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CN115814077A - 抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其使用方法 - Google Patents

抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其使用方法 Download PDF

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CN115814077A CN202211417149.0A CN202211417149A CN115814077A CN 115814077 A CN115814077 A CN 115814077A CN 202211417149 A CN202211417149 A CN 202211417149A CN 115814077 A CN115814077 A CN 115814077A
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Abstract

本发明涉及特异性地结合原肌生长抑制素和/或潜伏肌生长抑制素的抗体及其方法和用途。

Description

抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其使用方法
本申请是申请日为2017年1月6日和发明名称为“抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其使用方法”的201780015496.1号中国发明专利申请的分案申请。
相关申请
本申请要求2016年1月8日提交的U.S.临时专利申请No.62/276,698、2016年4月27日提交的U.S.临时专利申请No.62/328,597、2016年5月9日提交的U.S.临时专利申请No.62/333,816、2016年5月9日提交的U.S.临时专利申请No.62/333,810、2016年10月26日提交的U.S.临时专利申请No.62/413,278和2016年9月15日提交的国际申请No.PCT/US2016/052014的优先权。各申请的全部内容通过引用并入本文中。
序列表
本申请包含以ASCII格式电子提交并由此通过引用全文并入的序列表。2017年1月6日生成的所述ASCII拷贝名称为127036-00320_SL.txt且大小为108,683字节。
背景技术
肌生长抑制素，也称为GDF8，是TGFβ超家族的成员且属于包括两个成员的亚家族：肌生长抑制素和GDF11。如同TGFβ超家族的其它成员，肌生长抑制素和GDF11最初都表达为无活性的前体多肽(分别称为原肌生长抑制素和proGDF11)。
肌生长抑制素是骨骼肌质量的公知的负调节剂且通过两个单独的蛋白酶切割步骤从自体抑制性的N-末端前结构域释放。导致“成熟”肌生长抑制素从其非活性复合物局部释放的这些切割事件可以称为超细胞激活。在激活后，成熟肌生长抑制素通过结合I和II型细胞表面受体(Alk4/5和ActRIIB)的复合体发信号，其下游信号传导引起肌萎缩。
存在着肌生长抑制素作为用于治疗肌肉萎缩的靶标的兴趣。靶向ActRIIB信号传导途径的多种治疗剂正在完成肌肉萎缩病症的早期和中期临床试验，包括少肌症、肌肉营养不良、恶病质和髋关节置换/髋骨折。但是到目前为止，主要临床策略集中于直接阻断成熟肌生长抑制素和细胞表面受体之间的相互作用，且几种治疗程序由于缺乏特异性(导致不可接受的毒性)和/或功效而中断。因此，存在着对于改进的抗-肌生长抑制素治疗剂的需要。
发明内容
本发明包括以下认识：阻断肌生长抑制素的激活步骤而非靶向早已激活的肌生长抑制素可以提供在体内选择性地抑制肌生长抑制素信号传导的有利模式。因此，本发明可以具有在其中肌生长抑制素信号传导的体内选择性降低有益的任何病症中作为治疗剂的用途。更具体地，本发明包括肌生长抑制素激活的特异性抑制可以不仅实现肌肉质量增加而且实现增强的肌肉功能，以及防止肌萎缩和代谢失调的令人惊异的发现。出人意料地，有益的治疗效果也可以在具有神经元和靶组织如靶肌肉之间受损的而非完全丧失的信号传导的受试者中甚至在病变下方获得。据发明人对本公开的最好理解，这是首次通过抑制肌生长抑制素信号传导在体内实现这种证明，尽管存在着自从在大约20年前发现肌生长抑制素，已经开发了多种用于抑制肌生长抑制素的拮抗剂的事实。因此，在一个方面中，本发明还包括用于通过使用肌生长抑制素抑制剂治疗涉及运动神经元和其靶肌肉之间受损的信号传导的病症的方法，以在受试者中(包括在病变下方)实现治疗益处。
因此，在一个方面中，本文公开了用于在受试者中抑制肌生长抑制素激活的方法，该方法包括以下步骤：以在受试者中有效引起以下两种或更多种的量向受试者施用包含特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素并阻断成熟肌生长抑制素的释放的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的组合物：(a)受试者中肌肉组织的质量和/或功能的提高；(b)受试者的代谢速率的提高；(c)受试者的胰岛素敏感性的提高；(d)受试者中棕色脂肪组织水平的提高；(e)受试者中米色脂肪组织水平的提高；(f)受试者中白色脂肪组织水平的降低；(g)受试者中内脏脂肪组织水平的降低；(h)受试者中脂肪组织-肌肉组织的比率的降低；(i)受试者中棕色脂肪组织、米色脂肪组织或肌肉组织的葡萄糖摄取的提高；(j)白色脂肪组织或肝组织的葡萄糖摄取的降低；(k)受试者中肌肉蛋白质分解代谢和/或肌肉氨基酸释放的降低；(l)受试者中胰岛素依赖的血糖控制的提高；(m)受试者中肌肉内脂肪浸润的降低；(n)标准化生活质量测试评分的临床上有意义的提高；(o)受试者中肌肉损失或肌萎缩的预防；和/或(p)受试者中与肌肉功能障碍相关的代谢失调的发生的预防，其中所述受试者是人受试者，例如，从降低的肌生长抑制素信号传导受益的人受试者。
在一个实施方式中，该方法进一步包括选择患有肌肉病症或障碍的受试者的步骤。在另一个实施方式中，该方法进一步包括选择患有代谢障碍或处于发生代谢障碍的风险中的受试者的步骤。
在一个实施方式中，施用有效量的特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素和阻断成熟肌生长抑制素的激活的肌生长抑制素抑制剂，例如，抗体或其抗原结合片段，引起受试者的血清中潜伏肌生长抑制素水平的提高，如与对照相比的。
在一个实施方式中，受试者具有选自肌病、肌萎缩、肌营养不良和神经损伤的肌肉病症。在一个实施方式中，肌萎缩与运动神经元的缺陷相关。在一个实施方式中，所述缺陷包括遗传突变。在另一个实施方式中，肌萎缩与脊髓性肌萎缩(SMA)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)或重症肌无力相关。在一个实施方式中，神经损伤包括使肌肉受神经支配的神经元的部分去神经支配或者运动神经元和靶肌肉之间受损的信号传导。在一个实施方式中，神经损伤是SCI。在另一个实施方式中，SCI是部分/不完全SCI。SCI中病变的位置可以是沿脊髓的任何地方。在一个实施方式中，SCI包括i)T1-T6；ii)T7-L5；iii)C6-C7；iv)C5-C6；或v)C3-C8之间的病变。在一个实施方式中，受试者处于SCI的急性期；SCI的亚急性期；或SCI的慢性期。在一个实施方式中，受试者具有与SCI相关的代谢障碍或处于发生与SCI相关的代谢障碍的风险中。在一个实施方式中，代谢障碍是或包括胰岛素抵抗、炎症、异常脂质代谢或肌肉内脂肪浸润的增加。在一个实施方式中，肌萎缩包括糖皮质激素诱导的肌萎缩。
在一个实施方式中，受试者患有选自I型糖尿病、II型糖尿病、肥胖症、代谢综合征/前驱糖尿病、心血管疾病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、脊髓损伤(SCI)、低代谢状态、双重糖尿病、库欣病和肥胖综合征的代谢疾病。
在一个实施方式中，所述受试者用第二疗法治疗。在一个实施方式中，第二疗法包括神经保护疗法。在另一个实施方式中，神经保护疗法包括干细胞疗法。在一些实施方式中，神经保护疗法是促进运动神经元的存活的药剂。在一些实施方式中，该药剂是奥利索西、利鲁唑或促甲状腺素释放激素。
在另一个实施方式中，第二疗法包括剪接校正疗法(splice-correctiontherapy)。在一个实施方式中，剪接校正疗法是运动神经元生存(SMN)校正剂。在一些实施方式中，SMN校正剂是增加受试者中功能性SMN蛋白质的表达的SMN2剪接校正剂。
在一些实施方式中，SMN2剪接校正剂是反义分子。在一些实施方式中，SMN2剪接校正剂是
Figure SMS_1
(Nusinersen)。在一些实施方式中，反义分子通过静脉内或鞘内注射施用。但是，可以使用其它合适的施用途径。在一些实施方式中，SMN2剪接校正剂是小分子。在一些实施方式中，SMN2剪接校正剂是RG7800(Roche)、RG7916(Roche)或LMI070(Novartis)。在一些实施方式中，小分子口服或通过另一合适的方法施用。
在另一方面中，本文公开了一种治疗或预防人受试者中与神经元和靶组织(例如，靶肌肉)之间受损的神经信号传导相关的疾病的方法，该方法包括选择患有与神经元和靶组织之间受损的神经信号传导相关的疾病的人受试者；和以有效治疗或预防所述疾病的量向人受试者施用包含特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素并阻断成熟肌生长抑制素的释放的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的组合物，由此治疗或预防人受试者中与受损的神经信号传导相关的疾病。
在一些实施方式中，靶组织表达肌生长抑制素(例如，肌生长抑制素前体和/或成熟肌生长抑制素)。在一个实施方式中，靶组织选自肌肉组织、脂肪组织、脑组织、肝组织和血管组织。在一个实施方式中，靶组织是肌肉。
在另一方面中，本文公开了一种用于治疗受试者中引起神经元和靶肌肉之间受损的信号传导而非信号传导的完全丧失的病变的方法。这样的方法包括以有效治疗受试者中位于病变之下的肌肉的量向受试者施用包含肌生长抑制素抑制剂(例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体)的组合物的步骤。在一些实施方式中，所述量是有效预防受试者中病变之下的肌肉损失或肌萎缩的量。在一些实施方式中，所述量是有效提高受试者中病变之下的肌肉质量和/或功能的量。
在一些实施方式中，病变与不完全性脊髓损伤相关。
在一个实施方式中，肌肉包含快速收缩肌肉纤维。在另一个实施方式中，位于病变之下的肌肉选自比目鱼肌、腓肠肌、二头肌和三头肌。在一个实施方式中，所述量有效提高受试者中病变之上的肌肉的质量和/或功能。在另一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂是在体内阻断、拮抗或抑制肌生长抑制素信号传导的药剂。在一些实施方式中，这样的药剂是抗体或其抗原结合部分、小分子或基因疗法。在一些实施方式中，所述抗体是在体内特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素和阻断成熟肌生长抑制素的释放的抗体。在一些实施方式中，抗体结合成熟肌生长抑制素。在一些实施方式中，抗体相对于成熟GDF11选择性地(例如，优先地)结合成熟肌生长抑制素。在一些实施方式中，抗体特异性结合成熟肌生长抑制素但不结合成熟GDF11。在一些实施方式中，抗体结合和/或阻断肌生长抑制素受体。
在一些实施方式中，病变是脊髓病变。在一个实施方式中，受试者具有不完全性脊髓损伤(SCI)。在一个实施方式中，不完全性SCI包括i)T1-T6；ii)T7-L5；iii)C6-C7；iv)C5-C6；或v)C3-C8之间的病变。
在一个实施方式中，所述量有效地治疗受试者中的代谢病症。在一个实施方式中，所述量在受试者中有效地引起：(a)受试者中肌肉组织的质量和/或功能的提高；(b)受试者的代谢速率的提高；(c)受试者的胰岛素敏感性的提高；(d)受试者中棕色脂肪组织水平的提高；(e)受试者中米色脂肪组织水平的提高；(f)受试者中白色脂肪组织水平的降低；(g)受试者中内脏脂肪组织水平的降低；(h)受试者中脂肪组织-肌肉组织的比率的降低；(i)受试者中棕色脂肪组织、米色脂肪组织或肌肉组织的葡萄糖摄取的提高；(j)白色脂肪组织或肝组织的葡萄糖摄取的降低；(k)受试者中肌肉蛋白质分解代谢和/或肌肉氨基酸释放的降低；(l)受试者中胰岛素依赖的血糖控制的提高；(m)受试者中肌肉内脂肪浸润的降低；(n)标准化生活质量测试评分的临床上有意义的改善；(o)受试者中肌肉损失或肌萎缩的预防；和/或(p)受试者中与肌肉功能障碍相关的代谢失调的发生的预防。
在另一方面中，本公开提供了一种治疗或预防人受试者中的代谢疾病的方法，该方法包括选择患有代谢疾病的人受试者；和向人受试者施用有效量的特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)，从而治疗或预防人受试者的代谢疾病。
在一个实施方式中，代谢疾病选自I型糖尿病、II型糖尿病、肥胖症、代谢综合征/前驱糖尿病、心血管疾病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、脊髓损伤(SCI)、低代谢状态、双重糖尿病、库欣病和肥胖综合征。在一个实施方式中，肥胖症是少肌性肥胖症。在一个实施方式中，低代谢状态选自与长期不活动相关的状态、与卧床相关的状态、与打石膏相关的状态、与中风相关的状态、与截肢相关的状态和手术后状态。在一个实施方式中，库欣病选自皮质类固醇诱导的库欣病和肿瘤诱导的库欣病。在一个实施方式中，肥胖综合征选自普瑞德威利(Prader Willi)综合征、与遗传障碍相关的肥胖综合征和与下丘脑障碍相关的肥胖综合征。
在另一方面中，本公开提供了一种治疗或预防人受试者中与神经元和靶组织之间受损的神经信号传导相关的疾病的方法，该方法包括选择患有与神经元和靶组织之间受损的神经信号传导相关的疾病的人受试者；和向人受试者施用有效量的特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)，从而治疗或预防人受试者中与受损的神经信号传导相关的疾病。在一些实施方式中，靶组织表达肌生长抑制素(例如，肌生长抑制素前体和/或成熟肌生长抑制素)。
在一个实施方式中，与神经元和靶组织之间受损的神经信号传导相关的疾病选自脊髓损伤(SCI)、重症肌无力(myasthelia gravis)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和脊髓性肌萎缩(SMA)。在一个实施方式中，与神经元和靶组织之间受损的神经信号传导相关的疾病是脊髓损伤(SCI)。在一个实施方式中，人受试者处于脊髓损伤(SCI)急性期。在一个实施方式中，人受试者处于脊髓损伤(SCI)亚急性期。在一个实施方式中，人受试者处于脊髓损伤(SCI)慢性期。
在一个方面中，本公开提供了一种用于促进受试者的纤维类型转换(fiber typeswitch)的方法。该方法包括以有效促进纤维类型转换的量向受试者施用包含特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素并阻断成熟肌生长抑制素的释放的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的组合物，从而促进受试者的纤维类型转换。
在另一方面中，本公开提供了一种在受试者中相对于I型或慢缩肌纤维优先增加II型或快缩肌纤维的方法。该方法包括以有效地相对于I型或慢缩肌纤维优先增加II型或快缩肌纤维的量向受试者施用包含特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素并阻断成熟肌生长抑制素的释放的抗体或其抗原结合片段的组合物，从而在受试者中相对于I型或慢缩肌纤维优先增加II型或快缩肌纤维。
在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高人受试者中肌肉组织的质量和/或功能。在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高人受试者中快缩肌肉组织的质量和/或功能。在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高人受试者中慢缩肌肉组织的质量和/或功能。
在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高人受试者的代谢速率。在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高人受试者的胰岛素敏感性。在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高人受试者的棕色脂肪组织水平。在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高人受试者的米色脂肪组织水平。在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用降低人受试者的白色脂肪组织水平。在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用降低人受试者的内脏脂肪组织水平。在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用降低人受试者的脂肪组织-肌肉组织的比率。
在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用增加人受试者中肌肉组织的葡萄糖摄取。在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用降低靶组织的葡萄糖摄取，其中靶组织选自白色脂肪组织、肝组织和血管组织。
在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用降低人受试者中的肌肉蛋白质分解代谢和/或肌肉氨基酸释放。在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高人受试者中的胰岛素依赖的血糖控制。
在另一方面中，本文公开了一种提高人受试者的代谢速率的方法，该方法包括选择会受益于代谢速率的提高的人受试者；和向人受试者施用有效量的特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)，从而提高人受试者的代谢速率。
在另一方面中，本文公开了一种提高人受试者的棕色脂肪组织水平的方法，该方法包括选择会受益于棕色脂肪组织水平的提高的人受试者；和向人受试者施用有效量的特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)，从而提高人受试者的棕色脂肪组织水平。
在另一方面中，本文公开了一种提高人受试者的米色脂肪组织水平的方法，该方法包括选择会受益于米色脂肪组织水平的提高的人受试者；和向人受试者施用有效量的特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)，从而提高人受试者的米色脂肪组织水平。
在另一方面中，本文公开了一种提高人受试者的胰岛素依赖的血糖控制的方法，该方法包括选择会受益于胰岛素依赖的血糖控制的提高的人受试者；和向人受试者施用有效量的特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)，从而提高人受试者的胰岛素依赖的血糖控制。
在另一方面中，本文公开了一种降低人受试者的肌肉蛋白质分解代谢和/或肌肉氨基酸释放的方法，该方法包括选择会受益于肌肉蛋白质分解代谢和/或肌肉氨基酸释放的降低的人受试者；和向人受试者施用有效量的特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)，从而降低人受试者的肌肉蛋白质分解代谢和/或肌肉氨基酸释放。
在另一方面中，本文公开了一种降低人受试者中靶组织的葡萄糖摄取的方法，该方法包括选择会受益于选自白色脂肪组织、肝组织和血管组织的靶组织的葡萄糖摄取降低的人受试者；和向人受试者施用有效量的特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)，从而降低人受试者中靶组织的葡萄糖摄取。
在一个实施方式中，靶组织包含巨噬细胞、平滑肌细胞和泡沫细胞(foam cell)。
在另一方面中，本文公开了一种治疗或预防人受试者的代谢疾病的方法，该方法包括选择患有代谢疾病的人受试者；和向人受试者施用在受试者中有效引起以下的两种或更多种的量的特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)：(a)人受试者中肌肉组织的质量和/或功能的提高；(b)人受试者中代谢速率的提高；(c)人受试者的胰岛素敏感性的提高；(d)人受试者中棕色脂肪组织水平的提高；(e)人受试者中米色脂肪组织水平的提高；(f)人受试者中白色脂肪组织水平的降低；(g)人受试者中内脏脂肪组织水平的降低；(h)人受试者中脂肪组织-肌肉组织的比率的降低；(i)人受试者中白色脂肪组织、肝组织或血管组织的葡萄糖摄取的提高；(j)人受试者中肌肉蛋白质分解代谢和/或肌肉氨基酸释放的降低；和/或(k)人受试者中胰岛素依赖的血糖控制的提高，从而治疗或预防人受试者的代谢疾病。
在另一方面中，本文公开了一种预防患有病变的受试者中病变之下的肌萎缩的方法，该方法包括选择患有病变的受试者；和向人受试者施用有效量的特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)。这样的受试者可以处于发生肌肉功能障碍，例如，肌萎缩的风险中。
在一个实施方式中，病变是由于脊髓损伤(SCI)。在一个实施方式中，人受试者处于脊髓损伤(SCI)急性期。在一个实施方式中，人受试者处于脊髓损伤(SCI)亚急性期。在一些实施方式中，SCI是不完全性SCI，特征在于受影响的神经和/或靶肌肉的功能部分地保留。在一些实施方式中，受试者患有涉及运动神经元的部分去神经支配的不完全性SCI且处于SCI的急性或亚急性期。在一些实施方式中，受试者在SCI后的6个月内，例如，SCI后的5个月内，4个月内，3个月内，2个月内，4周内或2周内。在一些实施方式中，受试者没有表现出病变之下的肌萎缩和/或肌肉损失。
在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用进一步提高病变之上肌肉的质量和/或功能。在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高快速收缩肌肉的质量和/或功能。在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高慢速收缩肌肉的质量和/或功能。
在一些实施方式中，肌肉组织的质量增加至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，肌肉组织的质量增加至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
在一些实施方式中，肌肉组织的功能提高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，肌肉组织的功能提高至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高人受试者的运动功能。在一些实施方式中，人受试者的运动功能提高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，人受试者的运动功能提高至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高人受试者的运动协调和平衡。在一些实施方式中，人受试者的运动协调和平衡提高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，人受试者的运动协调和平衡提高至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高人受试者的肌肉强度。在一些实施方式中，人受试者的肌肉强度提高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，人受试者的肌肉强度提高至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高人受试者的握力。在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用降低人受试者的白色脂肪组织水平。在一些实施方式中，白色脂肪组织水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，白色脂肪组织水平降低至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高人受试者的总身体质量。在一些实施方式中，总身体质量水平提高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，总身体质量水平提高至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高人受试者的代谢速率。在一些实施方式中，代谢速率提高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，代谢速率提高至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
在一个实施方式中，肌肉选自比目鱼肌、腓肠肌、二头肌和三头肌。
在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)在人受试者遭受病变后少于5、10、20、30、40、50、60分钟内施用于人受试者。在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)在人受试者遭受病变后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或24小时施用于人受试者。在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)在人受试者遭受病变后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或者至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、48或60个月内施用于人受试者。在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)施用于人受试者约1-30天、约1-50天、约1-100天、约1-200天或约1-300天。
在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)长期施用于人受试者。在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)以0.01mg/kg-100mg/kg范围的剂量施用于人受试者。在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)腹膜内外、静脉内、肌肉内、局部或皮下施用于人受试者。
在一个实施方式中，本文公开的方法还包括向人受试者施用第二疗法。在一个实施方式中，第二疗法选自胰岛素、胰岛素敏感性增强剂、α-葡糖苷酶拮抗剂、双胍类、磺酰脲类、胰岛素分泌促进剂、香树素(amyrin)激动剂、磷酸酪氨酸(phosphotyrosin)磷酸酶抑制剂、醛糖还原酶抑制剂、神经营养因子、PKC抑制剂、晚期糖基化终产物(AGE)抑制剂、活性氧淬灭剂、他汀类、鲨烯合成酶抑制剂、贝特类、烟酸、PCSK9抑制剂、甘油三酯降低剂、胆固醇清除剂(cholesterol sequesting agent)、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II拮抗剂、钙通道阻滞剂、熊去氧胆酸、吡格列酮、奥利司他、甜菜碱、罗格列酮、中枢抗-肥胖症剂、胃肠脂肪酶拮抗剂、β3-肾上腺素受体激动剂、肽基食欲抑制剂、缩胆囊素激动剂、多巴胺激动剂、DPP-4拮抗剂、胰高血糖素样肽、美格列脲、磺酰脲类、钠葡萄糖转运体(SGLT)2拮抗剂、环氧合酶拮抗剂、孕酮衍生物、基于甲氧氯普胺的药剂、基于四氢大麻酚的药剂和脂质代谢改善剂。
在另一方面中，本文公开了一种治疗受试者的方法，该方法包括选择表现出以下任一的人受试者：i)如与原肌生长抑制素的对照水平相比的，靶肌肉中原肌生长抑制素水平的提高，或ii)如与潜伏肌生长抑制素的对照水平相比的，循环中潜伏肌生长抑制素水平的降低；和向人受试者施用治疗有效量的特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素和阻断成熟肌生长抑制素的释放的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)，从而治疗受试者。在一个实施方式中，受试者表现出i)和ii)两者。
在一个实施方式中，施用步骤导致在施用步骤后靶肌肉中潜伏肌生长抑制素水平的提高。在一个实施方式中，在施用步骤后靶肌肉中潜伏肌生长抑制素的提高在施用步骤后的48小时内是可检测的。在一个实施方式中，在施用步骤后靶肌肉中潜伏肌生长抑制素的提高在施用步骤后至少28天是可检测的。在一个实施方式中，在施用步骤后靶肌肉中潜伏肌生长抑制素的水平与施用步骤前靶肌肉中潜伏肌生长抑制素的水平相比提高至少1.2-倍。
在一个实施方式中，施用步骤导致在施用步骤后受试者的循环中潜伏肌生长抑制素水平的提高。在一个实施方式中，在施用步骤后受试者的循环中潜伏肌生长抑制素的提高在施用步骤后的48小时内是可检测的。在一个实施方式中，在施用步骤后受试者的循环中潜伏肌生长抑制素的提高在施用步骤后至少28天是可检测的。在一个实施方式中，在施用步骤后受试者的循环中的潜伏肌生长抑制素水平比施用步骤之前循环中的潜伏肌生长抑制素水平高至少2-倍。
在一个实施方式中，选择步骤包括测定靶肌肉中的原肌生长抑制素水平。在一个实施方式中，选择步骤包括测定循环中的潜伏肌生长抑制素水平。
在一个实施方式中，该方法还包括测定施用步骤后靶肌肉中的原肌生长抑制素水平的步骤。在一个实施方式中，该方法还包括测定施用步骤后循环中的潜伏肌生长抑制素水平的步骤。在一个实施方式中，靶肌肉中的原肌生长抑制素水平通过从受试者获得肌肉组织样品并测定肌肉组织样品中的原肌生长抑制素水平来测定。在一个实施方式中，循环中的潜伏肌生长抑制素水平通过从受试者获得血液样品并测定血液样品中的潜伏肌生长抑制素水平来测定。
在一个实施方式中，靶肌肉是快速收缩肌肉。在一个实施方式中，靶肌肉包含氧化型快肌纤维(fast oxidative fiber)。
在一个实施方式中，施用步骤包括单剂量的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)。在一个实施方式中，施用步骤包括至少两个剂量的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)。
在一个实施方式中，肌肉质量的降低在受试者中防止。在一个实施方式中，受试者在施用步骤后表现出肌肉质量的增加。在一个实施方式中，受试者在施用步骤后表现出肌肉功能的提高。
在一个实施方式中，受试者是人受试者。
在另一方面中，本文公开了一种防止人受试者中肌肉质量的降低和/或增加肌肉质量的方法，该方法包括向人受试者施用单剂量的治疗有效量的特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素且阻断成熟肌生长抑制素的释放的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)，其中受试者在剂量施用后表现出至少8周的肌肉质量持续增加，从而防止人受试者中肌肉质量的降低和/或增加肌肉质量。在一个实施方式中，受试者在施用后表现出肌肉质量的逐渐增加至少12周。在一个实施方式中，受试者在施用后表现出肌肉质量的持续增加至少16周。
在另一方面中，本文公开了一种防止人受试者中肌肉质量的降低和/或增加肌肉质量的方法，该方法包括向人受试者施用超过两个剂量(包括至少第一剂量和第二剂量)的治疗有效量的特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素且阻断成熟肌生长抑制素的释放的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)，其中第一剂量和第二剂量间隔至少约4周施用于受试者，且其中受试者在第一剂量施用后表现出肌肉质量的持续增加至少8周，从而防止人受试者中肌肉质量的降低和/或增加肌肉质量。在一个实施方式中，第一剂量和第二剂量间隔至少约8周施用于受试者。
在一个实施方式中，受试者是受益于增加的肌肉质量和/或提高的肌肉功能的受试者。在一个实施方式中，受试者患有肌病或处于发生肌病的风险中。在一个实施方式中，肌病是脊髓损伤。在一个实施方式中，肌病是继发性肌病。在一个实施方式中，继发性肌病是去神经支配、遗传性肌无力或恶病质。
在一个实施方式中，受试者患有肌萎缩或处于发生肌萎缩的风险中。在一个实施方式中，肌萎缩是糖皮质激素诱导的肌萎缩。在一个实施方式中，糖皮质激素诱导的肌萎缩是由皮质醇(氢化可的松)、可的松、强的松、泼尼松龙、甲泼尼龙、地塞米松、倍他米松、曲安西龙、倍氯米松、醋酸氟氢可的松、醋酸脱氧皮质酮(doca)或醛固酮诱导的肌萎缩。
在一个实施方式中，受试者在施用肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)之后施用糖皮质激素。在一个实施方式中，糖皮质激素以足以在未施用肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)的对照受试者中诱导瘦体重的显著降低的剂量施用。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段以约0.01mg/kg-约30mg/kg的剂量施用。在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)腹膜内、静脉内、肌肉内或皮下施用。
在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)抑制受试者的肌生长抑制素信号传导。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素而不结合成熟肌生长抑制素。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素而不结合转化生长因子β家族的另一成员。在一个实施方式中，转化生长因子β家族的成员是GDF11或激活素(Activin)。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段不结合GDF11。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段是与人和鼠原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素交叉反应的。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段抑制通过tolloid蛋白酶的成熟肌生长抑制素的蛋白水解形成。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段以小于1μM的IC50抑制通过tolloid蛋白酶的成熟肌生长抑制素的蛋白水解形成。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变域，其包含含有如SEQID NO:10-11和66中任一所示的序列的互补决定区3(CDRH3)。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变域，其包含含有如SEQ ID NO:22-23和67中任一所示的序列的互补决定区3(CDRL3)。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含六个互补决定区(CDR)：CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRH1包含如SEQ ID NO:1-3中任一所示的序列，CDRH2包含如SEQ ID NO:4-9中任一所示的序列，CDRH3包含如SEQ ID NO:10-11和66中任一所示的序列，CDRL1包含如SEQ IDNO:12-17中任一所示的序列，CDRL2包含如SEQ ID NO:18-21中任一所示的序列，和CDRL3包含如SEQ ID NO:22-23和67中任一所示的序列。
在一个实施方式中，CDRH1包含如SEQ ID NO:1或2中所示的序列，CDRH2包含如SEQID NO:4或5中所示的序列，CDRH3包含如SEQ ID NO:10中所示的序列，CDRL1包含如SEQ IDNO:12或13中所示的序列，CDRL2包含如SEQ ID NO:18或19中所示的序列，和CDRL3包含如SEQ ID NO:22中所示的序列。
在一个实施方式中，CDRH1包含如SEQ ID NO:1或3中所示的序列，CDRH2包含如SEQID NO:6或7中所示的序列，CDRH3包含如SEQ ID NO:11中所示的序列，CDRL1包含如SEQ IDNO:14或15中所示的序列，CDRL2包含如SEQ ID NO:20或21中所示的序列，和CDRL3包含如SEQ ID NO:23中所示的序列。
在一个实施方式中，CDRH1包含如SEQ ID NO:1或3中所示的序列，CDRH2包含如SEQID NO:8或9中所示的序列，CDRH3包含如SEQ ID NO:11中所示的序列，CDRL1包含如SEQ IDNO:16或17中所示的序列，CDRL2包含如SEQ ID NO:20或21中所示的序列，和CDRL3包含如SEQ ID NO:23中所示的序列。
在一个实施方式中，CDRH1包含如SEQ ID NO:1或2中所示的序列，CDRH2包含如SEQID NO:4或5中所示的序列，CDRH3包含如SEQ ID NO:66中所示的序列，CDRL1包含如SEQ IDNO:12或13中所示的序列，CDRL2包含如SEQ ID NO:18或19中所示的序列，和CDRL3包含如SEQ ID NO:67中所示的序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含如SEQ ID NO:24-29中任一所示的重链可变域序列。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含如SEQ IDNO:30-35中任一所示的轻链可变域序列。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有如SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有如SEQ ID NO:51的氨基酸序列的轻链。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段与本文所述的任何其它抗体竞争结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段在与本文所述的抗体相同的表位处结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段以小于10-6M的抗体与原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素之间的平衡解离常数Kd竞争结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素。在一个实施方式中，Kd在10-11M-10-6M的范围内。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段是人抗体、人源化抗体、双体抗体、嵌合抗体、Fab片段、F(ab')2片段或Fv片段。在一个实施方式中，抗体是人源化抗体。在一个实施方式中，抗体是人抗体。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含具有人种系序列的框架。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含选自IgG、IgG1、IgG2、IgG2A、IgG2B、IgG2C、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgM和IgE恒定域的重链恒定域。在一个实施方式中，抗体包含IgG4的恒定域。在一个实施方式中，抗体包含具有Ser至Pro的骨架置换的IgG4恒定域，该置换产生IgG1-样铰链并允许链间二硫键的形成。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分不结合GDF11。
具体地，本发明涉及以下各项：
1.一种用于在受试者中抑制肌生长抑制素激活的方法，该方法包括以下步骤：
向所述受试者施用在所述受试者中有效引起以下两种或更多种的量的包含特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素并阻断成熟肌生长抑制素的释放的抗体或其抗原结合片段的组合物：
(a)所述受试者中肌肉组织的质量和/或功能的提高；
(b)所述受试者的代谢速率的提高；
(c)所述受试者的胰岛素敏感性的提高；
(d)所述受试者中棕色脂肪组织水平的提高；
(e)所述受试者中米色脂肪组织水平的提高；
(f)所述受试者中白色脂肪组织水平的降低；
(g)所述受试者中内脏脂肪组织水平的降低；
(h)所述受试者中脂肪组织-肌肉组织的比率的降低；
(i)所述受试者中棕色脂肪组织、米色脂肪组织或肌肉组织的葡萄糖摄取的提高；
(j)白色脂肪组织或肝组织的葡萄糖摄取的降低；
(k)所述受试者中肌肉蛋白质分解代谢和/或肌肉氨基酸释放的降低；
(l)所述受试者中胰岛素依赖的血糖控制的提高；
(m)所述受试者中肌肉内脂肪浸润的降低；
(n)生活质量的改善，如通过标准化生活质量测试评价的；
(o)所述受试者中肌肉损失或肌萎缩的预防；和/或
(p)所述受试者中与肌肉功能障碍相关的代谢失调的发生的预防，
其中所述受试者是从降低的肌生长抑制素信号传导受益的人受试者。
2.如第1项所述的方法，进一步包括以下步骤：
选择患有肌肉病症或障碍的受试者。
3.如第1项所述的方法，进一步包括以下步骤：
选择患有代谢障碍或处于发生代谢障碍的风险中的受试者。
4.如第1-3项中任一项所述的方法，其中所述量是与对照相比引起循环血清样品中潜伏肌生长抑制素水平的提高的量。
5.如第1-4项中任一项所述的方法，其中所述受试者具有选自以下的肌肉病症：肌病、肌萎缩、肌营养不良和神经损伤。
6.如第5项所述的方法，其中所述肌萎缩与运动神经元的缺陷相关。
7.如第6项所述的方法，其中所述缺陷包括遗传突变。
8.如第7项所述的方法，其中所述肌萎缩与脊髓性肌萎缩(SMA)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)或重症肌无力相关。
9.如第5项所述的方法，其中所述神经损伤包括使肌肉受神经支配的神经元的部分去神经支配或者运动神经元和靶肌肉之间受损的信号传导。
10.如第5项所述的方法，其中所述神经损伤是SCI。
11.如第10项所述的方法，其中所述SCI是部分/不完全SCI。
12.如第11项所述的方法，其中所述SCI包括i)T1-T6；ii)T7-L5；iii)C6-C7；iv)C5-C6；或v)C3-C8之间的病变。
13.如第10-12项中任一项所述的方法，其中所述受试者处于SCI的急性期；SCI的亚急性期；或SCI的慢性期。
14.如第13项所述的方法，其中所述受试者具有与SCI相关的代谢障碍或处于发生与SCI相关的代谢障碍的风险中。
15.如第14项所述的方法，其中所述代谢障碍是或包括胰岛素抵抗、炎症、异常脂质代谢或肌肉内脂肪浸润的增加。
16.如第5项所述的方法，其中所述肌萎缩包括糖皮质激素诱导的肌萎缩。
17.如第1-4项中任一项所述的方法，其中所述受试者患有选自I型糖尿病、II型糖尿病、肥胖症、代谢综合征/前驱糖尿病、心血管疾病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、脊髓损伤(SCI)、低代谢状态、双重糖尿病、库欣病和肥胖综合征的代谢疾病。
18.如第1-17项中任一项所述的方法，其中所述受试者用第二疗法治疗。
19.如第18项所述的方法，其中所述第二疗法包括神经保护疗法。
20.如第19项所述的方法，其中所述神经保护疗法包括干细胞疗法。
21.一种治疗或预防人受试者中与神经元和靶组织之间受损的神经信号传导相关的疾病的方法，该方法包括
选择患有与神经元和表达肌生长抑制素前体的靶组织之间受损的神经信号传导相关的疾病的所述人受试者；和
以有效治疗或预防所述疾病的量向所述人受试者施用包含抗体或其抗原结合片段的组合物，该抗体或其抗原结合片段特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素并阻断成熟肌生长抑制素的释放，
由此治疗或预防所述人受试者中所述与受损的神经信号传导相关的疾病。
22.如第21项所述的方法，其中所述靶组织选自肌肉、脂肪组织、脑组织、肝组织和血管组织。
23.如第22项所述的方法，其中所述靶组织是骨骼肌。
24.一种用于治疗受试者中引起神经元和靶肌肉之间受损的信号传导而非信号传导完全丧失的病变的方法，该方法包括
以有效治疗所述受试者中位于所述病变之下的肌肉的量向所述受试者施用包含肌生长抑制素抑制剂的组合物。
25.如第24项所述的方法，其中所述量是有效预防所述病变之下的肌肉损失或肌萎缩的量。
26.如第24项所述的方法，其中所述量是有效提高所述病变之下的肌肉的质量和/或功能的量。
27.如第24项所述的方法，其中所述肌肉包含快速收缩肌肉纤维。
28.如第24项所述的方法，其中所述肌肉包含慢速收缩肌肉纤维。
29.如第24-28项中任一项所述的方法，其中所述位于所述病变之下的肌肉选自比目鱼肌、腓肠肌、二头肌和三头肌。
30.如第24-29项中任一项所述的方法，其中所述量有效提高所述受试者中所述病变之上的肌肉的质量和/或功能。
31.如第24-30项中任一项所述的方法，其中所述肌生长抑制素抑制剂是抗体或其抗原结合部分、小分子或基因疗法。
32.如第31项所述的方法，其中所述抗体结合i)成熟肌生长抑制素；ii)肌生长抑制素受体；和/或iii)GDF11。
33.如第21-32项中任一项所述的方法，其中所述受试者具有不完全性脊髓损伤(SCI)。
34.如第32项所述的方法，其中所述不完全性SCI包括i)T1-T6；ii)T7-L5；iii)C6-C7；iv)C5-C6；或v)C3-C8之间的病变。
35.如第21-34项中任一项所述的方法，其中所述量有效治疗所述受试者中的代谢病症。
36.如第35项所述的方法，其中所述量在所述受试者中有效引起：
(a)所述受试者中肌肉组织的质量和/或功能的提高；
(b)所述受试者的代谢速率的提高；
(c)所述受试者的胰岛素敏感性的提高；
(d)所述受试者中棕色脂肪组织水平的提高；
(e)所述受试者中米色脂肪组织水平的提高；
(f)所述受试者中白色脂肪组织水平的降低；
(g)所述受试者中内脏脂肪组织水平的降低；
(h)所述受试者中脂肪组织-肌肉组织的比率的降低；
(i)所述受试者中棕色脂肪组织、米色脂肪组织或肌肉组织的葡萄糖摄取的提高；
(j)白色脂肪组织或肝组织的葡萄糖摄取的降低；
(k)所述受试者中肌肉蛋白质分解代谢和/或肌肉氨基酸释放的降低；
(l)所述受试者中胰岛素依赖的血糖控制的提高；
(m)所述受试者中肌肉内脂肪浸润的降低；
(n)生活质量的改善，如通过标准化生活质量测试评价的；
(o)所述受试者中肌肉损失或肌萎缩的预防；和/或
(p)所述受试者中与肌肉功能障碍相关的代谢失调的发生的预防。
附图说明
图1A-1B显示肌生长抑制素域结构和原肌生长抑制素组装。图1A显示作为原蛋白分泌的肌生长抑制素，其具有抑制性前结构域(prodomain)和随后的C-末端生长因子结构域，该原蛋白作为二硫键连接的二聚体存在。图1B显示以无活性构象组装的前体蛋白，其中前结构域(深灰色)以“紧身衣”组装包围生长因子(浅灰色)。该图形是从潜伏TGFβ1的结构(Shi等Nature 2011)的适应。
图2显示肌生长抑制素的激活涉及两个不同的蛋白酶事件，从而产生三种主要肌生长抑制素种类。生物合成的前体蛋白(原肌生长抑制素)通过两种单独的蛋白酶处理。原肌生长抑制素(和proGDF11)的切割通过前体蛋白转化酶如Furin/PACE3(偶合基本氨基酸裂解酶(Paired Basic Amino acid Cleaving Enzyme)3)或PCSK5(前体蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 5型)进行，其切开前结构域和成熟生长因子之间的保守RXXR位点。这一切割产生潜伏复合物，其中成熟生长因子被前结构域屏蔽而不与其受体结合。激活和活性生长因子的释放通过来自BMP/tolloid家族的另外的蛋白酶如TLL-2(Tolloid-样蛋白2)或BMP1(骨形态发生蛋白1)在切割后完成。这些切割事件产生肌生长抑制素的成熟形式，其可以称为活性肌生长抑制素或成熟肌生长抑制素。
图3A-3C显示Ab1阻断原肌生长抑制素通过蛋白酶tolloid家族的成员的切割。与增加量的Ab1预孵育的潜伏肌生长抑制素样品在肌生长抑制素激活试验中分析。在通过报告试验(图3A)分析肌生长抑制素释放后，样品然后在还原条件下运行并使用针对肌生长抑制素的前结构域产生的抗体通过蛋白质印迹探测(图3B)。～18kDa条带(方框)，对应于在tolloid切割后产生的前结构域的ARM部分，随增加的Ab1剂量成比例地减小。潜伏和原肌生长抑制素标准品(加载的45ng)显示～50kDa处的原肌生长抑制素和～37kDa处的前结构域的迁移。图3C显示肌生长抑制素的激活涉及两个不同的蛋白酶事件，从而产生三种主要肌生长抑制素种类。生物合成的前体蛋白(原肌生长抑制素)通过两种单独的蛋白酶处理。原肌生长抑制素(和proGDF11)的切割通过前体蛋白转化酶如Furin/PACE3(偶合基本氨基酸裂解酶3)或PCSK5(前体蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 5型)进行，其切开前结构域和成熟生长因子之间的保守RXXR位点。这一切割产生潜伏复合物，其中成熟生长因子被前结构域屏蔽而不与其受体结合。参见图3B，其显示tolloid蛋白酶的潜在抑制，从而阻断原肌生长抑制素的进一步切割。激活和活性生长因子的释放通过来自BMP/tolloid家族的另外的蛋白酶如TLL-2(Tolloid-样蛋白2)或BMP1(骨形态发生蛋白1)在切割后完成。
图4显示亲本Ab1抗体和其它候选者在基于细胞的报告分析中的表现。在用来自前体蛋白转化酶和tolloid蛋白酶家族两者的酶的过夜蛋白水解反应后，成熟生长因子的释放在293T细胞中使用基于CAGA的报告分析测量。结果与对照反应相比以计算在该试验中释放的原肌生长抑制素或proGDF11的分数。显示了3个重复的平均的标准差，但对于大多数数据点由于其低幅度而在曲线图上不可见。
图5图示地显示Ab1、Ab2、Ab4和Ab6抗体不抑制proGDF11激活。
图6显示评估平均百分体重变化的试验的结果。动物每日称重且计算相对于第0日的百分重量变化。数据表示组平均值±SEM。在研究的第42天各组的平均百分变化数据相比于PBS对照组使用单因素ANOVA接着Holm-Sidak’s后验检验进行分析，**p<0.01。
图7A-7D显示评估组织重量的试验的结果。图7A显示平均腓肠肌重量。图7B显示平均胸肌重量。图7C显示平均比目鱼肌重量。图7D显示平均三头肌重量。统计学评估相比于溶剂对照组(组1)使用单因素ANOVA接着Holm-Sidak’s后验检验进行。数据表示组平均值±SEM。**p<0.01。棒从左至右指示组1-5。
图8A-8C显示评估组织重量的试验的结果。图8A显示平均胫骨前肌重量。图8B显示平均膈肌重量。图8C显示平均四头肌重量。统计学评估相比于溶剂对照组(组1)使用单因素ANOVA接着Holm-Sidak’s后验检验进行。数据表示组平均值±SEM。*p<0.05。棒从左至右指示组1-5。
图9A-9B显示评估平均百分体重和瘦体重变化的试验的结果。图9A是显示在整个研究过程中每周两次称重的动物中所计算的相对于第0天的百分重量变化的曲线图。在图9B中，动物经历EchoMRI(QNMR)以测量第-4、7、14、21和28天的身体组成，并计算相对于第-1天的百分瘦体重变化。数据表示组平均值±SEM。对于体重和瘦体重两者，在研究的第28天各组的平均百分变化数据相比于IgG对照组(组2)使用单因素ANOVA接着Holm-Sidak’s后验检验进行分析。***p<0.0005，**p<0.005，*p<0.05，ns(不显著)。
图10A-10D是显示评估肌肉重量的试验结果的曲线图。图10A显示平均四头肌(股直肌)重量，图10B显示平均腓肠肌重量，图10C显示平均胫骨前肌重量，和图10D显示平均膈肌重量。Ab1处理组与IgG对照组相比的平均肌肉重量的百分差异标明在各棒上方。统计学评估相比于IgG对照组(组2)使用单因素ANOVA接着Holm-Sidak’s后验检验进行。数据表示组平均值±SEM。****p<0.0001，***p<0.0005，**p<0.005，*p<0.05，ns(不显著)。
图11A-11B显示评估平均百分体重和瘦体重变化的试验的结果。图11A显示从在整个研究过程中每周两次称重的动物计算的相对于第0天的百分重量变化。(图11B)动物经历EchoMRI(QNMR)以测量第-1、6和13天的身体组成，并计算相对于第-1天的百分瘦体重变化。PBS＝磷酸盐缓冲盐水，Dex＝地塞米松，IgG(20)＝以20mg/kg/wk给药的IgG对照抗体，Ab1(20)＝以20mg/kg/wk给药的Ab1抗体，和Ab1(2)＝以2mg/kg/wk给药的Ab1抗体。数据表示组平均值±SEM。在第14天(对于体重)和第13天(对于瘦体重)各组的平均百分变化数据相对于组1使用单因素ANOVA接着Dunnett's多重比较检验进行分析(****p<0.0001，***p<0.0005，**p<0.005，*p<0.05)且相对于组5使用单因素ANOVA接着Dunnett's多重比较检验进行分析(++++p<0.0001，+++p<0.0005，++p<0.005，+p<0.05)。ns(不显著)。
图12A-12D是显示评估不同肌肉的重量的试验结果的曲线图。图12A显示平均腓肠肌重量(克)，图12B显示平均四头肌(股直肌)重量(克)，图12C显示相对于用PBS(IP)和正常饮水处理的对照动物(组1)的平均百分腓肠肌重量变化，和图12D显示相对于用PBS(IP)和正常饮水处理的对照动物(组1)的平均百分四头肌(股直肌)重量变化。PBS＝磷酸盐缓冲盐水，Dex＝地塞米松，IgG(20)＝以20mg/kg/wk给药的IgG对照抗体，Ab1(20)＝以20mg/kg/wk给药的Ab1抗体，和Ab1(2)＝以2mg/kg/wk给药的Ab1抗体。对于图12A-12B，误差棒代表标准差(SD)。对于图12C-12D，误差棒代表平均值的标准误差(SEM)。统计学评估相对于组1(****p<0.0001，***p<0.0005，**p<0.005，*p<0.05)和相对于组5(++++p<0.0001，+++p<0.0005，++p<0.005，+p<0.05)使用单因素ANOVA接着Dunnett's多重比较检验进行。ns(不显著)。棒从左至右指示PBS，水；PBS，dex；IgG对照；Ab1(20)；和Ab1(2)。
图13A-13B显示评估平均百分体重和瘦体重变化的试验的结果。图13A显示对于在整个研究过程中每周两次称重的动物计算的相对于第0天的百分重量变化。图13B显示从经历EchoMRI(QNMR)以测量第-1、7和14天的身体组成的动物计算的相对于第-1天的百分瘦体重变化。PBS＝磷酸盐缓冲盐水，IgG(20)＝以20mg/kg/wk给药的IgG对照抗体，Ab1(20)＝以20mg/kg/wk给药的Ab1抗体，和Ab1(2)＝以2mg/kg/wk给药的Ab1抗体。数据表示组平均值±SEM。
图14A-14D显示评估肌肉重量的试验的结果。图14A显示打石膏的腿的平均腓肠肌重量(克)，图14B显示打石膏的腿的平均四头肌(股直肌)重量(克)，图14C显示相对于用PBS(IP)处理且未打石膏的对照动物(组1)的平均百分腓肠肌重量变化，和图14D显示相对于用PBS(IP)处理且未打石膏的对照动物(组1)的平均百分四头肌(股直肌)重量变化。PBS＝磷酸盐缓冲盐水，IgG(20)＝以20mg/kg/wk给药的IgG对照抗体，Ab1(20)＝以20mg/kg/wk给药的Ab1抗体，和Ab1(2)＝以2mg/kg/wk给药的Ab1抗体。对于图14A-14B，误差棒代表标准差(SD)。对于图14C-14D，误差棒代表平均值的标准误差(SEM)。统计学评估相对于组1(****p<0.0001，***p<0.0005，**p<0.005，*p<0.05)和相对于组5(++++p<0.0001，+++p<0.0005，++p<0.005，+p<0.05)使用单因素ANOVA接着Dunnett's多重比较检验进行。ns(不显著)。棒从左至右指示PBS，无石膏；PBS，打石膏；IgG对照(1)，打石膏；Ab1(20)，打石膏；和Ab1(2)，打石膏。
图15显示评估第21天(右上)和第28天(左上)的瘦体重变化的试验的结果。它还描述了在测试抗体的三个不同剂量(20mg/kg/wk(左下)、2mg/kg/wk(中下)和0.5mg/kg/wk(右下))、PBS对照和IgG对照下瘦体重的百分变化。统计学评估相对于组1(****p<0.0001，***p<0.005，**p<0.01，*p<0.05)和相对于IgG对照使用单因素ANOVA接着Dunnett's多重比较检验进行。对于上方的两幅图，棒从左至右是：PBS；IgG Ctrl 20mg/kg/wk；Ab1 20mg/kg/wk；Ab1 2mg/kg/wk；Ab1 0.5mg/kg/wk；Ab2 20mg/kg/wk；Ab2 2mg/kg/wk；Ab2 0.5mg/kg/wk；Ab4 20mg/kg/wk；Ab4 2mg/kg/wk；Ab4 0.5mg/kg/wk；Ab6 20mg/kg/wk；Ab6 2mg/kg/wk；和Ab6 0.5mg/kg/wk。对于左下图(20mg/kg/wk)，对应于给药后第28天的数据点从上至下对应于Ab1、Ab4、Ab2、Ab6、IgG对照和PBS。对于中下图(2mg/kg/wk)，对应于给药后第28天的数据点从上至下对应于Ab2、Ab1、Ab6、Ab4、IgG对照和PBS。对于右下图(0.5mg/kg/wk)，对应于给药后第28天的数据点从上至下对应于IgG对照Ab1、Ab2、PBS、Ab4和Ab6。
图16A-16B显示肌生长抑制素前体形式的域结构和评估。图16A显示原肌生长抑制素和潜伏肌生长抑制素的域结构，指明了蛋白酶切割位点。图16B显示在SDS PAGE凝胶上运行的部分前体蛋白转化酶切割的原肌生长抑制素。在还原条件下，蛋白质条带由原肌生长抑制素单体(～50kD)、前结构域(～37kD)和生长因子(12.5kD)组成。
图17A-17B显示Ab1对于肌生长抑制素是特异性的。图17A显示Ab1特异性地结合原肌生长抑制素和潜伏肌生长抑制素，没有观察到与TGFB超家族的其它成员的结合，最显著地GDF11的对应形式。Ab1以高浓度(50ug/mL)施用于用所示抗原涂覆的Forte-Bio BLI尖端且测量结合和解离速率以获得近似Kd值。生物传感器反应(指示结合事件)的幅度通过黑色棒图形表示，且计算的Kd以橙色表示。图17B显示Ab1阻断原肌生长抑制素的激活，但不阻断proGDF11的激活。在用来自前体蛋白转化酶和tolloid蛋白酶家族两者的酶的过夜蛋白水解反应后，成熟生长因子的释放在293T细胞中使用基于CAGA的报告试验测量。结果与对照反应相比以计算在该试验中释放的原肌生长抑制素或proGDF11的分数。
图18A-18C显示候选抗体的SCID剂量反应。图18A显示腓肠肌的肌肉重量和图18B显示四头肌(股直肌)的肌肉重量。图18C显示与PBS对照相比的平均肌肉重量的百分变化。图18A-18B中的棒从左至右是：PBS；IgG Ctrl 20mg/kg/wk；Ab1 20mg/kg/wk；Ab1 2mg/kg/wk；Ab1 0.5mg/kg/wk；Ab2 20mg/kg/wk；Ab2 2mg/kg/wk；Ab2 0.5mg/kg/wk；Ab4 20mg/kg/wk；Ab4 2mg/kg/wk；Ab4 0.5mg/kg/wk；Ab6 20mg/kg/wk；Ab6 2mg/kg/wk；和Ab6 0.5mg/kg/wk。
图19显示将Ab1与现有肌生长抑制素抗体(AbMyo)相比的作用持续时间研究的结果。PBS用作阴性对照；IgG用作阳性对照。瘦体重变化在21天后在不同给药方案下检验。
图20是说明体外重建肌生长抑制素激活的试验的示意图。
图21A-21B显示具有置换丝氨酸的脯氨酸的IgG4亚型的人源化单克隆抗体(Ab2)的重链(图21A；SEQ ID NO:50)和轻链(图21B；SEQ ID NO:51)。这产生了IgG1-样铰链序列且最小化链间二硫桥(其是IgG4的特征)的不完全形成。互补决定区(CDR)加下划线。黑体的NST序列：N-连接的糖基化共有序列位点；黑体的DP序列是潜在切割位点；黑体的NX序列(其中X可以是S、T或G)是潜在脱酰胺位点；黑体的DX序列(其中X可以是G、S、T或SDG)是潜在异构化位点；黑体的甲硫氨酸是潜在甲硫氨酸氧化位点；黑体的Q是预期的N-末端焦谷氨酸。
图22是显示通过种系化(germlining)降低的免疫原性风险的示意图。24H4(WT)在框架区内包含5个非种系氨基酸，如在示意图中表示的。
图23A-23C显示Ab1的优化。选择特异性地结合原肌生长抑制素的优化候选者，得到数十个具有提高的亲和力的克隆。进行FACS以显示与Ab1(图23A)相比酵母克隆(图23B)的增加的结合。图23C显示亲和力成熟的变体也具有通过octet的较慢的解离速率。
图24A-24B显示亲本Ab1与亲和力优化的变体Ab3和Ab5的重链可变区(图24A)和轻链可变区(图24B)的序列比对。序列标识从上至下对应于SEQ ID NO:24、26、28(图24A)。序列标识从上至下对应于SEQ ID NO:30、32、34(图24B)。互补决定区(CDR)使用Kabat(下划线)和IMGT命名法(黑体)定义。相对于亲本Ab1的置换以浅灰色显示。
图25显示在来自正常和肌萎缩的小鼠的肌肉和血浆中原-肌生长抑制素和潜伏-肌生长抑制素的表达。
图26显示肌肉和血浆中原肌生长抑制素和潜伏肌生长抑制素的变化的量化。棒从左至右显示对照肌肉中的原肌生长抑制素、对照肌肉中的潜伏肌生长抑制素、地塞米松(DEX)处理肌肉中的原肌生长抑制素、地塞米松(DEX)处理肌肉中的潜伏肌生长抑制素及来自对照和DEX处理小鼠的血清中的潜伏肌生长抑制素。
图27显示Ab2独特地识别原肌生长抑制素和潜伏肌生长抑制素，从而结合血清和肌肉两者中的肌生长抑制素的主要形式。前结构域(深灰色)和成熟生长因子(浅灰色)的非还原蛋白质印迹。重组原肌生长抑制素(rPro-Myostatin)显示原肌生长抑制素和肌生长抑制素前结构域(潜伏肌生长抑制素)在凝胶上的迁移，其通过箭头突出显示。在血清中，Ab2和AbMyo两者结合潜伏肌生长抑制素(前结构域条带)及多种部分加工的前体，但是仅Ab2识别原肌生长抑制素(上条带)。在肌肉中，Ab2沉淀原肌生长抑制素，而在肌肉组织中没有AbMyo与原肌生长抑制素的相互作用。
图28A-28B提供正常和萎缩肌肉中肌生长抑制素流的模型。在正常肌肉中(图28A)，原肌生长抑制素在肌肉中产生并通过弗林(Furin)蛋白酶(其可以在细胞内或细胞外存在)的切割转化成潜伏肌生长抑制素。肌肉中一定部分的潜伏肌生长抑制素然后释放到循环中，从而形成潜伏肌生长抑制素的循环池。在肌肉萎缩中(图28B)，活性肌生长抑制素生长因子的增加通过肌肉中原肌生长抑制素水平的上调和潜伏肌生长抑制素至活性生长因子的转化增加而引起。结果，循环潜伏肌生长抑制素随着潜伏肌生长抑制素的肌肉池通过mTLL2切割重定向至形成成熟肌生长抑制素而减少。
图29显示来自给药的大鼠的血清中Ab2(上线)和IgG对照(下线)抗体的检测。Ab2显示出与IgG对照相比在循环中升高的水平，在研究结束时血清中具有平均17.1μg/ml的Ab2。Ab2水平使用已知量的用作参比标准的各抗体通过人IgG-特异性ELISA测定。
图30A-30B显示在处理的大鼠中Ab2的药效学作用。图30A显示用Ab2处理的大鼠表现出与PBS-或IgG对照-处理的动物相比增加的瘦体重。Ab2和IgG在第0天以10mg/kg剂量静脉内施用。瘦体重在基线(第0天)及给药后7、14、21和28天通过qNMR测量(N＝8/组)。图30B显示股直肌和胫骨前肌(tibilais anterior)在研究结束时从所有组收集(N＝8/组)并称重以测定肌肉质量。用Ab2处理的大鼠分别显示出股直肌和胫骨前肌肌肉质量的14％和11％的增加。
图31A-31B显示Ab2处理的大鼠中的原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素水平。图31A显示Ab2的处理(上线)提高大鼠血清中潜伏肌生长抑制素水平～20-倍。图31B显示在大鼠肌肉(股直肌)中，Ab2处理导致肌生长抑制素的潜伏形式1.9x的增加。棒从左至右对应于原肌生长抑制素、潜伏肌生长抑制素、原肌生长抑制素和潜伏肌生长抑制素。在大鼠肌肉中没有观察到原肌生长抑制素的统计学显著的变化。这些数据来自n＝3样品/组的定量蛋白质印迹分析。
图32显示Ab2的处理(Ab2)或比较抗体的处理(AbMyo)早在抗体给药后7天导致小鼠中增加的瘦体重。瘦体重的增加直到给药后21天对于Ab2和AbMyo是等同的。但是，到给药后28天，瘦体重的增加在AbMyo-处理组中丧失，而Ab2-处理组中的增加在整个研究期间保持。上线对应于Ab2，中线对应于AbMyo，和下线对应于IgG对照(5mg/kg)。
图33显示在单个5mg/kg剂量的Ab2(上线)或比较抗体(AbMyo；下线)后，药物的血清水平使用抗-人IgG ELISA测量。药物早在给药后1小时在血清中检测到，且两种抗体的>1μg/ml的水平可以在整个研究中检测到。但是，Ab2表现出比AbMyo显著更长的半衰期和推断的曲线下面积(AUCINF)，表明在相似的剂量下，Ab2表现出比AbMyo显著更高的暴露量。
图34显示血清肌生长抑制素使用萦光蛋白质印迹在药物处理的小鼠中和在对照中测量。尽管具有增加的Ab2血清暴露，血清潜伏肌生长抑制素水平在Ab2-和AbMyo-处理小鼠两者中是相似的。这些数据表明游离药物的循环水平相对于靶标的水平充分过量，使得增加的Ab2的血清暴露不导致循环潜伏肌生长抑制素与在AbMyo组中观察到的相比增加更多。数据组从左至右对应于IgG、Ab2、AbMyo、IgG、Ab2和AbMyo。
图35A-35B显示潜伏肌生长抑制素和原肌生长抑制素的相对水平通过萦光蛋白质印迹在小鼠肌肉溶解产物中测量。图35A显示潜伏肌生长抑制素在Ab2-和AbMyo-处理肌肉两者中升高。但是，潜伏肌生长抑制素的升高在AbMyo-处理的肌肉中到第28天返回到基线，而Ab2处理肌肉中的那些保持升高直到至少这一时间(P<0.003，相对于AbMyo处理)。图35B显示对于原肌生长抑制素观察到相似的趋势，尽管在第28天时Ab2和AbMyo处理组之间的差异不是统计学显著的(P＝0.068)。
图36A显示一组抗体的肌生长抑制素结合和阻断活性。
图36B将肌生长抑制素结合和阻断活性与对肌萎缩的作用相关。
图37A-37H显示健康动物中muAb1的施用增强肌肉功能。图37A在鼠形式的Ab1的四周处理后的体内跖屈功能性能。最大力针对肢体长度标准化。力测量经由坐骨神经从跖屈肌群的电刺激产生。40-150Hz平均，最大力(maximal force)存在19％的增加(p＝0.003)。具体地，在60Hz下，测量了最大力18％的提高(p＝0.083)。图37B显示在muAb1施用后增加的腓肠肌重量。图37C显示，当相对于腓肠肌重量标准化时，没有最大力的变化，表明没有肌肉品质的变化。图37D显示在muAb1的四周处理后的体外趾长伸肌肌肉功能。在增加的刺激频率上EDL的力测量相对于EDL长度标准化。肌肉力量的增加是：80Hz下24％(p＝0.024),100Hz下28％(p＝0.010)，和150Hz下27％(p＝0.011)。图37E显示在muAb1施用后增加的EDL重量。图37F显示，当相对于EDL重量标准化时，没有最大力的变化，表明没有肌肉品质的变化。图37G显示muAb1和PBS的IIB型平均纤维面积。图37H显示PBS和muAb样品中的4种肌肉纤维类型(％)。
图38A-38I显示健康动物中muAb1的施用增强肌肉功能。图38A-38B显示在muAb1的四周处理之后，按照体内的跖屈功能能的最大松弛和收缩速率及力-频率关系。图38C-38D显示在muAb1的四周处理之后，按照体外趾长伸肌肌肉功能的最大松弛和收缩速率及力-频率关系。图38E-38I显示跖屈肌群的肌肉纤维截面积定量。
图39A-39B显示用抗-原/潜伏GDF8抗体探测的胫骨前肌的横截面，Ab10或非特异性靶向抗体显示于图39A中，HuNeg显示于图39B中，且各图用DAPI复染。比例尺是0.01cm。
图40A-40C显示用抗-原/潜伏GDF8抗体Ab10探测的胫骨前肌的横截面，其已经在单独的封闭缓冲液中孵育(图40A)、在具有10-倍摩尔过量的重组小鼠GDF8的封闭缓冲液中孵育(图40B)或在具有10-倍摩尔过量的重组小鼠GDF11的封闭缓冲液中孵育(图40C)。图40A-40C用DAPI复染。
图41A-41C显示用抗-原/潜伏GDF8抗体Ab10及抗-层粘连蛋白探测并用DAPI复染的胫骨前肌的横截面。原/潜伏GDF8和层粘连蛋白共定位于肌纤维顶点的间隙空间中(箭状物)、肌纤维之间(箭头)和间质核周围(星号)。
图42A-42B显示单剂量药代动力学/药效学作用时间研究中1小时、4周和8周后的不同肌肉重量。图44A显示不同组的四头肌(股直肌)重量和图44B显示不同组的腓肠肌重量。
图43A-43D显示健康食蟹猴中Ab2处理对瘦体重变化的影响。健康雄性食蟹猴通过以Ab2的三个不同剂量(3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg)每周一次静脉内注射共8周及4-周恢复期给药。对照动物施用溶剂对照(20mM柠檬酸盐和150mM氯化钠USP,pH 5.5)。瘦体重通过双能X-射线吸收测定法(DEXA)测量。图43A是显示在第0天、4周、8周和12周测量的Ab2-处理和对照动物中所有肢体的肌肉的平均百分瘦体重变化的曲线图。图43B是显示在第4周测量的Ab2-处理和溶剂对照动物中所有肢体的肌肉的平均百分瘦体重变化的曲线图。图43C是在第8周测量的Ab2-处理和溶剂对照动物中肢体肌肉的平均百分瘦体重变化的曲线图。图43D是显示在第12周测量的Ab2-处理和溶剂对照动物中肢体肌肉的平均百分瘦体重变化的曲线图。
图44A-44B是显示从健康食蟹猴收集的肱二头肌和腓肠肌中Ab2处理对肌肉重量的影响的曲线图。健康雄性食蟹猴通过以Ab2的三个不同剂量(3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg)每周一次静脉内注射共8周及4-周恢复期至第12周来给药。对照动物施用溶剂对照(20mM柠檬酸盐和150mM氯化钠USP,pH 5.5)。肌肉重量在第12周通过组织重量测量。
图45显示用Ab2处理的健康食蟹猴与溶剂对照相比的相对于基线(第0天)的平均百分瘦体重变化及肌肉重量的百分差异。
图46A和46B显示Ab2-处理的健康食蟹猴和对照动物的血清样品中使用定量萦光蛋白质印迹测量的潜伏肌生长抑制素水平。健康雄性食蟹猴通过以三个不同剂量(3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg)每周一次静脉内注射共8周及4-周恢复期来给药。对照动物施用溶剂对照(20mM柠檬酸盐和150mM氯化钠USP,pH 5.5)。血清样品在不同的研究日收集且血清样品中的相对潜伏肌生长抑制素水平使用定量萦光蛋白质印迹进行分析。
图47描绘了在SCI后1周和2周时幼稚小鼠及假手术、SCI-veh、SCI-IgG、SCI-Ab1处理组的体重。顶部的星号*反映与假手术的显著差异；且条底部的星号*反映与SCI-Ab1的显著差异。
图48描绘了在SCI后2-周时假手术、SCI-veh、SCI-IgG、SCI-Ab1处理组的肌肉湿重(质量)。切除的肌肉包括病变下比目鱼肌和腓肠肌及病变上二头肌和三头肌。
图49描绘了在SCI后2-周时假手术、SCI-veh、SCI-IgG和SCI-Ab1处理组中总无脂肪(瘦)体重和脂肪质量的分析。
图50描绘了在SCI后2-周时假手术、SCI-veh、SCI-IgG、SCI-Ab1处理组中作为体重的百分比的瘦体重。
图51描绘了在SCI后2-周时假手术、SCI-veh、SCI-IgG和SCI-Ab1处理组中kcal/hr和TEE的分析。在下方曲线图中，SCI/处理对照组表现了来自上方曲线图的综合SCI/veh+SCI/IgG组。
图52描绘了在基线(在存活手术前)、SCI后1天、1周和2周时假手术、SCI-veh、SCI-IgG和SCI-Ab1组的BMS运动评价。SCI后1周和2周的统计学比较反映综合SCI-veh+SCI-IgG数据。
图53描绘了在训练前(PT)、SCI后1周和2周之后假手术、SCI-veh、SCI-IgG和SCI-Ab1组的转棒(Rotarod)时间评分。
图54描绘了在训练前(PT)、SCI后1周和2周之后假手术、SCI-veh、SCI-IgG和SCI-Ab1组的握力。
图55描绘了使用Ab2在来自健康小鼠的冷冻切片胫骨前肌上进行和用层粘连蛋白共染色的免疫萦光分析。
具体实施方式
本公开涉及能够特异性结合肌生长抑制素前体或前体复合物并在体内阻断其蛋白水解加工成成熟肌生长抑制素的抗体，从而抑制肌生长抑制素信号传导以在体内诱导有益的作用。这样的抗体可用于施用于可能从降低的肌生长抑制素信号传导受益或需要降低的肌生长抑制素信号传导的受试者。
根据本发明，向受试者施用有效量的本文所述的肌生长抑制素抑制剂，例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体，可以在受试者中通过在体内选择性地抑制肌生长抑制素的激活而产生多种有益的生物学效应。这样的生物学效应包括以下益处中的两种或更多种，例如，3种或更多种，4种或更多种，5种或更多种，6种或更多种，2-4种，2-5种，2-6种，3-5种或3-6种：
a)受试者中肌肉质量和/或功能的提高；
b)受试者的代谢速率的提高；
c)受试者的胰岛素敏感性的提高；
d)受试者中棕色脂肪组织水平的提高；
e)受试者中米色脂肪组织水平的提高；
f)受试者中白色脂肪组织水平的降低；
g)受试者中内脏脂肪组织水平的降低；
h)受试者中脂肪组织-肌肉组织的比率的降低；
i)受试者中白色脂肪组织、肝组织或血管组织的葡萄糖摄取的增加；
j)受试者中肌肉蛋白质分解代谢和/或肌肉氨基酸释放的降低；
k)受试者中胰岛素依赖的血糖控制的提高；
l)受试者中肌肉内脂肪浸润的降低；
m)标准化生活质量测试评分的临床上有意义的改善；
(o)受试者中肌肉损失或肌萎缩的预防；和/或
(p)受试者中与肌肉功能障碍相关的代谢失调的发生的预防。
因此，本发明包括特异性地结合原肌生长抑制素和/或潜伏肌生长抑制素和阻断受试者(例如，受益于降低的肌生长抑制素信号传导的人受试者)中成熟肌生长抑制素的体内激活的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的用途。本发明包括以有效治疗或预防与肌生长抑制素功能障碍相关的病症的量使用特异性地结合原肌生长抑制素和/或潜伏肌生长抑制素和阻断肌生长抑制素的激活的抗体或其抗原结合片段治疗或预防这类病症的方法。与肌生长抑制素功能障碍相关的病症包括肌肉疾病和障碍以及某些代谢失调。
为了本发明可以更容易地理解，首先定义某些术语。另外，应当注意，在述及参数的值或值的范围的任何时候，意在所述值中间的值和范围也意图是本发明的部分。
在以下说明书中，为了解释的目的，给出特定数量、材料和配置以提供对本发明的充分理解。但是，对于本领域技术人员明显的是，本发明可以在没有这些具体细节的情况下实施。在一些情况中，公知的特征可以忽略或简化而不模糊本发明。此外，说明书中述及如“一个实施方式”或“一实施方式”的短语意思是与该实施方式相关描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施方式中。在说明书的各种不同位置的如“一个实施方式中”的短语的出现不必然都是指相同的实施方式。
定义
冠词“一”和“一个”在本文中用于指一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法客体。举例来说，“一元素”意思是一个元素或超过一个元素。
除了在操作实施例中或者在另有指明的情况中，本文中所用的表示组分或反应条件的量的所有数字应当理解为在所有情况下用术语“约”来修饰。术语“约”在结合百分比使用时可以意指±1％。此外，术语“约”可以意指在值的±1％内。
术语“施用”、“实施”或“给药”包括递送抗体或其抗原结合片段(例如，包含这种抗体或抗原结合片段的组合物)或者药剂到受试者的系统中或到受试者中或受试者上的特定区域(分别系统性施用和局部施用)的任何方法。
本文中使用的术语“抗体”意图指由通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)组成的免疫球蛋白分子。各重链由重链可变区(本文中简称为HCVR或VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。各轻链由轻链可变区(本文中简称为LCVR或VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步细分成穿插有更保守的区域(称为框架区(FR))的超变区(称为互补决定区(CDR))。VH和VL各自由三个CDR和四个FR构成，其从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。本发明的抗体更详细地描述于国际专利申请WO2016073853A1和2016年9月15日提交的国际申请No.PCT/US2016/052014中，其各自的全部内容通过引用合并于此。如本领域中已知的抗体变体也包括在本发明中。
本文中使用的术语抗体的“抗原结合片段”、“抗原结合区段”或“抗原结合部分”(或简称“抗体片段”或“抗体部分”)指的是保留与抗原(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素)特异性结合的能力的一个或多个抗体片段。已经证明抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等,(1989)Nature341:544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域，VL和VH，通过单独的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头接合，该合成接头使得它们能够作为单一蛋白质链制备，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等(1988)Science 242:423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。这类单链抗体也意图包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。也包括单链抗体的其它形式如双体抗体。双体抗体是二价的双特异性抗体，其中VH和VL域在单一多肽链上表达，但使用太短的接头以致于不允许同一链上的两个结构域配对，从而促使结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如，Holliger，P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.，等(1994)Structure 2：1121-1123)。
本文使用的术语“包含”或“包括”用于指对于本发明必要的组合物、方法和相应组分，但也是开放的以包括未指定的元素，无论是必要的还是不必要的。
术语“由…组成”是指本文所述的组合物、方法及其相应组分，其排除未在该实施方式的说明中述及的任何元素。
本文使用的术语“对照”或“对照样品”是指任何临床上或科学上相关的比较样品或对应物，包括例如来自健康受试者的样品，来自具有可引起或使得受试者易感特定疾病或病症的缺陷的受试者、患有目标疾病或病症的受试者的样品，来自用药用载体治疗的受试者的样品，来自治疗前的受试者的样品，假治疗或缓冲液治疗的受试者或样品，未治疗的受试者或样品，等等。
术语“对照水平”是指生物标志物的公认的或预定的水平，例如，在治疗或疾病发作之前或者在药物(例如，抗体或其抗原结合部分)施用之前获得的标志物水平。具有一种或多种特定特征(例如，特定疾病或病症的存在或不存在)的受试者或受试者群体中存在的生物标志物的水平。
本文使用的术语“降低”在疾病症状的情况中是指这种水平的统计学显著的降低。该降低可以是，例如，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或者低于检测方法的检测水平。该降低也可以是，例如，低于检测方法的检测水平约1-10％、10-20％、1-30％、20-50％、30-60％、40-70％、50-80％或60-90％。在某些实施方式中，该降低达到公认为在对于不具有这种障碍的个体正常的范围内的水平，这也可以称为水平的正常化。
本文使用的术语“去神经支配”是指到达其靶组织如肌肉组织中的神经分布或神经元输入的损失或扰乱。去神经支配的原因包括神经的疾病(例如，运动神经元的遗传障碍)、化学毒性、物理损伤或有意的外科阻断等。去神经支配可以是部分去神经支配(也称为不完全去神经支配)或完全去神经支配。部分去神经支配可以是，例如，到达其靶组织中的神经分布或神经元输入的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的损失或扰乱。在一些实施方式中，部分去神经支配包括到达其靶组织中的神经分布或神经元输入的约1-10％、10-20％、1-30％、20-50％、30-60％、40-70％、50-80％、60-90％的损失或扰乱。
本文使用的“测定”理解为进行试验或使用方法以确定某些人或某些事的状态，例如，某些状况、生物标志物、疾病状态或生理状况的存在、不存在、水平或程度。
疾病的“发生”或“进展”意味着疾病的初始表现和/或随后进展。疾病的发生可以是可检测的并使用标准临床技术评价。但是，发生也指可能不可检测的进展。为本公开的目的，发生或进展是指症状的生物学过程。“发生”包括出现、复发和发作。如本文中使用的，与肌病相关的疾病/障碍的“发作”或“出现”包括初发和/或复发。
虽然与本文所述的那些类似或等同的方法和材料可以用于实施或测试本公开，但合适的方法和材料描述如下。缩写“e.g.”是源自拉丁语exempli gratia，且在本文中用于指非限制性的例子。因此，缩写“e.g.”是术语“例如”的同义语。
术语“表位”包括能够特异性地结合免疫球蛋白或T-细胞受体的任何多肽决定子。在某些实施方式中，表位决定子包括分子的化学活性表面群组，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，且在某些实施方式中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位是被抗体结合的抗原区域。在某些实施方式中，当抗体优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的其靶抗原时，其被称为特异性地结合抗原。表位可以是线性表位或构象表位。
本文使用的术语"有效量"和"有效剂量"指的是足以以可接受的效益/风险比实现其预期目的，即，在组织或受试者中所希望的生物学或医疗反应的化合物或组合物的任何量或剂量。例如，在本发明的某些实施方式中，预期的目的可以是抑制肌生长抑制素的体内激活，实现与肌生长抑制素抑制相关的临床有意义的结果。
相关预期目的的量度可以是客观的(即，可通过一些分析或标志物测量的)或主观的(即，受试者给出效果的迹象或感觉)。在一些实施方式中，治疗有效量是在施用于符合疾病、障碍或病症的特定临床标准(例如，如通过表现的症状、疾病进展/阶段、遗传特征等确定的)的患者群体时，在群体中获得统计学显著的治疗反应的量。
在一些实施方式中，有效量是在根据特定的方案施用时，以合理地可接受的不良反应(例如，毒性)水平产生积极临床结果的量，使得不良反应(如果存在)对于患者继续该治疗方案是足够耐受的且治疗的益处超过毒性的风险。本领域技术人员将理解，在本发明的一些实施方式中，如果单位剂量包含适合用于在与积极结果相关的剂量方案的情况中施用的量，则其可以被认为包含有效量。
治疗有效量通常在可以包含多个单位剂量的给药方案中施用。对于任何特定药剂，治疗有效量(和/或有效给药方案中的适宜单位剂量)可以例如根据施用途径、与其它药剂的组合而变化。在一些实施方式中，对于任何特定患者的特定治疗有效量(和/或单位剂量)可以取决于多种因素，包括所治疗的障碍和障碍的严重程度；使用的特定药剂的活性；使用的特定组合物；患者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；使用的特定药剂的施用时间、施用途径和/或排泄或代谢速率；治疗持续时间；及医疗领域中公知的类似因素。
如本文中使用的术语“人抗体”旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体及其片段。本公开的人抗体可以包括非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中和特别地在CDR3中。但是，如本文中使用的术语“人抗体”不旨在包括其中源自另一哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列被嫁接到人框架序列上的抗体。
在例如疾病症状如例如与疾病相关的功能丧失或质量(例如，肌肉质量)损失的情况中的术语“提高”是指这种水平的统计学显著的提高。该提高可以是，例如，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或者高于检测方法的检测水平。该提高可以是，例如，高于检测方法的检测水平约1-10％、10-20％、1-30％、20-50％、30-60％、40-70％、50-80％或60-90％。在某些实施方式中，该提高高达公认为在对于没有这种障碍的个体正常的范围内的水平，这也可以称为水平的正常化。在某些实施方式中，该提高是疾病的迹象或症状水平的正常化，疾病迹象的受试者水平和疾病迹象的正常水平之间的差异的增加。在某些实施方式中，该方法包括在受试者用特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的抗体处理后肌肉组织的质量和/或功能的提高。在某些实施方式中，该方法包括与原肌生长抑制素的对照水平相比靶肌肉中原肌生长抑制素水平的提高。
如本文使用的“分离的抗体”意指基本上没有具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的分离的抗体基本上没有特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素以外的抗原的抗体)。但是，特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的分离的抗体可以具有对其它抗原如来自其它物种的原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素分子的交叉反应性。而且，分离的抗体可以基本上不含其它细胞物质和/或化学品。
除非另外明确说明，术语“成熟肌生长抑制素”是指肌生长抑制素的完全加工的生物活性的形式。肌生长抑制素的生物活性形式能够实现肌生长抑制素受体结合和/或激活。成熟肌生长抑制素的野生型序列作为SEQ ID NO:52提供。在一些情况中，成熟肌生长抑制素可以包含一个或多个突变，其可以表现出改变的结构/功能或稳定性。
本文使用的术语“肌生长抑制素抑制剂”是指抑制或拮抗肌生长抑制素(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素)的活性或表达水平的任何化合物。在一些实施方式中，肌生长抑制素抑制剂可以是抗体(包括其片段，如域抗体(dAb)，如例如，U.S.专利6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；和6,696,245中描述的)、小分子抑制剂、Adnectin、亲和体(Affibody)、DARPin、Anticalin、Avimer、Versabody或基因疗法。抗体或其抗原结合片段可以结合成熟肌生长抑制素、肌生长抑制素受体和/或GDF11。在一些实施方式中，肌生长抑制素抑制剂是小分子抑制剂。在其它实施方式中，肌生长抑制素抑制剂是指基因疗法。在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂特异性地结合肌生长抑制素，但不结合GDF11。在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂可以用于治疗代谢疾病、肌肉病症或障碍、与受损的神经信号传导相关的疾病或障碍或者部分去神经支配或本文所述的其它病症。在另一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂可以用于治疗涉及快缩肌纤维的疾病，如本文所述的。在另一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂可以用于在病变之下提供治疗效果，如本文所述的。
本文使用的短语“循环中的潜伏肌生长抑制素”或“循环的潜伏肌生长抑制素”是指血液、血浆或血清中的潜伏肌生长抑制素。
本文使用的术语“原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素”是指原肌生长抑制素、潜伏肌生长抑制素或两者(即，肌生长抑制素的原形或者前体)。
在特异性结合对(例如，配体和结合位点、抗体和抗原、生物素和抗生物素蛋白)的成员之间的相互作用的情况中的“特异的”和“特异性”是指相互作用的选择性反应性。短语“特异性结合”和类似短语是指抗体(或其抗原反应性片段)特异性地结合抗原(或其片段)且不特异性地结合其它实体的能力。特异性结合理解为，例如，相对于对照的非特异性抗原、表位、受体配体或结合伴体以至少2-倍、5-倍、10-倍、50-倍、100-倍、200-倍、500-倍或1,000-倍的优势结合特定抗原、表位、受体配体或结合伴体的优先性。本文使用的“特异性结合”也可以指基于结合动力学如Kon、Koff和KD的结合对。例如，如果其具有10-2sec-1或更小、10-3sec-1或更小、10-4sec-1或更小、10-5sec-1或更小或者10-6sec-1或更小的Koff；和/或10-6M或更小、10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M或更小、10-10M或更小或者10-11M或更小或者10- 12M或更小的KD，配体可以理解为特异性地结合其靶位点。应理解各种蛋白质可以共有共同的表位或其它结合位点(例如，激酶反应性位点)。在某些实施方式中，结合位点可以结合超过一个配体，但仍然可以基于与非特异性抗原相比的结合优先性和/或通过具有某些特定结合动力学参数被认为具有特异性。选择适当的非特异性对照的方法在本领域技术人员的能力内。结合分析通常在生理条件下进行。
本文使用的术语“慢收缩”、“慢缩”、“1型”或“I型”肌肉是指富含I型肌肉纤维的肌肉且频率使用，更通常是姿势肌，并且帮助实现长程举动如长跑。本文使用的术语“快收缩”、“快缩”、“2型”或“II型”肌肉是指提供较高能量输出和力量的肌肉且在强力的暴发运动如疾跑中使用，但这种肌肉更快速地疲劳且不可以重复地使用。快缩肌肉分成两个纤维类型的类别：中间快缩纤维(IIA型)和快缩纤维(IIB或IIx型)。中间快缩纤维比慢缩纤维更粗、更快收缩且更快疲劳。快缩纤维(最有力和在耐力上最低)在身体接近最大运用时激活。尽管大多数肌肉倾向于由各种纤维类型的混合物组成，但不同的肌肉包含纤维类型的不同比率。在发育过程中或响应于某些事件(例如，运动、疾病、损伤等)，肌肉或肌肉群内的纤维类型可能发生纤维类型转换，导致肌肉生理的改变的表型(phynotype)。
本文使用的术语“受试者”和“患者”可以互换地使用。在一个实施方式中，受试者是指需要治疗的脊椎动物，特别是哺乳动物，例如，宠物(例如，狗、猫等等)、农畜(例如，奶牛、猪、马、绵羊、山羊、禽类等等)和实验室动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠等等)。在一些实施方式中，受试者是受益于治疗或需要治疗的人。在一个实施方式中，受试者是人受试者。
在肌肉质量增加的情况中，本文使用的短语“持续增加”是指在施用治疗有效量的肌生长抑制素抑制剂(例如，如本文所述的抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体)后指定时间的肌肉质量增加。持续增加可以是连续的或非连续的，但总体上导致指定时间的肌肉质量增加。
“治疗”或“预防”疾病或障碍意思是延迟或防止这种疾病或障碍的发作，逆转、缓解、改善、抑制、减缓或中止与这种疾病或障碍相关的病症的进展、加重或恶化、进程或严重性，但不必然需要疾病或障碍的完全治疗或预防。在一个实施方式中，疾病或障碍的症状减轻至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。
肌生长抑制素
肌生长抑制素(也称为GDF8)是TGFβ超家族的成员，并属于包括两个成员的亚家族：肌生长抑制素和GDF11。如同TGFβ超家族的其它成员，肌生长抑制素和GDF11最初都表达为无活性的前体多肽(分别称为原肌生长抑制素和proGDF11)。结构域结构和命名显示于图1A中。图1B显示原肌生长抑制素的总体结构的卡通模型，其中成熟生长因子保持锁定在由通过称为“潜伏套索(latency lasso)”的环连接的两个α螺旋组成的笼中。
肌生长抑制素是良好表征的骨骼肌质量的负调节剂，其通过两个单独的蛋白酶切割步骤从自体抑制的N-末端前结构域释放。例如，在肌肉纤维微环境中的这些切割事件可以称为超细胞激活。在激活后，成熟肌生长抑制素通过结合I和II型细胞表面受体(Alk4/5和ActRIIB)的复合体发信号，其下游信号传导引起肌萎缩。存在着肌生长抑制素作为用于治疗肌肉萎缩的靶标的兴趣。靶向ActRIIB信号传导途径的多种治疗剂正在完成肌肉萎缩病症的早期至中期临床试验，包括少肌症、肌肉营养不良、恶病质和髋关节置换/髋骨折。到目前为止，主要临床策略集中于阻断成熟肌生长抑制素和细胞表面受体之间的相互作用。但是，几种治疗程序由于缺乏特异性(导致不可接受的毒性)和/或功效而中断。在体内，肌生长抑制素主要处于与其抑制性前结构域的复合物中。
本文提供的本公开的方面涉及阻断肌生长抑制素从这些抑制性前结构域复合物的超细胞激活提供特异性地阻断肌生长抑制素途径信号传导的手段达到的程度的评价。本公开的进一步方面涉及特异性结合肌生长抑制素前体形式的一组人单克隆抗体的评估，包括体外抑制蛋白水解激活的亚集。在一些实施方式中，已经发现阻断激活的抗体能够保护小鼠免于地塞米松诱导的肌萎缩。来自健康动物和来自发生地塞米松诱导的肌萎缩的动物的血清和肌肉样品的评价证明在肌萎缩过程中前体形式的生物分布改变，这是在理解肌肉萎缩病理学中具有重要含义的独特发现。此外，健康小鼠用鼠形式的强效激活阻断抗体处理促进稳健的肌肉生长并导致肌肉功能的显著提高。本文中提供的结果提供了肌生长抑制素加工在骨骼肌蛋白质内稳态中的重要性的深入了解。另外，阻断生长因子从前体形式的超细胞激活是阻止肌生长抑制素信号传导的强力方法，这是提供也可以应用于TGFβ超家族的其它成员的新的治疗策略的技术。
成熟肌生长抑制素的激活和释放通过几个离散的蛋白酶切割事件完成。原肌生长抑制素和proGDF11的第一切割步骤通过前体蛋白转化酶进行，其在前结构域和成熟生长因子之间的保守RXXR位点处切割。这一切割产生“潜伏肌生长抑制素”，其中成熟生长因子通过前结构域屏蔽而不与其受体结合。成熟的、活性肌生长抑制素生长因子的激活和释放在通过来自BMP/tolloid家族的另外的蛋白酶如mTLL-2切割潜伏肌生长抑制素后完成。本文使用的术语“成熟肌生长抑制素”可以是指全长成熟肌生长抑制素以及全长成熟肌生长抑制素的片段(其保留生物学活性)。
术语“原肌生长抑制素”，也称为“proGDF8”，是指成熟肌生长抑制素的无活性前体，其包含二硫键连接的同型二聚体，该同型二聚体的各分子包含与羧基末端成熟肌生长抑制素结构域共价结合的氨基末端前结构域。在一个实施方式中，“原肌生长抑制素”未被前体蛋白转化酶或来自BMP/tolloid家族的蛋白酶切割。示例性的原肌生长抑制素序列、其变体和生成原肌生长抑制素的方法在本领域中是公知的且更详细地描述于本文中。
本文使用的术语“潜伏肌生长抑制素”是指成熟肌生长抑制素的无活性前体，其包含二硫键连接的同型二聚体，该同型二聚体的各分子包含与羧基末端成熟肌生长抑制素结构域非共价结合的氨基末端前结构域。在一个实施方式中，“潜伏肌生长抑制素”从已被前体蛋白转化酶切割，但未被来自BMP/tolloid家族的蛋白酶切割的原肌生长抑制素产生。在另一实施方式中，“潜伏肌生长抑制素”可以通过在体外组合前结构域和羧基末端成熟肌生长抑制素结构域并允许它们正确地折叠而产生。参见，例如，Sengle等,J.Biol.Chem.,286(7):5087-5099,2011。示例性的潜伏肌生长抑制素序列、其变体和生成潜伏肌生长抑制素的方法在本领域中是公知的且更详细地描述于本文中。
人、大鼠、小鼠和食蟹猴中的示例性proGDF8序列在下面提供。在这些proGDF8序列中，前体蛋白转化酶切割位点以黑体指示和tolloid蛋白酶位点通过加下划线指示。在一些实施方式中，前体蛋白转化酶切割位点包含SEQ ID NO:52-55的氨基酸残基240-243。在一些实施方式中，tolloid蛋白酶位点包含SEQ ID NO:52-55的氨基酸残基74-75。应当理解，本文中提供的示例性proGDF8序列不旨在是限制性的，且来自其它物种的另外的proGDF8序列(包括其任何异形体)在本公开的范围内。
proGDF8(人)：
Figure SMS_2
proGDF8(大鼠)：
Figure SMS_3
proGDF8(小鼠)：
Figure SMS_4
proGDF8(食蟹猴)：
Figure SMS_5
肌生长抑制素和GDF11在其成熟生长因子结构域之间共有相对高的保守性水平，具有90％的同一性，但在其前结构域区域中保守性低得多，在这两者之间具有低于50％的氨基酸同一性。肌生长抑制素和GDF11结合由与II型受体(ACTRIIA/B)结合的I型受体(ALK4/5)组成的相同受体并通过其发信号。肌生长抑制素与I型和II型受体的啮合启动导致SMAD磷酸化和肌肉萎缩基因的转录激活的信号传导级联。成熟生长因子中相对高的保守性水平使得鉴定可以区分成熟肌生长抑制素和GDF11的试剂如单克隆抗体成为挑战。
在一些实施方式中，本文中提供了特异性地结合嵌合构建体的原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体，该嵌合构建体包含生长因子结构域和GDF11的N末端前肽部分和GDF8的前肽的C末端部分。这一嵌合构建体(如以下示出的)称为GDF11Arm8。
GDF11Arm8(SEQ ID NO:65)
MDMRVPAQLLGLLLLWFSGVLGDYKDDDDKHHHHHHLEVLFQGPAEGPAAAAAAAAAAAAAGVGGERSSRPAPSVAPEPDGCPVCVWRQHSRELRLESIKSQILSKLRLKEAPNISREVVKQLLPKAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETIITMPTESDFLMQVDGKPKCCFFKFSSKIQYNKVVKAQLWIYLRPVETPTTVFVQILRLIKPMKDGTRYTGIRSLKLDMNPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVTFPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRRNLGLDCDEHSSESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGQCEYMFMQKYPHTHLVQQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNDKQQIIYGKIPGMVVDRCGCS
肌生长抑制素在肌肉内稳态和代谢调节中的作用
骨骼肌占到体重的大约40％且是动态器官，以每天1-2％的速率更新。肌生长抑制素据信在健康和疾病两种状况中维持肌肉内稳态中发挥关键作用。肌生长抑制素能够通过抑制成肌细胞增殖、提高泛素-蛋白酶体活性和下调IGF-Akt途径的活性来诱导肌萎缩。这些公认的作用在多种肌萎缩引起的情况中看到，包括损伤、如恶病质的疾病、失用和太空飞行，从而证明肌生长抑制素信号传导机制的重要性。基于这种中心作用，已经进行了大量工作以抑制体内肌生长抑制素的作用。事实上，拮抗肌生长抑制素信号传导已经显示有利于肌肉生长/增加。
另外，已知肌肉是身体的主要蛋白质库且因此有助于氨基酸体内平衡。连同葡萄糖(在肝和肌肉中主要作为糖元产生和储存)和脂质(在脂肪组织中储存)一起，肌肉中的蛋白质可以作为能量源发挥作用(即，分解以产生能量)。身体中这些能量库的利用或动员的损害或不平衡可以至少部分地成为各种类型的代谢失调的基础。因此，设想的是肌生长抑制素可以通过协调身体中葡萄糖、脂肪和/或肌肉的分解vs.合成/储存之间的平衡而在代谢的调节中发挥直接作用。事实上，尽管肌生长抑制素自从在1997年被发现以来主要被认为是肌肉生长/损失的关键调节子，本文中更详细地给出的发现表明肌生长抑制素作为代谢调节剂的更广泛作用。
肌生长抑制素途径抑制
在针对肌肉相关病症的治疗的各个阶段的临床开发中存在着几种肌生长抑制素途径拮抗剂，如小分子、抗体或其抗原结合部分和基因疗法。这样的途径拮抗剂靶向成熟生长因子或其II型受体。值得注意的是，这些抑制剂中大多数不是肌生长抑制素特异性的，使得它们拮抗多个TGFβ家族成员的信号传导。例如，多种当前的临床候选物阻断另外的生长因子，如激活素A、GDF11及BMP9和10，其分别是生殖生物学、伤口愈合、红细胞生成和血管生成的调节剂。本公开的方面涉及别处描述的这些肌生长抑制素拮抗剂中观察到的特异性的缺乏可能由于它们阻断肌生长抑制素之外的另外的生物学途径(如以上所列的那些)而对某些患者群体造成更大风险的认识。因此这可能由于不可接受的副作用如异常出血、作品愈合或通过脱靶抗体结合引起的生殖问题而潜在地限制可以安全地进行治疗的患者群体(Campbell等Muscle Nerve(2016)；David,L.,Blood 109,1953-1961(2007))。例如，激活素A涉及伤口愈合和生殖生物学两者，且因此与激活素A的结合将限制在最近经历手术或损伤的患者中或在生殖年龄的妇女中的使用。不良反应或毒性的这种提高的风险可以特别地考虑是否i)患者群体需要长期治疗(如慢性病症)；和/或ii)患者群体是或包括儿科患者，其可能易发生这类不良反应和/或毒性。因此，本发明包括以潜在更高的安全性特征在体内抑制肌生长抑制素信号传导的新途径。
因此，本文提供了能够结合原肌生长抑制素和/或潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂如抗体或其抗原结合片段，从而抑制肌生长抑制素激活，及其用于治疗与肌病相关的疾病和障碍的用途。在一些实施方式中，鉴于潜伏复合物在循环中的普遍性，本文中提供了特异性地靶向更丰富的和更长寿的肌生长抑制素前体(例如，原肌生长抑制素和潜伏肌生长抑制素)而非成熟生长因子的治疗。不希望局限于任何特定理论，本文中提供的肌生长抑制素抑制剂如抗体或其抗原结合片段可以防止原肌生长抑制素和/或潜伏肌生长抑制素蛋白水解激活成能够激活肌生长抑制素途径(例如，通过结合I型(ALK4/5)和II型(ACTRIIA/B)受体)的成熟肌生长抑制素(其被认为是肌生长抑制素的“活性”形式)。
本文使用的术语“原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素”是指原肌生长抑制素、潜伏肌生长抑制素或两者。在一些实施方式中，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段特异性结合原肌生长抑制素。在一些实施方式中，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段特异性结合潜伏肌生长抑制素。在一些实施方式中，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段特异性结合潜伏肌生长抑制素和原肌生长抑制素两者。在优选的实施方式中，特异性地结合原肌生长抑制素和/或潜伏肌生长抑制素的抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段不结合成熟肌生长抑制素。在优选的实施方式中，特异性地结合原肌生长抑制素和/或潜伏肌生长抑制素的抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段不结合原/潜伏GDF11或成熟GDF11。
抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段及其产生
本公开至少部分地基于阻断肌生长抑制素的激活步骤而非靶向早已激活的肌生长抑制素可以提供在体内选择性地抑制肌生长抑制素信号传导的有利模式的意外发现。因此，本发明可以具有在其中体内肌生长抑制素信号传导的选择性降低有益的任何病症中作为治疗剂的用途。更具体地，本发明包括肌生长抑制素激活的特异性抑制可以不仅实现肌肉质量的增加而且实现增强的肌肉功能，以及防止代谢失调的令人惊异的发现。出人意料地，有益的治疗效果也可以在具有神经元和靶组织如靶肌肉之间受损的而非完全丧失的信号传导的受试者中甚至在病变之下获得。
抗体(可以以复数形式互换使用)是能够通过至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性地结合靶标(如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)的免疫球蛋白分子。抗体包括任何类别的抗体，如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或其亚类)，且抗体不需要是任何特定类别。取决于抗体重链恒定域的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可以分配到不同类别。具有五个主要的免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且这些类别中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于免疫球蛋白的不同类别的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的。
本文所述的抗体或其抗原结合片段能够结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素，从而抑制原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素蛋白水解激活成为成熟肌生长抑制素。在一些情况中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可以抑制原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的蛋白水解激活至少20％，例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。在一些情况中，本文所述的抗体可以抑制前体蛋白转化酶(例如，弗林蛋白酶)对原肌生长抑制素的蛋白水解切割至少20％，例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。在一些情况中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可以抑制tolloid蛋白酶(例如，mTLL2)对原肌生长抑制素或潜伏肌生长抑制素的蛋白水解切割至少20％，例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。
在一些实施方式中，原肌生长抑制素或潜伏肌生长抑制素通过tolloid蛋白酶的蛋白水解切割的抑制导致肌肉质量的逐步增加。在一些实施方式中，受试者表现出肌肉质量的逐步增加至少2周、4周、6周、8周、10周、12周、14周、16周、18周或20周(或被任何这些值包括的任何范围)。抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体的抑制性活性可以通过常规方法测量，例如，通过如WO 2016/073853公开的实施例1和图3中所描述的蛋白质印迹分析，该申请的全部内容明确地通过引用并入本文。但是，应理解，另外的方法可以用于测量抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体对原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的蛋白水解切割的抑制性活性。在一些实施方式中，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素切割(例如，通过前体蛋白转化酶和/或tolloid蛋白酶)的抑制可以反映为抑制常数(Ki)，其提供抑制剂效能的量度，且其是降低蛋白酶活性(例如，前体蛋白转化酶或tolloid蛋白酶的活性)一半所需的拮抗剂(例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体)的浓度且不依赖于酶或底物浓度。
在一些实施方式中，前体蛋白转化酶包含(i)水解包含前体蛋白转化酶切割位点的蛋白质的肽键的催化结构域，和(ii)结合具有前体蛋白转化酶切割位点的rTGF的结合口袋。根据本公开使用的前体蛋白转化酶的实例包括，但不限于PCSK5/6、PACE4、PACE7和PACE3(例如，弗林蛋白酶)。在一些实施方式中，前体蛋白转化酶获自(例如，纯化自)任何哺乳动物，包括但不限于人、猴或啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)。在另一个实施方式中，前体蛋白转化酶重组地产生。
在一些实施方式中，前体蛋白转化酶与选自以下的前体蛋白转化酶是同源的：PCSK5/6、PACE4、PACE7和PACE3(例如，弗林蛋白酶)。例如，前体蛋白转化酶可以与PCSK5/6、PACE4、PACE7或PACE3(例如，弗林蛋白酶)至少70％相同、至少80％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同、至少99.5％相同或至少约99.9％相同。
在一些实施方式中，前体蛋白转化酶切割位点是可以通过前体蛋白转化酶(例如，PCSK5/6、PACE4、PACE7和PACE3)切割的氨基酸序列。在一些实施方式中，前体蛋白转化酶切割位点包含氨基酸序列R-X-X-R，其中R是精氨酸和X是任何氨基酸。在一些实施方式中，前体蛋白转化酶切割位点包含氨基酸序列R-X-(K/R)-R，其中R是精氨酸，K是赖氨酸和X是任何氨基酸。在一些实施方式中，前体蛋白转化酶切割位点包含氨基酸序列R-V-R-R(SEQ IDNO:57)，其中R是精氨酸和V是缬氨酸。对于人、大鼠、小鼠和食蟹猴肌生长抑制素的示例性前体蛋白转化酶切割位点在SEQ ID NO:52-55中以黑体显示。在一些实施方式中，前体蛋白转化酶切割位点包含氨基酸序列RSRR(SEQ ID NO:56)。
在一些实施方式中，根据本公开使用的tolloid蛋白酶包括，但不限于BMP-1、mTLL-1和mTLL-2。tolloid蛋白酶可以获自任何哺乳动物，包括但不限于人、猴或啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)。在一些实施方式中，tolloid蛋白酶与选自以下的tolloid蛋白酶是同源的：BMP-1、mTLL-1和mTLL-2。例如，tolloid蛋白酶可以与BMP-1、mTLL-1和mTLL-2至少70％相同、至少80％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同、至少99.5％相同或至少约99.9％相同。
在一些实施方式中，tolloid蛋白酶切割位点是可以通过tolloid(例如，BMP-1、mTLL-1和mTLL-2)切割的氨基酸序列。对于人、大鼠、小鼠和食蟹猴肌生长抑制素的示例性tolloid蛋白酶切割位点在SEQ ID NO:52-55中加下划线显示。在一些实施方式中，tolloid切割位点包含氨基酸序列QR，其中Q是谷氨酰胺和R是精氨酸。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段能够结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素，从而抑制肌生长抑制素活性。在一些情况中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可以抑制肌生长抑制素信号传导至少20％，例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。在一些实施方式中，肌生长抑制素信号传导的抑制可以通过常规方法测量，例如，使用如WO 2016/073853中公开的实施例1中所述的肌生长抑制素激活分析，该申请的全部内容明确地通过引用并入本文。但是，应理解，另外的方法可以用于测量肌生长抑制素信号传导活性。
应理解，肌生长抑制素通过，例如，前体蛋白转化酶和/或tolloid蛋白酶的蛋白水解切割的程度可以使用任何合适的方法测量和/或定量。在一些实施方式中，肌生长抑制素的蛋白水解切割的程度使用酶联免疫吸附分析(ELISA)测量和/或定量。例如，ELISA可以用于测量释放的生长因子(例如，成熟肌生长抑制素)的水平。作为另一实例，特异性地结合原肌生长抑制素、潜伏肌生长抑制素和/或成熟肌生长抑制素的抗体或其抗原结合片段可以用于ELISA中以测量肌生长抑制素的特定形式(例如，原/潜伏/成熟-肌生长抑制素)的水平，从而定量肌生长抑制素的蛋白水解切割的程度。在一些实施方式中，肌生长抑制素的蛋白水解切割的程度使用免疫沉淀接着胰蛋白酶肽的SDS-PAGE或质谱、基于萦光各向异性的技术、FRET分析、氢-氘交换质谱和/或NMR谱来测量和/或定量。
在一些实施方式中，抗体，也称为免疫球蛋白，是由各大约25kDa的两条轻链(L)和各大约50kDa的两条重链(H)构成的四聚糖基化蛋白质。抗体中可以发现两种类型的轻链，称为λ和κ。取决于重链恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分配到五个主要类别：A、D、E、G和M，且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。各轻链通常包括N-末端可变(V)结构域(VL)和恒定(C)结构域(CL)。各重链通常包括N-末端V结构域(VH)、三个或四个C结构域(CH1-3)和铰链区。最接近于VH的CH结构域命名为CH1。VH和VL结构域由称为框架区的具有相对保守序列的四个区(FR1、FR2、FR3和FR4)(其形成用于具有超变序列的三个区(互补决定区，CDR)的骨架)组成。CDR包含大多数负责抗体与抗原的特异性相互作用的残基。CDR称为CDR1、CDR2和CDR3。因此，重链上的CDR成分称为CDRH1、CDRH2和CDRH3，而轻链上的CDR成分称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。CDR通常指Kabat CDR，如Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Department of Health andHuman Services(1991),eds.Kabat等中所述的。用于表征抗原结合位点的另一标准被称为由Chothia描述的超变环。参见，例如，Chothia,D.等(1992)J.Mol.Biol.227:799-817；和Tomlinson等(1995)EMBO J.14:4628-4638。再另一标准是Oxford Molecular’s AbM抗体建模软件使用的AbM定义。一般参见例如，Protein Sequence and Structure Analysis ofAntibody Variable Domains.In:Antibody Engineering Lab Manual(Ed.:Duebel,S和Kontermann,R.,Springer-Verlag,Heidelberg)。针对Kabat CDR描述的实施方式可以替代地使用相对于Chothia超变环或AbM-定义的环或者这些方法中的任何组合所描述的相似关系实施。
适合用于本发明的方法中的抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段包括国际专利申请No.PCT/US15/59468和PCT/US16/52014中描述的那些。前述申请各自的全部内容通过引用全文合并于此。
在一些实施方式中，本公开的抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段及编码抗体或其抗原结合片段的本公开的核酸分子包括表1-3中所示的CDR氨基酸序列。
表1.
Figure SMS_6
Figure SMS_7
在表1中，CDRH3和CDRL3的单一序列反映Kabat和IMGT。
表2.
Figure SMS_8
Figure SMS_9
Figure SMS_10
Figure SMS_11
Figure SMS_12
表3
Figure SMS_13
Figure SMS_14
Figure SMS_15
Figure SMS_16
Figure SMS_17
在一些实施方式中，本公开的抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分包括任何抗体或其抗原结合片段，其包括CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3，或者其组合，如对于表1-3中所示的任一抗体提供的。在一些实施方式中，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分包含表1-3中所示的任一抗体的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3。本公开也包括编码包含如对于表1-3中所示的任一抗体提供的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3的分子的任何核酸序列。抗体重链和轻链CDR3结构域在抗体对抗原的结合特异性/亲和力中可以发挥特别重要的作用。因此，本公开的抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分或者其核酸分子可以包括如表1-3中所示的抗体的至少重链和/或轻链CDR3。
本公开的方面涉及结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素蛋白且包含六个互补决定区(CDR)：CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3的单克隆抗体或抗原结合片段。
在一些实施方式中，CDRH1包含如SEQ ID NO:1-3中任一所示的序列。在一些实施方式中，CDRH2包含如SEQ ID NO:4-9中任一所示的序列。在一些实施方式中，CDRH3包含如SEQ ID NO:10-11、66、71、76、81、86、91、96、101、106和111中任一所示的序列。CDRL1包含如SEQ ID NO:12-17中任一所示的序列。在一些实施方式中，CDRL2包含如SEQ ID NO:18-21中任一所示的序列。在一些实施方式中，CDRL3包含如SEQ ID NO:22-23、67、72、77、82、87、92、97、102、107和112中任一所示的序列。
在一些实施方式中(例如，对于表1中所示的抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体Ab1或其抗原结合部分)，CDRH1包含如SEQ ID NO:1或2中所示的序列，CDRH2包含如SEQ ID NO:4或5中所示的序列，CDRH3包含如SEQ ID NO:10中所示的序列，CDRL1包含如SEQID NO:12或13中所示的序列，CDRL2包含如SEQ ID NO:18或19中所示的序列，和CDRL3包含如SEQ ID NO:22中所示的序列，且该抗体或其抗原结合部分结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素。
在一些实施方式中(例如，对于表1中所示的抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体Ab2或其抗原结合部分)，CDRH1包含如SEQ ID NO:1或2中所示的序列，CDRH2包含如SEQ ID NO:4或5中所示的序列，CDRH3包含如SEQ ID NO:66中所示的序列，CDRL1包含如SEQID NO:12或13中所示的序列，CDRL2包含如SEQ ID NO:18或19中所示的序列，和CDRL3包含如SEQ ID NO:67中所示的序列，且该抗体或其抗原结合部分结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素。
在一些实施方式中(例如，对于表1中所示的抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体Ab3或其抗原结合部分)，CDRH1包含如SEQ ID NO:1或3中所示的序列，CDRH2包含如SEQ ID NO:6或7中所示的序列，CDRH3包含如SEQ ID NO:11中所示的序列，CDRL1包含如SEQID NO:14或15中所示的序列，CDRL2包含如SEQ ID NO:20或21中所示的序列，和CDRL3包含如SEQ ID NO:23中所示的序列，且抗体或其抗原结合部分结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素。
在一些实施方式中(例如，对于如表1中所示抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体Ab5或其抗原结合部分)，CDRH1包含如SEQ ID NO:1或3中所示的序列，CDRH2包含如SEQ ID NO:8或9中所示的序列，CDRH3包含如SEQ ID NO:11中所示的序列，CDRL1包含如SEQID NO:16或17中所示的序列，CDRL2包含如SEQ ID NO:20或21中所示的序列，和CDRL3包含如SEQ ID NO:23中所示的序列，且抗体或其抗原结合部分结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素。
在一些实例中，本公开的任何抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分包括具有与CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和/或CDRL3基本上相似的一个或多个CDR(例如，CDRH或CDRL)序列的任何抗体或抗原结合片段。例如，抗体可以包括与SEQID NO:1-23、66、67、71、72、76、77、81、82、86、87、91、92、96、97、101、102、106、107、111和112任一中的对应CDR区相比包含最多5、4、3、2或1个氨基酸残基变异的如表1中所示的一个或多个CDR序列(SEQ ID NO:1-23、66、67、71、72、76、77、81、82、86、87、91、92、96、97、101、102、106、107、111和112)。
在一些实施方式中，本公开的抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分包括包含SEQ ID NO:24-29、73、78、83、88、93、98、103、108和113任一的重链可变域或SEQ ID NO:30-35、74、79、84、89、94、99、104、109和114任一的轻链可变域的任何抗体。在一些实施方式中，本公开的抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分包括包含SEQ ID NO:24和30；25和31；26和32；27和33；28和34；或29和35的重链可变和轻链可变对的任何抗体。
本公开的方面提供了具有与本文所述任何重链可变和/或轻链可变氨基酸序列同源的重链可变和/或轻链可变氨基酸序列的抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分。在一些实施方式中，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:24-29、73、78、83、88、93、98、103、108和113中任一的重链可变序列或SEQ ID NO:30-35、74、79、84、89、94、99、104、109和114中任一的轻链可变序列至少75％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)相同的重链可变序列或轻链可变序列。在一些实施方式中，同源重链可变和/或轻链可变氨基酸序列在本文提供的任何CDR序列内不改变。例如，在一些实施方式中，序列变异的程度(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)可以存在于除本文提供的任何CDR序列以外的重链可变和/或轻链可变序列中。
两个氨基酸序列的“百分同一性”使用Karlin和AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990的算法(如在Karlin和AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993中改进的)确定。这种算法整合在Altschul等J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)中。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序，评分＝50，字长＝3进行以获得与目标蛋白质分子同源的氨基酸序列。在两个序列之间存在空位的情况中，带空位BLAST可以如Altschul等,Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1997中所述使用。当采用BLAST和带空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
在一些实施方式中，保守突变可以在如基于晶体结构确定的其中残基不太可能参与与原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的相互作用的位置处引入CDR或框架序列中。如本文中使用的，“保守氨基酸置换”是指不改变进行氨基酸置换的蛋白质的相对电荷和大小特征的氨基酸置换。变体可以按照本领域技术人员已知用于改变多肽序列的方法制备，如在汇编这样的方法的参考文献中发现的，例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook等,eds.,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,New York,1989,或Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等,eds.,John Wiley&Sons,Inc.,New York。氨基酸的保守置换包括在以下组中的氨基酸之间进行的置换：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；和(g)E、D。
在一些实施方式中，本文中提供的抗体或其抗原结合片段包含对抗体或其抗原结合片段赋予所需性质的突变。例如，为避免由于Fab-臂交换(其已知对于原始IgG4 mAb发生)导致的潜在并发症，本文中提供的抗体或其抗原结合片段可以包含稳定的“Adair”突变(Angal S.等,“A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity ofchimeric mouse/human(IgG4)抗体”,Mol Immunol 30,105-108；1993)，其中丝氨酸228(EU编号；残基241Kabat编号)转换为脯氨酸，导致IgG1-样(CPPCP(SEQ ID NO:58))铰链序列。因此，任何抗体可以包括稳定的“Adair”突变或氨基酸序列CPPCP(SEQ ID NO:58)。
本公开的抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分可以任选地包含抗体恒定区或其部分。例如，VL结构域可以在其C-末端连接于轻链恒定域如Cκ或Cλ。类似地，VH结构域或其部分可以连接于所有或部分重链，如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，及任何同种型亚类。抗体可以包括合适的恒定区(参见，例如，Kabat等,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,No.91-3242,National Institutes of HealthPublications,Bethesda,Md.(1991))。因此，本公开范围内的抗体可以包括与任何合适的恒定区组合的VH和VL结构域或其抗原结合部分。
在某些实施方式中，VH和/或VL结构域可以回复为种系序列，例如，这些结构域的FR使用常规分子生物学技术突变以匹配通过种系细胞产生的那些。例如，VH和/或VL结构域可以分别回复为IgHV3-30(SEQ ID NO:36)和/或IgLV1-44(SEQ ID NO:37)的种系序列。应理解，任何VH和/或VL结构域可以回复为任何合适的种系序列。在其它实施方式中，FR序列保持相异于共有种系序列。
IgHV3-30
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:36)
IgLV1-44
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNG(SEQ ID NO:37)
在一些实施方式中，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或抗原结合片段可以包括或不包括SEQ ID NO:24-35所示的抗体的框架区。在一些实施方式中，抗-原-潜伏肌生长抑制素抗体是鼠抗体且包括鼠框架区序列。
在一些实施方式中，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段可以以相对高的亲和力结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素，例如，低于10-6M、10- 7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或更低的Kd。例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段可以以5pM和500nM之间，例如，50pM和100nM之间，例如，500pM和50nM之间的亲和力结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素。本发明也包括与本文所述的任何抗体竞争结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素且具有50nM或更低(例如，20nM或更低、10nM或更低、500pM或更低、50pM或更低或者5pM或更低)的亲和力的抗体或抗原结合片段。抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体的亲和力和结合动力学可以使用任何合适的方法测试，包括但不限于生物传感器技术(例如，OCTET或BIACORE)。
在一些实施方式中，本文公开了特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，本文中提供的任何抗体或其抗原结合片段结合在原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的tolloid切割位点处或附近或者tolloid对接位点处或附近。在一些实施方式中，如果抗体结合在tolloid切割位点或tolloid对接位点的15个或更少氨基酸残基内，则抗体结合在tolloid切割位点附近或tolloid对接位点附近。在一些实施方式中，本文中提供的任何抗体或其抗原结合片段结合在tolloid切割位点或tolloid对接位点的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基内。在一些实施方式中，抗体结合在GDF8的tolloid切割位点处或附近。例如，抗体可以结合如SEQ IDNO:62PKAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHAT(SEQ ID NO:62)中所示的氨基酸序列。在其它实施方式中，本文中提供的任何抗体或其抗原结合片段结合在原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的前体蛋白转化酶切割位点处或附近或者前体蛋白转化酶对接位点处或附近。在一些实施方式中，如果抗体结合在前体蛋白转化酶切割位点或前体蛋白转化酶对接位点的15个或更少个氨基酸残基内，则抗体结合在前体蛋白转化酶切割位点附近或前体蛋白转化酶对接位点附近。在一些实施方式中，本文中提供的任何抗体或其抗原结合片段结合在前体蛋白转化酶切割位点或前体蛋白转化酶对接位点的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基内。在一些实施方式中，抗体结合在GDF8的前体蛋白转化酶切割位点处或附近。例如，抗体可以结合SEQ ID NO:63(GLNPFLEVKVTDTPKRSRRDFGLDCDEHSTESRC)中所示的氨基酸序列。
在一个实例中，本文所述的抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段与其它形式的肌生长抑制素和/或生长因子的TGFβ家族的其它成员相比特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素。生长因子的TGFβ家族的成员包括，但不限于AMH、ARTN、BMP10、BMP15、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8A、BMP8B、GDF1、GDF10、GDF11、GDF15、GDF2、GDF3、GDF3A、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF9、GDNF、INHA、INHBA、INHBB、INHBC、INHBE、LEFTY1、LEFTY2、NODAL、NRTN、PSPN、TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3蛋白。这样的抗体或其抗原结合片段可以以与生长因子的TGFβ家族的其它成员相比高得多的亲和力(例如，高至少2-倍、5-倍、10-倍、50-倍、100-倍、200-倍、500-倍或1,000-倍)结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素。在一些实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段可以以与生长因子的TGFβ家族的其它成员相比高至少000倍的亲和力结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素。在一些实施方式中，本文中提供的抗体或其抗原结合片段可以以与一种或多种形式的GDF11或成熟肌生长抑制素相比高得多的亲和力(例如，高至少2-倍、5-倍、10-倍、50-倍、100-倍、200-倍、500-倍或1,000-倍)结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素。在一些实施方式中，本文中提供的抗体或其抗原结合片段可以以与一种或多种形式的GDF11(例如，proGDF11、潜伏GDF11或成熟GDF11)或成熟肌生长抑制素相比高至少1,000倍的亲和力结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素。可选地或另外地，抗体或其抗原结合片段可以表现出与TGFβ家族的其它成员如原/潜伏GDF11相比高得多(例如，高至少2-倍、5-倍、10-倍、50-倍、100-倍、200-倍、500-倍、1,000-倍)的针对原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的蛋白水解切割(例如，通过前体蛋白转化酶或tolloid蛋白酶)的抑制性活性。在另一个实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段不结合GDF11。这避免了与具有与肌生长抑制素和GDF11两者的交叉反应性的抗体相关的潜在毒性问题。
在一些实施方式中，抗体结合抗原但不能有效地从血浆消除抗原。因此，在一些实施方式中，血浆中抗原的浓度可以通过减少抗原的清除而提高。但是，在一些实施方式中，本文提供的抗体(例如，清扫抗体)具有对pH敏感的对抗原的亲和力。这样的pH敏感抗体可以在中性pH下与血浆中的抗原结合且在酸性内体中与抗原解离，因此减少抗体-介导的抗原累积和/或促进抗原从血浆清除。
本公开的方面涉及清扫抗体。如本文中使用的，“清扫抗体”或其抗原结合片段是指具有pH-敏感的抗原结合和在中性或生理pH下与细胞表面新生Fc受体(FcRn)的至少阈值水平的结合两者的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，清扫抗体或其抗原结合部分在中性pH下结合新生Fc受体FcRn。例如，清扫抗体可以在7.0-7.6范围的pH下结合FcRn。在一些实施方式中，清扫抗体或其抗原结合部分可以在抗原结合位点处结合抗原和通过抗体的Fc部分结合细胞FcRn。在一些实施方式中，清扫抗体或其抗原结合部分然后可以中和，从而在酸性内体(其可以被降解)中释放抗原。在一些实施方式中，不再与抗原结合的清扫抗体或其抗原结合部分然后可以通过细胞释放(例如，通过胞吐作用)返回到血清中。
在一些实施方式中，(例如，受试者的)血管内皮中的FcRn延长清扫抗体或其抗原结合部分的半衰期。在一些实施方式中，血管内皮细胞内化清扫抗体或其抗原结合部分，其在一些实施方式中结合抗原如肌生长抑制素(例如，原肌生长抑制素、潜伏肌生长抑制素或激发的(primed)肌生长抑制素)。在一些实施方式中，清扫抗体或其抗原结合部分再循环回到血流中。在一些实施方式中，清扫抗体或其抗原结合部分与其常规对应物相比具有增加的半衰期(例如，在受试者的血清中)。在一些实施方式中，清扫抗体的常规对应物是指清扫抗体或其抗原结合部分所衍生(例如，在对常规抗体的Fc部分工程化而在pH7下以更高的亲和力结合之前)的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方式中，清扫抗体或其抗原结合部分在受试者的血清中具有与其常规对应物相比长至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、35％、50％、75％、100％、150％、200％或250％的半衰期。
在一些实施方式中，清扫抗体的Fc部分结合FcRn。在一些实施方式中，清扫抗体的Fc部分在pH 7.4下以10-3M-10-8M范围的Kd结合FcRn。在一些实施方式中，清扫抗体在pH7.4下以10-3M-10-7M，10-3M-10-6M，10-3M-10-5M，10-3M-10-4M，10-4M-10-8M，10-4M-10-7M，10-4M-10-6M，10-4M-10-5M，10-5M-10-8M，10-5M-10-7M，10-5M-10-6M，10-6M-10-8M，10-6M-10-7M或10-7M-10-8M范围的Kd结合FcRn。在一些实施方式中，FcRn结合于清扫抗体的CH2-CH3铰链区。在一些实施方式中，FcRn结合与蛋白A或蛋白G相同的区域。在一些实施方式中，FcRn结合与FcγR不同的结合位点。在一些实施方式中，清扫抗体Fc区的氨基酸残基AA是与FcRn结合所需要的。在一些实施方式中，清扫抗体Fc区的氨基酸残基AA影响与FcRn的结合。
在一些实施方式中，本文中提供的任何抗体或其抗原结合片段经工程化而以较高亲和力结合FcRn。在一些实施方式中，本文中提供的任何抗体或其抗原结合片段经工程化而在pH 7.4下以较高亲和力结合FcRn。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段对FcRn的亲和力提高以与其常规对应物相比扩展其药代动力学(PK)性质。例如，在一些实施方式中，清扫抗体由于其在较低剂量下的功效而引起较少的不良反应。在一些实施方式中，清扫抗体或其抗原结合部分以较低频率施用。在一些实施方式中，清扫抗体或其抗原结合部分转胞吞到某些组织类型增加。在一些实施方式中，清扫抗体或其抗原结合部分增强经胎盘递送的效率。在一些实施方式中，清扫抗体或其抗原结合部分以较低成本产生。
在一些实施方式中，本文中提供的任何抗体或其抗原结合片段经工程化而以较低亲和力结合FcRn。在一些实施方式中，本文中提供的任何抗体或其抗原结合片段经工程化而在pH 7.4下以较低亲和力结合FcRn。在一些实施方式中，清扫抗体或其抗原结合部分对FcRn的亲和力降低以与其常规对应物相比缩短其药代动力学(PK)性质。例如，在一些实施方式中，对于成像和/或放射免疫疗法，清扫抗体或其抗原结合部分更快速地清除。在一些实施方式中，清扫抗体或其抗原结合部分作为自身免疫性疾病的治疗促进内源病原性抗体的清除。在一些实施方式中，清扫抗体或其抗原结合部分降低不良妊娠结果(其可以通过母源的胎儿特异性抗体的经胎盘转运引起)的风险。
在一些实施方式中，清扫抗体或其抗原结合部分在与中性或生理pH(例如，pH7.4)相比的低pH下具有对于抗原的降低的亲和力。在一些实施方式中，清扫抗体或其抗原结合部分在与生理pH(例如，pH7.4)相比的酸性pH(例如，5.5-6.5范围的pH)下具有对于抗原的降低的亲和力。
应理解，本文中提供的任何抗体或其抗原结合片段可以经工程化以根据pH的变化与抗原解离(例如，pH敏感抗体)。在一些实施方式中，本文中提供的清扫抗体或其抗原结合部分经工程化而以pH依赖性的方式结合抗原。在一些实施方式中，本文中提供的清扫抗体或其抗原结合部分经工程化而以pH依赖性的方式结合FcRn。在一些实施方式中，本文中提供的清扫抗体或其抗原结合部分通过胞吞内化。在一些实施方式中，本文提供的清扫抗体或其抗原结合部分通过FcRn结合内化。在一些实施方式中，胞吞的清扫抗体或其抗原结合部分在内体中释放抗原。在一些实施方式中，清扫抗体或其抗原结合部分重循环回到细胞表面。在一些实施方式中，清扫抗体保持连接于细胞。在一些实施方式中，胞吞的清扫抗体或其抗原结合部分重循环回到血浆。应理解，本文中提供的任何抗体或其抗原结合片段的Fc部分可以工程化以具有不同的FcRn结合活性。在一些实施方式中，FcRn结合活性影响抗原被清扫抗体清除的清除时间。在一些实施方式中，清扫抗体可以是长效或速效的清扫抗体。
在一些实施方式中，将常规治疗抗体或其抗原结合部分转化成清扫抗体或其抗原结合部分降低了有效剂量。在一些实施方式中，将常规治疗抗体或其抗原结合部分转化成清扫抗体或其抗原结合部分降低有效剂量至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施方式中，将常规治疗抗体或其抗原结合部分转化成清扫抗体或其抗原结合部分降低有效剂量至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、50倍或100倍。
在一些实施方式中，选择用于治疗的清扫抗体或其抗原结合部分的适宜剂量可以经验地进行。在一些实施方式中，高剂量的清扫抗体或其抗原结合部分可以饱和FcRn，导致稳定血清中的抗原而不内化的抗体。在一些实施方式中，低剂量的清扫抗体或其抗原结合部分可能不是治疗有效的。在一些实施方式中，清扫抗体或其抗原结合部分一天一次、一周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每6周一次、每8周一次、每10周一次、每12周一次、每16周一次、每20周一次或每24周一次施用。
在一些实施方式中，本文中提供的任何抗体或其抗原结合片段可以以修饰或工程化而成为清扫抗体。在一些实施方式中，本文中提供的任何抗体或其抗原结合片段可以使用任何合适的方法转化成清扫抗体。例如，用于制备清扫抗体或其抗原结合部分的合适的方法之前已经在Igawa等,(2013)“Engineered Monoclonoal Antibody with NovelAntigen-Sweeping Activity In vivo”,PLoS ONE 8(5):e63236；和Igawa等,“pH-dependent antigen-binding antibodies as a novel therapeutic modality”,Biochimica et Biophysica Acta 1844(2014)1943-1950中描述；其各自的内容通过引用由此合并。但是，应当理解，用于制备本文提供的清扫抗体或其抗原结合部分的方法不意味着是限制性的。因此，用于制备清扫抗体或其抗原结合部分的另外的方法在本公开的范围内。
本公开的一些方面是基于本文中提供的任何抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段的亲和力(例如，作为Kd表示的)对于pH的改变敏感的认识。在一些实施方式中，本文中提供的抗体或其抗原结合片段在相对低的pH(例如，4.0-6.5范围的pH)下与相对高的pH(例如，7.0-7.4范围的pH)相比具有与原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素结合的提高的Kd。在一些实施方式中，本文中提供的抗体或其抗原结合片段在pH为4.0-6.5时具有10-3M、10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M范围的与原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素结合的Kd。在一些实施方式中，本文中提供的抗体或其抗原结合片段在pH为7.0-7.4时具有10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M范围的与原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素结合的Kd。在一些实施方式中，本文中提供的抗体或其抗原结合片段在4.0-6.5的pH下与7.0-7.4的pH相比具有高至少2倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍、至少5000倍或至少10000倍的与原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素结合的Kd。
在一些实施方式中，本文提供了不特异性地结合如(SEQ ID NO:64)所示的氨基酸序列内的表位的原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，本文中提供的原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段不与国际专利申请公开No.WO 2016/098357的表2a、11a、11b或13中所述的抗体特异性地结合相同的表位，该国际专利申请公开于2016年6月23日且是基于2015年12月18日提交的国际专利申请No.PCT/JP2015/006323。在一些实施方式中，本文中提供的原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段不与国际专利申请公开No.WO 2016/098357的表2a、11a、11b或13中所述的抗体竞争或交叉竞争结合相同的表位，该国际专利申请公开于2016年6月23日且是基于2015年12月18日提交的国际专利申请No.PCT/JP2015/006323。在一些实施方式中，本文中提供的原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段不与包含国际专利申请公开No.WO 2016/098357的表2a、11a、11b或13中所述的VH和VL对的抗体特异性地结合相同的表位，该国际专利申请公开于2016年6月23日且是基于2015年12月18日提交的国际专利申请No.PCT/JP2015/006323。在一些实施方式中，本文中提供的原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段不与包含国际专利申请公开No.WO 2016/098357的表2a、11a、11b或13中所述的VH和VL对的抗体竞争或交叉竞争结合相同的表位，该国际专利申请公开于2016年6月23日且是基于2015年12月18日提交的国际专利申请No.PCT/JP2015/006323。
多肽
本公开的一些方面涉及具有选自以下的序列的多肽：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO 29。在一些实施方式中，多肽是可变重链结构域。在一些实施方式中，多肽与SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO 29中所示的任一氨基酸序列至少75％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一。
本公开的一些方面涉及具有选自以下的序列的多肽：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO 35。在一些实施方式中，多肽是可变轻链结构域。在一些实施方式中，多肽与SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO 35中所示的任一氨基酸序列至少75％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一。
与抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段竞争的抗体和抗原结合片段
本公开的方面涉及与本文提供的任何抗体或其抗原结合片段竞争或交叉竞争的抗体及其抗原结合片段。如本文中关于抗体使用的术语“竞争”意思是第一抗体以与第二抗体的结合充分相似的方式结合蛋白质(例如，潜伏肌生长抑制素)的表位，以使得第一抗体与其表位结合的结果在第二抗体的存在下与不存在第二抗体的情况下第一抗体的结合相比可检测地降低。其中第二抗体与其表位的结合也在第一抗体的存在下可检测地降低的替代方式可能是这种情况，但不必然是这种情况。也就是说，第一抗体可以抑制第二抗体与其表位的结合，而没有第二抗体抑制第一抗体与其相应表位的结合。但是，在各抗体可检测地抑制其它抗体与其表位或配体的结合(无论是以相同、较大或较小的程度)，抗体被称为彼此“交叉竞争”结合其相应的表位。竞争和交叉竞争的抗体两者在本公开的范围内。无论这类竞争或交叉竞争发生的机制(例如，立体位阻、构象变化或者与共同表位或其部分的结合)，本领域技术人员将理解，这样的竞争和/或交叉竞争抗体被包括在本文提供的方法和/或组合物且可以用于本文提供的方法和/或组合物。
本公开的方面涉及与本文提供的任何抗体或其抗原结合片段竞争或交叉竞争的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分结合在与本文提供的任何抗体相同的表位处或附近。在一些实施方式中，如果抗体或其抗原结合部分结合在表位的15个或更少的氨基酸残基内，则抗体或其抗原结合部分结合在表位附近。在一些实施方式中，本文中提供的任何抗体或其抗原结合片段结合在本文提供的任何抗体或其抗原结合片段所结合的表位的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基内。
在另一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分以低于10-6M的抗体和蛋白质之间的平衡解离常数Kd竞争或交叉-竞争结合本文中提供的任何抗原(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素)。在其它实施方式中，抗体或其抗原结合部分以10-11M-10-6M范围的Kd竞争或交叉-竞争结合本文中提供的任何抗原。
本公开的方面涉及与本文提供的任何抗体或其抗原结合片段竞争结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分在与本文提供的任何抗体或其抗原结合部分相同的表位处结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素。例如，在一些实施方式中，本文中提供的任何抗体结合在原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的tolloid切割位点处或附近或者tolloid对接位点处或附近。在其它实施方式中，本文中提供的任何抗体或其抗原结合片段结合在原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的前体蛋白转化酶切割位点处或附近或者前体蛋白转化酶对接位点处或附近。在另一实施方式中，抗体或其抗原结合部分以低于10-6M的抗体或其抗原结合部分与原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素之间的平衡解离常数Kd竞争结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素。在其它实施方式中，与本文中提供的任何抗体或其抗原结合部分竞争的抗体或其抗原结合部分以10-11M-10-6M范围的Kd结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素。
本文中提供的任何抗体或其抗原结合片段可以使用任何合适的方法表征。例如，一种方法是鉴别抗原与其结合的表位或“表位作图”。存在着许多用于定位和表征蛋白质上表位的位置的合适方法，包括解析抗体-抗原复合物的晶体结构、竞争分析、基因片段表达分析和基于合成肽的分析，如在例如，Harlow和Lane,Using Antibodies,a LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1999的第11章中所述的。在另外的实例中，表位作图可以用于确定抗体或其抗原结合部分与其结合的序列。表位可以是线性表位，即包含在单一氨基酸延伸链中，或由氨基酸的三维相互作用形成的构象表位，其可能不是必然包含在单一延伸链(初级结构线性序列)中。可以分离或合成(例如，重组地合成)变化长度(例如，至少4-6氨基酸长)的肽且用于与抗体的结合分析。在另一实例中，抗体或其抗原结合部分与其结合的表位可以通过使用源自目标抗原序列的重叠肽并测定抗体或其抗原结合部分的结合在系统筛选中确定。根据基因片段表达分析，编码目标抗原的开放阅读框随机地或通过特定遗传构建片段化且测定表达的抗原片段与待测试的抗体的反应性。例如，基因片段可以通过PCR产生和然后在放射性氨基酸的存在下在体外转录和翻译成蛋白质。抗体或其抗原结合部分与放射标记的抗原片段的结合然后通过免疫沉淀和凝胶电泳测定。某些表位也可以通过使用在噬菌体颗粒的表面上展示的随机肽序列的大文库(噬菌体文库)来鉴定。或者，重叠肽片段的限定文库可以在简单结合分析中测试与测试抗体或其抗原结合部分的结合。在另外的实例中，可以进行抗原结合结构域的诱变、结构域交换实验和丙氨酸扫描诱变以鉴定表位结合所需要的、足够的和/或必要的残基。例如，结构域交换实验可以使用其中原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素多肽的各个片段已经用来自密切相关的但抗原性上不同的蛋白质(如TGFβ蛋白家族的另一成员(例如，GDF11))的序列替代(交换)的目标抗原的突变体进行。通过评估抗体或其抗原结合部分与突变体原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的结合，可以评估特定抗原片段对抗体或其抗原结合部分结合的重要性。
或者，竞争分析可以使用已知结合相同抗原的其它抗体进行以确定是否抗体或其抗原结合部分结合与其它抗体或其抗原结合部分相同的表位。竞争分析是本领域技术人员公知的。
任何合适的方法，例如，本文中所述的表位作图方法，可以应用于确定是否抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分结合本文所述的原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素中的一个或多个特定残基/区段。此外，抗体或其抗原结合部分与原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素中的那些限定的残基中的一个或多个的相互作用可以通过常规技术测定。例如，可以确定晶体结构，且相应地可以测定原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素中的残基与抗体或其抗原结合部分中的一个或多个残基之间的距离。基于这种距离，可以确定是否原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素中的特定残基与抗体或其抗原结合部分中的一个或多个残基相互作用。此外，合适的方法如竞争分析和靶诱变分析可以应用于确定与另一靶标如突变体原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素相比候选抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分与原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的优先结合。
抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段的产生
多种方法可以用于获得本公开的抗体或其抗原结合片段。例如，抗体及其抗原结合片段可以使用重组DNA方法产生。单克隆抗体及其抗原结合片段也可以通过根据已知方法生成杂交瘤(参见，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature,256:495-499)来产生。以这种方式形成的杂交瘤然后使用标准方法，如酶联免疫吸附分析(ELISA)和表面等离子体共振(例如，OCTET或BIACORE)分析，进行筛选以鉴定产生特异性地结合指定抗原的抗体或其抗原结合部分的一种或多种杂交瘤。任何形式的指定抗原可以用作免疫原，例如，重组抗原、天然存在的形式、其任何变体或片段，以及其抗原性肽(例如，本文中描述为线性表位或在骨架内作为构象表位的任何表位)。制备抗体及其抗原结合部分的一种示例性的方法包括筛选表达抗体或其片段(例如，scFv)的蛋白质表达文库，例如，噬菌体或核糖体展示文库。噬菌体展示描述于，例如，Ladner等,U.S.专利No.5,223,409；Smith(1985)Science 228:1315-1317；Clackson等(1991)Nature,352:624-628；Marks等(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597WO92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690和WO 90/02809中。
除了使用展示文库外，指定的抗原(例如，原肌生长抑制素)可以用于免疫非人动物，例如，啮齿动物，例如，小鼠、仓鼠或大鼠。在一个实施方式中，非人动物是小鼠。
在另一个实施方式中，单克隆抗体从非人动物获得，和然后使用合适的重组DNA技术修饰，例如，嵌合。用于制备嵌合抗体的多种途径已经描述。参见例如，Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851,1985；Takeda等,Nature 314:452,1985,Cabilly等,U.S.专利No.4,816,567；Boss等,U.S.专利No.4,816,397；Tanaguchi等,欧洲专利公开EP171496；欧洲专利公开0173494,英国专利GB 2177096B。
对于另外的抗体产生技术，参见Antibodies:A Laboratory Manual,eds.Harlow等,Cold Spring Harbor Laboratory,1988。本公开不必然限制于抗体的任何特定的来源、生产方法或其它特殊的特征。
本公开的一些方面涉及用多核苷酸或载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以是原核或真核细胞。存在于宿主细胞中的多核苷酸或载体可以整合到宿主细胞的基因组中或其可以保持在染色体外。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，如细菌、昆虫、真菌、植物、动物或人细胞。在一些实施方式中，真菌细胞是，例如，酵母属的那些，特别是酿酒酵母种的那些。术语“原核的”包括可以用DNA或RNA分子转化或转染用于表达抗体或相应的免疫球蛋白链的所有细菌。原核宿主可以包括格兰氏阴性以及格兰氏阳性细菌如，例如，大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、粘质沙雷氏菌和枯草芽胞杆菌。术语“真核的”包括酵母、高等植物、昆虫和脊椎动物细胞，例如，哺乳动物细胞，如NSO和CHO细胞。取决于重组体产生过程中使用的宿主，多核苷酸编码的抗体或免疫球蛋白链可以糖基化或可以是非糖基化的。抗体或相应的免疫球蛋白链也可以包括起始甲硫氨酸氨基酸残基。
在一些实施方式中，一旦载体已经被并入适宜宿主中，宿主可以维持在适合于核苷酸序列的高水平表达的条件下，且按照需要，随后可以进行免疫球蛋白轻链、重链、轻/重链二聚体或完整抗体、抗原结合片段或其它免疫球蛋白形式的收集和纯化；参见Beychok,Cells of Immunoglobins Synthesis,Academic Press,N.Y.,(1979)。因此，多核苷酸或载体引入细胞中，其随后产生抗体或抗原结合片段。此外，包含前述宿主细胞的转基因动物，优选哺乳动物，可以用于抗体或抗体片段的大规模生产。
转化的宿主细胞可以在发酵器中生长并使用任何合适的技术培养以获得最佳细胞生长。一旦表达，全抗体、其二聚体、单个轻链和重链、其它免疫球蛋白形式或抗原结合片段可以按照本领域的标准过程纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱色谱、凝胶电泳等等；参见Scopes,"Protein Purification",Springer Verlag,N.Y.(1982)。抗体或抗原结合片段然后可以从生长培养基、细胞溶解产物或细胞膜部分分离。例如，细菌表达的抗体或抗原结合片段的分离和纯化可以是通过任何常规的方式，如，例如，制备性色谱分离和免疫分离，如涉及使用针对例如抗体的恒定区的单克隆或多克隆抗体的那些。
本公开的方面涉及杂交瘤，其提供无限延长的单克隆抗体来源。作为直接从杂交瘤的培养物获得免疫球蛋白的替代方式，永生化的杂交瘤细胞可以用作用于后续表达和/或遗传操作的重排的重链和轻链基因座的来源。重排的抗体基因可以从适宜的mRNA反转录以产生cDNA。在一些实施方式中，重链恒定区可以与不同同种型的重链恒定区交换或一起消除。可变区可以连接以编码单链Fv区。多个Fv区可以连接以赋予对超过一个靶标的结合能力或者可以采用嵌合的重链和轻链组合。任何适宜的方法可以用于抗体可变区的克隆和重组抗体及其抗原结合部分的产生。
在一些实施方式中，获得编码重链和/或轻链的可变区的适宜核酸并插入可以转染到标准重组宿主细胞中的表达载体中。可以使用多种这样的宿主细胞。在一些实施方式中，哺乳动物宿主细胞对于高效的加工和生产可能是有利的。可用于这一目的的典型哺乳动物细胞系包括CHO细胞、293细胞或NSO细胞。抗体或抗原结合片段的产生可以通过在适合于宿主细胞的生长和编码序列的表达的培养条件下培养修饰的重组宿主来进行。抗体或抗原结合片段可以通过将其从培养物分离来回收。表达系统可以设计为包括信号肽以使得所得抗体分泌到培养基中；但是，细胞内产生也是可能的。
本公开还包括编码本文所述的抗体的至少免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸。在一些实施方式中，该多核苷酸编码的可变区包含通过上述任一杂交瘤产生的抗体可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)。
编码抗体或抗原结合片段的多核苷酸可以是，例如，DNA、cDNA、RNA或者合成产生的DNA或RNA，或者包含单独或组合的任何这些多核苷酸的重组产生的嵌合核酸分子。在一些实施方式中，多核苷酸是载体的部分。这样的载体可以包含允许在合适的宿主细胞中和在合适的条件下选择载体的进一步的基因，如标记基因。
在一些实施方式中，多核苷酸操作性地连接表达控制序列而允许在原核或真核细胞中表达。多核苷酸的表达包括多核苷酸转录成可翻译的mRNA。确保在真核细胞(优选哺乳动物细胞)中的表达的调控元件是本领域技术人员公知的。它们可以包括促进转录起始的调控序列及任选地促进转录终止和转录物的稳定的聚-A信号。另外的调控元件可以包括转录以及翻译增强子和/或天然相关的或异源的启动子区域。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调控元件包括，例如，大肠杆菌中的PL、Lac、Trp或Tac启动子，且允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的实例是酵母中的AOX1或GAL1启动子或者在哺乳动物和其它动物细胞中的CMV-启动子、SV40-启动子、RSV-启动子(劳氏肉瘤病毒)、CMV-增强子、SV40-增强子或球蛋白内含子。
除了负责转录起始的元件外，这些调控元件还可以包括该多核苷酸下游的转录终止信号，如SV40-聚-A位点或tk-聚-A位点。此外，取决于所采用的表达系统，能够将多肽指引到细胞区室或将其分泌到培养基中的先导序列可以添加到多核苷酸的编码序列上并已经在之前描述。先导序列与翻译、起始和终止序列，及优选地能够指导翻译的蛋白质的或其部分分泌到例如细胞外基质中的先导序列以适当的相组装。任选地，可以使用编码包括赋予所需特性(例如，表达的重组产物的稳定或简化的纯化)的C-或N-末端鉴别肽的融合蛋白的异源多核苷酸序列。
在一些实施方式中，编码轻链和/或重链的至少可变结构域的多核苷酸可以编码两个免疫球蛋白链或仅一个免疫球蛋白链的可变结构域。同样地，多核苷酸可以在相同启动子的控制下或可以单独地控制用于表达。此外，一些方面涉及载体，特别地常规地用于遗传工程中的质粒、粘粒、病毒和噬菌体，其包含编码抗体或抗原结合片段的免疫球蛋白链的可变结构域的多核苷酸；任选地与编码抗体的另一免疫球蛋白链的可变结构域的多核苷酸结合。
在一些实施方式中，表达控制序列作为真核启动子系统提供在能够转化或转染真核宿主细胞的载体中，但也可以使用用于原核宿主的控制序列。源自病毒如逆转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体可以用于递送多核苷酸或载体到目标细胞群体中(例如，以对细胞进行工程化而表达抗体或抗原结合片段)。多种适宜的方法可用于构建重组病毒载体。在一些实施方式中，多核苷酸和载体可以重构到脂质体中用于递送到目标细胞。包含多核苷酸(例如，免疫球蛋白链的重链和/或轻链可变结构域的编码序列和表达控制序列)的载体可以通过合适的方法转移到宿主细胞中，该方法根据细胞宿主的类型而变化。
修饰
本公开的抗体和抗原结合片段可以用可检测的标记进行修饰，包括但不限于，酶、辅基、萦光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、正电子发射金属、非放射性顺磁性金属离子和用于检测和分离原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的亲和标记。可检测物质可以使用合适的技术直接地与本公开的多肽偶联或缀合或者通过中间体(如，例如，接头)间接地偶联或缀合。合适的酶的非限制性实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的非限制性实例包括链酶亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的萦光物质的非限制性实例包括生物素、伞形酮、萦光素、异硫氰酸萦光素、若丹明、二氯三嗪基胺萦光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；生物发光物质的非限制性实例包括萦光素酶、萤光素和水母发光蛋白；且合适的放射性物质的实例包括放射性金属离子，例如，α发射体或其它放射性同位素如，例如，碘(131I,125I,123I,121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115mIn,113mIn,112In,111In)和锝(99Tc,99mTc)、铊(201Ti)、镓(68Ga,67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、86R、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se和锡(113Sn,117Sn)。可检测物质可以使用合适的技术直接地与本公开的抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分偶联或缀合或者通过中间体(如，例如，接头)间接地偶联或缀合。与可检测物质缀合的抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分可以用于如本文中所述的诊断分析。
肌生长抑制素抑制剂如抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其抗原结合片段的生物学效应
本公开包括的肌生长抑制素抑制剂如抗体及其抗原结合片段可以用作在以有效量施用于受试者时在受试者中实现有益效果(例如，治疗效果)的药物。本文中提供了示例性的这类生物学有益的效果。受试者中有益的生物学效应可以通过施用如本文所述的特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)实现。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分以有效引起两种或更多种以下描述的生物学效应的量施用。在一些实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)以有效引起三种或更多种以下描述的生物学效应的量施用。在一些实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)以有效引起四种或更多种以下描述的生物学效应的量施用。在一些实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)以有效引起五种或更多种以下描述的生物学效应的量施用。在一些实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)以有效引起六种或更多种以下描述的生物学效应的量施用。在一些实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)以有效引起七种或更多种以下描述的生物学效应的量施用。在一些实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)以有效引起八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种或十六种以下描述的生物学效应的量施用。
A.对人受试者中肌肉组织的质量和/或功能的作用
特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高人受试者中肌肉组织的质量和/或功能。在一些实施方式中，肌肉组织选自平滑肌组织、骨骼肌组织和心肌组织。平滑肌组织由长锥形细胞(longtapering cell)构成，一般是不随意肌且在高得多的肌动蛋白/肌球蛋白比率、明显肌节的不存在和收缩到其静息长度的小得多的分数的能力方面不同于横纹肌。平滑肌细胞特别地在血管壁中、肠周围和子宫中发现。心肌组织是负责脊椎动物心脏的泵送活动的横纹但非随意组织。单个心肌细胞不一起融合成多核结构(如它们在横纹肌组织中)。骨骼肌组织处于随意控制中。肌肉纤维是合胞体的且包含肌原纤维，串联的肌节阵列。具有两个主要的骨骼肌纤维类型：根据其特定肌球蛋白重链(MHC)亚型的表达的慢收缩(I型)和快收缩(II型)。慢收缩肌肉的配置更利于有氧工作并帮助实现长程举动如长跑，而快收缩肌肉更快速地疲劳但其配置更利于无氧工作且用于强力的暴发运动如疾跑。慢收缩和快收缩肌肉纤维之间的区分是基于肌球蛋白三磷酸腺苷酶(ATPase)的组织化学染色和肌球蛋白重链的类型。慢收缩肌肉纤维(I型纤维)是MHC亚型I且三种快收缩亚型(II型纤维)是MHC亚型IIa、MHC亚型IId和MHC亚型IIb(S.Schiaffino,J.Muscle Res.Cell.Motil.,10(1989),pp.197-205)。在一些实施方式中，人受试者中快缩肌肉组织的质量和/或功能提高。在其它实施方式中，人受试者中慢收缩肌肉组织的质量和/或功能提高。
本文提供的有效量的药物组合物的生物学效应可以与肌肉纤维类型的表型改变相关，这是称为纤维类型转换的过程。在一些实施方式中，纤维类型转换通过如损伤和饥饿的事件触发。
在一个方面中，本公开提供了促进受试者的纤维类型转换的方法。该方法包括向受试者施用有效促进纤维类型转换的量的包含特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素并阻断成熟肌生长抑制素的释放的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的组合物，从而促进受试者的纤维类型转换。
在另一方面中，本公开提供了在受试者中相对于I型或慢缩肌纤维优先增加II型或快缩肌纤维的方法。该方法包括向受试者施用有效地相对于I型或慢缩肌纤维纤维类型转换优先增加II型或快缩肌纤维的量包含特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素并阻断成熟肌生长抑制素的释放的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的组合物，从而在受试者中相对于I型或慢缩肌纤维优先增加II型或快缩肌纤维。
在一些实施方式中，有效量的本文所述的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)施用于受试者可以引起肌肉质量的增加。优选地，肌肉质量的这种增加是临床上有意义的以有益于或以其它方式改善受试者的健康状态。例如，肌肉质量的临床上有意义的改变可以改善患者的活动性、自理、代谢等。在一些实施方式中，肌肉质量的增加是一个或多个瘦肌肉的增加。在一些实施方式中，肌肉质量的这种增加是系统性的效应，使得整个身体或基本上整个身体的肌肉显示可测量的效应。在其它实施方式中，效应局限于某些肌肉群/类型。在一些实施方式中，肌肉组织的质量，例如，瘦肌肉组织，增加至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，肌肉组织的质量，例如，瘦肌肉组织，增加至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。肌肉质量的这种增加可以通过任何合适的已知方法推导或测量，包括通过MRI测量截面积(例如，前臂截面)、测量周长、隔膜宽度(例如，通过超声)等。
在一些实施方式中，有效量的本文所述的抗体或其抗原结合片段施用于受试者可以引起肌肉功能的增强。肌肉功能可以通过多种量度评价，包括但不限于：力生成、握力(例如，最大握力)、耐力、肌肉氧化能力、动态握耐力等。在一些实施方式中，血清肌酐水平用作指示肌肉质量的经验证的生物标志物，尽管具有有限的灵敏度。
在一些实施方式中，肌肉组织的功能提高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，肌肉组织的功能提高至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。在一些实施方式中，提高的肌肉功能包括提高的评级，例如，从1至2、2至3、3至4、4至5、5至6、6至7、7至8、8至9或9至10。
在一些实施方式中，用于本发明的方法中的肌生长抑制素抑制剂，例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段可以提高遭受病变(例如，由于脊髓损伤)的受试者中肌肉组织的质量和/或功能。在一些实施方式中，受试者处于紧接在损伤后的脊髓损伤急性期中，其中完全和不完全损伤之间的诊断一般是困难的。在其它实施方式中，受试者处于脊髓损伤亚急性期，其中存在完全和不完全脊髓损伤之间的区别，且通过持续复健的恢复是可能的。在再另一实施方式中，受试者处于脊髓损伤慢性期。慢性SCI期存在于从损伤日起大约4或6个月，其中患者表现出恢复速率的显著降低，或者尽管具有持续的标准治疗尝试，此时复健努力达到平台。
在一些实施方式中，病变之下的肌肉组织的质量和/或功能在具有病变(例如，脊髓损伤)的受试者中提高。在其它实施方式中，病变之上的肌肉组织的质量和/或功能在具有病变(例如，脊髓损伤)的受试者中提高。在一些实施方式中，该肌肉选自比目鱼肌、腓肠肌、二头肌和三头肌。在一些实施方式中，肌肉组织的质量增加至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，肌肉组织的质量增加至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。在一些实施方式中，肌肉组织的功能提高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，肌肉组织的功能提高至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
在一些实施方式中，特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高人受试者的运动功能，例如，在具有病变的受试者中。在一些实施方式中，人受试者的运动功能提高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，人受试者的运动功能提高至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
在一些实施方式中，特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高人受试者的运动协调和平衡，例如，在具有病变的受试者中。在一些实施方式中，人受试者的运动协调和平衡提高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，人受试者的运动协调和平衡提高至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
在另一个实施方式中，特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高人受试者的肌肉强度，例如，在具有病变的受试者中。在一些实施方式中，人受试者的肌肉强度增加至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，人受试者的肌肉强度增加至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
在一些实施方式中，特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用可以引起的肌肉功能的临床上有意义的改变，其对应于患者的增强的功能性。在一些实施方式中，增强的功能性包括患者的活动性、自理、代谢等的改善。在一些实施方式中，有效量的特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用促进或加速从病症如损伤、手术和其它医学过程的恢复。合适的这类病症可以涉及与神经损害相关的状况(无论是否由损伤、手术和其它医学过程导致)。
例如，合适的受试者包括总体健康的个体，如其：i)维持涉及到影响肌肉功能的神经损害的急性损伤；ii)安排进行可能引起意外的神经损伤(例如，运动神经元损伤)的外科手术程序(治疗性或矫正性的)；iii)已经进行已经引起意外的肌肉功能障碍的外科手术程序；iv)接受包括特定肌肉或肌肉群的固定的治疗(例如，打石膏等)；v)使用呼吸机(例如，作为急性损伤的结果)的患者。本文所述的肌生长抑制素抑制剂的施用可以加速这些患者中的恢复。在一些实施方式中，这种施用可以是预防性的。例如，在进行可能引起神经损害和相关肌肉功能障碍的外科手术程序之前或紧接其后，该抗体可以施用以防止肌肉功能障碍。预防包括缓解或减轻这种功能障碍的严重性。在这些实施方式中，施用可以是在受影响区域(例如，损伤、手术等)的位点处或附近的局部施用。
B.对人受试者的代谢速率的作用
特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高人受试者的代谢速率。在一些实施方式中，有效量的这种肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用可提高受试者的基础代谢速率。代谢速率可以通过本领域已知的任何方法计算，例如，通过检查氧输入和二氧化碳输出，或通过间接测热法，如通过本申请的实施例11显示的。在一些实施方式中，代谢速率提高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，代谢速率提高至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
C.对人受试者的胰岛素敏感性的作用
特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高人受试者的胰岛素敏感性。用于测量胰岛素敏感性的方法是本领域中已知的，例如，葡萄糖耐量试验和空腹胰岛素或血糖试验。在葡萄糖耐量试验过程中，禁食患者口服75克剂量的葡萄糖，然后在随后两小时内测量血糖水平。低于7.8mmol/L(140mg/dl)的血糖被认为是正常的，7.8-11.0mmol/L(140-97mg/dl)的血糖被认为是糖耐量受损的(IGT)，和大于或等于11.1mmol/L(200mg/dl)的血糖被认为是糖尿病。对于空腹胰岛素试验，高于25mIU/L或174pmol/L的空腹血清胰岛素水平被认为是胰岛素抵抗。在一些实施方式中，代谢速率提高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，代谢速率提高至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
D.对人受试者中的脂肪组织水平的作用
特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用影响人受试者的脂肪组织水平。本文使用的术语“脂肪组织”是指包括储存脂肪的结缔组织的脂肪。脂肪组织来源于前体脂肪细胞。其主要作用是以脂质形式储存能量，虽然它也衬垫和绝缘身体。两种类型的脂肪组织是白色脂肪组织(WAT)(其储存能量)和棕色脂肪组织(BAT)(其产生身体热量)。
棕色脂肪组织(BAT)已知在响应于寒冷或过度进食的化学能量耗散中发挥功能，且也具有调节能量平衡的能力。棕色脂肪组织的活化已经显示改善人体中的葡萄糖体内平衡和胰岛素敏感性，表明具有受损的胰岛素功能的任何人可能受益于BAT活化(Stanford等,J Clin Invest.2013,123(1):215-223)。
米色脂肪组织作为WAT棕色化(也称为米色化)的结果而产生。这在WAT库内的脂肪细胞显现BAT的特征时发生。米色脂肪细胞呈现多泡外观(包含若干脂质小滴)并增加解偶联蛋白1(UCP1)的表达。在这种情况下，这些正常情况下储存能量的白色脂肪细胞变成能量释放脂肪细胞(Harms等Nature Medicine.2013,19(10):1252-63)。
内脏脂肪或腹部脂肪(也称为器官脂肪或腹内脂肪)位于腹腔内，填充在器官(胃、肝、肠、肾等)之间。内脏脂肪不同于皮肤下面的皮下脂肪和散置在骨骼肌中的肌内脂肪。身体下部(如大腿和臀部)中的脂肪是皮下的且不是一致地间隔开的组织，而腹腔中的脂肪大部分是内脏的和半流体的。过量的内脏脂肪称为中央型肥胖症或"腹脂"，其中腹部过度突出，且新的进展如身体容量指数(Body Volume Index)(BVI)特别地设计用于测量腹部体积和腹部脂肪。过量的内脏脂肪也与2型糖尿病、胰岛素抵抗、炎性疾病和其它肥胖症相关疾病关联(Mokdad等,JAMA:The Journal of the American Medical Association.2001,289(1):76-9)。
脂肪组织的质量可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法测定。例如，脂肪组织可以通过双能X-射线吸收测定法(DXA)测量，如在本申请的实施例11中显示的。
特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高人受试者中棕色脂肪组织水平和/或米色脂肪组织水平。另一方面，肌生长抑制素抑制剂，例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分的施用降低人受试者中白色脂肪组织和内脏脂肪组织的水平。
在一些实施方式中，棕色或米色脂肪组织水平提高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，棕色或米色脂肪组织水平提高至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
在一些实施方式中，白色或内脏脂肪组织的水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，白色或内脏脂肪组织的水平降低至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
E.对人受试者中脂肪组织-肌肉组织的比率的作用
特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用降低人受试者的脂肪组织-肌肉组织之间的比率。在一些实施方式中，脂肪组织-肌肉组织的比率降价至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，脂肪组织-肌肉组织的比率降低至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
F.对人受试者的葡萄糖摄取的作用
特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用影响人受试者中组织的葡萄糖摄取。在一些实施方式中，肌肉组织的葡萄糖摄取增加。例如，肌肉组织的葡萄糖摄取增加至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方式中，肌肉组织的葡萄糖摄取增加至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
在其它实施方式中，白色脂肪组织、肝组织和血管组织的葡萄糖摄取降低。在一些实施方式中，白色脂肪组织、肝组织和血管组织的葡萄糖摄取降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，白色脂肪组织、肝组织和血管组织的葡萄糖摄取降低至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
G.对人受试者中肌肉蛋白质分解代谢和/或肌肉氨基酸释放的作用
特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用降低人受试者中的肌肉蛋白质分解代谢和/或肌肉氨基酸释放。在一些实施方式中，肌肉蛋白质分解代谢和/或肌肉氨基酸释放降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，肌肉蛋白质分解代谢和/或肌肉氨基酸释放降低至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
H.对人受试者中的胰岛素依赖的血糖控制的作用
特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用提高人受试者中的胰岛素依赖的血糖控制。在一些实施方式中，胰岛素依赖的血糖控制提高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，胰岛素依赖的血糖控制提高至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
I.对人受试者中的肌肉内脂肪浸润的作用
特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用降低人受试者的肌肉内脂肪浸润。在一些实施方式中，肌肉内脂肪浸润降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，肌肉内脂肪浸润降低至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
J.对人受试者的生活质量的作用
在患有严重或慢性病症的患者如SC患者中生活质量的评价可以涉及评估身体、精神、社会和其它参数的各个方面的综合方式。一般地，较高的生活质量水平与如以下的因素相关：辅助技术的可及性；社区再融合；下肢和行走的功能性和/或轮式运动性；精神健康；神经功能损害和自主机能障碍的严重性；疼痛管理；功能独立性和自理；上肢力量；和强直控制。特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的抗体或其抗原结合片段的施用提高人受试者的生活质量以实现临床上有意义的改善，如通过标准化生活质量测试/系统测量的。用于评价患者的生活质量的多种合适的测试是本领域中已知的，包括：尿失禁生活质量问卷(Incontinence Quality of Life Questionnaire)(I-QOL)、生活满意度问卷(Life Satisfaction Questionnaire)(LISAT-9,LISAT-11)、生活质量指数(QLI)-SCI版、身体残疾成人的生活质量评价(Quality of Life Profile for Adults with PhysicalDisabilities)(QOLP-PD)、健康质量量表(Quality of Well Being)(QWB)和健康质量自我评估量表(Quality of Well Being–Self-Administered)(QWB-SA)、Qualiveen、生活满意度量表(Satisfaction with Life Scale)(SWLS,Deiner Scale)、简明健康调查量表36(Short Form 36)(SF-36)、疾病影响量表68(Sickness Impact Profile 68)(SIP 68)和世界卫生组织生活质量测定量表(World Health Organization Quality of Life)-BREF(WHOQOL-BREF)。
在一些实施方式中，生活质量按照SF-36生活质量评分系统评价，其是经验证的评分系统，其中8点的变化被认为是临床上有意义的。通常，对于SCI患者，值在50分以下。在一些实施方式中，有效量的特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的抗体或其抗原结合片段的施用导致标准化生活质量测试评分的临床上有意义的改善。本文使用的术语“临床上有意义的改善”是指超过标准水平的显著改善。在一些实施方式中，SCI患者的SF-36生活质量评分在用有效量的本文所述的抗体或其抗原结合片段治疗后提高至少8点，如与治疗前的患者评分相比的。在一些实施方式中，如通过SF-36生活质量测试评价的，患者实现更高的评分，例如，SF-36生活质量评分系统的评分中至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40或50点的提高。在其它实施方式中，SF-36生活质量评分系统的评分提高至少约8-10、10-15、15-20、20-30、30-40、40-50、8-20、8-30、8-40或8-50点。
在一些实施方式中，SCI神经学生活质量测试用于在用本文公开的肌生长抑制素信号传导的抑制剂治疗之前和之后评价患者的生活质量。这一测试的优势包括：i)其易于执行；ii)其评价身体机能和精神健康两者；和iii)其对于多种临床适应症是高度认可的。
K.对防止人受试者中的肌肉损失或肌萎缩的作用
有效量的特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用防止具有发生肌肉损失和/或肌萎缩的风险的人受试者中的肌肉损失或肌萎缩。在一些实施方式中，肌肉损失或肌萎缩降低或防止至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，肌肉损失或肌萎缩降低或防止至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
在一些实施方式中，合适的受试者是未发生肌萎缩但认为处于发生肌萎缩的风险中的受试者。在一些实施方式中，受试者患有与损害运动神经元功能的神经缺损相关的疾病或病症。在一些实施方式中，这些病症通过肌营养不良或肌萎缩引起。在一些实施方式中，神经缺损通过神经损伤引起。在一些实施方式中，神经损伤涉及运动神经元的部分去神经支配，其引起受影响的肌肉中的部分功能损害。在一些实施方式中，这些病症通过SCI引起。在一些实施方式中，具有SCI的受试者处于SCI的急性或亚急性期(例如，还未达到慢性期)。
在一些实施方式中，当包含有效量的本文所述肌生长抑制素信号传导的抑制剂的组合物施用于处于发生与运动神经元的部分去神经支配相关的肌萎缩的风险中的患者群体时，该组合物i)在统计学显著分数的患者群体中防止肌萎缩的表现或恶化；或ii)在统计学显著分数的患者群体中减轻肌萎缩的严重程度。
通过使用本文所述的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)防止肌肉损失或肌萎缩可以通过任何合适的方法容易地监测或评价以评估涉及受影响的肌肉的运动功能。
在一些实施方式中，有效量的这种抗体的施用也防止或减轻受影响的肢体的早发性轴突多神经病。
L.对防止受试者中代谢疾病的发生的作用
有效量的特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用防止受试者(例如，人受试者)中代谢疾病的发生。在一些实施方式中，代谢疾病的发生减少至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方式中，代谢疾病的发生减少至少约1-5％、5-10％、10-20％、1-30％、1-40％、1-50％、10-50％、20-30％、20-60％、30-80％、40-90％或50-100％。
在一些实施方式中，合适的受试者是未完全发生代谢疾病但被认为处于发生这种病症的风险中的受试者。在一些实施方式中，受试者患有与肌肉功能障碍相关的疾病或病症。在一些实施方式中，肌肉功能障碍与运动神经元的部分去神经支配相关，其在受影响的肌肉中引起部分功能损害。在一些实施方式中，这样的病症通过肌营养不良或肌萎缩引起。在一些实施方式中，这种病症通过SCI引起。在一些实施方式中，患有SCI的受试者处于SCI的急性或亚急性期(例如，还未达到慢性期)。
在一些实施方式中，当包含有效量的本文所述肌生长抑制素信号传导的抑制剂的组合物施用于处于发生与肌肉功能障碍相关的代谢障碍的患者群体时，该组合物i)在统计学显著分数的患者群体中防止代谢障碍的表现或恶化；或ii)在统计学显著分数的患者群体中减轻代谢疾病的严重程度。
在一些实施方式中，对代谢的影响可以通过胰岛素抵抗、脂质组(lipid panel)/标志物(例如，瘦素)、炎性标志物和氧化应激标志物，包括但不限于：IL-6、TNF、CRP、血浆总抗氧化剂状态、脂质氧化和红细胞谷胱甘肽过氧化物酶活性监测或测量。
肌生长抑制素抑制剂如抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其抗原结合片段的用途
药物组合物
本文所述的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)可以配制成适合施用于人或非人受试者的药物组合物。这样的药物组合物可能意图用于治疗用途或预防用途。一种或多种肌生长抑制素抑制剂，例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体可以与药学上可接受的载体(赋形剂)(包括缓冲剂)混合以形成用于施用于可能受益于体内降低的肌生长抑制素信号传导的患者的药物组合物。“药学上可接受的”意思是载体必须与组合物的活性成分相容(和优选地，能够稳定活性成分)且对于所治疗的受试者不是有害的。药学上可接受的赋形剂(载体)(包括缓冲剂)的实例是本领域技术人员清楚的且之前已经描述。参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(2000)Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对于接受者是无毒的，并且可以包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵(hexamethonium chloride)；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(低于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶蛋白或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，如TweenTM、PluronicsTM或聚乙二醇(PEG)。药学上可接受的赋形剂在本文中进一步描述。
在一个实例中，本文所述的药物组合物包含超过一种肌生长抑制素抑制剂，例如，超过一种识别目标抗原的不同表位/残基的抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分。
在一些实例中，本文所述的药物组合物包含基于乳液或基于脂质的制剂，如含有肌生长抑制素抑制剂(例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分)的脂质体，其可以通过任何合适的方法制备，如Epstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688(1985)；Hwang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980)；和U.S.专利No.4,485,045和4,544,545中描述的。具有增加的循环时间的脂质体公开于U.S.专利No.5,013,556中。特别有用的脂质体可以通过反相蒸发方法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。脂质体通过具有限定孔隙大小的过滤器挤出以产生具有所需直径的脂质体。
肌生长抑制素抑制剂(例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分)也可以包裹在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如，分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。示例性的技术之前已经描述，参见例如，Remington,The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.MackPublishing(2000)。
在其它实例中，本文所述的药物组合物可以配制成持续释放形式。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体或其抗原结合部分的固体疏水性聚合物的半渗透基质，该基质为成形颗粒的形式，例如，膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(U.S.专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和7-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯基乙酸乙酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球)、乙酸异丁酸蔗糖酯和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的药物组合物必须为无菌的。这容易地例如通过经无菌的过滤膜的过滤来达成。治疗性抗体组合物一般置于具有无菌进入端口的容器中，例如，具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的静注溶剂袋或小瓶。
本文所述的药物组合物可以为单位剂型如片剂、丸剂、胶囊、粉末剂、颗粒剂、溶液或悬浮液、或栓剂，其用于口服、肠胃外或直肠施用，或通过吸入或吹入的施用。
为制备固体组合物如片剂，主要活性成分可以与药用载体混合，例如，常规压片成分如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树脂，及其它药用稀释剂，例如，水，以形成包含本公开的化合物或其非毒性的药学上可接受的盐的均质混合物的固体预制剂组合物。当提到这些预制剂组合物为均质的时，意思是活性成分在整个组合物中均匀地分散，使得组合物可以容易地细分成同等有效的单位剂型如片剂、丸剂和胶囊。这一固体预制剂组合物然后细分成包含0.1mg至约500mg的本公开活性成分的上述类型的单位剂型。新型组合物的片剂或丸剂可以包衣或另外地复配以提供给予延长作用的优势的剂型。例如，片剂或丸剂可以包含内剂量和外剂量组分，后者为前者上的包覆层的形式。两个组分可以通过肠溶层分隔，该肠溶层用于对抗胃中的崩解并允许内组分完整地进入十二指肠中或延迟释放。多种材料可以用于这类肠溶层或涂层，这样的材料包括多种聚合酸和聚合酸与诸如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素的这些材料的混合物。
合适的表面活性试剂包括，特别地，非离子试剂如聚氧乙烯山梨聚糖(例如，TweenTM 20、40、60、80或85)和其它山梨聚糖(例如，SpanTM 20、40、60、80或85)。具有表面活性试剂的组合物便利地包含0.05-5％的表面活性试剂，且可以为0.1-2.5％。应理解，如果需要，可以添加其它成分，例如甘露糖醇或其它药学上可接受的溶剂。
合适的乳液可以使用商购可得的脂肪乳液如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM和LipiphysanTM制备。活性成分可以溶解在预混合的乳液组合物中或者可选地它可以溶解在油(例如，大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中，且乳液在与磷脂(例如，卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合时形成。应理解，可以添加其它成分，例如甘油或葡萄糖，以调节乳液的张力。合适的乳液通常含有最多20％的油，例如，5和20％之间。
乳液组合物可以是通过混合抗-原肌生长抑制素抗体与IntralipidTM或其成分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)制备的那些。
用于吸入或吹入的药物组合物包括药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液及粉末。液体或固体组合物可以包含如以上给出的合适的药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，组合物通过口腔或鼻呼吸途径施用用于实现局部或系统效应。
在优选无菌的药学上可接受的溶剂中的组合物可以通过使用气体雾化。雾化的溶液可以从雾化装置直接呼吸或者雾化装置可以连接于面罩、帐幕或间歇性正压呼吸机。溶液、悬浮液或粉末组合物可以从以适宜的方式递送制剂的装置(优选经口或经鼻腔)施用。
受试者
本文所述的药物组合物适合施用于人或非人受试者。因此，本文所述的肌生长抑制素抑制剂，例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其抗原结合部分可用作施用于很可能受益于降低的肌生长抑制素信号传导的受试者的药物。在一些实施方式中，合适的受试者包括可能仍然受益于增强的肌肉质量/功能以及改善的代谢的健康个体。在一些实施方式中，合适的受试者具有现存的肌肉病症和/或相关的代谢功能障碍。在一些实施方式中，合适的受试者处于发生这种病症的风险中。在一些实施方式中，合适的受试者是进行包含治疗肌肉/代谢病症的另一治疗剂(但其与不良反应或毒性相关)的疗法的那些受试者。
在一些实施方式中，优选的受试者符合至少两种以下标准：i)受试者具有与运动神经元的部分去神经支配相关的病症；ii)该病症涉及包含或富含快缩肌纤维的肌肉；和iii)受试者保留合成代谢能力(例如，具有损伤的总体健康的成人)和/或处于生长期(例如，幼儿等)。
在一些实施方式中，这种药物适合施用于儿童群体、成人群体和/或老年人群体。
需要本文所述的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其抗原结合部分)的儿童群体年龄可以在0-6个月、0-12个月、0-18个月、0-24个月、0-36个月、0-72个月、6-36个月、6-36个月、6-72个月、12-36个月、12-72月的范围内。在一些实施方式中，适合接受本文所述的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的很可能受益于这种治疗的儿童群体年龄可以在0-6岁、0-12岁、3-12岁、0-17岁的范围内。在一些实施方式中，该群体具有至少5岁的年龄，例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17岁。在一些实施方式中，儿童群体年龄可以低于18岁。在一些实施方式中，儿童群体年龄可以为(a)至少5岁和(b)低于18岁。
需要本文所述的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其抗原结合部分)的成人群体年龄可以为至少18岁，例如，至少19、20、25、30、35、40、45、50、55、60或65岁。在一些实施方式中，成人群体可以低于65岁。在一些实施方式中，成人群体可以为(a)至少18岁和(b)低于65岁。
需要本文所述的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其抗原结合部分)的老年人群体年龄可以为65岁或更大(即，≥65岁)，例如，至少70、75或80岁。
很可能受益于这种治疗的人受试者可能是患有与受损的神经信号传导相关的代谢疾病/障碍(如以下描述的那些)、处于发生这种代谢疾病/障碍的风险中或疑似具有这种代谢疾病/障碍的人类患者。患有原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素相关疾病或障碍的受试者可以通过日常医学检查鉴定，例如，实验室检验、器官功能测试、CT扫描或超声检查。疑似具有任何这种代谢疾病/障碍的受试者可能显示该疾病/障碍的一种或多种症状。处于该疾病/障碍的风险中的受试者可以是具有对于该疾病/障碍的一种或多种风险因子的受试者。
如本文所述的对照受试者是提供用于评估测试对象或受试者的特定治疗或干预的效果的适宜基准的受试者。对照受试者可以具有与测试对象相似的年龄、种族、性别、体重、身高和/或其它特征，或其任何组合。
在一些实施方式中，肌生长抑制素分析(例如，肌生长抑制素ELISA)用于确定需要抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体的治疗的受试者。用于测定肌生长抑制素的方法可以在Lakshman等Molecular and Cell Endocrinology(2009)302:26-32(肌生长抑制素ELISA)和Bergen等Skeletal Muscle(2015)5:21(具有串联质谱的液相色谱)中找到，这两者通过引用并入本文。
在一些实施方式中，提供了用于改善受试者的肌肉性能的方法。受试者可以具有或没有与降低的肌肉质量和/或降低的肌肉功能相关的病症或发生该病症的风险。本文使用的术语“肌肉性能”一般是指肌肉收缩和/或施加力(例如，向外部物体)的能力。在一些实施方式中，肌肉性能可能与肌肉消耗能量的能力有关。例如，在一些实施方式中，肌肉性能可能与肌肉产生和/或消耗腺苷三磷酸(ATP)分子以促进肌肉收缩的能力有关。在一些实施方式中，肌肉性能是指肌肉重复收缩特定的时间段的能力。在一些实施方式中，肌肉性能是指肌肉对物体施加力(例如，以移动物体可测量的距离)的能力。在一些实施方式中，肌肉性能是指肌肉在特定的时间段内对物体施加力(例如，在特定的时间段内移动物体可测量的距离)的能力。
在一些实施方式中，本文所述的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其抗原结合部分)以足以抑制体内原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素水解激活成活性肌生长抑制素达至少20％(例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的量施用于需要治疗的受试者。在其它实施方式中，肌生长抑制素抑制剂，例如，抗体或其抗原结合部分，以有效降低原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素或潜伏肌生长抑制素水平至少20％(例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的量施用。
在一些实施方式中，本文所述的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分)施用于受益于增加的肌肉质量的受试者。在一些实施方式中，本文所述的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分)施用于受益于增加的肌肉-脂肪比率的受试者。在一些实施方式中，本文所述的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分)施用于受益于提高的肌肉功能的受试者。在一些实施方式中，受试者可能具有或没有与降低的肌肉质量和/或降低的肌肉功能相关的病症或处于其风险中。在一些实施方式中，受试者具有与降低的肌肉质量和/或降低的肌肉功能相关的病症或处于其风险中。
本发明的方法还包括选择受试者。在一些实施方式中，受试者患有肌肉病症或障碍或者处于发生肌肉病症或障碍的风险中。在一些实施方式中，受试者患有代谢障碍或者处于发生代谢障碍的风险中。在一些实施方式中，受试者患有与受损的神经信号传导相关的疾病或障碍或者处于发生该疾病或障碍的风险中。
施用途径
为实施本文中公开的方法，有效量的上述药物组合物可以通过合适的途径来施用于需要治疗的受试者(例如，人)，如静脉内施用(例如，作为浓注或通过一段时间的连续输注)、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、吸入或局部途径。用于液体制剂的可商购喷雾器，包括喷射雾化器和超声雾化器，可用于施用。液体制剂可以直接雾化且冻干粉末可以在重构后雾化。或者，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体可以使用氟碳化合物制剂及计量吸入器雾化，或者作为冻干和研磨粉末吸入。
医学领域的普通技术人员已知的常规方法可以用于根据待治疗疾病的类型或疾病的部位向受试者施用药物组合物。这一组合物也可以通过其它常规途径施用，例如，口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、经鼻、口腔、阴道或经由植入的储器施用。本文使用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。另外，它可以经由可注射储存型施用途径如使用1-、3-或6-月储存型可注射或生物降解材料和方法施用于受试者。
注射组合物可以包含各种载体如植物油、二甲基乙酰胺(dimethylactamide)、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射，水溶性抗体可以通过滴注法施用，从而输注包含抗体和药学上可接受的赋形剂的药物制剂。生理上可接受的赋形剂可以包括，例如，5％右旋糖、0.9％盐水、林格氏液或其它合适的赋形剂。肌肉内制剂，例如，抗体的合适可溶性盐形式的无菌制剂可以在药用赋形剂如注射用水、0.9％盐水或5％葡萄糖溶液中溶解和施用。
在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂，例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分，通过位点特异性的或靶向的局部递送技术施用。位点特异性的或靶向的局部递送技术的实例包括肌生长抑制素抑制剂(例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分)的各种可植入储存型源或局部递送导管(如灌注导管、留置导管或针内导管)、合成移植物、外膜敷料(adventitial wraps)、分流器和支架或者其它可植入装置、位点特异性载体、直接注射或直接敷用。参见，例如，PCT公开No.WO00/53211和U.S.专利No.5,981,568。
用于本文所述方法中的特定剂量方案，例如，剂量、时机和重复，取决于特定受试者和该受试者的医疗史。
对于与肌病相关的疾病/障碍的治疗效能可以使用任何合适的方法评价。例如，与肌病相关的疾病/障碍的治疗功效可以通过评估肌无力(例如，评价肌无力的模式和严重性)、肌电图、评估血液化学(例如，评价电解质、评价内分泌原因、测量肌酐激酶水平、测定红细胞沉降率和进行抗核抗体分析)和活检评估(例如，通过组织学、组织化学、电子显微镜、生物化学和遗传分析)来评价。
本文使用的“有效量”是指单独地或与一种或多种其它活性剂组合地赋予受试者治疗效果所需要的各活性剂的量。例如，有效量是指足以实现生物效应的本公开肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的量，例如，受试者中肌肉质量或肌肉纤维直径的增加、肌肉纤维类型的转换、肌肉产生的力的量的增加、肌肉组织质量和/或功能的提高；受试者的代谢速率的提高；受试者的胰岛素敏感性的提高；受试者中棕色脂肪组织水平的提高；受试者中米色脂肪组织水平的提高；受试者中白色脂肪组织水平的降低；受试者中内脏脂肪组织水平的降低；受试者中脂肪组织-肌肉组织的比率的降低；受试者中棕色脂肪组织、米色脂肪组织或肌肉组织的葡萄糖摄取的提高；白色脂肪组织或肝组织的葡萄糖摄取的降低；受试者中肌肉蛋白质分解代谢和/或肌肉氨基酸释放的降低；受试者中胰岛素依赖的血糖控制的提高；或受试者中肌肉内脂肪浸润的降低；或临床上有意义的结果，例如，在损伤后执行体力活动的能力的部分或完全恢复；生活质量的临床上有意义的改善，如通过标准化系统评价的，如SF-36生活质量评分系统；受试者中肌肉损失或肌萎缩的预防；和/或受试者中代谢疾病的发生的预防。
如本领域技术人员公认的，有效量根据治疗的特定病症、病症的严重性、个体患者参数(包括年龄、身体状况、体形、性别和体重)、治疗持续时间、同时治疗(如果有的话)的性质、具体施用途径及健康护理者的知识和技能内的类似因素而变化。这些因素是本领域技术人员公知的且可以仅利用常规试验解决。一般优选的是使用单个组分或者其组合的最大剂量，也就是说，根据合理的医学判断的最高安全剂量。但是，本领域技术人员应理解患者出于医学原因、生理原因或出于实际上任何其它理由可以坚持较低剂量或可耐受剂量。
在一些实施方式中，在靶肌肉中原肌生长抑制素水平的提高的情况中，该提高是与原肌生长抑制素的对照水平相比的至少1-倍、1.2-倍、1.5-倍、2-倍、2.5-倍、3-倍、4-倍、5-倍、6-倍、7-倍、8-倍、9-倍或10-倍或者更多(或通过任何所述值包括的任何范围)。在一个实施方式中，靶肌肉中原肌生长抑制素水平与原肌生长抑制素的对照水平相比的提高在1-倍至3-倍、1.2-倍至10-倍、2-倍至9-倍、3-倍至8-倍、4-倍对7-倍、2-倍至7-倍等的范围内的提高。
在一些实施方式中，在施用步骤后靶肌肉中潜伏肌生长抑制素的提高的情况中，该提高在施用步骤后的4小时、24小时、48小时、7天、14天、21天、28天或30天(或者通过任何所列时间段包括的任何时间范围)内是可检测的。在一个实施方式中，在施用步骤后靶肌肉中潜伏肌生长抑制素的提高在施用步骤后至少5天、7天、14天、21天、28天或30天(或者通过任何所列时间段包括的任何时间范围)是可检测的。在一个实施方式中，在施用步骤后靶肌肉中潜伏肌生长抑制素的水平与施用步骤前靶肌肉中潜伏肌生长抑制素的水平相比的提高是至少1-倍、1.2-倍、1.5-倍、2-倍、2.5-倍、3-倍、4-倍、5-倍、6-倍、7-倍、8-倍、9-倍或10-倍或者更多(或通过任何所述值包括的任何范围)。在一个实施方式中，在施用步骤后靶肌肉中潜伏肌生长抑制素的水平与施用步骤前靶肌肉中潜伏肌生长抑制素的水平相比的提高在1-倍至3-倍、1.2-倍至10-倍、2-倍至9-倍、3-倍至8-倍、4-倍至7-倍、2-倍至7-倍等的范围内的提高。
在一些实施方式中，在施用步骤后循环中潜伏肌生长抑制素的提高的情况中，该提高在施用步骤后的4小时、24小时、48小时、7天、14天、21天、28天或30天(或者通过任何所列时间段包括的任何时间范围)内是可检测的。在一个实施方式中，在施用步骤后循环中潜伏肌生长抑制素的提高在施用步骤后至少5天、7天、14天、21天、28天或30天(或者通过任何所列时间段包括的任何时间范围)是可检测的。在一个实施方式中，在施用步骤后循环中潜伏肌生长抑制素水平与施用步骤前循环中潜伏肌生长抑制素水平相比的提高是至少1-倍、2-倍、3-倍、5-倍、10-倍、15-倍、20-倍、25-倍、30-倍、35-倍、40-倍、45-倍或50-倍或者更多(或通过任何所述值包括的任何范围)。在一个实施方式中，在施用步骤后靶肌肉中潜伏肌生长抑制素的水平与施用步骤前靶肌肉中潜伏肌生长抑制素的水平相比的提高在1-倍至3-倍、1.2-倍至10-倍、2-倍至9-倍、3-倍至8-倍、4-倍至7-倍、2-倍至7-倍等的范围内的提高。
在一些实施方式中，在循环中潜伏肌生长抑制素水平的降低的情况中，与潜伏肌生长抑制素的对照水平相比的降低是至少1-倍、1.2-倍、1.5-倍、2-倍、2.5-倍、3-倍、4-倍、5-倍、6-倍、7-倍、8-倍、9-倍或10-倍或者更多(或通过任何所述值包括的任何范围)。在一个实施方式中，循环中潜伏肌生长抑制素水平的降低是与潜伏肌生长抑制素的对照水平相比在1-倍至3-倍、1.2-倍至10-倍、2-倍至9-倍、3-倍至8-倍、4-倍至7-倍、2-倍至7-倍等的范围内的降低。
如上所述，在一些实施方式中，在肌生长抑制素抑制剂(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)施用于受试者的情况中，有效量是与对照肌肉质量相比有效增加受试者的靶肌肉的质量的量。在一些实施方式中，用有效量的抗体处理的肌肉与未用有效量的抗体处理的对照肌肉质量相比增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％等。在一些实施方式中，这种肌肉质量增加在受试者的选定肌肉群或类型中实现。
在一些实施方式中，在肌生长抑制素抑制剂(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)施用于受试者的情况中，有效量是在受试者中有效转换纤维类型的量。在一些实施方式中，有效量的抗体可以促进纤维类型从I型转换成II型。在一些实施方式中，有效量的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)可以促进纤维类型从I型转换成IIB型。在一些实施方式中，有效量的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)可以相对于其它纤维类型促进II型纤维。在一些实施方式中，有效量的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)可以相对于其它纤维类型促进IIB型纤维。在一些实施方式中，纤维的这种表型转换可以在没有总体肌肉质量的显著改变的情况下发生。在其它实施方式中，纤维的这种表型转换可以与总体肌肉质量的增加一致。
在一些实施方式中，在肌生长抑制素抑制剂(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)施用于受试者的情况中，有效量是与对照肌肉纤维相比有效增加受试者中的肌肉纤维直径的量。在一些实施方式中，肌肉纤维直径的增加与对照肌肉纤维相比是至少1.1-倍、至少1.2-倍、至少1.3-倍、至少1.4-倍、至少1.5-倍、至少1.6-倍、至少1.7-倍、至少1.8-倍、至少1.9-倍、至少2-倍、至少4-倍、至少5-倍或更多的增加。在一些实施方式中，肌肉纤维直径的增加与对照肌肉纤维相比是在1-倍至5-倍、2-倍至10-倍、1-倍至1.5-倍、1-倍至2-倍等的范围内的增加。
在一些实施方式中，在向受试者施用肌生长抑制素抑制剂(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)的情况中，有效量是与对照肌肉质量相比有效提高肌肉-脂肪比率的量。在一些实施方式中，肌肉-脂肪比率的提高与对照受试者相比是至少1.1-倍、至少1.2-倍、至少1.3-倍、至少1.4-倍、至少1.5-倍、至少1.6-倍、至少1.7-倍、至少1.8-倍、至少1.9-倍、至少2-倍、至少4-倍、至少5-倍或更多的提高。在一些实施方式中，肌肉-脂肪比率的提高与对照受试者相比是在1-倍至5-倍、2-倍至10-倍、1-倍至1.5-倍、1-倍至2-倍等的范围内的提高。
在一些实施方式中，在向受试者施用肌生长抑制素抑制剂(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)的情况中，有效量是与对照肌肉质量相比有效降低受试者的肌肉内脂肪浸润的量。在一些实施方式中，肌肉内脂肪浸润的降低与对照受试者相比是至少1.1-倍、至少1.2-倍、至少1.3-倍、至少1.4-倍、至少1.5-倍、至少1.6-倍、至少1.7-倍、至少1.8-倍、至少1.9-倍、至少2-倍、至少4-倍、至少5-倍或更多的降低。在一些实施方式中，肌肉内脂肪浸润的降低与对照受试者相比是在1-倍至5-倍、2-倍至10-倍、1-倍至1.5-倍、1-倍至2-倍等的范围内的降低。
在一些实施方式中，防止人受试者中肌肉质量的降低和/或增加肌肉质量的方法包括向受试者施用抑制通过tolloid蛋白酶蛋白水解形成成熟肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂，例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，抑制tolloid蛋白酶对原肌生长抑制素或潜伏肌生长抑制素的蛋白水解切割导致肌肉质量的逐步增加。在一个实施方式中，受试者表现出肌肉质量的逐步增加至少2周、4周、6周、8周、10周、12周、14周、16周、18周或20周(或通过任何所述值包括的任何范围)。在一些实施方式中，防止人受试者中肌肉质量的降低和/或增加肌肉质量的方法包括向受试者施用包括超过两个剂量的肌生长抑制素抑制剂，例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)的施用包括至少第一剂量和第二剂量，该第一剂量和第二剂量间隔至少约2周、间隔4周、间隔6周、间隔8周或间隔12周施用于受试者。
在一些实施方式中，在肌生长抑制素抑制剂(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)施用于受试者的情况中，有效量是与对照肌肉功能相比有效提高受试者中靶肌肉的功能的量。在一些实施方式中，肌肉功能的提高与对照肌肉功能相比是至少1.1-倍、至少1.2-倍、至少1.3-倍、至少1.4-倍、至少1.5-倍、至少1.6-倍、至少1.7-倍、至少1.8-倍、至少1.9-倍、至少2-倍、至少4-倍、至少5-倍或更多的提高。在一些实施方式中，肌肉功能的提高与对照肌肉功能相比是在1-倍至5-倍、2-倍至10-倍、1-倍至1.5-倍、1-倍至2-倍等的范围内的提高。
本文使用的术语“对照肌肉质量”是指可用于评估某状况(例如，用肌生长抑制素抑制剂(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)的处理)对受试者的靶肌肉的质量的影响的基准标准。在一些实施方式中，对照肌肉质量是预定的值。在一些实施方式中，对照肌肉质量是试验测定的。在一些实施方式中，对照肌肉质量是未施用肌生长抑制素抑制剂(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)的受试者中的靶肌肉质量。在一些实施方式中，对照肌肉质量是未施用肌生长抑制素抑制剂(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)的受试者群体中靶肌肉的质量(例如，平均质量)。在一些实施方式中，对照肌肉质量是在施用肌生长抑制素抑制剂(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)之前(例如，紧接施用之前)受试者的靶肌肉的质量。在一些实施方式中，对照肌肉质量是代替肌生长抑制素抑制剂(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)而施用从未暴露于原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段所针对的抗原的动物获得的正常抗体(例如，与原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体相同同种型的抗体)的受试者中的靶肌肉质量。在一些实施方式中，对照肌肉质量是代替肌生长抑制素抑制剂(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)而施用溶剂(例如，盐水)的受试者中的靶肌肉质量。
在一些实施方式中，在肌生长抑制素抑制剂(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)施用于受试者的情况中，有效量是与对照力生成能力相比在受试者中有效提高靶肌肉的力生成能力(例如，在体外使用适应于横向灌注浴的肌肉杠杆系统测定的最大力生成)的量。在一些实施方式中，力生成能力的提高与对照力生成能力相比是至少1.1-倍、至少1.2-倍、至少1.3-倍、至少1.4-倍、至少1.5-倍、至少1.6-倍、至少1.7-倍、至少1.8-倍、至少1.9-倍、至少2-倍、至少4-倍、至少5-倍或更多的提高。在一些实施方式中，力生成能力的提高与对照力生成能力相比是在1-倍至5-倍、2-倍至10-倍、1-倍至1.5-倍、1-倍至2-倍等的范围内的提高。
本文使用的术语“对照力生成能力”是指可用于评估某状况(例如，用肌生长抑制素抑制剂(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)的处理)对受试者中肌肉的力生成能力的影响的基准标准。在一些实施方式中，对照力生成能力是预定的值。在一些实施方式中，对照力生成能力是试验测定的。在一些实施方式中，对照力生成能力是未施用肌生长抑制素抑制剂(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)的受试者中靶肌肉的力生成能力。在一些实施方式中，对照力生成能力是未施用肌生长抑制素抑制剂(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)的受试者群体中靶肌肉的力生成能力(例如，平均力生成能力)。在一些实施方式中，对照力生成能力是在施用肌生长抑制素抑制剂(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)之前(例如，紧接施用之前)受试者中靶肌肉的力生成能力。在一些实施方式中，对照力生成能力是代替肌生长抑制素抑制剂(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体)而施用从未暴露于原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体所针对的抗原的动物获得的正常抗体(例如，与原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体相同同种型的正常抗体)的受试者中靶肌肉的力生成能力。在一些实施方式中，对照力生成能力是代替肌生长抑制素抑制剂(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)而施用溶剂(例如，盐水)的受试者中靶肌肉的力生成能力。
在一些实施方式中，靶肌肉是跖屈肌。在一些实施方式中，靶肌肉是包含2型纤维的肌肉。在一些实施方式中，靶肌肉是包含快速氧化纤维或快速糖酵解纤维的肌肉。在一些实施方式中，靶肌肉是包含IIB型纤维的肌肉。在一些实施方式中，肌生长抑制素抑制剂(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)的施用导致IIB型纤维横截面积与施用步骤之前的横截面积相比增加至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％(或通过任何所述值包括的任何范围)。
剂量
经验考虑因素，如半衰期，一般有助于剂量的确定。例如，与人免疫系统相容的抗体及其抗原结合部分，如人源化抗体或全人抗体，可以用于延长抗体的半衰期和防止抗体被宿主的免疫系统攻击。施用频率可以在治疗过程中确定和调整，且一般地但不是必然地基于与肌病相关的疾病/障碍的治疗和/或抑制和/或缓解和/或延迟。或者，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分)的持续连续释放制剂可能是适宜的。用于实现持续释放的各种制剂和装置对于本领域技术人员是清楚的且在本公开的范围内。
在一个实例中，本文所述的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)的剂量可以在已经给予一次或多次肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)施用的个体中经验地确定。个体给予拮抗剂的递增剂量。为评价拮抗剂的功效，可以追踪疾病/障碍的指标。
一般地，对于本文所述的任何抗体或其抗原结合片段的施用，初始候选剂量可以是约2mg/kg。为本公开的目的，典型的日剂量范围可以大约为0.1μg/kg至3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg，至30mg/kg至100mg/kg或更高的范围中的任何一种，其取决于以上提及的因素。对于在几天或更长时间内的重复施用，根据病症，治疗持续直到发生所需的症状抑制或直到实现足够的治疗水平以缓解与原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素相关的疾病或障碍或者其症状。示例性的给药方案包括施用约2mg/kg的初始剂量，接着约1mg/kg的每周维持剂量的抗体或其抗原结合片段，或接着每隔一周的约1mg/kg的维持剂量。但是，其它剂量方案可能是有用的，取决于实施者希望获得的药代动力学衰减模式。例如，设想一周1-4次的给药。在一些实施方式中，可以使用约3μg/mg-约2mg/kg(如约3μg/mg、约10μg/mg、约30μg/mg、约100μg/mg、约300μg/mg、约1mg/kg和约2mg/kg)范围的给药。在一些实施方式中，给药频率是每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次或每10周一次；或者每月一次、每2月一次、或每3月一次、每4月一次、每5月一次、每6月一次、每8月一次、每10月一次、每年或更长时间一次。这一治疗的进展容易地通过常规技术和分析监测。给药方案(包括使用的抗体)可以随时间变化。
在一些实施方式中，本文所述的任何肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用包括单一剂量。在一些实施方式中，本文所述的任何肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的施用包括多个剂量(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个剂量)。施用可以包括超过两个剂量。在一些实施方式中，施用包括至少第一剂量和第二剂量的治疗有效量的肌生长抑制素抑制剂，例如，抗体或其抗原结合部分。在一个实施方式中，第一剂量和第二剂量间隔至少约4周、间隔6周、间隔8周或间隔12周施用于受试者。
在一些实施方式中，对于正常体重的成人患者，可以施用约0.3-5.00mg/kg范围的剂量。特定的剂量方案，例如剂量、时间和重复，取决于特定个体和该个体的医疗史，以及单个药剂的性质(如药剂的半衰期和其它相关考虑因素)。
为本公开的目的，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)的适宜剂量取决于所使用的特定抗体(或其组合物)、疾病/障碍的类型和严重性、是否抗体施用用于预防或治疗目的、之前的治疗、患者的临床史和对拮抗剂的反应及负责医师的判断。在一些实施方式中，临床医生施用肌生长抑制素抑制剂(例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分)直到达到实现所需结果的剂量。肌生长抑制素抑制剂(例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分)的施用可以是连续的或间歇的，例如，取决于接受者的生理状况、施用目的是治疗性还是预防性的及有经验的实施者已知的其它因素。肌生长抑制素抑制剂(例如抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)的施用可以在预先选择的时间段内基本上是连续的或可以为一系列的间隔剂量，例如，在与原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素相关的疾病或障碍发生之前、期间或之后。
本文使用的术语“治疗”是指为治愈、愈合、缓解、减轻、改变、治疗、改善、改进或影响障碍、疾病的症状或疾病/障碍的倾向的目的向具有与肌病相关的疾病/障碍、疾病/障碍的症状或发生疾病/障碍的倾向的受试者应用或施用包括一种或多种活性剂的组合物。
减轻与原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素相关的疾病/障碍包括延迟疾病的发展或进展，或者减轻疾病严重性。减轻疾病不必然需要治愈性的结果。如本文中使用的，“延迟”与原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素相关的疾病/障碍的发展意味着推迟、阻碍、减缓、迟滞、稳定和/或延缓疾病的进展。这种延迟可以具有变化的时间长度，这取决于病史和/或治疗的个体。“延迟”或减轻疾病的发展或者延迟疾病的发作的方法是当与未使用该方法相比时，降低在给定时间段内发生疾病的一种或多种症状的可能性和/或减轻在给定时间段内症状的程度的方法。这样的比较通常基于使用足以给出统计学显著的结果的多个受试者的临床研究。
联合疗法
本发明包括用作用于治疗可能受益于体内肌生长抑制素抑制的联合疗法的药物组合物和相关方法。在任何这些实施方式中，这样的受试者可以接受包括与包含至少一种意图治疗相同或重叠的疾病或临床病症的另外的治疗剂的第二组合物结合的包含至少一种本文所述的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)的第一组合物的联合疗法。第一和第二组合物可以同时作用于相同的细胞靶标或分离的细胞靶标。在一些实施方式中，第一和第二组合物可以治疗或改善疾病或临床病症的相同或重叠的症状集或方面。在一些实施方式中，第一和第二组合物可以治疗或改善疾病或临床病症的单独的症状集或方面。仅举个例子，第一组合物可以治疗与疾病相关的肌病，而第二组合物可以治疗与相同疾病相关的炎症或纤维化，等等。这样的联合疗法可以彼此结合施用。在联合疗法的情况中的短语“与…结合”意思是在接受联合疗法的受试者中第一疗法的疗效在时间和/或空间上与第二疗法的疗效重叠。因此，联合疗法可以配制为用于同时施用的单一制剂，或配制为用于疗法的顺序施用的单独制剂。
在优选的实施方式中，联合疗法在疾病的治疗中产生协同效应。术语“协同”是指总体上高于各单一疗法的加性效应的效应(例如，更高疗效)。
在一些实施方式中，包括本文所述的药物组合物的联合疗法产生的功效总体上等同于另一疗法(如第二药剂的单一疗法)产生的功效，但与第二药剂的单一疗法相比，其与第二药剂相关的更少的不希望副作用或较不严重的毒性关联。在一些实施方式中，这样的联合疗法允许较低的第二药剂剂量但维持总体功效。这样的联合疗法可以特别适合于其中长期治疗有意义的患者和/或涉及儿科患者的群体。
因此，本发明提供用于增强肌肉质量/功能和用于治疗或预防代谢疾病或与受损的神经信号传导相关的疾病(包括糖尿病、肥胖症和脊髓损伤)的联合疗法中的药物组合物和方法。因此，方法或药物组合物进一步包括第二疗法。在一些实施方式中，第二疗法可能可用于治疗或预防代谢疾病或与受损的神经信号传导相关的疾病。第二疗法可以减轻或治疗与目标疾病相关的至少一种症状。第一和第二疗法可以通过相似或不相关的作用机制发挥其生物学作用；或者第一和第二疗法中任一或两者可以通过多重作用机制发挥其生物学作用。
应理解，本文所述的药物组合物可以在相同的药物上可接受的载体中或在不同的药物上可接受的载体中具有第一和第二疗法用于各所述的实施方式。应进一步理解，第一和第二疗法可以在所述的实施方式中同时或顺序地施用。
一种或多种本发明的抗-肌生长抑制素抗体或其它肌生长抑制素抑制剂可以与一种或多种另外的治疗剂组合使用。可以与本发明的抗-肌生长抑制素抗体一起使用的另外的治疗剂的实例包括，但不限于糖尿病治疗剂、糖尿病并发症治疗剂、心血管疾病治疗剂、抗-高血脂剂、低血压或抗高血压剂、抗-肥胖症药、非酒精性脂肪肝炎(NASH)治疗剂、化疗剂、免疫治疗剂、免疫抑制剂等。这样的联合疗法可以有利地采用所施用治疗剂的较低剂量，因此避免可能的与各种单一疗法相关的毒性或并发症。
用于治疗糖尿病的药剂的实例包括胰岛素制剂(例如，从牛或猪的胰腺提取的动物胰岛素制剂；使用微生物或方法通过基因工程技术合成的人胰岛素制剂)、胰岛素敏感性增强剂、其药物上可接受的盐、水合物或溶剂合物(例如，吡格列酮、曲格列酮、罗格列酮、尼格列酮(netoglitazone)、巴格列酮、来格列酮、替格列扎、法格立他扎、CLX-0921、R-483、NIP-221、NIP-223、DRF-2189、GW-7282TAK-559、T-131、RG-12525、LY-510929、LY-519818、BMS-298585、DRF-2725、GW-1536、GI-262570、KRP-297、TZD18(Merck)、DRF-2655等)、α-糖苷酶抑制剂(例如，伏格列波糖、阿卡波糖、米格列醇、乙格列酯等)、双胍类(例如，苯乙双胍、二甲双胍、丁双胍等)或磺酰脲类(例如，甲苯磺丁脲、格列本脲、格列齐特、氯磺丙脲、甲磺氮草脲、乙酰苯磺酰环己脲、格列吡脲、格列美脲等)以及其它胰岛素分泌促进剂(例如，瑞格列奈、色那列奈(senaglinide)、那格列奈、米格列奈、GLP-1等)、香树素激动剂(amyrinagonist)(例如，普兰林肽等)、磷酸酪氨酸磷酸酶抑制剂(例如，钒酸等)，等等。
用于治疗糖尿病并发症的药剂的实例包括，但不限于醛糖还原酶抑制剂(例如，托瑞司他、依帕司他、折那司他、唑泊司他、米那司他、非达司他(fidareatat)、SK-860、CT-112等)、神经营养因子(例如，NGF、NT-3、BDNF等)、PKC抑制剂(例如，LY-333531等)、晚期糖化终产物(AGE)抑制剂(例如，ALT946、匹马吉定、pyradoxamine、苯甲酰噻唑溴化物(ALT766)等)、活性氧淬灭剂(例如，硫辛酸或其衍生物、生物类黄酮包括黄酮类、异黄酮类、黄酮醇类、原花青素类、花青素类、柏松素(pycnogenol)、叶黄素、番茄红素、维生素E、辅酶Q等)、脑血管扩张剂(例如，硫必利、美西律(mexiletene)等)。
抗高血脂剂包括，例如，基于他汀的化合物，其是胆固醇合成抑制剂(例如，普伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、阿托伐他汀、氟伐他汀、瑞舒伐他汀等)、鲨烯合成酶抑制剂或具有降甘油三酯效果的贝特类化合物(例如，非诺贝特、吉非罗齐、苯扎贝特、氯贝特、sinfibrate、克利贝特等)、烟酸、PCSK9抑制剂、甘油三酯降低剂或胆固醇或胆固醇清除剂(cholesterol sequesting agent)。
低血压药物包括，例如，血管紧张素转化酶抑制剂(例如，卡托普利、依那普利、地拉普利、苯那普利、西拉普利、依拉普利、依那普利拉、福辛普利、赖诺普利、莫西普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、群多普利等)或血管紧张素II拮抗剂(例如，洛沙坦、坎地沙坦西酯、奥美沙坦酯、依普沙坦、缬沙坦、替米沙坦、厄贝沙坦、他索沙坦、pomisartan、利匹沙坦、福拉沙坦等)或钙通道阻滞剂(例如，氨氯地平)或阿司匹林。
非酒精性脂肪肝炎(NASH)-治疗剂包括，例如，熊二醇、吡格列酮、奥利司他、甜菜碱、罗格列酮。
抗-肥胖症药物包括，例如，抗中央型肥胖症药物(例如，右芬氟拉明、芬氟拉明、芬特明、安非拉酮、右旋安非他明、马吲哚、苯丙醇胺、氯苄雷司等)、胃肠脂肪酶抑制剂(例如，奥利司他等)、β3-肾上腺素受体激动剂(例如，CL-316243、SR-58611-A、UL-TG-307、SB-226552、AJ-9677、BMS-196085等)、基于肽的食欲抑制剂(例如，瘦素、CNTF等)、缩胆囊肽激动剂(例如，林替曲特、FPL-15849等)，等等。
化疗剂包括，例如，烷化剂(例如，环磷酰胺、异环磷酰胺等)、代谢拮抗剂(例如，甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶等)、抗癌抗生素(例如，丝裂霉素、亚德里亚霉素等)、植物源的抗癌剂(例如，长春新碱、长春地辛、紫杉醇等)、顺铂、卡铂、依托泊苷等。在这些物质中，5-氟尿嘧啶衍生物如去氧氟尿苷和新氟铁龙是优选的。
免疫治疗剂包括，例如，微生物和细菌组分(例如，胞壁酰二肽衍生物、溶血链球菌素(picibanil)制剂等)、具有免疫增强活性的多糖(例如，香菇多糖、西佐喃、云芝多糖等)、通过基因工程技术获取的细胞因子(例如，干扰素、白介素(IL)等)、集落刺激因子(例如，粒细胞集落刺激因子、红细胞生成素等)，等等。在这些物质中，优选的是IL-1、IL-2、IL-12等。
免疫抑制剂可以是，例如，钙调神经蛋白抑制剂/免疫亲和蛋白(immunophilin)调节剂如环孢霉素(山地明、Gengraf、Neoral)、他克莫司(普乐可复、FK506)、ASM981、西罗莫司(RAPA、雷帕霉素、雷帕鸣)或其衍生物SDZ-RAD、糖皮质激素(泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松等)、嘌呤合成抑制剂(麦考酚酸酯、MMF、CellCept(R)、硫唑嘌呤、环磷酰胺)、白介素拮抗剂(巴利昔单抗、达克珠单抗、脱氧精胍菌素)、淋巴细胞-耗竭药物如抗胸腺细胞球蛋白(胸腺细胞球蛋白(Thymoglobulin)、抗淋巴细胞球蛋白(Lymphoglobuline))、抗CD-3抗体(OKT3)，等等。
另外，其恶病质改善效果已在动物模型或临床阶段确认的药剂也可能与本发明的抗-肌生长抑制素抗体共同使用，所述药剂如环加氧酶抑制剂(例如，吲哚美辛等)、孕酮衍生物(例如，醋酸甲地孕酮)、糖皮质激素(例如，地塞米松等)、基于甲氧氯普胺的药物、基于四氢大麻酚的药物、脂质代谢改善药物(例如，二十碳五烯酸等)、生长激素、IGF-1，或抗TNF-α、LIF、IL-6、制瘤素M的抗体。用于治疗与代谢障碍和/或受损的神经信号传导相关的疾病或病症的另外的治疗剂是本领域技术人员清楚的且在本公开的范围内。
在一些实施方式中，适合与本文所述的抗体结合作为联合疗法施用的第二药剂是抗-纤维化剂，如TGFβ1拮抗剂。
在一些实施方式中，适合与本文所述的抗体结合作为联合疗法施用的第二药剂是生长因子TGFβ超家族的某些成员如BMP6、BMP7、GDF11、TGFβ2、TGFβ3、RGMc等的调节剂(例如，激动剂和拮抗剂)。
任何上述药剂可以与本发明的肌生长抑制素抗体组合施用以治疗代谢疾病或与神经元和靶组织之间受损的神经信号传导相关的疾病，例如，脊髓损伤、肌萎缩和肌营养不良。
肌生长抑制素抑制剂如抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其抗原结合片段用于治疗疾病/障碍的用途
本文所述的药物组合物适合施用于人类患者用于治疗或预防其中希望降低的肌生长抑制素信号传导的疾病或病症。这样的疾病和病症包括，但不限于：肌肉病症或障碍、代谢障碍和与受损的神经信号传导相关的疾病，例如，脊髓损伤。本发明的组合物和方法可能有用的示例性病症进一步描述如下。
A.肌肉病症和障碍
在一些实施方式中，本发明的方法适合于治疗或预防肌肉病症和障碍。本文使用的术语”肌肉病症”或“肌肉障碍”是指其中肌肉未正常发挥功能的疾病、病症或障碍，或者其中肌肉的功能正常但由于可用的肌肉量减少而由肌肉产生较少的力的疾病、病症或障碍。肌肉病症或障碍可以包括，但不限于肌病、肌萎缩、肌营养不良等。这样的病症可以通过运动神经元的一种或多种缺陷、遗传突变或损伤如神经损伤引起。
在一个实施方式中，肌肉病症是肌病。本文使用的术语“肌病”是指特征在于受损的肌肉结构或功能的肌肉状况，通常导致肌无力。“肌病”也可以包括特征在于正常的肌肉结构但受损或异常的神经元输入(其随之影响肌肉功能)的肌肉病症。“肌病”也可以包括炎性肌病和/或自身免疫性肌病，例如，重症肌无力。
肌病包括性质上为神经肌肉或肌肉骨骼的肌肉病症。在一些实施方式中，肌病是遗传性肌病。遗传性肌病包括，但不限于营养不良、肌强直、先天性肌病(例如，线状体肌病、多核/微核肌病和中央核肌病)、线粒体肌病、家族性周期性肌病、炎性肌病和代谢性肌病(例如，糖原贮积病和脂质贮积障碍)。在一些实施方式中，肌病是获得性肌病。获得性肌病包括，但不限于外源物质诱导的肌病(例如，药物诱导的肌病和糖皮质激素肌病、酒精性肌病及由于其它毒性剂导致的肌病)、肌炎(例如，皮肌炎、多肌炎和包涵体肌炎)、骨化性肌炎、横纹肌溶解和肌红蛋白尿症(myoglobinurias)，及失用性萎缩。在一些实施方式中，肌病是失用性萎缩，其可以由持续的股肉失用(导致正常肌肉功能的退化)引起。失用性萎缩可以是住院治疗、骨折(例如，髋骨折)的结果或由神经损伤引起。在一些实施方式中，肌病与如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、脊髓性肌萎缩(SMA)、由于肾衰竭、AIDS、心脏病和/或癌症导致的恶病质综合征的疾病或障碍相关。在一些实施方式中，肌病与老化相关。在一些实施方式中，肌病与少肌症相关。在一些实施方式中，肌病与椎旁肌萎缩(PMA)相关。
在一些实施方式中，肌病是原发性肌病。在一个实施方式中，原发性肌病包括失用性萎缩。在一些实施方式中，失用性萎缩与髋骨折、选择性关节置换、重症肌病、脊髓损伤或中风相关。在一些实施方式中，肌病是与例如肌营养不良相关的遗传性肌无力。
在一些实施方式中，肌病是继发性肌病，其中肌肉损失或功能障碍继发于疾病病理。在一些实施方式中，继发性肌病包括去神经支配或恶病质。在一些实施方式中，继发性肌病通过与运动神经元(monitor neuron)功能障碍相关的去神经支配引起。在一些实施方式中，运动神经元功能障碍是由于影响运动神经元的遗传突变。已知涉及运动神经元中的突变的疾病包括，但不限于肌萎缩性侧索硬化(ALS)和脊髓性肌萎缩(SMA)。在一些实施方式中，继发性肌病是与肾衰竭、AIDS、心脏病、癌症或老化相关的恶病质。在一些实施方式中，继发性肌病通过神经损伤引起，包括在医疗过程如外科手术过程中持续的不希望的神经损伤。对靶组织(例如，靶肌肉)功能的这种损伤的有害作用可以通过施用本文所述的肌生长抑制素抑制剂有效地治疗。例如，这种施用可以预防和/或减轻肌病和/或促进恢复。
在一些实施方式中，本发明的方法适合于治疗或预防肌肉病症和障碍，包括声带局部麻痹(paresis)/麻痹(paralysis)。本文使用的术语“声带局部麻痹/麻痹”是指输入到喉头肌肉(喉肌)中的异常神经输入导致的病症。麻痹可以涉及神经脉冲的完全中断，导致无运动；局部麻痹可以涉及神经脉冲的部分中断，导致喉肌的弱运动或异常的运动。在一些实施方式中，抗-肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段局部施用，例如，通过直接局部注射到受影响的声带肌中。单侧注射仅在声带一侧受影响(例如，由于在一侧的神经损伤)时需要。在其它实施方式中，在双侧的神经被损伤时，声带的两侧均受影响，且因此，双侧注射是优选的。
用于本发明的方法中的抗-肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段可以局部地增加声带肌肉质量以封闭两个声带褶之间的间隙而恢复功能。在其中该间隙太大的严重情况中，可能需要手术来校正这种情况。在这些严重声带局部麻痹/麻痹的情况中，抗-肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段可以用作手术的辅助疗法以进一步封闭该间隙。在一些实施方式中，本发明的方法适合治疗或预防其发声功能受到影响但其中校正手术不是必要的轻度声带局部麻痹/麻痹。在其它实施方式中，本发明的方法适合作为手术的辅助或者在手术不可行或风险太大的情况中作为主要疗法来治疗或预防严重声带局部麻痹/麻痹。
在一些实施方式中，本发明的方法适合于治疗或预防肌肉病症和障碍，包括椎旁肌萎缩(PMA)。在一个实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合片段用于治疗作为术后椎旁肌萎缩(即，外科手术后的椎旁肌萎缩)的椎旁肌萎缩的方法中。在一个实施方式中，治疗方法包括治疗神经损伤相关的肌萎缩。在一个实施方式中，本文所述的治疗方法包括治疗术后神经损伤相关的肌萎缩。在一个实施方式中，治疗方法包括治疗术后肌萎缩，其中手术是脊柱手术。在一个实施方式中，治疗方法包括治疗术后肌萎缩，其中脊柱手术是腰椎手术或腰椎程序，例如，腰椎融合术、腰椎非融合术、后腰椎融合术、前腰椎融合术、微创性(MIS)后腰椎减压术、微创性(MIS)后腰椎融合术、非-MIS等效程序等。在一个实施方式中，治疗方法包括在腰椎融合术后治疗椎旁肌萎缩。在一个实施方式中，治疗方法包括在后腰椎融合术后治疗椎旁肌萎缩。在一个实施方式中，治疗方法包括在非-MIS腰椎融合术后治疗椎旁肌萎缩。在一个实施方式中，本文所述的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的治疗方法导致术后椎旁肌萎缩的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、18％、20％或25％的减少。在一个实施方式中，使用本文所述的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的治疗方法导致手术后神经损伤相关的椎旁肌萎缩至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、18％、20％或25％的降低。
本公开的另一方面包括治疗患有与先天性肌病相关的疾病或病症的受试者的方法。示例性的先天性肌病包括，但不限于X-连锁肌管性肌病、常染色体显性中心核肌病、常染色体隐性中心核肌病、线状体肌病和先天性纤维型不相称性肌病。
本公开的另一方面包括治疗患有与肌肉营养不良相关的肌肉疾病或病症的受试者的方法。示例性肌营养不良包括，但不限于杜氏肌营养不良、贝氏肌营养不良、面肩肱型肌营养不良(FSH)和肢带肌肉营养不良。
本公开的另一方面包括治疗患有妇科泌尿相关疾病或病症、发声障碍(狭窄)、眼外肌病、腕管综合征、Guillain-Barré综合征或骨肉瘤的受试者的方法。
B.代谢障碍和疾病
本发明提供用于治疗或预防受试者的代谢疾病的方法。本文使用的术语“代谢疾病”是指涉及由于代谢(合成代谢和/或分解代谢)的改变导致的正常体内平衡生理状态的扰乱的任何不希望的病症。代谢障碍影响身体如何处理完成生理功能所需的物质且一般与异常的葡萄糖、脂质和/或蛋白质代谢及由这种障碍导致的病理性后果相关。本发明的多种代谢障碍共有某些特征，例如，它们与无脂肪或瘦肌肉质量的损失、过量的脂肪量、较低代谢速率、胰岛素抵抗、调节血糖的能力的缺乏、体重增加和/或体重指数的增加相关。如本文中更详细地讨论的，代谢障碍可以相继于肌肉病症或障碍发生，或者作为肌肉病症或障碍的结果发生。
本发明至少部分地基于特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)施用于患有代谢疾病的受试者显著改善损伤的受试者的生理和功能特征两者的发现。特别地，本发明人出人意料地发现，肌生长抑制素抑制剂(例如，抗-肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分)的施用显著提高患有代谢疾病的受试者的代谢速率或能量消耗。肌生长抑制素抑制剂(例如，抗-肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分)的施用也显著地减弱SCI-诱导的病变下肌肉质量和总体身体质量的降低，而同时减少不希望的脂肪组织如白色和内脏脂肪组织的质量。另外，接受肌生长抑制素抑制剂(例如，抗-肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分)治疗的受试者表现出其运动功能、肌肉强度以及运动协调和平衡技能的显著改善。
因此，本发明提供用于治疗或预防人受试者的代谢疾病的方法。该方法包括选择患有代谢疾病的人受试者，和向人受试者施用有效量的特异性结合肌生长抑制素的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)，从而治疗或预防人受试者的代谢疾病。优选地，抗体或其抗原结合片段特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素，但不结合GDF11。特异性识别原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素但不识别GDF11的抗体是有益的且避免受试者中由抗体与GDF11的脱靶结合引起的不希望的毒性。
可以通过本发明的方法治疗或预防的代谢疾病的实例包括但不限于1型糖尿病、2型糖尿病、代谢综合征、前驱糖尿病、肥胖症、心血管疾病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、脊髓损伤(SCI)、低代谢状态、双重糖尿病、库欣病、肥胖综合征、胰岛素抵抗、胰岛素不足、高胰岛素血症、糖耐量受损(IGT)、异常的糖原代谢、高脂血症、低白蛋白血症、高甘油三酯血症、X综合征和脂肪性肝病。在一些实施方式中，代谢疾病包括与受损的神经信号传导或部分去神经支配相关的疾病。
与代谢障碍和/或身体组成相关的另外的疾病或病症对于技术人员是清楚的且在本公开的范围内。
糖尿病是指特征在于由胰岛素分泌或作用或两者的缺陷导致的高血糖(葡萄糖)水平的一组代谢疾病。存在两种最常见的糖尿病类型，即1型糖尿病和2型糖尿病，两种均因身体不能调节胰岛素所致。胰岛素是胰腺响应于血液中血糖(葡萄糖)水平的升高而释放的激素。
本文使用的术语“1型糖尿病”是指当胰腺产生的胰岛素过少而无法适当地调节血糖水平时发生的慢性疾病。1型糖尿病也称作胰岛素依赖性糖尿病、IDMM和青少年发作型糖尿病。患有I型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)的人产生很少的胰岛素或完全不产生胰岛素。虽然大约6％的美国人口患有某些形式的糖尿病，但全部糖尿病患者中仅约10％具有I型障碍。患有I型糖尿病的大多数人在30岁前发生该障碍。1型糖尿病代表胰腺β-细胞的渐进性自身免疫性破坏的结果，伴随后续的胰岛素缺乏。胰腺的超过90％的胰岛素产生细胞(β细胞)被永久破坏。所导致的胰岛素缺乏是严重的，且为了生存，患有I型糖尿病的人必须定期地注射胰岛素。
在II型糖尿病(也称为非胰岛素依赖性糖尿病，NDDM)中，胰腺继续制造胰岛素，有时甚至以高于正常水平制造。但是，身体产生对其作用的抗性，从而导致相对的胰岛素缺乏。II型糖尿病可以在儿童和青少年中发生，但通常在30岁后开始并随着年龄的增长逐渐变得更常见：约15％的超过70岁的人患有II型糖尿病。肥胖症是II型糖尿病的风险因子，且具有这一障碍的80-90％的人是肥胖的。
在一些实施方式中，糖尿病包括前驱糖尿病。“前驱糖尿病”是指一种或多种早期糖尿病病症，包括受损的葡萄糖利用、异常或受损的空腹血糖水平、糖耐量受损、受损的胰岛素敏感性和胰岛素抵抗。前驱糖尿病是发生2型糖尿病、心血管疾病和死亡的主要风险因子。关注点大多给予开发通过有效地治疗前驱糖尿病防止2型糖尿病的发生的治疗干预。
在一些实施方式中，糖尿病包括双重糖尿病，其是具有胰岛素抵抗的特征的1型糖尿病和2型糖尿病的组合。
糖尿病可以通过进行糖耐量试验来诊断。在临床上，糖尿病通常分成几个基本类别。这些类别的主要实例包括自身免疫性糖尿病、非胰岛素依赖性糖尿病(1型NDDM)、胰岛素依赖性糖尿病(2型IDDM)、非自身免疫性糖尿病、非胰岛素依赖性糖尿病(2型NIDDM)和青年的成人发病型糖尿病(MODY)。进一步的类别，通常称为继发的，是指通过引起或允许发生糖尿病综合征的一些可鉴别的病症导致的糖尿病。继发性类别的实例包括由胰腺疾病引起的糖尿病、激素异常、药物-或化学物质诱导的糖尿病、由胰岛素受体异常引起的糖尿病、与遗传综合征相关的糖尿病和其它原因的糖尿病(参见例如，Harrison's(1996)14th ed.,New York,McGraw-Hill)。
肥胖症是另一种可通过本发明的方法治疗或预防的普遍代谢疾病。“肥胖症”是指通过过量体脂限定的慢性病症。正常量的体脂(表示为体重的百分比)在女性中为25-30％和在男性中为18-23％。具有超过30％的体脂的女性和具有超过25％的体脂的男性被认为是肥胖的。肥胖症可以使用任何临床上相关的定义来限定。例如，在成人中，体重指数(BMI,kg/m2)通常用作超重和肥胖症的量度，其中超重定义为BMI 25-29.9kg/m2，肥胖症定义为BMI等于或大于30kg/m2，和病态肥胖症定义为BMI高于40kg/m2。肥胖症在成人中也可以通过如通过腰围测定的中心脂肪过多来定义，其中增大的腰围在男性中定义为等于或大于102cm和在女性中定义为等于或大于88cm。患有肥胖症的受试者可以表现出其它症状如提高的空腹血糖、提高的空腹血浆甘油三酯、降低的空腹高密度脂蛋白(HDL)水平和提高的血压。肥胖症也可以引起各种整形外科问题、皮肤障碍及足部和踝的肿胀。肥胖症的严重并发症包括高得多的冠状动脉障碍及其主要风险因子II型糖尿病、高脂血症和高血压的风险。许多与肥胖症相关的死亡与II型糖尿病关联，因为控制不好的糖尿病和肥胖症导致总称为综合征X或代谢综合征的症状集群。在一些实施方式中，肥胖症是少肌性肥胖症。
本发明的方法也适合治疗或预防代谢疾病如代谢综合征。本文使用的“代谢综合征”是指在单一个体中集合在一起并导致发生糖尿病和/或心血管疾病的高风险的风险因子集群的概念。代谢综合征的主要特征包括胰岛素抵抗、高血压(高的血压)、胆固醇异常、血脂异常、甘油三酯异常、提高的凝血风险和过度体重，特别是在腹部，或者肥胖。美国心脏协会认为代谢综合征通过三种或更多种以下成分的存在诊断：(1)升高的腰围(男性，等于或大于40英寸(102cm)；女性，等于或大于35英寸(88cm))；(2)升高的甘油三酯(等于或大于150mg/dL)；(3)降低的高密度脂蛋白胆固醇或HDL(男性，小于40mg/dL；女性，小于50mg/dL)；(4)升高的血压(等于或大于130/85mm Hg)；和(5)升高的空腹血糖(等于或大于100mg/dL)。
在另一方面中，本发明的方法适合治疗或预防代谢疾病如肥胖综合征。术语“肥胖综合征”是指引起受试者肥胖或超重的任何障碍或病症。如同其它代谢疾病，患有肥胖综合征的人通常与无脂或瘦肌肉质量的损失、过量的脂肪质量、较低的代谢速率、胰岛素抵抗、调节血糖的能力的缺乏、体重增加和体重指数的提高相关。在一些实施方式中，肥胖综合征选自普瑞德威利综合征、与遗传障碍相关的肥胖综合征和与下丘脑障碍相关的肥胖综合征。
本发明的方法还适合治疗或预防与低代谢状态相关的代谢疾病。术语“低代谢状态”是指降低的代谢或代谢活性的状态，其中身体不产生足够的能量。具有低代谢状态的患者一般具有较低的代谢速率、无脂或瘦肌肉质量的损失、脂肪质量的过度增加、胰岛素抵抗、调节血糖的能力的缺乏、体重增加和体重指数的提高。在一些实施方式中，低代谢状态选自与长期不活动相关的状态、与卧床相关的状态、与打石膏相关的状态、与中风相关的状态、与截肢相关的状态和手术后状态。在一些实施方式中，低代谢状态是手术后状态，例如，腰椎手术后的椎旁肌萎缩。在一个实施方式中，椎旁肌萎缩是神经损伤相关的肌萎缩。在一个实施方式中，手术是脊柱手术。在一个实施方式中，脊柱手术是腰椎手术或腰椎程序，例如，腰椎融合术、腰椎非融合术、后腰椎融合术、前腰椎融合术、微创性(MIS)后腰椎减压术、微创性(MIS)后腰椎融合术、非-MIS等效程序等。
在另一方面中，本发明的方法适合治疗或预防代谢疾病如库欣病。术语“库欣病”是指其中垂体腺释放太多的促肾上腺皮质激素(ACTH)的病症。库欣病的症状可以包括上身肥胖(腰以上)和瘦的手臂和腿，圆的、红色、丰满的脸(满月脸)和儿童中的慢生长率。在一些实施方式中，库欣病选自皮质类固醇诱导的库欣病和肿瘤诱导的库欣病。
在再另一方面中，本发明的方法适合治疗或预防代谢疾病如心血管疾病。术语“心血管疾病”是指心脏或血管的任何疾病。心血管或心脏病包括但不限于，例如，心绞痛、心律不齐、冠状动脉病(CAD)、冠心病、心肌病(包括扩张性心肌病、限制性心肌病、致心律失常的右心室心肌病和糖尿病性心肌病)、心脏病发作(心肌梗死)、心力衰竭、肥厚性心肌病、二尖瓣回流、二尖瓣脱垂、肺动脉瓣狭窄等。血管疾病包括但不限于，例如，外周血管病、动脉病、颈动脉病、深静脉血栓、静脉疾病和动脉粥样硬化。
本公开的另一方面包括治疗患有与老化相关的代谢疾病或病症的受试者的方法。示例性的与老化相关的疾病和病症包括，但不限于少肌症(年龄相关的肌肉损失)、虚弱和雄激素缺乏。
本公开的另一方面包括治疗患有与失用性萎缩/创伤相关的代谢疾病或病症的受试者的方法。示例性的与失用性萎缩/创伤相关的疾病或病症包括，但不限于与在重症监护室(ICU)中的时间、髋/关节置换、髋骨折、中风、卧床、SCI、肩袖损伤、膝关节置换、骨折和烧伤相关的肌无力。
C.与受损的神经信号传导相关的疾病
本公开至少部分地基于肌生长抑制素信号传导的抑制可以特别地用于干预涉及肌肉与其支配神经元之间的通讯缺陷的病症的出人意料的发现。因此，本公开提供了用于治疗或预防受试者(例如，人受试者)中与神经元和表达肌生长抑制素的靶组织之间受损的神经信号传导相关的疾病的方法。在一些实施方式中，该方法包括将有效量的特异性结合肌生长抑制素并抑制肌生长抑制素信号传导的肌生长抑制素抑制剂(例如，抗体或其抗原结合片段)施用于患有与神经元和靶组织之间受损的神经信号传导相关的疾病的受试者，从而治疗或预防受试者中与受损的神经信号传导相关的疾病。优选地，抗体或其抗原结合片段特异性地结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素但不结合GDF11。
本文所述的术语“与受损的神经信号传导相关的疾病”是指通过神经元和其靶组织(例如，肌肉组织、脑组织、肝组织、血管组织或脂肪组织)之间破坏的信号转导或通讯的故障引起的或与其相关的任何疾病或障碍。在一些实施方式中，受损的神经信号传导由于神经元结构的损害而发生，其中神经元不能够向其靶标传输信号。在其它实施方式中，神经元的结构保持完整，但存在功能破坏或缺陷，例如，神经肌肉接合的阻断，使得神经元传输信号的能力受到影响。
在一些实施方式中，“具有受损的神经信号传导的疾病”是指与去神经支配相关的疾病或病症，例如，对于其靶标如肌肉的神经分布或神经元输入的部分损失或扰动。在一些实施方式中，去神经支配通过损伤诱导。在一些实施方式中，去神经支配与疾病相关。具有受损的神经信号传导的疾病的非限制性实例包括，例如，声带局部麻痹/麻痹、脊髓损伤(SCI)、重症肌无力、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和脊髓性肌萎缩(SMA)。
脊髓损伤
本发明的方法还适合治疗或预防具有由于神经损伤导致的受损的神经信号传导的病症。在一些实施方式中，这种病症是脊髓损伤(SCI)。本文使用的术语“脊髓损伤”是指对脊髓的任何部分或脊管末端的神经的损害。脊髓损伤经常引起损伤位点之下力量、感觉和其它身体功能的永久变化。每年，据估计具有12,500个新的脊髓损伤病例(US)。发病率在US是275,000个病例，且大约60％具有截瘫。还没有处于开发中的针对逆转或减轻SCI中的肌萎缩的疗法，且这代表了大的未满足的需求。尽管根据自从损伤的时间、损伤的水平和完全性及残疾的程度存在着显著的患者异质性，但改善肌肉功能和代谢结果的身体康复是标准治疗。
SCI患者基于病变的水平(截瘫vs.四肢瘫痪)和完全性(完全vs不完全)分级。这种分级已经发展成ASIA评分，基于瘫痪水平具有两个宽泛的组：完全(AIS级A/B)和不完全(AIS级C/D/E)，定义如下：
A：完全的运动和感官丧失
B：运动丧失而保留感官知觉(仍然可以感觉接触、压力)
C和D：不完全运动丧失
E：运动功能保留：这代表了人群的较低比例。
具有7个颈椎(颈部)、12个胸椎(胸部)、5个腰椎(背部)和5个骶椎(尾部)。SCI中的病变可能存在于沿脊椎的任何位置。需要测试以确定神经功能水平的关键肌肉如下：
C5：肘屈肌(二头肌、肱肌)
C6：腕伸肌(桡侧伸腕长和短肌)
C7：肘伸肌(三头肌)
C8：长手指屈肌(屈指深肌)
T1：小指外展肌(小指展肌)
L2：髋屈肌(髂腰肌)
L3：膝伸肌(四头肌)
L4：踝背曲肌(胫骨前肌)
L5：趾长伸肌(伸姆长肌)
S1：踝跖曲肌(腓肠肌、比目鱼肌)
在具有完全脊髓损伤的情况下，脊髓在损伤水平之下不能发送信号。结果，患者在损伤之下是瘫痪的。在具有不完全损伤的情况下，患者在损伤之下具有一些运动和感觉。
具有多个与脊髓损伤相关的阶段。患者紧接在损伤后可能处于急性脊髓损伤期，其中完全和不完全损伤之间的诊断一般是困难的，部分地是由于创伤和相关的炎症。通常，急性期定义为在急性医疗/外科护理中所述事件/损伤后的初始住院期，其一般为～2周左右。受试者可以处于亚急性脊髓损伤期，其中存在完全和不完全脊髓损伤之间的差别，且通过持续复健的恢复是可能的。通常，亚急性期占到损伤后的～2周直至～18个月(例如，损伤后3-6个月)。再进一步地，受试者可以处于慢性脊髓损伤期，其一般在损伤时间后的大约6-12个月开始(其中患者显示恢复率的显著降低)或者到复健努力达到稳定阶段(例如，平台)时，尽管持续进行标准治疗工作。
肌肉强度应当总是按照所获得的最大强度分级，无论在检验过程中该强度维持得多么简短。肌肉以患者仰卧位测试。运动水平通过具有3或以上的肌肉强度的最尾部的关键肌肉测定，而上方的区段是正常的(＝5)。
运动指数评分使用各关键肌肉的0-5的评分，每个肢体的总分数是25和总体可能评分是100。
下肢运动评分(LEMS)使用两个下肢中的ASIA关键肌肉，总体可能评分是50(即，每个肢体的各关键肌肉[L2、L3、L4、L5和S1]的最大评分为5)。20或更小的LEMS表示患者很可能是受限的行走者。30或更高的LEMS表明个体很可能是社区行走者。
ASIA推荐使用用于评价脊髓损伤的运动强度的以下发现尺度：
0:无收缩或活动
1:最小活动
2:主动活动，但非抗重力
3:抗重力的主动活动
4:抗阻力的主动活动
5:抗全阻力的主动活动
监测SCI患者的功能性结果和生活质量是复杂的任务，因为适宜的功能量度的选择取决于损伤的完全性和水平。适用于所有患者的一种常见量度是功能独立性量度(FIM)，其是设计为量化患者对护理者的依赖性的7点尺度。目前受到关注的用于测量生活质量的另外的度量是SCI-QOL，其整合了患者的功能性技能和情绪健康(Tulsky 2015,J SpinalCord Med.38(3):257-69)。许多其它的功能性结果测量由SCIRE项目概述。
在一些实施方式中，通过对SCI患者施用有效量的本文所述的肌生长抑制素抑制剂获得的有意义的临床效果可以对应于总ASIA运动评分相对于基线的至少6点(≥6)的提高，例如，在第24周时。在一些实施方式中，通过对SCI患者施用有效量的本文所述的肌生长抑制素抑制剂获得的有意义的临床效果可以对应于第112天(+/-7天)时处理和未处理/对照组之间平均总SCIM III评分的差异。在一些实施方式中，通过对SCI患者施用有效量的本文所述的肌生长抑制素抑制剂获得的有意义的临床效果可以对应于运动的功能独立性测量(FIM-L)评分的大于4点(>4)的提高。
具有脊髓损伤的个体具有与不活动、肌萎缩和增加的脂肪过多相关的糖和脂质代谢异常的更高发病率。身体组成通过代谢活跃的肌肉团和骨骼的快速和长期的下降及中心脂肪过多的明显增加而显著改变并由此代表。后者造成适应不良的代谢特征，其有利于损伤后2-7个月发生的体重的显著增加。在一起发生时，这些共病风险因子引起所有原因心血管疾病、糖尿病和作为心血管代谢疾病的风险集群，后者包括用于血脂异常、葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗的组成危害。
快速和深度的肌肉萎缩影响具有脊髓损伤的那些并影响整个身体，而不仅是去神经支配的肢体。肌肉损失据信是由于包括(局部麻痹肢体的)去神经支配、不活动、炎症、由麻痹的肌肉释放的因子、类固醇使用、感染和营养缺乏的因素的组合。大百分比(～30％)的瘦肌肉质量在损伤后的前六周(急性期)损失。这种加速的瘦体重损失率持续到慢性状况，其对于四肢瘫痪具有3％的瘦体重降低(每十倍(per decade))和对于截瘫具有2.4％的瘦体重降低(如与健康对照中观察到的1％的降低相比)(Spungen 2003)。这种加速的肌萎缩造成早发的少肌症。
SCI患者发生总身体组成的深刻变化。特别地，瘦肌肉质量被脂肪质量替代，SCI患者与健康对照相比平均具有多13％的脂肪组织/单位BMI，伴随肌肉内脂肪的显著增加(Spungen 2003,Gorgey 2007)。这种全身的组成变化(～60-70％是肥胖的)对于代谢具有深刻的影响，其通过心血管疾病、II型糖尿病和甲状腺障碍的发病率增加来证明。
脊髓损伤后的去应力负荷(mechanical unloading)也转化为骨动态平衡的破坏。SCI患者具有降低的骨矿物质含量，发生骨质疏松和遭受增加的骨折率(多达50％的SCI患者在损伤后经历骨折)(Battaglino2013)。骨折导致住院且可以通过提高发生压力性溃疡、膝和髋部的挛缩及对于经历高血压危象的风险而具有深远的影响。
SCI患者中总体的瘦体重增加和脂肪质量的降低可以通过几种良好验证的方法监测，如通过磁共振成像测定的大腿或上臂肌肉体积，或者通过双能X射线吸收测定法或DEXA测定的总身体组成。这样的测量在该领域中常规地进行。
治疗的结果和进展(例如，总体临床效果)可以通过使用通常用于评估SCI临床应用的任何良好表征的测试来测量。这些测试可用于i)提供关于各测量的临床应用和心理测量性质的信息；ii)帮助医师选择对特定患者特别调整的适宜测量；iii)识别可能受益于特定疗法的个体；iv)监测进展；v)评估是否治疗是有效的；和/或vi)帮助程序改善对于患者和医疗专业人员的服务。患者可用的合适的临床评估工具/测试包括，但不限于以下：
为评估辅助技术，可用的测试包括：辅助技术装置倾向性评价(AssistiveTechnology Device Predisposition Assessment)(ATD-PA)；辅助技术满意度的Quebec用户评估(QUEST 2.0)；和Wingate无氧试验(WAnT)。
为评估社区再融合(Community Reintegration)，可用的测试包括：生活习惯量表的评定(Assessment of Life Habits Scale)(LIFE-H)；社区融入问卷(CommunityIntegration Questionnaire)(CIQ)；Craig残疾评估和报告技巧(Handicap Assessment&Reporting Technique)(CHART)；参与和自主性测评问卷(Impact on Participation andAutonomy Questionnaire)(IPAQ)；脊髓损伤人士的身体活动恢复评价(PhysicalActivity Recall Assessment for People with Spinal Cord injury)(PARA-SCI)；身体残疾个体身体活动度量表(Physical Activity Scale for Individuals with PhysicalDisabilities)(PASIPD)；和重返正常生活(Reintegration to Normal Living)(RNL)指数。
为评估下肢&行走，可用的测试包括：10米步行测试(10MWT)；6-分钟步行测试(6MWT)；Berg平衡量表(BBS)；临床结局变化量表(Clinical Outcome Variables Scale)(COVS)；功能性站立测试(Functional Standing Test)(FST)；脊髓损伤功能性步行目录(Spinal Cord Injury Functional Ambulation Inventory)(SCI-FAI)；计时起立-行走试验(Timed Up and Go Test)(TUG)；及脊髓损伤步行指数(Walking Index for SpinalCord Injury)(WISCI)和WISCI II。
为评估心理健康，可用的测试包括：贝克抑郁量表(Beck Depression Inventory)(BDI)；简明症状量表(Brief Symptom Inventory)(BSI)；CAGE问卷；流调中心抑郁量表(Center for Epidemiological Studies Depression Scale)(CES-D和CES-D-10)；抑郁焦虑压力量表(Depression Anxiety Stress Scale-21)(DASS-21)；疲劳严重度量表(FSS)；医院焦虑抑郁量表(Hospital Anxiety and Depression Scale)(HADS)；患者健康问卷-9(Patient Health Questionnaire-9)(PHQ-9)；分级一般健康问卷-28(Scaled GeneralHealth Questionnaire-28)(GHQ-28)；症状自评量表修订版(Symptom Checklist-90-Revised)(SCL-90-R)；和Zung抑郁自评量表(SDS)。
为评估神经功能缺陷和自主功能障碍，可用的测试包括：美国脊椎损伤学会功能损伤评分(American Spinal Injury Association Impairment Scale)(AIS)；脊髓损伤神经学分类国际标准(International Standards for Neurological Classification ofSpinal Cord Injury)；和表面肌电图(Surface Electromyography)(sEMG)。
用于影响的生理系统的其它可用评估系统包括：运动自我效能量表(ExerciseSelf-Efficacy Scale)(ESES)；Moorong自我效能量表(Moorong Self-Efficacy Scale)(MSES)；脊髓损伤继发状况量表(Spinal Cord Injury Secondary Conditions Scale)(SCI-SCS)；脊髓病变应对策略问卷(Spinal Cord Lesion Coping StrategiesQuestionnaire)(SCL CSQ)；脊髓病变情绪健康问卷(Spinal Cord Lesion EmotionalWellbeing Questionnaire)(SCL EWQ)；和Wingate无氧试验(WAnT)。
为评价疼痛，可用的测试包括：简明疼痛量表(Brief Pain Inventory)(BPI)；SCI的慢性疼痛分类系统；Donovan SCI疼痛分类系统；多维疼痛量表(Multidimensional PainInventory)(MPI)–SCI版；多维疼痛变化倾向问卷(Multidimensional Pain Readiness toChange Questionnaire)(MPRCQ2)；定量感觉测定(Quantitative Sensory Testing)(QST)；Tunk分类方案(Tunk’s Classification Scheme)；和轮椅使用者肩痛指数(Wheelchair Users Shoulder Pain Index)(WUSPI)。
为评估生活质量和健康状态，可用的测试包括：尿失禁生活质量问卷(I-QOL)；生活满意度问卷(LISAT-9,LISAT-11)；生活质量指数(QLI)–SCI版；身体残疾成人的生活质量评价(QOLP-PD)；健康质量量表(QWB)和健康质量自我评估量表(QWB-SA)；Qualiveen；生活满意度量表(SWLS,Deiner Scale)；简明健康调查量表36(SF-36)；疾病影响量表68(SIP68)；和世界卫生组织生活质量-BREF(WHOQOL-BREF)。
为评估自理&日常生活，可用的测试包括：残疾的评估：主要和次要量表(Appraisals of DisAbility:Primary and Secondary Scale)(ADAPSS)；Barthel指数(BI)；Frenchay活动量表(Frenchay Activities Index)(FAI)；功能独立性测量(Functional Independence Measure)(FIM)；自我报告功能独立性测量(FunctionalIndependence Measure Self-Report)(FIM-SR)；Klein-Bell日常生活活动量表(Klein-BellActivities of Daily Living Scale)(K-B量表)；Lawton工具性日常生活活动量表(Lawton Instrumental Activities of Daily Living scale)(IADL)；四肢瘫痪功能指数(Quadriplegia Index of Function)(QIF)；改良四肢瘫痪功能指数(Quadriplegia Indexof Function Modified)(QIF-改良版)；简明四肢瘫痪功能指数量表(Quadriplegia Indexof Function-Short Form)(QIF-SF)；Rivermead运动指数(Rivermead Mobility Index)(RMI)；自我护理评价工具(Self Care Assessment Tool)(SCAT)；自我报告功能测量(SelfReported Functional Measure)(SRFM)；脊髓独立性测量(Spinal Cord IndependenceMeasure)(SCIM)；和脊髓损伤生产方式量表(Spinal Cord Injury Lifestyle Scale)(SCILS)。
对于性和生殖，可用的测试包括：情感关系质量量表(Emotional Quality of theRelationship Scale)(EQR)；关于性的知识、舒适、途径和态度量表(Knowledge,Comfort,Approach and Attitude towards Sexuality Scale)(KCAASS)；性态度和信息问卷(Sexual Attitude and Information Questionnaire)(SAIQ)；性行为量表(SexualBehaviour Scale)(SBS)；性兴趣与满意度量表(Sexual Interest and SatisfactionScale)(SIS)；性兴趣、活动和满意度量表(Sexual Interest,Activity an；andSatisfaction)(SIAS)/性活动与满意度量表(Sexual Activity and Satisfaction)(SAS)。
为评估皮肤健康，可用的测试包括：Abruzzese量表；Braden量表；Gosnell测量；Norton测量；皮肤管理需求评估清单(Skin Management Needs Assessment Checklist)(SMNAC)；急性脊髓损伤压力性溃疡(Spinal Cord Injury Pressure Ulcer Scale–Acute)(SCIPUS-A)；脊髓损伤压力性溃疡量表(Spinal Cord Injury Pressure Ulcer Scale)(SCIPUS)测量；Stirling’s压力性溃疡严重性量表(Stirling’s Pressure UlcerSeverity Scale)；和Waterlow量表。
为评估强直状态，可用的测试包括：Ashworth和改良Ashworth量表(MAS)；钟摆试验(Pendulum Test)(Wartenberg)；Penn痉挛频率量表(Penn Spasm Frequency Scale)(PSFS)；脊髓痉挛性反射评价工具(Spinal Cord Assessment Tool for SpasticReflexes)(SCATS)；脊髓损伤强直和评估工具(Spinal Cord Injury Spasticit andEvaluation Tool)(SCI-SET)。
为评估上肢功能，可用的测试包括：盒-块试验(Box and Block Test)(BBT)；上肢器械能力(Capabilities of Upper Extremity Instrument)(CUE)；力量、情感和理解的分级重定义评价(Graded Redefined Assessment of Strength,Sensibility andPrehension)(GRASSP)；抓握释放试验(Grasp and Release Test)(GRT)；手持式肌力计(Hand-Held Myometer)；Jebsen手功能测试(Jebsen Hand Function Test)(JHFT)；改良功能性伸展试验(Modified Functional Reach Test)(mFRT)；六分钟手臂试验(Six-MinuteArm Test)(6-MAT)；Sollerman手功能测试(Sollerman Hand Function Test)；四肢瘫痪手活动问卷(Tetraplegia Hand Activity Questionnaire)(THAQ)；和简式Van Lieshout试验(VLT-SV)。
且为了评估轮式运动(Wheeled Mobility)，可用的测试包括：自身推进手动轮椅人士的4项功能试验(4Functional Tests for Persons who Self-Propel a ManualWheelchair)(4FTPSMW)；定时电机试验(Timed Motor Test)(TMT)；评价轮椅依赖性截瘫患者的运动性的工具(Tool for assessing mobility in wheelchair-dependentparaplegics)；轮椅环行(Wheelchair Circuit)(WC)；和轮椅技能测试(WheelchairSkills Test)(WST)。
基于肌生长抑制素对肌肉质量和代谢的作用，肌生长抑制素抑制剂，例如，抗-肌生长抑制素抗体或其抗原结合部分，可以加强多种影响伴随SCI生活的那些人的多种长期健康结果(其可以通过一种或多种标准的测试/工具如以上列出的那些来测量)，且在损伤时和/或在慢性病症中对于患者导致临床上有意义的益处。事实上，本发明人出人意料地发现肌生长抑制素激活通过肌生长抑制素抑制剂(例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体)的特异性抑制对受试者中的肌肉功能具有积极影响，包括在损伤或病变之下的肌肉中。具体地，肌生长抑制素抑制剂，例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体，施用于部分去神经支配动物模型不仅在损伤的受试者中防止肌萎缩和增加肌肉质量，而且增加损伤的肌肉的功能，以及防止与神经元损伤相关的代谢失调，且因此改善受试者的总体代谢健康，这可以提供显著的长期益处。
D.其它疾病
本公开的另一方面包括治疗患有与恶病质相关的疾病或病症的受试者的方法。示例性的与恶病质相关的疾病或病症包括，但不限于癌症、慢性心力衰竭、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)和慢性肾病(CKD)。
本公开的另一方面包括治疗患有与稀有疾病相关的疾病或病症的受试者的方法。示例性的稀有疾病和病症包括，但不限于成骨不全症、特发性包涵体肌炎和急性淋巴母细胞性白血病。
试剂盒
本公开还提供用于减轻与肌病相关的疾病/障碍的试剂盒。这样的试剂盒可以包括包含肌生长抑制素抑制剂，例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段，例如，本文所述的那些中的任一种的一个或多个容器。
在一些实施方式中，试剂盒可以包括按照本文所述的任何方法使用的说明书。包括的说明书可以包含施用肌生长抑制素抑制剂，例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段以治疗目标疾病(如本文所述的那些)、延迟目标疾病的发作或缓解目标疾病的说明。试剂盒可以进一步包括基于确定个体是否患有目标疾病选择适合于治疗的个体的说明。在再其它的实施方式中，说明书包括向具有目标疾病的风险的个体施用抗体的说明。
与肌生长抑制素抑制剂(例如，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段)的使用相关的说明书一般包括关于用于预期治疗的剂量、给药时间表和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、大包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。在本公开的试剂盒中提供的说明书通常是标签或包装插页(例如，试剂盒中包括的纸页)上的书面说明书，但机器可读的说明书(例如，承载在磁盘或光存储盘上的说明书)也是可接受的。
标签或包装插页指示组合物用于治疗与肌病相关的疾病或障碍、延迟其发作和/或缓解与肌病相关的疾病或障碍。可以提供用于实施本文所述的任何方法的说明书。
本公开的试剂盒在合适的包装中。合适的包装包括，但不限于小瓶、瓶子、罐子、柔性包装(例如，密封的Mylar或塑料袋)等等。还设想与特定装置如吸入器、经鼻施用装置(例如，喷雾器)或输注装置如微型泵结合使用的包装。试剂盒可以具有无菌进入口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有通过皮下注射针可刺穿的瓶塞的小瓶)。容器也可以具有无菌进入口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有通过皮下注射针可刺穿的瓶塞的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是如本文中所述的那些的抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段。
试剂盒可以任选地提供另外的组分如缓冲剂和解说信息。正常情况下，试剂盒包含容器及在容器上或与容器结合的标签或包装插页。在一些实施方式中，本公开提供了包含本文所述的试剂盒的内容物的制品。
用于检测原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的分析
在一些实施方式中，本文提供的方法和组合物涉及用于检测从受试者获得的样品中的原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的方法。如本文中使用的，“受试者”是指单个生物体，例如，单个哺乳动物。在一些实施方式中，受试者是人。在一些实施方式中，受试者是非人哺乳动物。在一些实施方式中，受试者是非人灵长动物。在一些实施方式中，受试者是啮齿动物。在一些实施方式中，受试者是绵羊、山羊、牛、猫或狗。在一些实施方式中，受试者是脊椎动物、两栖动物、爬行动物、鱼、昆虫、苍萧或线虫。在一些实施方式中，受试者是研究动物。在一些实施方式中，受试者是遗传工程化的，例如，遗传工程化的非人受试者。受试者可以是任一性别且可以处于任何发育阶段。在一些实施方式中，受试者是患者或健康志愿者。在一些实施方式中，受试者是“健康志愿者"(例如，没有发生肌肉病症如肌萎缩的风险但仍然可以受益于增加的肌肉质量和/或功能的受试者)。在一些实施方式中，受试者患有肌萎缩或肌无力或者具有发生该病症的风险。在一些实施方式中，受试者患有肌萎缩或肌无力或者具有发生该病症的风险，且会受益于增加的肌肉质量和/或功能。
在一些实施方式中，用于检测从受试者获得的样品中的原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的方法包括(a)在适合于抗体与抗原的结合(如果抗原存在于样品中)的条件下将样品与抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体或其抗原结合片段接触，从而形成结合复合物；和(b)测定与抗原结合的抗体或抗原结合片段的水平(例如，测定结合复合物的水平)。
如本文中使用的，结合复合物是指与抗原(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素蛋白)结合的抗体(包括抗原结合片段)的生物分子复合物。结合复合物可以包含具有单一特异性的抗体或者具有不同特异性的两种或更多种抗体或抗原结合片段。在一个实施方式中，结合复合物包含识别相同抗原上的不同抗原性位点的两种或更多种抗体。在一些情况中，抗体可以与抗原结合，该抗原已经与其它生物分子如RNA、DNA、多糖或蛋白质结合。在一个实施方式中，结合复合物包含识别不同抗原的两种或更多种抗体。在一些实施方式中，结合复合物中的抗体(例如，与抗原结合的固定抗体)本身可以作为抗原与抗体(例如，可检测地标记的抗体)结合。因此，在一些情况中，结合复合物可以包含多个抗原和多个抗体或抗原结合片段。
结合复合物中存在的抗原可以处于或不处于其原始的原位构象中。在一些实施方式中，结合复合物在抗体与纯化的蛋白质抗原或包含抗原的分离蛋白质之间形成，其中抗原不是处于其原始的原位构象中。在一些实施方式中，结合复合物在抗体与纯化的蛋白质抗原之间形成，其中抗原不是处于其原始的原位构象中且是固定在固体支持物(例如，PVDF膜)上。在一些实施方式中，结合复合物用抗体和例如以原始构象原位地存在(例如，在细胞的表面上)的细胞表面蛋白形成。
结合复合物中的抗体可以可检测地标记或不标记。在一些实施方式中，结合复合物包含可检测地标记的抗体和非标记的抗体。在一些实施方式中，结合复合物包含可检测地标记的抗原。在一些实施方式中，结合复合物中的抗体固定于一个或多个固体支持物。在一些实施方式中，结合复合物中的抗原固定于一个或多个固体支持物。示例性的固体支持物在本文中公开且对于本领域技术人员是清楚的。结合复合物的前述实例不意图是限制性的。结合复合物的其它实例对于本领域技术人员是清楚的。
在任何检测、诊断和监测方法中，抗体(包括抗原结合片段)或抗原可以直接或间接地偶联于固体支持物表面。用于与固体支持物偶联的方法是标准的且可以通过共价和非共价相互作用完成。偶联方法的非限制性实例包括：吸附、交联、蛋白A/G-抗体相互作用和链酶亲和素-生物素相互作用。其它偶联方法对于本领域普通技术人员是很容易明白的。
在一些方面中，检测、诊断和监测方法包括将与抗原(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素)结合的抗体(包括抗原结合片段)的水平与一个或多个参照标准比较。参照标准可以是，例如，具有或不具有原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的受试者中的相应原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的水平。在一个实施方式中，参照标准是在不包含原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的样品中检测的原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的水平(例如，背景水平)。或者，背景水平可以通过使样品与非特异性抗体(例如，从非免疫血清获得的抗体)接触从含有特定原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的样品测定。然后再次，参照标准可以是在确实含有原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的样品中检测的原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的水平(例如，阳性对照)。在一些情况中，参照标准可以是与样品中原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的变化浓度相关的且可用于定量测试样品中原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的浓度的一系列水平。参照标准的前述实例不是限制性的且其它合适的参照标准对于本领域普通技术人员是容易明白的。在一些实施方式中，与原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素结合的抗体的水平与成熟肌生长抑制素的水平比较。在一些情况中，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的水平与成熟肌生长抑制素比较以确定样品中无活性肌生长抑制素与活性肌生长抑制素的比率。
原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的水平可以如本文中提供的从生物样品测量。生物样品是指可以从受试者或细胞获得的任何生物材料。例如，生物样品可以是全血、血浆、血清、唾液、脑脊液、尿液、细胞(或细胞溶解产物)或组织(例如，正常组织或肿瘤组织)。在一些实施方式中，生物样品是流体样品。在一些实施方式中，生物样品是实体组织样品。例如，组织样品可以包括，但不限于骨骼肌、心肌、脂肪组织以及来自其它器官的组织。在一些实施方式中，生物样品是活检样品。在一些实施方式中，实体组织样品可以使用本领域中的常规方法制成流体样品。
生物样品也可以包括细胞系的一个或多个细胞。在一些实施方式中，细胞系包括人细胞、灵长类细胞(例如，vero细胞)、大鼠细胞(例如，GH3细胞、OC23细胞)或小鼠细胞(例如，MC3T3细胞)。存在多种人细胞系，包括但不限于人胚肾(HEK)细胞、HeLa细胞、来自国立癌症研究所的60个癌症细胞系(NCI60)的癌细胞、DU145(前列腺癌)细胞、Lncap(前列腺癌)细胞、MCF-7(乳腺癌)细胞、MDA-MB-438(乳腺癌)细胞、PC3(前列腺癌)细胞、T47D(乳腺癌)细胞、THP-1(急性髓性白血病)细胞、U87(成胶质细胞瘤)细胞、SHSY5Y人成神经细胞瘤细胞(从骨髓瘤克隆)和Saos-2(骨癌)细胞。
进一步的实施方式涉及用于监测患有疾病或病症或者处于其风险中的受试者的疾病、病症或其任何治疗(例如，肌病或肌病治疗)的方法，包括：(a)从受试者获得生物样品，(b)使用检测原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的抗体测定生物样品中的原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的水平；和(c)一次或多次在(on one or more occasions)重复步骤(a)和(b)。肌生长抑制素已经用作肌肉萎缩的生物标志物，但是，当前可用的商业方法和试剂(例如，ELISA和蛋白质印迹中使用的抗体)或者不是对于肌生长抑制素特异性的，或者仅检测成熟肌生长抑制素或完全不检测肌生长抑制素。因此，本文提供了用于在疾病和/或病症(例如，肌肉萎缩)的背景下检测原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素用于诊断目的的方法和试剂(例如，抗体)。作为一个实例，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的水平可以在受试者中或来自其的生物样品中测量以检测或监测疾病或病症的进展。作为另一个实例，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的水平可以在受试者中或来自其的生物样品中测量以监测对于疾病或病症的治疗的反应。应理解，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的水平可以在任何合适的时间段内监测，这可能根据受试者患有的疾病或病症或者受试者可能经历的任何治疗方案而不同。
另一实施方式涉及包含上述抗体、抗原结合片段、多核苷酸、载体或细胞中任一种及任选地用于检测的合适方式的诊断组合物。例如，抗体适合用于免疫分析中，其中它们可以在液相中使用或结合于固相载体。可以利用该抗体的免疫分析的实例是直接或间接形式的竞争性和非竞争性免疫分析。这样的免疫分析的实例是酶联免疫分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、夹心(免疫测定分析)、流式细胞分析、蛋白质印迹分析、免疫沉淀分析、免疫组织化学、免疫显微术、横向流免疫色谱分析和蛋白质组学阵列。抗原和抗体可以结合于许多不同的固体支持物(例如，载体、膜、柱、蛋白质组学阵列等)。固体支持物材料的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚偏氟乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和修饰纤维素如硝基纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。支持物的性质可以是固定的(fixed)或悬浮在溶液中(例如，珠)。
按照进一步的实施方式，本文提供的抗体(包括抗原结合片段)也可以用于通过从受试者获得生物样品(其可以是组织样品、血液样品或任何其它适宜的体液样品)评估受试者中的原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素表达的方法中。该过程可以包括在使得能够形成抗体和抗原之间的结合复合物的条件下使血液样品(全血、血清、血浆)、组织样品或从其分离的蛋白质样品与抗体接触。这样的结合复合物的水平然后可以通过任何合适的方法测定。在一些实施方式中，生物样品在适合于抗体与原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素蛋白(如果该抗原存在于样品中)的结合及形成由与抗原结合的抗体组成的结合复合物的条件下与抗体接触。这一接触步骤通常在反应室如管、平板孔、膜浴、细胞培养皿、显微镜载片等中进行。在一些实施方式中，抗体固定在固体支持物上。在一些实施方式中，抗原固定在固体支持物上。在一些实施方式中，固体支持物是反应室的表面。在一些实施方式中，固体支持物是聚合物膜(例如，硝基纤维素条、聚偏氟乙烯(PVDF)膜等)。可以使用其它合适的固体支持物。
在一些实施方式中，抗体在与抗原接触之前固定在固体支持物上。在其它实施方式中，抗体的固定在结合复合物形成后进行。在再其它的实施方式中，抗原在结合复合物形成之前固定在固体支持物上。检测试剂添加到反应室以检测固定的结合复合物。在一些实施方式中，检测试剂包含针对抗原的可检测地标记的第二抗体。在一些实施方式中，第一抗体本身可检测地标记，且因而是检测试剂。
在一个方面中，检测方法包括将抗体固定于固体支持物上；在允许抗原与抗体(如果存在于样品中)的结合的条件下将样品(例如，生物样品或分离的蛋白质样品)应用于固体支持物；从固体支持物除去过量的样品；在允许可检测地标记的抗体与抗原结合的固定抗体的结合的条件下应用可检测地标记的抗体；洗涤固体支持物并测定固体支持物上标记物的存在的步骤。
在一些实施方式中，抗原在反应室(例如，膜浴)中与抗体接触之前固定于固体支持物如PVDF膜上。检测试剂添加到反应室以检测固定的结合复合物。在一些实施方式中，检测试剂包含针对抗原的可检测地标记的第二抗体。在一些实施方式中，检测试剂包含针对第一抗体的可检测地标记的第二抗体。如本文中公开的，可检测的标记可以是，例如，放射性同位素、萦光团、发光分子、酶、生物素部分、表位标签或染料分子。在一些实施方式中，第一抗体本身可检测地标记，且因而是检测试剂。合适的可检测标记在本文中描述，且对于本领域技术人员是容易明白的。
因此，提供了适合家庭或临床使用(现场使用)的诊断试剂盒，其包含(a)作为抗原结合试剂(例如，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素结合试剂)的可检测地标记的和/或非标记的抗体；(b)检测试剂；及任选地，(c)使用该试剂检测样品中的抗原的完整说明。在一些实施方式中，诊断试剂盒包括抗体和/或固定在固体支持物上的原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素。任何本文所述的固体支持物适合于加入诊断试剂盒中。在优选的实施方式中，固体支持物是平板孔的反应室的表面。通常，平板孔是在具有选自6、12、24、96、384和1536的孔数目的多孔板中，但不限于此。在其它实施方式中，诊断试剂盒提供可检测地标记的抗体。诊断试剂盒不限于这些实施方式，且试剂盒组成的其它变化对于本领域技术人员是容易明白的。
本发明进一步通过以下实施例举例说明，该实施例不意图以任何方式进行限制。整个本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的全部内容以及附图和序列表由此通过引用合并于此。
实施例
实施例1：抗体的产生和选择
抗体总结
Ab2是IgG4/λ同种型的全人抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素单克隆抗体，其以高亲和力(Kd＝3420pM，通过ForteBio BLI测定)结合人原-肌生长抑制素和潜伏-肌生长抑制素。抗体能够以0.5微摩尔范围(这处于或接近分析的极限)的IC50值抑制原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的蛋白水解激活。多肽的理论分子量是144,736Da且其理论pI是6.7。使用抗体展示进行亲和力优化以鉴定较高亲和力的变体Ab4和Ab6。亲和力优化的变体类似地在人IgG4/λ同种型框架上构建。
表4：候选抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体的生物化学性质
Figure SMS_18
亲本抗体的平台和鉴定
亲本Ab1抗体使用原-肌生长抑制素和潜伏-肌生长抑制素作为用于选择的主要抗原通过原始噬菌体展示文库的选择来鉴定。噬菌体选择和初始筛选使用与通过McCafferty等(McCafferty等,1990)所述的类似的形式的展示常规scFv的文库进行。各轮选择由预清除(用于除去非特异性噬菌体抗体)、与抗原孵育、洗涤、洗提和扩增组成。选择使用固体相(免疫管上包被的生物素化抗原)和溶液相(使用链酶亲和素包被的珠捕获的生物素化抗原)淘选策略两者通过多轮进行。
总计10,000个单独scFv克隆通过两个单独的行动筛选与原-肌生长抑制素或潜伏-肌生长抑制素的结合。第一程序利用原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素作为抗原，而第二行动使用潜伏肌生长抑制素作为抗原。用于目标scFv克隆的DNA被测序并鉴定216个独特的克隆。阳性结合scFv克隆针对与proGDF11以及与一组非相关的蛋白质的结合进行反向筛选以确认对于原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的特异性。从该组独特的scFv克隆，(134个GDF8特异性克隆)中的101个转化为全长IgG(IgG1同种型)用于另外的表征。
全长IgG抗体进一步通过ELISA鉴定与人和鼠的肌生长抑制素和GDF11的原-和潜伏-形式的结合。抗体也筛选与肌生长抑制素前结构域、proTGFβ(人和鼠)、肌生长抑制素的成熟生长因子、GDF11成熟生长因子、激活素A生长因子和原激活素A的结合。前导抗体基于其与人和鼠原肌生长抑制素和潜伏肌生长抑制素的交叉反应性而没有与GDF11、激活素或TGFβ蛋白的相互作用来选择。
使用两种形式的表位淘选。首先，设计和产生嵌合构建体，其交换肌生长抑制素和GDF11的前结构域的部分。这些嵌合蛋白通过ELISA测定与筛选抗体的相互作用。表位装箱(epitope binning)使用ForteBio BLI仪器完成，其中生物素化的原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体固定在链酶亲和素包被的生物传感器芯片上，且通过传感器反应评估抗体的交叉阻断。这些表位装箱实验与来自ELISA结合实验的数据一起允许我们的功能活性前导抗体(参见以下)分离成三个不同表位组(参见表5)。
表5：五种抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素IgG1抗体的分级
Figure SMS_19
*通过单因素ANOVA与Dunnett的统计学显著性。
Ab8不结合潜伏肌生长抑制素，仅结合原肌生长抑制素。鼠原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素制备物具有～40％的潜伏物质，其在功能分析中降低明显功效。
ND：未测定。
为了评估抗体结合和抑制原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的激活的能力，建立了多种生物化学和细胞学分析。与原-肌生长抑制素和潜伏-肌生长抑制素的结合动力学通过ForteBio Octet测量，其中生物素化的底物蛋白固定在链酶亲和素包被的传感器芯片上。来自筛选的候选者的平衡解离常数显示在表5中。
为测量IgG抑制肌生长抑制素信号传导的能力，开发了肌生长抑制素激活分析。产生了来自过表达mTll2(肌生长抑制素激活需要的tolloid蛋白酶)或弗林蛋白酶(从前结构域切割成熟生长因子的前体蛋白转化酶)的细胞的条件培养基。在与测试抗体预孵育后，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素或潜伏肌生长抑制素与mTll2和弗林蛋白酶条件化培养基的混合物(原肌生长抑制素)或mTll2条件化培养基(潜伏肌生长抑制素)一起孵育。在过夜蛋白水解反应后，成熟生长因子的释放使用293T细胞中的CAGA-基报告分析测量。抗体进一步在相同的分析中通过剂量反应验证，其结果显示于表5中。
五种亲本抗体(表5)在所有以上分析中一致地表现出强选择性和活性，且还进行选择用于进一步的体内表征(实施例2中讨论的)。为了一致性，这些抗体对于原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的结合和活性被总结，如Ab8不识别潜伏肌生长抑制素。
为确定抗体候选者的作用机制，样品使用针对肌生长抑制素的前结构域产生的多克隆抗体通过蛋白质印迹进行分析，如图3中所示。这允许追踪肌生长抑制素前结构域的片段(加框的)，该片段在mTll2切割后产生。随着Ab1浓度的提高，在这一片段的产生中看到剂量依赖性的降低。这一实验表明在表位元1中的抗体通过阻断蛋白酶tolloid家族对原-肌生长抑制素和潜伏-肌生长抑制素的切割发挥作用。
基于活性抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体的体外和体内活性，Ab1选择为用于进一步表征(包括亲和力成熟、种系化(germlining)和可制造性分析)的先导。
Ab1的优化
Ab1抗体选择用于进一步表征。对于原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的亲和力使用酵母展示优化。另外，Ab1的序列被种系化以降低人可变区框架内的非种系氨基酸位置的潜在免疫原性倾向。
Ab1通过酵母展示的亲和力优化
Ab1亲本抗体使用基于酵母的scFv展示途径对于与原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的结合进行优化。简言之，产生三个不同的scFv文库以基于使用抗体深度测序在天然人抗体库中观察到的氨基酸频率对应于Ab1利用的人框架引入点突变到所选择的CDR位置。各文库包含具有引入各CDR中的单一点突变的基于Ab1序列的scFv，使得所得重链或轻链的各变体具有总共三个置换，每个CDR中一个。三个文库用于基于FACS的分选和选择以鉴定具有对于原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的较高亲和力的克隆池(图23)。酵母表达的scFv克隆的直接结合用于选择用于转化成哺乳动物细胞培养物中表达的全长IgG的抗体。
在酵母行动中鉴定的许多较高亲和力的scFv克隆包含重链的位置28处的置换。对于一些克隆，苏氨酸至天冬酰胺的置换导致CDRH1内非正则N-糖基化基序的加入。由于抗体可变区内的N-糖基化可能是不希望的，包含糖基化基序的任何克隆进一步置换以在这一位置包含丙氨酸。
与原-肌生长抑制素和潜伏-肌生长抑制素的结合动力学然后通过octet对于各亲和力优化的构建体进行评价并与亲本Ab1进行比较(实施例2中讨论的)。所有克隆显示显著提高的对于肌生长抑制素的结合亲和力，且两个克隆(Ab3和Ab5)基于相对于GDF11的选择性结合特征来选择。
抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体的初级序列和骨架
亲本Ab1与其亲和力优化的变体的可变区的序列比对显示如下。互补决定区(CDR)使用Kabat(加下划线)和IMGT命名法(黑体)定义。从亲本Ab1的置换以红色小写显示(以下和图24A-24B)。
A.重链可变区
Figure SMS_20
B.轻链可变区
Figure SMS_21
抗体工程和同种型选择的基本原理
在一些实施方式中，可用于肌生长抑制素阻断的抗体将缺乏效应子功能。因此对于人源化构建体，选择IgG4-Fc区。IgG4同种型的抗体较差地结合补体C1q且因此不显著地激活补体。这些抗体也与Fcγ受体弱结合，从而导致不足的或缺乏抗体-依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
为避免由于Fab-臂交换(其已知发生于原始IgG4 mAb)导致的潜在并发症，Ab1及其变体用稳定性“Adair”突变工程化(Angal,1993)，其中丝氨酸228(EU编号；残基241，Kabat编号)转化为脯氨酸，导致IgG1-样(CPPCP(SEQ ID NO:58))铰链序列。这一工程化的Fc-序列用于生产批准的抗体Keytruda、Mylotarg和Tysabri以及多种当前的后期临床候选mAb。
种系化和免疫原性风险评价
Ab1亲本抗体及其变体是源自噬菌体展示的全人IgG4(S228P)λ抗体。抗体的Fc部分包含单一稳定性突变以防止Fab臂交换(如上所述)。该IgG4 Fc不预期具有可测量的与Fcγ受体的结合(参见实施例2)。如从全人原始噬菌体文库分离的Ab1的可变框架区包含五个非种系氨基酸(参见以下和图22)。互补决定区(CDR)使用Kabat命名法定义和加下划线。非种系残基以小写显示。
A.重链可变区
Figure SMS_22
B.轻链可变区
Figure SMS_23
Figure SMS_24
为减轻对于免疫原性的潜能，产生另外的Ab1分子的变体，其将非-种系框架残基替换为其相应的种系氨基酸。在一些实施方式中，涉及Ab1的置换可以类似地应用于Ab3和Ab4或者种系化对于其合适的本文公开的任何抗体。
Ab1与其亲和力优化的变体的可变区序列比对显示如下：A.)重链、B.)轻链。互补决定区(CDR)使用Kabat(加下划线)和IMGT命名法(黑体)定义。存在于亲本Ab1中的框架区置换以小写显示。
A.重链可变区
Figure SMS_25
B.轻链可变区
Figure SMS_26
Figure SMS_27
五个置换中的三个被发现远离CDR区且因此对结合没有影响。轻链的位置2处的脯氨酸针对CDRL3包装，且置换为种系丝氨酸实际上通过稳定CDR构象而改善与原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的结合。
总体上抗体为高于99％的人的(计算为100％减去％非种系AA，排除CDRH3)。不存在化学缀合。重链CDRH2序列包含潜在的异构化倾向(Asp-Gly)，其也存在于种系IgHV3-30序列中。
实施例2：药理学表征
体外药理学分析
总共24个优化的Ab1变体作为IgG4表达和纯化，并测定改善的结合和功能活性。对这些分子的改变包括对亲本可变区的种系化突变以及CDR中的突变(其在亲和力成熟筛选中赋予提高的对原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素的结合)(参见实施例1)。
Ab1变体在几种不同的基于ELISA的分析中筛选，其中与原肌生长抑制素和潜伏肌生长抑制素蛋白(人、鼠和食蟹猴)的结合与阴性对照蛋白的大量筛选一起重新评价以验证非特异性结合不因为亲和力成熟而引入。阴性对照包括GDF11蛋白(proGDF11、潜伏GDF11和成熟GDF11)、TGFβ蛋白和激活素蛋白(原激活素)。另外，抗体在与之前公布的(Hotzel等,2012)相似的筛选中评价多特异性(其可导致快速清除)。在多特异性筛选中具有与阴性对照蛋白或与杆状病毒颗粒的显著相互作用的任何抗体不进一步考虑作为用于开发程序的候选者。
24个优化的Ab1变体也在原肌生长抑制素激活分析中评价以测定其功能效力，且来自剂量反应曲线的EC50值与亲本Ab1抗体比较。大多数抗体具有等同或改善的EC50值，少数在这一分析中显示出降低的效力。在活性分析中具有降低的效力的那些从进一步的分析中排除。
鉴定了具有改善的与原肌生长抑制素和潜伏肌生长抑制素的结合而同时保持对于原肌生长抑制素和潜伏肌生长抑制素的特异性的三个Ab1变体。这三个变体和亲本Ab1分子的结合和活性数据总结于表4-7中，序列显示于实施例1中。
表6：针对人/食蟹猴/小鼠原肌生长抑制素的抗体与亲本Ab1IgG4的结合特征。
Figure SMS_28
表7：针对人/食蟹猴/小鼠原肌生长抑制素的抗体与具有替换为非种系化残基的正确种系残基Ab1 IgG4(Ab2)的结合特征。
Figure SMS_29
表8：针对人/食蟹猴/小鼠原肌生长抑制素的抗体与包含校正的种系残基的Ab3IgG4(Ab4)的结合特征。
Figure SMS_30
表9：针对人/食蟹猴/小鼠原肌生长抑制素的抗体与包含校正的种系残基的Ab5IgG4(Ab6)的结合特征。
Figure SMS_31
基于细胞的离体和体内生物活性分析
在剂量反应研究中，Ab1优化变体在GDF8激活分析中评价。在这些实验中，0.5μM原肌生长抑制素与增加量的测试品预孵育。在这一预孵育步骤后，添加来自过表达mTll2和弗林蛋白酶的HEK293细胞的条件化培养基以从原肌生长抑制素释放成熟生长因子。在30℃下孵育过夜后，物质添加到携带SMAD-基萦光素酶报告质粒的293T细胞，且记录释放的物质的活性。来自筛选的数据显示于图4中。
相对于其它TGFβ家族成员对肌生长抑制素的选择性
候选抗体的选择性也通过结合和功能分析两者评价以验证对于TGFβ家族的其它成员的交叉反应性的缺乏。人肌生长抑制素和GDF11在成熟生长因子结构域中共有90％同一性，且在前结构域区域中共有47％同一性。从表位作图研究确定，亲本Ab1分子识别原肌生长抑制素和潜伏肌生长抑制素的前结构域上的表位，因为ELISA分析已经显示这一抗体与由肌生长抑制素的前结构域组成的构建体的结合。尽管肌生长抑制素和GDF11的前结构域共有小于50％的同一性，且我们不预期显著的交叉反应性，但先导抗体的特异性被仔细地评估。
开发了用于检测目标抗体和阴性对照试剂之间的相互作用的灵敏分析。在这一分析中，生物素化proGDF11或生物素化原肌生长抑制素固定在ForteBio BLI链酶亲和素包被的传感器尖端上，其应用于包含30μg/mL的抗体的孔。分析物与固定在芯片上的蛋白质的相互作用通过生物传感器芯片的反应强度测量。在5分钟的结合后的生物传感器反应(对于proGDF8的饱和信号)在两个抗原之间比较，并表示为对于GDF8结合的百分反应。与对于原肌生长抑制素测量的稳定结合事件相比，所有抗体具有与proGDF11的最小相互作用。
表10：在候选分子的高浓度下与proGDF11的相互作用
表示为GDF8反应的百分比的GDF11反应
Ab1 1.33％
Ab2 0.81％
Ab4 2.51％
Ab6 2.07％
抗体候选者也在GDF11激活分析中评估。在这一分析中，50nM proGDF11与提高浓度的抗体预孵育。在预孵育后，添加来自过表达BMP-1(tolloid家族蛋白酶)和PCSK5(对于GDF11特异性的弗林蛋白酶家族成员)的HEK293细胞的条件化培养基以蛋白水解激活proGDF11。在30℃下过夜孵育后，反应混合物在基于SMAD的报告细胞系中针对GDF11活性进行评价。如表10中所示，抗-肌生长抑制素抗体不抑制proGDF11激活，而阳性对照抗体施加剂量依赖性的GDF11激活的抑制。
抗体候选者的结合亲和力使用利用了生物层干涉测定法的FortéBio Octet QKe浸试即读无标记分析系统测定。抗原在各实验中固定于生物传感器(对于proGDF8、proGDF11和原激活素的链酶亲和素包被的生物传感器；对于所有其它抗原的直接胺偶联)且抗体/构建体以高浓度(50μg/mL)存在于溶液中以测量结合相互作用。
表11：抗体对于与不同形式的几种TGFβ家族成员的结合的比较。
Figure SMS_32
*非特异性结合。
来自抗原结合研究的结果总结于表11中。存在一些计算的Kd值，其与具有不良结合反应的数据符合，这在表中作为弱的非特异性结合表示(*)。
由于表11中使用的proGDF8样品包含大约10-15％的潜伏GDF8，单独的实验用于确认proGDF8特异性地与人和鼠GDF8抗原结合。另外，激发的GDF8(其中proGDF8通过前体蛋白转化酶和tolloid蛋白酶两者蛋白水解切割)也评价与Ab2和AbMyo的结合亲和力。对于这些实验，人proGDF8的同源制备物从在30μM癸酰基-RVKR-CMV存在下培养的稳定整合的293细胞纯化。激发的人GDF8通过利用来自mTll2-过表达细胞的条件化培养基和纯化的弗林蛋白酶的proGDF8的体外切割产生。在这些蛋白质的结合实验中，150nM的Ab2或AbMyo用于饱和人Fc捕获尖端(FortéBio)上的固定位点，且评估150nM分析物的结合和解离。
也评价与鼠蛋白质的结合亲和力的分析并报告在表12中。鼠proGDF8蛋白通过用紧密地识别潜伏和成熟GDF8的抗体(AbMyo2)经负向选择从样品除去所有成熟和潜伏鼠GDF8来产生。50nM的抗体用于饱和抗-人Fc捕获尖端(FortéBio)。最初，所有抗体针对单一200nM浓度的鼠proGDF8、鼠潜伏GDF8和成熟GDF8进行测试。如果观察到结合，Kd值通过如之前所述固定抗体和使用通过3-倍稀释的200-0.82nM滴定的分析物测定。Kd利用FortéBio数据分析软件8.2使用全局拟合确定。对于与成熟肌生长抑制素的结合，5ug/mL的生长因子(R&D systems)在pH 5的乙酸盐缓冲液中与胺反应性传感器尖端(FortéBio)偶联。所有抗体初始以333nM测试与这一肌生长抑制素-偶联传感器的结合。显示出结合的抗体然后在通过3倍稀释的333-1.37nM范围的浓度中测试。全局拟合用于使用FortéBio数据分析8.2确定相互作用的Kd。
表12：抗体对于与不同形式的人和鼠GDF8的结合的比较。
Figure SMS_33
Figure SMS_34
来自抗原结合研究的结果总结在表12中。没有可检测的结合的实验通过负号(-)注明。一些值，标记为<1E-12，具有非常低的解离速率，使得高亲和力不能被量化。令人惊异地，AbMyo不能识别重组proGDF8，其与Latres等2015中报告的结果不同，在该文献中作者报道了在来自用抗体给药的小鼠的血清的免疫沉淀实验中AbMyo与proGDF8的结合，其可产生假象。另一令人惊异的结果是Ab2和激发的GDF8(GDF8与tolloid-切割的前结构域的复合物)之间的相互作用。这一结果是出人意料的，因为Ab2阻断前结构域的tolloid切割并表明Ab2与proGDF8和潜伏GDF8的相互作用不需要完整的tolloid切割位点。
Fc-区功能性的评估
在一些实施方式中，抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素疗法涉及与可溶性靶标(原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素)的结合和防止蛋白水解激活。在一些实施方式中，抗体依赖性的细胞介导细胞毒性和补体固定不参与这一过程。Ab1及其相关变体经工程化以包含IgG4-Fc区。应理解IgG4抗体一般由于其与补体组分C1q和Fcγ受体的弱结合而缺乏效应子功能。
为证明降低的效应子功能的能力，Ab1和相关抗体通过ELISA测试与CD64(FcgRI)和C1q的结合。为进行比较，也制备Ab1的IgG1变体。在这一分析中，所有IgG4抗体与IgG1相比显示出与CD64和C1q的显著较弱的结合(10至20-倍)。EC50下的相对结合值列于表13中。
表13：Ab2和相关抗体对CD64的相对结合亲和力。
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Figure SMS_36
未测定
Ab1及其相关变体与CD64和C1q的表观结合亲和力与其它IgG4临床候选抗体相似，且与IgG1同种型的抗体相比显著降低。基于IgG4抗体的生物学，因此得出抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体在体内不诱导明显的效应子功能的结论。
动物模型中的效力
基于体外表征，选择四种抗体在体内研究中测试(Ab7、Ab1、Ab8和Ab9)。该研究的目的是评价这四种候选抗体调节小鼠肌肉质量的能力。十只(10)雌性SCID小鼠的五个(5)组在第0、7、14、21、28和35天每周一次通过腹膜内(IP)注射接受测试品施用。在测试品施用(第0天)之前，所有动物进行握力评估。握力评估也在研究的最后一天(第42天)进行。在第0天，通过眼球后取血收集血液用于全血计数(CBC)的评价。在给药后，动物每日评估体重和总体健康观察。在第42天，在握力评价后，动物通过CO2过量处死且血液通过心脏穿刺收集用于CBC评价。收集另外的血液用于制备血浆。分离各种组织并称重。收集的肌肉是：腓肠肌、胸肌、比目鱼肌、三头肌、胫骨前肌、四头肌(股直肌)和膈肌。收集的器官是：心脏、肾脏、脾脏、肝脏和腹股沟白色脂肪组织。除腓肠肌(其在福尔马林(腿1)和OCT(腿2)中固定用于组织学分析)外，所有组织称重并急冻。
总结
在研究SCH-02中对于动物的平均每日百分重量变化数据显示于图6中。所有五个组中的动物每周体重增加。用抗体Ab1处理的动物如图6中显示的具有最大的体重增加(14.6％)。与溶剂(PBS)对照组中的动物相比，仅Ab1处理的动物具有平均百分体重变化的统计学显著的增加(图6)。
所切除的肌肉的重量在图7和8中作图。与溶剂(PBS)对照处理的动物相比，用Ab1处理的动物具有腓肠肌(图7A)和膈肌(图8B)重量的统计学显著的增加，分别为27.6％和49.8％。与PBS对照相比，来自Ab1处理动物的另外的肌肉显示重量的增加，但这些差异不是统计学显著的。对于心脏、脾脏、肾脏、肝脏和脂肪组织的平均组织重量，处理组之间不存在统计学显著的差异。
SCID剂量反应研究
在体内研究(以上)中，Ab1以每周一次25mg/kg给药，持续6周的动物与给予溶剂(PBS)的动物相比显示出统计学显著的体重和肌肉重量(腓肠肌和膈肌)的增加。Ab1的这种肌肉增强活性接下来在SCID小鼠的剂量反应研究中更详细地进行研究。在这一研究中，检验了是否对肌肉质量的作用的强度可以通过增加Ab1的剂量到高达60mg/kg/wk而提高和是否对肌肉质量的作用的强度可以通过降低Ab1的剂量到低至2mg/kg/wk而降低。在这一研究中，Ab1的活性与另两种抗体(Ab8，其原来在上述研究上测试，Ab10)比较。
十只(10)雌性SCID小鼠的十(10)个组在第0、3、7、10、14、17、21和24天每周两次通过腹膜内(IP)注射(10ml/kg)接受测试品施用。测试品的剂量如下：Ab1(30mg/kg、10mg/kg、3mg/kg和1mg/kg)、Ab10(10mg/kg和3mg/kg)和Ab8(10mg/kg和3mg/kg)。对照组用PBS和IgG-对照(30mg/kg)给药。处理组描述于表14中。动物在研究开始时是10周龄的。体重在第-4天和在整个研究中每周两次(对应于给药日)测量。身体质量组成参数(脂肪量、瘦体重和水含量)通过Echo MRI(QNMR)在第-4、7、14、21和28天测量。在第一抗体剂量后三十(30)天，动物通过CO2过量处死且血液通过心脏穿刺收集用于CBC评价和血浆制备。另外，在研究结束时，分离各种组织并称重。收集的肌肉是：腓肠肌、比目鱼肌、胫骨前肌、四头肌(股直肌)和膈肌。肌肉从研究小鼠的右腿和左腿两者切除。为进行分析，将来自两只腿的单个肌肉的重量组合并计算按克计的平均肌肉重量。收集的其它组织是：心脏、肾脏、脾脏、肝脏和脂肪组织。除腓肠肌(其在福尔马林(左腿)和OCT(右腿)中固定用于组织学分析)外，所有组织称重并然后急冻。
表14：研究设计
处理组 测试品剂量 剂量#/周 总剂量/周 动物ID
1 PBS对照 2 0 1-10
2 IgG对照(30mg/kg) 2 60mg/kg/wk 11-20
3 Ab1(30mg/kg) 2 60mg/kg/wk 21-30
4 Ab1(10mg/kg) 2 20mg/kg/wk 31-40
5 Ab1(3mg/kg) 2 6mg/kg/wk 41-50
6 Ab1(1mg/kg) 2 2mg/kg/wk 51-60
7 Ab10(10mg/kg) 2 20mg/kg/wk 61-70
8 Ab10(3mg/kg) 2 6mg/kg/wk 71-80
9 Ab8(10mg/kg) 2 20mg/kg/wk 81-90
10 Ab8(3mg/kg) 2 6mg/kg/wk 91-100
来自用溶剂(PBS)、IgG对照和不同剂量的Ab1处理的动物的平均百分重量变化和平均百分瘦体重变化数据显示于图9中。用20和60mg/kg/wk剂量的Ab1处理的动物与IgG对照处理的动物相比在研究的第28天具有显著的体重增加，分别为15.3％和14.4％(图9A)。用Ab1(60、20、6和2mg/kg/wk剂量)处理的所有四组动物与IgG对照处理的动物相比在研究的第28天具有统计学显著的瘦体重增加，分别为14.1％、12.4％、17.1％和15.5％(图9B)。
四种肌肉(四头肌(股直肌)、腓肠肌、胫骨前肌和膈肌)的重量在图10中作图。比目鱼肌也切除，但肌肉的小尺寸导致高度可变的数据集。用所有剂量的Ab1处理的动物与IgG对照动物相比具有统计学显著的肌肉重量增加(图10)。与IgG对照相比肌肉质量的平均百分变化在各肌肉曲线上相应的条上方显示。四头肌(股直肌)的平均百分重量变化范围为从最高剂量的20.5％至最低剂量的10.7％(图10A)。腓肠肌的平均百分重量变化范围为从最高剂量的17.7％至最低剂量的15.9％(图10B)。胫骨前肌的平均百分重量变化范围为从最高剂量的24.0％至最低剂量的18.0％(图10C)。膈肌的平均百分重量变化对于所有剂量组大于30％(图10D)。对于心脏、脾脏、肾脏、肝脏和脂肪组织的平均组织重量在处理组之间不存在统计学显著的差异。
地塞米松诱导的肌肉萎缩模型中的抗-肌生长抑制素抗体处理
既然已知抗-肌生长抑制素抗体Ab1在健康SCID小鼠中增加肌肉质量的能力，现确定是否Ab1处理也可以针对诱导肌肉萎缩的处理来保护动物。皮质类固醇诱导的肌肉萎缩的模型通过用其饮水中的地塞米松处理动物两周建立。选择的剂量(2.5mg/kg/天)能够诱导瘦体重和单个后肢肌肉的质量的显著降低。在以下实验中，动物用不同剂量的Ab1处理以确定它是否可以保护动物免于这种地塞米松-诱导的肌肉萎缩的影响。
在这一研究中，十只(10)雄性小鼠(C57BL/6)的八个(8)组以13.5周龄入组研究中。在研究的第0天开始，小鼠给予正常饮水(组1-4)或包含地塞米松的水(组5-8)。测试品在第0、3、7和10天每周两次通过腹膜内(IP)注射(10ml/kg)施用。测试品和剂量如下：PBS(组1和5)、10mg/kg IgG Ctl(组2和6)、10mg/kg Ab1(组3和7)和1mg/kg Ab1(组4和8)。处理组描述于表15中。体重在整个研究中至少每周测量两次。身体质量组成参数(脂肪质量、瘦体重和水含量)通过Echo MRI(QNMR)在第-1、6和13天测量。在第一抗体剂量后十四(14)天，动物通过CO2过量处死且血液通过心脏穿刺收集用于血浆制备。另外，在研究结束时，分离各种组织并称重。收集的肌肉是：腓肠肌、比目鱼肌、胫骨前肌、四头肌(股直肌)和膈肌。肌肉从研究小鼠的右腿和左腿两者切除。为进行分析，将来自两只腿的单个肌肉的重量组合并计算按克计的平均肌肉重量。收集的其它组织是：心脏、肾脏、脾脏、肝脏和脂肪组织。除腓肠肌(其在福尔马林(左腿)和OCT(右腿)中固定用于组织学分析)外，所有组织称重并然后急冻。
表15：用于地塞米松诱导萎缩症模型研究的处理组
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在这一实验中，确定小鼠用抗-肌生长抑制素抗体Ab1的处理是否可以保护动物免于皮质类固醇诱导的肌肉萎缩。在研究期间，体重每周测量两次且瘦体重在第-1、6和13天通过QNMR测量。非疾病对照组(组1)和地塞米松处理组(组5-8)中的动物的平均百分重量变化和平均百分瘦体重变化数据显示于图11中。在第14天这些处理组中任何组之间平均百分体重变化上不存在显著差异(图11A)。小鼠用地塞米松处理两周导致与给予正常饮水的对照组(组1)相比瘦体重的显著降低(组5和6)(图11B)。但是，用地塞米松和20mg/kg/wk的抗体Ab1两者处理的小鼠(组7)与对照组(组1)相比在研究的第14天没有显示瘦体重百分变化的显著差异。用20mg/kg/wk而非2mg/kg/wk的Ab1处理的动物当与任一地塞米松处理对照组(组5和6)比较时在第14天显示瘦体重百分变化的显著差异。
在地塞米松和测试品的两周处理结束时，切除单个肌肉并称重。两种肌肉(腓肠肌和四头肌(股直肌))的重量数据在图12A-12B中作图。通过其饮水接受地塞米松且也接受PBS或IgG对照抗体的动物与非疾病对照组(组1)相比显示腓肠肌和四头肌(股直肌)的显著萎缩(组5和6)。用地塞米松和20mg/kg/wk(而非2mg/kg/wk)的Ab1两者处理的动物(组7)在与任一地塞米松处理的对照组(组5和6)比较时显示肌肉重量的显著差异。另外，用地塞米松和20mg/kg/wk的抗体Ab1两者处理的小鼠(组7)在与非疾病对照组(组1)相比时没有显示腓肠肌和四头肌(股直肌)重量的显著差异。各组与对照组(组1，PBS和水)的平均肌肉重量相比的肌肉重量平均百分差异显示于图12C-12D中。地塞米松处理在PBS和IgG Ctl组中诱导的腓肠肌质量的百分降低分别是16.5％和18.9％。相反，用地塞米松和20mg/kg/wk的Ab1两者处理的动物仅具有腓肠肌肌肉质量的4.0％降低，其与非疾病对照组(组1)没有统计学差异。尽管用地塞米松和2mg/kg/wk的Ab1两者处理的动物(组8)仅具有腓肠肌肌肉质量的10％降低，该组的肌肉质量降低与PBS和IgG对照组(组5和6)的降低相比没有统计学差异。类似的结果对于四头肌(股直肌)观察到(图12D)。
石膏诱导肌肉萎缩模型中的Ab1处理
已知抗-肌生长抑制素抗体Ab1在健康SCID小鼠中增加肌肉质量的能力，研究了是否Ab1处理也可以针对诱导肌肉萎缩的处理来保护动物。失用性萎缩的模型通过对小鼠右腿打石膏两周建立。使足部处于跖屈位置对右腿打石膏持续这一时间段能够诱导单个后肢肌肉的质量的显著降低。在以下实验中，动物用不同剂量的Ab1处理以确定其保护动物免于这种石膏诱导的肌肉萎缩的程度。
表16：用于石膏诱导萎缩模型研究的处理组
Figure SMS_38
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在这一研究中，十只(10)雄性小鼠(C57BL/6)的八个(8)组以14.5周龄入组研究中。在研究的第0天开始，小鼠置于麻醉下且石膏以使足部处于跖屈位置应用于右后肢(组5-8)。对照组(组1-4)也置于麻醉下但不将石膏置于后肢上。测试品在第0、3、7和10天每周两次通过腹膜内(IP)注射(10ml/kg)施用。测试品和剂量如下：PBS(组1和5)、10mg/kg IgGCtl(组2和6)、10mg/kg Ab1(组3和7)和1mg/kg Ab1(组4和8)。处理组描述于表16中。体重在整个研究中至少每周测量两次。身体质量组成参数(脂肪质量、瘦体重和水含量)通过EchoMRI(QNMR)在第-1、7和14天测量。在第一抗体剂量后十四(14)天，动物通过CO2过量处死且血液通过心脏穿刺收集用于血浆制备。
另外，分离各种组织并称重。收集的肌肉是：腓肠肌、比目鱼肌、跖肌、胫骨前肌和四头肌(股直肌)。为进行分析，收集来自动物右后肢的单个肌肉的重量。收集的其它组织是：心脏、脂肪组织和脾脏。除腓肠肌(其在福尔马林中固定用于组织学分析)外，所有组织称重并然后急冻。
总结
在这一实验中，测试了小鼠用抗-肌生长抑制素抗体Ab1处理是否可以保护小鼠免于由右后肢打石膏诱导的失用性肌肉萎缩。在研究期间，体重每周测量两次且瘦体重在第-1、7和14天通过QNMR测量。非疾病对照组(组1)和打石膏两周的组(组5-8)的动物的平均百分重量变化和平均百分瘦体重变化数据显示于图13中。右后肢打石膏对体重增加没有任何负面作用(图13A)且组的任何瘦体重差异不是显著的(图13B)。
在两周研究结束时，切除单个肌肉并称重。两种肌肉(腓肠肌和四头肌(股直肌))的重量数据在图14A-14B中作图。腿部打石膏且也接受PBS或IgG对照抗体的动物与不打石膏的对照组(组1)相比显示腓肠肌和四头肌(股直肌)的显著萎缩(组5和6)。打石膏且也以20mg/kg/wk而非2mg/kg/wk给药Ab1的动物(组7)当与打石膏的对照组(组5和6)任一相比时显示肌肉重量的显著差异。另外，用20mg/kg/wk的抗体Ab1处理的打石膏的小鼠(组7)在与不打石膏的对照组(组1)相比时未显示腓肠肌和四头肌(股直肌)重量的显著差异。各组的肌肉重量与不打石膏的对照组(组1)的平均肌肉重量相比的平均百分差异显示于图14C-14D中。在PBS和IgG Ctl组中通过打石膏诱导的腓肠肌质量的百分降低分别是22.8％和23.5％。相反，用20mg/kg/wk的Ab1处理的打石膏小鼠仅具有10.0％的腓肠肌肌肉质量降低。这一差异发现与接受PBS和IgG Ctl抗体的打石膏对照组(组5和6)在统计学差异的。用2mg/kg/wk Ab1处理的打石膏小鼠的肌肉质量降低与PBS和IgG对照组(组5和6)的降低相比没有统计学差异。类似的结果对于四头肌(股直肌)观察到(图14D)。
原肌生长抑制素和潜伏肌生长抑制素的结构域结构(指示了蛋白酶切割位点)显示于图16A中。在SDS PAGE凝胶上运行的部分前体蛋白转化酶切割的原肌生长抑制素的实例显示于图16B中。在还原条件下，蛋白条带由原肌生长抑制素单体(～50kD)、前结构域(～37kD)和生长因子(12.5kD)组成。
Ab1特异性地结合原肌生长抑制素和潜伏肌生长抑制素，而没有观察到与TGFβ超家族的其它成员的结合，最显著地GDF11的对应形式(图17A)。Ab1以高浓度(50ug/mL)施用于用所示抗原包被的Forte-Bio BLI尖端并测量结合和解离速率以获得近似Kd值。生物传感器反应(指示结合事件)的强度通过黑色条图形表示，且计算的Kd以橙色指示。而且Ab1阻断原肌生长抑制素的激活，但不阻断proGDF11的激活(图17B)。
Ab1、Ab2、Ab4和Ab6的SCID剂量反应研究
之前的Ab1体内研究已经证明Ab1可以增加健康动物中的肌肉质量以及在小鼠肌肉萎缩模型(地塞米松和打石膏诱导的萎缩)中防止肌肉损失。抗体工程化工作鉴定了具有优于Ab1的体外特征的三种抗体。在这一研究中，在SCID小鼠中，这些抗体的体内活性在三个不同剂量下与早已确定的Ab1活性比较。
八只(8)雌性SCID小鼠的十四个(14)组在第0、3、7、10、14、17、21和24天每周两次接受通过腹膜内(IP)注射(10ml/kg)的测试品施用。测试品的剂量如下：Ab1、Ab2、Ab4和Ab6以3个不同剂量(10mg/kg、1mg/kg和0.25mg/kg)给予且IgG-Ctl抗体以10mg/kg给予。处理组描述于表17中。动物在研究开始时为10周龄。体重在整个研究中每周测量两次(对应于给药日)。身体质量组成参数(脂肪量、瘦体重和水含量)在第0、7、14、21和28天通过Echo MRI(QNMR)测量。在第一抗体剂量后二十八(28)天，动物通过CO2过量处死且血液通过心脏穿刺收集用于血浆制备。
另外，分离各种组织并称重。收集的肌肉是：腓肠肌、比目鱼肌、胫骨前肌、四头肌(股直肌)、趾长伸肌和膈肌。肌肉从研究小鼠的右腿和左腿两者切除。为进行分析，将来自两只腿的单个肌肉的重量合并并计算按克计的平均肌肉重量。收集的其它组织是：心脏、肾脏、脾脏、肝脏和脂肪组织。除左腓肠肌(其在福尔马林中固定用于组织学分析)外，所有组织称重并然后急冻。
表17：用于剂量反应模型研究的处理组
处理组 测试品剂量 剂量#/周 总剂量/周 动物ID
1 PBS对照 2 0 1-8
2 IgG对照(10mg/kg) 2 20mg/kg/wk 9-16
3 Ab1(10mg/kg) 2 20mg/kg/wk 17-24
4 Ab1(1mg/kg) 2 2mg/kg/wk 25-32
5 Ab1(0.25mg/kg) 2 0.5mg/kg/wk 33-40
6 Ab2(10mg/kg) 2 20mg/kg/wk 41-48
7 Ab2(1mg/kg) 2 2mg/kg/wk 49-56
8 Ab2(0.25mg/kg) 2 0.5mg/kg/wk 57-64
9 Ab4(10mg/kg) 2 20mg/kg/wk 65-72
10 Ab4(1mg/kg) 2 2mg/kg/wk 73-80
11 Ab4(0.25mg/kg) 2 0.5mg/kg/wk 81-88
12 Ab6(10mg/kg) 2 20mg/kg/wk 89-96
13 Ab6(1mg/kg) 2 2mg/kg/wk 97-104
14 Ab6(0.25mg/kg) 2 0.5mg/kg/wk 105-112
用溶剂(PBS)、IgG对照及不同剂量的Ab1、Ab2、Ab4和Ab6处理的动物的平均百分瘦体重变化(相对于第0天)数据显示于图15中。用20mg/kg/wk剂量水平的Ab1、Ab2、Ab4和Ab6处理的动物与IgG对照和溶剂(PBS)处理的动物相比在研究的第21天和第28天具有瘦体重的显著增加。用2mg/kg/wk剂量水平的Ab1和Ab2处理的动物在研究的第21和28天也具有瘦体重的显著变化。对于用0.5mg/kg/wk剂量水平的Ab1、Ab2、Ab4和Ab6处理的动物，没有相对于对照组的瘦体重的显著变化。
在研究结束(第28天)时，收集肌肉并称重。四头肌(股直肌)和腓肠肌的重量在图18A和18B中作图。用20mg/kg/wk剂量水平的Ab1、Ab2、Ab4和Ab6处理的动物与溶剂(PBS)处理的动物相比具有腓肠肌和四头肌(股直肌)肌肉重量的显著增加。用2mg/kg/wk剂量水平的Ab2和Ab4处理的动物也具有腓肠肌肌肉重量的显著变化。用2mg/kg/wk剂量水平的Ab2处理的动物也具有四头肌(股直肌)肌肉重量的显著变化。对于用0.5mg/kg/wk剂量水平的Ab1、Ab2、Ab4和Ab6处理的动物，相对于对照组没有肌肉质量的显著变化。用不同剂量的Ab1、Ab2、Ab4和Ab6处理的动物的腓肠肌和四头肌(股直肌)肌肉重量的百分差异(当与溶剂对照相比时)列于图18C中。
SCID小鼠中Ab1的作用研究的持续时间
在SCID小鼠中测试了在单一剂量后和3个每周剂量后Ab1增加瘦体重的能力。八只(8)雌性SCID小鼠的七个(7)组在第0天(组1-4)或在第0、7和14天每周一次(组5-7)通过腹膜内(IP)注射(10ml/kg)接受测试品施用。参见表18。抗体(IgG对照、Ab1和AbMyo)以10mg/kg给药。动物在研究开始时是10或11周龄。体重在整个研究中每周测量两次(对应于给药日)。身体质量组成参数(脂肪量、瘦体重和水含量)在第0、7、14和21天通过Echo MRI(QNMR)测量。
表18：处理组和给药频率
处理组 测试品 剂量(mg/kg) 给药频率
1 PBS对照 0 一次
2 IgG CTL 10 一次
3 Ab1 10 一次
4 AbMyo 10 一次
5 IgG CTL 10 每周一次
6 Ab1 10 每周一次
7 AbMyo 10 每周一次
用溶剂(PBS)、IgG对照、Ab1、AbMyo处理的动物的平均百分瘦体重变化数据显示于图19中。数据表示为相对于研究的第0天的瘦体重变化。在单一剂量的测试品后21天时，用Ab1处理的动物(组3)具有显著的瘦体重增加(与IgG对照动物-组1相比)，其与3个剂量的Ab1后的瘦体重变化(组6)不可区分。瘦体重的这些变化也与用单一剂量的AbMyo处理的动物(组4)或用3个周剂量的AbMyo处理的动物(组7)中看到的变化相当。
实施例3：化学/药物学
Ab2是具有位置228处替代丝氨酸的脯氨酸的IgG4亚型的人源化单克隆抗体。这产生IgG1-样铰链序列和最小化链间二硫键的不完全形成(这是IgG4特征性的)。Ab2重链和轻链的完整氨基酸序列显示如下。互补决定区(CDR)加下划线。紫色：N-连接的糖基化共有序列位点；浅蓝色：潜在的切割位点；红色：潜在的脱酰胺位点；浅绿色：潜在的异构化位点；深蓝色：潜在的甲硫氨酸氧化位点；黑体：预期的N-末端焦谷氨酸(图21A-21B)。
Ab1的分子建模鉴定了几个翻译后修饰的潜在位点。轻链中的两个天冬酰胺和重链中的七个天冬酰胺易于脱酰胺。这些残基中的两个位于重链的CDR区内。
原始IgG4 mAb可能具有重链间二硫键的不完全形成，其中两个半分子(各半分子包含一个重链和一个轻链)通过非共价相互作用保持在完整抗体结构中。IgG4分子可能易在体外和体内发生半分子的交换，且半分子的水平必须在制造批次间是一致的。IgG4结构的骨架中Ser至Pro的置换导致IgG1-样铰链序列，由此使得能够形成链间二硫键和显著地稳定抗体结构。铰链区的完整性和稳定性使用如非还原毛细管电泳和游离巯基的定量的这类分析在扩展表征的开发过程中监测。链交换的潜能在体内监测。
总结
本文提供了阻断原肌生长抑制素和/或潜伏肌生长抑制素的激活的原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素特异性抗体。这一激活阻断抗体施用于健康小鼠增加瘦体重和肌肉大小，其中仅需要单剂量在1个月的时间内维持肌肉增强作用。另外，抗体施用在两种独立的肌肉萎缩模型中保护健康小鼠免于肌肉萎缩。数据证明，阻断肌生长抑制素的激活促进稳健的肌肉生长和在体内防止肌肉萎缩，并代表了肌肉萎缩的治疗性干预的可选机制。
实施例4：原-肌生长抑制素和潜伏-肌生长抑制素在肌肉萎缩中的分析
进行蛋白质印迹以确定原肌生长抑制素和潜伏肌生长抑制素在肌肉萎缩过程中以及在正常状况中在肌肉组织和在循环中的存在。肌肉萎缩的标准模型包括用2.5mg/kg/周地塞米松(在饮水中给药)处理小鼠，并在处理的2周后收集肌肉和血浆。这一模型经常地在治疗过程中导致肌肉质量的15-25％降低。同时从未用地塞米松处理的小鼠收集对照肌肉和血浆。切除股直肌、胫骨前肌和比目鱼肌，在液氮中速冻和在-80℃下储存直到备用。肌肉溶解产物通过研磨，接着在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的T-PER缓冲液中裂解来产生。血浆通过标准方法收集并在-80℃下储存。
包含相同浓度的蛋白质的多个样品通过PAGE凝胶分离和蛋白质印迹到PVDF膜上。对于肌肉溶解产物，10-50ng总蛋白加载到凝胶上。血浆在PBS中1:10稀释且10μl的各样品加载到凝胶上。作为尺寸标准物，0.1-1ng重组原肌生长抑制素和/或潜伏肌生长抑制素也加载到凝胶上。肌生长抑制素蛋白的鉴定使用识别肌生长抑制素的前结构域的抗体(AF1539,R&D Systems)完成。这一分析显示原肌生长抑制素是肌肉中的支配形式，而潜伏肌生长抑制素是血浆中的主要形式(图25)。此外，经证明，在具有由地塞米松诱导的肌肉萎缩的小鼠中，原肌生长抑制素在肌肉组织中增加，而潜伏肌生长抑制素在血浆中降低。
为确认这些结果，蛋白质印迹使用萦光标记和检测重复(Azure Biosystems)。定量了来自正常和地塞米松处理小鼠的血浆中及股直肌和胫骨前肌中各种肌生长抑制素形式的相对水平。这些数据确认以上描述的结果，显示两种肌肉中原肌生长抑制素2-至2.5-倍的增加和血浆中潜伏肌生长抑制素2.3-倍的降低(图26)。
基于这些数据，给出正常和患病肌肉中肌生长抑制素“流”的模型。如证明的，在正常肌肉中(图28A)，原肌生长抑制素在肌肉中产生并通过弗林蛋白酶的切割转化成潜伏肌生长抑制素，该蛋白酶可能存在于细胞内或细胞外(Anderson等,2008)。肌肉中某些部分的潜伏肌生长抑制素然后释放到循环中，从而形成潜伏肌生长抑制素的循环池。在肌肉萎缩中，产生活性肌生长抑制素生长因子的增加，从而驱动肌肉萎缩。这种增加被认为通过肌肉中原肌生长抑制素水平的上调和潜伏肌生长抑制素转化成活性生长因子的增加来引起(图28B)。此处概述的数据直接支持这一模型的第一步，表明肌肉中增加的原肌生长抑制素。该数据也支持第二步，因为观察到地塞米松处理的小鼠中降低的肌肉质量，表明成熟肌生长抑制素产生增加而没有肌肉中潜伏肌生长抑制素的伴随增加。因此，血浆中肌生长抑制素的水平降低，表明对成熟肌生长抑制素的转化增加。
实施例5：从鼠血清和肌肉组织的免疫沉淀
进行免疫沉淀以确定循环中原肌生长抑制素的存在并研究Ab2和AbMyo与血清和肌肉中的内源肌生长抑制素前体的结合。Ab2识别肌肉中肌生长抑制素的主要形式。图27中显示的结果证明血清原肌生长抑制素的池随Ab2沉淀，表明具有体内存在的细胞外原肌生长抑制素。除与血清中的原肌生长抑制素、潜伏肌生长抑制素和肌生长抑制素的其它部分加工的形式结合外，Ab2从肌肉提取物免疫沉淀原肌生长抑制素。相反，AbMyo有效地结合血清中的潜伏肌生长抑制素和部分加工的前体，而没有与肌肉中原肌生长抑制素的可检测的相互作用。既然肌肉是其中肌生长抑制素信号传导发生的部位，这可以对于Ab2作用机制提供重要的优势。
匀浆的肌肉溶解产物如下制备：冷冻的小鼠四头肌(股直肌)使用CryoPrep粉碎机(Covaris,Woburn MA)研磨。研磨的肌肉然后在具有1x HaltTM蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物而没有EDTA(ThermoFisher Scientific)的M-Per缓冲液(ThermoFisher Scientific)中重悬浮至50mg/mL的浓度。组织然后使用塑料杵(Bio-Plas Cat#4030-PB)冲击并进一步用平头移液管尖端的重复吸打来均质化。肌肉样品然后在4℃下伴随端对端旋转孵育30分钟。最后，样品以16,100g离心10分钟以沉淀不溶性部分。可溶性部分吸出并用于下游实验中。
对于免疫沉淀，Ab2、IgG Ctl或AbMyo抗体使用Thermo Scientific PierceTM Co-Immunoprecipitation试剂盒按照制造商的说明书与琼脂糖珠共价偶联。75ug的各抗体与50uL的珠浆料偶联，且30ug的抗体用于各免疫沉淀中。免疫沉淀针对3mL的合并正常小鼠血清(Bioreclamation)或1.05mL的如上所述制备的均质化可溶性小鼠四头肌进行。抗体偶联的珠和样品在4℃下伴随端对端旋转孵育过夜。在孵育后，珠使用QIAvac 24Plus真空歧管(Qiagen)通过使整个样品体积经过包括在共免疫沉淀试剂盒中的旋转过滤器回收。珠然后用200uL的IP裂解/洗涤缓冲液洗涤3x，和按照试剂盒的说明用100μL的1x条件缓冲液洗涤一次。洗脱用50μL的洗脱缓冲液进行五分钟和然后在收集管中与5μL的1M Tris,pH 9.5混合。
通过测试抗体拉下的肌生长抑制素物质利用AF1539,(R&Dsystems)ab124721、(Abcam)Alexa
Figure SMS_40
680AffiniPure驴抗-绵羊IgG(H+L),(Jackson ImmunoResearch)和
Figure SMS_41
800CW驴抗-兔IgG(H+L)(LI-COR Biosciences)Thermo Scientific通过蛋白质印迹可视化。SEA BLOCK阻断缓冲液用于阻断和第一抗体孵育。
实施例6：用Ab2处理的大鼠中增加的肌肉质量和改变的肌生长抑制素蛋白表达
七至八周龄雌性Sprague-Dawley大鼠施用单一静脉内剂量的Ab2(10mg/kg)、非功能性人IgG对照抗体(10mg/kg)或等同体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在研究的过程中，血清在给药后的4小时、48小时、7天、14天、21天和28天从3只大鼠/组收集。收集通过标准方法进行且样品储存在-80℃下。瘦体重通过定量核磁共振(qNMR)在基线(第0天给药前)和在第7、14、21和28天时(8只大鼠/组)测量且骨骼肌(股直肌、胫骨前肌和比目鱼肌)在研究结束(第28天)时收集、称重和在液氮中速冻用于在-80℃下储存。
药物暴露以已知量的各药物用作参照标准使用对于人IgG特异性的ELISA在血清样品中测量。如图29中所示，注射后4小时，Ab2和IgG对照抗体在大鼠血清中检测。随着研究进展，Ab2与IgG对照相比表现出升高的循环药物水平，在研究结束时血清中具有平均17.1μg/ml的药物。
Ab2处理的药效学作用通过在研究过程中测量瘦体重(通过qNMR)和通过测定在研究结束时切除的肌肉的重量来评价。图30A显示研究过程中的瘦体重测量，其中用Ab2处理的大鼠与用PBS或用人IgG对照抗体处理的大鼠相比显示出瘦体重的明显增加。肌肉质量通过在研究结束(28天)时收集和称重整个骨骼肌而进行测量。如图30B中所示，用Ab2处理的大鼠分别显示股直肌和胫骨前肌肌肉质量的14％和11％的增加。总的说来，这些数据表明大鼠用单一剂量的Ab2处理导致肌肉质量的持久增加。
原肌生长抑制素和潜伏肌生长抑制素的相对水平通过肌肉溶解产物或血清样品的定量蛋白质印迹测定。肌肉溶解产物通过研磨，接着在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的T-PER缓冲液中裂解从速冻的肌肉样品产生。在裂解后，包含相同浓度的蛋白质的样品通过PAGE凝胶分离并蛋白质印迹到低萦光PVDF膜上。对于肌肉溶解产物，10-50ng总蛋白加载到凝胶上。血浆在PBS中1:10稀释且10μl的各样品加载到凝胶上。作为尺寸标准物，0.1-1ng重组原肌生长抑制素和/或潜伏肌生长抑制素也加载到凝胶上。肌生长抑制素蛋白的鉴定使用识别潜伏肌生长抑制素的前结构域的抗体(AF1539,R&D Systems)，接着用萦光标记的第二抗体的检测来完成。对于所有蛋白质印迹分析，测定最少三个样品/组。
Ab2的处理在大鼠血清中与IgG对照处理的大鼠相比提高潜伏肌生长抑制素水平～20-倍(图31A)。这些数据与对于其它抗体药物观察到的作用一致，从而反映了循环中药物靶标的结合。在大鼠肌肉(股直肌)中，Ab2处理导致肌生长抑制素的潜伏形式1.9x的增加(vs.IgG对照处理的大鼠)。没有观察到原肌生长抑制素的统计学显著的变化。这些数据表明Ab2结合其靶标，原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素，并改变肌肉中以及循环中的肌生长抑制素加工。还观察到Ab2处理增加大鼠肌肉中的潜伏肌生长抑制素，但不增加原肌生长抑制素(图31B)。
实施例7：用Ab2处理的小鼠中增加的肌肉质量和肌生长抑制素蛋白表达的改变及与比较抗-肌生长抑制素抗体的对比。
十周龄雄性SCID小鼠施用单一腹膜内剂量(5mg/kg)的Ab2、非功能性人IgG对照抗体或通过阻断肌生长抑制素/受体相互作用发挥作用的比较抗体(AbMyo)。在研究的过程中，血清和骨骼肌在给药后的1小时、4小时、48小时、7天、14天、21天、28天和56天收集。血清收集通过标准方法进行且样品储存在-80℃下。收集骨骼肌(股直肌、胫骨前肌和比目鱼肌)、称重和在液氮中速冻用于在-80℃下储存。瘦体重通过定量核磁共振(qNMR)在基线时(第0天给药前)和在整个研究过程中每周测量。
Ab2处理的药效学作用通过在研究过程中测量瘦体重(通过qNMR)来评价。图32显示研究过程中的瘦体重测量，其中用Ab2处理的小鼠与用人IgG对照抗体处理的小鼠相比显示出瘦体重的明显增加。对于研究的前三周，用比较抗体(AbMyo)处理的小鼠显示与Ab2组中的那些小鼠等同的瘦体重增加。但是，到给药后28天，AbMyo处理的小鼠不维持增加的瘦体重。相反，Ab2处理组中的小鼠在研究的整个持续期间(56天)保持其增加的瘦体重。这些数据表明Ab2具有比AbMyo更长的作用持续时间。
也测量肌肉组织重量。在四头肌(股直肌)中，给药四周后，肌肉重量在两个处理组中增加。给药后八周，Ab2和AbMyo组两者中的四头肌(股直肌)增加高于IgG对照的四头肌(股直肌)，其中Ab2组显示与AbMyo组相比的略微增加(图42A)。在腓肠肌中，Ab2和AbMyo组与IgG对照相比，在给药后一小时显示出大致等同的肌肉重量。四周后，Ab2和AbMyo组在处理后一小时显示出比IgG对照更大的重量，其中Ab2组显示出与AbMyo组相比的略微增加。处理后八周，Ab2和AbMyo组的腓肠肌高于IgG对照组(图42B)。
药物暴露量在血清样品中使用对于人IgG特异性的ELISA测量，以已知量的各药物用作基准标准。如图33中所示，早至注射后1小时，Ab2和比较抗体(AbMyo)两者在血清中检测且两种抗体的>1μg/ml的水平可以在整个研究中检测到。但是，Ab2与AbMyo相比表现出显著更长的半衰期和推测的曲线下面积(AUCINF)，从而表明在相似的剂量下，Ab2与AbMyo相比表现出显著更大的暴露量。
原肌生长抑制素和潜伏肌生长抑制素的相对水平通过肌肉溶解产物或血清样品的定量蛋白质印迹测定。肌肉溶解产物通过研磨，接着在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的T-PER缓冲液中裂解从速冻的肌肉样品产生。在裂解后，包含相同浓度的蛋白质的样品通过PAGE凝胶分离并蛋白质印迹到低萦光PVDF膜上。对于肌肉溶解产物，10-50ng总蛋白加载到凝胶上。血浆在PBS中1:10稀释且10μl的各样品加载到凝胶上。作为尺寸标准物，0.1-1ng重组原肌生长抑制素和/或潜伏肌生长抑制素也加载到凝胶上。肌生长抑制素蛋白的鉴定使用识别潜伏肌生长抑制素的前结构域的抗体(AF1539,R&D Systems)，接着用萦光标记的第二抗体的检测来完成。对于所有蛋白质印迹分析，测定最少三个样品/组。
血清肌生长抑制素在药物处理的小鼠中和对照中使用萦光蛋白质印迹测量。尽管Ab2具有增加的血清暴露，Ab2-和AbMyo-处理的小鼠两者中的血清潜伏肌生长抑制素水平是相似的(图34)。这些数据表明游离药物(未结合于靶标)的循环水平充分高于靶标的水平，以使得提高的Ab2血清暴露不转化成与对于AbMyo观察到的循环潜伏肌生长抑制素增加相比更大的循环潜伏肌生长抑制素增加。
肌肉(股直肌)中的肌生长抑制素水平也通过萦光蛋白质印迹评估。潜伏肌生长抑制素和原肌生长抑制素的相对水平在小鼠肌肉溶解产物中通过萦光蛋白质印迹测量。潜伏肌生长抑制素在Ab2和AbMyo处理的肌肉两者中升高(图35A)。但是，AbMyo处理的肌肉中潜伏肌生长抑制素的升高到第28天返回到基线，而Ab2处理的肌肉中潜伏肌生长抑制素的升高保持升高直到至少这一时间(P<0.003vs.AbMyo处理)。类似的趋势对于原肌生长抑制素观察到(图35B)，尽管差异不是统计学显著的(P＝0.068)。这些数据表明Ab2在药物作用部位(骨骼肌)处更长的作用持续时间。
实施例8：肌生长抑制素激活的阻断在鼠地塞米松模型中防止肌萎缩
一组十种肌生长抑制素前体特异性的抗体用于探询与肌生长抑制素的结合是否足以阻断肌生长抑制素信号传导或者是否防止生长因子的释放阻止体内信号传导。这一工作评估阻断肌生长抑制素从前体形式的激活可以保护其它方面健康的小鼠免于地塞米松诱导的肌萎缩达到的程度。
糖皮质激素诱导的肌萎缩模型通过在雄性C57/BL6小鼠的饮水中给药地塞米松两周来建立。瘦体重的变化用定量NMR(QNMR)追踪，且肌肉在处理期结束时称重以监测肌萎缩。选择能够在给药两周后诱导瘦体重(～10.9％)及个体后肢肌肉的质量(股直肌和腓肠肌分别～24.5％和～21.9％)的显著降低的剂量(2.5mg/kg/天)(图36B，黑色空心方块的IgG对照)。
动物用全人抗体以20mg/kg/wk给药两周，假设在这一时间段中不发生针对这些抗体的免疫反应。诱导的不仅是在体外报告分析中阻断重组肌生长抑制素的激活的抗体，而且是紧密地结合肌生长抑制素的前体和/或成熟形式且在体外不抑制肌生长抑制素信号传导的抗体(图36A)。对于在体外分析中具有功能活性的各抗体，在该组中存在缺乏这一功能活性的具有相似结合特征的另一抗体。
在地塞米松和测试品的两周处理结束时，切割个体肌肉并称重。腓肠肌重量的百分变化在图36B中作图。通过其饮水接受地塞米松且也接受IgG对照抗体或结合肌生长抑制素但在体外肌生长抑制素激活分析中不阻断其信号传导的受体的动物与非疾病的对照组(黑色条)相比显示显著的腓肠肌肌萎缩(～20％)。
有趣的是，在具有体外功能活性的五种抗体中，其中四种识别原肌生长抑制素和潜伏肌生长抑制素两者。这些抗体中的三种(Ab2、Ab10和Ab11)防止肌萎缩(vs患病IgG对照分别p＝0.0003，p＝0.0076，p＝0.0309)。第四种抗体Ab7倾向于统计学显著性(p＝0.0572)。重要的是，没有一种抗体在两周时间的过程中在腓肠肌重量中具有与非疾病对照群组相比的统计学显著的偏差，从而反映所有四种抗体对于地塞米松诱导的肌萎缩的保护。
不属于主要功能表位结合特征的具有功能活性的一种抗体(Ab8)在这一模型中不防止肌萎缩(vs非疾病对照p＝0.0003，vs IgG对照p＝0.9991)。
包括了另一对照抗体，Ab-C5，其识别肌生长抑制素(和GDF11)的成熟和潜伏形式(表23)。这一抗体通过阻断肌生长抑制素生长因子和细胞表面受体之间的相互作用抑制肌生长抑制素和GDF11信号传导。小鼠用这一抗体处理也防止地塞米松诱导的肌萎缩达到与Ab2相似的程度(图36B)。Ab14，其也识别成熟和潜伏GDF8(但不识别GDF11)且不阻断激活，不能够在这一模型中防止肌萎缩。这些数据表明阻断肌生长抑制素从前体形式的激活至少与阻断受体-生长因子识别一样有效。
表23：十种肌生长抑制素前体结合抗体对鼠GDF8和GDF11的结合特征
Figure SMS_42
Figure SMS_43
n.b.＝在200nM Ab浓度下没有检测到结合
1n.b.＝在333nM Ab浓度下没有检测到结合
实施例9：肌生长抑制素激活的阻断改善肌肉性能
研究了Ab1对肌肉性能的影响。具有鼠恒定区的Ab1形式，称为muAb1(SEQ ID NO:116-117)，用于在免疫活性动物中避免免疫反应。9-周龄的C57BL/6J小鼠适应一周，然后以在所有组中大致相等的体重分配到处理组。处理或对照(IgG(20mg/kg)和PBS)每周通过结核菌素注射器I.P.施用。IgG对照的数据与PBS类似(数据未显示)。在处理4周后，动物在体内测试其跖屈功能。在这一测试后，处死动物并在体外测试趾长伸肌(EDL)功能。
muAb1-重链恒定区
ASTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPG(SEQ ID NO:116)
muAb1-轻链恒定区
GQPKSSPSVTLFPPSSEELETNKATLVCTITDFYPGVVTVDWKVDGTPVTQGMETTQPSKQSNNKYMASSYLTLTARAWERHSSYSCQVTHEGHTVEKSLSRADCS(SEQ ID NO:117)
肌肉性能在体内用305C肌肉杠杆系统(Aurora Scientific Inc.,Aurora,CAN)测量。收缩通过坐骨神经的经皮电刺激引发。最佳等距扭距(optimal isometric twitchtorque)通过在各次收缩之间以最小30s提高电流来测定以避免疲劳。然后以增加的刺激频率(0.2ms脉冲，500ms队列持续时间)进行一系列的刺激：1、10、20、40、60、80、100、150Hz，接着1Hz的最终刺激。在测量后，释放足部并移除销钉，且小鼠允许在单独的清洁笼中恢复，之后返回到其生活室。
在四周的治疗后，跖屈群(腓肠肌、比目鱼肌和跖肌群)的神经诱发功能在体内在其整个激活范围中分析。在用muAb1处理的动物中，我们以大于60Hz的频率观察到等距扭距(针对肢体长度标准化)的～19％的提高(主效应p＝0.003)(图37A)。伴随这一提高的功能，我们确认最大收缩率的31％的提高(p＝0.025)(图38A)，其独立于力-频率反应的任何变化而发生(图38B)。与肌生长抑制素抑制的合成代谢作用一致，我们发现力量的增加通过腓肠肌重量的22％增加反映(p＝0.009,图37B)。因此，当力量相对于肌肉重量标准化时，在组之间没有差异(图37C)，表明Ab1诱导的过度增生没有不利地影响肌肉质量、兴奋性或神经肌肉接合。
为确认肌生长抑制素阻断对肌肉的直接作用(与神经无关)，分离EDL肌肉并在体外测量力。体外EDL肌肉性能在体外用适应于横向灌注浴的305C肌肉杠杆系统(AuroraScientific Inc.,Aurora,CAN)测量。简言之，下肢上的皮肤脱套一半长度达到膝部且胫骨前肌小心地切割而没有下方的EDL。缝合丝线(4-0)绑扎到EDL的远侧肌腱且切断肌腱。肌肉然后小心地切割而没有胫骨和邻近的肌肉，然后切断可见的近侧肌腱。肌肉置于冰冷的生理缓冲溶液中且缝合丝线绑扎到近侧肌腱。肌肉置于305C肌肉杠杆系统的横向浴中并用以95％ O2/5％CO2氧合和保持在37℃下的生理缓冲液灌注。缝线在一侧绑扎到固定柱，且杠杆臂绑扎到另一侧。0.01Hz频率的一系列的1Hz和100Hz场刺激(0.2ms脉冲，100ms持续时间)通过肌肉侧翼的铂电极递送以确保缝线是拉紧的和最大发生力是稳定的。一旦稳定，以以下提高的刺激频率(1ms脉冲，250ms队列持续时间)进行一系列刺激：1、10、20、40、60、80、100、150Hz，接着1Hz的最后刺激。
muAb1的处理以150Hz导致最大力的27％的提高(p＝0.011，图37D)，没有收缩和松弛率的改变(图38C)，也没有力-频率关系的任何差异(图38D)。再次，肌生长抑制素的阻断导致EDL重量的34％的提高(p＝0.007，图37E)，使得在力量相对于肌肉重量标准化时，没有组之间的差异(图37F)。图37G显示nuAB2和PBS的IIB型平均纤维面积。图37H显示PBS和muAb样品中的4种肌肉纤维类型(％)。
跖屈肌群冷冻用于组织学分析并在软木塞表面上包埋在低温基质中以使得能够容易地切片。简言之，冷冻和包埋的组织安装在冷冻切片机上并垂直于纤维轴连续地切片(10μm厚度)。在肌肉的不同部分获取多个切片(5-10)。切片然后在冰冷的多聚甲醛中固定并保持在-80℃下直到将来使用。
为了横截面积测定，来自肌肉中腹的固定的切片用与萦光团偶联的麦胚凝集素染色以可视化细胞膜。切片使用萦光显微术数字化，细胞边界使用预测软件追踪，且横截面积通过无偏的自动化测量测定。为确定肌肉纤维类型，从比目鱼肌和腓肠肌的中腹获取组织学切片。固定的组织切片然后使用补充4％牛血清白蛋白、0.01％ Triton X-100和10μg/mlFab片段的Tris-缓冲盐水在室温下封闭1h。载玻片然后用PBS洗涤并用针对MyHC-I、MyHC-IIa或MyHC-IIb的一抗(1:20稀释；Developmental Studies Hybridoma Database)覆盖和在4℃下孵育过夜。载玻片然后用PBS洗涤并在室温下添加适宜的二抗1h。载玻片再次在PBS中洗涤，封盖在封片溶液中，且盖玻片用于密封组织切片以进行萦光显微测量。萦光标记的组织切片使用萦光显微镜(Nikon)数字化。图像然后使用标准计数软件分析细胞数量。单位体积的细胞数从切片体积和肌肉重量外推。
H&E染色按照Treat-NMD实验方案MDC1a_M1.2.004进行。简言之，肌肉切片在4％多聚甲醛中固定5分钟，然后在流动自来水中冲洗1分钟。载玻片在Mayer’s苏木精溶液中浸没5分钟，接着在温热的流动自来水中10分钟的蓝染期。红色染色通过在具有1％乙酸的0.5％曙红溶液中的10-分钟孵育实现，然后在ddH2O中冲洗3次持续1分钟，然后在70％、90％、100％乙醇和100％二甲苯中连续脱水。载玻片在成像之前在基于二甲苯的封片介质中封片。
跖屈肌群的组织学评估揭示了muAb1处理的总肌肉横截面积的27％的增加(p＝0.019，图38E)，和平均纤维横截面积的14％的增加(p＝0.010，图38F)。这种增加通过IIB型纤维横截面积的29％增加支持(p＝0.009)(图38G-38H)，其与相对纤维类型(图38I)或I、IIA或IIx型纤维的CSA(图38G-38I)的任何变化无关。
实施例10：健康食蟹猴中Ab2处理对瘦体重、肌肉重量和血清肌生长抑制素的作用
Ab2处理对瘦体重变化的影响在健康食蟹猴(n＝6/处理组)中评估。健康雄性食蟹猴(研究开始时的平均年龄：34个月)以Ab2的三个不同剂量水平(3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg)通过每周一次静脉内注射持续8周给药，具有4-周恢复期。对照动物施用溶剂对照(20mM柠檬酸盐和150mM氯化钠USP，pH 5.5)。瘦体重在基线时和在整个12周研究中以一定间隔通过双能X-射线吸收测定法(DEXA)测量(图43A-43D)。Ab2的处理在Ab2-处理的猴中与溶剂对照相比导致肢体瘦体重5-9％的增加(图43A-43D和图45)。Ab2处理对来自健康食蟹猴的肱二头肌和腓肠肌的组织重量的影响也在第12周测量(图44A-44B)。Ab2处理的显著影响在这些肌肉的重量中是明显的(图44A-44B和图45)。在Ab2-处理的动物中腓肠肌和肱二头肌(其富含快缩肌纤维)与溶剂对照相比显著更大，多达25％(图45)。因此，Ab2处理对肌肉生长具有明显的作用。此外，Ab2处理对富含快速收缩的肌肉纤维具有特别稳定的作用。
在整个这一研究中，用于血清肌生长抑制素水平分析的血清样品在图46A和46B中所示的研究日2、4、8、15、22、29、36、43、64和85收集。Ab2-处理的动物中肌生长抑制素水平的提高在研究日15和29之间达到峰值和达到稳定，并且到研究日85时下降(图46A-46B)。血清中潜伏肌生长抑制素水平的提高对于所有Ab2剂量观察到，其中最大的提高在用30mg/kg的Ab2处理的动物中观察到(图46A-46B)。
实施例11.抗-肌生长抑制素抗体处理对脊髓损伤小鼠的作用脊髓损伤及测试品处理和研究措施
mu-Ab1对小鼠的脊髓损伤的作用在小鼠严重挫伤模型中研究。成体雌性C57BL/6小鼠(8周龄)随机化到四个测试组。小鼠使用氯胺酮(100mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)混合物通过腹膜内(i.p.)注射进行麻醉，然后在胸椎T8和T10之间进行椎板切除术以暴露脊髓的背侧面。为诱导脊髓损伤，T9处的脊髓直接置于Infinte Horizon Impactor(IH-0400冲击器,Precision Systems Instrumentation,LLC,Virginia,USA)的立轴之下，接着缓慢降低轴杆直到力传感器上的响应峰值达到预定水平(65k达因)。对照组在T9水平(仅)进行椎板切除术(假手术)。紧接在损伤后，动物通过i.p.注射施用测试品–溶剂(20mM柠檬酸盐和150mM氯化钠,pH 5.5)、IgG(40mg/Kg)或GDF8(Mu-Ab1,40mg/Kg)。测试品的后续注射在SCI后1周以相同的方式施用。在两周研究期间，多种身体和行为测量用于评价抗-肌生长抑制素药物治疗的效果。身体测量包括总体重、肌肉重量、总身体组成(瘦体重(LBM)、脂肪质量和骨矿物质密度)和使用间接量热法测定的总代谢能量消耗。也评价行为测量，包括BMS运动评分、转棒实验和握力测试。组间差异使用单因素ANOVA，接着Tukey后验比较进行分析(GraphPad,Prism)。数据表示为平均值±SEM。p<0.05的显著性水平接受为与对照不同。
结果和数据分析
体重、肌肉质量和身体组成
体重在以下时间点测量：0(基线：在存活手术之前)；手术后1-周；和手术后2-周(图47)。在基线时体重不存在显著的组差异。SCI(和处理)后1-周，SCI-veh(P<0.0001)和SCI-IgG(P<0.0001)组中与假对照相比存在显著的体重降低。在假对照和SCI-GDF8(Mu-Ab1)组之间没有体重的统计学差异(P＝0.2805)，但是，SCI-GDF8(Mu-Ab1)组体重显著高于SCI-veh(P＝0.004)和SCI-IgG(P＝0.0003)两组。SCI后2-周，SCI-veh(P＝0.0011)和SCI-IgG(P＝0.0009)的体重保持显著低于假对照。SCI-GDF8(Mu-Ab1)组的体重保持显著高于SCI-veh(P＝0.0152)和SCI-IgG(P＝0.0123)组，但与假对照相比没有差异(P＝0.585)。
数据表明，与未损伤的小鼠相比，SCI诱导总身体质量的显著下降。GDF8(Mu-Ab1)作为处理显著减弱对于SCI观察到的体重损失，使得未损伤和GDF8(Mu-Ab1)处理的小鼠之间的组平均在性质上是相似的且是非统计学显著的。
在尸检(SCI后2-周)时，几个肌肉组织(比目鱼肌、腓肠肌、二头肌和三头肌)被提取以评估SCI和处理对湿重的影响(图48)。比目鱼肌的平均重量在SCI-veh和SCI-IgG组中显著低于假对照(两者P<0.0001)。假对照和SCI-GDF8(Mu-Ab1)组之间不存在比目鱼肌质量的统计学差异(P＝0.3129)，但是，SCI-GDF8(Mu-Ab1)组比目鱼肌质量显著高于SCI-veh和SCI-IgG两者(两者P<0.0001)。类似地，腓肠肌的平均重量在SCI-veh和SCI-IgG中显著低于假对照(两者P<0.0001)。假对照和SCI-GDF8(Mu-Ab1)组之间比目鱼肌质量不存在统计学差异(P＝0.3255)，但是SCI-GDF8(Mu-Ab1)组比目鱼肌质量显著高于SCI veh和SCI-IgG两者(两者P<0.0001)。
二头肌的平均质量在SCI veh(P＝0.045)和SCI-IgG(P＝0.04)组中与假对照相比时也显著较低。SCI-GDF8(Mu-Ab1)组之间二头肌质量的组平均趋势大于SCI-veh和SCI-IgG组两者。三头肌的平均质量在SCI-veh(P＝0.007)和SCI-IgG组(P＝0.0013)中与假对照相比也显著较低。SCI-GDF8(Mu-Ab1)组三头肌质量显著高于SCI-veh和SCI-IgG两者(两者P<0.0001)。
数据显示病变下肌肉质量–包括主要氧化性的比目鱼肌和主要糖酵解的腓肠肌–在SCI后与未损伤的小鼠相比时显著降低。GDF8(Mu-Ab1)处理出人意料地和显著地减弱这种肌肉损失，其中比目鱼肌和腓肠肌两者的平均肌肉质量等于未损伤的小鼠的质量，表明在肌肉表型上的影响。当检查病变上肌肉质量(包括二头肌和三头肌)时，SCI与未损伤的小鼠相比也没有质量的显著降低。这很可能是由于对于SCI的生理系统总体抑制和全局的质量损失(虽然较大比例的肌肉质量损失是病变下的)。
SCI后2-周的身体组成(瘦体重和脂肪量)在所有试验组中通过双能X-射线吸收测定(DXA)密度测定法(Lunar PIXImusTM densitometer(GE Medical-Lunar,Madison,WI))评价。总身体无脂肪(瘦)体重在SCI-veh(P＝0.0124)和SCI-IgG(P＝0.056)组中与假对照相比显著更低。SCI-GDF8(Mu-Ab1)组总无脂肪(瘦)体重显著高于SCI-veh(P＝0.0254)和SCI-IgG(P＝0.0114)组两者(图49)，且组平均趋势表明在SCI-veh和SCI-IgG组两者中与假对照相比的更高脂肪质量(图49)。整个身体脂肪质量的SCI-GDF8(Mu-Ab1)组平均趋势也低于SCI-veh和SCI-IgG组两者，并与假对照相当。当检查作为体重的百分比的平均无脂肪(瘦)体重时，没有可分辨的组之间差异，表明SCI后体重的变化及GDF8(Mu-Ab1)的处理效应限于瘦体重的变化(图50)。
这些数据显示，总的–或整个身体的–无脂肪(瘦)体重在SCI后与假对照相比显著降低。GDF8(Mu-Ab1)处理显著减弱SCI后无脂肪(瘦)体重的这一损失，其中平均无脂肪(瘦)体重与未损伤小鼠没有差异，表明对总体瘦组织的影响。相反地，当检查组平均时，SCI后的总脂肪质量表现为与假对照相比提高。病变下无脂肪(瘦)体重的降低及肥胖(全局和局部)的增加是慢性SCI病理生理的良好表征的特征。
代谢和总能量消耗
间接量热法使用Comprehensive Lab Animal Monitoring System的12-室开放回路Oxymax系统(CLAMS；Columbus Instruments,Columbus,OH,USA)对小鼠进行。小鼠在SCI后2-周的分析时间点之前(且包括该时间点)转移到单个代谢室3天。VO2和VCO2连续地测量，且使用间接量热法计算能量消耗/小时(kcal/hr)和总能量消耗/天(TEE)(图51)。组平均趋势表明SCI-veh和SCI-IgG中与假对照相比在这些测量中的降低，且SCI-veh组相对于假对照的代谢降低接近统计学显著的(P＝0.075)。组平均在SCI-GDF8(Mu-Ab1)组中与SCI-veh和SCI-IgG组相比倾向于升高。值得注意的是，SCI-GDF8(Mu-Ab1)与SCI-veh相比的代谢提高接近统计学显著的(P＝0.0530)，且SCI-GDF8组平均的方向与假对照相比表现为略微升高。为了另外的分析，未接受GDF8(Mu-Ab1)处理药物的SCI组(SCI-veh+SCI-IgG)被堆叠(collapsed)以增加SCI处理对照的组能力。在这种情况下，发现合并的SCI-处理对照组中的kcal/hr和TEE低于假对照(P＝0.0159)。在假对照和SCI-GDF8(Mu-Ab1)组之间没有kcal/hr和TEE的统计学差异(P＝0.9764)，但是SCI-GDF8(Mu-Ab1)组kcal/hr和TEE显著高于合并的SCI-处理对照组(P＝0.0106)。
结果显示代谢(作为能量消耗)在SCI后抑制，且GDF8(Mu-Ab1)处理维持静息代谢在接近于未损伤对照的水平。这些结果进一步表明GDF8(Mu-Ab1)对瘦组织(特别地肌肉)的生物学作用保持静息代谢水平，其在其它情况下在SCI后降低。
功能测量
BMS开放场运动试验
Basso Mouse Scale(BMS)开放场运动试验(使用0-9评级系统)用于评价SCI后后肢运动功能的恢复，包括(但不限于)如脚放置(foot replacement)、负重支撑和关节活动的变量。在盲法条件下，两名研究者的一个组在基线时、SCI/假手术后1天及之后每周在4-分钟时间段内评估小鼠。场地划分成三个区(壁区、间区和中心区)且小鼠行为使用高分辨率摄影机在5-分钟时间段内记录。分析跨越的线的总数、在各区中花费的时间及刻板行为如梳理和竖立，并表示为事件数。
SCI后1天在SCI-veh和SCI-IgG组中存在BMS复合评分的显著降低(两者P<0.0001)(图52)。由于在SCI-veh和SCI-IgG组中这一时间点的均匀性，这两个组堆叠以在之后的时间点提供额外的研究能力(SCI-处理对照)。而且，在SCI后1天时，SCI-GDF8(Mu-Ab1)组与假对照相比具有BMS评分的显著降低(P<0.0001)。SCI后1-周，BMS评分在SCI-处理对照组(P<0.0001)和SCI-GDF8(Mu-Ab1)组中与假对照相比保持显著降低(P＝0.0128)。但是，BMS评分在SCI-GDF8(Mu-Ab1)组中与SCI-处理对照相比显著更高(P＝0.0148)。类似地，在SCI后2-周，BMS评分在SCI-处理对照组(P<0.001)和SCI-GDF8(Mu-Ab1)组(P＝0.0182)两者中保持显著降低，但再次，SCI-GDF8(Mu-Ab1)组与SCI处理对照相比具有显著更高的BMS评分(P＝0.0143)。
转棒(rotarod)试验
运动协调和平衡在加速旋转圆柱(Rotamex 4/8,Columbus Instruments)上测试。该程序由5-天的预训练(第1-5天)和之后的测试(SCI/假手术后1-周和2-周)组成。圆柱以增加的速度和恒定的加速度旋转(在10-分钟的时间段内10-60rpm)。记录在跌落之前在棒上花费的总时间，且非行走行为(如被动攀附于棒)手动校正。各试验由平均4个阶段组成。
使用转棒时间实验作为运动协调和平衡的代理测量，这一研究显示SCI后1-周，SCI-veh、SCI-IgG和SCI-GDF8组与假对照相比具有平均转棒时间的显著降低(全部P<0.0001)(图53)。SCI-GDF8(Mu-Ab1)组平均值大于SCI-veh和SCI-IgG组两者(P＝0.118)。类似地，SCI后2-周，SCI-veh、SCI-IgG和SCI-GDF8(Mu-Ab1)组中与假对照相比平均转棒时间的显著降低持续(全部P<0.0001)。再次，虽然任何SCI组之间没有统计学差异，SCI-GDF8(Mu-Ab1)组平均值大于SCI-veh和SCI-IgG组两者(P＝0.1708)。
握力测试
来自假手术和SCI组的所有动物使用握力测试进行后肢峰值力(肌肉强度)的分析。后肢握力使用数字测力计(Chatillon DFIS2,Ametek)评价，其产生作为最大肌肉强度的神经肌肉功能的量度-具有以克计的力的单位。该测试由手术之前的基线评价，接着手术后1-周和2-周的测试日评价组成。力值是5个试验的计算平均值。
SCI后一周，SCI-veh、SCI-IgG和SCI-GDF8(Mu-Ab1)组与假手术对照相比具有握力的显著降低(全部P<0.0001)(图54)。SCI-GDF8(Mu-Ab1)组握力显著高于SCI-veh(P＝0.0006)和SCI-IgG(P＝0.0003)两组，虽然后两组彼此没有差异。SCI后两周，SCI-veh、SCI-IgG和SCI-GDF8(Mu-Ab1)组与假手术对照相比具有握力的显著降低(全部P<0.0001)。SCI-GDF8(Mu-Ab1)组的握力显著高于SCI-veh组(P＝0.0124)，虽然与SCI-IgG组没有显著差异(但是组平均倾向于较大的力；P＝0.1856)。
结果表明SCI引起后肢运动功能(BMS)的急剧降低，转化为运动协调和平衡(转棒)的明显降低，以及肌肉强度(握力)的急剧降低。GDF8(Mu-Ab1)处理防止这一变化，因为GDF8的复合BMS评分显著大于其它损伤组。用GDF8(Mu-Ab1)处理的动物也具有较高的运动协调和平衡，如通过转棒时间实验评价的。
总之，这些数据证明GDF8(Mu-Ab1)处理对具有SCI的小鼠的身体测量、生理和功能结果测量的深刻影响。体重和病变下肌肉质量的SCI-诱导的降低被GDF8(Mu-Ab1)减弱，且与SCI相关的代谢异常(与身体组成和能量消耗有关)在GDF8(Mu-Ab1)处理后较不明显。此外，GDF8(Mu-Ab1)处理的作用转化在与未处理的SCI病症相比时的运动和功能益处。
实施例12：细胞内原肌生长抑制素vs分泌的原肌生长抑制素
方法
免疫萦光
胫骨前(TA)肌在冰冷的4％多聚甲醛(EMS),PBS中固定30min，在4℃下10％蔗糖,PBS中孵育过夜，然后在20％蔗糖,PBS中孵育过夜。肌肉然后装载在具有黄蓍胶(Sigma)的软木上并在液氮冷却的异戊烷(Sigma)中冷冻用于冷冻切片。TA肌的10μm切片用0.1％Triton-X100(Sigma),PBS渗透20分钟，用0.05％ Triton-X 100,PBS(PBS/T)洗涤一次，和然后在以1滴/1.5mL PBS/T稀释的Mouse IgG封闭试剂(Vector Lab)中孵育1h。切片用PBS/T洗涤一次和然后在室温下10％正常山羊血清(Sigma)、1％封闭粉末(Perkin Elmer)、PBS/T(NGB)中孵育30分钟。一抗(兔抗层粘连蛋白，1:5000,Abcam；Ab10,50μg/mL；HuNeg,50μg/mL)在NGB中稀释并在4℃下应用于切片过夜。切片用PBS/T洗涤三次，和然后在NGB中稀释的二抗(Alexa Fluor 488偶联的山羊抗-兔，1:1000,Invitrogen；Alexa Fluor 594偶联的山羊抗-人IgG FCγ,1:500,Jackson ImmunoResearch)中孵育1h。切片然后在350nM DAPI(Thermo),PBS/T中孵育5分钟，用PBS/T洗涤两次，和然后用Vectashield(VectorLaboratories)封片。对于重组蛋白质吸收试验，50μg/mL Ab10单独地或与NGB中10x摩尔过量的rGDF8或rGDF11(两者均为鼠的)孵育过夜，和然后用作一抗。
显微术
萦光图像用配备40x/.80Fluotar目镜的Leica DM4 B使用Leica ApplicationSuite X软件捕获。图像然后用Fiji(Schindelin,J.；Arganda-Carreras,I.&Frise,E.etal.(2012),"Fiji:an open-source platform for biological-image analysis",Naturemethods 9(7):676-682,PMID 22743772)处理。
结果
之前的数据表明肌肉中存在的大多数肌生长抑制素作为原肌生长抑制素储存。但是，这些方法不能区分细胞内的和分泌的原肌生长抑制素库。为解决这一问题，免疫萦光在来自健康小鼠的冷冻切片TA肌上使用特异性地检测原肌生长抑制素和潜伏肌生长抑制素的抗体Ab10进行。
测试抗-原/潜伏GDF8抗体Ab10的特异性的对照试验显示于图39-40中。图39A-39B显示用抗-原/潜伏GDF8抗体Ab10或非特异性靶向抗体探测的TA肌的横截面。Ab10显示于图39A中，HuNeg显示于图39B中，且各图用DAPI复染。比例尺是0.01cm。图40A-40C显示用抗-原/潜伏GDF8抗体Ab10探测的TA肌的横截面，其已经在单独的封闭缓冲液中孵育(图40A)、在具有10-倍摩尔过量的重组小鼠GDF8的封闭缓冲液中孵育(图40B)或在具有10-倍摩尔过量的重组小鼠GDF11的封闭缓冲液中孵育(图40C)。图40A-40C用DAPI复染。
抗-原/潜伏GDF8抗体Ab10与层粘连蛋白(细胞外基质标志物)的共染色证明在肌肉中检测的大多数肌生长抑制素前体在细胞外空间中，而很少的信号在细胞内检测。图41A-41C和55显示用抗-原/潜伏GDF8抗体Ab10和抗-层粘连蛋白探测并用DAPI复染的TA肌的横截面。原/潜伏GDF8和层粘连蛋白共定位于肌纤维顶点处的间隙空间中(箭状物)、肌纤维之前(箭头)和间质核周围(星号)。因此，在健康肌肉中，原肌生长抑制素主要位于超细胞空间中，且Ab10识别肌肉中存在的肌生长抑制素的主要形式。
尽管本公开的几个实施方式已经在本文中描述和阐明，但本领域技术人员很容易设想多种用于执行功能和/或获得本文所述的结果和/或一种或多种优势的其它方式和/或结构，且这样的变化和/或改进各自认为在本公开的范围内。更一般地，本领域技术人员很容易理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和构造意味着是示例性的且实际的参数、尺寸、材料和/或构造将取决于本公开的教导所使用的一种或多种特定的应用。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定与本文所述的本公开特定实施方式的许多等同物。因此，应理解前述实施方式仅通过举例的方式给出，且在所附权利要求及其等同的范围内，本公开可以以所特别描述和要求保护的方式以外的方式实施。本公开涉及本文所述的各单个特征、系统、物品、材料和/或方法。另外，如果这样的特征、系统、物品、材料和/或方法不是相互矛盾的，则两种或更多种这样的特征、系统、物品、材料和/或方法的任何组合包括在本公开的范围内。

Claims (10)

1.一种用于在受试者中抑制肌生长抑制素激活的方法，该方法包括以下步骤：
向所述受试者施用在所述受试者中有效引起以下两种或更多种的量的包含特异性结合原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素并阻断成熟肌生长抑制素的释放的抗体或其抗原结合片段的组合物：
(a)所述受试者中肌肉组织的质量和/或功能的提高；
(b)所述受试者的代谢速率的提高；
(c)所述受试者的胰岛素敏感性的提高；
(d)所述受试者中棕色脂肪组织水平的提高；
(e)所述受试者中米色脂肪组织水平的提高；
(f)所述受试者中白色脂肪组织水平的降低；
(g)所述受试者中内脏脂肪组织水平的降低；
(h)所述受试者中脂肪组织-肌肉组织的比率的降低；
(i)所述受试者中棕色脂肪组织、米色脂肪组织或肌肉组织的葡萄糖摄取的提高；
(j)白色脂肪组织或肝组织的葡萄糖摄取的降低；
(k)所述受试者中肌肉蛋白质分解代谢和/或肌肉氨基酸释放的降低；
(l)所述受试者中胰岛素依赖的血糖控制的提高；
(m)所述受试者中肌肉内脂肪浸润的降低；
(n)生活质量的改善，如通过标准化生活质量测试评价的；
(o)所述受试者中肌肉损失或肌萎缩的预防；和/或
(p)所述受试者中与肌肉功能障碍相关的代谢失调的发生的预防，
其中所述受试者是从降低的肌生长抑制素信号传导受益的人受试者。
2.如权利要求1所述的方法，进一步包括以下步骤：
选择患有肌肉病症或障碍的受试者。
3.如权利要求1所述的方法，进一步包括以下步骤：
选择患有代谢障碍或处于发生代谢障碍的风险中的受试者。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述量是与对照相比引起循环血清样品中潜伏肌生长抑制素水平的提高的量。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述受试者具有选自以下的肌肉病症：肌病、肌萎缩、肌营养不良和神经损伤。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述肌萎缩与运动神经元的缺陷相关。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述缺陷包括遗传突变。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述肌萎缩与脊髓性肌萎缩(SMA)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)或重症肌无力相关。
9.如权利要求5所述的方法，其中所述神经损伤包括使肌肉受神经支配的神经元的部分去神经支配或者运动神经元和靶肌肉之间受损的信号传导。
10.如权利要求5所述的方法，其中所述神经损伤是SCI。
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