(2)；Glu，4.8(5)；Ser，1.6(2)；His，2.6(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.1(1)；Arg，7.3(7)；

Val，0.8(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.3(8)；Lys，1.1(1)；Ala，1.8(2).

实施例VIII

hPTHrp(1-34)类似物基因的合成

设计一段编码hPTHrp(1-34)类似物即化合物4(SEQ ID NO：9)的合成基因，其序列和限制性酶切位点如图1所示。用DNA合成仪(Milligen/Biosearch)，用Sinha等在《核酸研究》(Nucleic Acid Research)21，4539-4557(1984)上所述的方法合成要求的寡脱氧核苷酸，去保护后，利用15％制备聚丙烯酰胺凝胶上的凝胶电泳来纯化粗制寡核苷酸。利用紫外光(UV)定位寡核苷酸，将其从凝胶中切出，在WatersC18 Sep-pak^_柱上脱盐，然后冷冻干燥。

在Perkin-Elmer Cetus热循环仪上进行25轮聚合酶链反应(PCR)扩增：94℃1分钟，50℃2分钟，72℃3分钟，使用“GeneAmp”扩增试剂盒(Perkin-ElmerCetus)的试剂包括Taq聚合酶。

制备两段重迭寡核苷酸作为hPTH(1-34)类似物基因的模板DNA序列，分别为一段88聚体(2μg)的PTH3，(SEQ ID NO：31)

CCTCTAGATC TCCGCGGCGC TAGC ATG GCT GTT TCT GAA CAT CAG 45

Met Ala Val Ser Glu His Gln

1 5

CTG CTT CAT GAC AAA GGT AAA TCG ATT CAA GAT CTG AGA CGT C 88

Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln Asp Leu Arg Arg

10 15 20

和一段反义链，90聚体(2μg)的PTH4，(SEQ ID NO：32)：

CCTCGAAGCT TATGCATCAT TATCTAGA CAT AGT ATG CAG CTT TTC 46

Met Thr His Leu Lys Glu

30

AAG CAG TTT CTC CAG CAG CTC GCG ACG TCT CAG ATC TTG AAT 88

Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu Arg Arg Arg Leu Asp Gln Ile

25 20 15

CG 90，

使用以下两段侧翼引物，PYHPCR1：CCTCTAGATC TCCGCGGCGC TAG(SEQ ID NO：33)和PYHPCR2：CCTCGAAGCT TATGCATCAT TATC(SEQ IDNO：34)，用PCR扩增完整的基因。在4％NuSieve^_琼脂糖凝胶上利用凝胶电泳纯化扩增后的DNA产物。从凝胶上切取包含长约150碱基对的合成hPTHrp(1-34)类似物基因的条带，由Elu-Quik^_玻璃凝胶DNA萃取(Schleicher & Schuell，Keene，NH)分离得到约200ng DNA。

实施例IX

hPTHrp(1-34)类似物基因的分子克隆

为了亚克隆实施例VI的hPTHrp(1-34)类似物基因，分离200ng扩增的DNA并用限制性酶HindIII和SacII切割。如图2所示，将DNA与2μg事先用HindIII和SacII切割的TrpLE 18 Prot(Ile³，Pro⁵)质粒连接。

形成的质粒TrpLE 18 hPTHrp(1-34)1包含一份拷贝的hPTHrp(1-34)类似物基因，然后将其转化到感受态的大肠杆菌HB101细胞(CLONTECH，Palo Alto，CA)中。用PCR证实转化子中的插入。选取转化细胞的菌落，在200μl水中煮沸5分钟；取2μl用插入片段两侧的引物进行PCR。在1％琼脂糖凝胶上检测PCR产物，证实存在一份拷贝的hPTHrp(1-34)类似物基因插入片段。在自动DNA测序仪(Applied Biosystems 373型，Foster City，CA)上，使用供应商的染料脱氧终止剂试剂盒进行DNA测序来检验TrpLE 18 hPTHrp(1-34)1构建物。

实施例X

包含hPTHrp(1-34)类似物基因多拷贝的Trp LE 18载体的构建

单一的Nhe I和Xba I限制性位点靠近hPTHrp(1-34)类似物基因的起点和终点。识别不同序列但产生相同单链粘端的这两个位点允许在Trp LE 18载体内构建hPTHrp(1-34)类似物基因的多份拷贝。

图3中表示了构建串联形式的重复hPTHrp(1-34)序列的方法。在分离反应中，用Bam HI+Nhe I和Xba I+Bam HI切割包含单拷贝基因的TrpLE 18hPTHrp(1-34)1构建物。从两份消化产物中各可分离约300ng包含hPTHrp(1-34)类似物基因的片段。将两种片段混合并连接，形成TrpLE 18 hPTHrp(1-4)2质粒。用该质粒转化感受态的大肠杆菌HB101细胞。在1％琼脂糖凝胶上测定转化后PCR产物的大小，用以确定存在2二拷贝的hPTHrp(1-34)基因插入片段。然后由DNA测序检验含有两份基因拷贝的TrpLE 18 hPTHrp(1-34)2。两份hPTHrp(1-34)基因的正确融合消除了连接处的Nhe I和Xba I位点。由此使得留下的Nhe I和Xba I位点仅位于串联基因的两侧。

如图4所示，重复以上步骤，构建出包含hPTHrp(1-34)基因4份拷贝的TrpLE18 hPTHrp(1-34)4。DNA测序证实TrpLE 18 hPTHrp(1-34)4的序列正确。

实施例XI

TrpLE 18 hPTHrp(1-34)4的表达和纯化

TrpLE 18 hPTHrp(1-34)4的引入

将包含TrpLE 18 hPTHrp(1-34)4质粒的大肠杆菌细胞接种在50ml包含50μg/ml氨苄青霉素和100μg/ml色氨酸的LB培养基中(J.H.Miller，“分子遗传学实验”(“Experiments in Molecular Genetics”)p431(1972)，在此参考)，并在37℃通宵剧烈振荡培养，达到A₅₅₀约6。用20ml起始培养物接种入37℃预热的2升LB培养基中，生长至A₅₅₀约0.06。然后，加入10mg/ml吲哚丙烯酸(IAA)溶液2ml，将培养物剧烈振荡培养至A₅₅₀约0.6至0.8。在良好的通气条件下继续培养约16小时，直至最终A₅₅₀约6(通常在4至10之间)。离心浓缩细胞后重悬在500ml 50mM的Tris-HCl，pH7.5，0.1mM EDTA缓冲溶液(Tris缓冲液)中。

在Heat Systems-Ultrasoniac，Inc.220F型超声发生仪(配有3/4”天线)上超声处理悬浮液，以全功率的50％操作以免过热。

为了确定引入的程度，利用SDS-PAGE检测完整的细胞。由TrpLE 18hPTHrp(1-34)4构建物产生的基因产物呈约17,000预计分子量的主要条带。该产物占全部细胞蛋白质的10％。

融合蛋白的分离

细胞裂解液以约3600×g离心15分钟以沉淀TrpLE 18 hPTHrp(1-34)4融合蛋白；弃去上清液。将沉淀重悬在200ml Tris缓冲液中。(通常为40至80A₅₅₀/ml)。

实施例XIII

融合蛋白的加工和高丝氨酸内酯hPTHrp(1-34)肽的纯化

用CNBr切除hPTHrp(1-34)多聚体融合蛋白侧面的甲硫氨酸残基，释放出要求的高丝氨酸hPTHrp(1-34)多肽，然后如下进行纯化。

融合蛋白的CNBr处理

温和搅拌，将洗涤后的TrpLE 18 hPTHrp(1-34)4融合蛋白重悬于60ml 70％甲酸(约20mg/m1总蛋白；通常将1000 A₅₅₀单位细胞的产物溶于3ml中)。加入数滴辛醇，在溶液中通20分钟氮气，然后加入5.5g CNBr。该反应在25℃进行6小时，然后将等体积的50∶50 MeOH∶H₂O与样品混合，然后旋转蒸发将其去除。该过程重复2至4次，基本去除甲酸和CNBr。然后将样品蒸发至干，重新溶解在20ml水中，冷冻干燥保存。

高丝氨酸内酯hPTHrp(1-34)的纯化

用50mM的KH₂PO₄ pH6.5透析CNBr切割后的上清液，期间多次更换透析液。在透析过程中，将pH维持在6.5。透析后，高速离心去除沉淀。用Gelman 0.45μ过滤装置(Acrodisc 4184)澄清上清液。

阳离子交换色谱

利用Bio-Gel TSK-SP-5PW HPLC柱(21.5×150mm)上的阳离子交换色谱进行最初的纯化。8ml/min流速，产量约12mg高度纯化的高丝氨酸内酯hPTHrp(1-34)肽的色谱条件为：

1.在50mM KH₂PO₄，pH6.5中进行柱平衡

2.上样10ml澄清的上清液(约1.5L培养液或2.4g内含物)。

3.用含有50mM NaCl的50mM KH₂PO₄，pH6.5洗柱，直至基线稳定。

4.用含有90mM NaCl的50mM KH₂PO₄，pH6.5洗脱，收集流份约45分钟，

5.用C18 HPLC检测90mM NaCl流份的高丝氨酸内酯hPTHrp(1-34)浓度，然后汇集流份并保存。

反相HPLC色谱

将反相Poros R/H 4.6×100mm柱(Perseptive Biosystems，Cambridge，MA)用于最终的纯化步骤。色谱条件如下：

移动相A：0.1％三氟乙酸(TFA)/水

B：0.1％三氟乙酸(TFA)/CH₃CN

时间流速％B

0min 4ml/min 15

5.0min 4ml/min 40

5.2min 4ml/min 100

6.8min 4ml/min 100

7.0min 4ml/min 15

高丝氨酸内酯hPTHrp(1-34)即化合物4的滞留时间约2.943分钟。经质谱测定，纯化后的肽纯度约98％。

实施例XIII

通常根据Gunness-Hey和Hock在(Metab.Bone Dis)5：177-181(1984)中所示的方法，在切除了卵巢的大鼠中评价本发明化合物对骨质量的作用。

使成年Sprague-Dawley雌性大鼠适应环境，按重量分组(n＝9、10或12)，进行双侧卵巢切除或对照手术。手术后起始给药17天并继续20天。试验化合物以2％大鼠血清/盐水载体每天一次皮下施用。

给药20天后，处死大鼠并切断右侧股骨，将股骨切去一半，再通过钻取小梁将远端半段股骨(DHF)分离成小梁骨(TB)和皮质骨(CB)。抽提钙，并用Calcette钙分析仪测定，表示为平均骨钙，单位为mg/DHF/100g体重。

用双样品t试验来比较0VX和对照组。用单边ANOVA(one-way ANOVA)比较OVX组，然后用Fisher LSD多重比较来比较各处理组和载体组。

卵巢切除造成严重的总体骨流失，主要是小梁骨流失。总骨钙比对照组低47至54％。

每日80μg/kg的bPTH(1-34)和hPTH(1-34)在统计学上显著提高治疗的OVX大鼠总骨钙，分别为53至95％和18至40％；然而在皮质骨钙中无显著增加。

每日80μg/kg给药本发明的化合物，提高总骨钙66至138％，小梁骨钙87至128％。与非治疗OVX对照相比，皮质骨钙、小梁厚度和骨体积也明显增加。

在该试验中，对以下化合物进行了测试：

化合物编号 n 小梁骨钙总骨钙

(测试次数) (相对OVX的提高％) (相对OVX的提高％)

化合物1

(SEQ ID NO：7) 6 101-128％ 88-138％

化合物2

(SEQ ID NO：6) 3 87-102％ 66-114％

化合物4

(SEQ ID NO：9) 3 - 88-114％

在类似的研究中，切除了卵巢的大鼠以每日40μg/kg的剂量用药5、10和20天，结果如下：

化合物编号 n 总骨钙

(测试次数) 用药天数(d) (相对OVX的提高％)

化合物1

(SEQ ID NO：7) 3 20 73-109％

化合物4

(SEQ ID NO：9) 5 20 79-105％

化合物4

(SEQ ID NO：9) 1 10 79％

化合物49

(SEQ ID NO：63) 1 10 93％

化合物4

(SEQ ID NO：9) 1 5 55％

化合物42

(SEQ ID NO：56) 1 5 60％

实施例XIV

成熟新西兰雌性白兔(Hazelton Rearch Products，Inc.，3.6kg，n＝9-11/处理组)在13个月内，每日注射载体或0.15mg/kg泼尼松。用双能X光吸收比色法(HologicQDR-11500W型，Hologic，Inc.，Waltham，MA)测定骨矿物质密度(BMD)，然后进行骨代谢的生物化学标记。9个月后，亚组在接受每日0.05，0.15或0.5ug/kg的化合物1(SEQ ID NO：7)皮下注射。2个月后，将剂量提高至每日0.5，3和10ug/kg。泼尼松处理导致迅速的早期骨流失(2-4个月)，BMD然后在以后的研究中保持稳定。腰椎A/P检查、外侧检查和远端股骨中观察到离基线12.4±1.3％、18.1±1.9％和11.8±2.5％的最终骨流失。在股骨骨干中观察到了较小的减少(7.8±2.2％)。较低的早期剂量并不改变以上情况。在持续使用泼尼松的动物中，10ug/kg化合物1使用30至60天后，使得各位置的BMD值恢复到与只用载体处理12个月的对照兔基本相同。泼尼松处理的兔其血清骨钙质(serum osteocalcin)比50±8ng/ml的基线值下降6.4倍，但在联用10ug/kg化合物1后恢复正常。

Claims

1.甲状旁腺素、甲状旁腺素相关肽的合成多肽类似物或其盐，或所述甲状旁腺素、甲状旁腺素相关肽的具有生理活性的截短形式同系物或类似物多肽或其盐，用于制备治疗由皮质甾类诱发的骨质减少的药物的用途，其中所述多肽的氨基酸残基22-31的序列选自SEQ ID N0：85、86、26、27、28、29和30。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物包含0.002-10μg多肽/kg病人体重/天的所述多肽。

3.根据权利要求1所述的用途，所述药物呈单位剂型的形式，其中包含1-1000μg所述多肽和药学上认可的载体。