CN115193099B - 使用低共熔溶剂提取泥炭藓活性成分的方法 - Google Patents
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Classifications
-
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Abstract
本发明公开了使用低共熔溶剂提取泥炭藓活性成分的方法，低共熔溶剂，由氯化胆碱和1,2‑丙二醇组成。将泥炭藓植物体粉碎，与低共熔溶剂混合提取，分离得到泥炭藓活性成分。本发明一些实例的低共熔溶剂，可以有效提取出泥炭藓特定活性成分，与其他溶剂相比，使用本发明低共熔溶剂提取得到的泥炭藓活性成分，总酚含量高达39.02±7.08 mg GAE/g DW，总酚含量显著高于其他溶剂提取。本发明一些实例的低共熔溶剂，成本低廉，安全性高，易于制备，易于工业化生产。本发明一些实例的泥炭藓活性成分，具有良好的抑菌能力和抗DPPH游离自由基能力，有望应用于化妆品、保健品。
Description
技术领域
本发明属于天然产物提取领域，具体涉及使用低共熔溶剂提取泥炭藓活性成分的方法。
背景技术
泥炭藓(Sphagnum palustre L.)又名大泥炭藓、水藓、水苔、地毛衣，是分布最广、最常见的树种。其常见于潮湿的山地湿润地区或沼泽，常为大型植物群落，是泥炭的主要来源。由于这类植物具有独特的细胞结构，拥有着十分强大的贮水能力。其在中国大部地区山地均有分布，另外在欧洲、美洲、大洋洲均有分布。泥炭藓柔软，疏松丛生，灰白带黄绿色，略呈淡红色。茎直立，高18-20厘米，枝丛疏生，每丛具2-3条倾立的强枝，及1-2条下垂的弱枝。茎叶阔舌形，长1-2毫米，宽数毫米，雌雄异株。泥炭沼泽沉积物中有很大一部分是泥炭藓，这种泥炭沉积物的组成记录了气候信息。获取这种信息的一种方法是确定花粉和大型化石记录[8-10]；然而，这种记录并不总是被保存下来。以陆地植被计算，全世界的泥炭藓种总数约为300种。在芬兰发现了38种泥炭藓，芬兰沼泽的植被通常是由一些泥炭属物种所主导。在许多半陆地生态系统的植物区系中，广泛的像地毯一样的生长和缓慢的衰变速率说明了泥炭属的重要性。
泥炭藓除了在全球碳循环中所具有的重要作用，其在传统中草药中也有着一席之地，是一种具有独特药用价值的植物。《中华本草》中记载其植物体具有清热明目、止痒、主目生云翳、皮肤病以及虫叮咬瘙痒的功效。在《全国中草药汇编》也描述了其清热明目，退云翳，消肿；主治角膜白斑，目赤肿痛的效果。白齿泥炭藓含酚类(0.007％)，单糖(1.05％)，二糖(0.75％)，木质素(14.3％)，纤维素(17.64％)，蛋白质以及一些微量元素等。一些泥炭藓也含反式泥炭藻酸乙酯和对羟基苯乙酮，它们是从泥炭藻细胞壁的乙醇提取物和辐照后的反式泥炭草酸溶液中分离得到的。然而国内外对其生物活性与药用价值的研究并不多，对其化学成分没有系统的分析与总结。
泥炭藓、仙鹤藓、曲尾藓、提灯藓和毛尖金发藓所含的抗菌活性成分，被研究认定为多酚化合物。特别是，在过去几年中发现了许多新化合物，包括酚酸在内的类黄酮类化合物是苔藓中主要的酚类物质。苔藓植物中的黄酮可细分为芹菜素、木犀草素、灯盏花素、异灯盏花素、羟基木犀草素和五羟黄酮。芹菜素、山奈酚以及香豌豆甙元在苔藓中是较为普遍的黄酮类化合物的酚类物质。芹菜素、木犀草素和木犀草醇中的双黄酮类化合物也是苔藓次生代谢物的重要来源。
低共熔溶剂(deep eutectic solvent，DES)作为一种新型的绿色溶剂，被广泛应用于从中草药中提取酚类、黄酮类、生物碱等生物活性物质。与传统有机溶剂相比，DES不仅环保、稳定、挥发性低，而且具有合成容易、极性范围广的优势。它的设计源于离子液体，离子液体由有机阳离子和无机阴离子组成，它们具有高热稳定性、宽的液相范围和低的蒸汽压，使它们有资格作为次生代谢物的提取溶剂，如酚类化合物。然而，离子液体可能有几个缺点，如昂贵和有毒，合成需要有机溶剂，生物降解性差，生物相容性差，而且不可持续。这些缺点引发了DES的使用，这些溶剂具有与离子液体类似的良好物理化学性质而不良条件少。
DES是新一代液体，并且通常基于廉价和容易获得的组分的混合物：季铵盐(例如氯化胆碱)和天然衍生的不带电的氢键供体(例如，维生素，胺，糖，醇和羧酸)。DES具有独特的物理化学性质，并且由于可以针对特定目的设计其特性，因此其对大自然的破坏小和有吸引力的价格已成为研究和工业界越来越感兴趣的人。
DES虽然在很多领域都有应用，但其从天然活性产物中提取的研究报道相对较少，近年来DES因其稳定性好、无毒等优点和优秀生物相容性以及它吸收超声波和微波的能力而逐渐表现出在天然产物提取方面的潜力。DES作为萃取溶剂，可萃取蒽醌、三萜皂甙、木脂素、挥发油等活性成分。李梅等以DES用作提取溶剂，以辅助微波提取薏苡仁叶中的总黄酮，提取率为0.4577％。不同的DES具有不同的提取特性，需要针对性地设计。到目前为止，还没有有研究不同溶剂类型对从泥炭藓提取物里化合物的影响。
如何高效地提取得到具有特定活性的泥炭藓有效成分，对于提高泥炭藓的经济价值，具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种使用低共熔溶剂提取泥炭藓活性成分的方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
用于提取泥炭藓活性成分的低共熔溶剂，由氯化胆碱和1,2-丙二醇组成，氯化胆碱和1,2-丙二醇的摩尔比为1：(2～4)。
在一些低共熔溶剂的实例中，其制备方法包括：按比例将氯化胆碱和1,2-丙二醇混合均匀，之后加热混合至形成澄清透明的均一液体。
在一些低共熔溶剂的实例中，加热至60～90℃混合形成澄清透明的均一液体。
本发明的第二个方面，提供：
一种提取泥炭藓活性成分的方法，包括如下步骤：
S1)将泥炭藓植物体粉碎，与低共熔溶剂混合提取，所述低共熔溶剂如本发明第一个方面所述；
S2)提取完毕后，分离得到泥炭藓活性成分。
在一些方法的实例中，泥炭藓植物体与低共熔溶剂的质量体积比为1g：(30～50)mL。
在一些方法的实例中，提取的温度为40～80℃。
在一些方法的实例中，提取的时间为0.5～8h。
在一些方法的实例中，提取的温度为40～80℃，提取的时间为0.5～8h。
在一些方法的实例中，泥炭藓植物体与低共熔溶剂的质量体积比为1g：(30～50)mL，提取的温度为40～80℃。
本发明的第三个方面，提供：
按本发明第二个方面所述方法制备得到的泥炭藓活性成分。
本发明的第四个方面，提供：
一种组合物，含有本发明第三个方面所述的泥炭藓活性成分。
在一些组合物的实例中，所述组合物为化妆品、食品添加剂。
本发明的有益效果是：
本发明一些实例的低共熔溶剂，可以有效提取出泥炭藓特定活性成分，与其他溶剂相比，使用本发明低共熔溶剂提取得到的泥炭藓活性成分，总酚含量高达39.02±7.08mgGAE/g DW，总酚含量显著高于其他溶剂提取。
本发明一些实例的低共熔溶剂，成本低廉，安全性高，易于制备，易于工业化生产。
本发明一些实例的泥炭藓活性成分，具有良好的抑菌能力和抗DPPH游离自由基能力，有望应用于化妆品、保健品。
附图说明
图1是不同提取溶剂对泥炭藓提取物的总酚含量影响。
图2是泥炭藓水溶剂提取物总离子流图。
图3是泥炭藓甲醇溶剂提取物总离子流图。
图4是泥炭藓乙醇溶剂提取物总离子流图。
图5是泥炭藓低1溶剂提取物总离子流图。
图6是泥炭藓低2溶剂提取物总离子流图。
图2～6中，靠左的部分图为正离子模式图；靠右的部分图为负离子模式图。
图7是不同提取物的DPPH抗氧化能力IC50值。
图8是不同提取物的DPPH自由基抑制率。
具体实施方式
本发明的第一个方面，提供：
用于提取泥炭藓活性成分的低共熔溶剂，由氯化胆碱和1,2-丙二醇组成，氯化胆碱和1,2-丙二醇的摩尔比为1：(2～4)。更佳的，低共熔溶剂，由氯化胆碱和1,2-丙二醇按1：2的摩尔比混合得到，无水。
在一些低共熔溶剂的实例中，其制备方法包括：按比例将氯化胆碱和1,2-丙二醇混合均匀，之后加热混合至形成澄清透明的均一液体。
在一些低共熔溶剂的实例中，加热至60～90℃混合形成澄清透明的均一液体。这样有利于得到更佳的低共熔溶剂。
本发明的第二个方面，提供：
一种提取泥炭藓活性成分的方法，包括如下步骤：
S3)将泥炭藓植物体粉碎，与低共熔溶剂混合提取，所述低共熔溶剂如本发明第一个方面所述；
S4)提取完毕后，分离得到泥炭藓活性成分。
在一些方法的实例中，泥炭藓植物体(干重)与低共熔溶剂的质量体积比为1g：(30～50)mL。这样既可以充分提取出泥炭藓植物体中活性成分，又可以避免使用过多低共熔溶剂所导致的成本增加。
提取的温度可以根据需要进行相应的调整。在一些方法的实例中，提取的温度为40～80℃。这样具有很好的提取效果，同时温度较低，不会破坏活性成分的结构。
提取的时间可以根据需要进行相应的调整。在一些方法的实例中，提取的时间为0.5～8h。这一时间下，已经可以比较充分地提取出其中的活性成分。
在一些方法的实例中，提取的温度为40～80℃，提取的时间为0.5～8h。
在一些方法的实例中，泥炭藓植物体与低共熔溶剂的质量体积比为1g：(30～50)mL，提取的温度为40～80℃。
本发明的第三个方面，提供：
按本发明第二个方面所述方法制备得到的泥炭藓活性成分。
本发明的第四个方面，提供：
一种组合物，含有本发明第三个方面所述的泥炭藓活性成分。
在一些组合物的实例中，所述组合物为化妆品、食品添加剂。
下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
材料与方法
主要材料和仪器
本实验的所提取的植物为成熟的藓纲泥炭藓科泥炭藓属泥炭藓(Sphagnumpalustre L.)，洗净后晒干备用。提取部位为植物体，品呈缠绕的团状，黄绿色或黄白色。湿润展平后，茎长10-15cm，有4-5条丛生的分枝，茎生叶舌形，长1.5-1.7mm，枝生叶瓢状卵形，较茎生叶稍大。孢子黄色。气微，味淡。样品来自于仲恺农业工程学院。氯化胆碱、柠檬酸以及1,2-丙二醇均购自上海阿拉丁生化有限公司。
在本实验中所使用的提取溶剂都为分析纯级别，若无特殊说明所用水均为去离子水。
低共熔溶剂制备本实验中以柠檬酸或1,2-丙二醇为氢键供体，氯化胆碱为氢键受体制备低共熔溶剂。低共熔溶剂命名和配比分别为“低1”：氯化胆碱/柠檬酸(摩尔比1：1、含水量20％)以及“低2”：氯化胆碱/1,2-丙二醇(摩尔比1：2、含水量0％)。将配好的混合物在80℃下搅拌加热，直到形成澄清透明的均一液体。
植物成分提取
将泥炭藓植物体粉碎，因泥炭藓的强吸水性，取1g粉末加入至50mL圆底烧瓶于30mL不同溶剂中在80℃下提取2h。提取完成后过滤取泥炭藓提取液(Sphagnum extracts，SEs)，待做下一步实验。
提取溶剂分别为水、50％甲醇、50％乙醇、低1和低2，分组各命名为水、甲、乙、低1和低2。
总酚测定
总酚含量(Determination of total phenolic content，TPC)据相关文献所采用的分光光度法测定。将50μL等分稀释的提取物和50μL福林酚试剂加入96孔板黑暗中25℃孵育5分钟，随后均加入200μL的20％Na2CO3溶液并置于25℃避光孵育20分钟，然后在765nm处测量吸光度。作系列校准曲线时使用没食子酸(Gallic acid，GA)为标准品，结果表示为每克提取物干重(dried weight，DW)的毫克没食子酸当量(gallic acid equivalent，GAE):mg GAE/g DW。最终结果表示为平均值±标准偏差。使用GraphPad Prism 8软件进行常规单因素方差分析并进行多重比较与作图。
UHPLC-Q Exactive Orbitrap/MS分析
使用UHPLC-Q Exactive Orbitrap/MS仪器分析(Thermo Fisher Scientific，美国)。HPLC-MS/MS系统由配备二极管阵列检测器的Agilent 1200 HPLC系统组成和QExactive HFX质谱仪(Orbitrap MS，Thermo，美国)。色谱分离使用Zorbax Eclipse C18plus色谱柱(250mm×4.6mm，3.5μm，Aligent，美国)。流动相包括A相(0.1％甲酸水溶液)和B相(乙腈)，以0.8mL/min的恒定流速流动，进样量为10μL，在以下梯度洗脱条件下：15％B，0-5分钟；25-35％B，5-25分钟；25-50％B，25-40分钟；85％B，40-45分钟；和15％B，45-50分钟。柱温为30℃，采集软件持续评估全扫描质谱图。在NCE模式下碰撞能量为10/30/60，喷涂电压为4.0kV(正)或3.8kV(负)。使用4.1版本的Thermo Scientific Xcalibur软件对高分辨质谱结果进行初步分析，然后使用Compound Discoverer 3.0软件的mz-Cloud、Chemspider、mz-Vault数据库进行检索匹配。
结果
总酚含量：
据报道，DES的结构在很大程度上影响其理化特性，从而显著影响生物活性化合物的提取效率。在本研究中，用2种基于氯化胆碱、柠檬酸和和1,2-丙二醇的DES包括DES来验证其对来自SEs的酚类化合物提取效率。图1显示了不同提取溶剂对泥炭藓提取物的总酚含量影响。结果表明，两种低共熔溶剂在提取总酚类化合物方面具有非常出色的效率，氯化胆碱与1,2-丙二醇配比的低共熔溶剂提取效率更高(39.02±7.08mg GAE/g DW)，且与低1总酚含量(26.31±2.43mg GAE/g DW)有显著性差异。而传统溶剂提取的总酚含量比低共熔溶剂提取的有更大的显著性差异，而传统溶剂提取效率之间差异并不明显。水提法(1.547±0.309mg GAE/g DW)比醇提法的总酚含量小，甲醇提取法(4.960±0.091mg GAE/g DW)和乙醇提取法(4.979±0.013mg GAE/g DW)的差距十分细微。
UHPLC-Q Exactive Orbitrap/MS分析结果
通过UHPLC-Q Exactive Orbitrap/MS分析得到不同提取溶剂所得泥炭藓提取物的正负总离子流图，见图2至图6。所得数据采用Thermo Xcalibur 4.1软件进行初步处理，对检测化合物的准确分子量测试值与理论值进行匹配并在Compound Discoverer 3.1的mz-Cloud、mz-Vault以及ChemSpider数据库中进行检索，然后依据多级质谱进行了分析和鉴定。
最后经过推测得到泥炭藓提取物含253种化合物。水提组中发现了97种化合物，含4-甲氧基肉桂酸、D-木糖酸、草酸等多种有机酸以及二乙酰间苯三酚、乙基麦芽酚等六种酚类化合物并含黄酮类化合物维采宁-3和香豆素类化合物秦皮素。研究表明4-甲氧基肉桂酸有广谱抑菌能力，乙基麦芽酚具有对辣椒疫霉菌的抗真菌活性。而维采宁-3有着抑制IL-1β刺激的MAPK活化的抗炎作用，秦皮素则有着对抗金黄色葡萄球菌的抗菌作用。泥炭藓的甲醇提取物含100种化合物包括柠檬酸、DL-苹果酸等有机酸和麝香草酚、3-丁基大茴香醚等酚类化合物。研究证实柠檬酸可抑制脑脂质过氧化、肝损伤和炎症，而麝香草酚有着强大的抗氧化和抗菌特性[42,43]。有53种化合物在50％乙醇提取物中被发现，含D-木糖酸、柠檬酸等有机酸和L-苏氨酸、13(S)-HpOTrE等物质。作为酚类化合物，13(S)-HpOTrE有着灭活NLRP3炎症小体复合物的抗炎作用。低1提取物共38种化合物含莽草酸、2-甲基柠檬酸等有机酸以及没食子酸、5-氟水杨酸等酚类物质。莽草酸有抗血栓作用的生物活性，而没食子酸是一种抗氧化剂和有效的细胞凋亡诱导剂[45,46]。泥炭藓的低2提取物中含山梨酸、DL-苹果酸等有机酸以及三萜类化合物熊果酸还有酚类物质麝香草酚等共75种化合物。山梨酸对酿酒酵母的杀菌能力很强，熊果酸有着十分优秀的保肝、抗炎、抗氧化的能力[47,48]。甲醇组和低2组的成分较多，表明低2是一种提取效率很高的提取溶剂。
结果归纳分析后发现泥炭藓提取物均含柠檬酸，除了低1组外的泥炭藓提取物均发现磷酸和L-(+)-缬氨酸，成分D-木糖酸、L-苏氨酸和3-羟基-D-酪氨酸在传统溶剂组(水、甲、乙)中均被发现。而仅在低共熔溶剂组(低1和低2)中存在的脱镁叶绿酸盐A对几种人类癌细胞系有显著的抗增殖作用。这说明传统溶剂与低共熔溶剂在天然产物化合物提取方面有一些差异，在本研究中发现使用低共熔溶剂提取法是一种很好的提取泥炭藓中脱镁叶绿酸盐A的方法。
提取物生物活性测定
材料与方法
金黄色葡萄球菌(ATCC6538)菌株由广东微生物学研究所(中国广州)提供。2,2-联苯基-1-苦基肼基、LB肉汤购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，96孔板购自赛默飞世尔(上海)仪器有限公司。实验中若没有特殊说明所用水均为去离子水。
抗氧化能力测定
抗氧化能力最终通过2,2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH)方法测定。随后，一些研究者开发了通过DPPH评价其植物提取物抗氧化活性和抗氧化能力的方法。该方法是基于DPPH自由基的还原由抗氧化剂(即植物提取物中的抗氧化剂)，导致自由基改变颜色(主要变为淡黄色)表明其还原形式(二苯基苦味肼)。由于DPPH试剂在517nm处有个电子被强吸收。在自由基清除剂的情况下，DPPH单电子被捕获，在最大光吸收波长下吸收值降低。颜色变化可以通过使用515-520nm的分光光度计来表示，本实验中通过酶标仪来进行测定。根据其浓度与吸光度的线性变化以评估其氧化能力。一般来说DPPH清除率数值越高意味着抗氧化能力越强。
首先，在96孔板中加入150μL带有浓度梯度的样品溶液；其次，再加入等量0.1mmol/L DPPH溶液；盖上盖子，用箔纸封住96孔板，25℃避光30分钟；最后，测量孔板在517nm处的吸光度。最终结果表示为50％的抑制浓度(50％inhibiting concentration，IC50)和DPPH清除率。这些值表示为平均值±标准偏差。浓度表示为每毫克提取物的干重(dried weight，DW)除以溶剂提取物的体积(extracted solvent，ES)。
DPPH清除率＝[1-(OD样品-OD空白)/OD参比]×100％。
抑菌能力测定
在抗菌测定中使用的微生物菌株是，金黄色葡萄球菌(ATCC6538)。泥炭藓提取物的最小抑制浓度(minimal inhibit concentration，MIC)通过肉汤微稀释法确定。
将50μL的LB培养基添加到96孔板的每个孔中，然后加入50μL配置好浓度梯度的SEs，最后加入50μL最终浓度约为5.0×105CFU/mL细菌的肉汤培养物。在37℃孵育一天后，通过参照空白对照组进行有效计数进而确定幸存的生物的数量。MIC被定义为接种量显著降低(>90％)最低药物浓度。所有测试均以一式三份进行。
结果与分析
图7显示了不同提取方法下泥炭藓提取物对DPPH游离自由基的半抑制浓度。可明显得到水组(1.177±0.1472mg DW/mL ES)和低2组(1.355±0.05655mg DW/mL ES)的IC50数值显著高于余下三组，低2组对甲组(0.7639±0.0005155mg DW/mL ES)和低1组(0.8637±0.01573mg DW/mL ES)的显著性程度更甚(p<0.01)。甲组、乙组(0.64±0.001mg DW/mL ES)和低1组的组内差异不大，乙组相对表现最小的IC50值。图8显示了不同提取方法下泥炭藓提取物对DPPH游离自由基的抑制率。整体上可以看出自由基抑制率随着提取物浓度的降低而降低，而在6.60-33.00mg DW/mL ES的高浓度区间下抑制率与浓度呈反比，这表明了在高的提取物浓度下低共熔溶剂比传统溶剂的提取物抗氧化能力更低。低1组(66.08-95.41％)的整体抗氧化能力比低2组(17.87-65.01％)的更强，在6.60mg DW/mL ES浓度以下抑制率均强于余下组，这说明了在低浓度下低2(氯化胆碱/1,2-丙二醇；摩尔比1：2；含水量0％)的泥炭藓提取物有十分强的抗氧化能力。
最小抑菌能力实验
表3-1不同溶剂提取的泥炭藓提取物的抑制金黄色葡萄球菌活性
表3-1显示了通过不同的溶剂提取获得的泥炭藓提取物的抗金黄色葡萄球菌活性。DESs获得的SEs显示比其他溶剂获得的提取物具有更好的抗微生物活性。其中，低1组的提取物抑菌能力最明显(0.258mg DW/mL ES)。本实验在MIC值(33.0-0.258mg DW/mL ES)范围内测试了五种提取物的抑制金黄色葡萄球菌能力。可从结果看出水提方法得到的提取物抑菌能力最弱(>33.0mg DW/mL ES)，甲醇和乙醇提取能力接近(2.06mg DW/mL ES)，低2抑菌能力比传统溶剂提取的强(0.516mg DW/mL ES)。许多研究证实，提取物中的次生代谢物(包括酚类、黄酮类和萜类化合物等)对不同病原菌的抗菌活性具有重要作用[50,51]。在本研究中，DESs获得的提取物之所以具有较强的抗菌活性，可能与其所含脱镁叶绿酸盐A有关。
附表：
表A-4泥炭藓低1溶剂提取物成分表
表A-5泥炭藓低2溶剂提取物成分表
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种提取泥炭藓活性成分的方法，包括如下步骤：
S1)将泥炭藓植物体粉碎，与低共熔溶剂混合提取，泥炭藓植物体与低共熔溶剂的质量体积比为1g：(30～50) mL，提取的温度为40～80 ℃，所述低共熔溶剂由氯化胆碱和1,2-丙二醇组成，氯化胆碱和1,2-丙二醇的摩尔比为1：(2～4)，其制备方法包括：按比例将氯化胆碱和1,2-丙二醇混合均匀，之后加热混合至60～90℃形成澄清透明的均一液体；
S2)提取完毕后，分离得到泥炭藓活性成分。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，提取的时间为0.5～8 h。
3.一种泥炭藓活性成分，按权利要求1或2所述的方法制备得到。
4.一种组合物，含有权利要求3所述的泥炭藓活性成分。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物为化妆品、食品添加剂。
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