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CN115103686A - Il-2直向同源物及其使用方法 - Google Patents

Il-2直向同源物及其使用方法 Download PDF

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CN115103686A
CN115103686A CN202080095613.1A CN202080095613A CN115103686A CN 115103686 A CN115103686 A CN 115103686A CN 202080095613 A CN202080095613 A CN 202080095613A CN 115103686 A CN115103686 A CN 115103686A
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cells
cell
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CN202080095613.1A
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P-J·佩纳弗洛尔阿斯普里亚
S·A·麦克考雷
M·奥特
S·考德
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Sindkain Co ltd
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Abstract

本发明涉及hIL2正交配体(“IL2直向同源物”)，其特异性且选择性地结合至由修饰的hCD122多肽构成的胞外结构域(ECD)跨膜多肽。hIL2直向同源物对修饰的hCD122多肽的结合参与胞内信号转导的转导通路，导致与hIL2结合至中等亲和力或高亲和力hIL2受体相关联的天然胞内信号转导模式的生物学活性，但表现出对工程改造的表达hCD122正交受体的选择性。相较于其对野生型hCD122的胞外结构域的结合，本发明的hIL2直向同源物表现出显著减少的结合，单独地，或当hCD122以内源高或中等亲和力hIL2受体的形式存在时。

Description

IL-2直向同源物及其使用方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2019年12月13日提交的美国临时专利申请序列号62/948066的优先权。
关于政府资金的声明
在构思本发明的主题或将其付诸实施时，没有使用美国政府的资金。
背景技术
受控操纵细胞的分化、发育和增殖，特别是工程改造的免疫细胞，具有重大的临床意义。T细胞已被工程改造用于治疗应用，例如识别和杀死癌细胞、细胞内病原体和参与自身免疫的细胞。通过选择性地激活和扩增提供特定的功能的工程改造T细胞，并引导为选择性攻击癌细胞，促进工程改造细胞疗法在癌症治疗方面的应用。在一些过继免疫疗法的例子中，从对象的血液中分离出T细胞，离体处理，并重新输注进对象体内。因此，需要能够选择性地激活靶向工程改造细胞群的组合物和方法。
制造细胞治疗产品的挑战是，这种“活的药物”需要密切控制其环境以保持活力和功能。在实践中，分离的细胞，无论是来自患者(自体)还是来自单一供体来源(同种异体)，在离开对象或受控的培养条件后，开始迅速失去功能。在离开对象或受控培养条件时，成功地维持分离细胞的健康和功能，使分离细胞恢复功能，以重新插入细胞产品制造工作流程或患者体内。
此外，工程改造T细胞疗法的临床应用的挑战是选择性地刺激这些工程改造细胞，以最大化其治疗效果。提供工程改造T细胞产品的持续维持激活的典型手段是全身给予细胞因子，例如IL2。然而，IL2的全身给予与工程改造细胞群体之外非特异性刺激作用有关，特别是在高剂量下，与人对象的显著毒性有关。此外，IL2在体内的寿命很短，需要经常给予IL2以维持工程改造T细胞处于激活状态。虽然来自初始群体的初始给予的工程改造的细胞在工程改造细胞产品给予后的几个月或甚至几年都可以检测到，单这些工程改造细胞中有相当一部分会陷入静息状态，需要重新激活它们以表现出显著的治疗效果。因此，基于细胞的疗法的挑战是将所需的可调节的行为赋予转移的细胞，其不受内源性信号转导通路的影响，不影响非靶向内源细胞，并且在工程改造细胞群给予对象之后可以选择性地受控。
CD122是中等亲和力和高亲和力IL2受体复合物的组分。Sockolosky，等(Science(2018)359：1037-1042)和Garcia，等(美国专利申请公开US2018/0228841A1公开于2018年8月16日)描述了正交IL2/CD122配体/受体系统以促进选择性刺激工程改造以表达正交CD122受体的细胞。还描述了是正交受体的同源配体的IL2突变蛋白。表达正交(orthogonal)CD122的工程改造T细胞与这种正交CD122对应的正交配体(“IL2直向同源物(IL2 ortholog)”)接触，使得其能够特异性激活这种工程改造T细胞。特别是这种正交IL2受体配体复合物提供了细胞的混合群体，特别是T细胞的混合群体中工程改造以表达正交受体的细胞的选择性扩增。
对于非工程改造的中等亲和力(CD122/CD132)IL-2受体复合物或高亲和力(CD25/CD122/CD132)IL-2受体复合物具有减弱的亲和力的IL-2直向同源物也用于将直向同源物IL-2的活性选择性靶向表现出CD25高表达的细胞，例如在自身免疫疾病的治疗中。对于天然野生型hCD122胞外结构域(ECD)具有显著减弱的亲和力，但保留了对CD25的ECD的结合的IL-2直向同源物，也可以用作野生型IL-2的竞争性拮抗剂，通过干扰高亲和力IL-2受体复合物形成，并因此可以用于自身免疫疾病或移植物抗宿主(GVH)病的治疗中。
本发明涉及与正交hCD122受体相互作用的配体。特别地提供了hIL-2正交配体(hIL2直向同源物)其通过受体提供选择性结合和信号转导，所述受体包括hCD122正交受体的胞外结构域，特别是包含氨基酸取代H133D和Y134F的人CD122的胞外结构域。与表达正交hCD122的细胞上存在的hIL2直向同源物的活性相比，本hIL2直向同源物的在表达野生型hCD122的细胞上的IL2活性显著减弱。因此，提供了在工程改造的细胞群上使用hIL-2直向同源物选择性激活和/或扩增表达包含正交hIL2的胞外结构域的受体的工程改造的细胞。
发明内容
本发明涉及人IL2正交配体(“hIL2直向同源物”)，其特异性且选择性地结合至包含修饰的hCD122多肽的胞外结构域(ECD)跨膜多肽，所述修饰的hCD122多肽在正交hCD122多肽的ECD的133位和/或134位包含修饰。在一些实施方式中，正交hCD122多肽包含氨基酸取代H133D和Y134F。hIL2直向同源物对修饰的hCD122多肽的结合参与胞内信号转导的转导通路，导致与IL2结合至中等亲和力或高亲和力IL2受体相关联的天然胞内信号转导模式的生物学活性，但表现出对工程改造的表达hCD122正交受体的选择性。在一些实施方式中，hIL2直向同源物是本文以下所述的式1的hIL2变体本发明的hIL2直向同源物对野生型hCD122的胞外结构域表现出显著减少的结合，单独地，或当hCD122存在时，对于hIL2直向同源物对hCD122正交受体的结合是以内源高或中等亲和力hIL2受体的形式。在一些实施方式中，hIL2直向同源物对正交hCD122的胞外结构域的亲和力与野生型hIL2对野生型hCD122的亲和力相当。在一些实施方式中，hIL2直向同源物对正交hCD122的胞外结构域(“ECD“)的亲和力大于野生型hIL2对野生型hCD122的胞外结构域的亲和力。在一些实施方式中，hIL2直向同源物对正交hCD122的胞外结构域的亲和力小于野生型hIL2对野生型hCD122的胞外结构域的亲和力。在一个实施方式中，正交hCD122受体的ECD包括含有取代H133D和Y134F的修饰的人hCD122ECD多肽(按照野生型hCD122编号)，其中正交hCD122受体的ECD的氨基酸序列包括214个氨基酸的多肽，其具有序列：
Figure BDA0003780618550000041
在一个实施方式中，正交hCD122受体是修饰的人CD122，其具有的氨基酸序列(减去信号肽)，为包含取代H133D和Y134F的hCD122的ECD的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和野生型hCD122分子的跨膜(TM)和胞内结构域(ICD)，正交hCD122受体(hoRb)具有氨基酸序列：
Figure BDA0003780618550000042
Figure BDA0003780618550000051
在一个实施方式中，本发明提供了hIL2直向同源物，其氨基酸序列与式#1的多肽具有至少80％同一性：
Figure BDA0003780618550000052
其中：
AA1是A(野生型)或缺失；
AA2是P(野生型)或缺失；
AA3是T(野生型)、C、A、G、Q、E、N、D、R、K、P或缺失；
AA4是S(野生型)或缺失；
AA5是S(野生型)或缺失；
AA6是S(野生型)或缺失；
AA7是T(野生型)或缺失；
AA8是K(野生型)或缺失；
AA9是K(野生型)或缺失；
AA13是Q(野生型)、W或缺失；
AA14是L(野生型)、M、W或缺失；
AA15是E(野生型)、K、D、T、A、S、Q、H或缺失；
AA16是H(野生型)、N或Q或缺失；
AA18是L(野生型)或R、L、G、M、F、E、H、W、K、Q、S、V、I、Y、H、D或T；
AA19是L(野生型)、A、V、I或缺失；
AA20是D(野生型)、T、S M L或缺失；；
AA22是Q(野生型)或F、E、G、A、L、M、F、W、K、S、V、I、Y、H、R、N、D、T、F或缺失；
AA23是M(野生型)、A、W、H、Y、F、Q、S、V、L、T或缺失；
AA27是G(野生型)、K、S或缺失；
AA38是R(野生型)、W或G；
AA39是M(野生型)、L或V；
AA42是F(野生型)或K；
AA51是T(野生型)、I或缺失
AA55是H(野生型)或Y；
AA74是Q(野生型)、N、H、S；
AA80是L(野生型)、F或V；
AA81是R(野生型)、I、D、Y、T或缺失
AA85是L(野生型)或V；
AA86是I(野生型)或V；
AA88是N(野生型)、E或Q或缺失；
AA89是I(野生型)或V；
AA91是V(野生型)、R或K；
AA92是I(野生型)或F；
AA97是K(野生型)或Q；
AA104是M(野生型)或A；
AA109是D(野生型)、C或具有激活的侧链的非天然氨基酸；
AA113是T(野生型)或N；
AA125是C(野生型)、A或S；
AA126是Q(野生型)或H、M、K、C、D、E、G、I、R、S或T；
和/或
AA130是S(野生型)、T或R。
在本发明的一些实施方式中，提供了包括IL2变体多肽的hIL2直向同源物，其在以下位置包含氨基酸修饰：E15、L16、L19、D20和M23和任选地Q22。在一些实施方式中，hIL2直向同源物包括IL2变体多肽，其包含氨基酸取代：L12、Q13、H16、L19、D20、M23、R81、D84、S87、N88、V91、I92和E95。在本发明的一些实施方式中，提供了包括IL2变体多肽的hIL2直向同源物，其包含氨基酸修饰包括IL2变体多肽的hIL2直向同源物，其在以下位置包含氨基酸修饰：Q74N、Q74H、Q74S、L80F、L80V、R81D、R81T、L85V、I86V、I89V和/或I92F。在一些实施方式中，本发明提供了hIL2直向同源物，包括IL2变体多肽，其包含选自以下氨基酸取代组的氨基酸修饰：
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23AL80F-R81D-L85V-I86V-I92F]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126M]；或
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126M]。
在一些实施方式中本发明提供了hIL2直向同源物，包括IL2变体多肽，其包含位于以下位置的氨基酸取代：S4、K8、K9、T10、Q11、Q13、N26、N29、N30、N30、Y31、K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、M46、K48、K49、K54、E61、E62、K64、P65、E67G、E68、V69、N71、L72、Q74S75、K76、H79、I89、N90、I92、S99、T101、F103、Y107、I114、I128和T133。在一些实施方式中本发明提供了hIL2直向同源物，包括IL2变体多肽，其包含一个或多个的氨基酸取代：S4P、K8R、K9T、T10A、Q11R、Q13R、N26D、N29S、N30S、N30D、N30T、Y31H、Y31C、K35R、T37A、T37R、M46L、K48E、K49R、K49E、K54R、E61D、K64R、E67G、E68D、V69A、N71T、N71A、N71R、A73V、Q74PS75P、K76E、K76R、H79R、I89V、N90H、I92T、S99P、T101A、F103S、I114V、I128T、T133A和T133N。在一些实施方式中，本发明提供了IL2变体多肽，其包含选自以下氨基酸取代组的氨基酸修饰：
[R38A-F42A-Y45A-E62A]；[F42A-Y45A-L72G]；[V69A，Q74P]；[V69A，Q74，T101A]；[V69A，Q74P，I128T]；[N30D，V69A，Q74P，F103S]；[K49E，V69A，A73V，K76E]，[V69A，Q74P，T101A，T133N]；[N30S，V69A，Q74P，I128A]；[N30S，V69A，Q74P，I128T]；[K9T，Q11R，K35R，V69A，Q74P]，[A1T，M46L，K49R，E61D，V69A，H79R]；[K48E，E68D，N71T，N90H，F103S，I114V]；[S4P T10A，Q11R，V69A，Q74P，T133A]；[N30S，Y31H，K35R，K48E，V69A，Q74P，I92T]；[N30S，E68D，V69A，N71A，Q74P，S75P，K76R，N90H]；[N30S，Y31C，T37A，V69A，A73V，Q74P.H79R，I128T]，[N26D，N29S，N30S，K54R，E67G，V69A，Q74P，I92T]；[K8R，Q13R，N26D，N30T，K35R，T37R，V69A，Q74P，I92T]，[N29S，Y31H，K35R，T37A，K48E，V69A，N71R，Q74P，I39V]和[T41P-T51P]。
在本发明的一些实施方式中，提供了包括IL2变体多肽的hIL2直向同源物，其在以下位置包含氨基酸修饰：Q11、L18、Q22、E110、N119、T123、Q126、S127、Q126、S127、I129、S130和T133。在一些实施方式中本发明提供hIL2直向同源物，其包括具有选自下组的一个或多个氨基酸取代的IL2变体多肽：L18R、L18G、L18M、L18F、L18E、L18H、L18W、L18K、L18Q、L18S、L18V、L18I、L18Y、L18H、L18D、L18T、Q22E、Q22E、Q22E、Q22E、、Q22G、Q22E、、Q22A、Q22L、Q22M、Q22F、Q22W、Q22K、Q22S、Q22V、Q22I、Q22Y、Q22H、Q22R、Q22N、Q22D、Q22T、Q22F、Q126H、Q126M、Q126K、Q126C、Q126D、Q126E、Q126G、Q126I、Q126R、Q126S或Q126T。在一些实施方式中，本发明提供了hIL2直向同源物，其包括IL2变体多肽，其具有选自以下氨基酸取代组的氨基酸取代组：
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22E-M23A]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-M23A]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-M23A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-M23A-Q126K]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126K]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q126K]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126K]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-M23A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-M23A-Q126K]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126K]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-186V-I92F-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L85V-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L85V-Q126H]；或
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V-Q126M]。
在一些实施方式中，本发明提供了hIL2直向同源物，包括选自SEQ ID NO：5-138的IL2变体多肽。
在一些实施方式中本发明提供hIL2直向同源物可操作地连接至至少一个运载体分子。在一些实施方式中本发明提供hIL2直向同源物其包含至少一个聚乙二醇(PEG)分子。
在一些实施方式中本发明提供hIL2直向同源物包括结构：
[PEG]-[接头]n-[hoIL2]
其中n＝0或1且hoIL2是式1的人正交IL2多肽变体。在一些实施方式中PEG分子量为5kDa至80kDa之间。在一些实施方式中PEG分子量约为40kDa。在一些实施方式中本发明提供上述结构的hIL2直向同源物，其中hoIL2是IL2多肽变体，其包含氨基酸取代组-[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]。在一些实施方式中本发明提供上述结构的hIL2直向同源物，其中hoIL2是IL2多肽变体，其包括氨基酸序列：
Figure BDA0003780618550000111
在一些实施方式中本发明提供编码式#1的hIL2直向同源物多肽的核酸序列。
在一些实施方式中本发明提供编码编码式#1A的hIL2直向同源物多肽的核酸序列的重组载体，包括权利要求22所述核酸序列的重组载体。
在一些实施方式中本发明提供一种治疗对象所患有的疾病、紊乱或病症的方法，通过给予所述对象：
a.工程改造的哺乳动物细胞，其包括编码含有正交hCD122的胞外结构域(ECD)的跨膜受体分子的核酸序列，该核酸序列可操作地连接至一个或多个能够作用于所述跨膜受体分子的ECD的表达和表面呈递的表达控制元件；和
b.给予所述患者治疗有效剂量的式#1所述的hIL2直向同源物。
在一些实施方式中本发明提供了一种制备工程改造的T细胞产品的方法，所述T细胞产品包括至少20％的hoCD122 T细胞，所述方法包括步骤：
a.从哺乳动物对象分离T细胞群；
b.将所述离体分离的T细胞群与重组载体接触，所述重组载体包括编码hoCD122的核酸序列，其可操作地连接至一个或多个表达控制序列，使得在允许所述重组载体被T细胞摄取的情况下，促进在哺乳动物T细胞中的表达；
c.将所述分离的T细胞群接触有效量的如权利要求1所述的hIL2直向同源物。
在一些实施方式中本发明提供了至少20％工程改造的hoCD122 T细胞的细胞群。
本发明进一步提供了制备本发明的hIL2直向同源物的方法。特别地，本发明提供重组表达载体，其包含编码可操作地连接至控制元件的hIL2直向同源物的核酸序列，以在宿主细胞中提供编码hIL2直向同源物的核酸序列的表达。
本发明进一步提供了包含混合细胞群的组合物，其包含至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％的T细胞(例如T细胞、CD8+T细胞、Treg、TIL、NK细胞、TCR修饰的细胞、CAR-T细胞等)，其中T细胞已经被重组修饰以表达正交hCD122受体多肽。本发明还提供了产生工程改造的细胞治疗产品的药学上可接受的剂型的方法，所述剂型包含T细胞群，其中所述T细胞群是基本上富集了一种或多种工程改造T细胞种类的，所述工程改造的T细胞表达包含hCD122正交多肽的胞外结构域的受体，所述方法包括在本发明的hIL2直向同源物的存在下，离体培养所述包含表达含有hCD122正交多肽的胞外结构域的受体的工程改造的T细胞的T细胞群，持续足以富集一种或多种此类工程改造的T细胞的细胞群的时间。
在一些实施方式中，本发明提供了重组载体，其包含编码可操作地连接至控制元件的本文所述的hIL2直向同源物的核酸序列，以促进hIL2直向同源物从哺乳动物细胞的表达和分泌，给予对象以提供hIL2直向同源物的原位表达。在一些实施方式中，重组载体被瘤内给予患癌对象。在一些实施方式中，重组载体是重组病毒载体。在一些实施方式中重组病毒载体是重组腺相关病毒(rAAV)或重组腺病毒(rAd)，例如，在一些实施方式中，源自人腺病毒血清型3和/或5的复制缺陷的腺病毒。在一些实施方式中，复制缺陷的腺病毒具有一个或多个对E1区的修饰，这干扰病毒启动细胞循环和/或凋亡途径的能力。复制缺陷的腺病毒载体可以任选地在E3结构域中包含缺失。在一些实施方式中，腺病毒是复制能力型腺病毒。在一些实施方式中腺病毒是复制能力型重组病毒，其被工程改造为选择性地在肿瘤细胞中复制。
本发明进一步提供了制备细胞疗法产品的药学上可接受的剂型的方法，其包含至少一种(或2、3、4或更多种)工程改造T细胞，所述工程改造的T细胞表达跨膜受体蛋白，其中这种跨膜受体蛋白的胞外结构域包括hCD122正交多肽的胞外结构域，其中在细胞疗法产品中，工程改造细胞部分占细胞疗法产品的总细胞数的至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％。
在一些实施方式中提供了治疗性方法，所述方法包括向患有疾病、紊乱或病状的对象引入工程改造细胞群，所述工程改造细胞群包含编码以下的核酸序列：包括SEQ IDNO：1的ECD的跨细胞膜正交受体多肽、跨膜结构域和胞内信号转导结构域，其对hIL2直向同源物配体到所述跨细胞膜正交受体多肽的ECD的结合反应，产生胞内信号，所述核酸序列可操作性地连接至表达控制元件，以促进所述跨膜多肽的ECD的转录和翻译和细胞表面呈递，给予本发明的hCD122直向同源物与之组合。这种细胞群可以包括已经离体修饰且对于对象而言是自体的或同种异体的细胞。一些实施方式中，所述治疗性方法包括：(1)将工程改造细胞群与一定量的同源hIL2直向同源物以足以激活所述工程改造细胞的浓度和持续时间离体接触，所述工程改造细胞表达包含hIL2正交CD122 ECD的受体；和(2)将所述细胞群给予对象；和(3)给予对象同源hIL2直向同源物，给予对象工程改造细胞与之组合。在一些实施方式中，工程改造hIL2正交CD122 ECD受体细胞群和hIL2直向同源物给予的对象患有肿瘤疾病。在一些实施方式中，正交受体和配体与至少一种其他/补充治疗或预防剂组合给予。
附图简要说明
结合附图，通过以下详述更好地理解本发明。需要强调，按照惯例，附图的各个特征不成比例。相反，各种特征的尺寸被任意放大或者缩小以清楚显示。附图部分包括如下的附图。
附图的图1提供了用来自更详细地描述于本文实施例7的实验的293转染上清处理的NKL细胞的
Figure BDA0003780618550000141
值。对于接受指定稀释的每种上清的NKL细胞，用粗体表示，重复的
Figure BDA0003780618550000142
值示于并排的列中。
附图的图2提供了被重组修饰以表达SEQ ID NO2的hCD122正交受体的NKL细胞(“NKL hoRB细胞”)的
Figure BDA0003780618550000143
值，用来自实施例7中所述实验的293转染上清处理。对于接受指定稀释的每种上清的NKL hoRB细胞，用粗体表示，重复的
Figure BDA0003780618550000144
值示于并排的列中。
具体实施方式
为了使本发明更容易被理解，下文以及整个说明书中对某些术语和短语进行了定义。本文提供的定义是非限制性的，应根据本领域技术人员的知识阅读。
在描述本发明的方法和组合物之前，应理解，本发明不限于所述的方法或组合物，因为它们当然可能变化。还应理解，本文中使用的术语仅意在描述特定实施方式，并不旨在进行限制。
提供数值范围时，也应视作具体公开了该范围的上限和下限之间以下限单位十分之一为间隔的各中间数值，除非上下文另有明确说明。本发明还包括设定范围内任何设定数值或中间数值和该设定范围内任何其它设定数值或中间数值之间的较小范围。取决于设定范围内任何明确排除的限值，所述范围可独立地包含或排除这些较小范围的上下限，本发明也包括这些较小范围不包含限值、包含任一或两个限值的各范围。设定范围包含一个或两个限值时，本发明也包括排除所述限值之一个或两个的范围。
除非另有说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。虽然也可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但在此描述一些潜在和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用纳入本文，以公开和描述与所引用出版物相关的方法和/或材料。
应注意，本文和所附权利要求书所用的单数形式″一个″、″一种″和″所述″包括复数含义，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提到″细胞″包括多个这样的细胞，提到″所述肽″包括本领域技术人员已知的一或多个肽及其等同物，例如多肽，等等。
提供本文讨论的出版物仅针对其在本申请提交日之前的公开。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际公开日期不同，这可能需要单独确认。
除非另有说明，份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度是摄氏度(℃)，压力是大气压或接近大气压。使用标准缩写，包括下述：bp＝碱基对；kb＝千碱基；pl＝皮升；s或sec＝秒；min＝分钟；h或hr＝小时；aa＝氨基酸；kb＝千碱基；nt＝核苷酸；pg＝皮克；ng＝纳克；μg＝微克；mg＝毫克；g＝克；kg＝千克；dl或dL＝分升；μl或μL＝微升；ml或mL＝毫升；l或L＝升；μM＝微摩尔；mM＝毫摩尔；M＝摩尔；kDa＝千道尔顿；i.m.＝肌肉内(经肌肉内)；i.p.＝腹膜内(经腹膜内)；SC或SQ＝皮下(经皮下)；QD＝每日一次；BID＝每日两次；QW＝每周一次；QM＝每月一次；HPLC＝高效液相色谱；BW＝体重；U＝单元；ns＝无统计学显著性；PBS＝磷酸盐缓冲盐水；PCR＝聚合酶链式反应；NHS＝N-羟基琥珀酰亚胺；HSA＝人血清白蛋白；MSA＝小鼠血清白蛋白；DMEM＝达氏改良伊氏培养基；GC＝基因组拷贝；EDTA＝乙二胺四乙酸。
应理解，在本公开内容中，根据单字母或三字母代码提及氨基酸。为了方便阅读者，单字母和三字母氨基酸代码在下表1中提供：
Figure BDA0003780618550000161
科学文献中描述了分子生物学的标准方法(参见，例如，Sambrook和Russell(2001)《分子克隆》(Molecular Cloning)，第3版，冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)，纽约冷泉港；和Ausubel，等(2001)《新编分子生物学指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，卷1-4，约翰威利父子公司(John Wileyand Sons，Inc.)纽约州纽约，其描述了在细菌细胞中克隆和DNA定点诱变(卷1)、哺乳动物细胞中和酵母中的克隆(卷2)、糖偶联物和蛋白质表达(卷3)，以及生物信息学(卷4))。科学文献描述了用于蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、层析、电泳、离心和结晶，以及化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的生产和蛋白糖基化(参见，例如，Coligan，等(2000)《新编蛋白质科学方案》(Current Protocols in Protein Science)，卷.1-2，约翰威利父子公司(John Wiley and Sons，Inc.)，NY)。
除非另有说明，下述术语意在具有如下含义。在整个说明书中定义了其他术语。
激活：本文所用术语“激活”用于指受体或受体复合物以反映直接和/或通过参与多组分信号转导级联产生的生物学效应，该生物学效应是对配体的结合反应，由激动剂配体结合至受体产生的。例如，据称IL2激动剂结合至其同源IL2受体“激活”受体的信号转导以产生一种或多种胞内生物学效应(例如STAT5的磷酸化)。
活性：如本文所用术语“活性”是针对分子而言，以描述分子在测试系统或生物学功能方面的特性，例如该分子结合至另一分子的程度。这种生物学功能的例子包括但不限于生物剂的催化活性、刺激胞内信号转导的能力、基因表达、细胞增殖、调节免疫学活性(如炎症反应)的能力。“活性”通常表示为每个单元的给予试剂的生物活性，例如[催化活性]/[mg蛋白]、[免疫活性]/[mg蛋白]，活性的国际单位(IU)，[STAT5磷酸化]/[mg蛋白]、[T-细胞增殖]/[mg蛋白]、噬斑形成单位(plaque forming units)(pfu)等。术语“增殖活性”涵盖了促进细胞分裂的活性，所述细胞分裂包括在肿瘤疾病、炎症性疾病、纤维化、发育异常、细胞转化、转移和血管生成中观察到的失调的细胞分裂。
给药/给予：术语“给予”和“施用”在此可互换使用，指的是接触对象的行为，包括用试剂与对象体外、体内或离体的细胞、组织、器官或生物流体接触(例如，IL-2直向同源物、CAR-T细胞、化疗剂、抗体或调节剂或包括上述一种或多种的药物制剂)。试剂的给予可以通过多种本领域认可的方法中的任一种实现，包括但不限于局部、血管内注射(包括静脉或动脉内输注)、皮内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、颅内注射、瘤内注射、经皮、经粘膜、离子渗透递送(iontophoretic delivery)、淋巴管内注射、胃内输注、前列腺内注射、膀胱内输注(如：膀胱)、呼吸道吸入器、眼内注射、腹内注射、病灶内注射、卵巢内注射、脑内输注或注射、脑室内注射(ICVI)等。术语“给予”包括试剂与细胞、组织或器官的接触，以及试剂与液体的接触，其中液体与细胞接触。
不良事件：如本文所用，术语“不良事件”是指与在对象中使用治疗性或预防性试剂有关的任何不期望的经历。不良事件不一定是由给予治疗或预防试剂(例如IL2直向同源物)引起的，也可能由无关的情况引起。不良事件通常被分为轻度、中度或严重。如本文所使用的不良事件的分类符合美国卫生与公众服务部、国家卫生研究院和国家癌症研究所公布于2010年6月14日的不良事件通用术语标准v4.03(CTCAE)。
亲和力：如本文所用术语“亲和力”是指第一分子(例如配体)特异性结合至第二分子(例如受体)的程度，并通过以Kd表示的结合动力学衡量，其为分子与其靶标之间的解离常数(Koff)和分子与其靶标之间的缔合常数(Kon)的比率。
激动剂：如本文所用，术语“激动剂”是指特异性结合至第二试剂(“靶标”)并与靶标相互作用以引起或促进靶标激活的增加的第一试剂。在一些情况下，激动剂是受体蛋白的激活剂，可以调节细胞激活、增强激活、使细胞对第二试剂的激活敏感、或上调一个或多个基因、蛋白质、配体、受体、生物学通路，其可能导致细胞增殖或导致细胞周期停止，或导致细胞死亡(如通过凋亡)的通路的表达。在一些实施方式中，激动剂是结合至受体并改变受体状态，导致生物学反应的试剂，其模拟受体的内源配体的作用。术语“激动剂”包括部分激动剂、完全激动剂和超级激动剂。当激动剂导致所研究的受体诱发的基本完全的生物反应(即与天然存在的配体/受体结合相互作用有关的反应)时，可将这种激动剂描述为“完全激动剂”，或者，激动剂也可以被描述为部分激动剂。″超级激动剂″是能够产生大于靶受体的内源性激动剂的最大反应的激动剂，因此具有超过天然配体的100％的活性。超级激动剂通常是合成分子，在比较试验中以类似的浓度评估时，在分子的天然存在形式的可评估的定量或定性参数中，其表现出大于110％、或者大于120％、或者大于130％、或者大于140％、或者大于150％、或者大于160％、或者大于170％的反应。应该注意的是，与完全激动剂相关的生物效应可能在程度和/或种类上与部分或超级激动剂的那些生物效应不同。与激动剂相反，拮抗剂可以特异性地结合至受体，但不导致通常由受体启动的信号级联，并且可以改变激动剂在该受体上的作用。反向激动剂是指产生与激动剂方向相反的药理反应的药剂。
拮抗剂：如本文所用，术语“拮抗剂”或“抑制剂”是指与激动剂一种或多种作用相对的分子。拮抗剂可以防止、减少、抑制或中和激动剂的活性，而且拮抗剂也可以防止、抑制或减少靶标(如靶受体)的组成型活性，即使没有鉴定的激动剂。抑制剂是减少、阻断、防止、延迟激活、失活、脱敏或下调，例如，基因、蛋白质、配体、受体、生物学通路(包括免疫检查点通路)或细胞的分子。
抗体：如本文所用，术语“抗体”统称指：(a)糖基化的和非糖基化的免疫球蛋白(包括但不限于哺乳动物免疫球蛋白类别IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)，它们特异性结合至靶分子，和(b)免疫球蛋白衍生物，其包括但不限于IgG(1-4)ΔCH2、F(ab’)2、Fab、ScFv、VH、VL、四抗、三抗、双抗、dsFv、F(ab’)3、scFv-Fc和(scFv)2，它们与其来源的免疫球蛋白竞争结合至靶分子。术语抗体不限于来自任何特定哺乳动物物种(包括小鼠、人、马、骆驼)的免疫球蛋白、抗体、人抗体。术语抗体包括所谓的“重链抗体”或“VHH”或
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通常获取自骆驼科(包括骆驼、美洲驼和羊驼)的免疫(参见，例如Hamers-Casterman，等(1993)Nature 363：446-448)。具有给定特异性的抗体也可以来源于非哺乳动物来源，例如从软骨鱼(包但不限于鲨鱼)的免疫中获得的VHH。术语“抗体”包括可从天然来源或用抗原免疫后从动物身上分离的抗体，以及工程改造抗体，包括单克隆抗体、双特异性抗体、三特异性、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR移植的、饰面(veneered)的或去免疫化的(例如，去除T细胞表位)抗体、骆驼源化的(在VHH的情况下)，或非免疫球蛋白支架中包含抗体的结合结构域(如CDR)的分子。术语″抗体″应解释为不限于任何特定的合成方式，包括可从天然来源分离的天然存在的抗体，以及通过″重组″手段制备的工程改造抗体分子，所述工程改造的抗体分子包括从转人免疫球蛋白基因的转基因动物或由其制备的杂交瘤分离的抗体，从转化了导致抗体表达的核酸构建体的宿主细胞中分离出的抗体，从组合抗体文库(包括噬菌体展示文库)中分离出的抗体。在一个实施方式中，“抗体”是哺乳动物的免疫球蛋白。在一些实施方式中，该抗体是“全长抗体”，其包括提供结合和效应功能的可变和恒定结构域。如本文所用术语“单域抗体”(sdAb)是指由单体可变抗体结构域组成的抗体片段，其能够选择性地结合至抗原并与其所衍生的亲本抗体竞争结合。如本文所用，术语“VHH”是指衍生自骆驼科动物抗体的单域抗体，通常获取自骆驼科(包括骆驼、美洲驼和羊驼)的免疫(参见，例如Hamers-Casterman，等(1993)Nature 363：446-448)。VHH也可以称为重链抗体或
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作为单域抗体也可以来源于非哺乳动物来源，例如从软骨鱼(包但不限于鲨鱼)的IgNAR抗体免疫中获得的VHH。术语抗体包括抗体偶联物，其包括为延长作用时间而进行的修饰，例如融合蛋白或与偶联至聚合物(如PEG化的)，在下文更详细地描述。
生物样品：如本文所用术语“生物样品”或“样品”表示获自或源自对象的样品。举例而言，生物样品包括选自下组的材料：体液、血液、全血、血浆、血清、粘液分泌物、唾液、脑脊液(CSF)、支气管肺泡灌洗液(BALF)、眼液(如玻璃体液、房水)、淋巴液、淋巴结组织、脾脏组织、骨髓，以及来自这些组织中一个或多个组织的免疫球蛋白富集部分。在一些实施方式中，样品获取自已经暴露于包括hhIL2直向同源物的药物制剂的治疗方案的对象，例如重复暴露于同一药物。在其他实施方式中，样品获取自最近没有暴露于hIL2直向同源物的对象，或在计划给予hIL2直向同源物之前从对象处获得。
“CAR”或“嵌合抗原受体”：如本文所用，术语“嵌合抗原受体”和“CAR”可互换使用，指的是包含多个功能结构域的嵌合多肽，其从氨基端到羧基端的序列依次排列为：(a)抗原结合结构域(ABD)；(b)跨膜结构域(TD)；和(c)一个或多个胞质信号转导结构域(CSD)，其中上述结构域可以任选地由一个或多个间隔子结构域连接。CAR还可进一步包括信号肽序列，其通常在翻译后处理过程中被去除，并在用包含编码CAR的核酸序列的表达载体转化的细胞表面呈递CAR。在本发明的实践中有用的CAR可以按照本领域众所周知的原理制备。参见，例如，Eshhaar等，美国专利号7,741,465 B1，2010年6月22日授权；Sadelain，等(2013)Cancer Discovery 3(4)：388-398；Jensen和Riddell(2015)《新编免疫学观点》(CurrentOpinions in Immunology)33：9-15；Gross，等(1989)PNAS(USA)86(24)：10024-10028；Curran，等(2012)J Gene Med 14(6)：405-15。可以被修饰以纳入本发明的正交受体的市售可得CAR-T细胞产品的例子包括阿基伦赛(axicabtagene ciloleucel)(从吉利德制药公司(Gilead Pharmaceuticals)以名称
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市售可得)和替沙伦赛(tisagenlecleucel)(从诺华(Novartis)以名称
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市售可得)。
CAR-T细胞：如本文所用，术语“嵌合抗原受体T-细胞”和“CAR-T细胞”可互换使用，指的是经过重组修饰以表达嵌合抗原受体的T细胞。如本文所用，CAR-T细胞可以被工程改造以表达hCD122正交(ortho)多肽。
CD-122正交(Ortho)：如本文所用，术语″CD122正交(ortho)″或“hoCD122”或“hoIL2Rb”互换使用，以指hCD122多肽的变体，其包含在hCD122多肽的ECD的133位组氨酸(H133)和134位酪氨酸(Y134)处的氨基酸取代。在一些实施方式中CD-122正交包含在133位的从组氨酸到天冬氨酸(H133D)、谷氨酸(H133E)或赖氨酸(H133K)的氨基酸取代和/或在134位从酪氨酸到苯丙氨酸(Y134F)、谷氨酸(Y134E)或精氨酸(Y134R)的氨基酸取代。在优选的实施方式中，hCD122正交受体是具有氨基酸取代H133D和Y134F的hCD122分子。在一个实施方式中hCD122正交受体是具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽。
CDR.如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”是指在重链和轻链多肽免疫球蛋白多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。CDR已由Kabat等，J.Biol.Chem.252，6609-6616(1977)；Kabat等，(1991)U.S.美国卫生及公共服务部，“免疫学热门蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)”(本文中也称为Kabat 1991)；Chothia等，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))(本文中也称为Chothia 1987)；以及MacCallum等，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)描述，其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。不过，述及抗体或移植抗体或其变体的CDR定义意在落在本文定义或所用术语范围之内。在本发明的上下文中，CDR位置的编号是根据Kabat编号法提供的。
相当的：如本文所用，术语“相当的”用于描述可评价的定量或定性参数的两个测量结果的差异程度。例如，当可评价的定量参数(例如通过CTLL-2增殖或磷酸化-STAT5试验确定的IL-2活性水平)的第一测量结果和该可评价参数的第二测量结果没有偏离本领域技术人员将会认为两个结果之间不会产生统计学显著性差异的范围，那么这两个测量将被视为“相当的”。在一些情况下，如果一个测量结果偏离另一个测量结果少于35％、或者少于30％、或者少于25％、或者少于20％、或者少于15％、或者少于10％、或者少于7％、或者少于5％、或者少于4％、或者少于3％、或者少于2％或者少于1％，则测量结果可被视为“相当的”。在特定的实施方式中，如果一个测量结果偏离参考标准少于15％、或者少于10％、或者少于5％，则该测量结果与参考标准是相当的。
来源于：如本文所用术语“来源于”，在氨基酸序列或多核苷酸序列的上下文中(例如氨基酸序列“来源于”IL-2多肽)意为表示多肽或核酸具有基于参考多肽或核酸的序列(例如天然存在的IL-2多肽或编码IL-2的核酸)，不意在被限制为制备蛋白质或核酸的来源或方法。举例而言，术语“来源于”包括参考氨基酸或DNA序列的同源物或变体。
有效浓度(EC)：如本文所用，术语“有效浓度”或其缩写“EC”互换使用表示试剂的浓度为足以使测试系统中给定参数产生变化的量。缩写“E”指的是当测试系统被暴露于测试试剂时，测试系统中观察到的给定生物学效应的量级。当反应的量级以测试试剂的浓度(“C”)的因数表示时，使用缩写“EC”。在生物系统的环境下，术语E最大指的是在反应于激活测试试剂的饱和浓度中观察到的给定生物学效应的最大量级。当提供带下标的缩写EC(例如，EC40、EC50等)时，下标是指在该浓度观察到生物学反应的E最大值的百分比。例如，在测试系统中，反应于此测试试剂，测试试剂足以导致可测量的生物学参数减少这种可测量的生物学参数的最大水平的30％的浓度，针对此生物学参数，其被称为该测试试剂的“EC30”。类似地，术语“EC100”用于表示试剂的有效浓度，该浓度使得可测量参数对该试剂产生最大(100％)反应。类似地，术语EC50(其通常用于药代动力学领域)是指足以导致可测量参数半最大(50％)改变的试剂浓度。术语“饱和浓度”是指在标准温度和压力的条件下，测试试剂能够溶于标准体积的特定溶剂(例如水)的最大可能量。在药代动力学中，药物的饱和浓度通常用于表示足以使所有可用受体被药物占据的药物浓度，而EC50是给予半最大效应的药物浓度。
富集的：本文所用的术语“富集的”是指对样品进行非天然操作，使感兴趣的分子以以下存在：(a)比分子在起始样品(如生物样品)中的浓度高(例如，至少高3倍、或者至少高5倍、或者至少高10倍、或者至少高50倍、或者至少高100倍、或者至少高1000倍)；或(b)浓度高于制备该分子的环境(例如，在重组修饰的细菌或哺乳动物细胞中)。
胞外结构域：如本文所用术语“胞外结构域”或其缩写“ECD”是指细胞质膜外侧的细胞表面蛋白质部分(例如细胞表面受体)。ECD可以包括跨膜蛋白、细胞表面或膜相关蛋白、分泌蛋白、细胞表面靶向蛋白的整个胞质外部分。
hCD-122：如本文所用术语“hCD122”是指天然存在的人CD122多肽，包括其天然存在的变体。一种天然存在的hCD122变体的氨基酸序列是：
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Figure BDA0003780618550000241
同一性：对于多肽或DNA序列本文所用的的术语″同一性″是指两个分子之间的亚单位序列同一性。当两个分子中的亚单位位置被相同的单体亚单位(即相同的氨基酸残基或核苷酸)占据时，那么这两个分子在该位置是相同的。两个氨基酸或两个核苷酸序列之间的相似性是相同位置的量的直接函数。通常，比对序列以获得最高阶匹配。如有必要，可以用已公开的技术和广泛使用的计算机程序来计算同一性，例如GCS程序包(Devereux等，(1984)Nucleic Acids Res.12：387)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等，(1990)J.Molecular Biol.215：403-410)。适合测定序列同一性百分数和序列相似性百分数的算法是BLAST和BLAST 2.0算法，描述于Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410和Altschul等(1977)Nucleic Acids Res.25：3389-3402。进行BLAST分析的软件可从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)网站公开获得。此算法包括：首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，与数据库序列中长度相同的字比对时它们能匹配或满足一些正值的阈值评分“T”。T称为相邻字评分阈值(Altschul等，同上)。这些初始相邻字命中(word hit)用作启动搜索的种子，以便找到含有它们的较长HSP。然后，沿各序列在两个方向上延伸该字命中，直到提高累积的比对评分。就核苷酸序列而言，采用参数“M”(一对匹配残基的奖励评分；总是＞0)和“N”(错配残基的罚分；总是＜0)计算累积评分。就氨基酸序列而言，用评分矩阵计算累积评分。出现以下情况时中止字命中在各个方向上的延伸：(a)累积比对评分比其最大获得值降低X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分变为零或零以下；或者(b)达到任一序列的末端。BLAST算法参数“W”、“T”和“X”确定该比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)功能类似但采用的默认值如下：字长(“W”)28，期望值(“E”)10，M＝1，N＝-2，以及比较两条链。就氨基酸序列而言，BLASTP程序使用如下默认值：字长(W)为3，期望值(E)为10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，(1989)PNAS(USA)89：10915-10919)。
IL-2：如本文所用，术语“白细胞介素-2”或″IL-2″是指具有IL-2活性的天然存在的IL-2多肽。在一些实施方式中，IL-2是指成熟的野生型人IL-2。成熟的野生型人IL-2(hIL2)是133个氨基酸的多肽(减去由额外的20个N-末端氨基酸组成的信号肽)，如Fujita，等，PNAS USA，80，7437-7441(1983)所述。成熟的野生型人IL-2(hIL2)的天然存在的变体的氨基酸序列是：
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如本文所用，残基的编号是基于hIL2序列UniProt ID P60568，不包括与SEQ IDNO：4的相同的信号肽。
IL2活性：术语“IL2活性”是指对细胞与有效量的IL2多肽接触反应的细胞上的一个或多个生物学效应。可以测量IL2活性，例如，在细胞增殖试验中使用CTLL-2小鼠细胞毒性T细胞，参见，Gearing，A.J.H.和C.B.Bird(1987)在《淋巴因子和干扰素：实用方法》(Lymphokines and Interferons，A Practical Approach.)Clemens，M.J.等(编)：IRL出版社(IRL Press).295。重组人IL-2的比活性约为2.1x104IU/μg，其为针对重组人IL-2WHO国际标准(NIBSC编码：86/500)校准的。在一些实施方式中，例如当感兴趣的hIL2正交多肽表现出(或被工程改造以具有)对CD25的减弱亲和力时，IL2活性可以在人细胞(例如YT细胞)中评估，所述细胞不需要CD25来通过IL2受体提供信号转导，而是能够通过中等亲和力CD122/CD132受体信号转导。当在对比实验中以相似浓度评估时，本发明的正交人IL-2可以具有WHO国际标准(NIBSC编码：86/500)野生型成熟人IL-2的活性的低于20％、或者低于约10％、或者低于约8％、或者低于约6％、或者低于约4％、或者低于约2％、或者低于约1％、或者低于约0.5％的。
IL-2直向同源物：如本文所用，术语“IL-2直向同源物”是指衍生自IL-2亲本多肽的hIL2的变体，其特异性结合至正交hCD122 ECD，且表现出对野生型hCD122的胞外结构域的结合显著减少。在一些实施方式中该hIL2直向同源物表现出特异性结合至包含正交hCD122 ECD的受体，并且接触表达包含正交hCD122多肽的ECD的跨膜受体的细胞，所述接触的量是足以使所述跨膜受体的胞内结构域(ICD)产生的信号的信号特征产生变化的量。当跨膜受体包含正交hCD122 ECD和hCD122 ICD时，hIL2直向同源物结合至此受体产生CD122/CD132中等亲和力hIL2受体的Cd25/CD122/CD132高亲和力的激活的胞内信号特征。IL-2直向同源物对野生型hCD122的结合表现出显著降低。术语hIL2直向同源物包括IL-2正交变体和修饰的hIL2直向同源物。在一些实施方式中，hIL2直向同源物衍生自人IL2的天然存在的变体，这种人IL2直向同源物可称为“hoCD122”或“hoRb”。在Garcia，等(美国专利申请公开US2018/0228842A1，公开于2018年8月16日)中提供了某些修饰的IL-2多肽。如本文所用，术语hIL2直向同源物不包含修饰的hIL2多肽，其描述于Garcia，等的美国专利申请公开US2018/0228842A1，公开于2018年8月16日。
足以产生变化的量：如本文所使用的短语“足以产生变化的量”是指足以使之前(如基线水平)和施用测试试剂之后测量的指标水平之间产生可检测的差异的测试试剂的量，如在基于细胞的试验中评估对给予一定量的测试试剂的反应生物学功能。“足以产生变化的量”可以是足以治疗有效的量，但“足以产生变化的量”可能多于或少于治疗有效量。
需要治疗的：本文所用术语“需要治疗的”是指医生或其他护理人员对对象作出的判断，关于对象和对象需要或将有可能从治疗中受益。这种判断是基于医生或护理人员的专业知识领域中的多种因素作出的。
需要预防的：本文所用术语“需要预防的”是指医生或其他护理人员对对象作出的判断，关于对象其对象需要或将有可能从预防护理中受益。这种判断是基于医生或护理人员的专业知识领域中的多种因素作出的。
抑制剂：如本文所用术语“抑制剂”是减少、阻断、防止、延迟激活、失活、脱敏或下调的分子，例如，基因、蛋白质、配体、受体或细胞。抑制剂也可以被定义为减少、阻断或失活细胞或生物体的组成型活性的分子。
胞内结构域：如本文所用术语“胞内结构域”或其缩写″ICD″是指细胞质膜内的细胞表面蛋白质部分(例如细胞表面受体)。ICD可以包含跨膜蛋白或膜关联蛋白的整个胞内部分，或胞内蛋白。
分离的：如本文所使用的术语“分离的”是指感兴趣的多肽，如果是天然存在的，其环境与它可能天然存在的环境不同。“分离的”意指包括在样品中的多肽，其基本上富集了感兴趣的多肽和/或感兴趣的多肽被部分或基本上纯化了。如果多肽不是天然存在的，“分离的”表示该多肽已经从其通过合成或重组手段制备的环境中分离出来。
正交受体的胞内结构域：如本文所用术语″正交受体的胞内结构域″或″ICD-OR″是指跨膜正交受体的部分，它位于表达这种跨膜正交受体的细胞的质膜内。ICD-OR可以包括一个或多个″增殖信号转导结构域″或″PSD″，其指向细胞发出信号以进入有丝分裂并开始细胞生长的蛋白结构域。例子包括Janus激酶，包括但不限于JAK1、JAK2、JAK3、Tyk2、Ptk-2、来自其他哺乳动物或真核物种的Janus激酶家族的同源成员、IL-2受体β和/或γ链以及来自细胞因子受体超家族蛋白的其他亚基，它们可能与Janus激酶家族的蛋白相互作用以转导信号，或其部分、修饰或组合。信号的例子包括一个或多个STAT分子的磷酸化，包括但不限于STAT1、STAT3、STAT5a和/或STAT5b的一个或多个。
Kabat编号：如本文所用的术语″Kabat编号″是本领域公认的术语，指的是对免疫球蛋白的重链和轻链区域中比其他氨基酸残基更可变的氨基酸残基(例如，高变的(hypervariable))进行编号的系统(Kabat，等，(1971)Ann.NYAcad.Sci.190：382-93；Kabat，等，(1991)《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，第五版，美国卫生与公共服务部，NIH出版号91-3242)。出于本公开的目的，抗体可变区域中CDR的定位遵循Kabat编号或简称为″Kabat″。
配体：如本文所用，术语“配体”是指特异性结合受体并导致受体变化的分子，其使得受体的活性发生改变或在表达受体的细胞中发生反应。在一个实施方式中，术语“配体”是指可以作为受体的激动剂或拮抗剂的分子或其复合物。如本文所用，术语“配体”包括天然和合成的配体。“配体”也包括小分子，细胞因子和抗体的肽模拟物。配体和受体的复合物被称为“配体-受体复合物”。配体可以包括多蛋白或融合蛋白的一个结构域(例如，或抗体/配体融合蛋白的结构域)
转移：如本文所用术语“转移”描述了癌细胞从原发癌向周围组织和向远端器官的传播
修饰的IL-2直向同源物：如本文所用术语“修饰的IL-2直向同源物”用于指具有一个或多个修饰的IL-2直向同源物，例如聚乙二醇化、糖基化(N-和O-连接)、酰基化或多聚唾液酸化或通过与其他多肽运载体分子偶联(无论是化学还是融合蛋白)，包括但不限于白蛋白融合多肽，其包含血清白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)或和Fc-融合蛋白，或具有靶向部分(例如包含hhIL2正交多肽融合蛋白的IgG)，靶向IL-2正交多肽，例如ScFv-hIL2正交蛋白多肽融合蛋白和VHH-IL-2正交蛋白多肽融合蛋白。可以制备修饰的hIL2直向同源物，以增强一种或多种特性，例如，调节免疫原性；增加水溶性、生物利用度、血清半衰期和/或治疗半衰期的方法；和/或调节生物活性。某些修饰也可用于，例如，提高用于检测试验的抗体(例如，表位标签)和提供便于蛋白质纯化。
调节：如本文所用，术语“调节”、“调制”等是指测试试剂在系统(包括生物系统或生化途径)中影响反应的能力，可以是积极或消极的，也可以是直接或间接的。术语调节剂包括激动剂和拮抗剂。
肿瘤疾病：如本文所用，术语“肿瘤疾病”指的是对象中由细胞过度增殖或失控(或失调)的细胞复制引起的紊乱或病症。术语肿瘤疾病指对象中存在肿瘤引起的紊乱。肿瘤可以分类为：(1)良性(2)恶变前(或“癌前”)；和(3)恶性(或“癌性”)。术语“肿瘤疾病”包括肿瘤相关疾病、紊乱和病症，指的是与肿瘤疾病直接或间接相关的病症，包括例如血管生成和癌前病症，例如发育异常(dysplasia)或缓慢进展型多发性骨髓瘤(smoldering multiplemyeloma)。由细胞复制失调引起良性紊乱的例子包括肥厚性疤痕，例如瘢瘤(keloidscar)。N-末端：如本文在多肽结构的上下文中使用，“N-末端”(或“氨基末端”)和“C-末端”(或“羧基末端”)分别指多肽的极氨基端和羧基端，而术语“N-末端的”和“C-末端的”分别指多肽的氨基酸序列中朝向N-末端和C-末端的相对位置，并可分别包括N-末端和C-末端残基。“近邻N-末端的”或“近邻C-末端的”是指第一氨基酸残基相对于第二氨基酸残基的位置，其中第一和第二氨基酸残基共价结合以提供连续的氨基酸序列。
核酸：术语“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”等在本文中可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸的非限制性例子包括线性和环形核酸、信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、载体、探针、引物等。
根据hIL2编号：如本文所用术语″根据hIL2编号″是指根据在成熟野生型hIL2的序列(SEQ ID NO：4)中通常存在的氨基酸所在位置确定特定氨基酸的位置。例如，对于hIL2，“R81”指的是成熟野生型hIL2的序列中存在的第81个(从N-末端起编号)氨基酸处的精氨酸。应注意，不同哺乳动物物种的IL2分子的氨基酸序列具有不同的氨基酸数量和氨基酸序列。因此，当根据本约定提及残基时有助于鉴定所讨论的IL2物种。
根据hCD122编号：如本文所用术语″根据hCD122编号″是指根据在成熟野生型hCD122分子的序列中，在一个实施方式中，SEQ ID NO.3的hCD122中，通常存在的氨基酸所在位置确定特定氨基酸的位置。例如，对于人CD122，H133指的是成熟野生型hCD122的序列的第133个(从N-末端起编号)氨基酸处的组氨酸。
根据hCD122的胞外结构域编号：如本文所用术语″根据hCD122的胞外结构域编号″或″根据hCD122 ECD编号″是指根据在成熟野生型hCD122分子的胞外结构域(ECD)序列(SEQID NO.3)中，通常存在的氨基酸所在位置确定特定氨基酸的位置。例如，对于人CD122 ECD，H133指的是成熟野生型hCD122 ECD的序列的第133个(从N-末端起编号)氨基酸处的组氨酸。
可操作地连接：在本文中使用术语“可操作地连接”指的是分子之间的关系，通常是多肽或核酸，它们被安排在构建体中，使得各组分分子的功能得以保留，尽管可操作连接可能导致构建体中单独组成部分的活性被正向或负向地调控。例如，聚乙二醇(PEG)分子可操作连接至野生型蛋白，可能导致构建体中该蛋白的生物活性相对于野生型分子降低，但两者仍被视为可操作连接。当术语“可操作地连接”用于指编码不同功能的多个核酸序列在组合成单个核酸分子的关系时，例如，当使用重组技术将其引入细胞时，提供能够在细胞中实现特定核酸序列的转录和/或翻译的核酸。例如，如果它导致前蛋白的表达，编码信号序列的核酸序列可以被认为可操作地连接至编码多肽的DNA，由此信号肽促进多肽分泌；如果它影响序列的转录，启动子或增强子被认为可操作地连接至编码序列；或如果它被定位以促进翻译，核糖体结合位点被认为可操作地连接至编码序列。通常，在核酸分子的上下文中，术语″可操作地连接″意为被连接的核酸序列是连续的，在分泌型前导或分子的相关联亚结构域的上下文中，其为连续的并且处于阅读段。然而，某些遗传元件，如增强子，可以在一定距离处发挥功能，不需要与它们产生作用的序列连续，不过可以被认为可操作地连接。
正交hCD122：如本文所用术语“正交hCD122”或“CD122正交受体”在本文中互换使用，指hCD122多肽变体，其包含导致特异性结合至hhIL2直向同源物但并不特异性结合至hIL2的天然变体的氨基酸取代。在一个实施方式中，hCD122是在SEQ ID NO：4(天然存在的hCD122)的第133和134位具有氨基酸修饰的hCD122.在一些实施方式中，正交hCD122包括是具有氨基酸取代H133D和Y134F的hCD122分子(SEQ ID NO：2)。
正交受体：如本文所用术语“正交受体”指的是受体的变体，正交受体包含对氨基酸序列的修饰，使得正交受体表现出对其同源配体的结合显著减少，但特异性结合工程改造为与正交受体相互作用的正交配体。在一些实施方式中，正交受体可以包含对其同源天然配体表现出结合显著减少的胞外结构域，而正交受体对其一个或多个同源天然受体的ECD表现出结合显著减少。在一些实施方式中，正交配体表现出对同源正交受体的亲和力与天然配体对天然受体的亲和力相当，例如，具有天然细胞因子受体对亲和力的至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约100％且可能更高，例如，是天然细胞因子对天然受体的亲和力的2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍。正交受体可以由其衍生的亲本分子来称呼(例如正交hCD122)或由正交受体的正交配体衍生的同源配体来称呼(例如正交hIL2受体)。
直向同源物：如本文所用术语“直向同源物”指的是正交配体/受体对的配体组分，指一级结构中纳入修饰的多肽，以提供多肽变体，所述多肽变体表现出：(a)对其天然同源受体(即，该直向同源物衍生自的亲本多肽的天然受体)的亲和力显著减少；和(b)特异性结合工程改造的正交受体，所述正交受体为直向同源物的同源受体的变体。直向同源物结合至正交受体后(正交受体在细胞表面表达，所述细胞被重组DNA技术修饰以纳入编码正交受体的核酸序列，其可操作地连接至控制元件，以实现重组修饰细胞中正交受体的表达)，激活的正交受体起始信号转导，通过天然细胞元件转导，以提供模拟同源物的天然反应但对表达正交受体的重组修饰细胞群特异性的生物学活性。在本发明的一些实施方式中，相对于同源受体，直向同源物具有对正交受体的显著的选择性，且相对于同源受体，任选地具有显著减少的效力。通常在对配体/受体结合反应诱导的活性的表征试验中通过活性测量评估选择性。在一些实施方式中，相较于在同一试验中测得的正交受体的EC50增加的亲和力，直向同源物具有至少5倍、或者至少10倍、或者至少20倍、或者至少30倍、或者至少40倍、或者至少50倍、或者至少100倍、或者至少200倍的差异。
亲本多肽：如本文所用，术语″亲本多肽″或″亲本蛋白″互换使用以表示第二多肽(例如衍生物或变体)的来源，相对于第一″亲本″多肽，第二蛋白经修饰。在一些情况下，亲本多肽是蛋白的野生型或天然存在形式。在一些情况下，亲本多肽可以经修饰，形成进一步修饰的天然存在的蛋白。术语“亲本多肽”可以指多肽自身或包含亲本多肽的组合物(例如糖基化的或PEG化形式和/或包含亲本多肽的融合蛋白)。
部分激动剂：如本文所用，术语“部分激动剂”是指特异性结合结合至并激活给定受体的分子，但相对于完全激动剂，它只具有部分激活受体。部分激动剂可以同时表现激动和拮抗作用。例如，当完全激动剂和部分激动剂同时存在时，部分激动剂作为竞争性拮抗剂，通过与完全激动剂竞争对受体的结合，相对于在不存在部分激动剂的情况下受体与完全激动剂的接触，导致受体激活净减少。当内源性配体存在的数量不足时，对象中的部分激动剂可用于激活受体以提供所需的亚最大反应，或者当内源性配体数量过多时，它们可减少对受体的过度刺激。部分激动剂产生的最大反应(E最大)被称为其固有活性，当完全激动剂产生100％的反应时，可以用百分比表示其固有活性。在给定的试验系统中以类似浓度评估时，部分激动剂可以具有参考多肽的活性的大于10％但低于100％、或大于20％但小于100％、或大于30％但小于100％、或大于40％但小于100％、或大于50％但小于100％、或大于60％但小于100％、或大于70％但小于100％、或大于80％但小于100％、或大于90％但小于100％。
PEG-hIL2直向同源物：如本文所用的术语“PEG-IL2直向同源物”是指共价结合至至少一个聚乙二醇(PEG)分子的hIL2直向同源物，至少一个PEG分子共价附接至IL-2直向同源物的至少一个氨基酸残基。PEG化的多肽还可以称为单聚乙二醇化、二聚乙二醇化、三聚乙二醇化(等)，以表示分别包含附接至IL-2直向同源物的一个、两个、三个(或更多)PEG部分的PEG-hIL2直向同源物。在一些实施方式中，PEG可以直接地共价附接至IL-2直向同源物(例如，通过赖氨酸侧链、半胱氨酸的巯基或N-末端胺)或任选地在PEG和IL-2直向同源物之间采用接头。在一些实施方式中，PEG-hIL2直向同源物包含多于一个的PEG分子，每个分子附接至不同的氨基酸残基上。在一些实施方式中，PEG-hIL2直向同源物来源于SEQ ID NO：4。
多肽：如本文所用术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，并且指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遗传编码的或非遗传编码的氨基酸，化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸，和具有修饰的多肽主链的多肽。这些术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白；具有异源和同源前导序列的融合蛋白；具有或不具有N-末端甲硫氨酸残基的融合蛋白；具有免疫学标签蛋白的融合蛋白；免疫学活性蛋白(例如抗原性白喉或破伤风毒素片段)的融合蛋白等等。
防止：本文所用的术语“预防”、“防止”等是指在对象疾病、紊乱、病症或其症状发生之前启动的行动过程，使得暂时或永久地预防、减轻、抑制或减少对象患某种疾病、紊乱、病症或类似疾病的风险(例如通过没有临床症状来确定)，或推迟其发作，一般是在对象由于遗传、经验或环境因素而易患某种特定疾病、紊乱或病症的情况下。在某些情况下，术语“预防”、“防止”也被用来指减缓疾病、紊乱或病症从目前的状态向更有害的状态发展。
受体：如本文所用，术语“受体”是指具有特异性结合配体的结构域的多肽，该配体的结合导致该多肽的至少一种生物学特性的改变。在一些实施方式中，受体是细胞表面受体，其包括胞外结构域(ECD)和膜关联结构域，后者用于将ECD锚定至细胞表面。在细胞表面受体的一些实施方式中，受体是跨膜多肽，其包括由通常称为跨膜结构域(transmembranedomain)(TM)的跨膜的结构域(membrane spanning domain)连接的胞内结构域(ICD)和胞外结构域(ECD)。同源配体结合至受体导致受体的构象变化，从而产生可测量的生物学效应。在一些情况下，如果受体是包括ECD、TM和ICD的跨膜多肽，配体结合至ECD导致由ICD的一个或多个结构域介导的可测量的胞内生物学效应，以反应于配体结合至ECD。在一些实施方式中，受体是多组分复合物的组分，以促进胞内信号转导。例如，配体可以结合细胞表面受体，该受体不单独与任何胞内信号转导相关联，但在配体结合后促进异源多聚体(包括异二聚体、异三聚体等)或同源多聚体(例如同二聚体、同三聚体、同四聚体等)复合物的形成，导致细胞中可测量的生物学效应，例如胞内信号转导级联(例如Jak/STAT途径)的激活。例如，配体可以结合细胞表面分子，该分子不单独与任何胞内信号转导相关联，但在配体结合后促进异源多聚体(包括异二聚体(例如中等亲和力hCD122/CD132 hIL2受体)、异三聚体(如高亲和力CD25/CD122/CD132 hIL2受体)或同源多聚体(同二聚体、同三聚体、同四聚体)复合物的形成，导致胞内信号转导级联(如Jak/STAT途径)的激活。在一些实施方式中，受体是跨膜单链多肽，其包括ECD、TM和ICD结构域，其中ECD、TM和ICD结构域来源于相同或不同的天然存在的受体变体或其合成功能性等同物。
重组的：如本文所用，术语“重组的”用作形容词指使用重组DNA技术修饰多肽、核酸或细胞的方法。“重组蛋白”是指使用重组DNA技术产生的蛋白，通常在蛋白名称前缩写为小写“r”，以表示产生蛋白的方法(例如重组产生的人生长激素通常缩写为“rhGH”)。类似地，如果细胞经修饰，通过使用重组DNA技术纳入(例如转染、转导、感染)外源核酸(例如ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA、mRNA、病毒或非病毒载体、质粒、黏粒等)，则细胞被称为“重组细胞”。用于重组DNA技术的技术和方案是本领域众所周知的，例如，可以在Sambrook等(1989)《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)(第2版，冷泉港实验室出版社，纽约州普莱恩维尤)中和其他标准分子生物学实验手册中找到。
反应：术语“反应”，例如，细胞、组织、器官或生物体的反应，包括可评估的生化或生理参数(例如，浓度、密度、粘附性、增殖、激活、磷酸化、迁移、酶活、基因表达水平、基因表达率、能量消耗率(rate of energy consumption)、分化水平或状态)的定量或定性变化，其中该变化与激活、刺激或处理相关，或与外源试剂接触或内部机制(如遗传编程)相关。在某些情况下，术语“激活”、“刺激”等是指由内部机制以及外部或环境因素调节的细胞激活；而术语“抑制”、“下调”等则是指相反的效果。“反应”可以在体外评估，例如通过使用试验系统、表面等离子体共振、酶活、质谱、氨基酸或蛋白质测序技术。“反应”可以体内定量评估，通过评估客观生理参数，例如体温、体重、肿瘤体积、血压、X-射线或其他成像技术的结果，或通过报告的主观感受(幸福、抑郁、忧虑或疼痛)的变化定性评估。在一些实施方式中，CD3激活的原代人T细胞的增殖水平可以在生物发光试验中评估，该试验产生与存在的ATP的量成比例的发光信号，而ATP与存在于培养物中的细胞的量成比例，如Crouch，等(1993)J.Immunol.Methods 160：81-8所述，或通过使用市售可得的试验，例如
Figure BDA0003780618550000351
2.0细胞活力实验或
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3D细胞活力试剂盒，其可商购自普洛麦格公司(Promega Corporation)，麦迪逊WI 53711，货号G9241和G9681，并基本按照制造商提供的说明书使用。在一些实施方式中，反应于测试试剂的给予的T细胞的激活水平可以通过所述流式细胞术方法测定，如通过STAT(例如STAT1、STAT3、STAT5)磷酸化水平测定，根据本领域众所周知的方法。例如，可以使用流式细胞术技术测量STAT5磷酸化，如Horta，等，同上，Garcia，等，同上，所述，或使用市售试剂盒，例如磷酸-STAT5(Tyr694)试剂盒(商购自铂金埃尔默(Perkin-Elmer)，马萨诸塞州沃尔瑟姆，部件号64AT5PEG)，基本根据制造商提供的说明书进行。
显著减少的结合：使用术语“表现出显著减少的结合”指相对于第一分子的亲本形式，第一分子(例如配体)的变体对于第二分子(例如受体)表现出显著减少的亲和力。如本文所用，使用术语“表现出显著减少的结合”指相对于正交配体对其同源受体的天然存在形式的结合，正交配体对正交受体的结合亲和力。如果正交配体对受体的天然形式的结合为天然存在的配体的小于20％、或小于约10％、或小于约8％、或小于约6％、或小于约4％、或小于约2％、或小于约1％、或小于约0.5％，则相对于配体的天然形式，正交配体表现出显著减少结合。类似地，如果配体的天然形式对受体的正交形式的结合为天然存在受体的小于20％、或小于约10％、或小于约8％、或小于约6％、或小于约4％、或小于约2％、或小于约1％、或小于约0.5％，则相对于配体的天然形式，正交受体表现出显著减少结合。
一个或多个小分子：术语“小分子”指的是分子量小于约10kDa、小于约2kDa或小于约1kDa的化学化合物(通常是药学活性化合物)小分子包括但不限于无机分子、有机分子、包含无机组分的有机分子、包含放射性原子的分子和合成分子。术语“小分子”是制药业普通技术人员所熟知的术语，通常用于区分有机化学化合物和生物制剂。
特异性结合：本文所用的术语“特异性结合”是指一个分子结合至另一个分子的选择性或亲和性的程度。在结合对(如配体/受体、抗体/抗原、抗体/配体、抗体/受体结合对)的上下文中，当结合对的第一分子不以显著量结合至样品中存在的其他组分时，就称作结合对的第一分子特异性结合至结合对的第二分子。当结合对的第一分子对第二分子的亲和力比第一分子对样品中存在的其他组分的亲和力至少大2倍、或至少大5倍、或至少大10倍、或至少大20倍、或至少大100倍时，结合对的第一分子被称为特异性结合至结合对的第二分子。在结合对中的第一分子是抗体的特定实施方式中，如果结合对的抗体和第二分子之间的平衡解离常数大于约106M、或者大于约108M、或者大于约1010M、或者大于约1011M、或者大于约1010M、或者大于约1012M，例如通过Scatchard分析确定，则该抗体特异性结合至结合对中的第二分子(例如，蛋白质、抗原、配体或受体)(Munsen，等1980Analyt.Biochem.107：220-239)。在一个实施方式中，其中配体是hIL2直向同源物，受体包括正交hCD122 ECD，如果hIL2直向同源物/正交hCD122 ECD的平衡解离常数大于约105M、或大于约106M、或大于约107M、或大于约108M、或大于约109M、或大于约1010M、或大于约1011M，则该hIL2直向同源物特异性结合。特异性结合可使用本领域已知的技术进行评估，包括但不限于竞争ELISA、放射性配体结合试验(例如，饱和结合、斯卡查德图(Scatchard plot)、非线性曲线拟合程序和竞争结合试验)；非放射性配体结合试验(例如，荧光偏振(fluorescence polarization)(FP)、荧光共振能量转移(FRET)；液相配体结合试验(例如，实时聚合酶链式反应(RT-qPCR)和免疫沉淀)；和固相配体结合试验(例如，多孔板试验、珠上配体结合试验、柱上配体结合试验和过滤试验)和表面等离子体共振试验(参见，例如，Drescher等(2009)，Methods MolBiol493：323-343，使用市售可得的仪器例如Biacore 8+、Biacore S200、BiacoreT200(GE医疗生命科学公司，地址：100Results Way，Marlborough MA01752))。
对象：术语“受体”、“个体”、“对象”和“患者”在本文中可互换使用，并指任何需要诊断、处理或治疗的哺乳动物对象，特别是人。用于治疗目的的“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养和农场动物、非人灵长类动物，以及动物园、运动或宠物动物，例如狗、马、猫、奶牛、绵阳、山羊、猪等。在一些实施方式中，哺乳动物为人。
患有：如本文所用，术语“患有”是指医生根据本领域公认的鉴定疾病、紊乱或病症的现有信息(包括但不限于X-射线、CT-扫描、常规实验室诊断测试(例如血细胞计数等)、基因组数据、蛋白质表达数据、免疫组织化学)对对象做出的其需要或将受益于治疗的判断。术语患有通常与特定疾病状态结合使用，例如“患有肿瘤疾病”指患者被诊断为携带肿瘤。
基本上纯的：如本文所用，术语“基本上纯的”表示组合物的组分占组合物总含量的大于约50％、或大于约60％、或大于约70％、或大于约80％、或大于约90％、或大于约95％。“基本上纯的”蛋白质占组合物总含量的大于约50％、或大于约60％、或大于约70％、或大于约80％、或大于约90％、或大于约95％。
T-细胞：如本文所用术语“T-细胞”或“T细胞”以其常规意义使用，是指在胸腺中分化的淋巴细胞，拥有特定细胞表面抗原受体，包括一些控制细胞介导的免疫和体液免疫和其他裂解携带抗原的细胞的起始或抑制的。在一些实施方式中，T细胞包括但不限于幼稚CD8+T细胞、细胞毒性CD8+T细胞、幼稚CD4+T细胞、辅助T细胞，例如TH1、TH2、TH9、TH11、TH22、TFH；调节性T细胞，例如TR1、Treg、诱导型Treg；记忆性T细胞，例如中心记忆T细胞、效应记忆T细胞、NKT细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和此类T细胞的工程改造变体，包括但不限于CAR-T细胞、重组修饰TIL和TCR-工程改造细胞。
末端/末端的：如本文在多肽结构的上下文中使用，“N-末端”(或“氨基末端”)和“C-末端”(或“羧基末端”)分别指多肽的极氨基端和羧基端，而术语“N-末端的”和“C-末端的”分别指多肽的氨基酸序列中朝向N-末端和C-末端的相对位置，并可分别包括N-末端和C-末端残基。“近邻N-末端的”是指连续多肽序列中第一氨基酸残基相对于第二氨基酸残基的位置，第一氨基酸距多肽的N-末端更近。“近邻C-末端的”是指连续多肽序列中第一氨基酸残基相对于第二氨基酸残基的位置，第一氨基酸距多肽的C-末端更近。
治疗有效量：本文使用的短语“治疗有效量”是指向对象给予试剂，单独地或作为药物组合物或治疗方案的一部分，以单剂量或作为系列剂量的一部分，以能够对疾病、紊乱或病症的任何症状、方面或特征产生任何可检测的、积极影响的量。治疗有效量可以通过测量相关的生理效应来确定，并且可以结合给药方案和对对象病情的诊断分析等来调整。用于确定试剂的治疗有效量的评估参数由医生使用公认的诊断标准确定，包括但不限于指标例如年龄、体重、性别、总体健康状况、ECOG评分、可观察到的生理参数、血液浓度、血压、心电图、计算机断层扫描、X-射线等。或者或此外，还可以监测临床情境中通常评估的其他参数，以确定是否对对象给予了治疗有效量的试剂，如体温，心率，血液化学的正常化，血压的正常化，胆固醇水平的正常化，或疾病、紊乱或病症的任何症状、方面或特征，生物标志物(如炎症细胞因子、IFN-γ、颗粒酶等)，血清肿瘤标志物的减少，实体瘤反应评估标准(RECIST)的改善、免疫相关缓解标准(irRC)的改善、生存期的延长、无进展生存期的延长、进展时间的延长、治疗失败时间的延长、无事件生存期的延长、下次治疗时间的延长、客观缓解率的改善、缓解持续时间的改善、肿瘤负担的减轻、完全缓解、部分缓解、稳定的疾病等，本领域的临床医生基于这些评估对象对给予试剂的反应的状况改善。如本文所用，涉及靶病灶的术语“完全缓解(CR)”、“部分缓解(PR)”、“稳定的疾病(SD)”和“进展性疾病(PD)”，涉及非靶病灶的术语“完全缓解(CR)”、“不完全缓解/稳定的疾病(SD)”和“进展性疾病(PD)”，应理解为RECIST标准中所定义。如本文所用术语“免疫相关完全缓解(irCR)”、“免疫相关部分缓解(irPR)”、“免疫相关进展性疾病(irPD)”和“免疫相关稳定的疾病(irSD)”如根据免疫相关缓解标准(irRC)定义。如本文所用，术语“免疫相关缓解标准(irRC)”是指用于评估免疫治疗的缓解的体系，如描述于Wolchok，等(2009)评估实体瘤中免疫治疗活性的指南：免疫相关缓解标准(Guidelines for the Evaluation of Immune TherapyActivity in Solid Tumors：Immune-Related Response Criteria)，Clinical CancerResearch 15(23)：7412-7420。在对象疗程期间，可以根据给药方案和/或对象病情的评估及前述因素的变化调整治疗有效量。在一个实施方式中，治疗有效量是在哺乳动物对象给药过程中当单独使用或与另一试剂组合使用时不导致不可逆的严重不良事件的试剂的量。
跨膜结构域：术语″跨膜结构域″或″TM″是指跨膜多肽(例如跨膜受体)的结构域，当该跨膜多肽与细胞膜相关联时，该结构域嵌入细胞膜中，并与跨膜多肽的胞外结构域(ECD)和胞内结构域(ICD)以肽基键连接(peptidyl linkage)。跨膜结构域可以与胞外和/或胞内结构域中的一个或两个同源(天然相关联)或异源(不天然相关联)。在一些实施方式中，跨膜结构域是与衍生正交受体的同源受体的ECD结构域天然相关联的跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域是与衍生正交受体的同源受体的ICD结构域天然相关联的跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域是与增殖信号转导结构域天然相关联的跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域是与不同蛋白质天然相关联的跨膜结构域。或者，正交受体的跨膜结构域可以是跨越质膜的人工氨基酸序列。在一些实施方式中，正交受体的跨膜结构域是与衍生正交受体的同源受体的ICD通常相关联的跨膜结构域。
治疗：术语“治疗”、“疗法”、“处理”等是指，对应于对象患有疾病、紊乱或病症或其症状的诊断，对于对象起始的行动过程((例如使对象接触hIL-2直向同源物(orthogolog)、hoRb T细胞、hoCAR-T细胞或包含其的药物组合物)，单独地或与补充剂组合)，起始该行动过程以暂时或永久地消除、减少、抑制、减轻或改善以下至少之一：(a)困扰对象的疾病、紊乱或病症的根本原因；和/或(b)与这种疾病、紊乱或病症相关的至少一种症状。在一些实施方式中，治疗包括对患有疾病的对象采取的行动过程，其中该行动过程导致对象的疾病被抑制(例如，阻止疾病、紊乱或病症的发展或改善与此相关的一个或多个症状)。
Treg细胞或调节性T细胞。如本文所用的术语“调节性T细胞”或“Treg细胞”是指CD4+T细胞的类型，其能够抑制其他T细胞的反应，包括但不限于效应T细胞(Teff)。Treg细胞特征在于表达CD4、IL-2受体的a亚基(CD25)和转录因子叉头盒P3(FOXP3)(Sakaguchi，Annu Rev Immunol 22，531-62(2004)。“常规CD4+T细胞”意指除调节性T细胞以外的CD4+T细胞。
变体：术语″变体″、″蛋白质变体″或″变体蛋白质″或″变体多肽″在本文中可互换使用，指的是由于至少一个氨基酸修饰、取代或缺失而与亲本多肽不同的多肽。该亲本多肽可以是天然存在的或野生型(WT)多肽，也可以是WT多肽的修饰形式。术语变体多肽可以指多肽本身、包含多肽的组合物或编码其的核酸序列。在一些实施方式中，相较于亲本多肽，变体多肽包括约1至约10个，或约1至约8个、或约1至约7个、或约1至约5个、或约1至约4个、或约1至约3个、或1至2个氨基酸修饰、取代或缺失，或者单一氨基酸氨基酸修饰、取代或缺失。变体可以与其所衍生的亲本多肽有至少约99％的同一性、或至少约98％的同一性、或至少约97％的同一性、或至少约95％的同一性、或至少约90％的同一性。
野生型：“野生型”或“WT”或“天然”在本文中是指在自然界中存在的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变异。WT蛋白，多肽，抗体，免疫球蛋白，IgG等具有未经人工修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
hIL2直向同源物
命名法：
本发明提供hIL2受体多肽变体的多个多肽配体。本文使用以下命名法以表示取代、缺失或插入。在本文中残基可以用野生型分子中发现的天然存在氨基酸的一字母或三字母氨基酸代码指定，但后接成熟hIL2分子的hIL2氨基酸位置，例如“Cys125”或“C125”是指野生型hIL2分子的第125位的半胱氨酸残基。对于hIL2直向同源物，本文指定取代是通过一字母氨基酸代码后接hIL2的氨基酸位置，后接取代的一字母氨基酸代码。本发明的hIL22直向同源物的编号是根据hIL2编号。例如，具有“K35A”修饰的hIL2直向同源物是指野生型hIL2序列的第35位的赖氨酸(K)残基在该位置被丙氨酸(A)残基取代。氨基酸残基的缺失被称为“des”，后接氨基酸残基及其在SEQ ID NO：4中的位置。例如术语“des-Ala1”或“ΔA1”“desA1”是指野生型hIL2序列的多肽的第1位的丙氨酸缺失。类似地，对于正交hCD122中的氨基酸取代，本文指定氨基酸取代是通过天然存在的氨基酸的一字母氨基酸代码，后接其在野生型hIL2序列中的位置编号，后接在该位置的取代的氨基酸的一字母氨基酸代码。对纳入正交受体的hCD122的hCD122修饰是根据hCD122编号的。例如，具有在第134位用苯丙氨酸取代酪氨酸残基的hCD122正交受体，该取代被缩写为“Y134F”。缩写hoRb与hoCD122同义使用，指包含正交hCD122受体的人CD122。类似地，提到“hoRb细胞”(例如hoRb T细胞或hoRbNKL细胞)是指表达正交hCD122受体的细胞。如本文所用术语SQVLKA是指hIL2直向同源物，其包含氨基酸取代：E15S、H16Q、L19V、D20L、Q22K和M23A。
hIL2直向同源物
在一些实施方式中，本发明提供hIL2直向同源物及其使用方法，hIL2直向同源物为包含修饰的hCD122 ECD的正交受体的同源配体。在一些实施方式中，术语hIL2直向同源物是指hIL2变体，其为包含第H133和/或Y134位的氨基酸取代的人正交hCD122的胞外结构域的受体的配体。在一些实施方式中，hIL2直向同源物是指包含第H133和/或Y134位的氨基酸取代的人hCD122的胞外结构域的正交受体的配体。在一些实施方式中，hIL2直向同源物是指包含第H133和/或Y134位的氨基酸取代的人CD122的胞外结构域的跨膜受体的配体，其ICD包含一个或多个STAT3结合基序。在一些实施方式中，hIL2直向同源物是指包含第H133和Y134位的氨基酸取代的正交人CD122的配体。在一些实施方式中，hIL2直向同源物是指包含氨基酸取代H133D和Y134F的正交hCD122的配体。
在多种实施方式中，本发明的组合物和方法包括hIL2直向同源物多肽的用途，所述hIL2直向同源物多肽具有与下式#1的多肽至少80％、或85％、或90％、或95％、或97％、或99％的同一性。
Figure BDA0003780618550000431
其中：
AA1是A(野生型)或缺失；
AA2是P(野生型)或缺失；
AA3是T(野生型)、C、A、G、Q、E、N、D、R、K、P或缺失；
AA4是S(野生型)或缺失；
AA5是S(野生型)或缺失；
AA6是S(野生型)或缺失；
AA7是T(野生型)或缺失；
AA8是K(野生型)或缺失；
AA9是K(野生型)或缺失；
AA13是Q(野生型)、W或缺失；
AA14是L(野生型)、M、W或缺失；
AA15是E(野生型)、K、D、T、A、S、Q、H或缺失；
AA16是H(野生型)、N或Q或缺失；
AA18是L(野生型)或R、L、G、M、F、E、H、W、K、Q、S、V、I、Y、H、D或T；
AA19是L(野生型)、A、V、I或缺失；；
AA20是D(野生型)、T、SML或缺失；；
AA22是Q(野生型)或F、E、G、A、L、M、F、W、K、S、V、I、Y、H、R、N、D、T、F或缺失；
AA23是M(野生型)、A、W、H、Y、F、Q、S、V、L、T或缺失；
AA27是G(野生型)、K、S或缺失；
AA38是R(野生型)、W或G；
AA39是M(野生型)、L或V；
AA42是F(野生型)或K；
AA51是T(野生型)、I或缺失
AA55是H(野生型)或Y；
AA74是Q(野生型)、N、H、S；
AA80是L(野生型)、F或V；
AA81是R(野生型)、I、D、Y、T或缺失
AA85是L(野生型)或V；
AA86是I(野生型)或V；
AA88是N(野生型)、E或Q或缺失；
AA89是I(野生型)或V；
AA91是V(野生型)、R或K；
AA92是I(野生型)或F；
AA97是K(野生型)或Q；
AA104是M(野生型)或A；
AA109是D(野生型)、C或具有激活的侧链的非天然氨基酸；
AA113是T(野生型)或N；
AA125是C(野生型)、A或S；
AA126是Q(野生型)或H、M、K、C、D、E、G、I、R、S或T；
和/或
AA130是S(野生型)、T或R。
根据实施例，如下表2提供的制备前述式1的系列hIL2直向同源物(用序列MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO.421)的附加N-末端信号肽表达的成熟蛋白序列)并评估其相对于NKL细胞的选择性激活NKL细胞的能力，其已被工程改造为表达SEQ ID NO：2的正交CD122，表达包含取代的正交IL2受体的T细胞。
Figure BDA0003780618550000451
Figure BDA0003780618550000461
Figure BDA0003780618550000471
Figure BDA0003780618550000481
Figure BDA0003780618550000491
Figure BDA0003780618550000501
Figure BDA0003780618550000511
Figure BDA0003780618550000521
Figure BDA0003780618550000531
Figure BDA0003780618550000541
Figure BDA0003780618550000551
Figure BDA0003780618550000561
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Figure BDA0003780618550000581
Figure BDA0003780618550000591
Figure BDA0003780618550000601
Figure BDA0003780618550000611
Figure BDA0003780618550000621
Figure BDA0003780618550000631
Figure BDA0003780618550000641
Figure BDA0003780618550000651
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Figure BDA0003780618550000681
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Figure BDA0003780618550000701
Figure BDA0003780618550000711
Figure BDA0003780618550000721
Figure BDA0003780618550000731
前述hIL2直向同源物的活性被评估为其激活NKL和hoRb NKL细胞的能力，基本根据本文在以下稀释中的教导内容。这些实验的结果在附图的图1和2以及下表3中提供：
Figure BDA0003780618550000741
Figure BDA0003780618550000751
Figure BDA0003780618550000761
Figure BDA0003780618550000771
Figure BDA0003780618550000781
Figure BDA0003780618550000791
Figure BDA0003780618550000801
Figure BDA0003780618550000811
Figure BDA0003780618550000821
Figure BDA0003780618550000831
Figure BDA0003780618550000841
Figure BDA0003780618550000851
Figure BDA0003780618550000861
Figure BDA0003780618550000871
评估IL2直向同源物在CD4+人T细胞克隆3F8细胞中的活性，在实施例8中更详细地描述。这些实验所得数据见下表4。
Figure BDA0003780618550000881
Figure BDA0003780618550000891
Figure BDA0003780618550000901
Figure BDA0003780618550000911
Figure BDA0003780618550000921
Figure BDA0003780618550000931
Figure BDA0003780618550000941
Figure BDA0003780618550000951
Figure BDA0003780618550000961
Figure BDA0003780618550000971
Figure BDA0003780618550000981
Figure BDA0003780618550000991
Figure BDA0003780618550001001
Figure BDA0003780618550001011
Figure BDA0003780618550001021
如以上数据所示，相对于不表达正交受体的人T细胞(NKL细胞)，式1的hIL2直向同源物选择性地激活hoCD122人T细胞。
保守氨基酸取代
在一些实施方式中，式1的hIL2直向同源物可以任选地包含一个或多个保守氨基酸取代。这种保守取代包括那些由Dayhoff描述于《蛋白质序列和结构图册5》(The AtlasofProtein Sequence and Structure 5)(1978)，以及由Argos描述于EMBO J.，8：779-785(1989)的。通常根据下表4中示出的进行保守取代：
Figure BDA0003780618550001022
Figure BDA0003780618550001031
通过选择比表4中示出的那些更不保守的氨基酸取代，可以进行功能或免疫学特性中的实质性改变。例如，可以进行更显著地影响多肽骨架结构或破坏二级或三级元件的取代，包括用大电荷的大侧链(天冬酰胺)取代具有小的无电荷侧链的氨基酸(例如甘氨酸)。特别地，那些参与与CD25、CD122和/或CD123的一个或多个相互作用的氨基酸的hIL2残基的取代，其可以从与描述于Wang，等(2005)Science 310：1159-1163的受体相缔合的hIL2晶体结构中看出。如上文提供的对一级结构的修饰可以任选地进一步包括修饰，其包括但不限于取代：N30E；K32E；N33D；P34G；T37I，M39Q，F42Y，F44Y，P47G，T51I，E52K，L53N，Q57E，M104A(参见美国专利号5,206,344)。
Cys125：
在一些实施方式中，本发明提供式1的hIL2直向同源物，其包含在细菌细胞中促进重组表达的修饰，通过C125A或C125S的取代消除第125位的未配对半胱氨酸残基。在一些实施方式中，本发明的hIL2直向同源物包括以下氨基酸修饰组之一：
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125S]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125A]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S]；
[desAlal-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；或
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L]。
增强hCD122亲和力的突变
在一些实施方式中，式1的hIL-2直向同源物在hIL-2序列的位置中包含一个或多个突变，其或接触hCD122或改变接触hCD122的其他位置的取向，调节hIL2直向同源物对于hCD122的结合亲和力。被鉴定为参与hIL2结合至hCD122的hIL-2残基包括L12、Q13、H16、L19、D20、M23、R81、D84、S87、N88、V91、I92和E95。在一些实施方式中，hIL2直向同源物包含一个或多个氨基酸取代：Q74N、Q74H、Q74S、L80F、L80V、R81D、R81T、L85V、I86V、I89V和/或I92F或其组合。在一些实施方式中，hIL2直向同源物包含一个或多个氨基酸取代：L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方式中，hIL2直向同源物包含一个或多个氨基酸取代：N74Q、L80F、R81D、L85V、I86V、I89V和I92F。在一些实施方式中，hIL2直向同源物包含一个或多个氨基酸取代：Q74N、L80V、R81T、L85V、I86V和I92F。在一些实施方式中，hIL2直向同源物包含一个或多个氨基酸取代：Q74H、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方式中，hIL2直向同源物包含一个或多个氨基酸取代：Q74S、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方式中，hIL2直向同源物包含一个或多个氨基酸取代：Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方式中，hIL2直向同源物包含一个或多个氨基酸取代：Q74S、R81T、L85V和I92F。在一些实施方式中，hIL2直向同源物包括突变组
[L80F-R81D-L85V-I86V-I92F]，其已被鉴定为增加hIL2对hCD122的亲和力。在一些实施方式中，本发明提供hIL2直向同源物，其为hIL2多肽，包括以下几组氨基酸修饰之一：
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A L80F-R81D-L85V-I86V-I92F]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126M]；或
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126M]。
在一些实施方式中，式1的hIL-2直向同源物包含被鉴定为增加hIL2对hCD122亲和力的取代L85V。在一些实施方式中，本发明提供hIL2直向同源物，其为hIL2多肽，包括以下几组氨基酸修饰之一：
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V-Q126M]；或
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V-Q126M]。
调节CD25亲和力的修饰
在一些实施方式中，式1的hIL-2直向同源物在调节对hCD25的结合亲和力的hIL-2直向同源物的位置包含一个或多个突变。基于IL2与IL2受体缔合的晶体结构(Wang，等(2005)Science 310：1159)，作为三聚体IL2受体复合物的部分，hIL2的突变区紧邻hCD25。在一些实施方式中，式1的hIL-2直向同源物包含位于选自下组的一个或多个位置的修饰：S4、K8、K9、T10、Q11、Q13、N26、N29、N30、N30、Y31、K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、M46、K48、K49、K54、E61、E62、K64、P65、E67G、E68、V69、N71、L72、Q74 S75、K76、H79、I89、N90、I92、S99、T101、F103、Y107、I114、I128和T133。可以被纳入hIL2直向同源物序列的氨基酸取代的例子包括选自下组的一个或多个取代：S4P、K8R、K9T、T10A、Q11R、Q13R、N26D、N29S、N30S、N30D、N30T、Y31H、Y31C、K35R、T37A、T37R、M46L、K48E、K49R、K49E、K54R、E61D、K64R、E67G、E68D、V69A、N71T、N71A、N71R、A73V、Q74P S75P、K76E、K76R、H79R、I89V、N90H、I92T、S99P、T101A、F103S、I114V、I128T、T133A和T133N。在一些实施方式中，本发明的hIL2直向同源物包含一个或多个点突变：S4P、K8R、K9T、T10A、Q11R、Q13R、N26D、N29S、N30S、N30D、N30T、Y31H、Y31C、K35R、T37A、T37R、M46L、K48E、K49R、K49E、K54R、E61D、K64R、E67G、E68D、V69A、N71T、N71A、N71R、A73V、Q74P、S75P、K76E、K76R、H79R、I89V、N90H、I92T、S99P、T101A、F103S、I114V、I128T、T133A和T133N(Wittrup，等同上)，R38A、F41A和/或F42A(Suave，等(1991)PNAS(USA)88：4636-4640)；P65L(Chen等Cell Death and Disease(2018)9：989)；F42A/G/S/T/Q/E/N/R/K、Y45A/G/S/t/Q/E/N/D/R/K和/或L72G/A/S/T/Q/E/N/D/R/K(Ast，等美国专利申请公开2012/0244112 A1，公开于2012年9月27日；美国专利号9,266,938 B2，授权于2016年2月23日)。
除了点突变，上述修饰的组合可以被用于调节式1的hIL-2直向同源物对CD25的结合。在一些实施方式中，本发明的hIL2直向同源物包含一个或多个以下氨基酸取代组：[R38A-F42A-Y45A-E62A](Carmenate，等(2013)J Immunol 190：6230-6238)；[F42A-Y45A-L72G](Roche RG7461(RO6874281)；[V69A，Q74P]；[V69A，Q74，T101A]；[V69A，Q74P，I128T]；[N30D，V69A，Q74P，F103S]；[K49E，V69A，A73V，K76E]，[V69A，Q74P，T101A，T133N]；[N30S，V69A，Q74P，I128A]；[N30S，V69A，Q74P，I128T]；[K9T，Q11R，K35R，V69A，Q74P]，[A1T，M46L，K49R，E61D，V69A，H79R]；[K48E，E68D，N71T，N90H，F103S，I114V]；[S4P T10A，Q11R，V69A，Q74P，T133A]；[N30S，Y31H，K35R，K48E，V69A，Q74P，I92T]；[N30S，E68D，V69A，N71A，Q74P，S75P，K76R，N90H]；[N30S，Y3 1C，T37A，V69A，A73V，Q74P.H79R，I128T]，[N26D，N29S，N30S，K54R，E67G，V69A，Q74P，I92T]；[K8R，Q13R，N26D，N30T，K35R，T37R，V69A，Q74P，I92T]和[N29S，Y31H，K35R，T37A，K48E，V69A，N71R，Q74P，I39V](Wittrup等，美国专利号7,569,215，授权于2009年8月4日)；和/或[T41P-T51P](Chang，等(1995)Molecular Pharmacology 47：206-211)。在一些实施方式中，本发明提供式1的hIL-2直向同源物，其包含以下几组氨基酸修饰之一：
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-V69A]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-V69A]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q74P]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q74P]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A-Q126M]；或
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A-Q126M]。
调节CD132亲和力的修饰
在本发明的一些实施方式中，本发明的hIL-2直向同源物包含调节对hIL-2直向同源物对CD132的结合的一个或多个突变。示例性hIL-2直向同源物在hIL-2序列的位置中包含一个或多个突变，其或接触CD132或改变接触hCD122的其他位置的取向，导致对CD132的结合改变。鉴定为调节hIL2对CD132的亲和力的hIL-2残基包括Q11、L18(例如L18R)、Q22(例如Q22E)、E110、N119、T123、Q126(例如Q126K/H)、S127、I129、S130和T133。在一些实施方式中，本发明提供hIL2直向同源物，其为hIL2多肽，包括以下几组氨基酸修饰之一：
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22E-M23A]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-M23A]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-M23A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-M23A-Q126K]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126K]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q126K]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126K]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-M23A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-M23A-Q126K]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126K]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L85V-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L85V-Q126H]；或
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V-Q126M]。
去除糖基化位点
本发明的hIL2直向同源物可以还提供或任选地提供Thr3位的O-糖基化位点的消除，以在哺乳动物细胞(例如CHO或HEK细胞)中表达直向同源物时促进非糖基化hIL2直向同源物变体的产生。因此，在某些实施方式中hIL2直向同源物还包含消除IL-2的对应于人IL-2的残基3位置的O-糖基化位点的修饰。在一些实施方式中所述消除IL-2的对应于人IL-2的残基3位置的O-糖基化位点的修饰是氨基酸修饰。示例性的氨基酸取代包括T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K和T3P，其去除位置3处的糖基化位点而没有消除生物学活性(参见美国专利号5,116,943；Weiger等，(1989)Bur.J.Biochem.，180：295-300)。在特定的实施方式中，所述修饰是氨基酸取代T3A。在一些实施方式中，本发明提供hIL2直向同源物，其为hIL2多肽，包括以下几组氨基酸修饰之一：
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125S]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125A]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L]；
[desAlal-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125S]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125A]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L 19V-D20L-Q22K]；或
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L]。
N末端缺失：
IL-2直向同源物可以进一步包含消除在1-9位的一个或多个N-末端氨基酸，或1-8位、或1-7位、或1-6位、或1-5位、或1-4位、或1-3位、或1-2位，同时保留hIL2直向同源物活性。在一些实施方式中，本发明提供hIL2直向同源物，其为hIL2多肽，包括以下几组氨基酸修饰之一：
[desAla1-E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22E-M23A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-M23A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-M23A-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-M23A-Q126K]；
[desAla1-E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126K]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q126K]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126K]；
[desAla1-E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-M23A-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-M23A-Q126K]；
[desAla1-desPro2-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAla1-desPro2-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；
[desAla1-desPro2-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]；
[desAla1-desPro2-E15S-H16Q-L19V-D20L]；
[desAla1-desPro2-desThr3-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAla1-desPro2-desThr3-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；
[desAla1-desPro2-desThr3-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]；
[desAla1-desPro2-desThr3-E15S-H16Q-L19V-D20L]；
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]；
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-E15S-H16Q-L19V-D20L]；
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-desSer5-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-desSer5-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-desSer5-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]；
[desAlal-desPro2-desThr3-desSer4-desSer5-E15S-H16Q-L19V-D20L]；
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-desSer5-desSer6-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-desSer5-desSer6-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-desSer5-desSer6-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]；或
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-desSer5-desSer6-E15S-H16Q-L19V-D20L]。
在一些实施方式中，hIL2直向同源物可以包含头两个氨基酸的缺失(desAla1-desPro2)，以及用半胱氨酸残基取代Thr3糖基化以促进选择性N-末端修饰，特别是半胱氨酸的巯基基团的聚乙二醇化(参见，例如，Katre，等美国专利号5,206,344，授权于1993年4月27日)。在一些实施方式中，本发明提供hIL2直向同源物，其为hIL2多肽，包括以下几组氨基酸修饰之一：
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S]；
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S]；
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125S]；
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S]；
[desAlal-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A]；
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A]；
[desAla1-desPro2-T3C E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125A]；
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A]；
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]；或
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L]。
在一些实施方式中，本发明的hIL2直向同源物包含第1位丙氨酸缺失(“desAla1”)hIL2直向同源物。在一些实施方式中，本发明提供des-Ala1-hIL2直向同源物，包含以下几组氨基酸修饰之一：
[desAlal-E15S-H16Q-L19V-D20L]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q126H]；
[desAlal-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q126M]；
[desAlal-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S-Q126M]；或
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S-Q126M]。
最小化血管渗漏综合征的修饰
在本发明的一些实施方式中，hIL2直向同源物包含避免血管渗漏综合征的氨基酸取代。Epstein，等，美国专利号7,514,073B2，2009年4月7日授权。被纳入本发明的hIL2直向同源物中的这种修饰的例子包括R38W、R38G、R39L、R39V、F42K和/或H55Y中的一个或多个。
氧化稳定化的M104A：
在本发明的一些实施方式中，hIL2直向同源物可以包含第M104位的修饰。在一个实施方式中用丙氨酸残基取代甲硫氨酸104(M104A)以提供更抗氧化的直向同源物(参见Koths，等，美国专利4,752,585，1988年6月21日授权)。
亲和力成熟：
在一些实施方式中，本发明的hIL2直向同源物可经亲和成熟以增强其对正交hCD122的活性。“亲和成熟的”多肽是在一个或多个残基上具有一个或多个改变的多肽，与不拥有这些一个或多个改变的亲本多肽相比，这导致正交多肽对同源正交受体的亲和力改进，或反之亦然。与“亲本”多肽相比，可进行亲和成熟增加hIL2直向同源物的结合亲和力至少约10％、或至少约50％、或至少约100％、或至少约150％、或1-5倍。在合适的试验条件下使用足够量的分子通过ELISA和/或FACS分析评估时，本发明的工程改造的hIL2直向同源物激活其同源正交受体，如上所述，但显著减少对天然受体的结合和激活。
延长体内作用时间的修饰
在一些实施方式中，本发明的hIL-2直向同源物可以包含修饰，以提供用于延长体内寿命和/或延长在对象中的作用时间。在一些实施方式中，本发明的hIL-2直向同源物在人对象体内的血浆半衰期大于4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、或30天。通过一级序列修饰和/或偶联至运载体分子实现这种延长寿命的hIL2直向同源物。
延长作用时间的一级序列修饰
本发明的hIL-2直向同源物可以包含导致延长体内寿命的氨基酸取代。可以被纳入hIL-2直向同源物以提供延长体内持续时间的氨基酸取代所在位置的例子包括V111、R117和/或T133的一个或多个。在一些实施方式中，本发明的hIL2直向同源物包含V111R、R117K和/或T133N修饰的一个或多个。Dakshinamurthi，等(2009)International Journalof Bioinformatics Research 1(2)：4-13。
运载体分子
在一些实施方式中hIL2直向同源物被修饰，以在对象中提供延长的作用时间，这可以通过偶联至运载体分子以提供所需的药理学特性(例如延长的半衰期)来实现。在一个实施方式中，hIL2直向同源物可以包含嵌合多肽的功能结构域。在一些实施方式中，hIL2直向同源物可以共价地连接至IgG的Fc结构域、白蛋白或其他分子以延长其半衰期，例如，通过本领域已知的聚乙二醇化、糖基化等。
Fc融合体
在一些实施方式中，本发明的hIL2直向同源物可操作地连接至Fc-融合体嵌合多肽分子的功能结构域。Fc融合体偶联物已被证明可以增加生物药物的全身半衰期，因此，生物药物产品可以不需要频繁给药。Fc结合至衬垫在血管的内皮细胞中的新生Fc受体(FcRn)，结合后，Fc融合分子被保护，不被降解并重新释放到循环中，使分子在循环中保持更长的时间。这种Fc结合被认为是内源性IgG保持其长血浆半衰期的机制。最近的Fc融合体技术将一份生物药物的单拷贝连接至抗体的Fc区，与传统的Fc融合体偶联物相比，优化了生物药物的药代动力学和药效动力学特性。用于制备Fc融合体的″Fc区″可以是天然存在或合成的多肽，其与用木瓜蛋白酶消化IgG产生的IgG C-末端结构域同源。IgG Fc的分子量约为50kDa。hIL2直向同源物可以提供整个Fc区，或保留延长其作为一部分的嵌合多肽的循环半衰期能力的较小部分。此外，全长或片段的Fc区可以是野生型分子的变体。在一个典型的呈现中，二聚体Fc的每个单体携带异源多肽，异源多肽是相同或不同的。
在一些实施方式中，当hIL2直向同源物要以Fc融合体的形式给予时，特别是在那些偶联至Fc二聚体的各个亚单位的多肽链不同的情况下，Fc融合体可以被工程改造为具有“杵臼(knob-into-hole)修饰”。杵臼修饰更全面地描述于Ridgway，等(1996)《蛋白质工程改造》(Protein Engineering)9(7)：617-621和1998年3月24日授权的美国专利号5,731,168。杵臼修饰是指在CH3结构域中两个免疫球蛋白重链之间界面的修饰，其中：i)在第一条重链的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链的氨基酸残基(例如，酪氨酸或色氨酸)替代，从表面产生突起(“杵”)和ii)在第二条重链的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链的氨基酸残基(如丙氨酸或苏氨酸)替代，从而在第二CH3结构域的界面内产生空腔(“臼”)，其中第一CH3结构域的突出侧链(“杵”)被第二CH3结构域中的空腔接收。在一个实施方式中，“杵臼修饰”包括抗体重链之一中的氨基酸取代T366W和任选地氨基酸取代S354C，和另一个抗体重链中的氨基酸取代T366S、L368A、Y407V和任选地Y349C。此外，Fc结构域可以通过在S354和Y349位置引入半胱氨酸残基进行修饰，从而在Fe区的两个抗体重链之间产生稳定的二硫键(Carter，等(2001)Immunol Methods 248，7-15)。杵臼形式用于促进在具有“杵”修饰的第一Fc单体上第一多肽(如hIL2直向同源物)的表达和在具有“臼”修饰的第二Fc单体上的第二多肽的表达，以促进异二聚体多肽偶联物的表达。
Fc区可以是″溶解性″或″非溶解性″的，但通常是非溶解性的。非溶解性Fc区通常缺乏高亲和力Fc受体结合位点和Clq结合位点。鼠IgG Fc的高亲和力Fc受体结合位点包括IgG Fc第235位的Leu残基。因此，Fc受体结合位点可以通过突变或缺失Leu 235而被抑制。例如，用Glu取代Leu 235抑制Fc区结合至高亲和力Fc受体的能力。通过突变或缺失IgG的Glu 318、Lys320和Lys 322残基，可以在功能上破坏鼠Clq结合位点。例如，用Ala残基取代Glu 318、Lys 320和Lys 322，使IgG1 Fc不能引导抗体依赖性补体裂解。与此相反，溶解性IgG Fc区具有高亲和力Fc受体结合位点和Clq结合位点。高亲和力的Fc受体结合位点包括IgG Fc的235位Leu残基，而Clq结合位点包括IgG 1的Glu 318、Lys 320和Lys 322残基。溶解性IgG Fc在这些位点具有野生型残基或保守的氨基酸取代。溶解性IgG Fc可以针对细胞进行抗体依赖性细胞毒性或补体定向细胞溶解(CDC)。人IgG的适当突变也是已知的(参见，例如，Morrison等，The Immunologist 2：119-124，1994；和Brekke等，The Immunologist2：125，1994)。在一些实施方式中，Fc结构域单体包括相对于野生型人IgG1、IgG2或IgG4 Fc区域的至少一个突变，如美国专利号US10,259,859 B2所述，其全部教导通过引用纳入本文。在一些实施方式中，与具有野生型人IgG Fc区的多肽相比，该多肽在吞噬试验中表现出吞噬作用的降低。在一些实施方式中，Fc结构域单体连接至包含第二Fc结构域单体的第二多肽，形成Fc结构域二聚体。
PEG化：
在一些实施方式中，本发明的hIL2直向同源物可以被偶联至一个或多个水溶性聚合物。在本发明实践中有用的水溶性聚合物的例子包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、多糖(聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚烯烃醇(polyolefinic alcohol))、多糖)、聚-α-羟基酸、聚乙烯醇(PVA)、聚磷腈、聚噁唑啉(polyoxazoline)(POZ)、聚(N-丙烯酰吗啉)，或其组合。
在一些实施方式中，hIL2直向同源物可操作地连接至一个或多个聚乙二醇分子或“PEG化”。尽管PEG附接至hIL2直向同源物的方法或位点可能不同，在某些实施方式中PEG化不改变或仅在最小程度上改变hIL2直向同源物的活性。
在一些实施方式中，hIL2直向同源物的选择性PEG化(例如通过纳入具有侧链的非天然氨基酸以促进选择性PEG偶联化学反应，如描述于Ptacin，等(2018年8月3日提交的PCT国际申请号PCT/US2018/045257，并于2019年2月7日作为国际公开号WO 2019/028419A1公开)可用于产生对hIL2受体复合物的一个或多个亚基(如CD25、CD132)的亲和力降低的hIL2直向同源物。例如，其中在hIL2的经鉴定为与CD25相互作用的那些序列或残基(包括氨基酸34-45、61-72和105-109)处纳入具有可PEG化的特定部分的非天然氨基酸的hIL2直向同源物提供具有调节的CD25结合的hIL2直向同源物。相似地，其中在hIL2的经鉴定为与hCD132相互作用的那些序列或残基(包括但不限于氨基酸18、22、109、126和/或133)处纳入具有可PEG化的特定部分的非天然氨基酸的hIL2直向同源物提供具有调节的hCD132结合亲和力的hIL2直向同源物。
在某些实施方式中，半衰期的增加大于生物学活性的任何减少。适合偶联至多肽序列的PEG通常在室温溶于水，并且具有通式R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R是氢或保护基团，例如烷基或烷醇基，其中n是1-1000的整数。当R是保护基团时，其通常具有1-8个碳。偶联至多肽序列的PEG可以是直链的或支链的。本发明考虑了支化PEG衍生物，“星形-PEG(star-PEG)”和多臂PEG。
在本发明的hIL2直向同源物的上下文中使用的PEG的分子量不限于任何特定范围。PEG-IL2直向同源物的PEG组分可以具有大于约5kDa、大于约10kDa、大于约15kDa、大于约20kDa、大于约30kDa、大于约40kDa、或大于约50kDa的分子量。在一些实施方式中，分子量为约5kDa至约10kDa，约5kDa至约15kDa，约5kDa至约20kDa，约10kDa至约15kDa，约10kDa至约20kDa，约10kDa至约25kDa或约10kDa至约30kDa。直链或支链PEG分子的分子量从约2,000至约80,000道尔顿，或者约2,000至约70,000道尔顿，或者约5,000至约50,000道尔顿，或者约10,000至约50,000道尔顿，或者约20,000至约50,000道尔顿，或者约30,000至约50,000道尔顿，或者约20,000至约40,000道尔顿，或者约30,000至约40,000道尔顿。在本发明的一个实施方式中，PEG为包含两个20kD臂的40kD支链PEG。
本公开还考虑了偶联物的组合物，其中PEG具有不同的n值，因此在特定的比率下存在多种不同的PEG。例如，一些组合物包含偶联物的混合物，其中n＝1、2、3和4。在一些组合物中，n＝1的偶联物的百分比为18-25％，n＝2的偶联物的百分比为50-66％，n＝3的偶联物的百分比为12-16％，n＝4的偶联物的百分比多达5％。这种组合物可以通过本领域已知的反应条件和纯化方法生产。层析可用于分辨偶联物的馏分，然后鉴定包含具有例如附接所需数量的PEG的偶联物的馏分，从未修饰的蛋白质序列和具有附接其他数量PEG的偶联物中纯化出来。
适合偶联至IL2直向偶联物的PEG通常在室温溶于水，并且具有通式R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R是氢或保护基团，例如烷基或烷醇基，其中n是1-1000的整数。当R是保护基团时，其通常具有1-8个碳。
两种广泛使用的第一代激活的单甲氧基PEG(mPEG)是琥珀酰亚胺基碳酸酯PEG(SC-PEG；参见，例如，Zalipsky，等(1992)Biotehnol.Appl.Biochem15：100-114)和苯并三唑甲酯PEG(BTC-PEG；参见，例如Dolence，等美国专利号5,650,234)，其优选与赖氨酸残基反应以形成氨基甲酸酯连接，但也已知与组氨酸和酪氨酸残基反应。使用PEG-醛接头通过还原性胺化靶向多肽的N-末端单个位点。
聚乙二醇化可以发生在多肽N-末端的α-氨基基团，赖氨酸残基侧链上的ε氨基基团和组氨酸残基侧链上的咪唑基团。由于大多数重组多肽具有单个α基团和若干ε基团和咪唑基团，根据接头的化学性质，可以产生许多位置异构体。本领域中已知的一般聚乙二醇化策略可本文中应用。
PEG可以通过末端反应性基团(“间隔子″)结合至本发明的hIL2直向同源物，该基团在一个或多个多肽序列的游离氨基或羧基与聚乙二醇之间介导结合。具有可结合至游离氨基基团的间隔子的PEG包括N-羟基琥珀酰亚胺聚乙二醇，它可以通过用N-羟基琥珀酰亚胺激活聚乙二醇的琥珀酸酯来制备。
在一些实施方式中，通过纳入带有独特侧链的非天然氨基酸以促进特定位点的PEG化来促进hIL2直向同源物的PEG化。将非天然氨基酸纳入多肽以提供功能部分以实现此类多肽的位点特异性聚乙二醇化是本领域中已知的。参见，例如Ptacin，等，(PCT国际申请号PCT/US2018/045257，2018年8月3日提交并公开于2019年2月7日，国际公开号WO 2019/028419A1。在一个实施方式中，本发明的hIL2直向同源物在hIL2直向同源物的D109位纳入非天然氨基酸。在本发明的一个实施方式中，hIL2直向同源物是hIL2直向同源物的109位PEG化的，PEG分子分子量约为20kD，或约30kD，或约40kD。
偶联至多肽序列的PEG可以是直链的或支链的。本发明考虑了支化PEG衍生物，“星形-PEG(star-PEG)”和多臂PEG。本发明的实践中有用的具体实施方式PEG包括10kDa直链PEG-醛(例如，
Figure BDA0003780618550001201
ME-100AL、NOF美国公司(NOF America Corporation)，北百老汇(One North Broadway)，纽约州白原市(White Plains，NY)10601USA)、10kDa直链PEG-NHS酯(例如，
Figure BDA0003780618550001202
ME-100CS，
Figure BDA0003780618550001203
ME-100AS，
Figure BDA0003780618550001204
ME-100GS，
Figure BDA0003780618550001205
ME-100HS，NOF)、20kDa直链PEG-醛(例如
Figure BDA0003780618550001206
ME-200AL，NOF、20kDa直链PEG-NHS酯(例如，
Figure BDA0003780618550001207
ME-200CS，
Figure BDA0003780618550001208
ME-200AS，
Figure BDA0003780618550001211
ME-200GS，
Figure BDA0003780618550001212
ME-200HS，NOF)、20kDa 2-臂支链PEG-醛，该20kDA PEG-醛，其包含两个10kDA直链PEG分子(例如，
Figure BDA0003780618550001213
GL2-200AL3，NOF)、20kDa 2-臂支链PEG-NHS酯，该20kDAPEG-NHS酯，其包含两个10kDA直链PEG分子(例如，
Figure BDA0003780618550001214
GL2-200TS，
Figure BDA0003780618550001215
GL200GS2，NOF)、40kDa 2-臂支链PEG-醛，该40kDA PEG-醛，其包含两个20kDA直链PEG分子(例如，
Figure BDA0003780618550001216
GL2-400AL3)、40kDa 2-臂支链PEG-NHS酯，该40kDA PEG-NHS酯，其包含两个20kDA直链PEG分子(例如，
Figure BDA0003780618550001217
GL2-400AL3，
Figure BDA0003780618550001218
GL2-400GS2，NOF)、直链30kDa PEG-醛(例如，
Figure BDA0003780618550001219
ME-300AL)和直链30kDa PEG-NHS酯。
在一个实施方式中，本发明的hIL2直向同源物包括结构：
[PEG]-[接头]n-[hoIL2]
其中n＝0或1。
在实施方式中，本发明的hIL2直向同源物包括结构：
[PEG]-[接头]n-[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]
其中n＝0或1。
在一个实施方式中，本发明的hIL2直向同源物包括结构：
[40kDa-PEG]-[接头]n-[hoIL2]，
其中n＝0或1。
在实施方式中，本发明的hIL2直向同源物包括结构：
[40kDa-PEG]-[接头]n-[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]
其中n＝0或1。
在一个实施方式中，本发明的hIL2直向同源物包括结构：
[40kDa-支链PEG]-[接头]n-[hoIL2]，
其中n＝0或1。
在实施方式中，本发明的hIL2直向同源物包括结构：
[40KD-支链PEG]-[接头]n-[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]，
其中n＝0或1。
在另一个实施方式中，hIL2直向同源物包括结构：
Figure BDA0003780618550001221
其中n＝0或1。
在另一个实施方式中，hIL2直向同源物包括结构：
Figure BDA0003780618550001222
其中n＝0或1。
合适的接头包括“柔性接头”，其长度通常足以允许修饰的多肽序列与连接的组分和分子之间有一些移动。接头分子通常约6-50个原子长。接头也可以是，例如，芳基乙炔、含有2-10个单体单元的乙二醇寡聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。合适的接头可以容易地选择，可以是任何合适的长度，例如1个氨基酸(如甘氨酸)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50或超过50个氨基酸。
柔性接头的例子包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如GmSo)n、(GSGG)n、(GmSoGm)n、(GmSoGmSoGm)n、(GSGGSm)n、(GSGSmG)n和(GGGGSm)n及其组合，其中m、n和o各自独立地选自至少1至10的整数，例如1-18、2-16、3-14、4-12、5-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)或其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此可用作组分之间的中性系链(neutraltether)，包括但不限于GGGSG(SEQ ID NO：139)、GGSGG(SEQ ID NO：140)、GSGSG(SEQ IDNO：141)、GSGGG(SEQ ID NO：142)、GGGGSG(SEQ ID NO：143)。柔性接头的其他例子包括甘氨酸聚合物(G)n或甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如GS)n、GSGGS)n、GGGS)n和GGGGS)n其中n＝1-50，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50G接头。示例性的柔性接头包括但不限于GGGGS(SEQ ID NO：144)、GGGGS(SEQ ID NO：145)、GGSG(SEQ ID NO：146)、GGSGG(SEQID NO：147)、GSGSG(SEQ ID NO：148)、GSGGG(SEQ ID NO：149)、GGGGSG(SEQ ID NO：150)和GSSSG(SEQ ID NO：151)。这些接头序列的多聚体(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30或30-50)可以连接在一起，以提供柔性接头，可用于将异源(therlogous)氨基酸序列偶联至本文公开的多肽或PEG分子。另选多肽接头，所述接头可以是化学接头。例如，PEG-醛接头。
乙酰化的：
在一些实施方式中，IL-2直向同源物在N-末端通过与N-末端乙酰转移酶和，例如，乙酰CoA的酶促反应被乙酰化。替代或除了N-末端乙酰化之外，IL-2直向同源物可以在一个或多个赖氨酸残基处乙酰化，例如通过与赖氨酸乙酰转移酶的酶促反应。参见，例如，Choudhary等(2009)Science 325(5942)：834-840。
Flag标签
在一些实施方式中，IL-2直向同源物被修饰为包含功能为抗原标签的其他多肽序列，例如FLAG序列。如本文所述，FLAG序列可被生物素化、高特异性的抗-FLAG抗体识别(参见例如，Blanar等(1992)Science256：1014和LeClair，等(1992)PNAS-USA 89：8145)。在一些实施方式中，IL-2直向同源物多肽进一步包括C-末端的c-myc表位标签。
白蛋白融合体：
在一些实施方式中，IL-2直向同源物被偶联至白蛋白，在本文中称为“IL2直向同源物白蛋白融合体”。在hIL2直向同源物白蛋白融合体的上下文中使用术语“白蛋白”时，包含白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)、食蟹猴血清白蛋白(cyno serum albumin)和牛血清白蛋白(BSA)。在一些实施方式中，相对于野生型HSA序列，该HSA包含C34S或K573P氨基酸取代。根据本发明，白蛋白可以被偶联至hIL2直向同源物，在羧基末端、氨基末端、羧基及氨基末端和内部(参见，例如，USP 5,876,969和USP 7,056,701)。在本公开所预期的HSA-hIL2直向同源物多肽偶联物中，可以使用多种形式的白蛋白，例如白蛋白分泌前序列(albuminsecretion pre-sequence)及其变体、其片段和变体和HSA变体。这种形式通常具有一种或多种所需的白蛋白活性。在其他实施方式中，本发明涉及包含hIL2直向同源物多肽直接或间接融合至白蛋白、白蛋白片段和白蛋白变体等的融合蛋白，其中融合蛋白比未融合的药物分子具有更高的血浆稳定性和/或融合蛋白保留了未融合药物分子的治疗活性。在一些实施方式中，直接融合是通过接头实现的，例如肽接头或其修饰的版本，如下文更充分地讨论的。
或者，hIL2直向同源物白蛋白融合体包含hIL2直向同源物，其为包含白蛋白结合结构域(ABD)多肽序列和hIL2直向同源物多肽的融合蛋白。如上所述，包含白蛋白结合结构域(ABD)多肽序列和hIL2直向同源物多肽的融合蛋白能够，例如，通过遗传操作实现，使得编码HSA的核酸或其片段被接合至编码一种或多种hIL2直向同源物序列的核酸。在一些实施方式中，白蛋白结合肽包括氨基酸序列：DICLPRWGCLW(SEQ ID NO：152)。
His标签
在一些实施方式中，本发明的hIL2直向同源物(包括这种IL-2直向同源物的融合蛋白)被表达为具有一个或多个过渡金属螯合多肽序列的融合蛋白。纳入这种过渡金属螯合结构域促进纯化固定化金属亲和层析(IMAC)，如Smith等1986年2月11日授权的美国专利第4,569,794号所述。在本发明的实践中有用的过渡金属螯合多肽的例子描述于Smith等(同上)以及Dobeli等的1995年5月10日授权的美国专利第5,320,663号，其中的全部教导通过引用纳入此处。特别的在本发明的实践中有用的过渡金属螯合多肽是包含3-6个连续的组氨酸残基的肽，例如6-组氨酸肽(His)6，在本领域经常被称为“His-标签”。
上述融合蛋白可以通过本领域已知的技术通过重组DNA方法容易地生产，通过构建重组载体，该载体包含核酸序列，该核酸序列包括与编码hIL2直向同源物的N-末端或C-末端融合伴侣的核酸序列同框的编码hIL2直向同源物的核酸序列，该序列可任选地进一步包括在框内的编码接头或间隔子多肽的核酸序列。
靶向的hIL2直向同源物分子
在一些实施方式中，hIL2直向同源物被提供为具有多肽序列(“靶向结构域”)的融合蛋白，以促进选择性地结合到特定的表达特异性结合至这种靶向域的细胞表面分子的细胞类型或组织，任选地在hIL2直向同源物和融合蛋白的靶向结构域序列之间纳入接头分子。在一个实施方式中，hIL2直向同源物融合蛋白的靶向区域特异性结合至被表达正交hCD122的CAR-T细胞靶向的细胞类型的细胞表面分子。例如，在正交hCD122 CAR-T细胞包含具有特异性结合至CD-19的ECD的CAR的情况下，hIL2直向同源物融合蛋白的靶向结构域也可以结合至CD-19。靶向结构域的表达可以包括细胞表面受体的配体或特异性结合分子抗体。在一个实施方式中，hIL2直向同源物融合蛋白包括特异性结合至被靶向的与表达正交配体(例如hoRb CAR-T细胞)的工程改造细胞相同细胞类型。在一个实施方式中，其中hoRbCAR-T细胞的CAR的ECD特异性地结合至CD-19，IL-2直向同源物可以作为具有CD-19靶向部分的融合蛋白提供。例如，在一个实施方式中，其中hoRb CAR-T细胞的CAR的ECD是提供特异性结合至CD-19的scFv分子，IL-2直向同源物作为与CD-19靶向部分(例如特异性结合至CD-19的单链抗体(例如scFv或VHH))的融合蛋白提供。在一个实施方式中，融合蛋白包括IL-10直向同源物和抗-CD19 scFv FMC63(Nicholson，等(1997)Mol Immunol 34：1157-1165)。类似地，在一些实施方式中，其中hoRb CAR-T细胞的CAR的ECD特异性结合至BCMA，IL-2直向同源物作为与BCMA靶向部分的融合蛋白提供，所述靶向部分例如包含Kalled等(美国专利9,034,324，2015年5月9日授权)所述的抗BMCA抗体的CDR的抗体或包含Brogdon等(美国专利号10,174,095，2019年1月8日授权)所述的CDR的抗体。在一些实施方式中，其中hoRb CAR-T细胞的CAR的ECD特异性结合至GD2，IL-2直向同源物作为与GD2靶向部分的融合蛋白提供，所述靶向部分例如包含Cheung等(美国专利号9,315,585，2016年4月19日授权)所述CDR，或来自ME36.1(Thurin等，(1987)Cancer Research 47：1229-1233)、14G2a、3F8(Cheung等，1985Cancer Research 45：2642-2649)、hu14.18、8B6、2E12或ic9的CDR的抗体。
在一些实施方式中，hIL2直向同源物融合体蛋白的靶向部分是与表达正交hCD122的CAR-T细胞提供的相同的或其不同的，特别是其被引导到被CAR靶向的肿瘤细胞类型上表达的替代抗原。例如，在正交hCD122scfv 14G2a GD2靶向CAR-T细胞的情况中，hIL2直向同源物可以在包含另一个GD2肿瘤抗原的特异性结合结构域的靶向融合体构建体中提供。
在替代性实施方式中，本发明的靶向hIL2直向同源物可与CAR-T细胞疗法组合给予，以提供基于CAR-T细胞的胞外受体的hIL2直向同源物至CAR-T细胞的靶向递送，例如通过和抗-FMC63抗体，以将hIL2活性靶向CAR-T细胞，并再生体内耗尽的CAR-T细胞。因此，本公开的实施方式包括通过将这种hIL2直向同源物偶联至设计为与CAR-T细胞的特定细胞表面分子相互作用的抗体或配体来靶向递送hIL2直向同源物。这种分子的例子可以是抗-FMC63-hIL2直向同源物。
在其他实施方式中，嵌合多肽包括突变IL-2多肽和异源多肽，其功能为增强突变IL-2多肽的表达或指导细胞定位，例如Aga2p凝集素亚基(参见，例如，Boder和Wittmp，Nature Biotechnol.15：553-7，1997)。
蛋白转导结构域融合蛋白：
在一些实施方式中，hIL2直向同源物可以任选地包括“蛋白转导结构域”或“PTD”。PTD是多肽、多核苷酸、碳水化合物、或有机或无机分子，其有利于穿越脂质双分子层、胶束、细胞膜、细胞器膜或囊泡膜。PTD纳入hIL2直向同源物有利于分子穿越膜。在一些实施方式中，PTD共价连接至hIL2直向同源物的氨基或羧基末端。在一些实施方式中，PTD作为PTD-IL2直向同源物融合蛋白的部分，纳入分子的N末端或C末端。
示例性的蛋白转导结构包括但不限于最小的十肽蛋白转导结构域(对应于HIV-1TAT的残基47-57)；聚精氨酸序列，其包括足以指导进入细胞的精氨酸残基数量(例如，3、4、5、6、7、8、9、10或10-50个精氨酸)；VP22结构域(Zender等(2002)Cancer Gene Ther.9(6)：489-96)；果蝇触角足突变Drosophila Antennapedia)蛋白转导结构域(Noguchi等(2003)Diabetes52(7)：1732-1737)；截短的人降血钙素肽(Trehin等(2004)Pharm.Research21：1248-1256)；聚赖氨酸(Wender等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：13003-13008)、转运蛋白(如描述于Wierzbicki，等，(2014)Folio Histomchemica etCytobiologica 52(4)：270-280和Pooga，等(1998)FASEB J12(1)67-77且可以商购自AnaSpec，目录号AS-61256)；KALA(如描述于Wyman等，(1997)Biochemistry 36(10)3008-3017且可商购自AnaSpec，目录号AS-65459)；触角足突变肽(如描述于Pietersz等，(2001)Vaccine19：1397且可商购自AnaSpec，目录号AS-61032)；TAT 47-57(可商购自AnaSpec，目录号AS-60023)。
hIL2直向同源物的制备
hIL2直向同源物可以通过任何常规方法生产，包括重组或固相合成。
固相化学合成：
除了通过已经通过重组分子生物技术改变的核酸分子的表达产生突变多肽之外，主体hIL2直向同源物可以化学合成。化学合成多肽可以由本领域技术人员常规地生产。化学合成包括通过化学方式进行的编码表现出所述特性的hIL2直向同源物的蛋白质序列的肽的直接合成。
在一些实施方式中，本发明的hIL2直向同源物可以通过化学合成制备。hIL2直向同源物的化学合成可以通过液相或固相进行。固相肽合成(SPPS)允许纳入非天然氨基酸和/或肽/蛋白质骨架修饰。可用于合成本发明的hIL2直向同源物的SPPS的多种形式是本领域已知的(例如，Ganesan A.(2006)MiniRev.Med.Chem.6：3-10；和Camarero等，(2005)Protein Pept Lett.12：723-8)。在化学合成的过程中，α官能团和任何反应性侧链可以用酸不稳定或碱不稳定基团保护，其在进行连接酰胺键的条件下是稳定的，但在不损害已形成的肽链的情况下容易被裂解。
在固相合成中，N-末端或C-末端氨基酸可以被偶联至合适的支持材料。合适的支持材料是那些对合成过程中逐步缩合和裂解反应的试剂盒反应条件惰性的材料，并且不溶解于正在使用的反应介质。市售可得的支持材料的例子包括用活性基团和/或聚乙二醇修饰的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；氯甲基化的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；羟甲基化或氨基甲基化的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物等。被保护氨基酸的连续偶联可以根据肽合成中的常规方法进行，通常在自动肽合成仪中进行。
在固相合成结束时，从支持材料上将肽裂解下来，同时裂解侧链保护基团。所获得的肽可以通过多种层析方法纯化，包括但不限于疏水吸附层析、离子交换层析、分配层析、高压液相色谱和反相HPLC。
重组生产：
在一些实施方式中，hIL2直向同源物(或包含hIL2直向同源物的融合蛋白)通过重组方法生产。编码所需的hIL2直向同源物多肽的核酸序列(任选地包含分泌前导序列或信号肽)被引入表达载体进入待工程改造的细胞，核酸序列被可操作地连接至一个或多个表达控制序列，由载体编码并在目标宿主细胞中发挥功能。如果在多肽中纳入分泌前导序列(信号肽)，重组hIL2直向同源物可以通过破坏宿主细胞或从细胞介质中回收。重组hIL2直向同源物可以被纯化和浓缩用于进一步用途，包括纳入。hIL2多肽的重组生产的过程是本领域已知的，描述于Fernandes和Taforo，美国专利号4,604,377，1986年8月5日授权，以及hIL2直向同源物描述于Mark等美国专利号4,512,584，1985年5月21日授权，Gillis，美国专利号4,401,756，1983年8月30日授权，其全部教导通过引用纳入本文。
编码hIL2直向同源物的DNA可以按照工程改造过程中的设计从多种来源获得。如本文所述，通过在编码序列中引入适当的核苷酸变化，来制备产生本发明的hIL2直向同源物的hIL2多肽的氨基酸序列变体。这种变体表示所指出的残基的插入、取代和/或特异性缺失。插入、取代和/或特异性缺失的任何组合都可以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有本文定义的所需生物活性。
编码hIL2直向同源物的核酸序列的构建
在一些实施方式中，hIL2直向同源物通过重组方法生产，使用编码hIL2直向同源物(或包含hIL2直向同源物的融合蛋白)的核酸序列。编码所需hIL2直向同源物的核酸序列可以使用寡核苷酸合成仪通过化学方式合成。
核酸序列不限于编码多肽的序列；也可以包括位于编码序列(例如，hIL2的编码序列)的上游或下游的部分或全部非编码序列。分子生物学的本领域技术人员熟知用于分离核酸分子的常规操作。例如，他们可以用限制性核酸内切酶处理基因组DNA或通过进行聚合酶链式反应(PCR)产生。如果核酸分子是核糖核酸(RNA)，分子可以，例如，通过体外转录产生。
编码hIL2直向同源物的核酸分子(及其融合体)可以包含天然存在的序列或不同于天然存在序列的序列，但由于遗传密码的简并性，其编码相同的多肽。这些核酸分子可以由以下组成：RNA或DNA(例如基因组DNA、cDNA或合成DNA，例如通过基于亚磷酰胺的合成(phosphoramidite-based synthesis)产生的)或这些类型核酸内核苷酸的组合或修饰。此外，核酸分子可以是双链的或单链的(即正义链或反义链)。
编码hIL2直向同源物的核酸序列可以获取自提供定制核酸序列的多种商业来源。生产本发明的hIL2直向同源物的hIL多肽的氨基酸序列变体是基于本领域众所周知的遗传密码将合适的核苷酸变化纳入编码序列来制备的。这种变体表示所指出的残基的插入、取代和/或特异性缺失。插入、取代和/或特异性缺失的任何组合都可以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有本文定义的所需生物活性。
构建编码hIL2直向同源物的DNA序列和在合适的转化的宿主中表达这些序列的方法包括但不限于使用PCR-辅助诱变技术。也可以用标准重组技术向hIL2多肽中制造由氨基酸残基缺失或添加组成的突变。如果缺失或添加，编码hIL2的核酸分子任选地用合适的限制性核酸内切酶消化。所得片段可以直接表达，或通过，例如，连接至第二片段来进一步操作。如果核酸分子的两个末端包含相互重叠的互补核苷酸，则可以促进连接，但也可以连接平末端片段。PCR产生的核酸也可以用于产生多种突变序列。
本发明的hIL2直向同源物不仅可以直接重组生产，而且可以与异源多肽(例如信号序列或其他在成熟hIL2直向同源物的N-末端或C-末端具有特定裂解位点的多肽)的融合多肽形式生产。通常，信号序列可以是载体的组分，也可以是插入到载体中的编码序列的部分。所选择的异源信号序列优选是被宿主细胞识别和处理(即被信号肽酶裂解)的序列。在一些实施方式中，信号序列是与hIL2直向同源物天然相关联的信号序列(即人IL2信号序列)。信号序列的包含取决于其是否需要从制备的重组细胞分泌hIL2直向同源物。如果所选细胞是原核细胞，通常优选DNA序列不编码信号序列。如果所选细胞是真核细胞，通常优选编码信号序列，最优选使用野生型IL2信号序列。或者，异源哺乳动物信号序列也是合适的，例如来自相同或相关物种的分泌多肽的信号序列，以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。当重组宿主细胞是酵母细胞，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)时，可以使用α交配因子分泌信号序列(alpha mating factor secretion signal sequence)以实现IL2直向同源物的胞外分泌，进入培养基，如描述于Singh，美国专利号7,198,919 B1，2007年4月3日授权。
密码子优化：
在一些实施方式中，编码重组蛋白(IL2直向同源物、正交hCD122或CAR)的核酸序列可以是“密码子优化”的以促进在特定宿主细胞类型中的表达。在多种表达系统，包括哺乳动物、酵母和细菌宿主细胞中密码子优化的技术是本领域众所周知的，且有在线工具以提供用于在多种宿主细胞类型中表达的密码子优化的序列。参见例如，Hawash，等(2017)9：46-53和Mauro和Chappell在《哺乳动物细胞中重组蛋白表达：方法和方案》(Recombinant Protein Expression in Mammalian Cells：Methods and Protocols)，David Hacker编(胡马纳出版社(Human Press)纽约)。此外，有多种基于网络的在线软件可以免费使用，以协助制备密码子优化的核酸序列。
表达载体：
组装(通过合成、定点诱变或另一方式)后，编码hIL2直向同源物的核酸序列被插入表达载体。可以使用用于多种宿主细胞中的多种表达载体，通常是基于用于表达的宿主细胞选择。载体组分通常包括但不限于以下一个或多个：复制起点，一个或多个标志物基因，增强子元件、启动子和转录终止序列。载体包括病毒载体、质粒载体、整合载体等。质粒是非病毒载体的例子。为了促进目标细胞的转染，可以在有利于摄取非病毒载体的条件下使目标细胞直接暴露于非病毒载体。促进哺乳动物细胞摄取外源核酸的条件的例子在本领域是众所周知的，包括但不限于化学手段(例如
Figure BDA0003780618550001321
赛默飞世尔科技(Thermo-Fisher Scientific))，高盐和磁场(电穿孔)。
hIL2直向同源物不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽(例如信号序列或其他在成熟蛋白质或多肽的N-末端具有特定裂解位点的多肽)的融合多肽。通常，信号序列可以是载体的组分，也可以是插入到载体中的编码序列的部分。所选择的异源信号序列优选是被宿主细胞识别和处理(即被信号肽酶裂解)的序列。在哺乳动物细胞表达中，可以使用天然信号序列，或其他哺乳动物信号序列是合适的，例如来自相同或相关物种的分泌多肽的信号序列，以及病毒分泌前导，例如单纯疱疹gD信号。
可选择标志物
表达载体通常包含选择基因，也被称为可选择标志物。该基因编码转化的宿主细胞在选择性培养基中生长的存活或生长所必需的蛋白质。未用含有选择基因的载体转化的宿主细胞无法在培养基中存活。典型的选择基因编码蛋白质，其将(a)赋予对抗生素或其他毒素例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的抗性；(b)弥补营养缺陷型缺陷；或(c)提供无法从复合培养基中获得的关键营养素。
调控序列：
用于本发明的hIL2直向同源物的表达载体包含调节序列，其被宿主生物体识别且可操作地连接至编码hIL2直向同源物的核酸序列。术语“调控序列”、“调节序列”或“表达控制序列”在本文中可互换使用，指启动子、增强子和其他表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。参见，例如Goeddel(1990)于《基因表达技术：酶学方法》(Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology)185(学术出版社(Academic Press)，美国加利福尼亚州圣地亚哥。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中引导组成型表达的核苷酸序列，和仅在某些宿主细胞中引导表达的核苷酸序列(例如，组织特异性调节序列)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可能取决于例如要转化的宿主细胞的选择，所需蛋白质的表达水平等因素。在表达控制序列的选择中，本领域技术人员理解将要考虑多种因素。这些包括，例如，序列的相对强度、它的可控性，以及它与编码主体hIL2直向同源物的实际DNA序列的相容性，特别是关于潜在的二级结构。
启动子
在一些实施方式中，调节序列是启动子，其选择基于，例如，寻求在其中表达的细胞类型。表达载体将包含被宿主生物体识别的启动子，并可操作地连接至正交蛋白质编码序列。启动子是位于结构基因起始密码子上游(5′)的非翻译序列(通常在约100到1000bp内)，其控制与其可操作地连接的特定核酸序列的转录和翻译。这种启动子通常分为两类，诱导型的和组成型的。诱导型启动子是对培养条件的某些变化(如营养物的存在或不存在或温度的变化)反应，从其控制下的DNA启动增加转录水平的启动子。多种潜在的宿主细胞所识别的大量启动子是众所周知的。例如，在细菌中可以使用T7启动子，在昆虫细胞中可以使用多角体蛋白启动子，在哺乳动物细胞中可以使用巨细胞病毒或金属硫蛋白(metallothionein)启动子。另外，在高等的真核细胞的情况下广泛使用组织特异性和细胞特异性启动子。这些启动子以其在给定的体内组织或细胞类型中核酸分子的指导表达的能力而命名。技术人员知晓许多可用于核酸的指导表达的启动子和其他调节元件。
哺乳动物宿主细胞中载体的转录可以被控制，由，例如，从病毒基因组中获得的启动子，例如多瘤病毒、牛痘病毒、腺病毒(如人类腺病毒血清型5)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒(如鼠干细胞病毒)、乙肝病毒和最理想的猿猴病毒40(SV40)，来自异源哺乳动物的启动子，例如，肌动蛋白启动子、PGK(磷酸甘油酸激酶)或免疫球蛋白启动子，来自热休克启动子，只要这些启动子与宿主细胞系统相容。SV40病毒的早期和晚期启动子可方便地以SV40限制性片段形式获得，该片段也含有SV40病毒的复制起点。
增强子
高等真核生物的转录通常通过向载体中插入增强子序列并可操作地连接至编码hIL2直向同源物的核酸序列来增强。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约为10至300bp，它作用于启动子以增加其转录。增强子的取向和位置相对独立，在转录单元的5′和3′处、内含子内以及编码序列本身内都有发现。现在已经从哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)中得知了许多增强子序列。然而，通常人们会使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括复制起点后侧的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可以被剪接到表达载体中编码序列的5′或3′的位置，但优选是位于离启动子5′的位置。用于真核宿主细胞的表达载体还将包含用于终止转录和用于稳定化mRNA所必需的序列。这种序列通常可以从真核生物或病毒DNA或cDNA的5′，偶尔3′非翻译区获得。含有一个或多个上述组分的合适载体的构建采用了标准技术。
除了促进插入核酸分子的转录的序列之外，载体可以包含复制起点和其他编码可选择标志物的基因。例如，新霉素-抗性(neoR)基因赋予其表达细胞G418抗性，因而允许对转染的细胞进行表型选择。标志物或报告基因的其他例子包括β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、腺苷脱氨酶(ADA)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶(HPH)、胸苷激酶(TK)、lacZ(编码β-半乳糖苷酶)和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)。本领域技术人员可以容易地确定给定的调节元件或可选择标志物适合或不适合用于特定表达环境。
表达载体的正确组装可以通过核酸测序、限制性图谱和在合适宿主中生物活性多肽的表达来确认。
用于生产hIL2直向同源物的宿主细胞
在一个实施方式中，本发明进一步包括包含编码hIL2直向同源物的核酸序列的重组细胞。该细胞可以是原核的或真核的。本发明的细胞是转染的细胞，即核酸分子进入的细胞，例如已经通过重组DNA技术引入编码突变hIL2多肽的核酸分子的。这种细胞的子代也被认为在本发明的范围内。
通常根据它们与所选表达载体的相容性、本发明DNA序列编码的产物的毒性、它们的分泌特性、它们正确折叠多肽的能力、它们的发酵或培养要求、以及DNA序列编码的产物的纯化难易程度来选择用于表达hIL2直向同源物的宿主细胞。用于克隆或表达本文载体中DNA的合适宿主细胞是上述的原核细胞、酵母或高等真核细胞。
在一些实施方式中用于hIL2直向同源物的重组生产的宿主细胞是真核细胞，例如酵母或人细胞。合适的真核宿主细胞包括昆虫细胞(例如在培养的昆虫细胞中可用于蛋白表达的杆状病毒载体(例如Sf9细胞)包括pAc系列(Smith等(1983)Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 170：31-39))；酵母细胞(例如用于在酵母啤酒酵母(S.cerenvisiae)(包括pYepSecl)中表达的载体(Baldari等(1987)EMBOJ.6：229-234)，pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell 30：933-943)，pJRY88(Schultz等(1987)Gene 54：113-123)，pYES2(英杰公司(Invitrogen Corporation)，加利福尼亚州圣地亚哥)和pPicZ(英杰公司，加利福尼亚州圣地亚哥))；或哺乳动物细胞(哺乳动物表达载体包括pCDM8(Seed(1987)Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman等(1987)EMBO J.6：187：195))。
有用的哺乳动物宿主细胞系的例子为，小鼠L细胞(L-M[TK-]，ATCC号CRL-2648)、由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(293或293细胞亚克隆，在悬浮培养中生长；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO)；小鼠塞尔托利氏细胞(TM4)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。
在一些实施方式中，获得的hIL2直向同源物将是糖基化的或未糖基化的，取决于用于生产突变蛋白的宿主生物体。如果选择细菌作为宿主，那么生产的hIL2直向同源物将是未糖基化的。另一方面，真核细胞将糖基化该hIL2直向同源物，或许与天然-IL2糖基化的方式不同。
关于用于原核和真核细胞的其他表达系统，参见Sambrook等(1989)《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)(第2版，冷泉港实验室出版社，纽约州普莱恩维尤)的第16和17章。参见，Goeddel(1990)于《基因表达技术：酶学方法》(GeneExpression Technology：Methods in Enzymology)185(学术出版社，加利福尼亚州圣地亚哥)。
转染：
该编码hIL2直向同源物的核酸表达构建体被引入宿主细胞以从而生产本文公开的hIL2直向同源物，或以生产其生物学活性突变蛋白。载体DNA可以通过常规转化或转染技术被引入原核或真核细胞。关于用于转化或转染宿主细胞的合适的方法可以在Sambrook等(1989)《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)(第2版，冷泉港实验室出版社，纽约州普莱恩维尤)中和其他标准分子生物学实验手册中找到。
为了促进目标细胞的转染，可以在有利于摄取非病毒载体的条件下使目标细胞直接暴露于非病毒载体。促进哺乳动物细胞摄取外源核酸的条件的例子在本领域是众所周知的，包括但不限于化学手段(例如
Figure BDA0003780618550001361
赛默飞世尔科技(Thermo-FisherScientific))，高盐和磁场(电穿孔)。
细胞培养：
细胞可以在被改良为适合用于诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养。哺乳动物宿主细胞可以在多种培养基中培养。市售可得的培养基如汉姆氏F10(Ham′s F10)(西格玛(Sigma))、最小必需培养基((MEM)，西格玛)、RPMI1640(西格玛)和达氏改良的伊氏培养基((DMEM)，西格玛)都适合培养宿主细胞。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素、微量元素和葡萄糖或等同的能量来源。任何其他必需的补充剂也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包含在内。培养条件，如温度、pH值等，是以前用于选择表达的宿主细胞的条件，对普通技术人员来说是显而易见的。
重组蛋白回收：
如果使用分泌前导序列，重组生产的hIL2直向同源物多肽可以以分泌多肽形式从培养基中回收。或者，hIL2直向同源物多肽也可以从宿主细胞裂解物中回收。蛋白酶抑制剂，例如苯基甲基磺酰氟(PMSF)可以在从细胞裂解物种回收阶段中使用，以抑制纯化过程中的蛋白酶降解，并可包括抗生素以防止外源污染物的生长。在一些实施方式中，hIL2直向同源物是在大肠杆菌中生产的，其中hIL2直向同源物的过表达被隔离在包涵体中。分离和溶解包涵体以及回收活性蛋白的技术是本领域众所周知的。
各种纯化步骤是本领域已知的，并且可以寻用，例如亲和层析。亲和层析利用了通常存在于生物大分子中的高度特异性结合位点，根据分子与特定配体结合的能力将其分离。共价键将配体附接至不溶性的多孔支持介质上，使配体明显地呈现在蛋白质样品上，从而利用一种分子种类的天然特异性结合，从混合物中分离和纯化第二种类。抗体通常用于亲和层析。也可以使用尺寸选择步骤，例如，凝胶过滤层析(也被称为尺寸排阻或分子筛层析)用于根据蛋白质的尺寸进行分离。在凝胶过滤中，蛋白质溶液通过由半透性多孔树脂填充的柱。半透性树脂具有孔径范围，决定了可以用该柱分离的蛋白质的大小。
正交hIL2直向同源物可用本领域已知的方法浓缩、过滤、透析等。对于治疗性应用，hIL2直向同源物可以被给予包含合适的工程改造正交受体的哺乳动物。给予可以是静脉内的，以推注或通过一段时间内连续输注的方式给予。给予的替代性途径包括肌肉内、腹膜内、脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径。正交hIL2直向同源物还可以适合地通过瘤内、癌旁、病灶内、或病灶周围途径给予，或给予淋巴以发挥局部以及全身治疗作用。
hIL2直向同源物的给予途径：
在本发明的治疗性方法的实施方式中，包括给予需要治疗的对象包含hIL2直向同源物(和/或编码hIL2直向同源物的核酸)的药物制剂。给予对象可以通过静脉内，以推注或通过一段时间内连续输注的方式实现。给予的替代性途径包括肌肉内、腹膜内、脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径。hIL2直向同源物还可以适合地通过瘤内、癌旁、病灶内、结内或病灶周围途径给予，或给予淋巴以发挥局部以及全身治疗作用。
在一些实施方式中，主体hIL2直向同源物(和/或编码hIL2直向同源物的核酸)可以被纳入组合物，包括药物组合物。这种组合物通常包括多肽或核酸分子和药学上可接受的运载体。制备药物组合物以相容于其意在给予的途径，且相容于治疗用途，用于给予需要治疗或预防的对象hIL2直向同源物。
hIL2直向同源物的制剂
在一些实施方式中，本发明提供了hIL2直向同源物的药学上可接受的制剂。优选制剂取决于预期的给药方式和治疗应用。hIL2直向同源物的药学上可接受的制剂包括生理上可接受的运载体，其本身是无毒且无治疗作用的。这种运载体的例子包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂，血清蛋白质如人血清白蛋白，缓冲物质如磷酸盐、蔗糖、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质和PEG。多肽的局部或基于凝胶形式的运载体包括多糖，例如羧甲基纤维素钠或甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物、PEG、聚氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚合体(lipid aggregate)(例如油性液滴或脂质体)。
该制剂还可以包括药学上可接受的、无毒的运载体、赋形剂、稳定剂或稀释剂，其被定义为通常用于配制用于动物或人给药的药物组合物的载剂。选择稀释剂以不影响组合的生物学活性。在所用剂量和浓度下，可接受的运载体、赋形剂或稳定剂是对受者无毒的，包括：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。用于体内给药的制剂通常为无菌的。本发明组合物的灭菌可以通过无菌滤膜过滤容易地实现。
通常，制剂被制备为可注射的，液体溶液或悬浮液；也可以制备适用于在注射前置于液体载剂中的溶液或悬浮液的固体形式。该制备还可以是乳化的或包封在脂质体或微颗粒中的，例如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物，用于增强辅助作用，如上所述。Langer，Science(1990)249：1527和Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews(1997)28：97-119。本发明的试剂可以以贮库注射(depot injection)或植入制剂的形式给予，其配制方式可以允许活性成分的维持或脉冲释放。药物组合物通常配制为无菌的基本上等渗且完全符合美国食品和药物管理局的所有良好生产规范(GMP)法规。
在一些实施方式中，本发明的方法包括hIL2直向同源物的肠胃外给予。肠胃外途径的示例包括，例如静脉内、皮内、皮下、透皮(局部)、经粘膜和直肠给药。肠胃外制剂包括用于肠胃外应用的溶液或悬浮液，可以包括载剂和缓冲剂。适于肠胃外给药的药物制剂包括无菌水性溶液(水溶性时)或分散液，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。胃肠外制剂可封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。在一个实施方式中，在用于肠胃外给予的预先填充的注射器中提供制剂。
如果使用口服制剂通常包括一种或多种惰性稀释剂和/或可食用运载体。对于口服治疗给药目的，可用赋形剂将hIL2直向同源物掺入并以片剂、含片或胶囊的形式使用，例如明胶胶囊。口服组合物也可以使用液体运载体制备以用作漱口水。可以包含药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料作为制剂的部分。片剂、丸剂、胶囊、含片等可含有任何以下成分或具有相似特性的化合物：粘合剂例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖，崩解剂例如海藻酸、羧甲基淀粉(PrimogelTM)或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或完全氢化植物油(SterotesTM)；助流剂例如二氧化硅胶体；甜味剂例如蔗糖或糖精；或调味剂例如薄荷、水杨酸甲酯、或橙调味剂。
在通过吸入给药的情况下，主体hIL2直向同源物或编码它的核酸以来自含合适推进剂(例如，如二氧化碳气体)或喷雾剂的受压容器或分配器的气雾剂喷雾形式递送。这类方法包括描述于美国专利号6,468,798中的那些。
也可以通过经粘膜或透皮制剂全身给予主体hIL2直向同源物或核酸。对于经粘膜或透皮给药，在制剂中采用适合渗透屏障的渗透剂。这类渗透剂通常为本领域已知，并包括例如用于经粘膜给药的去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可以通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂栓剂(例如使用常规的栓剂基料，如可可油或其它甘油酯)或滞留灌肠剂的形式制备化合物用于直肠递送。对于透皮给药，将活性化合物配制成药膏、软膏、凝胶或霜剂，如本领域通常已知的那样，并可纳入渗透促进剂，如乙醇或羊毛脂。
在一些实施方式中，hIL2直向同源物制剂为延长释放制剂，以在数小时或数天的时间段内提供hIL2直向同源物试剂的延长递送。可注射组合物的延长释放制剂的例子可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)来实现。在一个实施方式中，用运载体制备主体hIL2直向同源物或核酸，其将保护该突变的IL-2多肽不被身体快速清除，如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。可以使用标准技术制备这种制剂。脂质体悬浮液也能被用作药学上可接受的运载体。
工程改造的hoCD122细胞：
在本发明的实践中有用的重组细胞的制备是通过用包含编码hCD122正交受体的核酸序列的表达载体转化分离而实现的。本发明的hIL2直向同源物可以应用于选择性扩增这种工程改造的hoRb细胞(例如人T-细胞)的方法中，所述细胞被工程改造以表达相应的正交hCD122受体。用于以本文所述构建体进行工程改造的T细胞包括幼稚T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞或其组合。上述用于工程改造的T细胞是从对象或供者处收集的，可以通过富集所需细胞的技术从细胞混合物中分离出来，或者可以不经分离而进行工程改造和培养。或者，用于工程改造的T细胞可以与其他细胞分离。提供精确分离的技术包括荧光激活细胞分选机。通过使用与死细胞相关的染料(如碘化丙啶)，可以对死细胞进行细胞选择。分离出的细胞可被收集在任何适当的培养基中，以保持细胞的活力，通常在收集管的底部有血清垫。多种培养基是市售可得的，可根据细胞的性质使用，包括dMEM、HBSS、dPBS、RPMI、Iscove氏培养基等，通常补充胎牛血清(FCS)。收集的和任选地富集的细胞群可立即用于遗传修饰，或可在液氮温度下冷冻并储存，解冻后能够重新使用。细胞通常会被储存在10％DMSO、50％FCS、40％RPMI 1640培养基中。
在一些实施方式中，工程改造的细胞包括免疫细胞的复杂混合物，例如，从需要治疗的个体中分离的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。参见，例如，Yang和Rosenberg(2016)AdvImmunol.130：279-94，“(过继T细胞疗法用于癌症)Adoptive T Cell Therapy forCancer；Feldman等(2015)肿瘤学研讨会(Seminars in Oncol.)42(4)：626-39“过继细胞疗法-肿瘤-浸润淋巴细胞，T细胞受体和嵌合抗原受体(Adoptive Cell Therapy-Tumor-Infiltrating Lymphocytes，T-Cell Receptors，and Chimeric Antigen Receptors)”；Clinical Trial NCT01174121，“使用肿瘤浸润淋巴细胞的免疫疗法用于患转移癌的患者(Immunotherapy Using Tumor Infiltrating Lymphocytes for Patients WithMetastatic Cancer)”；Tran等(2014)Science 344(6184)641-645，“在上皮癌患者中基于突变-特异性CD4+T细胞的癌症免疫疗法(Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+T cells in a patient with epithelial cancer)”。
CAR-T细胞
在本发明的一个实施方式中，hoRb细胞是T-细胞(例如，人T-细胞)，其被修饰为表面表达嵌合抗原受体(“hoCAR-T细胞”)。如本文所用，术语抗原结合结构域(ABD)是指特异性结合至靶细胞表面表达的抗原的多肽。ABD可以是任何多肽，其可以特异性结合至靶细胞表面表达的一个或多个抗原。CAR进一步包括跨膜结构域，将ABD(或接头，如果采用的话)接合至CAR的胞内胞质结构域。跨膜结构域由任何在真核细胞膜中热力学上稳定的多肽序列构成。跨膜结构域可以来自天然存在的跨膜蛋白的跨膜结构域，也可以是合成的。在设计合成的跨膜结构域时，优选使用有利于α-螺旋结构的氨基酸。用于构建CAR的跨膜结构域由约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、22、23或24个有利于形成具有α-螺旋二级结构的氨基酸构成。具有有利于α-螺旋构象的氨基酸在本领域是众所周知的。参见，例如Pace，等(1998)Biophysical Journal75：422-427。特别有利于α螺旋构象的氨基酸包括甲硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸和赖氨酸。在一些实施方式中，CAR跨膜结构域可来自于I型跨膜蛋白的跨膜结构域，如CD3ζ、CD4、CD8、CD28等。
CAR多肽的胞质结构域(ICD)包括一个或多个胞内信号结构域。在一个实施方式中，胞内信号结构域包括在抗原受体接合后启动信号转导的T细胞受体(TCR)和共受体的胞质序列，以及其功能性衍生物和亚片段。胞质信号转导结构域，例如那些来自T细胞受体ζ-链的信号域，被用作CAR的部分，以在嵌合受体与靶抗原接合后产生刺激T淋巴细胞增殖和效应功能的信号。胞质信号转导结构域的例子包括但不限于CD27的胞质结构域、CD28的胞质结构域S、CD137的胞质结构域(也被称为4-1BB和TNFRSF9)、CD278的胞质结构域(也称为ICOS)，PI3激酶的p110α、β或δ催化亚基、人CD3ζ-链，CD134的胞质结构域(也称为OX40和TNFRSF4)、FcεR1γ和β链、MB1(Igα)链、B29(Igβ)链等等)、CD3多肽(δ、Δ和ε)、syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)和其他参与T细胞转导的分子，如CD2、CD5和CD28。
在一些实施方式中，CAR还提供共刺激结构域。术语“共刺激结构域”，是指CAR的刺激结构域，通常是胞内结构域(endodomain)，其提供二级非特异性激活机制，通过该机制传播一级特异性刺激。共刺激结构域指的是CAR的部分，其能增强记忆细胞的增殖、生存或发育。共刺激的例子包括在通过T细胞受体的抗原特异性信号转导后，抗原非特异性T细胞共刺激，和在通过B细胞受体的信号转导后，抗原非特异性B细胞共刺激。共刺激，例如T细胞共刺激，以及所涉及的因素已描述于Chen和Flies.(2013)Nat Rev Immunol 13(4)：227-42。在本发明的一些实施方式中，CSD包括一个或多个TNFR超家族成员，CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40或其组合。
CAR通常称为第一代、第二代、第三代或第四代。术语第一代CAR指的是CAR其中的胞质结构域仅通过单个信号转导结构域传递来自抗原结合的信号，例如来自CD3ζ链或IgEFcεR1γ的高亲和力受体的信号转导结构域。该结构域包含一个或三个基于免疫受体酪氨酸的激活基序[ITAM]，用于抗原依赖的T细胞激活。基于ITAM的激活信号赋予T细胞对抗原结合反应进行裂解靶肿瘤细胞和分泌细胞因子的能力。第二代CAR除了CD3ζ信号外，还包括共刺激信号。递送的共刺激信号的共同递送增强细胞因子的分泌和CAR转导的T细胞诱导的抗肿瘤活性。共刺激结构域通常是相对于CD3ζ结构域的膜近端。第三代CAR包括三方信号转导结构域，例如包括CD28、CD3ζ、OX40或4-1BB信号转导区。在第四代，或“武装(armoredcar)”CAR T细胞被进一步修饰，以表达或阻断分子和/或受体，以增强免疫活性，例如表达IL-12、IL-18、IL-7和/或IL-10；4-1BB配体、CD-40配体。
在本发明的实践中用于可纳入hoCAR-T细胞的胞内信号转导结构域的例子包括(氨基到羧基)：CD3ζ；CD28-41BB-CD3ζ；CD28-OX40-CD3ζ；CD28-41BB-CD3ζ；41BB-CD-28--CD3ζ和41BB-CD3ζ。
术语CAR还包括CAR变体，包括但不限于分裂CAR、开-开关CAR、双特异性或串联CAR、抑制性CAR(iCAR)和诱导多能干(iPS)CAR-T细胞。
术语“分裂CAR”是指CAR，其中CAR的胞外部分、ABD和胞质信号转导结构域存在于两个不同的分子上。CAR变体还包括开-开关CAR，其为条件性可激活的CAR，例如，包括分裂CAR，其中分裂CAR的两个部分的条件性异源二聚体是药理学受控的。CAR分子及其衍生物(即CAR变体)被描述于，例如，在PCT申请号US2014/016527、US1996/017060、US2013/063083中；Fedorov等Sci Trans1 Med(2013)；5(215)：215ra172；Glienke等Front Pharmacol(2015)6：21；Kakarla和Gottschalk 52 Cancer J(2014)20(2)：151-5；Riddell等Cancer J(2014)20(2)：141-4；Pegram等Cancer J(2014)20(2)：127-33；Cheadle等Immunol Rev(2014)257(1)：91-106；Barrett等Annu Rev Med(2014)65：333-47；Sadelain等CancerDiscov(2013)3(4)：388-98；Cartellieri等，J Biomed Biotechnol(2010)956304；其公开内容通过引用全文纳入本文。
术语“双特异性或串联CAR”是指包含能够放大或抑制一级CAR的活性的二级CAR结合结构域的CAR。
术语“抑制性嵌合抗原受体”或“iCAR”在本文中可互换使用，指的是CAR其中结合iCAR使用双重抗原靶向，通过配备二级CAR结合结构域的抑制性信号转导结构域的第二抑制性受体的接合，关闭活性CAR的激活，导致一级CAR的激活的抑制。抑制性CAR(iCAR)设计为通过抑制性受体信号转导模块激活来调节CAR-T细胞活性。这种方法组合了两个CAR的活性，其中一个产生显性负信号，限制由激活受体激活的CAR-T细胞的反应。iCAR当结合至仅由正常组织表达的特异性抗原时，可以关闭抵消激活子CAR反应。通过这种方式，iCAR-T细胞可以区分癌细胞和健康细胞，并以抗原选择性的方式可逆地阻断转导的T细胞的功能。iCAR中的CTLA-4或PD-1胞内结构域触发T淋巴细胞上的抑制性信号，导致细胞因子产生减少，靶细胞裂解效率降低，淋巴细胞运动性改变。
术语“串联CAR”或“TanCAR”是指通过两个嵌合受体的接合介导T细胞的双特异性激活的CAR，这两个嵌合受体设计为对两个不同的肿瘤相关抗原的独立接合反应而递送刺激或共刺激性信号。
通常，嵌合抗原受体T-细胞(CAR-T细胞)是通过转导编码CAR的表达载体而重组修饰的T细胞，基本根据上述教导。
在一些实施方式中，hoCAR-T细胞对于被治疗的个体是同种异体的。Graham等(2018)Cell 7(10)E155。在一些实施方式中同种异体工程改造T细胞是完全HLA匹配的。然而并非所有患者都具有完全匹配的供者，适合所有患者的独立于HLA类型的细胞产品提供了替代方案。
因为hoCAR-T细胞衍生自对象自己的T细胞，要给予对象的细胞群必然是可变的，对这种试剂的反应可能变化，因此涉及对治疗相关毒性的持续监测和管理，在给予hoCAR-T细胞产品之前，通过药物免疫抑制或B细胞耗竭疗程管理。通常，至少将要给予1x106个hoCAR-T细胞/kg，至少1x107个hoCAR-T细胞/kg，至少1x108个hoCAR-T细胞/kg，至少1x109个hoCAR-T细胞/kg，至少1x1010个hoCAR-T细胞/kg，或更多，通常受收集期间获得的T细胞数量限制。工程改造的hoCAR-T细胞可以在任何生理上可接受的介质中通过任何方便的给药途径输注给对象，通常是血管内，尽管其也可以通过其他途径引入细胞能够找到适合生长的部位。
如果hoCAR-T细胞是同种异体T细胞，这种细胞可以被修饰以减少移植物抗宿主病。例如，本发明的工程改造细胞可以是通过基因编辑技术实现TCRαβ受体敲除的。TCRαβ是异二聚体，α和β链都需要存在才能被表达。一个基因编码α链(TRAC)，2个基因编码β链，因此为此目的缺失TRAC基因座KO。许多不同的方法被用于完成此缺失，例如CRISPR/Cas9；兆核酸酶(meganuclease)；工程改造的I-CreI归巢内切核酸酶等。参见，例如，Eyquem等(2017)Nature 543：113-117，其中TRAC编码序列被CAR编码序列替代；和Georgiadis等(2018)Mol.Ther.26：1215-1227，其将CAR表达与TRAC破坏通过规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9连接起来，而不直接将CAR纳入TRAC基因座。防止GVHD的替代性策略修饰T细胞以表达TCRαβ信号转导的抑制剂，例如使用CD3ζ的截短形式作为TCR抑制分子。
在一些实施方式中，本发明提供了从混合的细胞群中选择性扩增表达正交hCD122受体的工程改造的细胞群的方法，该方法包括在促进工程改造细胞的扩增的条件下，使混合的细胞群与本发明的hIL2直向同源物接触。在一个实施方式中，当表达正交hCD122受体的CAR-T细胞时，通过使用本文所述的hIL2直向同源物，表达正交受体的CAR-T细胞也被从背景或混合的转导和非转导细胞群中选择性扩增。用于治疗性应用的T细胞的扩增通常包括培养细胞，其与提供刺激CD3 TCR复合物相关信号的试剂，和刺激T细胞表面共刺激分子的试剂的表面接触。在常规实践中，在给予细胞治疗产品之前，刺激工程改造的T细胞，通过将其与CD3/D28接触，特别是在制备用于临床应用的CAR-T细胞中。多种或市售的产品可以用于促进基于珠的T细胞激活，包括但不限于
Figure BDA0003780618550001461
CTS
Figure BDA0003780618550001462
CD3/28(生命科技公司(Life Technologies，Inc.)加利福尼亚州卡尔巴斯德)或Miltenyi
Figure BDA0003780618550001463
GMPExpAct Treg珠，或Miltenyi MACS GMP TransActTM CD3/28珠(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec，Inc.))。适合用于T细胞培养的条件在本领域中是众所周知的。Lin，等(2009)Cytotherapy11(7)：912-922；Smith，等(2015)Clinical&TranslationalImmunology 4：e31，在线发表于2015年1月16日。目标细胞在支持生长所必需的条件下维持，例如，合适的温度(例如37℃)和气氛(例如空气加5％CO2)其中含有表达hCD122正交受体的工程改造的T细胞的混合细胞群在存在一定浓度的hIL2直向同源物的情况下进行培养。在一些实施方式中培养至少2小时、或者至少3小时、或者至少4小时、或者至少6小时、或者至少8小时、或者至少12小时、或者至少24小时、或者至少48小时、或者至少72小时，或者更多。在这种离体情况下，hIL2直向同源物的浓度足以诱导该细胞群的细胞增殖。T细胞增殖可以很容易地通过显微镜方法评估，确定hIL2直向同源物的最佳浓度将取决于hIL2直向同源物对正交hCD122受体的相对活性。
在一个实施方式中，本发明提供了一种制备基本富集工程改造的表达hoCD122的细胞的工程改造细胞产品的方法，该方法包括以下步骤：(a)获得包含T细胞的生物样品；(b)将该生物样品与编码hoCD122受体的重组载体接触；(c)将该生物样品与hIL2直向同源物接触一段时间，足以扩增工程改造的表达hoCD122的细胞。接触和培养的持续时间可以根据群体富集的程度而改变。
当细胞在体外与hIL2直向同源物接触时，hIL2直向同源物被添加到工程改造的细胞中，其剂量和时间足以激活来自hoCD122受体的信号转导，这可以利用天然细胞机制，例如辅助蛋白、共受体等。可以使用任何合适的培养基。这样激活的细胞可用于任何需要的目的，包括与确定抗原特异性、细胞因子概况分析等有关的实验目的，以及用于体内递送。
在体内进行接触时，将有效剂量的工程改造的细胞，包括但不限于修饰为表达正交hoCD122受体的CAR-T细胞，与正交细胞因子(例如IL-2)的给予相结合或在给予之前输给受者，并允许在其原生环境中，例如在淋巴结等处接触T细胞。剂量和频率可根据试剂；给予方式；hIL2直向同源物的性质等而变化。本领域的技术人员将理解，这种指南将根据个体的情况进行调整。剂量也可因给予途径而变化，例如，肌肉内注射、腹膜内注射、皮内注射、皮下注射、静脉注射等。通常，给予至少约104个工程改造细胞/kg、至少约105个工程改造细胞/kg、至少约106个工程改造细胞/kg、至少约107个工程改造细胞/kg，或更多。
当被修饰成表达hoCD122的工程改造细胞是T细胞时，增强的免疫反应可以表现为T细胞对受者中存在的靶细胞的T细胞的细胞溶解反应的增加，例如对肿瘤细胞、感染细胞的消除；自身免疫性疾病症状的减少；等等。在一些实施方式中，当工程改造的T细胞群被给予对象时，在给予工程改造T细胞群之前、或与给予工程改造T细胞群组合，向对象提供免疫抑制疗程。这种免疫抑制方案的例子包括但不限于全身性皮质类固醇(例如，甲基强的松龙)。B细胞耗竭的治疗包括按既定的临床给药指南静脉内免疫球蛋白(IVIG)，以恢复血清免疫球蛋白的正常水平。在一些实施方式中，在给予本发明的CAR-T细胞疗法之前，对象任选地经历淋巴清除方案。这种淋巴清除方案的一个例子由以下组成：给予对象氟达拉滨(每天30mg/m2静脉内给予，持续4天)和环磷酰胺(从第一剂氟达拉滨开始，每天500mg/m2 IV，持续2天)。
工程改造hoCD122细胞可以被提供在适合治疗用途(例如用于人治疗)的药物组合物中。包含这些细胞的治疗制剂可以冷冻，或用生理上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂制备用于给药(《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)第16版，Osol，A.Ed.(1980))，以水性溶液的形式。hoCD122细胞将以符合良好医学实践的方式进行配制、确定剂量和给药。就此而言的考量因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、患者个体临床状况、病因、试剂递送部位、给药方法、给药安排，以及医务人员所知的其它因素。
hoCD122细胞可以通过任何合适的方式给药，通常是肠胃外。肠胃外输注包括肌内、静脉内(推注或缓慢输注)、动脉内、腹膜内、鞘内或皮下给予。在典型的实践中，工程改造T细胞可以在生理上可接受的介质中输注给对象，通常是血管内，尽管其也可以被引入任何其他方便的部位，在那里细胞可以找到适合生长的部位。通常，至少将要给予1x105个细胞/kg，至少1x106个细胞/kg，至少1x107个细胞/kg，至少1x108个细胞/kg，至少1x109个细胞/kg，或更多，通常受收集期间获得的T细胞数量限制。
例如，用于本方法实践中的，经修饰以表达正交hCD122受体的细胞的典型给药范围为每疗程每kg对象体重约1x105至5x108个活细胞。因此，根据体重调整后，每个疗程人对象给予活细胞的典型范围为约1x106至约1x1013个活细胞，或者约5x106至约5x1012个活细胞，或者约1x107至约1x1012个活细胞，或者约5x107到约1x1012个活细胞，或者约1x108到约1x1012个活细胞，或者约5x108到约1x1012个活细胞，或者约1x109到约1x1012个活细胞。在一个实施方式中，每个疗程细胞的剂量在2.5-5x109个活细胞的范围内。
hIL2直向同源物和/或hoCD122细胞的疗程可以包括单剂量或在一段时期内的多剂量。在一些实施方式中，hoCD122细胞以单剂量给予。在一些实施方式中，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28、30、60、90、120或180天的时间内，以两次或更多次分剂量给予hoCD122细胞。在这种分次给药方案中，工程改造hoCD122细胞的数量在每次给药中可以是相同的，也可以以不同水平提供。在时间段内的多天给药方案可由熟练技术人员(如医生)提供，监测细胞的给予，考虑对象对治疗的反应，包括治疗的不良反应及其调节，如上文所述。
本发明的组合物和方法还提供了一种在没有事先淋巴清除的情况下用hoCD122细胞疗法(特别是CAR T细胞疗法)治疗对象的方法。淋巴清除通常与CAR T细胞疗法共同在对象中进行，因为随后给予混合细胞群和给予非特异性试剂(例如hIL2)以扩增对象体内的工程改造细胞群，组合给予细胞治疗产品的行为，导致显著的全身性毒性(包括细胞因子释放综合征或“细胞因子风暴”)，这是因为通过给予导致广泛激活的试剂，以及细胞治疗产品本身中相当部分的非工程改造细胞，而导致免疫细胞广泛增殖和激活。本发明的方法和组合物通过以下两点(或其中之一)避免了这一重大障碍：当采用前述离体方法时，提供基本纯化的工程改造细胞群，基本上没有非工程改造细胞的污染，和/或用本发明的hIL2直向同源物选择性激活和扩增工程改造T细胞，这大大减少非特异性增殖剂如IL2的脱靶效应。
例如，在目前CAR-T细胞治疗的临床实践中，CAR-T细胞通常与淋巴清除(例如，通过给予阿仑单抗(单克隆抗-CD52)、嘌呤类似物等)组合给予，以促进CAR-T细胞在宿主免疫恢复之前的扩增。在一些实施方式中，CAR-T细胞可被修饰为对阿仑单抗具有抗性。在本发明的一个方面，目前采用的与CAR-T疗法相关联的淋巴清除可由表达本发明的CAR-T的正交配体避免或减少。如上所述，通常采用淋巴清除来实现CAR-T细胞的扩增。然而，淋巴清除也与CAR-T细胞治疗的主要副作用有关。由于正交配体提供了选择性扩增特定T细胞群的手段，可以减少在给予表达正交配体的CAR-T之前对淋巴清除的需要。本发明使CAR-T细胞治疗的实践在给予表达正交配体的CAR-T之前无需或减少了淋巴清除。
在一个实施方式中，本发明提供了一种治疗患有可通过CAR-T细胞疗法治疗的疾病、紊乱或病症(例如癌症)的对象的方法，其通过给予表达正交配体的CAR-T，在给予正交配体CAR-T之前不进行淋巴清除。
在一个实施方式中，本发明提供了一种治疗哺乳动物对象的方法，该对象患有肿瘤疾病，该方法包括以下步骤：(a)从该个体获得包含T细胞的生物样品；(b)富集生物样品中存在的T细胞；(c)用一个或多个表达载体转染T细胞，该载体包含编码CAR的核酸序列和编码正交hCD122受体的核酸序列，CAR的抗原靶向结构域能够结合至肿瘤细胞上存在的至少一种抗原；(d)用hIL2直向同源物离体接触包含表达正交受体的CAR-T细胞的细胞群，使得该细胞群富集表达hoCD122的CAR T细胞，(e)给予哺乳动物药学有效量的表达正交受体的CAR-T细胞；以及(f)通过给予治疗有效量的hIL2直向同源物调节表达正交hCD122受体的CAR-T细胞的生长，该hIL2直向同源物可选择性地结合至CAR-T细胞上表达的正交hCD122受体。在上述方法中，当编码CAR和正交hCD122受体的核酸序列在同一载体上提供时，该序列可以任选地以多顺反子形式提供，核酸序列被间插序列(例如IRES或T2A序列)分隔开。在一个实施方式中，上述方法与开始CAR-T细胞治疗疗程之前的哺乳动物的淋巴清除或免疫抑制相关联。在另一个实施方式中，上述方法是在没有对哺乳动物进行淋巴清除和/或免疫抑制的情况下实施的。
编码hIL2直向同源物的病毒或非病毒载体的给予
给予hIL2直向同源物蛋白的替代方案，hIL2直向同源物可以通过给予对象编码hIL2直向同源物的核酸构建体来提供给对象，以实现对象持续暴露于选择性的hIL2直向同源物。编码hIL2直向同源物的重组载体的给予，提供了hIL2直向同源物对对象的延长递送，和对应的与这种hIL2直向同源物相关的、工程改造为表达同源正交受体的细胞的延长激活。
非病毒载体：
在一个实施方式中，hIL2直向同源物可以以在非病毒递送系统中提供的非病毒载体中的hIL2直向同源物的核酸表达构建体的形式给予对象。非病毒递送系统通常是复合物以促进用核酸载物转导目标细胞，其中核酸与试剂复合，所述试剂例如阳离子脂质(DOTAP、DOTMA)、表面活性剂、生物制品(明胶、壳聚糖)、金属(金、磁铁)和合成聚合物(PLG、PEI、PAMAM)。非病毒递送系统的许多实施方式是本领域众所周知的，包括脂质载体系统(Lee等(1997)治疗性药物运载体系统的关键性综述(Critical Reviews of Therapeutic DrugCarrier Systems)14：173-206)；聚合物涂覆脂质体(Marin等，美国专利号5,213,804，授权于1993年5月25日；Woodle，等，美国专利号5,013,556，授权于1991年5月7日)；阳离子脂质体(Epand等，美国专利号5,283,185，授权于1994年2月1日；Jessee，J.A.，美国专利号5,578,475，授权于1996年11月26日；Rose等，美国专利号5,279,833，授权于1994年1月18日；Gebeyehu等，美国专利号5,334,761，授权于1994年8月2日)。在一个实施方式中，非病毒载体系统中编码hIL2受体的核酸序列是在可调节启动子、诱导型启动子、组织特异性或肿瘤特异性启动子或时间调节启动子的控制下。
病毒载体：
在另一个实施方式中，hIL2直向同源物可以以编码hIL2直向同源物的病毒载体中核酸表达构建体的形式给予对象。术语“病毒载体”和“病毒”在本文中可互换使用，指任何没有蛋白质合成或能量产生机制的专性胞内寄生体。病毒基因组可以是含有脂质膜的蛋白质的包被结构的RNA或DNA。术语病毒和病毒载体在本文中可互换使用。在本发明的实践中有用的病毒包括重组修饰的包膜或非包膜DNA和RNA病毒，优选选自杆状病毒科(baculoviridiae)、细小病毒科(parvoviridiae)、微小RNA病毒科(picornoviridiae)、疱疹病毒科(herpesviridiae)、痘病毒科(poxviridae)或腺病毒科(adenoviridiae)。该病毒通过DNA重组技术修饰以包含表达外源性转基因(例如编码hIL2直向同源物的核酸序列)，并可被工程改造为复制缺陷型、条件性复制型或复制能力型。也可采用最小载体系统，其中病毒骨架仅包含病毒载体包装所需的序列，任选地包含转基因表达盒。术语“复制缺陷型”是指在野生型哺乳动物细胞中的复制高度减弱的载体。为了大量生产这种载体，通常通过与辅助病毒共转染或通过基因组修饰来补充缺失的功能，从而建立生产者细胞系。术语“复制能力型病毒载体”是指能够感染、DNA复制、包装和裂解受感染细胞的病毒载体。本文使用的术语“条件性复制型病毒载体”指的是有复制能力的载体，其被设计成在特定的细胞类型中实现选择性表达。这种条件性复制可以通过将组织特异性、肿瘤特异性或细胞类型特异性或其他选择性诱导的调控控制序列可操作性地连接至早期基因(如腺病毒载体的E1基因)来实现。用重组病毒或非病毒载体感染对象可以在对象中提供hIL2直向同源物的长期表达，并提供表达hCD122正交受体的工程改造T细胞的连续选择性维持。在一个实施方式中，在病毒载体系统中编码hIL2直向同源物的核酸序列是在可调节启动子、诱导型启动子、组织特异性或肿瘤特异性启动子或时间调节启动子的控制下。
治疗组合：
本发明的组合物和方法可与其他治疗剂组合。例如，当要治疗的疾病、紊乱或病症是肿瘤性疾病(如癌症)时，本发明的方法可与传统的化学治疗剂或其他生物抗癌药物如检查点抑制剂(如PD1或PDL1抑制剂)或治疗性单克隆抗体(如阿瓦斯丁(Avastin)、赫赛汀)组合。
本领域中被鉴定为对治疗肿瘤性疾病有用的化学试剂的例子包括但不限于：必除癌(abitrexate)、阿霉素(adriamycin)、氟尿嘧啶(adrucil)、安吖啶(amsacrine)、天冬酰胺酶(asparaginase)、蒽环类(anthracyclines)、氮杂胞苷(azacitidine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、必先优(bicnu)、硫酸博来霉素(blenoxane)、白消安(busulfan)、博来霉素(bleomycin)、开普拓(camptosar)、喜树碱(camptothecins)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、柔红霉素(cerubidine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)、更生霉素(cosmegen)、阿糖胞苷(cytarabine)、赛德萨(cytosar)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、癌得星(cytoxan)、放线菌素(dactinomycin)、多西他赛(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、(ellence)、门冬酰胺酶(elspar)、表柔比星(epirubicin)、依托泊苷(etoposide)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、福达华(fludara)、吉西他滨(gemcitabine)、健择(gemzar)、和美新(hycamtin)、羟基脲(hydroxyurea)、羟基脲(hydrea)、伊达比星(idamycin)、伊达比星(idambicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、异环磷酰胺(ifex)、伊立替康(irinotecan)、兰快舒(1anvis)、瘤可宁(1eukeran)、克拉屈滨(1eustatin)、甲苯肼(matulane)、氮芥(mechlorethamine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、丝裂霉素(mutamycin)、马利兰(myleran)、阿扎胞苷(mylosar)、诺维本(navelbine)、喷司他丁(nipent)、能灭瘤(novantrone)、长春新碱(oncovin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、铂尔定(paraplatin)、喷司他丁(pentostatin)、顺铂(platinol)、普卡霉素(plicamycin)、甲基苄肼(procarbazine)、巯基嘌呤(purinethol)、雷替曲塞(ralitrexed)、泰素帝(taxotere)、紫杉醇(taxol)、替尼泊苷(teniposide)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、拓优得(tomudex)、拓扑替康(topotecan)、戊柔比星(valrubicin)、长春碱(velban)、凡毕士(vepesid)、长春花碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、长春新碱(vincristine)、长春瑞滨(vinorelbine)、VP-16和威猛(vumon)。
本发明的组合物可与一种或多种其他治疗剂组合给予，这些治疗剂选自下组：酪氨酸激酶抑制剂，例如甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate)(作为
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上市，也称为STI-571)、吉非替尼(
Figure BDA0003780618550001532
也称为ZD1839)、厄洛替尼(作为
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上市)、索拉非尼
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舒尼替尼
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达沙替尼
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拉帕替尼
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尼洛替尼
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和硼替佐米
Figure BDA0003780618550001539
(鲁索替尼)；Janus激酶抑制剂，如托法替尼；ALK抑制剂，如克唑替尼(crizotinib)；Bc1-2抑制剂，如奥巴克拉(obatoclax)、维纳妥拉(venclexta)和棉子酚(gossypol)；FLT3抑制剂，例如米哚妥林(midostaurin)
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IDH抑制剂，例如AG-221；PARP抑制剂，如伊尼帕利布(Iniparib)和奥拉帕尼(Olaparib)；PI3K抑制剂，如哌立福新(perifosine)；VEGF受体2抑制剂，如阿帕替尼；AN-152(AEZS-108)多柔比星连接至[D-Lys(6)]-LHRH；Braf抑制剂，如威罗非尼(vemurafenib)、达拉非尼(dabrafenib)和LGX818；MEK抑制剂，如曲美替尼(trametinib)；CDK抑制剂，例如PD-0332991和LEE011；Hsp90抑制剂，如盐霉素(salinomycin)；和/或小分子药物偶联物，如维他拉肽(Vintafolide)；丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，如坦西莫司(Temsirolimus)
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依维莫司(everolimus)
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维莫非尼(Vemurafenib)
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曲美替尼(Trametinib)(Mekinist)和达拉非尼(Dabrafenib)
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在一些实施方式中，特别是在CAR的肿瘤抗原结合部分针对BCMA的情况下，工程改造的CAR-T细胞与γ-分泌酶抑制剂(GSI)组合给予，如描述于Pont等(2019)″γ-分泌酶抑制增加BCMA特异性嵌合抗原受体T细胞在多发性骨髓瘤中的疗效(γ-secretaseinhibition increases efficacy of BCMA-specific chimeric antigen receptor Tcells in multiple myeloma)″Blood https://doi.org/10.1182/blood.2019000050。
本领域中鉴定的对治疗肿瘤性疾病有用的生物试剂的例子包括但不限于：细胞因子或细胞因子拮抗剂，例如IL-12、INFα或抗表皮生长因子受体、放疗、伊立替康；四氢叶酸抗代谢剂，例如培美曲塞；针对肿瘤抗原的抗体、单克隆抗体和毒素的复合物、T细胞助剂、骨髓移植、或抗原呈递细胞(例如树突状细胞治疗)、抗肿瘤疫苗、复制能力型病毒、信号传导抑制剂(如
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或
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)或免疫调节剂，以实现对肿瘤生长的补充或协同抑制、环氧合酶-2(COX-2)抑制剂、类固醇、TNF拮抗剂(如。
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和
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)、干扰素-β1a
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和干扰素-β1b
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以及本领域熟练的临床医生容易理解的已知化疗治疗方案中的上述一种或多种的组合。
可与工程改造细胞组合给予的肿瘤特异性单克隆抗体可包括但不限于利妥昔单抗(作为MabThera或Rituxan上市)、阿仑单抗、帕尼单抗、伊匹单抗(Yervoy)等。
在一些实施方式中，本发明的组合物和方法可与免疫检查点疗法组合。免疫检查点疗法的例子包括PD1结合至PDL1和/或PDL2的抑制剂。PD1至PDL1和/或PDL2的抑制剂是本领域内众所周知的。干扰PD1结合至PDL1和/或PDL2的市售可得的单克隆抗体的例子包括纳武单抗(
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BMS-936558，MDX1106，商购自BristolMyers Squibb公司，新泽西州普林斯顿)，派姆单抗(
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MK-3475，兰姆单抗，商购自默克公司(Merck andCompany)，新泽西州肯尼尔沃斯)和阿特珠单抗(
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基因泰克/罗氏(Genentech/Roche)，加利福尼亚州南旧金山)。PD1抑制性抗体的其他例子包括但不限于杜瓦鲁单抗(MEDI4736，阿斯利康/米迪缪尼(Medimmune/AstraZeneca))、匹利珠单抗(CT-011，CureTech)、PDR001(诺华(Novartis))、BMS-936559(MDX1105，Bristol Myers Squibb)，以及阿维鲁单抗(MSB0010718C，默克/辉瑞(Merck Serono/Pfizer))和SHR-1210(因赛特医疗(Incyte))。2012年7月10日授权的美国专利号8,217,149(基因泰克公司)、2012年5月1日授权的美国专利号8,168,757(默沙东(Merck Sharp and Dohme Corp))、2011年8月30日授权的美国专利号8,008,449(美达莱(Medarex))、2011年5月17日授权的美国专利号7,943,743(美达莱公司)中描述了其他抗体PD1途径抑制剂。此外，小分子PD1至PDL1和/或PDL2的抑制剂是本领域内众所周知的。参见，例如Sasikumar，等的WO2016142833A1和Sasikumar，等WO2016142886A2，BMS-1166和BMS-1001(Skalniak，等(2017)Oncotarget 8(42)：72167-72181)。
现在已经完全描述了本发明，对于本领域的普通技术人员来说，显然可以做出许多改变和修改而不偏离本发明的构思或范围。
实施例
呈现以下实施例以更充分地说明本发明的优选实施方式。然而，它们不应解释为对本发明范围的限制。
实施例1.人IL2表达载体pcDNA3.1/hygro(+)-huIL2的产生
人IL2 DNA ORF(Genbank NM_000586.3)被合成(生命技术公司(LifeTechnologies)GeneArt服务，加利福尼亚州卡尔斯巴德)并通过PCR使用Platinum SuperFiII DNA聚合酶试剂盒(货号12361050，赛默飞世尔(ThermoFisher))扩增，按照制造商的方案，并使用引物：
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其纳入NheI限制性位点，和
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其纳入ApaI限制性位点。PCR片段在1％的琼脂糖凝胶(货号54803，隆萨公司(Lonza)，缅因州洛克兰(Rockland，ME))上可视化，从凝胶上切除并纯化，使用QIAquickPCR纯化试剂盒(货号28106，凯杰公司(Qiagen)，德国)，根据制造商的方案。
纯化的PCR片段和哺乳动物表达载体pcDNA 3.1/Hygro(+)(编号V87020，赛默飞世尔)用NheI和ApaI(编号R0111S和编号R0114L，新英格兰生物实验室公司(New EnglandBiolabs)，马萨诸塞州伊普斯维奇)限制酶消化。表达载体用快速去磷酸化试剂盒(编号M0508L，新英格兰生物实验室公司)根据制造商的方案进一步处理。PCR片段被连接至pcDNA3.1/Hygro(+)，使用快速DNA连接试剂盒(编号11635379001，西格玛奥德里奇(SigmaAldrich)，密苏里州圣路易斯)，根据制造商的方案，转化到OneShot TOP10化学感受态的大肠杆菌(编号C404006，生命技术公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)中，接种到LB琼脂板上，其含有100ug/ml羧苄青霉素(编号L1010，Teknova，加利福尼亚州霍利斯特)并在37C生长过夜。
次日，挑出单菌落并用于在含有100ug/ml氨苄青霉素(编号A9626，Teknova)的LB肉汤(编号10855-001，生命技术公司)中开始3ml细菌培养。培养物在37C下生长过夜。
次日，沉淀大肠杆菌(6,000rpm，10分钟，台式离心机，编号5424，Eppendorf，纽约州霍波格)，以及使用QIAprep Spin小抽试剂盒(编号27106，凯杰公司)分离DNA表达载体。质粒DNA经过序列验证(MCLab，加利福尼亚州南旧金山)。
实施例2.人IL2 ORTHO表达载体pcDNA3.1/hygro(+)-huIL2-ORTHO的产生
表达载体将六个突变引入人IL2 ORF(E35S、H36Q、L39V、D40L、Q42K和M43A；所有编号基于全长人IL2 ORF NM_000586.3编号)，基本按照pcDNA3.1/Hygro(+)中人IL2表达载体的实施例1中教导组装，除了以下例外：合成用于PCR的初始模板DNA，含有E35S、H36Q、L39V、D40L、Q42K和M43A突变。
实施例3.将突变引入pcDNA3.1/hygro(+)-huIL2或回复突变引入pcDNA3.1/hygro (±)-huIL2 IRTHO表达载体。
所有突变或回复突变(将pcDNA3.1/hygro(+)-huIL2-ORTHO中的突变恢复到与野生型IL2 ORF匹配)被引入pcDNA3.1/Hygro(+)-huIL2或pcDNA3.1/Hygro(+)-huIL2-ORTHO表达载体，使用Quik Change II定点诱变试剂盒(编号200524，安捷伦科技公司(AgilentTechnologies)，加利福尼亚州圣克拉拉)基本按照制造商的方案操作。
表5列出了产生的突变，引入突变的模板，以及用于引入突变的引物组。将QuikChange PCR反应转化进大肠杆菌中，以及质粒DNA的分离和序列分析，是使用与产生pcDNA3.1/Hygro-huIL2表达载体基本相同的方案进行的。模板的缩写为：模板1＝pcDNA3.1/hygro(+)-huIL2；模板2＝pcDNA3.1/Hygro(+)-huIL2 ORTHO。
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实施例4.HEK293细胞中的瞬时转染
所有表达载体被瞬时转染进HEK293细胞(编号CRL-1573，ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯)。约1E6 HEK293细胞被接种到6孔组织培养板的各孔中的补充有10％胎牛血清(编号SH30071.03，Fisher Scientific，美国伊利诺伊州芝加哥)的2ml DMEM(编号10569044，生命技术公司)中，并在37C和5％CO2下生长过夜。
第二天用Lipofectamine 3000试剂(编号L3000150，生命技术公司)转染细胞，按照制造商的方案，每次转染使用2.5ug DNA、5ul P3000试剂和7.5ul Lipofectamine3000。.转染的细胞在37C，5％CO2生长48-72小时然后收获条件培养基。
实施例5.蛋白质表达分析
通过ELISA测量一些突变蛋白的蛋白质表达，使用人IL2 V-PLEX ELISA试剂盒(编号K151QQD-4，Mesoscale Diagnostics，马里兰州巴尔的摩市)，按照制造商的方案(转染培养基最初以1∶4稀释，然后1∶2连续稀释)。在Meso Quickplex SQ120(MesoscaleDiagnostics)上使用制造商为该ELISA试剂盒预设的设置读取平板。该试剂盒中的人IL2标准品被用来计算条件培养基样品中的近似表达水平。下表6具体示出了表达的蛋白的大约表达水平。
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实施例7.在表达hoCD122的细胞系中直向同源物的活性的评估
在NKL细胞中评估IL2直向同源物的活性(Robertson，等(1996)ExperimentalHematology 24(3)：406-15)。为了产生表达人正交hCD122的细胞系(hoNKL hoRB)，根据本领域已知的程序，用编码hoRB hCD122和共表达YFP的逆转录病毒(MSCV-hoRb-IRES-YFP)感染NKL细胞。
NKL和NKL hoRB细胞与来自hIL2直向同源物转染的293细胞的上清接触，如下：细胞被接种在生长培养基中，其由RPMI 1640(赛默飞世尔(ThermoFisher))、10％胎牛血清(赛默飞世尔)、1％青霉素/链霉素(赛默飞世尔)、1％glutamax(赛默飞世尔)组成，0.5x106个细胞/ml。培养2天后，细胞被接种到96孔板(Falcon)中，每孔100μl生长培养基中25,000个细胞。将转染的293细胞上清在生长培养基中进行两倍或五倍的连续稀释，并将100μl各稀释液加入NKL和NKL hoRB细胞的平板中，设双重复，最终滴定范围1∶2到1∶31,250。平板被转移到加湿培养箱(赛默飞世尔)，在37摄氏度、5％的二氧化碳条件下孵育三天。
将培养箱中的板取出，并在室温保持30分钟。板在400xg离心5分钟并弃去上清。通过每孔添加50μl的Celltiterglo(普洛麦格公司(Promega))的PBS的1∶1稀释液裂解细胞。细胞裂解物在定轨摇床(VWR科学公司(VWR Scientific))上以600rpm混合两分钟，然后在室温下保持10分钟。裂解物被转移到黑色透明底的96孔板(科斯塔(Costar))，NKL细胞裂解物(图1)和NKL hoRB细胞裂解物(图2)的发光在Envision 2103多标签读板仪(铂金埃尔默(Perkin Elmer))中以每秒计数读取。
为了比较每种IL-2变体对NKL细胞和NKL hoRB细胞增殖的影响，将用上清处理的细胞的celltiterGlo值与单独用生长培养基、来自空载体转染的293上清、野生型IL-2转染、或人正交IL-2转染的上清处理的对照细胞获取的值进行比较。这些实验的数据列于附图的图1和2。
实施例8.在表达hoCD122的细胞系中直向同源物的活性的评估
评估IL2直向同源物在CD4+人T细胞克隆3F8细胞中的活性。CD4阳性T细胞克隆3F8是由健康供者的PBMC与EBV转化的B细胞系JY在两轮连续的混合白细胞反应中激活，然后通过有限稀释的单细胞克隆产生的，如描述于(Yssel和Spits(2002)《新编免疫学指南》(Current Protocols in Immunology)7.19.1-7.19.12)CD4阳性T细胞克隆3F8表达CD25和CD122并对IL-2反应增殖。为了产生表达人正交hCD122的细胞系(ho3F8hoRB)，根据本领域已知的程序，用编码hoRB hCD122和共表达YFP的逆转录病毒(MSCV-hoRb-IRES-YFP)感染3F8细胞。
3F8和3F8 hoRb细胞与来自hIL2直向同源物转染的293细胞的上清接触，如下：细胞以每ml 20万个细胞在由Yssel氏培养基(Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(赛默飞世尔)、0.25％w/v％人白蛋白(西格玛)、1％青霉素/链霉素(赛默飞世尔)、1％ITS-X胰岛素、转铁蛋白、硒(吉布可公司(Gibco))、30mg/L转铁蛋白(罗氏公司(Roche))、2mg/L棕榈酸(西格玛)、1％LA-OA-白蛋白亚油酸、油酸(西格玛)、1％人血清(Gemini)组成的生长培养基中生长(Yssel等(1984)J Immunol Methods 72：219-227)，50Gy辐照的JY细胞以每孔10万个细胞，40Gy辐照的同种异体PBMC以每mL 100万个细胞。经过十天的培养和用100pM的人IL-2扩增后，细胞被洗涤并接种到黑色透明底的96孔板(科斯塔(Costar))中，每孔5万个细胞，50μl生长培养基。将转染的293细胞上清在生长培养基中进行两倍的连续稀释，并将50μl各稀释液加入3F8和3F8 hoRB细胞的平板中，最终滴定范围为1∶2至1∶31250。平板被转移到加湿培养箱(赛默飞世尔)，在37摄氏度、5％的二氧化碳条件下孵育三天。
将培养箱中的板取出，并在室温保持30分钟。每孔加入100μlCelltiterglo(普洛麦格公司(Promega))裂解细胞。细胞裂解物在定轨摇床(VWR科学公司(VWR Scientific))上以600rpm混合两分钟，然后在室温下保持10分钟。3F8细胞裂解物(图1)和3F8 hoRB细胞裂解物(图2)的发光在Envision 2103多标签读板仪(铂金埃尔默(Perkin Elmer))中以每秒计数读取。
为了比较每种IL-2变体对3F8细胞和3F8 hoRB细胞增殖的影响，将用上清处理的细胞的celltiterGlo值与单独用生长培养基、来自空载体转染的293上清、野生型IL-2转染、或人正交IL-2转染的上清处理的对照细胞获取的值进行比较。这些实验所得数据见表4。

Claims (30)

1.一种hIL2直向同源物，其氨基酸序列与式#1的多肽具有至少90％同一性：
Figure FDA0003780618540000011
其中：
AA1是A(野生型)或缺失；
AA2是P(野生型)或缺失；
AA3是T(野生型)、C、A、G、Q、E、N、D、R、K、P或缺失；
AA4是S(野生型)或缺失；
AA5是S(野生型)或缺失；
AA6是S(野生型)或缺失；
AA7是T(野生型)或缺失；
AA8是K(野生型)或缺失；
AA9是K(野生型)或缺失；
AA13是Q(野生型)、W或缺失；
AA14是L(野生型)、M、W或缺失；
AA15是E(野生型)、K、D、T、A、S、Q、H或缺失；
AA16是H(野生型)、N或Q或缺失；
AA18是L(野生型)或R、L、G、M、F、E、H、W、K、Q、S、V、I、Y、H、D或T；
AA19是L(野生型)、A、V、I或缺失；
AA20是D(野生型)、T、S M L或缺失；；
AA22是Q(野生型)或F、E、G、A、L、M、F、W、K、S、V、I、Y、H、R、N、D、T、F或缺失；
AA23是M(野生型)、A、W、H、Y、F、Q、S、V、L、T或缺失；
AA27是G(野生型)、K、S或缺失；
AA38是R(野生型)、W或G；
AA39是M(野生型)、L或V；
AA42是F(野生型)或K；
AA51是T(野生型)、I或缺失
AA55是H(野生型)或Y；
AA74是Q(野生型)、N、H、S；
AA80是L(野生型)、F或V；
AA81是R(野生型)、I、D、Y、T或缺失
AA85是L(野生型)或V；
AA86是I(野生型)或V；
AA88是N(野生型)、E或Q或缺失；
AA89是I(野生型)或V；
AA91是V(野生型)、R或K；
AA92是I(野生型)或F；
AA97是K(野生型)或Q；
AA104是M(野生型)或A；
AA109是D(野生型)、C或具有激活的侧链的非天然氨基酸；
AA113是T(野生型)或N；
AA125是C(野生型)、A或S；
AA126是Q(野生型)或H、M、K、C、D、E、G、I、R、S或T；
和/或
AA130是S(野生型)、T或R。
2.如权利要求1所述的hIL2直向同源物，其中所述hIL2直向同源物包括在第AA15、AA16、AA19、AA20和AA24位的修饰。
3.如权利要求2所述的hIL2直向同源物，其中所述hIL2直向同源物进一步在选自下组的一个或多个位置包含氨基酸取代：L12、Q13、H16、L19、D20、M23、R81、D84、S87、N88、V91、I92和E95。
4.如权利要求3所述的IL2直向同源物，其中所述一个或多个取代选自下组：Q74N、Q74H、Q74S、L80F、L80V、R81D、R81T、L85V、I86V、I89V和/或I92F。
5.如权利要求3所述的IL2直向同源物，其中所述一个或多个氨基酸取代选自以下氨基酸取代组：
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A L80F-R81D-L85V-I86V-I92F]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126M]；或
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126M]。
6.如权利要求2所述的IL2直向同源物hIL2直向同源物，其中所述hIL2直向同源物进一步包括位于选白下组的一个或多个位置的氨基酸取代：S4、K8、K9、T10、Q11、Q13、N26、N29、N30、N30、Y31、K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、M46、K48、K49、K54、E61、E62、K64、P65、E67G、E68、V69、N71、L72、Q74 S75、K76、H79、I89、N90、I92、S99、T101、F103、Y107、I114、I128和T133。
7.如权利要求6所述的IL2直向同源物，其中所述一个或多个取代选自下组：S4P、K8R、K9T、T10A、Q11R、Q13R、N26D、N29S、N30S、N30D、N30T、Y31H、Y31C、K35R、T37A、T37R、M46L、K48E、K49R、K49E、K54R、E61D、K64R、E67G、E68D、V69A、N71T、N71A、N71R、A73V、Q74P S75P、K76E、K76R、H79R、I89V、N90H、I92T、S99P、T101A、F103S、I114V、I128T、T133A和T133N。
8.如权利要求6所述的IL2直向同源物，其中所述一个或多个氨基酸取代选自以下氨基酸取代组：
[R38A-F42A-Y45A-E62A]；[F42A-Y45A-L72G]；[V69A，Q74P]；[V69A，Q74，T101A]；[V69A，Q74P，I128T]；[N30D，V69A，Q74P，F103S]；[K49E，V69A，A73V，K76E]，[V69A，Q74P，T101A，T133N]；[N30S，V69A，Q74P，I128A]；[N30S，V69A，Q74P，I128T]；[K9T，Q11R，K35R，V69A，Q74P]，[A1T，M46L，K49R，E61D，V69A，H79R]；[K48E，E68D，N71T，N90H，F103S，I114V]；[S4P T10A，Q11R，V69A，Q74P，T133A]；[N30S，Y31H，K35R，K48E，V69A，Q74P，I92T]；[N30S，E68D，V69A，N71A，Q74P，S75P，K76R，N90H]；[N30S，Y31C，T37A，V69A，A73V，Q74P.H79R，I128T]，[N26D，N29S，N30S，K54R，E67G，V69A，Q74P，I92T]；[K8R，Q13R，N26D，N30T，K35R，T37R，V69A，Q74P，I92T]，[N29S，Y31H，K35R，T37A，K48E，V69A，N71R，Q74P，I39V]和[T41P-T51P]。
9.如权利要求2所述的IL2直向同源物，其中所述hIL2直向同源物进一步在选自下组的一个或多个位置包含氨基酸取代：Q11、L18、Q22、E110、N119、T123、Q126、S127、Q126、S127、I129、S130和T133。
10.如权利要求9所述的hIL2直向同源物，其中所述hIL2直向同源物进一步在选自下组的一个或多个位置包括氨基酸取代：L18R、L18G、L18M、L18F、L18E、L18H、L18W、L18K、L18Q、L18S、L18V、L18I、L18Y、L18H、L18D、L18T、Q22E、Q22E、Q22E、Q22E、、Q22G、Q22E、、Q22A、Q22L、Q22M、Q22F、Q22W、Q22K、Q22S、Q22V、Q22I、Q22Y、Q22H、Q22R、Q22N、Q22D、Q22T、Q22F、Q126H、Q126M、Q126K、Q126C、Q126D、Q126E、Q126G、Q126I、Q126R、Q126S或Q126T。
11.如权利要求1所述的hIL2直向同源物，其中所述hIL2直向同源物包含以下氨基酸修饰组之一：
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22E-M23A]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-M23A]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-M23A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-M23A-Q126K]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126K]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q126K]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126K]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-M23A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-M23A-Q126K]；
[E15S-H16Q-L18R-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126K]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126M]；
[desAlal-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L85V-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L85V-Q126H]；或
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V-Q126M]。
12.如权利要求1所述的hIL2直向同源物，其中所述hIL2直向同源物选自下组：SEQ IDNO：5-138。
13.如权利要求1所述的hIL2直向同源物，其中所述hIL2直向同源物可操作地连接至至少一个运载体分子。
14.如权利要求13所述的hIL2直向同源物，其中运载体分子独立地选自下组：水溶性聚合物、IgG的Fc结构域、糖和/或白蛋白。
15.如权利要求14所述的hIL2直向同源物，其中至少一个运载体分子是聚乙二醇(PEG)。
16.如权利要求14所述的hIL2直向同源物，其中至少一个运载体分子是聚乙二醇(PEG)。
17.如权利要求14所述的hIL2直向同源物，其中所述hIL2直向同源物包括结构：
[PEG]-[接头]n-[hoIL2]
其中n＝0或1且hoIL2是人正交IL2多肽变体。
18.如权利要求17所述的hIL2直向同源物，其中所述PEG具有5kDa至80kDa之间的分子量。
19.如权利要求17所述的hIL2直向同源物，其中所述PEG具有约40kDa的分子量。
20.如权利要求19所述的hIL2直向同源物多肽，其中所述hoIL2是IL2多肽变体，其包括氨基酸取代组
-[desAlal-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]。
21.如权利要求19所述的hIL2直向同源物多肽，其中所述hoIL2是IL2多肽变体，氨基酸序列为：
PTSSSTKKTQLQLSQLLVLLKAILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO：5)。
22.一种核酸序列，其编码如权利要求1中任一项所述的hIL2直向同源物多肽。
23.一种重组载体，其包含权利要求22所述的核酸分子。
24.一种治疗对象患有的疾病、紊乱或病症的方法，通过给予所述对象：
a.工程改造的哺乳动物细胞，其包括编码含有正交hCD122的胞外结构域(ECD)的跨膜受体分子的核酸序列，该核酸序列可操作地连接至一个或多个能够作用于所述跨膜受体分子的ECD的表达和表面呈递的表达控制元件；和
b.给予所述对象治疗有效剂量的权利要求1所述的hIL2直向同源物。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述工程改造的哺乳动物细胞是工程改造的T细胞。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述工程改造的T细胞是CAR-T细胞。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述hIL2直向同源物是权利要求12所述的hIL2直向同源物。
28.如权利要求24所述的方法，其中所述hIL2直向同源物是权利要求17所述的。
29.一种制备工程改造的T细胞产品的方法，所述T细胞产品包括至少20％的hoCD122 T细胞，所述方法包括步骤：
a.从哺乳动物对象分离T细胞群；
b.将所述离体分离的T细胞群与重组载体接触，所述重组载体包括编码hoCD122的核酸序列，其可操作地连接至一个或多个表达控制序列，使得在允许所述重组载体被T细胞摄取的情况下，促进在哺乳动物T细胞中的表达；
c.将所述分离的T细胞群接触有效量的如权利要求1所述的hIL2直向同源物。
30.如权利要求29所述的过程的细胞群产品，其中所述细胞群至少20％工程改造的hoCD122 T细胞。
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