CN114173804A

CN114173804A - Mps修饰肽及其用途

Info

Publication number: CN114173804A
Application number: CN202080046922.XA
Authority: CN
Inventors: 吴雷恩; 陈晋贤; 大卫·C·杨
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2019-05-17
Filing date: 2020-05-15
Publication date: 2022-03-11
Also published as: EP3969033A1; TW202110874A; EP3969033A4; US20220267390A1; CA3140129A1; WO2020236615A1

Abstract

本发明提供了一种分离的多肽疗法，还提供了编码所述多肽的多核苷酸和结合所述多肽的抗体。进一步提供了治疗和诊断用途。

Description

MPS修饰肽及其用途

政府支持声明

本发明是在NIH/NHLBI授予的第R01HL077902号政府资助下完成的。因此，美国政府对本发明享有一定的权利。

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C. § 119(e)要求2019年5月17日提交的美国临时申请第62/849637号的优先权，其内容通过引用整体并入本申请。

序列表

本申请包括序列表，并在此通过引用整体并入。该ASCII副本创建于2020年5月14日，命名为060933-0740_SL.txt，大小为41,917字节。

背景技术

MARCKS蛋白的鉴别可追溯到1982年，当时发现大鼠脑神经末梢中的87kDa酸性蛋白可通过激活PKC由钙和钙调蛋白调节（Wu, W.C. et al. (1982) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 79(17):5249-5253）。随后，该蛋白质被正式命名为豆蔻酰化富含丙氨酸的激酶C底物（MARCKS或MARKS）（Albert, K.A. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83(9):2822-2826）。MARCKS在各种物种和组织中广泛表达（Albert, K.A. et al. (1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(20):7046-7050；Stumpo, D.J. et al. (1989) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 86(11):4012-4016），而MARCKS家族的另一个成员，MARCKS相关蛋白（MRP，也称为MacMARKS，F52或MLP），是一种20 kDa的蛋白，在脑、生殖组织和巨噬细胞中高度表达（Aderem, A. (1992) Trend. Biochem. Sci. 17(10):438-443；Blacksher,P.J. (1993) J. Biol. Chem. 268:1501-1504）。与MARCKS相似，MRP也包含相同的三个进化保守结构域：N端豆蔻酰化结构域、多重同源2（MH2）结构域和效应器结构域（ED）。功能未知的MH2结构域类似于阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体的细胞质尾部。蛋白质磷酸化发生在ED结构域的Ser^159/163处。N末端（豆蔻酰化）和ED（磷酸化或非磷酸化）之间的结合对于控制这些分子与膜的结合至关重要。

本发明提供了一种分离的多肽或MPS多肽，其包含选自SEQ ID NO: 45或40-59的氨基酸序列或其每一个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。一方面，所述分离的多肽的等效物包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：与所述分离的多肽具有至少80%序列同一性的多肽，或由与编码所述分离的多肽或其互补序列的分离的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽，或由与编码选自SEQ ID No. 45或40-59的氨基酸序列的多核苷酸具有至少80%的序列同一性的多核苷酸编码的多肽。一方面，等效多肽与所述分离的多肽具有至少80%的序列同一性，或由与编码分离的多肽或其互补序列的分离的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽，或由与编码氨基酸序列的多核苷酸具有至少80%序列同一性的多核苷酸编码的多肽，并且在D氨基酸残基处未被取代，且保留了D氨基酸。

在另一方面，所述分离的多肽或其等效物包含不超过51个氨基酸，或基本上由其组成，或由其组成。在另一方面，所述分离的多肽或其等效物包含不超过35个氨基酸，或基本上由其组成，或由其组成。在进一步的方面，所述分离的多肽的等效物包含以下一个或多个，或基本上由其组成，或由其组成：可操作地连接的氨基酸序列，以促进分离的多肽进入细胞；靶向多肽或赋予所述多肽稳定性的多肽。

进一步提供了编码上述多肽的分离的多核苷酸、多核苷酸的互补序列及其各自的等效物。

还公开了一种载体，包含本发明的分离的多核苷酸中的一个或多个和任选的与分离的多核苷酸可操作地连接以进行复制和/或表达的调控序列，或基本上由其组成，或由其组成。在一个特定的方面，所述载体是AAV载体（腺相关病毒载体）。本文进一步公开了一种宿主细胞，其进一步包含本发明的分离的多肽、分离的多核苷酸或载体中的一种或多种。所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞。

本文提供了组合物，包含本载体和发明的分离的多肽、分离的多核苷酸、载体或宿主细胞中的一种或多种，或基本上由其组成，或由其组成。一方面，所述载体是药学上可接受的载体。另一个方面，本发明的组合物可根据预期用途进一步包含附加的治疗药物，例如化疗剂或药物，或抗纤维化剂或药物，或基本上由其组成，或由其组成。抗纤维化剂或药物的非限制性示例包括吡非尼酮（pirfenidone ）和尼达尼布（nintedanib）。化学治疗剂或药物的非限制性示例包括例如酪氨酸激酶抑制剂（TKI）（如VEGFR）、基于铂的药物（如顺铂）、或靶向EGFR的药物或药剂。

本文所公开的组合物可用于如本文所公开的诊断、治疗和筛选方法。其也可用于制备药物。此外，额外的药剂或药物可与相同制剂内的组合物组合，或包含在单独的制剂内，但在适当条件下以治疗有效量组合施用于有需要的对象。所述药物可以在本文所述的治疗方法中。

还提供了在有需要的对象中治疗与纤维化相关的疾病或病症的方法，其包含向对象施用有效量的本发明的分离的多肽或分离的多核苷酸中的一种或多种，或基本上由其组成，或由其组成。一方面，与纤维化相关的疾病或病症选自：肺纤维化、特发性肺纤维化、博来霉素诱导的肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化、皮肤纤维化、成纤维细胞病变、活化的成纤维细胞增殖、炎症或肌成纤维细胞产生。另一方面，治疗方法进一步包含施用有效量的抗纤维化剂或药物，或基本上由其组成，或由其组成。抗纤维化剂或药物的非限制性示例包括吡非尼酮和尼达尼布。

本文还提供了用于以下中的一种或多种的方法：抑制癌细胞生长、治疗癌症、抑制转移、抑制癌干细胞生长、抑制肿瘤细胞转移、或恢复耐药癌细胞对化疗剂的敏感性，所有都是在有需要的对象中，通过向对象施用有效量的本发明的分离的多肽或分离的多核苷酸中的一种或多种。一方面，癌细胞或癌症是淋巴瘤、白血病或实体瘤。另一方面，实体瘤是肺癌、肝癌、肾癌、脑癌、结直肠癌、胰腺癌、骨癌或喉癌类型的癌症。另一方面，治疗方法进一步包含施用有效量的抗癌药物或药剂（其可能是或可能不是MPS肽或编码MPS肽的多核苷酸），或基本上由其组成，或由其组成。另一方面，治疗方法进一步包含施用有效量的化疗药物（例如酪氨酸激酶抑制剂、铂类药物或免疫治疗药物），或基本上由其组成，或由其组成。

在一个特定方面，本文公开了一种用于在有需要的对象中跨过血脑屏障递送本发明的多肽的方法，该方法包含向对象施用有效量的如上所公开的载体，或基本上由其组成，或由其组成。

可以局部或全身给药，例如外用（topical）或通过吸入疗法。全身给药可包括通过雾化、口服、鞘内、外用、直接设置、舌下、静脉内、颅内、吸入治疗、鼻内、阴道或直肠给药。

哺乳动物，如马、鼠、猫、狗或人，可通过本发明的方法进行治疗。

还提供了试剂盒。所述试剂盒包含以下中的一种或多种：本发明的分离的多肽、分离的多核苷酸、载体、细胞或组合物和使用说明书，或基本上由其组成，或由其组成。一方面，说明书叙述了使用本文公开的分离的多肽、分离的多核苷酸、细胞、载体或组合物的方法。

附图说明

图1A和1B：IPF成纤维细胞中MARCKS的上调。（图1A）使用IPF成纤维细胞分析数据集（GSE21369和GSE2052）进行计算分析的图形表示。（图1B）与GSE2052中正常成纤维细胞相比，IPF中MARCKS的标准化表达。图1C和1D：特发性肺纤维化（IPF）中MARCKS和PIP3水平上调。（图1C）用抗MARCKS和抗PIP3抗体染色的三个正常成纤维细胞和三个IPF成纤维细胞中MARCKS和PIP3的表达水平。Tritc结合的MARCKS、FITC结合的PIP3和细胞核复染的DAPI在共聚焦激光扫描显微镜下可视化。比例尺：10µm。（图1D）MARCKS和PIP3的量化细胞荧光水平。用ImageJ量化和计算PIP3和MARCKS信号强度的校正总细胞荧光。

图2：IPF成纤维细胞中上调的MARCKS。左侧，实时RT_-qPCR测量的MARCKS mRNA的表达（n=5；*p<0.05 vs 正常-1）。右侧，通过蛋白质印迹证实了MARCKS蛋白及其磷酸化。

图3：通过伤口愈合试验（n=3）确定的MARCKS敲除对主要IPF成纤维细胞运动的影响。

图4A-4B：使用MPS肽的MARCKS抑制降低了主要IPF成纤维细胞的运动性（图4A）和集落形成能力（图4B），n=4；*，p<0.05。

图5：使用抗pSer159/163 MARCKS抗体在正常肺组织（左，n=10）和来自未接受（中，n=15）或接受（右，n=3）尼达尼布治疗患者的IPF样本中获得的代表性图像。

图6：左侧，经生理盐水或博来霉素处理的肺组织中磷酸化MARCKS（浅灰色）和α-SMA（深灰色）的代表性免疫荧光图像。DAPI（蓝色）：细胞核染色，右侧，阳性染色细胞的定量（n=3）。

图7A-7B：（图7A）用对照肽或MPS肽（100µM）处理48小时后，从生理盐水或博来霉素处理的小鼠中分离的肺成纤维细胞中磷酸化MARCKS、磷酸化AKT和α-SMA表达的蛋白质印迹分析。（图7B）MPS肽对从生理盐水（mFb生理盐水）或博来霉素处理（mFb博来霉素）的小鼠中分离的肺成纤维细胞的细胞活力的影响（n=4；*，p<0.05）。

图8：博来霉素诱导的肺纤维化和MPS治疗中的小鼠的体重。

图9：左侧，经过各种处理的小鼠肺的代表性Masson三色染色切片。放大倍数：4倍（顶部）和20倍（底部）。右侧，来自Masson三色染色小鼠肺切片的半定量纤维化评分。纤维化评分表示为每个高倍视野中阳性染色面积的百分比。使用ImageJ软件对每个肺的6到12个高倍视野进行分析。*，p<0.05（n=5）。

图10A-10C：（图10A）MARCKS磷酸化位点结构域（PSD）上的PIP2结合基序（SEQ IDNO: 12）。图10A公开了MH域SEQ ID NO: 86。（图10B）MPS肽与生物素标记PIP2结合的生物层干涉分析。（图10C）经PBS或MPS处理的IPF成纤维细胞中PIP3的水平。*与PBS相比，p<0.05（n=3）。

图11A-11B：（图11A）使用尼达尼布（1000 nM）和/或MPS（100 µM）对主要IPF成纤维细胞中的α-SMA和磷酸化AKT进行蛋白质印迹分析48小时。（图11B）尼达尼布治疗后激活PI3K/AKT通路的拟议模型。箭头：直接相互作用。

图12A-12E：（图12A-12B）MPS肽与尼达尼布对从两名IPF患者中分离的成纤维细胞的组合效应。用不同浓度的尼达尼布（62.5-2000nM）和/或MPS肽（6.25-200 µM）分别处理细胞72小时。单次（划线）或联合（划线）处理后，通过MTT测定细胞活力。（图12C）利用Chou和Talalay CI（组合指数）法，使用Calcusyn软件评估尼达尼布和MPS肽之间的治疗相互作用。灰线，MPS肽和药物组合的加性效应表示为CI=1。（图12D）用1 µM 尼达尼布、100 µM MPS肽或1 µM 尼达尼布和100 µM MPS肽的组合单独处理细胞。48小时后，通过台盼蓝排斥试验测定细胞活力（n+3；*，p<0.05）。（图12E）显示所选多肽及其对应的序列ID号。

图13：该表显示了MPS衍生物的序列（分别为SEQ ID NO: 48-54、40-42、45和47，按出现顺序排列）。肺癌细胞的IC₅₀（半数最大抑制浓度；µM）值。图13还显示了各种MPS相关肽的CLUSTAL O（1.2.4）多序列比对。以红色/粗体标记的残基是氨基酸的D异构体（SEQ IDNO: 57、48-54、40-42、45和47，按出现顺序排列）。

图14：MPS-12042（SEQ ID NO: 45）与已知酪氨酸激酶抑制剂（TKL）对治疗IPF成纤维细胞的比较。正常的和IPF肺成纤维细胞均用各种药物处理。72小时后，对细胞进行MTT分析并测定每种药物的IC₅₀。

图15：左侧，来自LG704的肿瘤球RNA序列显示325个基因因MPS处理而显著改变。然后用GSEA对这些基因进行分析，以确定哪些功能途径最受MARCKS的影响。右侧，与MARCKS活性相关的癌症干性标记物的热图。

图16：顶部，未添加（左）和添加10%CSE（右）的非粘附性三维培养中肿瘤球的相衬显微照片。底部，上述细胞中mRNA表达的RT-qPCR分析。

图17A-17B：（图17A）球体形成实验，用于评估MARCKS磷酸化对具有野生型或PSD突变（S159/163A）MARCKS异位表达的细胞中烟雾介导的干性的影响。（图17B）上述细胞中干性标记物的WB分析。

图18A-18C：（图18A）球体形成实验，用于评估MPS肽对烟雾介导的干性抑制作用。（图18B）肿瘤球数量和大小的量化。（图18C）上述肿瘤球mRNA表达的RT-qPCR分析。

图19显示了靶向磷酸化MARCKS、与PIP2结合并抑制PIP3的产生的MARCKS模拟肽（MPS）。用PBS或100 µM MPS肽处理多个IPF肺成纤维细胞12小时，然后使用抗PIP3抗体进行免疫细胞化学。显示了代表性图像（n=3）。比例尺：20 µm。

图20A和20B显示了MPS肽对体内肺纤维化的抑制作用。C57BL/6小鼠在气管内注射一次生理盐水或博来霉素（50 ml生理盐水中33 μg，n=5）9天后，每两天腹腔注射PBS、尼达尼布（28 mg/kg）、MPS肽（28 mg/kg）或MPS-12042（7 mg/kg）。（图20A）磷酸化MARCKS（Ser159/163）和磷酸化AKT（Ser473）（n=6）的代表性Masson三色和免疫组织化学染色。（图20B）通过羟脯氨酸ELISA测定上述小鼠左肺中的羟脯氨酸水平（平均值±标准差，*p<0.05）。

详细说明

在描述组合物和方法之前，应当理解，本发明不限于所述的特定方法、方案、细胞系、分析和试剂，因为它们可能变化。还应理解，本文所使用的术语旨在描述本发明的特定实施例，而并非旨在限制所附权利要求中所述的本发明的范围。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述类似或等效的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法、设备和材料。在本发明中，各种技术出版物均以阿拉伯数字标识，并在权利要求之前提供完整的参考书目。

本文引用的所有技术和专利出版物均通过引用整体并入本文。本文中任何内容均不得被解释为因先前披露早于此类披露而承认该披露无权。

除非另有说明，否则本发明的实践将采用本领域的技术范围的组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术。例如，参见Sambrook andRussell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition；theseries Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology；theseries Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；MacPherson et al.(1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press)；MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach；Harlow and Lane eds.(1999) Antibodies, A Laboratory Manual；Freshney (2005) Culture of AnimalCells: A Manual of Basic Technique, 5th edition；Gait ed. (1984)Oligonucleotide Synthesis；美国专利号4,683,195；Hames and Higgins eds. (1984)Nucleic Acid Hybridization；Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization；Hamesand Higgins eds. (1984) Transcription and Translation；Immobilized Cells andEnzymes (IRL Press (1986))；Perbal (1984) A Practical Guide to MolecularCloning；Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for MammalianCells (Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides ed. (2003) Gene Transfer andExpression in Mammalian Cells和Mayer and Walker eds. (1987) ImmunochemicalMethods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London).

所有数字名称，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值，其以0.1的增量变化（+）或（-）。需要理解的是，尽管并非总是明确指出，所有数字名称前面都有术语“大约”。还应理解，尽管并非总是明确指出，但本文所述试剂仅为示例性试剂，且本领域已知此类试剂的等效物。

定义

如在本发明的说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一”、“一个/一种”和“所述”也包括复数形式。例如，术语“一细胞”包括多个细胞，包括其混合物。

如本文所用，术语“包括”或“包括”旨在表示组合物和方法包括所述元件，但不排除其他元件。“基本由……组成”用于定义组合物和方法时，是指排除对所述目的组合具有任何重要意义的其他元素。因此，基本上由本文所定义的元素组成的组合物不会从分离和纯化方法和医药上可接受的载体（例如磷酸盐缓冲盐、防腐剂等）中排除微量污染物。“由……组成”是指排除多于其他成分的微量元素和用于施用本发明组合物的实质性方法步骤，或生产组合物或达到预期结果的工艺步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的方面在本发明的范围内。

如本文所用的关于核酸（如DNA或RNA）的术语“分离的”是指分别与大分子的天然来源中存在的其他DNA或RNA分离的分子。术语“分离的肽片段”旨在包括不是天然以片段存在且不会在天然状态下发现的肽片段。本文所用的术语“分离的”也用于指从其他细胞蛋白质中分离的多肽和蛋白质，其旨在包括纯化和重组的多肽。在其他实施例中，术语“分离的”是指从要素、细胞和其他中分离，其中所述细胞、组织、多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段通常在性质上相关。例如，分离的细胞是从具有不同表型或基因型的组织或细胞中分离出来的细胞。如本领域技术人员显而易见的，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”以将其与天然存在的对应物区分开来。

本文使用的术语“结合”旨在包括可使用例如杂交分析检测的分子之间的相互作用。这些术语还旨在包括分子间的“结合”相互作用。例如，相互作用可以是自然界中的蛋白质—蛋白质、抗体—蛋白质、蛋白质—核酸、蛋白质—小分子或小分子—核酸。这种结合可以形成包含相互作用分子的“复合物”。“复合物”是指通过共价或非共价键、相互作用或作用力将两个或多个分子结合在一起。

术语“MARCKS”是指官方命名为豆蔻酰化富含丙氨酸的激酶C底物（MARCKS或MARKS）的蛋白质（Albert, K.A. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83(9):2822-2826）。MARCKS在各种物种和组织中广泛表达（Albert, K.A. et al. (1987) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 84(20):7046-7050；Stumpo, D.J. et al. (1989) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86(11):4012-4016），而MARCKS家族的另一个成员，MARCKS相关蛋白（MRP，也称为MacMARKS，F52或MLP），是一种20 kDa的蛋白，在脑、生殖组织和巨噬细胞中高度表达（Aderem, A. (1992) Trend. Biochem. Sci. 17(10):438-443；Blacksher, P.J. (1993)J. Biol. Chem. 268:1501-1504）。与MARCKS相似，MRP也包含相同的三个进化保守结构域；N端豆蔻酰化结构域、多重同源2（MH2）结构域和效应器结构域（ED）。功能未知的MH2结构域类似于阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体的细胞质尾部。蛋白质磷酸化发生在ED结构域的Ser159/163处。N末端（豆蔻酰化）和ED（磷酸化或非磷酸化）之间的结合对于控制这些分子与膜的结合至关重要。

一方面，本发明的MPS多肽包含至少6个氨基酸且不超过51个氨基酸，或基本上由其组成，或由其组成。另一方面，所述多肽为至少6个氨基酸且不超过51个氨基酸，或至少45个氨基酸，或40个氨基酸，或35个氨基酸，或30个氨基酸，或不超过25个氨基酸，或不超过20个氨基酸，或者不超过15个氨基酸，或其每一个的等效物。一方面，等效物是其中一个或多个氨基酸已被保守氨基酸取代的多肽。

MPS多肽及其等效物具有“生物活性”或生物能力，从而：抑制MARCKS的表达，以预防、减少、延迟、抑制或压制与MARCKS磷酸化和/或与细胞膜分离和/或PIP2隔离效应相关的疾病或病症，或PIP3产生，或AKT激活，或炎症、纤维化或活化的成纤维细胞增殖，或肌成纤维细胞的产生和分化，或转化生长因子β（TGF-β）信号通路，或癌症、肿瘤细胞生长、实体肿瘤细胞生长或转移，或癌症干细胞生长、癌症干性或肿瘤细胞转移；以及任选地用于促进凋亡或恢复耐药癌细胞对化疗药物的敏感性。一方面，MPS多肽和等效物具有预防、减少、延迟、抑制或压制与肺纤维化、特发性肺纤维化或吸烟、博来霉素诱导的肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化、皮肤纤维化、成纤维细胞病、活化的成纤维细胞增殖、炎症或肌成纤维细胞产生相关的疾病或病症的能力。另一方面，MPS多肽及其等效物具有预防、减少、延迟、抑制或压制与淋巴瘤、白血病或实体瘤或癌症（癌或肉瘤）相关的疾病或病症的能力。实体瘤的非限制性示例包括癌症、肺癌、肾癌、卵巢癌、脑癌、结直肠癌、胰腺癌、骨癌或喉癌。一方面，“治疗”不包括防范或预防。

术语“多肽”与术语“蛋白质”和“肽”可互换使用，在其最广义上指两个或多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或拟肽的化合物。亚基可以通过肽键连接。在另一实施例中，亚基可通过其他键连接，例如酯、醚等。一方面，多肽包含非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸以及天然存在氨基酸的D和L光学异构体、氨基酸类似物和拟肽。如果肽链是短的，则由三个或更多氨基酸组成的肽通常称为寡肽。如果肽链是长的，则所述肽通常称为多肽或蛋白质。如本文所用，术语“肽片段”也指肽链。

短语“等效多肽”或“等效肽片段”是指蛋白质、多核苷酸或多核苷酸编码的肽片段，其与编码示例性多肽的多核苷酸或编码示例性多肽的多核苷酸的互补序列在高严格度条件下杂交，和/或在体内表现出类似的生物活性，例如，与标准或对照生物活性相比约100%，或超过90%，或超过85%，或超过70%。本发明范围内的其他实施例通过具有大于60%，或大于65%，或大于70%，或大于75%，或大于80%，或大于85%，或大于90%，或大于95%，或者大于97%，或大于98%或99%的序列同源性。在适当的条件下，同源性百分比可以通过运行例如BLAST 等程序进行序列比较来确定。一方面，程序在默认参数下运行。

“保守氨基酸取代”是指将被具有相似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸残基。本领域已定义具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链（例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链（例如，天冬氨酸、谷氨酸）、不带电荷的极性侧链（例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非极性侧链（例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、β支链侧链（例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳香侧链（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基优选地被来自相同侧链家族的另一氨基酸残基取代。在另一实施例中，氨基酸串可被在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同的结构相似的串取代。

下表提供了保守氨基酸取代的非限制性示例，其中0或更高的相似性分数表示两种氨基酸之间的保守取代。

术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性示例：基因或基因片段（例如探针、引物或EST）、外显子、内含子、信使RNA（mRNA）、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、RNAi、siRNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则可在多核苷酸组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可被非核苷酸成分中断。聚合后可进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记物的元件共轭，其一方面是多核苷酸和标记物的非自然发生的组合。该术语也指双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则本发明的任何多核苷酸实施例均包含双链形式和已知的或预测的构成双链形式的两种互补单链形式中的一种。

多核苷酸由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤（A）；胞嘧啶（C）；鸟嘌呤（G）；胸腺嘧啶；当多核苷酸是RNA时，尿嘧啶（U）代替胸腺嘧啶。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母顺序表示。这种字母顺序表示可以输入到具有中央处理单元的计算机的数据库中，并用于生物信息学应用，例如功能基因组学和同源性搜索。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是同义词，是指两个肽或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可以通过比较每个序列中的一个位置来确定，该位置可以为了比较而对齐。当比较序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸占据时，分子在该位置是同源的。序列之间的同源度是序列共享的匹配或同源位置数量的函数。“不相关的”或“非同源的”序列与本发明的其中一个序列具有小于40%的同一性，或小于25%的同一性。

多核苷酸或多核苷酸区域（或多肽或多肽区域）与另一序列具有一定百分比（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%）的“序列同一性”意味着，当对齐时，在比较两个序列时，该百分比的碱基（或氨基酸）是相同的。可使用本领域已知的软件程序，例如Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols在Molecular Biology中所述的软件程序，来确定该比对和同源性百分比或序列同一性。优选地，使用默认参数对齐。一种对齐程序是BLAST，使用默认参数。特别是，程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传代码=标准；过滤器=无；股=两股；截止值=60；期望=10；矩阵= BLOSUM62；描述=50个序列；排序方式=高分；数据库=非冗余，GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank – CDS –translations + SwissProtein + SPupdate + PIR。有关这些计划的详细信息，请访问以下网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi，最后访问日期为2007年11月26日。等效多核苷酸是指具有特定百分比同源性和/或编码具有相同或相似生物活性的多肽的多核苷酸。

“基因”是指包含至少一个开放阅读框（ORF）的多核苷酸，其能够在转录和翻译后编码特定多肽或蛋白质。本文所述的任何多核苷酸或多肽序列都可用于识别与其相关的基因的较大片段或全长编码序列。本领域技术人员已知分离较大片段序列的方法。

术语“表达”是指产生基因产物，如RNA或多肽或蛋白质。

如本文所用，“表达”是指多核苷酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸来自基因组DNA，则表达可包括真核细胞中mRNA的剪接。

“基因产物”或“基因表达产物”是指基因转录时的RNA或基因转录和翻译时产生的氨基酸（例如，肽或多肽）。

用于多核苷酸的术语“编码”是指被称为“编码”多肽的多核苷酸，如果在其天然状态下或当由本领域技术人员熟知的方法操作时，其可被转录和/或翻译以产生多肽和/或其片段的mRNA。反义链是这种核酸的互补序列，可以从中推导出编码序列。

申请人在本文中提供了用于下述基因和蛋白质转运和表达技术的多肽和/或多核苷酸序列。应当理解，尽管并非总是明确说明，本文提供的序列可用于提供表达产物以及产生具有相同生物学特性的蛋白质的基本相同的序列。这些“等效”或“生物活化”多肽由本文所述的等效多核苷酸编码。当使用默认条件下运行的序列识别方法进行比较时，它们可具有至少60%，或至少65%，或至少70%，或至少75%，或至少80%，或至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%与参考多肽相同的主要氨基酸序列。提供特定多肽序列作为特定实施例的示例。

“基因递送载体”被定义为任何能携带插入的多核苷酸进入宿主细胞的分子。基因递送载体的实例包括脂质体、胶束、生物相容性聚合物，包括天然聚合物和合成聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工病毒包膜；金属颗粒；以及细菌或病毒，例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒、噬菌体、粘粒、质粒、真菌载体和本领域通常使用的其他重组载体，其已被描述为用于在各种真核和原核宿主中表达，并且可用于基因治疗以及简单的蛋白质表达。

可使用基因递送载体将本发明的多核苷酸递送至细胞或组织。如本文所用，术语“基因递送”、“基因转移”、“转导”等是指将外源性多核苷酸（有时称为“转基因”）引入宿主细胞，而与用于引入的方法无关。此类方法包括多种众所周知的技术，例如载体介导的基因转移（例如通过病毒感染/转染，或各种其他基于蛋白质或基于脂质的基因递送复合物）以及促进“裸”多核苷酸递送的技术（例如电穿孔、“基因枪”递送和用于引入多核苷酸的各种其他技术）。引入的多核苷酸可以稳定地或暂时地维持在宿主细胞中。稳定维持通常要求引入的多核苷酸包含与宿主细胞相容的复制源，或整合到宿主细胞的复制子中，例如染色体外复制子（例如，质粒）或核或线粒体染色体。如本领域已知和本文所述，已知许多载体能够介导基因向哺乳动物细胞转移。

如本文所用，术语“载体”是指设计用于在不同宿主之间转移的核酸构建体，包括但不限于质粒、病毒、粘粒、噬菌体、BAC、YAC等。“病毒载体”被定义为重组产生的病毒或病毒颗粒，其包含将在体内、间接体外或体外递送到宿主细胞的多核苷酸。在一些实施例中，质粒载体可从市售的载体制备。在其他实施例中，根据本领域已知的技术，病毒载体可由杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、AAV等生产。在一个实施例中，病毒载体为慢病毒载体。病毒载体的示例包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、甲病毒载体等。基于传染性烟草花叶病毒（TMV）的载体可用于制造蛋白质，并已被报道在烟草叶中表达Griffithsin（O'Keefe et al. (2009) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 106(15):6099-6104）。甲病毒载体，如基于Semliki Forest病毒的载体和基于Sindbis病毒的载体，也已被开发用于基因治疗和免疫治疗。参见，Schlesinger & Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439和Ying et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827。在基因转移由逆转录病毒载体介导的方面，载体构建体是指包含逆转录病毒基因组或其部分的多核苷酸，和感兴趣的基因。关于用于基因转移的载体的现代方法的更多细节，可在例如Kotterman et al. (2015)Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook AnnualReview of Biomedical Engineering 17中找到。包含启动子和可操作地连接多核苷酸的克隆位点的载体是本领域众所周知的。这种载体能够在体外或体内转录RNA，并可从例如Agilent Technologies (Santa Clara, Calif.)和Promega Biotech (Madison, Wis.)等来源购买获得。

“病毒载体”被定义为重组产生的病毒或病毒颗粒，其包含将在体内、间接体外或体外递送到宿主细胞的多核苷酸。病毒载体的示例包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、甲病毒载体等。甲病毒载体，如基于Semliki Forest病毒的载体和基于Sindbis病毒的载体，也已被开发用于基因治疗和免疫治疗。参见，Schlesinger &Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439和Ying et al. (1999) Nat.Med. 5(7):823-827。在基因转移由逆转录病毒载体介导的方面，载体构建体是指包含逆转录病毒基因组或其部分的多核苷酸，以及治疗基因。

如本文所用，“逆转录病毒介导的基因转移”或“逆转录病毒转导”具有相同的含义，是指借助病毒进入细胞并将其基因组整合到宿主细胞基因组中，将基因或核酸序列稳定转移到宿主细胞中的过程。病毒可以通过其正常感染机制进入宿主细胞，或者经过修饰，使其与不同的宿主细胞表面受体或配体结合以进入细胞。如本文所用，逆转录病毒载体指能够通过病毒或病毒样进入机制将外源核酸引入细胞的病毒颗粒。

逆转录病毒以RNA的形式携带其遗传信息；然而，一旦病毒感染细胞，RNA就会被反转录成DNA形式，整合到受感染细胞的基因组DNA中。整合的DNA形式称为前病毒。

在基因转移由DNA病毒载体（例如腺病毒（Ad）或腺相关病毒（AAV））介导的方面，载体构建体是指包含病毒基因组或其部分的多核苷酸和转基因。腺病毒（Ad）是一组特征相对较好的同质病毒，包括50多种血清型。例如，参见国际PCT公开号WO 95/27071。Ad不需要整合到宿主细胞基因组中。重组Ad衍生载体，特别是那些降低野生型病毒重组和产生可能性的载体，也已被构建。参见国际PCT公开号WO 95/00655和WO 95/11984。野生型AAV具有高度传染性和特异性，可整合到宿主细胞基因组中。参见，Hermonat and Muzyczka (1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470和Lebkowski et al. (1988) Mol. Cell.Biol. 8:3988-3996。

包含启动子和可操作地连接多核苷酸的克隆位点的载体是本领域众所周知的。这种载体能够在体外或体内转录RNA，并可从例如Agilent Technologies (Santa Clara,Calif.)和Promega Biotech (Madison, Wis.)等来源购买获得。为了优化表达和/或体外转录，可能需要删除、添加或改变克隆的5'和/或3'未翻译部分，以消除额外的、潜在的不适当替代翻译起始密码子或可能干扰或减少表达的其他序列，无论是在转录还是翻译水平。或者，可以将共有的核糖体结合位点紧接插入起始密码子的5'以增强表达。

基因递送载体还包括DNA/脂质体复合物、胶束和靶向病毒蛋白—DNA复合物。包含靶向抗体或其片段的脂质体也可用于本发明的方法中。为了增强对细胞的递送，本发明的核酸或蛋白质可与结合细胞表面抗原的抗体或其结合片段共轭。除了向细胞或细胞群递送多核苷酸外，可通过非限制性蛋白质转染技术将本文所述蛋白质直接引入细胞或细胞群，替代地可以增强本发明的蛋白质的表达和/或促进其活性的培养条件是其他非限制性技术。

术语“培养”是指细胞、组织或生物体在各种培养基上或培养基中的体外繁殖。应当理解，在培养基中生长的细胞的后代可能与亲代细胞不完全相同（即，形态学、遗传学或表型）。

如本文所用，术语“抗体”以最广泛的含义使用，具体包括全长单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（例如，双特异性抗体）和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性。如本文所用，术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同型的抗体或免疫球蛋白、保留与抗原特异性结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fab'，F(ab)₂、Fv、scFv、dsFv、Fd片段、dAb、VH、VL、VhH和V-NAR结构域；微型体、双岩、三体、四体和kappa体；由抗体片段和一个或多个分离CDR或功能互补位形成的多特异性抗体片段；嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体和包含抗体和非抗体蛋白的抗原结合部分的融合蛋白。免疫球蛋白分子的重链和轻链可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体（Ab）的恒定区可能介导免疫球蛋白与宿主组织的结合。

如本文所用，“单克隆抗体”是指从基本上均一同质的抗体群中获得的抗体。单克隆抗体具有高度特异性，因为每个单克隆抗体都针对抗原上的单个决定簇。抗体可以用例如放射性同位素、产生可检测产物的酶、荧光蛋白等可检测地标记物。抗体可进一步共轭到其他部分，例如特异性结合对的成员，例如生物素（生物素—亲和素特异性结合对的成员）等。抗体也可结合至固体支持物，包括但不限于聚苯乙烯板或珠等。

单克隆抗体可使用本领域已知的杂交瘤技术或重组DNA方法生产。生产或选择抗体的替代技术包括淋巴细胞体外暴露于感兴趣的抗原，以及在细胞、噬菌体或类似系统中筛选抗体展示库。

如本文所用，术语“人类抗体”旨在包括具有源自人类种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区域的抗体。本发明的人类抗体可包括不由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基（例如，通过体外随机或位点特异性诱导或体内体细胞突变引入的突变）。然而，如本文所用，术语“人类抗体”并不旨在包括其中源自另一哺乳动物物种（例如小鼠）的种系的CDR序列已被移植到人类框架序列上的抗体。因此，如本文所用，术语“人类抗体”是指其中蛋白质的基本上每一部分（例如，CDR、框架、C_L、C_H结构域（例如，C_H1、C_H2、C_H3）、铰链（VL、VH））在人类中基本上是非免疫原性的，仅具有微小的序列变化或变异。类似地，特定的灵长类动物（猴子、狒狒、黑猩猩等）、啮齿动物（小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、仓鼠等）和其他哺乳动物的抗体指定此类物种、亚属、属、亚科、科特异性抗体。此外，嵌合抗体包括上述任何组合。对于未经修饰的抗体，这种改变或变异任选地且优选地保留或降低人类或其他物种的免疫原性。因此，人类抗体不同于嵌合抗体或人源化抗体。需要指出的是，人类抗体可以由能够表达功能重排的人类免疫球蛋白（例如，重链和/或轻链）基因的非人类动物或原核或真核细胞产生。此外，当人类抗体为单链抗体时，其可包含在天然人类抗体中未发现的连接肽。例如，Fv可包含连接肽，例如连接重链可变区和轻链可变区的2至约8个甘氨酸或其他氨基酸残基。这种连接肽被认为是人源的。

如本文所用，如果抗体是从使用人类免疫球蛋白序列的系统获得的，例如通过免疫携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠，或通过筛选人类免疫球蛋白基因库，则人类抗体是“源自”特定种系序列的。通过将人类抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，可以识别“源自”人类种系免疫球蛋白序列的人类抗体。所选人类抗体通常在氨基酸序列上与人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90%相同，并且包含与其他物种（例如，小鼠种系序列）的种系免疫球蛋白氨基酸序列进行比较时识别人类抗体为人类的氨基酸残基。在某些情况下，人类抗体的氨基酸序列可能与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少95%，甚至至少96%、97%、98%或99%相同。通常，来自特定人类种系序列的人类抗体与人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列之间的差异不超过10个氨基酸。在某些情况下，人类抗体与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列之间的差异可能不超过5个，甚至不超过4个、3个、2个或1个氨基酸。

“人类单克隆抗体”是指具有单一结合特异性的抗体，其具有源自人类种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。该术语也指重组人类抗体。本文描述了制备这些抗体的方法。

如本文所用，术语“重组人类抗体”包括通过重组方式制备、表达、创造或分离的所有人类抗体，例如从人类免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物（例如，小鼠）或从其制备的杂交瘤分离的抗体，从转化为表达抗体的宿主细胞分离的抗体（例如从转染瘤分离的抗体），从重组、组合人类抗体库分离的抗体，以及通过涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、创造或分离的抗体。这种重组人抗体具有源自人类种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而，在某些实施例中，此类重组人抗体可经受体外诱变（或者，当使用用于人类Ig序列的动物转基因时，体内体细胞诱变），因此重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列虽然源自人类种系VH和VL序列并与之相关，但在体内可能不会自然存在于人类抗体种系库中的序列。本文描述了制备这些抗体的方法。

如本文所用，嵌合抗体是其轻链和重链基因通常通过基因工程从属于不同物种的抗体可变区和恒定区基因构建的抗体。

如本文所用，术语“人源化抗体”或“人源化免疫球蛋白”是指含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的人/非人嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白（受体抗体），其中来自受体可变区的残基被来自非人类物种（供体抗体）可变区域的残基取代，例如具有所需特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。人源化抗体还可任选地包含免疫球蛋白恒定区（Fc）的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。非人抗体在框架区、恒定区或CDR中含有一个或多个氨基酸，其已被来自人抗体的相应位置的氨基酸取代。一般而言，与相同抗体的非人源化版本相比，人源化抗体预期在人类宿主中产生降低的免疫反应。人源化抗体可以具有对抗原结合或其他抗体功能基本上没有影响的保守氨基酸取代。保守取代包括：甘氨酸—丙氨酸、缬氨酸—亮氨酸—异亮氨酸、苯丙氨酸—酪氨酸、赖氨酸—精氨酸、丙氨酸—缬氨酸、丝氨酸—苏氨酸和天冬酰胺—谷氨酰胺。

如本文所用，术语“抗体衍生物”包含全长抗体或抗体片段，其中一个或多个氨基酸通过烷基化、聚乙二醇化、酰化、酯形成或酰胺形成等进行化学修饰，例如，用于将抗体连接到第二分子。这包括但不限于聚乙二醇化抗体、半胱氨酸聚乙二醇化抗体及其变体。

“组合物”旨在表示活性多肽、多核苷酸或抗体与另一种化合物或组合物的组合，该另一种化合物或组合物是惰性的（例如，可检测的标记物）或活性的（例如，基因递送载体），单独地或与载体组合，在一个实施例中，该载体可以是简单的载体，如盐水或药学上可接受的或如下定义的固体支持物。

“药物组合物”旨在包括活性多肽、多核苷酸或抗体与载体（惰性或活性载体，例如固体支持物）的组合，使该组合物适合于体外、体内或间接体外的诊断或治疗用途。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药用载体，例如磷酸盐缓冲盐溶液、水和乳液，例如油/水或水/油乳液，以及各种类型的润湿剂。所述组合物还可包括稳定剂和防腐剂。关于载体、稳定剂和佐剂的示例，参见Martin (1975) Remington’sPharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton)。

短语“固体支持物”指非水表面，如“培养板”、“基因芯片”或“微阵列”。此类基因芯片或微阵列可通过本领域技术人员已知的许多技术用于诊断和治疗目的。在一种技术中，讲寡核苷酸排列在基因芯片上，以通过杂交方法确定DNA序列，如美国专利号6,025,136和6,018,041所述。本发明的多核苷酸可被修饰为探针，其又可用于检测基因序列。例如，在美国专利号5,968,740和5,858,659中描述了此类技术。探针也可固定在电极表面，用于电化学检测核酸序列，如Kayem等人的美国专利号5,952,172和 Kelley et al. (1999)Nucleic Acids Res. 27:4830-4837所述。

术语“对象/受试者”、“宿主”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用以指代动物，通常指哺乳动物。任何合适的哺乳动物均可通过本文所述的方法、细胞或组合物进行治疗。哺乳动物的非限制性示例包括人类、非人灵长类动物（例如，猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猴子、猕猴等）、家畜（例如，狗和猫）、农场动物（例如，马、牛、山羊、绵羊、猪）和实验动物（例如，小鼠、大鼠、兔子、豚鼠）。在一些实施例中，哺乳动物是人类。哺乳动物可以是任何年龄或处于任何发育阶段（例如，成人、青少年、儿童、婴儿或子宫内的哺乳动物）。哺乳动物可以是雄性也可以是雌性。哺乳动物可以是怀孕的雌性。在一些实施例中，对象是人。在一些实施例中，对象患有或怀疑患有癌症或肿瘤疾病。

术语“细胞”、“宿主细胞”或“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应当理解，此类术语不仅指特定的受试细胞，而且指此类细胞的后代或潜在后代。此类细胞可以是小鼠、大鼠、兔子、猿猴、牛、绵羊、猪、狗、猫、马和灵长类动物（尤其是人类）中的一种或多种。由于突变或环境影响可能会在后代中发生某些修饰，因此这些后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用术语的范围内。

“真核细胞”包括除原核生物之外的所有生命界。它们可以通过膜结合的细胞核轻松区分。动物、植物、真菌和原生生物是真核生物或有机体，其细胞通过内膜和细胞骨架组织成复杂的结构。最典型的膜结合结构是细胞核。除非特别说明，否则术语“宿主”包括真核宿主，例如，酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。真核细胞或宿主的非限制性示例包括猿猴、牛、猪、鼠、大鼠、禽类、爬行动物和人类。

“原核细胞”通常缺少细胞核或任何其他膜结合的细胞器，并分为两个域：细菌和古细菌。除了染色体DNA外，这些细胞还可以在称为附加体的循环中包含遗传信息。细菌细胞非常小，大概相当于动物线粒体的大小（直径约1-2μm，长约10μm）。原核细胞有三种主要形状：杆状、球状和螺旋状。细菌细胞不是像真核生物那样经历复杂的复制过程，而是通过二分裂进行分裂。示例包括但不限于芽孢杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌。

如本文所用，“治疗”对象的疾病是指（1）防止易感或尚未显示病症的对象出现症状或疾病；（2）抑制疾病或阻止其发展或复发；或（3）改善或导致疾病或病症消退。如本领域所理解的，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果（包括临床结果）的方法。出于本技术的目的，有益的或期望的结果可以包括但不限于减轻或改善一个或多个症状、病症（包括疾病）程度的减轻、病症（包括疾病）状态的稳定（即，不恶化），病症（包括疾病）的延迟或减缓、病症（包括疾病）、状态和缓解（无论是部分还是全部）的进展、改善或缓解，无论是否可检测。一方面，防范或预防被排除在术语“治疗”之外。

当疾病为癌症时，以下临床终点是治疗的非限制性示例：肿瘤负担减轻、肿瘤生长减慢、总生存期延长、肿瘤进展时间延长、转移抑制、癌症干性降低或肿瘤转移减少。一方面，治疗不包括预防。当疾病为纤维化时，以下临床终点是治疗的非限制性示例：纤维化组织减少、炎症减少、成纤维细胞病变减少、活化成纤维细胞增殖减少、肌成纤维细胞生成减少、用力肺活量（FVC）下降率降低（其中FVC是肺功能测试期间呼出的总空气量）、FVC相对于基线的绝对和相对增加、FVC（%预测）相对于基线的绝对增加、无进展生存时间的增加、StGeorge呼吸问卷（SGRQ）总分相对于基线的减少（其中，SGRQ是与健康相关的生活质量问卷，分为3个部分：症状、活动和影响，总分（总权重）可以在0到100之间，分数越低表示健康状况越好）、高分辨率计算机断层扫描（HRCT）肺纤维化定量（QLF）评分相对于基线降低（其中QLF评分范围为0-100%，数值越大表示肺纤维化程度越大，被视为更差的健康状况）。以下临床试验中描述了纤维化治疗的非限制性示例临床终点和可用于测量所述临床终点的试验：NCT03733444 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03733444)（上次访问时间为2019年1月9日）、NCT00287729 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00287729)（上次访问时间为2019年1月9日）、NCT00287716 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00287716)（上次访问时间为2019年1月9日）、NCT02503657 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02503657)（上次访问时间为2019年1月9日）、NCT00047645 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00047645)（上次访问时间为2019年1月9日）、NCT02802345 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02802345)（上次访问时间为2019年1月9日）、NCT01979952 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01979952)（上次访问时间为2019年1月9日）、NCT00650091(clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00650091)（上次访问时间为2019年1月9日）、NCT01335464 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01335464)（上次访问时间为2019年1月9日）、NCT01335477 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01335477)（上次访问时间为2019年1月9日）、NCT01366209 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01366209)（上次访问时间为2019年1月9日）。King et al, (2014) N Engl J Med. May 29;370(22):2083-92和Richeldi et al, (2014) N Engl J Med. May 29;370(22):2071-82中描述了纤维化治疗的其他非限制性临床终点和可用于测量所述临床终点的试验。

“癌症干细胞”（“CSC”）是指移植到动物宿主体内时具有自我更新、分化和致瘤能力的肿瘤内细胞或细胞亚群。根据临床证据和实验观察，即使经过许多严酷的治疗，CSC似乎仍能长期维持恶性肿瘤的克隆和生存能力。定义CSC的黄金标准是一系列体内移植，但许多细胞表面标记物（如Sox2、Slug、CD44、CD24和CD133）已被证明可用于研究患者标本和实验系统中的CSC。由microRNA和Wnt/β-连环蛋白、Notch和Hedgehog信号通路组成的调节网络控制CSC的特性。如本文所用，其中一个或多个旨在作为癌症干细胞标记物。图15和17中提供了额外的标记物。这些标记物的表达可以通过本文和本领域已知和描述的方法来检测和监控。

Sox2（性别决定区Y(SRY)-框2）是指一种参与维持胚胎干细胞自我更新和多能性的转录因子。该蛋白在各种人类恶性肿瘤中的表达异常，并且据报道在食管鳞状细胞癌（SCC）中作为癌基因发挥作用。据报道，它还能促进牙髓干细胞（DPSC）的增殖、转移和粘附能力。已知它以PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶）/Akt通路介导的方式参与尤文肉瘤细胞增殖，其失活导致细胞凋亡和G1/S期阻滞。用于检测和监控表达的单克隆抗体可购买获得，例如Sigma-Aldrich和Novus Biological（最后访问日期为2020年5月6日）。

CD133或CD133抗原，也称为prominin-1，在人类中是一种由PROM1基因编码的糖蛋白。它是pentaspan跨膜糖蛋白的成员，其专门定位于细胞突起。用于检测和监控表达的单克隆抗体可购买获得，例如Abcam和ThermoFisher（最后访问日期为2020年5月6日）。

Slug或（SNAI2）是一种转录因子和上皮细胞向间充质细胞转化的诱导因子，在发育和肿瘤侵袭过程中介导细胞转移。Devendra et al. (2014) Stem Cells, Dec. 32(12):3209-3218, 10.1002/stem.1809。本领域已知检测和监控表达的方法，例如，Devendra et al. (2014)，同上。

与术语“治疗”相关的术语“患有”是指被诊断患有或易患疾病的患者或个体。患者也可能被称为“有患病的风险”。所述患者尚未发展出特征性的疾病病理，但由于家族史，已知易患该疾病、遗传上易患该疾病、或被诊断患有易患待治疗疾病的疾病或病症。

“有效量”旨在表示给患者服用或递送的最有可能产生预期治疗反应的化合物或药物的量。根据患者的临床参数（包括但不限于疾病阶段、年龄、性别、组织学、敏感性、毒性和肿瘤复发的可能性）凭经验确定剂量。一方面，“有效量”是治疗有效量。

如本文所用，“癌症”是一种疾病状态，其特征是对象体内存在表现出异常不受控复制的细胞，可与术语“肿瘤”互换使用。在一些实施例中，癌症是实体瘤、肺癌、肝癌、肾癌、脑癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、骨癌、喉癌、淋巴瘤或白血病。

“肿瘤”是一种组织的异常生长，由不受控制的、渐进的细胞增殖引起且没有生理功能。“肿瘤”也称为瘤。

如本文所用，术语“I期癌症”、“II期癌症”、“III期癌症”和“IV期癌症”是指癌症的TNM分期分类。I期癌症通常表明原发肿瘤仅限于起源器官。II期意味着原发肿瘤已扩散到周围组织和淋巴结，立即排出肿瘤区域。III期是指原发肿瘤较大，固定在较深的结构上。IV期意味着原发肿瘤较大，固定在较深的结构上。参见CANCER BIOLOGY, 2nd Ed., OxfordUniversity Press (1987)的第20和21页。

“具有相同癌症”用于将一名患者与另一名患者进行比较，或者将一个患者群体与另一个患者群体进行比较。例如，两名患者或患者群体将各自具有或患有结肠癌。

“给药/施用”可在整个治疗过程中一次、连续或间歇给药。确定最有效的给药方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且会随着用于治疗的组合物、治疗目的、治疗的靶细胞、治疗的疾病和治疗的对象而变化。可由治疗医师选择剂量水平和模式进行单次或多次给药。本领域已知合适的剂型和给药方法。还可以确定给药途径，并且确定最有效给药途径的方法是本领域技术人员已知的，并且将随用于治疗的组合物、治疗目的、治疗对象、靶细胞或组织的健康状况或疾病阶段而变化。给药途径的非限制性示例包括口服给药、鼻腔给药、吸入、注射和局部应用。

本发明的药剂可通过任何适当的给药途径给药以进行治疗。还应理解，优选的途径将随接受者的状况和年龄以及所治疗的疾病而变化。

酪氨酸激酶抑制剂（“TKI”）是一种抑制细胞内酪氨酸激酶作用的药剂（小分子或生物制剂）。酪氨酸激酶是通过信号转导级联激活许多蛋白质的酶。TKI通常用作抗癌药物。酪氨酸激酶抑制剂的示例包括但不限于ErbB: HER1/EGFR（厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、凡德他尼、舒尼替尼、来那替尼）；HER2/neu（拉帕替尼、来那替尼）；RTK III类：C-kit（阿昔替尼、舒尼替尼、索拉非尼）；FLT3（来他替尼）；PDGFR（阿昔替尼、舒尼替尼、索拉非尼）；和VEGFR（凡德他尼、司马沙尼、西地拉尼、阿昔替尼、索拉非尼）；bcr abl（伊马替尼、尼洛替尼、达沙替尼）；Src（博舒替尼）和Janus激酶2（来他替尼）。本领域已知小分子TKI，并在包含oncolink.org/treatment/article.cfmid=452的网址上列出（最后访问日期为2014年7月17日）。

PTK/ZK是一种具有广泛特异性的“小”分子酪氨酸激酶抑制剂，其靶向所有VEGF受体（VEGFR）、血小板衍生生长因子（PDGF）受体、c-KIT和c-Fms。Drevs (2003) Idrugs 6(8):787-794。PTK/ZK是一种靶向药物，通过抑制与VEGF结合的所有已知受体（包括VEGFR-1（Flt-1）、VEGFR-2（KDR/Flk-1）和VEGFR-3（Flt-4））的活性来阻断血管生成和淋巴管生成。PTK/ZK的化学名称为1-[4-氯苯胺基]-4-[4-吡啶基甲基]邻苯二甲酸丁二嗪酯或1-邻苯二甲嗪胺，N-（4-氯苯基）-4-（4-吡啶基甲基）-丁二酸（1:1）。PTK/ZK的同义词和类似物被称为瓦塔拉尼、CGP79787D、PTK787/ZK 222584、CGP-79787、DE-00268、PTK-787、PTK-787A、VEGFR-TK抑制剂、ZK 222584和ZK。

如本文所用，术语“基于铂的药物”旨在表示作为DNA烷基化剂亚类的基于铂的化合物的抗癌药物。此类药物在本领域中是众所周知的，并用于治疗多种癌症，例如肺癌、头颈癌、卵巢癌、结直肠癌和前列腺癌。此类药物的非限制性示例包括卡铂、顺铂、奈达铂、奥沙利铂、四硝酸三铂、沙铂、阿罗铂、洛铂和JM-216。（参见McKeage et al. (1997) J.Clin. Oncol. 201:1232-1237和大体上CHEMOTHERAPY FOR GYNECOLOGICAL NEOPLASM,CURRENT THERAPY AND NOVEL APPROACHES, in the Series Basic and ClinicalOncology, Angioli et al. Eds., 2004）。“奥沙利铂”（Eloxatin®）是一种基于铂的化疗药物，与顺铂和卡铂属于同一家族。它通常与氟尿嘧啶和亚叶酸联合使用，称为FOLFOX，用于治疗结直肠癌。与顺铂相比，环己基二胺被两个胺基取代以提高抗肿瘤活性。氯配体被草酸衍生的草酸双齿取代，以提高水溶性。本领域已知奥沙利铂的等效物，包括但不限于顺铂、卡铂、阿罗铂、洛铂、奈达铂和JM-216（参见McKeage et al. (1997) J. Clin. Oncol.201:1232-1237和大体上CHEMOTHERAPY FOR GYNECOLOGICAL NEOPLASM, CURRENT THERAPYAND NOVEL APPROACHES, in the Series Basic and Clinical Oncology, Angioli etal. Eds., 2004）。

执行本发明的方式

分离的多肽和组合物

本发明提供了一种分离的多肽或MPS多肽，其包含选自SEQ ID NO 40-56、58和59的氨基酸序列或其每一个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。一方面，所述分离多肽包括基本上同源和等效的多肽。一方面，本发明的分离多肽包含不超过51个氨基酸，或基本上由其组成，或由其组成。另一方面，本发明的分离多肽包含不超过35个氨基酸，或基本上由其组成，或由其组成。又一方面，所述多肽为至少6个氨基酸且不超过51个氨基酸，或至少45个氨基酸，或40个氨基酸，或35个氨基酸，或30个氨基酸，或不超过25个氨基酸，或不超过20个氨基酸，或不超过15个氨基酸，或其每一个的等效物。一方面，所述分离的多肽的等效物包含以下多肽，或基本上由其组成，或由其组成：与所述分离多肽具有至少80%序列同一性的多肽，或由与编码所述分离的多肽或其互补序列的分离的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽，或由与选自SEQ ID No 40-56、58和59的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多核苷酸编码的多肽。

高严格杂交条件通常在约60℃下在约1 x SSC中进行。基本上同源和等效的多肽以及基本上同源和等效的多核苷酸是指与以上描述的具有至少80%的同源性、或至少85%的同源性，或至少90%的同源性，或至少95%的同源性，或至少98%的同源性，每个都是如当在默认参数下运行时，使用本领域技术人员已知并在本文中说明的方法来确定的。当使用默认条件下运行的序列识别方法进行比较时，其可以具有至少60%，或至少65%，或至少70%，或至少75%，或至少80%，或至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%与参考多肽相同的主要氨基酸序列，或与参考多核苷酸相同的核酸序列。在一个特定方面，当使用默认条件下运行的序列识别方法进行比较时，其可以具有至少60%，或至少65%，或至少70%，或至少75%，或至少80%，或至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%与参考多肽相同的主要氨基酸序列，或与参考多核苷酸相同的核酸序列。一方面，等效物是其中一个或多个氨基酸已被保守氨基酸取代的多肽。一方面，所述分离多肽具有至少一种经修饰的非天然存在的氨基酸，例如D赖氨酸。

一方面，本发明的MPS多肽包含至少6个氨基酸和不超过51个氨基酸，或基本上由其组成，或由其组成。另一方面，所述多肽为至少6个氨基酸且不超过51个氨基酸，或至少45个氨基酸，或40个氨基酸，或35个氨基酸，或30个氨基酸，或不超过25个氨基酸，或不超过20个氨基酸，或者15个氨基酸，或其每一个的等效物。一方面，等效物是其中一个或多个氨基酸已被保守氨基酸取代的多肽。另一方面，肉豆蔻酸与N末端氨基酸（包括其等效物）共轭或结合，例如，其中所有丝氨酸均被丙氨酸取代。一方面，所述分离的多肽具有至少一种经修饰的非天然存在的氨基酸，例如D赖氨酸。

一方面，如上所述的分离的多肽具有添加到MPS的羧基末端或氨基末端上额外的氨基酸及其每一个的等效物，使得该多肽的长度包含额外的至少10个氨基酸，或至少15个氨基酸，或至少20个氨基酸，或至少25个氨基酸，或至少30个氨基酸，或至少35个氨基酸，或添加的氨基酸多达总共51个氨基酸。

本领域技术人员已知，可对任何肽进行修饰以使其具有改变的性质。本发明的肽片段可被修饰以包括非天然氨基酸。因此，肽可包含D氨基酸、D和L氨基酸的组合以及各种“设计”氨基酸（例如，β-甲基氨基酸、C-α-甲基氨基酸和N-α-甲基氨基酸等）来传递肽的特殊性质。此外，通过在特定偶联步骤分配特定氨基酸，可以生成具有α-螺旋、β转角、β折叠、α转角和环肽的肽。一般认为α-螺旋二级结构或随机二级结构是优选的。一方面，所公开的多肽包含非天然氨基酸。

本领域技术人员已知，可通过不会改变肽的生物功能的一种或多种功能等效的氨基酸取代一种或多种氨基酸来对任何肽进行修饰。一方面，被具有相似固有性质（包括但不限于疏水性、大小或电荷）的氨基酸取代的氨基酸。本领域技术人员已知用于确定要取代的适当氨基酸的方法。非限制性示例包括Layoff et al. (1978) In Atlas of ProteinSequence and Structure Vol. 5 suppl. 2 (ed. MR. Day off), pp. 345-352.National Biomedical Research Foundation, Washington DC描述的经验替代模型；PAM矩阵包括Day-off矩阵 Layoff et al. (1978)，同上，或如Jones et al. (1992)Compute. Appl. Basic. 8:275-282和Gannet et al. (1992) Science 256:1443-1145描述的JET矩阵；如Adak and Hasegawa (1996) J. Mol. Evil. 42:459-468描述的经验模型；如Henrico and Henrico (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919描述的块替换矩阵（BLOSSOM）；如Neil (1987) Molecular Evolutionary Genetics. ColumbiaUniversity Press, New York. 描述的泊松模型；和如Muller et al. (2002) Mol.Biol. Evil. 19:8-13描述的最大似然（ML）法。

因此，另一方面，分离的多肽或肽片段可包含由本文所述的等效多核苷酸编码的“等效”或“生物活化”多肽，或基本上由其组成，或由其组成。当使用默认条件下运行的序列识别方法进行比较时，其可以具有与参考多肽至少60%，或至少65%，或至少70%，或至少75%，或至少80%，或至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%相同的主要氨基酸序列。

分离的多肽或MPS多肽及其等效物具有以下能力：抑制MARCKS的表达，以预防、减少、延迟、抑制或压制与MARCKS磷酸化和/或与细胞膜分离和/或PIP2隔离效应相关的疾病或病症，或PIP3产生，或AKT激活，或炎症、纤维化或活化的成纤维细胞增殖，或肌成纤维细胞的产生和分化，或转化生长因子β（TGF-β）信号通路，或癌症、肿瘤细胞生长、实体肿瘤细胞生长或转移，或癌症干细胞生长、癌症干性或肿瘤细胞转移；以及任选地用于促进凋亡或恢复耐药癌细胞对化疗药物的敏感性。一方面，分离的多肽及其等效物具有预防、减少、延迟、抑制或压制与肺纤维化、特发性肺纤维化或吸烟、博来霉素诱导的肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化、皮肤纤维化、成纤维细胞病、活化的成纤维细胞增殖、炎症或肌成纤维细胞产生相关的疾病或病症的能力。另一方面，分离的多肽及其等效物具有预防、减少、延迟、抑制或压制与淋巴瘤、白血病或实体瘤相关的疾病或病症的能力。实体瘤的非限制性示例包括癌症、肺癌、肾癌、卵巢癌、脑癌、结直肠癌、胰腺癌、骨癌或喉癌。

所述多肽在治疗上可用于抑制或压制实体瘤生长，如体外或体内癌细胞的侵袭、转移、迁移和生存能力。它们还促进细胞凋亡，抑制肿瘤干细胞（如表达CD133+的干细胞）、恶性肿瘤和癌细胞的生长，增加或诱导癌细胞凋亡。

另一方面，进一步提供了一种分离的多肽，其进一步包含以下中的一个或多个，或基本上由其组成，或由其组成，可操作地连接的氨基酸序列，以促进分离多肽进入细胞；和靶向多肽或赋予多肽稳定性的多肽。还提供了一种分离的多肽，其中氨基酸序列包含以下多肽，或基本上由其组成，或由其组成：将多肽靶向特定细胞类型或稳定多肽的可操作地连接的多肽，或进一步包含促进细胞进入的转导结构域或肿瘤靶向域和如本文所述的MPS多肽。

可通过在适当的宿主细胞中表达编码本发明的多肽序列的多核苷酸来制备包含本发明的氨基酸序列的多肽，或基本上由其组成，或由其组成。这可以通过本领域技术人员已知的重组DNA技术的方法来实现。因此，本发明还提供了在真核或原核宿主细胞中重组产生本发明的多肽的方法，其一方面进一步从宿主细胞中分离。本发明的蛋白质和肽片段也可通过使用市售的自动肽合成器（如Perkin Elmer/Applied Biosystems, Inc., Model430A or 431A, Foster City, CA, USA制造的自动肽合成器）进行化学合成获得。合成的蛋白质或多肽可沉淀并进一步纯化，例如，通过高效液相色谱法（HPLC）。因此，本发明还提供了通过提供蛋白质和试剂（例如氨基酸和酶）的序列并以适当的方向和线性序列将氨基酸连接在一起来化学合成本发明的蛋白质的方法。

蛋白质和肽片段可以可操作地连接到转导结构域以促进细胞进入。蛋白质转导为向靶细胞递送治疗性蛋白质提供了基因治疗的替代方案，并且涉及蛋白质转导的方法在本发明的范围内。蛋白质转导是蛋白质从外部环境内化到宿主细胞中的过程。内化过程依赖于能够穿透细胞膜的蛋白质或肽。为了赋予正常非转导蛋白这种能力，可将非转导蛋白融合到转导介导蛋白，如触角肽、HIV-TAT蛋白转导结构域或单纯疱疹病毒VP22蛋白。参见Ford et al. (2001) Gene Ther. 8:1-4。因此，本发明的多肽例如包括可增加诸如稳定性、半衰期、进入细胞的能力和辅助给药（例如，本发明的多肽的体内给药）等能力的修饰。例如，如Schwarze et al. (1999) Science 285:1569-1572中所述，本发明的多肽可包含HIV-TAT蛋白的蛋白质转导域，或基本上由其组成，或由其组成。此外，或替代地，所述多肽包括将多肽靶向待治疗的细胞或组织和/或稳定多肽的氨基酸序列。

另一方面，本发明的任何蛋白质、肽或多核苷酸可与可检测的标记物（例如染料）结合以便于检测。此类化合物的非限制性示例包括放射性同位素、荧光染料、化学发光化合物、染料和蛋白质，包括酶。

多肽可与另一种药物或制剂（例如，可以是或可以不是抗癌药物或制剂的蛋白质、多肽、抗体、抗体片段）结合，例如抗癌药物或制剂，例如TKI、铂类药物或靶向EGFR的药物或制剂。另一方面，所述组合物与MARCKS蛋白、多肽或其片段结合，其中MARCKS片段包含在氨基酸序列上不与本发明的多肽或国际PCT公开号WO 2015/013669和WO 2015/095789中公开的MPS多肽重叠的多肽片段。这些组合物可与载体组合，例如药学上可接受的载体，用于本文所公开的诊断、筛选和治疗方法。

本发明还提供了用于体外和体内使用的药物组合物，其包含治疗有效量的MPS多肽或编码MPS多肽的多核苷酸，或基本上由其组成，或由其组成，在本文提供的方法中，当以小于约 10 微摩尔的摩尔浓度，或小于约9微摩尔，或小于约8微摩尔，或小于约7微摩尔，或小于约6微摩尔，或小于约5微摩尔，或小于约4微摩尔，或小于约3微摩尔，或小于约2微摩尔，或小于约1微摩尔，或小于约0.5微摩尔，或小于约0.25微摩尔浓度应用时，与未接受该组合物的对照相比，导致至少约75%，或至少约80%，或至少约85%，或至少约90%，或至少约95%，或至少约99%的有效性。可通过本领域已知的适当的体外或体内方法来确定比较有效性。

本发明还提供了用于体外和体内使用的组合物，其包含本文所述的分离的多肽或多核苷酸中的一种或多种及其药学上可接受的载体，或基本上由其组成，或由其组成。一方面，所述组合物是用于本发明的治疗方法的药物制剂。另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含所述分离的多肽或多核苷酸，或基本上由其组成，或由其组成。与不接受该组合物的对照相比，当以小于1微摩尔的摩尔浓度用于反应性癌细胞培养物时，其浓度使所述多肽的治疗有效量或所述组合物的药理学剂量引起至少75%、或至少80%、或至少85%、或至少90%，或至少95%，或至少97%的细胞生长减少。

分离的多核苷酸和组合物

本发明还提供了编码上述多肽的分离多核苷酸。一方面，本发明还提供了编码上述多肽的分离的多核苷酸和分离的抗MPS shRNA。本发明的多肽的非限制性示例包括SEQID No. 40-56、58和59及其等效物。本发明还提供了上述确定的序列的互补多核苷酸及其等效物。在中等或高度严格的条件下，可以使用传统杂交来确定互补性。一方面，多核苷酸编码本发明的分离多肽的等效物。另一方面，本文提供了分离的多核苷酸或其互补序列的等效物，其中所述等效物与本发明的多核苷酸具有至少80%的序列同一性。

分离的多核苷酸或其互补序列的等效物包括与编码本发明的分离的多肽的多核苷酸或其与编码分离的多肽或其互补序列的分离的多核苷酸杂交的等效物具有至少80%序列同一性的多核苷酸，或基本上由其组成，或由其组成。还提供了编码基本同源和等效的多肽或肽片段的多核苷酸。基本同源的和等效的是指具有不同程度同源性的那些，例如至少65%，或至少70%，或至少75%，或至少80%，或至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少97%的同源性，如上文所定义，并且编码具有本文所述生物活性的多肽。应当理解，尽管并非总是明确说明，但是基本同源的肽和多核苷酸的实施例旨在用于本发明的每个方面，例如肽、多核苷酸和抗体。

替代地，等效物是由核酸编码的多肽，所述核酸在严格条件下与编码该多肽的核酸或互补序列杂交，或者当多肽、多核苷酸在高度严格条件下与参考多核苷酸或其互补序列杂交。等效多核苷酸在高度严格的条件下与编码本发明多肽或其等效物或其互补序列的多核苷酸杂交。杂交反应可以在不同的“严格性”条件下进行。通常，低度严格杂交反应在约40℃下，在约10 x SSC或同等离子强度/温度的溶液中进行。中度严格杂交通常在约50℃下，在约6 x SSC中进行，高度严格杂交通常在约60℃下进行，在约1 x SSC中。杂交反应也可以在本领域技术人员熟知的“生理条件”下进行。生理条件的一个非限制性示例是细胞中通常存在的温度、离子强度、pH值和Mg²⁺浓度。等效多核苷酸是在严格条件下与参考多核苷酸或参考多核苷酸的互补序列杂交的多核苷酸，一方面，具有与参考多核苷酸相似的生物活性。

另一方面，多核苷酸及其互补序列及其各自的等效物用可检测的标记物或标签（例如染料或放射性同位素）标记，以便于检测。对于本文所公开的诊断和治疗方法，可将多核苷酸插入表达载体并递送至靶细胞（例如癌细胞）。

如本文所用，术语多核苷酸是指DNA和RNA以及修饰的核苷酸。例如，本发明还向这些序列或其补体提供反义多核苷酸链，例如其反义RNA或siRNA（shRNA）。可以使用编码MPS多肽的序列获得反义RNA，本领域普通技术人员已知该方法，其中遗传密码的简并性提供编码相同多肽的多个多核苷酸序列或如Van der Krol et al. (1988) BioTechniques 6:958中描述的方法。

本发明的多核苷酸可使用常规重组技术复制。或者，可以使用PCR技术复制多核苷酸。PCR是美国专利号4,683,195；4,800,159；4,754,065和4,683,202的主题，并在PCR: ThePolymerase Chain Reaction (Mullis et al. eds, Birkhauser Press, Boston(1994))和其中引用的参考文献中进行了描述。此外，本领域技术人员可以使用本文提供的序列和商业DNA合成器来复制DNA。因此，本发明还提供了通过提供多核苷酸的线性序列、适当的引物分子、化学物质（如酶等）及其复制说明，以及化学复制或以正确方向连接核苷酸以获得多核苷酸的说明。在单独的实施例中，进一步分离这些多核苷酸。更进一步地，本领域技术人员可以可操作地将多核苷酸连接到调节序列，以便它们在宿主细胞中表达。将多核苷酸和调控序列插入宿主细胞（原核或真核）进行复制和扩增。这样扩增的DNA可通过本领域技术人员熟知的方法从细胞中分离。本文进一步提供了通过该方法获得多核苷酸的方法以及这样获得的多核苷酸。

一方面，多核苷酸是一种作为短干扰RNA的 RNA分子，也称为siRNA。制备和筛选干扰RNA的方法以及选择阻断多核苷酸表达的能力是本领域已知的，其非限制性示例如下所示。这些干扰RNA由本发明单独提供或与合适的载体组合或在宿主细胞内提供。进一步提供了含有RNAi的组合物。如本领域已知和本文所述，RNAi可用于敲除或敲下细胞或组织中的选择功能。

siRNA序列可以通过获得目标mRNA序列并确定适当的siRNA互补序列来设计。本发明的siRNA被设计为与目标序列相互作用，这意味着它们与补充靶序列充分互补以与该序列杂交。siRNA可以与目标序列100%相同。然而，siRNA序列与靶序列的同源性可以小于100%，只要siRNA能够与目标序列杂交。因此，例如，siRNA分子可以与目标序列或目标序列的互补序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。因此，也可以使用相对于靶点具有插入、缺失或单点突变的siRNA分子。建议为每个目标mRNA生成几个不同的siRNA序列，以便筛选最佳目标序列。应进行同源性搜索，如BLAST搜索，以确保siRNA序列不包含任何已知哺乳动物基因的同源性。

一般而言，目标序列优选地位于距离AUG起始密码子至少100-200个核苷酸，且距离目标mRNA终止密码子至少50-100个核苷酸处（Duxbury (2004) J. Surgical Res. 117:339-344）。

研究人员已经确定，siRNA分子中的某些特征是共同的，可以有效地沉默其目标基因（Duxbury (2004) J. Surgical Res. 117:339-344; Ui-Tei et al. (2004) Nucl.Acids Res. 32:936–48）。作为一般指南，包括以下一个或多个条件的siRNA特别适用于在哺乳动物细胞中的基因沉默：GC比率在45-55%之间，无超过9 G/C的残基， G/C位于反义链的5′端；A/U位于反义链的5′端；反义链5′端前7个碱基中至少有5个A/U残基。

siRNA的长度通常在10到30个核苷酸之间。例如，siRNA可以是10-30个核苷酸长、12-28个核苷酸长、15-25个核苷酸长、19-23个核苷酸长或21-23个核苷酸长。当siRNA包含两条不同长度的链时，链中较长的一条表示siRNA的长度。在这种情况下，较长链的未配对核苷酸将形成悬垂。

术语siRNA包括短发夹RNA（shRNA）。shRNA包含形成茎环结构的单链RNA，其中茎由互补的正义链和反义链组成，形成双链siRNA，且环是大小不等的接头。shRNA的茎结构一般为10到30个核苷酸长。例如，茎可以是10-30个核苷酸长、12-28个核苷酸长、15-25个核苷酸长、19-23个核苷酸长或21-23个核苷酸长。

帮助siRNA设计的工具对公众是容易获得的。例如，基于计算机的siRNA设计工具可在互联网www.dharmacon.com上获得，最后访问日期为2007年11月26日。

本发明还提供了用于体外和体内使用的组合物，其包含一个或多个如本文所述的分离多核苷酸和药学上可接受的载体，或基本上由其组成，或由其组成。一方面，所述组合物是用于本发明的治疗方法的药物制剂。另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含分离的多核苷酸，或基本上由其组成，或由其组成。与不具有该组合物的对照组相比，其浓度使得该组合物的治疗有效量或药理学剂量引起癌细胞生长、活性或迁移减少至少75%，或至少80%，或至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少97%。可通过本领域已知和本文所述的合适的体外或体内方法来确定比较有效性。

dsRNA和siRNA的合成

如Micura (2002) Agnes Chem. Int. Ed. Emgl. 41:2265–2269; Betz (2003)Promega Notes 85:15–18和Paddison and Hannon (2002) Cancer Cell. 2:17–23中所述，dsRNA和siRNA可在体外化学合成或酶合成。化学合成可通过手动或自动方法进行，这两种方法在本领域中都是众所周知的，如上文Micura (2002)所述。siRNA也可以在细胞内以shRNA的形式内源性表达，如Yu et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6047–6052; 和McManus et al. (2002) RNA 8:842–850所述。内源性表达是通过使用小核RNA启动子（如RNA聚合酶III U6或H1或RNA聚合酶II U1）的质粒表达系统实现的，如Brummelkampet al. (2002) Science 296:550–553 (2002)和Novarino et al. (2004) J. Neurosci.24:5322–5330中所述。

可使用RNA聚合酶介导的过程进行体外酶促双链RNA和siRNA合成，以产生单独的正反义链，并在递送至所选细胞之前进行体外退火，如Fire et al. (1998) Nature 391:806–811; Donze and Picard (2002) Nucl. Acids Res. 30(10): e46; Yu et al.(2002)和Shim et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:30413–30416中所述。一些制造商（Promega、Ambion、New England Biolabs和Stragene）生产了可用于进行体外合成的转录试剂盒。

体外合成siRNA可以通过使用一对短双链寡核苷酸来实现，其包含位于正反义RNA序列上游的T7 RNA聚合酶启动子作为DNA模板。双链的每个寡核苷酸是合成一条siRNA链的单独模板。然后将合成的单独的短RNA链进行退火以形成siRNA，如Protocols andApplications, Chapter 2: RNA interference, Promega Corporation, (2005)中所述。

例如，可以通过在两条DNA目标序列链的5′端使用T7 RNA聚合酶启动子以实现dsRNA的体外合成。这是通过使用单独的DNA模板来实现的，每个模板都包含相对于T7启动子在不同方向的目标序列，在两个单独的反应中转录。得到的转录本被混合并在转录后退火。该反应中使用的DNA模板可通过PCR或使用两个线性化质粒模板创建，每个模板在目标序列的不同端含有T7聚合酶启动子。Protocols and Applications, Chapter 2: RNAinterference, Promega Corporation (2005)。

可通过首先将DNA多核苷酸插入合适的原核或真核宿主细胞来获得RNA。DNA可以通过任何适当的方法插入，例如通过使用适当的基因传递载体（例如脂质体、质粒或载体）或通过电穿孔。当细胞复制并且DNA转录成RNA时；然后可以使用本领域技术人员熟知的方法分离RNA，例如，如上文Sambrook和Russell（2001）所述。例如，根据上文Sambrook和Russell（2001）中所述的程序，可以使用各种裂解酶或化学溶液分离mRNA，或者按照制造商提供的附带说明通过核酸结合树脂提取mRNA。

为了表达本文所述的蛋白质，可通过多种技术递送编码感兴趣的基因的核酸序列。其示例包括如本文所述的病毒技术（例如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、甲病毒载体等）和非病毒技术（例如DNA/脂质体复合物、胶束和靶向病毒蛋白—DNA复合物）。一旦进入感兴趣的细胞内，转基因的表达可在普遍存在的启动子（例如EF-1）或组织特异性启动子（例如钙钙调素激酶2（CaMKI）启动子、NSE启动子和人类Thy-1启动子）的控制下进行。或者，如Wiznerowicz et al.（2005）Stem Cells 77:8957-8961所述，可通过使用可诱导的启动子系统（例如Tet on/off启动子）来控制表达水平。

启动子的非限制性示例包括但不限于巨细胞病毒（CMV）启动子（Kaplitt et al.(1994) Nat. Genet. 8:148 154），CMV/人类ÿ珠蛋白启动子（Mandel et al. (1998) J.Neurosci. 18:4271 4284），NCX1启动子，ÿMHC启动子，MLC2v启动子，GFAP启动子（Xu etal. (2001) Gene Ther. 8:1323 1332），1.8kb神经元特异性烯醇化酶（NSE）启动子（Kleinet al. (1998) Exp. Neurol. 150:183 194），鸡β肌动蛋白（CBA）启动子（Miyazaki(1989) Gene 79:269 277）和β葡萄糖醛酸酶（GUSB）启动子（Shipley et al. (1991)Genetics 10:1009 1018），人血清白蛋白启动子，α-1-抗胰蛋白酶启动子。为了提高表达，其他调控元件还可操作地与转基因连接，例如，土拨鼠肝炎病毒后调控元件（WPRE）（Donello et al. (1998) J. Virol. 72: 5085 5092）牛生长激素（BGH）聚腺苷酸化位点。

本发明进一步提供了与RNA转录启动子，以及用于DNA或RNA复制和/或瞬时或稳定表达的其他调控序列可操作地连接的本发明的分离的多核苷酸。如本文所用，术语“可操作地连接”是指以启动子将引导RNA转录离开DNA分子的方式定位。这类启动子的示例是SP6、T4和T7。在某些实施例中，细胞特异性启动子用于插入的多核苷酸的细胞特异性表达。包含启动子或启动子/增强子、具有终止密码子和可选择标记序列的载体，以及插入的DNA片段可操作地连接到该启动子的克隆位点，在本领域是众所周知的且可购买获得。有关一般方法和克隆策略，参见基因表达技术（Goeddel ed., Academic Press, Inc. (1991)）以及其中引用的参考文献和Vectors: Essential Data Series (Gacesa and Ramji, eds.,John Wiley & Sons, N.Y. (1994))，其中包含参考图谱、功能特性、商业供应商和各种合适载体的GenEMBL登录号。优选地，这些载体能够在体外或体内转录RNA。

含有这些核酸的表达载体可用于获得产生蛋白质和多肽的宿主载体系统。这意味着这些表达载体必须在宿主生物中作为附加体或作为染色体DNA的组成部分进行复制。合适的表达载体包括质粒、病毒载体，包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、粘粒等。腺病毒载体因其在体外和体内的高表达水平和细胞的高效转化而特别适用于在体内将基因导入组织。当核酸插入适当的宿主细胞（例如原核细胞或真核细胞）并且宿主细胞复制时，可重组产生蛋白质。合适的宿主细胞取决于载体，可包括哺乳动物细胞、动物细胞、人类细胞、猿猴细胞、昆虫细胞、酵母细胞和细菌细胞，如上所述，并使用众所周知的方法构建。参见Sambrook and Russell (2001)，同上。除了使用病毒载体将外源核酸插入细胞外，还可以通过本领域众所周知的方法将核酸插入宿主细胞，例如细菌细胞转化；用磷酸钙沉淀法转染哺乳动物细胞；DEAE葡聚糖；电穿孔；或显微注射。参见Sambrook and Russell (2001)，上文的方法。

本发明还提供了适用于将本发明的多核苷酸递送到细胞中（无论是体内、离体还是体外）的递送载体。本发明的多核苷酸可包含在基因递送载体、克隆载体或表达载体中。这些载体（尤其是表达载体）可依次被操纵以呈现多种形式中的任何一种，例如促进递送至细胞和/或进入细胞。

一方面，当编码两种或更多种肽（其中至少一个为MPS，SEQ ID NO: 40-56、58和59或其每一个的等效物）的多核苷酸被翻译和任选地表达时，编码多肽的多核苷酸可在重组mRNA或cDNA分子内组织，从而产生在单个mRNA分子上表达至少两个肽的转录本。这是通过使用具有位于编码两个肽的多核苷酸之间的内部核糖体进入位点（IRES）生物活性的多核苷酸来实现的。IRES元件启动多核苷酸的翻译，而无需使用传统上认为在真核细胞中翻译蛋白质所必需的“cap”结构。最初与单个小核糖核酸病毒（如脊髓灰质炎病毒和脑心肌炎病毒）的非翻译区有关，IRES元件后来被证明能有效地启动真核细胞中阅读框的翻译，并定位在真核启动子下游，它不会影响第一个顺反子的“cap”相关翻译。IRES元件在病毒中出现时通常至少有450个核苷酸长，并且在其3'端具有保守的“UUUC”序列，然后是多嘧啶痕迹、G贫间隔区和AUG三联体。

如本文所用，术语“IRES”旨在包括任何分子，例如mRNA多核苷酸或其逆转录（cDNA），其能够启动多核苷酸下游的基因翻译，而无需真核细胞中的cap位点。“IRES”元件可以与自然界中发现的序列相同，例如小核糖核酸病毒IRES，也可以是当转染到合适的宿主细胞中时执行相同的功能的非天然或非天然序列。本领域已知含有天然IRES元件的双顺反子和多顺反子表达载体，并在Pestova et al. (1998) Genes Dev. 12:67-83 和International PCT Publication No. WO 01/04306中进行了描述，其在第17页第35至38行引用了一些文献参考，其中包括但不限于：Ramesh et al. (1996) Nucl. Acids Res.24: 2697-2700; Pelletier et al. (1988) Nature 334:320-325; Jan et al. (1989)J. Virol. 63:1651-1660和Davies et al. (1992) J. Virol. 66:1924-1932。美国专利申请公开号2005/0014150 A1第[0009]段公开了几项已发布的美国专利，其中使用病毒衍生IRES元件在哺乳动物细胞、植物细胞以及通常在真核细胞中的线性多顺反子mRNA中表达外源基因。美国专利申请公开号2004/0082034 A1公开了一种在昆虫细胞中具有活性的IRES元件。美国专利号6,833,254中也描述了识别新元素的方法。

术语“IRES”元件中还包含了类似于美国专利号6,653,132中公开的细胞序列。该专利公开了一种序列元件（指定为SP163），其由来自VEGF（血管内皮生长因子基因）的5'-UTR的序列组成，该序列可能是通过先前未知的选择性剪接模式产生的。专利权人报告，SP163的优点在于它是一种天然的细胞IRES元件，与已知的细胞IRES元件相比，作为翻译刺激器和cap独立翻译的调停者具有优越的性能，并且这些功能在压力条件下得以保持。

在术语“IRES”元件中，还包括作为IRES元件的人工序列，如美国专利申请公开号2005/0059004 A1中所述。

分别是肽翻译和适当加工所需的序列可操作地且单独地与IRES元件连接。此类示例包括但不限于真核启动子、增强子、终止序列和聚腺苷酸化序列。此类序列的构建和使用在本领域是已知的，并且使用重组方法与IRES元件和蛋白质序列结合。“可操作地连接”是指两个或两个以上组件以允许它们达到其预期目的连接方式并置。启动子是驱动标记或目标蛋白转录的序列。必须选择用于特定宿主细胞，即哺乳动物、昆虫或植物细胞。病毒或哺乳动物启动子将在哺乳动物细胞中发挥作用。启动子可以是组成的或可诱导的，其示例是本领域中已知并描述的。

一方面，肽从单独的重组多核苷酸转录和翻译，并在宿主细胞中结合成功能蛋白。这种重组多核苷酸不需要IRES元件或标记蛋白，尽管在一方面，它可能存在。

这些含有本发明多核苷酸的分离的宿主细胞可用于本文所述的方法以及多核苷酸的重组复制、肽的重组生产和高通量筛选。

载体与宿主细胞

如本文所用，术语“载体”是指设计用于在不同宿主之间转移的核酸构建体，包括但不限于质粒、病毒、粘粒、噬菌体、BAC、YAC等。“病毒载体”被定义为重组产生的病毒或病毒颗粒，其包含将在体内、离体或体外递送到宿主细胞的多核苷酸。在一些实施例中，质粒载体可从市售的载体制备。在其他实施例中，根据本领域已知的技术，病毒载体可由杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、AAV等生产。在一个实施例中，病毒载体为慢病毒载体。病毒载体的示例包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、甲病毒载体等。基于传染性烟草花叶病毒（TMV）的载体可用于制造蛋白质，并已被报道在烟草叶中表达Griffithsin（O'Keefe et al. (2009) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 106(15):6099-6104）。甲病毒载体，如基于Semliki Forest病毒的载体和基于Sindbis病毒的载体，也已被开发用于基因治疗和免疫治疗。参见，Schlesinger & Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439和Ying et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827。在基因转移由逆转录病毒载体介导的方面，载体构建体是指包含逆转录病毒基因组或其部分的多核苷酸，和感兴趣的基因。关于用于基因转移的载体的现代方法的更多细节，可在例如Kotterman et al. (2015)Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook AnnualReview of Biomedical Engineering 17中找到。包含启动子和可操作地连接多核苷酸的克隆位点的载体是本领域众所周知的。这种载体能够在体外或体内转录RNA，并可从例如Agilent Technologies (Santa Clara, Calif.)和Promega Biotech (Madison, Wis.)等来源购买获得。

本文提供的载体包含本发明的一个或多个分离的多核苷酸和任选的与分离多核苷酸可操作地连接以进行复制和/或表达的调控序列，或基本上由其组成，或由其组成。载体的非限制性示例包括质粒或病毒载体，例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。在一个特定方面，所述载体是AAV载体（腺相关病毒载体）。

一方面，调控序列包含启动子、增强子元件和/或报告子，或基本上由其组成，或由其组成。一方面，所述载体进一步包含可检测的标记物或纯化标记物，或基本上由其组成，或由其组成。

如本文所用，术语“可检测的标记物”是指至少一个能够直接或间接产生可检测信号的标记物。该标记物的非详尽列表包括产生可检测信号的酶，例如通过比色法、荧光法、发光法（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）、发色团（如荧光）、发光染料、通过电子显微镜或其导电性、电流测定法、伏安法、阻抗、可检测基团等电性能检测到电子密度的基团，例如其分子大小足以引起其物理和/或化学性质的可检测的改变，此类检测可通过光学方法（如衍射、表面等离子体共振、表面变化、接触角变化）或物理方法（如原子力光谱法、隧道效应）或放射性分子（如³²P、³⁵S或¹²⁵I）来完成。

如本文所用，术语“纯化标记物”是指至少一种用于纯化或鉴定的标记物。所述标记物的非详尽列表包括His、lacZ、GST、麦芽糖结合蛋白、NusA、BCCP、c-myc、CaM、FLAG、GFP、YFP、樱桃、硫氧还蛋白、聚（NANP）、V5、Snap、HA、几丁质结合蛋白、Softag 1、Softag 3、Strep或S蛋白。合适的直接或间接荧光标记物包括FLAG、GFP、YFP、RFP、dTomato、樱桃、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、DNP、AMCA、生物素、地高辛、Tamra、德克萨斯红、罗丹明、Alexa fluors、FITC、TRITC或任何其他荧光染料或半抗原。

本文进一步公开了一种宿主细胞，其进一步包含本公开的分离的多肽、分离的多核苷酸或载体中的一种或多种，或基本上由其组成，或由其组成。

含有多肽和/或多核苷酸的合适细胞包括原核细胞和真核细胞，其包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞、哺乳动物细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、绵羊细胞、猿猴细胞和人类细胞。细菌细胞的示例包括大肠杆菌、肠道沙门氏菌和戈登链球菌。细胞可从商业供应商处购买，如American Type Culture Collection (ATCC, RockvilleMaryland, USA)或使用本领域已知的方法从分离物中培养。合适的真核细胞的示例包括但不限于293T HEK细胞以及仓鼠细胞系BHK-21；指定的小鼠细胞系NIH3T3、NS0、C127，猿猴细胞系COS、Vero；和人类细胞系HeLa，PER.C6（可从Crucell购买获得）U-937和Hep G2。昆虫细胞的非限制性示例包括草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）。用于表达的酵母的示例包括但不限于酵母菌、裂殖酵母菌、汉森酵母、念珠菌、球拟酵母、耶氏酵母或毕赤酵母。例如，参见美国专利号4,812,405; 4,818,700; 4,929,555; 5,736,383; 5,955,349; 5,888,768和6,258,559。

除物种特异性外，细胞可以是任何特定的组织类型，例如体细胞或胚胎干细胞，例如能或不能分化为终末分化细胞的干细胞。所述干细胞可以是人或动物来源的，如哺乳动物。

抗体组合物

本发明还提供了一种能够与本发明的多肽特异性形成复合物的抗体，所述多肽例如是SEQ ID No: 40-56的多肽，所述抗体可用于筛选所述多肽。一方面，抗体或其片段特异性结合到MARCKS蛋白质的磷酸化位点结构域（PSD），其可防止MARCKS磷酸化和/或隔离与MARCKS自然相互作用的蛋白质。另一方面，抗体或其片段与肽或其他分子共轭以促进进入细胞。术语“抗体”如上所述，包括多克隆抗体和单克隆抗体、抗体片段及其衍生物。抗体包括但不限于牛、兔子、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、绵羊、狗、猫、猴子、黑猩猩、猿等。抗体还可用于识别和纯化治疗性和/或诊断性多肽。还提供了产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

本发明的多克隆抗体可使用本领域已知并在文献中有详细描述的常规技术生产。有几种方法可用于生产多克隆抗体。例如，多克隆抗体通常通过免疫合适的哺乳动物产生，例如但不限于鸡、山羊、豚鼠、仓鼠、马、小鼠、大鼠和兔子。将抗原注射到哺乳动物体内，诱导B淋巴细胞产生抗原特异性IgG免疫球蛋白。这种IgG是从哺乳动物血清中纯化的。该方法的变化包括改变佐剂、给药途径和给药部位、每个部位的注射量和每只动物的部位数量，以实现动物的最佳生产和人道待遇。例如，佐剂通常用于改善或增强对抗原的免疫反应。大多数佐剂提供注射部位抗原库，允许抗原缓慢释放到引流淋巴结中。其他佐剂包括可促进蛋白质抗原分子在较大表面积上的浓度的表面活性剂和免疫刺激分子。用于生产多克隆抗体的佐剂的非限制性示例包括Freund佐剂、Ribi佐剂系统和Titermax。可使用美国专利号7,279,559; 7,119,179; 7,060,800; 6,709,659; 6,656,746; 6,322,788; 5,686,073和5,670,153中所述的方法产生多克隆抗体。

本发明的单克隆抗体可使用本领域已知并在文献中详细描述的常规杂交瘤技术生产。例如杂交瘤是通过融合合适的永生细胞系（例如，骨髓瘤细胞系，例如但不限于Sp2/0、Sp2/0-AG14、NSO、NS1、NS2、AE-1、L.5、>243、P3X63Ag8.653、Sp2 SA3、Sp2 MAI、Sp2 SS1、Sp2 SA5、U397、MLA 144、ACT IV、MOLT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、COS、RAJI、NIH 3T3、HL-60、MLA 144、NAMAIWA、NEURO 2A、CHO、PerC.6、YB2/O）等，或异源骨髓瘤，其融合产物，或从其衍生的任何细胞或融合细胞，或本领域已知的任何其他合适的细胞系（例如，见www.atcc.org、www.lifetech.com，最后访问日期为2007年11月26日等）而产生的，以及抗体生产细胞，例如但不限于分离或克隆的脾脏、外周血、淋巴、扁桃体，或其他免疫细胞或含B细胞的细胞，或任何其他表达重链或轻链恒定或可变或框架或CDR序列的细胞，无论是作为内源性或异源核酸，还是作为重组或内源性、病毒、细菌、藻类、原核生物、两栖动物、昆虫、爬行动物、鱼类、哺乳动物、啮齿动物、马、绵羊、山羊、羊、灵长类动物、真核生物、基因组DNA、cDNA、rDNA、线粒体DNA或RNA、叶绿体DNA或RNA、hnRNA、mRNA、tRNA、单链、双链或三链、杂交等或其任何组合。抗体产生细胞也可从已用感兴趣的抗原免疫的人类或其他合适动物的外周血，或优选地脾脏或淋巴结获得。任何其他合适的宿主细胞也可用于表达编码本发明抗体、特定片段或其变体的异源或内源性核酸。可使用选择性培养条件或其他合适的已知方法分离融合细胞（杂交瘤）或重组细胞，并通过限制稀释或细胞分选或其他已知方法进行克隆。

在一个实施例中，本文所述抗体可使用多抗原肽（MAP）系统生产。MAP系统利用三个或七个径向分支的赖氨酸残基的肽基核心，可使用标准固相化学在其上构建感兴趣的抗原肽。赖氨酸核心产生的MAP含有约4到8个肽表位拷贝，这取决于通常占总分子量不到10%的内核。MAP系统不需要载体蛋白进行结合。MAP中抗原表位的高摩尔比和多个拷贝的密集堆积已被证明能产生强烈的免疫原性反应。所述方法在美国专利号5,229,490中描述。

可使用产生或分离所需特异性抗体的其他合适方法，包括但不限于，从肽库或蛋白质库中选择重组抗体的方法（例如但不限于噬菌体、核糖体、寡核苷酸、RNA、cDNA等，展示库；例如使用本领域已知的方法，从各个商业供应商获得，例如Cambridge AntibodyTechnologies (Cambridgeshire, UK), MorphoSys (Martinsreid/Planegg, Del.),Biovation (Aberdeen, Scotland, UK) BioInvent (Lund, Sweden)。参见美国专利号4,704,692; 5,723,323; 5,763,192; 5,814,476; 5,817,483; 5,824,514; 5,976,862。替代的方法依赖于转基因动物的免疫（例如SCID小鼠，Nguyen et al. (1977) Microbiol.Immunol. 41:901-907 (1997); Sandhu et al.(1996) Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118; Eren et al. (1998) Immunol. 93:154-161，其能够产生一系列如本领域已知的和/或如本文所述的人类抗体库。这些技术包括但不限于核糖体展示（Hanes et al. (1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937-4942; Hanes et al.(1998) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 95:14130-14135）；单细胞抗体生产技术（例如，选择淋巴细胞抗体法（“SLAM”）（美国专利号5,627,052, Wen et al. (1987) J. Immunol. 17:887-892; Babcook etal. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848）；凝胶微滴和流式细胞术（Powell et al. (1990) Biotechnol. 8:333-337; One Cell Systems, (Cambridge,Mass); Gray et al. (1995) J. Imm. Meth. 182:155-163; 以及Kenny et al. (1995)Bio. Technol. 13:787-790）；B细胞选择（Steenbakkers et al. (1994) Molec. Biol.Reports 19:125-134）。

本发明的抗体衍生物也可通过将编码本发明抗体的多核苷酸递送至合适的宿主来制备，例如提供在其牛奶中产生此类抗体的转基因动物或哺乳动物，如山羊、奶牛、马、绵羊等。这些方法在本领域中是已知的，并且例如在美国专利号5,827,690; 5,849,992; 4,873,316; 5,849,992; 5,994,616; 5,565,362和5,304,489中描述。

术语“抗体衍生物”包括对抗体或片段的线性多肽序列的翻译后修饰。例如，美国专利号6,602,684 B1描述了一种生成改性乙二醇形式的抗体的方法，包括完整抗体分子、抗体片段或融合蛋白，其包括与免疫球蛋白的Fc区域等效的区域，具有增强的Fc介导的细胞毒性，以及由此生成的糖蛋白。

也可通过递送本发明的多核苷酸来制备抗体衍生物，以提供转基因植物和培养的植物细胞（例如，但不限于烟草、玉米和浮萍），其在植物部分或从中培养的细胞中产生此类抗体、特定部分或变体。例如，Cramer et al. (1999) Curr. Top. Microbol. Immunol.240:95-118和其中引用的参考文献描述了表达大量重组蛋白的转基因烟叶的生产，例如，使用可诱导的启动子。转基因玉米已被用于在商业生产水平上表达哺乳动物蛋白质，其生物活性相当于在其他重组系统中生产的或从天然来源纯化的蛋白质。参见，例如Hood etal. (1999) Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147及其引用的参考文献。从转基因植物种子中也大量产生了抗体衍生物，包括抗体片段，如单链抗体（scFv），包括烟草种子和马铃薯块茎。参见，例如Conrad et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38:101-109及其引用的参考文献。因此，根据已知方法，本发明的抗体也可以使用转基因植物产生。

抗体衍生物也可通过，例如，通过添加外源序列来改变免疫原性或减少、增强或修改结合、亲和力、结合率、解离率、亲和力、特异性、半衰期或任何其他合适的特性。通常，部分或全部非人类或人类CDR序列被保留，而可变区和恒定区的非人类序列被人类或其他氨基酸取代。

一般来说，CDR残基直接且实质性地参与影响抗原结合。本发明的抗体的人源化或工程化可使用任何已知方法进行，例如但不限于美国专利号5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5,763,192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6,180,370; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089; 5,225,539和4,816,567所述的方法。

用于制造部分至全长人类抗体的技术在本领域是已知的，并且可以使用任何此类技术。根据一个实施方案，在转基因小鼠中制备全长人类抗体序列，所述小鼠已被工程化以表达人类重链和轻链抗体基因。已经制备了这种转基因小鼠的多个品系，可以产生不同种类的抗体。来自产生所需抗体的转基因小鼠的B细胞可融合以制备杂交瘤细胞系以连续产生所需抗体。（参见，例如Russel et al. (2000) Infection and Immunity April 2000:1820-1826; Gallo et al. (2000) European J. of Immun. 30:534-540; Green (1999)J. of Immun. Methods 231:11-23; Yang et al. (1999) J. of Leukocyte Biology66:401-410; Yang (1999) Cancer Research 59(6):1236-1243; Jakobovits (1998)Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42; Green and Jakobovits (1998) J. Exp.Med. 188(3):483-495; Jakobovits (1998) Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4):607-614;Tsuda et al. (1997) Genomics 42:413-421; Sherman-Gold (1997) GeneticEngineering News 17(14); Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156;Jakobovits (1996) Weir’s Handbook of Experimental Immunology, The IntegratedImmune System Vol. IV, 194.1-194.7; Jakobovits (1995) Current Opinion inBiotechnology 6:561-566; Mendez et al. (1995) Genomics 26:294-307; Jakobovits(1994) Current Biology 4(8):761-763; Arbones et al. (1994) Immunity 1(4):247-260; Jakobovits (1993) Nature 362(6417):255-258; Jakobovits et al. (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(6):2551-2555和美国专利号6,075,181）。

本发明的抗体也可以被修饰以产生嵌合抗体。嵌合抗体是那些抗体的重链和轻链的不同结构域由来自多个物种的DNA编码的抗体。参见，例如，美国专利号4,816,567。

或者，也可以修饰本发明的抗体以产生贴面（veneered）抗体。贴面抗体是其中一个物种的抗体的外部氨基酸残基被第二个物种的氨基酸残基明智地取代或“贴面”以使第一个物种的抗体在第二个物种中不具有免疫原性，从而降低抗体的免疫原性的抗体。由于蛋白质的抗原性主要取决于其表面的性质，因此可以通过取代暴露的残基来降低抗体的。这种明智地取代外部残基对内部结构域或结构域间接触的影响应该很小或没有影响。因此，配体结合特性应不受可变区骨架残基的改变的影响。该过程被称为“贴面”，因为只有抗体的外表面或皮肤被改变，支持残基保持不变。

该“贴面”程序利用了Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 4th ed., Bethesda, Md., National Institutes of Health的人类抗体可变域的可用序列数据、数据库的更新，以及其他可访问的美国和外国数据库（核酸和蛋白质）。用于产生贴面抗体的方法的非限制性示例包括EP 519596; 美国专利号6,797,492并在 Padlan et al. (1991) Mol. Immunol. 28(4-5):489-498中描述。

术语“抗体衍生物”还包括“双抗体”，其是具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中片段包含连接到同一多肽链中的轻链可变域（VL）的重链可变域（VH）。（参见，例如EP404,097; WO 93/11161和Hollinger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448。）通过使用太短而不允许在同一链上的两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。（另见Chen等人的美国专利号6,632,926，该专利公开了一种抗体变体，其具有插入亲本抗体高变区的一个或多个氨基酸，并且与目标抗原的结合亲和力至少比亲本抗体与抗原的结合亲和力强约两倍。）

术语“抗体衍生物”还包括“线性抗体”。制备线性抗体的程序为本领域已知的，并在Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062中描述。简而言之，这些抗体包含形成一对抗原结合区的一对串联Fd片段（V_H-C_H1-VH-C_H1）。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。

本发明的抗体可通过已知方法从重组细胞培养物中回收和纯化，包括但不限于蛋白质A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。高效液相色谱法（“HPLC”）也可用于纯化。

本发明的抗体包括自然纯化的产物、化学合成程序的产物以及通过重组技术从真核宿主（例如，包括酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞）或上述原核细胞产生的产物。

如果被测单克隆抗体与蛋白质或多肽结合，则被测抗体和本发明杂交瘤提供的抗体为等效物。也可以在不进行过度试验的情况下，通过确定被测抗体是否阻止本发明的单克隆抗体与单克隆抗体正常反应的蛋白质或多肽结合，确定抗体是否具有与本发明的单克隆抗体相同的特异性。如果被测抗体与本发明的单克隆抗体竞争，如本发明的单克隆抗体结合减少所示，则两种抗体很可能与相同或密切相关的表位结合。或者，可以将本发明的单克隆抗体与正常反应的蛋白质预孵育，并确定被测单克隆抗体结合抗原的能力是否受到抑制。如果所测试的单克隆抗体被抑制，则其极有可能具有与本发明的单克隆抗体相同或密切相关的表位特异性。

术语“抗体”还包括所有同型的抗体。单克隆抗体的特定同型可通过从初始融合中选择直接制备，或从分泌不同同型单克隆抗体的亲本杂交瘤中二次制备，通过使用sib选择技术使用该程序分离类别转换变体，如Steplewski et al. (1985) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82:8653 or Spira et al. (1984) J. Immunol. Methods 74:307中描述的。

本领域普通技术人员也可以通过产生抗独特型抗体来完成分离分泌具有本发明单克隆抗体特异性的单克隆抗体的其他杂交瘤。Herlyn et al. (1986) Science 232:100。抗独特型抗体是识别杂交瘤产生的单克隆抗体上存在的独特决定因素的抗体。两种杂交瘤单克隆抗体之间的独特型识别表明，两种单克隆抗体在识别相同的表位决定簇方面是相同的。因此，通过在单克隆抗体上使用针对表位决定簇的抗体，可以识别表达具有相同表位特异性的单克隆抗体的其他杂交瘤。

两种杂交瘤单克隆抗体之间的独特型识别表明，两种单克隆抗体在识别相同的表位决定簇方面是相同的。因此，通过在单克隆抗体上使用针对表位决定簇的抗体，可以识别表达具有相同表位特异性的单克隆抗体的其他杂交瘤。

也可以使用抗独特型技术生产模拟表位的单克隆抗体。例如，针对第一单克隆抗体制备的抗独特型单克隆抗体将在高变区中具有结合域，其是由第一单克隆抗体结合的表位的镜像。因此，在这种情况下，抗独特型单克隆抗体可用于免疫以产生这些抗体。

抗体可以与例如药剂（例如化疗药物或毒素）结合。它们可以连接到细胞因子、配体和另一种抗体。用于与抗体结合以实现抗肿瘤效果的合适试剂包括细胞因子，例如白细胞介素2（IL-2）和肿瘤坏死因子（TNF）；光敏剂，用于光动力疗法，包括四磺酸铝（III）酞菁、血卟啉和酞菁；放射性核素，如碘131（¹³¹I）、钇90（⁹⁰Y）、铋212（²¹²Bi）、铋213（²¹³Bi）、锝99m（^99mTc）、铼186（¹⁸⁶Re）和铼188（¹⁸⁸Re）；抗生素，如阿霉素、亚德里亚霉素、柔红霉素、甲氨蝶呤、正定霉素、新制癌菌素和卡铂；细菌、植物和其他毒素，如白喉毒素、假单胞菌外毒素A、葡萄球菌肠毒素A、相思子A毒素、蓖麻毒素A（脱糖蓖麻毒素A和天然蓖麻毒素A）、TGF-α毒素、来自中国眼镜蛇的细胞毒素（naja naja atra）和白树毒素（一种植物毒素）；来自植物、细菌和真菌的核糖体失活蛋白，例如局限曲菌素（一种由局限曲菌产生的核糖体失活蛋白）、皂草素（一种来自皂草的核糖体失活蛋白）和RNase；酪氨酸激酶抑制剂；ly207702（一种二氟嘌呤核苷）；含有抗囊性药物的脂质体（例如，反义寡核苷酸、编码毒素的质粒、甲氨蝶呤等）；和其他抗体或抗体片段，如F(ab)。

本发明的抗体也可以与许多不同的载体结合。因此，本发明还提供含有抗体和另一种活性或惰性物质的组合物。众所周知的载体的示例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁。出于本发明的目的，载体的性质可以是可溶的或不可溶的。本领域技术人员将知道用于结合单克隆抗体的其他合适的载体，或将能够使用常规实验确定此类载体。

用于治疗的组合物

本文提供了一种组合物，其包含本发明的分离的多肽、分离的多核苷酸、载体或宿主细胞中的一个或多个，或基本上由其组成，或由其组成。例如，一方面，所述组合物包含SEQ ID No: 1-59的分离的多肽，或SEQ ID No: 40-56、59或40-56、58和59，或编码该多肽的多核苷酸，或其各自的等效物。进一步的诊断组合物包括结合所述多肽或其等效物或其片段的抗体。一方面，所述载体是药学上可接受的载体。另一方面，上述抗体、抗体片段、抗体衍生物、编码这些组合物和siRNA、载体或宿主细胞中的一种或多种的多肽或多核苷酸可进一步包含化疗剂或药物、或者抗纤维化剂或药物，或基本上由其组成，或由其组成。抗纤维化剂或药物的非限制性示例包括吡非尼酮和尼达尼布。化学治疗剂或药物的非限制性示例包括酪氨酸激酶抑制剂（TKI）、基于铂的药物、靶向EGFR的药物或药剂、或MANS多肽或其片段，其中所述片段包含适合在诊断或治疗方法中使用所述组合物的多肽和载体、药学上可接受的载体或医疗设备，或基本上由其组成，或由其组成。因此，所述组合物包含一种或多种上述组合物与载体、药学上可接受的载体或医疗设备的组合，或基本上由其组成，或由其组成。

载体可以是液相载体或固相载体，例如珠、凝胶、微阵列或载体分子，如脂质体。所述组合物可任选地进一步包含至少一种进一步的化合物、蛋白质或组合物。

“载体”的其他示例包括治疗活性剂，例如另一种肽或蛋白质（例如，Fab'片段）。例如，本发明的抗体、其衍生物或片段可以功能性地连接（例如，通过化学共轭、基因融合、非共价结合或其他方式）到一个或多个其他分子实体，例如另一种抗体（例如，产生双特异性或多特异性抗体）、细胞毒素、细胞配体或抗原。因此，本发明包含多种抗体结合物、双特异性和多特异性分子以及融合蛋白，无论它们是否靶向与本发明的抗体相同的表位。

“载体”的其他示例还包括治疗活性剂，例如另一肽或蛋白质（例如，Fab'片段）或用于治疗以下一种或多种的制剂：抑制MARCKS磷酸化和/或从细胞膜分离；抑制或减少Th2细胞因子（IL-4、IL-5、IL-13和趋化因子）的产生和/或IgE水平；抑制粘液化生；抑制或压制炎症细胞（单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞）的浸润；过敏性炎症或与过度反应相关的疾病或病症。

载体的其他示例是有机分子（也称为修饰剂）或活化剂，其可直接或间接共价连接至本发明的多肽、抗体、抗体片段、抗体衍生物、编码这些的多核苷酸或RNAi、载体或宿主细胞。分子的附着可以改善药代动力学特性（例如，增加体内血清半衰期）。有机分子的示例包括但不限于亲水性聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。如本文所用，术语“脂肪酸”包括单羧酸和双羧酸。本文使用的术语“亲水性聚合物基团”是指比辛烷更易溶于水的有机聚合物。

适用于修饰本发明抗体的亲水性聚合物可以是线性的或分支的，并且包括例如聚烷二醇（例如PEG、单甲氧基聚乙二醇（mPEG）、PPG等）、碳水化合物（例如葡聚糖、纤维素、寡糖、多糖等），亲水性氨基酸（例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等）、聚烷烃氧化物（例如聚氧化乙烯、聚氧化聚丙烯等）和聚乙烯吡咯烷酮的聚合物。修饰本发明抗体的合适的亲水性聚合物作为单独的分子实体具有约800至约150000道尔顿的分子量。亲水性聚合物基团可被一个至大约六个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基团取代。可以通过使用合适的方法来制备被脂肪酸或脂肪酸酯基团取代的亲水性聚合物。例如，包含胺基的聚合物可偶联至脂肪酸或脂肪酸酯的羧酸盐，并且脂肪酸或脂肪酸酯上的活化羧酸盐（例如，用N，N-羰基二咪唑活化）可偶联至聚合物上的羟基。

适用于修饰本发明抗体的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的，或者可以包含一个或多个不饱和单元。此类示例包括但不限于正十二酸、正十四酸、正十八酸、正二十烷酸、正二十二烷酸、正三十烷酸、正四烷酸、顺式-Δ9-十八烷酸、所有顺式-Δ5,8,11,14-二十碳四烯酸、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等。合适的脂肪酸酯包括包含直链或支链低烷基的二羧酸单酯。较低烷基可包含1至约12个、优选地1至约6个碳原子。

本发明提供了一种组合物，其包含本发明的至少一种抗体、其衍生物或片段，或基本上由其组成，或由其组成，其适用于以有效量给药，以抑制MARCKS的表达，以预防、减少、延迟、抑制或压制与MARCKS磷酸化和/或与细胞膜分离和/或PIP2隔离效应相关的疾病或病症，或PIP3产生，或AKT激活，或炎症、纤维化或活化的成纤维细胞增殖，或肌成纤维细胞的产生和分化，或转化生长因子β（TGF-β）信号通路，或癌症、肿瘤细胞生长、实体肿瘤细胞生长或转移，或癌症干细胞生长、癌症干性或肿瘤细胞转移；以及任选地用于促进凋亡或恢复耐药癌细胞对化疗药物的敏感性。一方面，所述组合物具有预防、减少、延迟、抑制或压制与肺纤维化、特发性肺纤维化或吸烟、博来霉素诱导的肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化、皮肤纤维化、成纤维细胞病、活化的成纤维细胞增殖、炎症或肌成纤维细胞产生相关的疾病或病症的能力。另一方面，所述组合物具有预防、减少、延迟、抑制或压制与淋巴瘤、白血病或实体瘤相关的疾病或病症的能力。实体瘤的非限制性示例包括癌症、肺癌、肾癌、卵巢癌、脑癌、结直肠癌、胰腺癌、骨癌或喉癌。一方面，“治疗”不包括防范或预防。

所述组合物包括例如药学和诊断组合物/试剂盒，其包含药学上可接受的载体和本发明的至少一种抗体、其变体、衍生物或片段。如上所述，所述组合物可进一步包含额外的抗体或治疗剂，其组合以提供最大治疗益处的多种疗法。

替代地，本发明的组合物可与其他治疗剂（例如小分子或肽）共同施用，无论是否与它们连接或以相同剂量施用。它们可与此类药剂同时施用（例如，以单一组合物或单独施用），或可在此类药剂施用之前或之后施用。

用于诊断的组合物

上述组合物中的一种或多种可进一步与载体、药学上可接受的载体或医疗设备组合，其适于在诊断或治疗方法中使用该组合物。一方面，所述组合物包含作为分离的多肽的SEQ ID No: 1-59，或SEQ ID No: 40-59，或SEQ ID No: 40-56、58和59，或编码所述多肽的多核苷酸，或其各自的等效物。进一步的诊断组合物包括结合该多肽或其等效物或其片段的抗体。

载体可以是液相载体或固相载体，例如珠、凝胶、基因芯片、微阵列或载体分子，如脂质体。所述组合物可任选地进一步包含以下物质，或基本上由其组成，或由其组成：至少一种进一步的化合物、蛋白质或组合物、抗癌剂或其他小分子、蛋白质、多肽、抗体或抗体片段，例如TKI抑制剂、靶向EGFR的药物或试剂，铂类药物或MARCKS多肽或其片段。

载体的其他示例是有机分子（也称为修饰剂）或活化剂，其可直接或间接共价连接至本发明的抗体。分子的附着可以改善药代动力学特性（例如，增加体内血清半衰期）。有机分子的示例包括但不限于亲水性聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。如本文所用，术语“脂肪酸”包括单羧酸和双羧酸。本文使用的术语“亲水性聚合物基团”是指比辛烷更易溶于水的有机聚合物。

还提供了包含至少一种本发明抗体的组合物。所述组合物包括例如药学和诊断组合物/试剂盒，其包含药学上可接受的载体和本发明的至少一种抗体、其变体、衍生物或片段。如上所述，所述组合物可进一步包含额外的抗体或治疗剂，其组合以提供最大治疗益处的多种疗法。

可选地，本发明的组合物可与其他治疗剂共同施用，无论是否与它们连接或以相同剂量施用。它们可与此类药剂同时施用（例如，以单一组合物或单独施用），或可在此类药剂施用之前或之后施用。此类药剂可包括抗癌疗法，例如厄洛替尼、伊立替康、5-氟尿嘧啶、爱必妥、西妥昔单抗、FOLFOX或放射疗法或本领域技术人员已知的其他药剂。

利用重组DNA技术和生物信息学的诊断方法

本发明的多核苷酸可连接至固体支持物，例如阵列或高密度芯片，用于使用本领域已知的方法进行高通量筛选分析。例如，编码MPS的多核苷酸，例如SEQ ID NO: 1-59，或40-56，或SEQ ID NO: 40-56、58和59，或其各自的等效物，可以用作探针来识别受试者样本中的表达。可以使用美国专利号5,405,783; 5,412,087和5,445,934中公开的方法在衍生玻璃表面上合成芯片。受光保护的核苷磷酰胺可偶联至玻璃表面，通过光刻掩模通过光解选择性地脱保护，并与第二个受保护的核苷磷酰胺反应。重复偶联/脱保护过程，直到完成所需探针。

可以使用化学合成来提供本发明的分离多核苷酸。多核苷酸的化学合成可以使用多种方案完成，包括使用固体支持物化学，其中寡核苷酸在锚定到无机聚合物的同时一次合成一个核苷。使用聚合物上的反应基团将第一个核苷酸连接到无机聚合物，该反应基团与核苷上的反应基团反应以形成共价键。然后通过以下方式将每个后续的核苷添加到第一个核苷分子：1）在原始核苷和具有保护基团的新核苷之间形成亚磷酸盐键；2）通过氧化将亚磷酸盐键转化为磷酸盐键；以及3）如美国专利号44580665,153,319; 5,132,418和4973679所述，去除其中一个保护基团以形成下一个核苷的新反应位点；所有这些均通过引用并入本文。固相合成寡核苷酸消除了在添加每个核苷酸碱基后分离和纯化中间产物的需要。在合成RNA之后，将寡核苷酸脱保护（美国专利号5,831,071）并纯化以去除副产物、不完全合成产物等。

美国专利号5,686,599描述了一种在适合于从2'羟基位置去除保护基团的条件下一锅法脱保护RNA的方法。美国专利号5,804,683描述了使用烷基胺去除外环保护基团的方法。美国专利号5,831,071描述了一种使用乙胺、丙胺或丁胺脱保护RNA的方法。美国专利号5,281,701描述了使用5'-O-保护-2'-O-烷基硅基腺苷磷酰胺和5'-O-保护-2'-O-烷基硅基鸟苷磷酰胺单体合成RNA的方法和试剂，其使用乙基硫代四唑进行脱保护。Usman andCedergren (1992) Trends in Biochem. Sci. 17:334-339描述了用于研究2'羟基作用的RNA-DNA嵌合体的合成。Sproat et al. (1995) Nucleosides & Nucleotides 14:255-273描述了使用5-乙基硫代-1H-四唑作为激活剂以提高寡核苷酸合成质量和产品产量。Gaitet al. (1991) Oligonucleotides and Analogues, ed. F. Eckstein, OxfordUniversity Press 25-48描述了RNA合成的一般方法。美国专利号4,923,901; 5,723,599;5,674,856; 5,141,813; 5,419,966; 4,458,066; 5,252,723; Weetall et al. (1974)Methods in Enzymology 34:59-72; Van Aerschot et al. (1988) Nucleosides andNucleotides 7:75-90; Maskos and Southern (1992) Nucleic Acids Research 20:1679-1684; Van Ness et al. (1991) Nucleic Acids Research 19:3345-3350;Katzhendler et al. (1989) Tetrahedron 45:2777-2792; Hovinen et al. (1994)Tetrahedron 50:7203-7218; GB 2,169,605; EP 325,970; 国际PCT公开号WO 94/01446;德国专利号280,968和德国专利号4,306,839都描述了用于寡核苷酸合成的固体支持物的具体示例以及某些寡核苷酸的具体使用方法。此外，本领域技术人员已知的寡核苷酸合成方法和试剂，如美国专利号7,205,399所述，通过引用整体并入本文。

探针和高密度寡核苷酸探针阵列还提供了监控多种基因表达的有效手段，其中一种包括所述基因。因此，表达监控方法可在多种情况下使用，包括检测疾病、识别在一段时间内从同一患者分离的样本之间的差异基因表达，或筛选一次性（或可选地在一段时间内）上调或下调基因表达的组合物。

适用于本发明的可检测的标签包括上述识别的标签以及通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电气、光学或化学手段可检测的任何组合物。本发明中有用的标签包括用于用标记的链霉亲和素偶联物染色的生物素、磁珠（例如Dynabeads™）, 荧光染料（例如，荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等）、放射性标记（例如，³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P）、酶（例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA中常用的其他酶），和比色标签，如胶体金或彩色玻璃或塑料（如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等）珠。教导使用此类标签的专利包括美国专利号3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149和4,366,241。

本领域技术人员已知检测此类标签的方法。因此，例如，可使用照相胶片或闪烁计数器检测放射性标签，可使用光电检测器检测发射光以检测荧光标签。通常通过向酶提供底物并检测酶在底物上作用产生的反应产物来检测酶标签，并通过简单地可视化彩色标签来检测比色标签。

国际PCT公开号WO 97/10365描述了在杂交之前或之后向目标（样品）核酸添加标签的方法。这些是可检测的标签，在杂交前直接附着或掺入目标（样品）核酸。相比之下，“间接标签”在杂交后加入到杂交双链中。通常，间接标签连接到杂交前已附着到目标核酸的结合部分。因此，例如，可在杂交之前对目标核酸进行生物素化。杂交后，亲和素结合荧光团将结合含生物素的杂交双链体，提供易于检测的标记。有关标记核酸和检测标记杂交核酸方法的详细综述，参见Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology,Vol. 24: Hybridization with Nucleic Acid Probes, P. Tijssen, ed. Elsevier,N.Y. (1993)。

也可在与高密度探针阵列杂交之前修饰核酸样品，以降低样品复杂性，从而降低背景信号，并使用国际PCT公开号WO 97/10365中公开的方法提高测量灵敏度。

芯片分析的结果通常使用计算机软件程序进行分析。参见，例如EP 0717 113 A2和WO 95/20681。将该信息与现有的疾病和健康个体的基因表达水平数据集进行比较。获得的数据与一组患病个体的数据之间的相关性表明受试者发病。

确定治疗剂的方法

本发明还提供了识别用于治疗与以下中的一种或多种相关的疾病或症状的线索和方法的方法：预防、减少、延迟、抑制或压制与MARCKS磷酸化和/或与细胞膜分离和/或PIP2隔离效应相关的疾病或病症，或PIP3产生，或AKT激活，或炎症、纤维化或活化的成纤维细胞增殖，或肌成纤维细胞的产生和分化，或转化生长因子β（TGF-β）信号通路，或癌症、肿瘤细胞生长、实体肿瘤细胞生长或转移，或癌症干细胞生长、癌症干性或肿瘤细胞转移；以及任选地用于促进凋亡或恢复耐药癌细胞对化疗药物的敏感性。一方面，所述组合物具有预防、减少、延迟、抑制或压制与肺纤维化、特发性肺纤维化或吸烟、博来霉素诱导的肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化、皮肤纤维化、成纤维细胞病、活化的成纤维细胞增殖、炎症或肌成纤维细胞产生相关的疾病或病症的能力。另一方面，所述组合物具有预防、减少、延迟、抑制或压制与淋巴瘤、白血病或实体瘤相关的疾病或病症的能力。实体瘤的非限制性示例包括癌症、肺癌、肾癌、卵巢癌、脑癌、结直肠癌、胰腺癌、骨癌或喉癌。

本发明还提供了用于识别治疗纤维化和/或癌症的线索和方法的方法。一方面，该筛选识别了模仿上述识别的多肽的先导化合物或生物制剂，并且可用于治疗这些疾病或治疗或改善与这些疾病相关的症状。用于筛选的试验物质可以来自任何来源。它们可以是天然产物库、组合化学库、由重组库制成的生物制品等。试验物质的来源对本发明并不重要。本发明提供了筛选化合物和组合物的方法，其以前在其他筛选方案中可能被忽略。

为了在体外进行筛选或分析，首先提供合适的细胞培养物或组织培养物。所述细胞可以是培养的细胞或差异表达受体和/或受体复合物的遗传修饰的细胞。替代地，细胞可以来自如下所述的组织培养物。细胞在一定条件下（温度、生长或培养基和气体（CO₂））培养，并在适当的时间内达到指数级增殖，并且无密度依赖性限制。还需要保持额外的单独的细胞培养（作为对照的不接受待测试试剂的细胞培养）。

对于本领域技术人员显而易见的是，可在微量滴定板中培养合适的细胞，并可通过记录基因型变化、表型变化和/或细胞死亡同时对几种试剂进行分析。

当试剂为DNA或RNA核酸分子以外的组合物时，合适的条件可直接添加到细胞培养物或添加到培养基中。对于本领域技术人员显而易见的是，必须添加可由经验确定的“有效”量。

筛选包括将试剂与表达复合物的测试细胞接触，然后分析细胞提供类似于本发明多肽的生物反应的能力。另一方面，从待治疗的受试者中分离测试细胞或组织样本，并筛选一种或多种潜在制剂以确定对该个体患者的最佳治疗和/或疗程。

出于本发明的目的，“试剂”旨在包括但不限于生物或化学化合物，例如简单或复杂的有机或无机分子、肽、蛋白质或寡核苷酸。可以合成大量化合物，例如寡聚物，如寡肽和寡核苷酸，以及基于各种核心结构的合成有机化合物，这些也包括在术语“试剂”中。此外，各种天然来源可提供用于筛选的化合物，例如植物或动物提取物等。应当理解，尽管并非总是明确说明，所述试剂单独使用或与另一试剂组合使用，其具有与通过筛选识别的试剂相同或不同的生物活性。这些制剂和方法也旨在与其他疗法结合使用。它们可以同时或按顺序施用。

治疗方法

本文提供了治疗需要治疗的受试者中与纤维化相关的疾病或病症的方法，包含以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：向受试者施用有效量的一种或多种上述分离的多肽或分离的多核苷酸（例如，SEQ ID No: 1-59，或40-59，或40-56、58和59），以及SEQ ID No: 1-59，或40-59，或40-56、58和59的肽的肽或组合物，以及包含至少6个且不超过51个氨基酸的多肽，其中所述氨基酸序列包含至少6个氨基酸至不超过51个或35个氨基酸的多肽，其包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：SEQ IDNo: 1-59或40-59，或SEQ ID No: 40-56、58和59。

一方面，所述肽包含下表中确定的肽（按照出现顺序排列分别为SEQ ID NO: 48-54、40-42、45和47）（红色残基为氨基酸的D异构体），或基本上由其组成，或由其组成：

一方面，所述多肽为至少6个氨基酸且不超过51个氨基酸，或至少45个氨基酸，或40个氨基酸，或35个氨基酸，或30个氨基酸，或不超过25个氨基酸，或不超过20个氨基酸，或不超过15个氨基酸的其每一个的生物等效物。一方面，生物等效物是其中一个或多个氨基酸已被保守氨基酸取代的多肽。一方面，所有丝氨酸被丙氨酸（A-MPS）取代。另一方面，肉豆蔻酸与肽的N末端氨基酸（包括其生物等效物）共轭或结合，例如，其中所有丝氨酸被丙氨酸取代。

另一方面，所述多肽选自SEQ ID NO: 18的分离的多肽，其中对应于位置6的氨基酸已被丙氨酸、脯氨酸或甘氨酸取代；或SEQ ID NO: 19，其中对应于位置7的氨基酸已被丙氨酸、脯氨酸或甘氨酸取代；或SEQ ID NO: 20，其中对应于位置8的氨基酸已被丙氨酸、脯氨酸或甘氨酸取代。

在上述每个实施例的一个方面，D-MPS（其中所有丝氨酸均被天冬氨酸取代）和豆蔻酰化野生型MPS被明确排除在本文所公开的多肽和方法之外。

在用于治疗纤维化的一个方面，“MPS”是指至少6个氨基酸且不超过51个氨基酸的多肽，其包含SEQ ID No:1-59，或40-56、58和59，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施例和生物等效物中，其中X不存在或为碱性氨基酸，和/或Y不存在或为疏水性氨基酸。一方面，碱性氨基酸包含一个或多个赖氨酸（K）、组氨酸（H）或精氨酸（R）。一方面，所有X均为赖氨酸（K）。一方面，Y是一种或多种疏水性氨基酸，选自丙氨酸（A）、异亮氨酸（I）、亮氨酸（L）、缬氨酸（V）、苯丙氨酸（F）、色氨酸（W）或酪氨酸（Y）。一方面，所有丝氨酸都是丙氨酸。另一方面，所有X均为赖氨酸，并且所有S均被丙氨酸取代。另一方面，所有S均为天冬氨酸（D）。又一方面，如本文所公开的所有上述多肽进一步包含共轭或连接到N端氨基酸的肉豆蔻酸，或基本上由其组成，或由其组成。一方面，MPS肽包含氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成。一方面，所有丝氨酸均被丙氨酸（A-MPS）取代。另一方面，肉豆蔻酸与SEQ ID NO:1-59、40-59或40-56、58和59的N末端氨基酸共轭或连接，包括其生物等效物，例如，其中所有丝氨酸被丙氨酸取代。

所述多肽可以是不超过51个氨基酸，包含分离的多肽，或基本上由其组成，或由其组成，该分离的多肽包含不超过51个氨基酸，或基本上由其组成，或由其组成，其中该氨基酸序列包含SEQ ID No:1-59或40-59，或40-56、58和59，及其各自的生物等效物；并且其中一方面，一个或多个丝氨酸被一个或多个中性或带正电的氨基酸取代，这些氨基酸可以是相同或不同的，例如丙氨酸（A）、甘氨酸（g）或脯氨酸（P），或其各自的生物等效物，其中生物等效物包含与上述多肽或氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽，或其中生物等效物包含在高严格性条件下与编码这些多肽的互补多核苷酸或编码这些多肽的多核苷酸杂交的分离多核苷酸编码的分离的多肽，其中高严格杂交条件通常在约60℃下在约1 x SSC中进行。一方面，术语还包括具有氨基酸序列XXXRYAYXXAYX（SEQ ID NO: 58）的多肽，其中X是任何氨基酸，或XXXXXRYAYXXAYXLAGYAYXXNXX（SEQ ID NO: 59），其中X是任何氨基酸，Y是疏水氨基酸残基，包括例如酪氨酸，以及任选地包含这些序列的任何连续12个氨基酸片段的多核苷酸及其生物等效物；并且进一步任选地，其中一个或多个丝氨酸（S）被一个或多个中性或带正电的氨基酸取代，所述氨基酸可以相同或不同，例如，一个或多个丝氨酸被一个或多个丙氨酸（A）、甘氨酸（G）或脯氨酸（P）取代，其中每个X相同或不同且为碱性氨基酸，其中每个Y相同或不同且为疏水性氨基酸。MPS多肽的非限制性示例包括包含SEQ ID NO: 1-59，或40-59，或40-56、58和59的生物等效物的分离的多肽，其包含与SEQ ID NO:1-59，或40-59，或40-56、58和59具有至少80%序列同一性的多肽，并且任选地，其中一个或多个丝氨酸（S）被一个或多个中性或带正电的氨基酸取代，所述氨基酸可以是相同或不同的，例如，一个或多个丝氨酸被一个或多个丙氨酸（A）、甘氨酸（G）或脯氨酸（P）取代，和/或其中生物等效物包含由分离的多核苷酸编码的分离的多肽，其在高严格性条件下与编码SEQ ID NO:1-59，或40-59，或40-56、58和59的互补多核苷酸杂交，并且任选地，其中一个或多个丝氨酸（S）被一个或多个中性或带正电的氨基酸取代，所述氨基酸可以是相同或不同的，例如，一个或多个丝氨酸被一个或多个丙氨酸（A）、甘氨酸（G）或脯氨酸（P）和/或编码SEQ ID NO:1-59，或40-59，或40-56、58和59的多核苷酸取代，并且任选地其中一个或多个丝氨酸（S）被一个或多个中性或带正电的氨基酸取代，这些氨基酸是可以相同或不同的，例如，一个或多个丝氨酸被一个或多个丙氨酸（A）、甘氨酸（G）或脯氨酸（P）取代，其中高严格杂交条件通常在约60℃下在约1 x SSC中进行。一方面，碱性氨基酸包含一个或多个赖氨酸（K）、组氨酸（H）或精氨酸（R）。一方面，所有X均为赖氨酸（K）。一方面，Y是一种或多种疏水性氨基酸，选自丙氨酸（A）、异亮氨酸（I）、亮氨酸（L）、缬氨酸（V）、苯丙氨酸（F）、色氨酸（W）或酪氨酸（Y）。一方面，如上所述的多肽不超过45个氨基酸，或40个氨基酸，或35个氨基酸，或30个氨基酸，或不超过25个氨基酸，或不超过20个氨基酸，或不超过15个氨基酸，SEQ ID NO: 21、25、31或32、40-56、58或59的多肽，并且任选地其中一个或多个丝氨酸（S）被一个或多个中性或带正电的氨基酸取代，这些氨基酸可以是相同或不同的，例如，一个或多个丝氨酸被一个或多个丙氨酸（A）、甘氨酸（G）或脯氨酸（P）和其中每一种的生物等效物取代。

MPS多肽和生物等效物具有达到上述相同或相似结果的能力。一方面，碱性氨基酸包含一个或多个赖氨酸（K）、组氨酸（H）或精氨酸（R）。一方面，所有X均为赖氨酸（K）。一方面，Y是一种或多种疏水性氨基酸，选自丙氨酸（A）、异亮氨酸（I）、亮氨酸（L）、缬氨酸（V）、苯丙氨酸（F）、色氨酸（W）或酪氨酸（Y）。一方面，所述多肽不多于45个氨基酸，或40个氨基酸，或35个氨基酸，或30个氨基酸，或不超过25个氨基酸，或不超过20个氨基酸，或不超过15个氨基酸。

一方面，与SEQ ID NO: 46和48相比，SEQ ID NO: 45和47的多肽是MPS多肽，其中野生型MPS肽的4个丝氨酸残基被丙氨酸残基取代，例如，（KKKKKRFAFKKAFKLAGFAFKKNKK（SEQ ID NO: 45），其增加膜亲和力。SEQ ID NO: 45-48的多肽带高度正电荷，并与磷脂膜上的PIP2静电相互作用。

一方面，与纤维化相关的疾病或病症选自：肺纤维化、特发性肺纤维化、博来霉素诱导的肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化、皮肤纤维化、成纤维细胞损伤、活化的成纤维细胞增殖、炎症或肌成纤维细胞生成。

本文还提供了用于以下中的一种或多种的方法：在有需要的受试者中抑制癌细胞生长、治疗癌症、抑制转移、抑制癌干细胞生长、抑制肿瘤细胞转移或恢复耐药癌细胞对化疗剂的敏感性，包括向受试者施用有效量的一种或多种本发明的分离多肽或分离多核苷酸。一方面，癌细胞或癌症是淋巴瘤、白血病或实体瘤。另一方面，癌细胞或癌症是肺癌、肝癌、肾癌、脑癌、结直肠癌、胰腺癌、骨癌或喉癌。

本发明还提供了识别用于治疗与以下中的一种或多种相关的疾病或症状的线索和方法的方法：预防、减少、延迟、抑制或压制与MARCKS磷酸化和/或与细胞膜分离和/或PIP2隔离效应相关的疾病或病症，或PIP3产生，或AKT激活，或炎症、纤维化或活化的成纤维细胞增殖，或肌成纤维细胞的产生和分化，或转化生长因子β（TGF-β）信号通路，或癌症、肿瘤细胞生长、实体肿瘤细胞生长或转移，或癌症干细胞生长、癌症干性或肿瘤细胞转移；以及任选地用于促进凋亡或恢复耐药癌细胞对化疗药物的敏感性。

一方面，所述组合物具有预防、减少、延迟、抑制或压制与肺纤维化、特发性肺纤维化或吸烟、博来霉素诱导的肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化、皮肤纤维化、成纤维细胞病、活化的成纤维细胞增殖、炎症或肌成纤维细胞产生相关的疾病或病症的能力。另一方面，所述组合物具有预防、减少、延迟、抑制或压制与淋巴瘤、白血病或实体瘤相关的疾病或病症的能力。实体瘤的非限制性示例包括癌症、肺癌、肾癌、卵巢癌、脑癌、结直肠癌、胰腺癌、骨癌或喉癌。

因此，通过向需要此类治疗的受试者接触或施用有效量的本发明的多肽和/或其他治疗组合物（例如，抗体或siRNA）来提供在体外或体内实现此类治疗的方法。当接触在体外时，可以通过任何合适的方法进行给药，并且有效量可以由治疗医师或本领域技术人员凭经验确定。

另一方面，治疗方法包括施用有效量的抗纤维化剂或药物，或基本上由其组成，或由其组成。抗纤维化剂或药物的非限制性示例包括吡非尼酮和尼达尼布。额外的药物包括但不限于尼达尼布、口服泼尼松（或某些其他形式的皮质类固醇）、富露施（N-乙酰半胱氨酸）、癌得星（环磷酰胺）、泼尼松、硫唑嘌呤和N-乙酰半胱氨酸（NAC）的组合、秋水仙碱、D-青霉胺、吡非尼酮（5-甲基-1-苯基-2-[1H]-吡啶酮）、干扰素β1a、松弛素、洛伐他汀、贝拉克坦、N-乙酰半胱氨酸、角质形成细胞生长因子、卡托普利、肝细胞生长因子、Rho激酶抑制剂、血栓调节蛋白样蛋白、胆红素、PPARγ（过氧化物酶体增殖物激活受体γ）激活剂、伊马替尼和干扰素γ。一方面，纤维化是肺纤维化，并且额外的药剂包括秋水仙碱、D-青霉胺、吡非尼酮（5-甲基-1-苯基-2-[1H]-吡啶酮）、干扰素β1a、松弛素、洛伐他汀、贝拉克坦、N-乙酰半胱氨酸、角质形成细胞生长因子、卡托普利、肝细胞生长因子、Rho激酶抑制剂、血栓调节蛋白样蛋白、胆红素、PPARγ（过氧化物酶体增殖物激活受体γ）激活剂、伊马替尼和干扰素γ。额外的药剂在文献中是已知的，例如JP A No. 8-268906, WO 00/57913, JP A No. 2002-371006, JP A No. 2003-119138, JP A No. 2005-513031, JP A No. 2005-531628, JPA No. 2006-502153, WO 2006/068232和Ann Intern Med. 2001; 134(2): 136-51。

在一些实施例中，具有IPF的受试者“对常规治疗无反应”，即，对包括皮质类固醇、环磷酰胺和硫唑嘌呤的IPF的常规现有技术治疗无反应。

另一方面，治疗方法进一步包括施用有效量的抗癌药物或药剂，或基本上由其组成，或由其组成。

另一方面，治疗方法进一步包括施用有效量的抗癌药物或药剂，或基本上由其组成，或由其组成。另一方面，治疗方法进一步包括施用有效量的酪氨酸激酶抑制剂、铂类药物或免疫治疗药物，或基本上由其组成，或由其组成。又一方面，可适当地组合和接触或施用有效量的药剂或药物（化学治疗剂或其它）。一方面，化学治疗剂是TKI，或基于铂的药物，或靶向EGFR的试剂，或进一步靶向MARCKS多肽或其片段，其中所述片段不是MARCKS的N端片段或不与如上所述的多肽具有序列同一性的氨基酸序列的多肽。

还提供了一种用于或恢复耐药癌细胞对化疗剂的敏感性的方法，所述方法包括以下步骤，或基本上由其组成，或由其组成：使所述细胞接触或向有需要的受试者施用有效量的分离的MPS多肽或其等效物或抗MARCKS siRNA，并且任选地，其中所述化学治疗药物或药剂选自TKI、基于铂的药物、靶向EGFR的药物或药剂、顺铂、紫杉醇、厄洛替尼或达沙替尼；并且任选地，其中所述化疗耐药癌细胞是TKI耐药细胞。本领域已知抑制RNA的siRNA和shRNA-MARCKS（参见，例如，WO 2015/013669）以及本文提供的序列。所述接触在体外或体内进行，并且一方面，所述细胞是哺乳动物实体瘤细胞。一方面，与正常对应细胞相比，肿瘤细胞包含或表达更高水平的磷酸化MARCKS多肽。此类细胞的非限制性示例包括肺癌细胞、结肠癌细胞、乳腺癌细胞或胰腺癌，和替代地或另外地，患有晚期癌症（II至IV期）的患者。另一方面，所述方法进一步包括使细胞接触或向患者或受试者施用有效量的化疗药物或药剂，例如TKI，或靶向EGFR的基于铂的药物或药剂，例如顺铂、紫杉醇、厄洛替尼或达沙替尼。

本文还提供了一种提高抗纤维化或抗癌剂或药物中的一种或多种对预防、减少、延迟、抑制或压制与以下相关的疾病或病症的一种或多种的功效的方法：MARCKS磷酸化和/或与细胞膜分离和/或PIP2隔离效应，或PIP3产生，或AKT激活，或炎症、纤维化或活化的成纤维细胞增殖，或肌成纤维细胞的产生和分化，或转化生长因子β（TGF-β）信号通路，或癌症、肿瘤细胞生长、实体肿瘤细胞生长或转移，或癌症干细胞生长、癌症干性或肿瘤细胞转移；以及任选地用于促进凋亡或恢复耐药癌细胞对化疗药物的敏感性，包括向受试者施用有效量的一种或多种抗纤维化或抗癌药物或药物和有效量的本发明的分离的多肽或分离的多核苷酸或组合物。

一个方面中，本文公开了一种提高吡非尼酮和尼达尼布、贝美替尼或厄洛替尼中的一种或多种对预防、减少、延迟、抑制或压制与以下相关的疾病或病症的一种或多种的功效的方法：MARCKS磷酸化和/或与细胞膜分离和/或PIP2隔离效应相关的疾病或病症，或PIP3产生，或AKT激活，或炎症、纤维化或活化的成纤维细胞增殖，或肌成纤维细胞的产生和分化，或转化生长因子β（TGF-β）信号通路，或癌症、肿瘤细胞生长、实体肿瘤细胞生长或转移，或癌症干细胞生长、癌症干性或肿瘤细胞转移；以及任选地用于促进凋亡或恢复耐药癌细胞对化疗药物的敏感性，包括向受试者施用有效量的尼达尼布、贝美替尼或厄洛替尼中的一种或多种和有效量的本发明的分离多肽或分离多核苷酸或组合物。癌症的非限制性示例包括肺癌、肝癌、肾癌、脑癌、结直肠癌、胰腺癌、骨癌、喉癌、淋巴瘤和白血病。

在治疗应用中，将含有一种或多种本文所述的多肽或其他治疗组合物（例如，抗体或siRNA）的药物组合物施用于怀疑患有或已经患有癌症的患者，其中所述组合物的给药量足以治愈，或至少部分阻止疾病的症状（生化、组织学和/或行为），包括疾病发展过程中的并发症和中间病理表型。一方面，通过腹腔注射或口服给药。

在一个特定方面，本文公开了一种向有需要的受试者跨过血脑屏障递送本发明的多肽的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的如上所公开的载体，或基本上由其组成，或由其组成。一方面，在不存在促进跨血脑屏障转运的试剂（例如甘露醇）的情况下递送肽。

一方面，对于本文公开的治疗方法，给药是局部用于被治疗的组织或全身性的。在一个特定方面，局部给药包括外用或通过吸入疗法，或基本上由其组成，或由其组成。另一方面，全身给药选自静脉内、颅内、吸入治疗、鼻内、阴道或直肠给药。

在整个治疗过程中，体内给药可以是一次、连续或间歇给药。确定最有效的给药方式和剂量的方法为本领域技术人员所熟知的，并且将随者用于治疗的组合物、治疗目的、治疗的靶细胞、实体瘤或癌症以及治疗的受试者而变化。可由治疗医师选择剂量水平和模式进行单次或多次给药。可在下文中找到适当剂量的剂型和给药方法。额外的剂量策略在美国专利号10,039,515中公开。

所述药物组合物可通过口、鼻、肠胃外、注射、口服给药，并且可以是片剂、锭剂、颗粒、胶囊、丸剂、安瓿、栓剂或气雾剂形式。它们也可以采用活性成分在水性或非水性稀释剂、糖浆、颗粒或粉末中的悬浮液、溶液和乳液形式。除了本发明的试剂外，药物组合物还可以包含其他药物活性化合物或本发明的多种化合物。

更具体地说，本发明的制剂在本文中也称为活性成分，可通过任何合适的途径给药，包括口服、直肠、鼻腔、局部（包括经皮、气雾剂、口腔和舌下）、阴道、肠胃外（包括皮下、肌肉内、静脉内和皮内）和肺部。还应理解，优选的途径将随接受者的状况和年龄以及所治疗的疾病而变化。

理想情况下，应使用所述药物以在疾病部位达到活性化合物的峰值浓度。这可通过例如静脉注射药剂（任选地在盐水中），或例如作为含有活性成分的片剂、胶囊或糖浆经口服来实现。可通过持续输注来维持所述制剂的理想血液水平，以在疾病组织内提供治疗量的活性成分。有效组合的使用旨在提供需要比单独使用每个单独的治疗化合物或药物时所需的每种成分剂的总剂量更低的治疗组合，从而减少不良反应。

虽然该药剂可以单独施用，但优选地将其作为包含至少一种活性成分（如上文所定义）以及一种或多种在药学上可接受的载体和任选地其它治疗剂的药物制剂。每种载体都必须是“可接受的”，即与配方的其他成分相容，且不会对患者造成伤害。

配方包括适合口服、直肠、鼻、局部（包括经皮、口腔和舌下）、阴道、肠胃外（包括皮下、肌肉内、静脉内和皮内）和肺部给药的制剂。这些制剂可以方便地以单位剂型呈现，并且可以通过药学领域中众所周知的任何方法制备。此类方法包括将活性成分与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。一般来说，制剂的制备方法是将活性成分与液体载体或精细分离的固体载体或两者均匀紧密地结合，然后在必要时成型产品。

适合口服给药的本发明制剂可作为离散单元存在，例如胶囊、缓冲剂或片剂，每个单元包含预定量的活性成分；作为粉末或颗粒；作为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或作为水包油液体乳状液或油包水液体乳状液。活性成分也可呈现为丸状、膏状或糊状。

片剂可通过压缩或模塑制成，可选地含有一种或多种辅助成分。可通过在适当的机器中压缩自由流动形式的活性成分（如粉末或颗粒）制备压缩片剂，可选地与粘合剂（例如聚维酮、明胶、羟丙基甲基纤维素）、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂（例如，乙醇酸淀粉钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠）表面活性剂或分散剂混合。模制片剂可通过在适当的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物来制备。片剂可任选地被包衣或刻痕，并且可被配制成使用例如羟丙基甲基纤维素以不同比例提供其中活性成分的缓慢或受控释放，以提供所需的释放曲线。片剂可以任选地提供肠衣，以在除胃以外的肠道部分释放。

适合口腔局部给药的制剂包括含片，含片以调味基础包含活性成分，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄芩；锭剂以惰性基础（如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶）包含活性成分；以及在合适的液体载体中包含活性成分的漱口水。

根据本发明的用于局部给药的药物组合物可配制为软膏、乳膏、悬浮液、乳液、粉末、溶液、糊剂、凝胶、喷雾、气雾剂或油。可选地，制剂可包括贴片或敷料，例如浸有活性成分和任选的一种或多种赋形剂或稀释剂的绷带或胶布。

如果需要，乳霜基质的水相可包括例如至少约30% w/w的多元醇，即具有两个或更多羟基的醇，例如丙二醇、丁烷-1,3-二醇、甘露醇、山梨糖醇、甘油和聚乙二醇及其混合物。局部制剂可期望包括增强制剂通过皮肤或其他受影响区域的吸收或渗透的化合物。此类皮肤渗透促进剂的示例包括二甲基亚砜和相关类似物。

本发明乳液的油相可由已知成分以已知方式构成。虽然该相可仅包含乳化剂（否则称为乳化剂），但理想地包含至少一种乳化剂与脂肪或油或脂肪和油的混合物。优选地，亲水性乳化剂与作为稳定剂的亲脂性乳化剂一起包括。优选地同时包含油和脂肪。含或不含稳定剂的乳化剂共同构成所谓的乳化蜡，蜡与油和/或脂肪共同构成所谓的乳化软膏基质，形成乳膏配方的油分散相。

适用于本发明配方的乳液和乳液稳定剂包括Tween 60、Span 80、十六烷醇、肉豆蔻醇、单硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸钠。

为配方选择合适的油或脂肪是基于达到所需的化妆品性质，因为活性化合物在大多数可能用于医药乳液配方的油中的溶解度非常低。因此，乳膏最好是一种不油腻、不染色、可洗涤的产品，具有适当的稠度，以避免从管或其他容器中泄漏。可使用直链或支链、单或二元烷基酯，例如二异己二酸、硬脂酸异乙二醇酯、椰子脂肪酸丙二醇二酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸癸酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、棕榈酸2-乙基己基酯或称为Crodamol CAP的支链酯混合物，最后三种是优选的酯。根据所需的特性，可单独或组合使用。替代地，可以使用高熔点脂质，例如白色软石蜡和/或液体石蜡或其他矿物油。

适合眼睛局部施用的制剂还包括滴眼液，其中活性成分溶解或悬浮在合适的载体中，尤其是用于制剂的水溶剂中。

直肠给药的制剂可呈现为栓剂，其具有的合适基质，例如包含可可脂或水杨酸盐。适用于阴道给药的制剂可呈现为阴道栓、棉条、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂，除药剂外还含有本领域已知的合适的载体。

适用于鼻腔给药的制剂，其中载体为固体，包括例如具有粒度在约20至约500微米范围内的粗粉，其作为干粉给药，或在吸入器装置中通过鼻腔通道从靠近鼻子的粉末容器快速吸入。其中所述载体为供施用的液体（例如，鼻喷雾剂、滴鼻剂或通过雾化器的气雾剂）的合适制剂，包括所述制剂的水溶液或油溶液。

适合于肠胃外给药的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期受试者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和增稠剂，以及脂质体或其他微粒系统，设计用于使化合物靶向血液成分或一个或多个器官。制剂可在单位剂量或多剂量密封容器（例如安瓿和小瓶）中呈现，并可在储存在冷冻干燥（冻干）条件下，仅需在使用前立即添加无菌液体载体（例如注射用水）。临时注射溶液和悬浮液可由上述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。

应当理解，除了上述特别提到的成分之外，本发明的制剂可以包括本领域常用的其他制剂，考虑到所述制剂的类型，例如，适合口服给药的制剂可以包括作为甜味剂、增稠剂和调味剂的其他制剂。本发明的制剂、组合物和方法也旨在与其他合适的组合物和疗法结合。

本发明的方法用于治疗“受试者/对象”、“宿主”、“个体”和“患者”，例如动物，通常是哺乳动物。任何合适的哺乳动物均可通过本文所述的方法、细胞或组合物进行治疗。哺乳动物的非限制性示例包括人类、非人灵长类动物（例如猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猴子、猕猴等）、家畜（例如狗和猫）、农场动物（例如马、牛、山羊、绵羊、猪）和实验动物（例如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠）。在一些实施例中，哺乳动物是人类。哺乳动物可以是任何年龄或处于任何发育阶段（例如，成人、青少年、儿童、婴儿或子宫内的哺乳动物）。哺乳动物可以是雄性也可以是雌性。哺乳动物可以是怀孕的雌性。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，受试者患有或怀疑患有癌症或肿瘤疾病。

如本文所用，“治疗”或“治疗”受试者的疾病是指（1）防止易感或尚未显示病症的受试者出现症状或疾病；（2）抑制疾病或阻止其发展或复发；或（3）改善或导致疾病或病症消退。如本领域所理解的，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果（包括临床结果）的方法。出于本技术的目的，有益的或期望的结果可以包括但不限于减轻或改善一个或多个症状、病症（包括疾病）程度的减轻、病症（包括疾病）状态的稳定（即，不恶化），病症（包括疾病）的延迟或减缓、病症（包括疾病）、状态和缓解（无论是部分还是全部）的进展、改善或缓解，无论是否可检测。一方面，治疗不包括预防。

当疾病为癌症时，以下临床终点是治疗的非限制性示例：肿瘤负担减轻、肿瘤生长减慢、总生存期延长、肿瘤进展时间延长、转移抑制、癌症干性降低或肿瘤转移减少。一方面，治疗不包括预防。

当疾病为纤维化时，以下临床终点是治疗的非限制性示例：纤维化组织减少、炎症减少、成纤维细胞病变减少、活化成纤维细胞增殖减少、肌成纤维细胞生成减少、用力肺活量（FVC）下降率降低（其中FVC是肺功能测试期间呼出的总空气量）、FVC相对于基线的绝对和相对增加、FVC（%预测）相对于基线的绝对增加、无进展生存时间的增加、St George呼吸问卷（SGRQ）总分相对于基线的减少（其中SGRQ是一份与健康相关的生活质量问卷，分为3个部分：症状、活动和影响，总分（总权重）可以在0到100之间，分数越低表示健康状况越好）、高分辨率计算机断层扫描（HRCT）肺纤维化定量（QLF）评分相对于基线降低（其中QLF评分范围为0-100%，数值越大表示肺纤维化程度越大，被视为更差的健康状况）。以下临床试验中描述了纤维化治疗的非限制性示例临床终点和可用于测量所述临床终点的试验：NCT03733444 (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03733444), NCT00287729(clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00287729), NCT00287716 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00287716), NCT02503657(https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02503657), NCT00047645 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00047645),NCT02802345 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02802345), NCT01979952(clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01979952), NCT00650091 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00650091), NCT01335464 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01335464),NCT01335477 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01335477), NCT01366209(clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01366209)。King et al, N Engl J Med. (2014)May 29;370(22):2083-92和Richeldi et al, N Engl J Med. 2014 May 29;370(22):2071-82中描述了纤维化治疗的其他非限制性临床终点和可用于测量所述临床终点的试验。

试剂盒

本文还公开了一种试剂盒，其包含以下中的一种或多种，或基本上由其组成，或由其组成：分离的多肽、分离的多核苷酸、载体或本发明的组合物和使用说明书。一方面，说明书叙述了使用本文公开的分离的多肽、分离的多核苷酸、载体或组合物的方法。

实验

实验1

肺纤维化是正常肺损伤修复过程中的重要步骤，因为肺是不断受到环境空气污染物轰炸的主要目标器官。吸烟是导致肺损伤和修复的病因之一，持续吸烟导致肺损伤和修复失控；这可能导致危及生命的疾病，如特发性肺纤维化（IPF），中位生存期仅为3至5年^1-3。针对增加的成纤维细胞增殖和肌成纤维细胞分化已被视为IPF的治疗策略；因此，迫切需要开发能够根除肌成纤维细胞或限制其发生的药物。在过去二十年中，针对IPF开发的绝大多数疗法侧重于抗炎作用，而非抗纤维化作用，因此在临床上取得的成功有限，炎症反应的非特异性抑制和有效的免疫抑制是主要障碍。2014年，美国食品药品管理局（FDA）批准了两种用于IPF的新型治疗药物，吡非尼酮和尼达尼布，每种药物每年的成本几乎为每位患者10万美元。由于无法忍受的副作用，一些IPF患者在停用吡非尼酮后改用尼达尼布⁴。尼达尼布是一种有效的多激酶抑制剂，通过阻断包括血小板衍生生长因子（PDGF）受体、成纤维细胞生长因子（FGF）受体和血管内皮生长因子（VEGF）受体在内的几种关键受体酪氨酸激酶显示出抗纤维化和抗炎作用^5、6。不幸的是，转化生长因子β（TGF-β）通路，IPF进展^7、8中的一个重要决定因素，不是该药物的主要靶点。此外，尼达尼布治疗的副作用很常见，并且剂量越高，副作用越严重，导致停药^9、10。因此，迫切需要为那些被诊断为IPF的患者寻求新的更好的治疗方法。本发明的中心思想是开发有效的方法，在不干扰免疫和炎症反应的情况下选择性地靶向纤维化途径，并提高尼达尼布治疗的疗效。此外，申请人评估了化合物在纤维化阶段而非炎症早期的抗纤维化特性。为了揭示有益的抗纤维化化合物，非常需要在动物模型的“纤维化”阶段使用更好地反映人类IPF的候选治疗。

申请人发现主要蛋白激酶C底物MARCKS（豆蔻酰化富含丙氨酸的激酶C底物）是IPF的潜在目标分子，并开发了新的肽基疗法，用于选择性消融活化的成纤维细胞和肌成纤维细胞，而不会对正常成纤维细胞产生不利影响。除了作为蛋白激酶C的主要底物外，MARCKS还是磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）相关蛋白，通过其磷酸化位点结构域（PSD；也称为基本效应结构域）与细胞膜结合。MARCKS PSD（Ser159和Ser163）内PKC的磷酸化增强了磷酸化MARCKS（phospho-MARCKS）与膜的分离，并抑制PIP2隔离效应^11,12。最近的研究表明，MARCKSPSD在磷酸化后的一个重要功能是为PI3K提供PIP2池，用于PIP3（磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸）的生产，从而激活AKT ^13-15。通过靶向磷脂化MARCKS阻止PIP2从其酶中释放，可防止失调细胞中PIP3、三磷酸肌醇和二酰甘油的异常产生，但对正常细胞过程中的酶活性没有影响；这表明MARCKS本身可能是更有效的目标。根据MARCKS PSD的序列，申请人已识别出一种25-肽，即MPS肽，其靶向MARCKS PSD序列并抑制癌症中的AKT活化^14、16。基于这些发现，已经开发了一系列小MPS多肽，其范围从12到25个氨基酸，旨在模拟MARCKS的PSD/ED基序序列的膜曲率和PIP2保留活性。基于PIP2和PIP3保留活性的抑制效果已在体内抑制博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型、体外抑制肌成纤维细胞分化以及体外IPF组织源性成纤维细胞生长中得到验证。以下是关于本公开的结果。

MARCKS磷酸化异常升高及其与IPF成纤维细胞的相关性

为了揭示驱动肺成纤维细胞中代表IPF特征的基因表达的调节分子，采用了一种比较方法，其中整合了两种不同的微阵列数据集（GSE21369和GSE2052），以发现与非IPF患者的正常成纤维细胞相比，从IPF患者分离的肺成纤维细胞中特异性上调的基因。目前，肌成纤维细胞最明确的分子标记物是α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），它指示成纤维细胞的激活，并在IPF的发展和进展中起关键作用^17、18。值得注意的是，申请人在数据集GSE27335中发现了487个与α-SMA表达正相关的基因，其中包括肺肌成纤维细胞样细胞的分析数据。通过分析GSE21369中366个基因和GSE2052中213个基因的重叠基因，这些基因与正常成纤维细胞相比显著上调，确定了一组14个基因作为IPF中控制成纤维细胞激活的候选靶点。鉴于超过三分之一的已知生物标志物和超过三分之二的潜在疾病靶点是膜相关蛋白^19、20，关键的PIP2结合伙伴MARCKS²¹（14个已识别基因之一）引起了注意，并被选中进行进一步研究（图1A）。通过对转录组数据集²²的分析，申请人比较了从接受肺移植的IPF患者的活检残余物或肺移植手术中获得的13个样本与从肺癌患者切除的11个正常组织学肺样本之间的MARCKS基因表达。观察到IPF肺组织中MARCKS表达显著升高（图1B）。为了验证MARCKS在IPF成纤维细胞中的失调，检测了从IPF和非IPF患者分离的原代肺成纤维细胞中MARCKS的表达及其磷酸化。图2显示了与正常成纤维细胞（正常-1和-2）相比，两种IPF成纤维细胞（IPF-1和（IPF-2）中Ser159和Ser163（磷酸化MARCKS）处α-SMA、MARCKS和MARCKS磷酸化的高表达，表明IPF成纤维细胞中高磷酸化MARCKS和MARCKS表达的影响。接下来，使用MARCKS特异性短发夹RNA（MARCKS shRNA）消除磷酸化MARCKS和MARCKS表达，并显示MARCKS敲除细胞迁移减少2.9倍（图3）。申请人先前开发了一种细胞渗透肽，即MPS肽，其靶向MARCKS磷酸化位点结构域（PSD；也称为基本效应结构域），并抑制癌症中的磷酸化MARCKS水平^14、16。正如预期的那样，在原代IPF成纤维细胞中使用该肽治疗证实MARCKS抑制降低了细胞运动和增殖（图4），这与MARCKS的shRNA敲除一致。这些结果表明，MARCKS在与IPF相关的几个表型中起着重要作用。由于MARCKS的功能取决于其磷酸化，申请人下一步从正常肺样本和接受或未接受尼达尼布治疗的患者（n=18）的IPF肺组织中证实了磷酸化MARCKS的免疫组织学水平。MARCKS磷酸化的免疫组织化学（IHC）分析显示IPF患者组织切片中磷酸化MARCKS信号增加（图5）。在接受尼达尼布治疗的IPF患者的组织中也观察到强磷酸化MARCKS染色。在成纤维细胞病灶中，观察到一些成纤维细胞样细胞没有太多免疫染色，而一些未定义的细胞显示出强烈的磷酸化MARCKS信号。目前，推测未定义的实质细胞为肌成纤维细胞；用α-SMA（一种肌成纤维细胞标志物）对磷酸化MARCKS进行双重染色，可以证实这一假设。

MPS肽可能作为博来霉素诱导的肺纤维化的抗纤维化剂。博莱霉素仍然是诱导动物实验性肺纤维化的标准药物²³。因此，如前所述²³，8周龄雌性C57BL/6J小鼠气管内注射生理盐水或博来霉素（50 ml生理盐水中33 μg）。收集博来霉素或生理盐水处理小鼠的肺标本，并进行免疫荧光染色。在博来霉素处理的肺组织中，磷酸化MARCKS和α-SMA的共同表达升高（图6）。接着，从生理盐水或博来霉素处理的小鼠（两个小鼠成纤维细胞系是Dr. SemH. Phan, University of Michigan School of Medicine, MI的礼物）分离的肺成纤维细胞与100 μm对照或MPS肽孵育48小时。博来霉素处理的小鼠的成纤维细胞在MPS存在下表现出磷酸化MARCKS、磷酸化AKT和α-SMA表达的减少（图7A）。此外，MTT分析证实，与盐水处理小鼠的成纤维细胞相比，MPS处理在降低这些成纤维细胞的细胞活力方面非常有效（图7B）。对MPS肽作为博来霉素诱导的肺纤维化的抗纤维化剂的可行性进行了测试。与接受生理盐水的小鼠（对照组）相比，在博来霉素暴露9天后小鼠的体重明显降低。盐水和博来霉素暴露的小鼠每隔一天腹腔注射PBS或MPS肽（28 mg/kg）。为了确定MPS肽对肺纤维化的治疗效果，在模型的“纤维化”阶段腹腔注射MPS。总共有四组（每组五只小鼠）：1）生理盐水加PBS；2）生理盐水加MPS；3）博来霉素加PBS；4）博来霉素加MPS。令人惊讶的是，申请人观察到暴露于博来霉素加PBS的小鼠体重持续下降，但在暴露于博来霉素并接受MPS治疗的小鼠中未观察到体重持续下降（图8）。博来霉素暴露22天后，收集小鼠肺并进行组织学和Masson三色染色。暴露于博来霉素的小鼠在肺部表现出广泛的结构变化，而暴露于博来霉素和MPS治疗的小鼠的肺中观察到纤维母细胞病变和沉积的细胞外基质减少（图9）。这些结果表明磷酸化MARCKS可能是肺纤维化的治疗靶点。

MPS肽的分子基础及其提高尼达尼布疗效的潜力。鉴于PSD在MARCKS蛋白功能中的重要性，申请人先前设计了一种25-mer MPS肽来模拟MARCKS PSD，并发现该肽可直接抑制癌症中磷酸化MARCKS介导的功能，同时对正常人类上皮细胞没有细胞毒性作用^14、16。基于MARCKS PSD上的PIP2结合基序（图10A），测试了该肽对PIP2结合和PIP3合成的影响，这是AKT激活的两个主要决定因素¹⁵。动力学分析证实该肽以17.64 nM的解离常数结合PIP2（图10B）。正如预期的那样，观察到MPS处理的IPF成纤维细胞的全细胞裂解物中PIP3池减少（图10C），支持MPS肽能够通过捕获PIP2抑制AKT激活的观点。鉴于目前IPF治疗药物尼达尼布的不良反应^9、10，临床上迫切需要提高IPF治疗的疗效。由于TGF-β受体不是尼达尼布的直接靶点，因此在服用尼达尼布的同时靶向TGF-β信号传导元件可避免尼达尼布单一疗法的缺点。鉴于在接受尼达尼布治疗的IPF患者的肺组织中观察到强烈的磷酸化MARCKS染色（图5），这表明在使用这种多激酶抑制剂的治疗下，MARCKS仍然具有活性。图11A显示了在使用尼达尼布治疗后α-SMA表达的增加，这与最近关于尼达尼布诱导α-SMA的报告一致，尽管TGF-β信号部分受高剂量尼达尼布治疗的影响²⁴。令人惊讶的是，尼达尼布治疗后磷酸化AKT没有变化。基于上述观察，假设TGF-β定向的磷酸化MARCKS是激活PI3K/AKT信号的旁路机制（图11B）；因此，通过MPS治疗抑制MARCKS似乎是合理的，可以提高尼达尼布的疗效，从而允许使用较低剂量的尼达尼布。为此，我们测试了MPS和尼达尼布之间协同作用的可能性，以避免尼达尼布单一疗法的缺点。当使用尼达尼布、MPS肽或尼达尼布与MPS肽的组合物进行治疗时，原代IPF成纤维细胞的细胞活力降低，在组合物中观察到最大的活力抑制（图12A-B）。此外，Chou和Talalay CI（组合指数）法²⁵用于评估尼达尼布和MPS肽之间的治疗相互作用。MPS的加入显著增强了尼达尼布的活性抑制，在ED50时CI值约为0.5（CI<1），表明药物组合物的协同效应（图12C）。特别是，所述值在ED50时低于1，在ED75时约为1，在ED90时高于1（数据未显示）。因此，联合效应与成分呈剂量依赖性相关，因此低剂量尼达尼布联合低剂量MPS对细胞增殖具有协同效应。同时，来自台盼蓝排斥试验的数据表明，与对照组、MPS和尼达尼布相比，联合治疗的细胞存活率显著降低（图12D）。在MPS肽序列的基础上，设计并合成了该肽中PIP2结合位点的重排，旨在提高MPS肽的功效和稳定性。图13列出了各种MPS衍生物的序列。根据各种蛋白酶和PIP2结合基序的切割位点，申请人将一些L异构体氨基酸替换为D异构体，这些肽被命名为MPS-12042和MPS-22026。为了进一步验证上述MPS衍生物的疗效，申请人对接受每种MPS衍生物处理的H1650细胞进行了剂量过程分析。MTT分析显示了各种MPS相关肽的IC50值（图13）。由于MPS-12042在杀死高度增殖的细胞H1650方面最为有效，因此确定了其在治疗IPF成纤维细胞方面的作用。使用MTS分析，申请人发现MPS-12042治疗在抑制IPF成纤维细胞增殖（IC50: 1.0~1.5 µM）方面比MPS肽（IC50: 125~178 µM）有更好的效果。值得注意的是，在IPF成纤维细胞中，1 µM的浓度显著降低了50%的细胞增殖，但在正常成纤维细胞中不会（图14）。除了MPS-12042的靶向选择性外，MPS-12042的IC50低于当前FDA批准的IPF药物尼达尼布（IC50: 13.8-15.9 µM）。

根据本发明的数据，磷酸化MARCKS作为活化成纤维细胞的特异性标记物，通过使用MPS肽抑制MARCKS活性可能导致未来的临床试验和IPF患者潜在的新疗法。MPS肽在博来霉素诱导的肺纤维化中的治疗潜力首次得到证实，并将有助于开发在不影响静止成纤维细胞的情况下破坏活化成纤维细胞和/或肌成纤维细胞的治疗方法。总之，申请人的研究可能定义和验证IPF的治疗靶点和/或生物标志物，这可能导致急需的IPF新疗法的发展。

靶向MARCKS PSD与抑制干细胞样细胞特性相关。鉴于PSD在MARCKS蛋白功能中的重要性，申请人设计了一种25-mer MPS肽来模拟MARCKS磷酸化位点结构域（PSD）。大量研究表明，这种25-mer肽与质膜静电相互作用。申请人发现MPS治疗可直接抑制肺癌和肾癌中磷酸化MARKS的体外和体内功能，而该肽对正常人类上皮细胞没有细胞毒性作用^14,16。由于磷酸化MARCKS促使肺癌向更恶性的方向发展²⁹，并且肿瘤干细胞样细胞（CSC）参与癌症恶化，因此高磷酸化MARCKS与癌症干性之间可能存在关联。申请人的初步研究表明，肺癌球体中磷酸化MARCKS的升高与干细胞标志物的增加平行，如CD133、Oct3/4、SOX2和Nanog（数据未包括在内）。如前所述^30-32，癌球来源于非粘附无血清培养条件下高表达MARCKS的肺癌细胞系（H1975和CL1-5）和原发性肺癌细胞（LG704和LC3：从晚期患者中分离的胸腔积液细胞）。流式细胞术证实约80%的LG704肿瘤细胞为CD133阳性，这是一种主要的肺CSC标志物。与粘附条件下的细胞相比，在球体条件下培养这些细胞不仅对DNA损伤剂和EGFR抑制剂具有更强的抵抗力，而且在体内具有较高的致瘤性（数据未包括在内）。通过RNA-seq比较PBS和MPS处理的LG704癌球之间的转录组分析，申请人确定了总共352个因MARCKS抑制而改变的编码基因（图15，左侧）。在50 μM MPS处理后，一些预期的癌症干细胞基因减少，尤其是ABCC8、CDH5、PROM1（CD133）、ALDH1L1和FGFR2（图15，右侧）。由于球体形成（或球体形成能力）是肿瘤侵袭性的一个指标，并且与癌症患者的低生存率相关，申请人接下来证实了长期暴露于烟雾会增强癌症干性（球体形成）这一事实^33-44。通过在显微镜下计数肿瘤球（oncospheres）的数量和大小来评估球体形成能力。采用无血清培养基和非粘附培养条件下培养和富集原在粘附培养条件下培养的低侵袭性肺癌细胞系CL1-0细胞的癌干样细胞群。在暴露于PBS或香烟烟雾提取物（CSE）七天的非粘附无血清培养条件下，烟雾处理的细胞显示出更高的瘤球形成能力（图16，顶部）和各种CSC相关转录因子的高表达（图16，底部）。此外，将V5标记的野生型和PSD突变（S159/163A）MARCKS构建体引入低MARCKS表达细胞。观察到烟雾处理细胞异位表达V5标记的野生型MACRKS的球体形成能力增加约3.7倍，而在过度表达磷酸化缺陷的S159/163A MARCKS的细胞中，烟雾增强的球体形成能力和干细胞基因表达不明显（图17）。在药理学上，申请人用MPS肽处理H292细胞衍生的富含烟雾的瘤球，以靶向MARCKSPSD。图18显示了MPS肽对癌球数量和大小以及干细胞基因表达的抑制作用。MPS肽对癌症干细胞的这种抑制可能归因于抑制烟草烟雾诱导的MARCKS磷酸化。

细胞培养

经同意，从UC Davis Medical Hospital（Sacramento, CA）提供的气道组织中获得人原代成纤维细胞。大学人体受试者研究审查委员会定期审查和批准人体组织采购和使用方案。从IPF患者中建立了原代成纤维细胞系、IPF-1和IPF-2细胞。细胞取自肺活检，IPF的诊断得到病史、体格检查、肺功能测试和典型的高分辨率胸部计算机断层扫描结果的支持。在所有病例中，IPF的诊断均通过肺组织的显微分析得到证实，并证实了常见间质性肺炎的特征性形态学发现。所有患者均符合美国胸科学会和欧洲呼吸学会制定的IPF诊断标准。使用非纤维化原代对照成人肺成纤维细胞系、正常-1和正常-2细胞。这些细胞系由正常肺组织或类癌旁组织学上正常的肺组织建立。IPF细胞系LL97A购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）（Manassas, VA）。肺成纤维细胞系在含10%胎牛血清和1%青霉素链霉素的高糖DMEM或RPMI-1640培养基中，在37℃、5%CO₂的湿化空气中培养。在第4和第8代之间使用成纤维细胞。细胞被表征为如所述的成纤维细胞²⁶。

实时定量PCR

靶基因的mRNA表达水平通过实时逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测，所用引物如下所述。管家基因TATA-box结合蛋白（TBP）被用作参考基因。与TBP相比，靶基因的相对表达水平被定义为–DCT = –[CT_靶 –CT_TBP]。靶/TBP mRNA比率计算为2^–DCT×K，其中K为常数。

患者肺标本及免疫组织化学染色

IPF肺组织和非IPF正常肺标本取自在加州大学戴维斯医学中心接受手术切除的组织学确诊的IPF患者。这项调查得到加州大学戴维斯分校卫生系统机构审查委员会的批准。所有患者均获得书面知情同意书。使用福尔马林固定和石蜡包埋的标本，通过免疫组织化学染色分析磷酸化MARCKS水平，如前所述^14、16、27。这些结果也由两位病理学家独立审查和评分。

动力学分析

按照制造商的说明，在Octet RED96系统（ForteBio）上使用生物层干涉仪（BLI）评估模拟MARCKS磷酸化位点结构域的肽（MPS肽，来自野生型MARCKS蛋白的氨基酸151至175）与生物素标记的PIP2的实时结合。简单来说，在sn-1位置（在ddH₂O中为1000 nM）用生物素标记的配体PIP2被固定在超级链霉亲和素（SSA）生物传感器上10分钟。在ddH₂O中以0至1000 nM的各种浓度对MPS分析物进行结合分析。监测结合和解离5分钟。在24℃下进行分析。使用Octet数据分析软件7.0（ForteBio）分析数据。

PI（3,4,5）P3定量

收集细胞并用三氯乙酸沉淀。用甲醇：氯仿（2:1）从三氯乙酸沉淀部分提取PIP3脂质两次。酸化后，根据PIP3 Mass ELISA试剂盒（Echelon Biosciences, Salt Lake, UT）的方案，使用有机相脂质进行PIP3定量。简而言之，将培养细胞的脂质提取物与PIP3特异性检测蛋白混合，然后将其在PIP3包被的微孔板中孵育进行竞争性结合。在几次洗涤后，将微孔板与HRP连接的二级检测器和四甲基联苯胺底物一起孵育以显色。然后添加2M H₂SO₄溶液来停止进一步显色。在450 nm的吸收波长下读取微孔板。使用一系列不同稀释度的PIP3标准品为每个反应建立标准曲线。通过比较微孔中的吸光度和标准曲线中的值，可以估计细胞内PIP3的含量。实验在三个培养皿中进行，并在两个细胞密度为5×10⁶个细胞/100 mm培养皿的独立培养皿中重复。

Transwell迁移分析

如前所述^13，14，使用Transwell腔室（孔径8-μm；Costar，Cambridge, MA）进行体外细胞迁移试验。简而言之，将2×10⁴个细胞接种在聚碳酸酯过滤器的顶部，并向上部和下部孔中添加0.5 ml含有扰乱肽或MPS肽（100μM）的生长培养基。孵育20小时后，用棉签擦拭过滤器，用甲醇固定，然后用Giemsa溶液（Sigma）染色。在光学显微镜下（放大10倍）对附着在过滤器下表面的细胞进行计数。

划痕伤口愈合试验

将细胞接种到六个良好的组织培养皿中并生长至融合。使用移液管尖端将线性伤口引入每个融合的单层，并用PBS洗涤三次。此后，观察细胞形态和迁移，并定期拍照12和24小时。在光学显微镜下获取迁移到无细胞区的细胞数量并计数。

免疫印迹和免疫荧光染色

蛋白质印迹分析和全细胞裂解物的制备已在上文描述^14、16、27。对于全细胞裂解物，在裂解缓冲液（50 mM Tris HCl（pH 7.4）、1%Triton X-100、10%甘油、150 mM NaCl、1 mMEDTA、20μg/ml亮抑酶肽、1 mM PMSF和20μg/ml抑肽酶）中裂解细胞，并通过SDS-PAGE分离。用合适的抗体进行免疫印迹，然后进行化学发光检测。对于免疫荧光染色，在抗原回收步骤后，组织切片与FITC标记的α-SMA和TRITC结合的磷酸化MARCKS抗体反应，并用DAPI染色区分细胞核。将细胞安装在载玻片上，并使用荧光显微镜（Axiovert 100型；Carl Zeiss,Oberkochen, Germany）或Zeiss LSM510激光扫描共焦显微镜图像系统进行观察。

博来霉素诱导的肺纤维化

雌性C57BL/6J小鼠（8周龄）购自Jackson实验室（Sacramento, CA），如前所述²³，在气管内注射生理盐水或博来霉素。简而言之，在第0天用5%异氟醚麻醉小鼠，并通过气管内抽吸给药博来霉素（APP Pharmaceuticals，Schaumburg，IL），剂量为0.005 U/g小鼠。对照组只接受等量的无菌生理盐水。在早期纤维化阶段，这些小鼠每两天腹腔（i.p）注射PBS或MPS肽（28mg/kg）。在博来霉素损伤的21天后，牺牲这些小鼠并收集肺部进行组织学分析。小鼠实验得到加州大学戴维斯分校动物护理和使用委员会的批准。

细胞增殖和集落形成试验

细胞以每孔5-10×10³个细胞的密度接种在96孔板上，并培养用于指定处理。使用MTS分析试剂盒（Promega, Madison, WI）评估细胞增殖。向每个孔中加入20微升MTS/PMS组合溶液，在37℃下孵育3小时，并使用ELISA读数器在490 nm处测量吸光度。对于台盼蓝试验，细胞被铺在12孔板上，并用指定的化疗药物处理。72小时后，收集附着和脱落的细胞，然后用0.2%台盼蓝（0.1%最终浓度）染色，并在低倍显微镜下使用血细胞仪计数台盼蓝阳性和阴性细胞的数量。对于集落形成试验，在六孔板的每个孔中接种200个细胞。IPF-1或IPF-2原代细胞用指定浓度的肽处理10天。菌落用0.001%结晶紫染色，在倒置显微镜下计数直径大于0.5 mm的菌落数。

试剂和抗体

Dulbecco 's Modified Eagle培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血清和青霉素链霉素从Life Technologies Inc.（Carlsbad, CA）购买获得。脂质体-AMINE™ 从Invitrogen（Carlsbad, CA）购买获得。VECTASTAIN^® Elite ABC试剂盒（兔IgG）、VECTOR^® HematoxylinQS核复染和DAB溶液从VECTOR Laboratories Inc（Burlingame, CA）购买获得。抗pSer158MARCKS（克隆EP2113Y）和抗MARCKS（克隆EP1446Y）从Abcam（Cambridge, MA）购买获得。抗pSer159/163 MARCKS（克隆D13D2）、抗pSer473-AKT、抗pSer308-AKT、抗AKT、抗α-SMA、抗GAPDH和抗β-actin抗体从Cell Signaling Technology, Inc（Danvers, MA）购买获得。

引物

用于定量实时PCR的所有引物如下：α-SMA正向引物5'-TCCTCATCCTCCCTTGAGAA-3'（SEQ ID NO: 60）和反向引物5'-ATGAAGGATGGCTGGAACAG-3'（SEQ ID NO: 61）；COL1A1正向引物5'-ACGAAGACATCCCACCAATCACCT-3'（SEQ ID NO: 62）和反向引物5'-AGATCACGTCATCGCACAACACCT-3'（SEQ ID NO: 63）；THY1正向引物5'-AGAGACTTGGATGAGGAG-3'（SEQ ID NO: 64）和反向引物5'-CTGAGAATGCTGGAGATG-3'（SEQ ID NO: 65）；FN1正向引物5’-TCCACAAGCGTCATGAAGAG-3’（SEQ ID NO: 66）和反向引物5’-CTCTGAATCCTGGCATTGGT-3'（SEQ ID NO: 67）；VIM正向引物5’-AACTTCTCAGCATCACGATGAC-3’（SEQ ID NO: 68）和反向引物5’-TTGTAGGAGTGTCGGTTGTTAAG-3'（SEQ ID NO: 69）；MARCKS正向引物5’-TTGTTGAAGAAGCCAGCATGGGTG-3’（SEQ ID NO: 70）和反向引物5’-TTACCTTCACGTGGCCATTCTCCT-3’（SEQ ID NO: 71）。

患者肺样本及免疫组化染色

IPF肺组织和非IPF正常肺标本取自在加州大学戴维斯医学中心接受手术切除的组织学确诊的IPF患者。这项调查得到加州大学戴维斯分校卫生系统机构审查委员会的批准。所有患者均获得书面知情同意书。使用福尔马林固定和石蜡包埋的标本，通过免疫组织化学染色分析磷酸化MARCKS的水平，如前所述¹。详细的实验程序根据制造商（CellSignaling，Danvers，MA）提供的石蜡免疫组织化学方案进行了修改。载玻片在二甲苯中脱蜡，并在分级酒精和水中再水合。对每个一级抗体使用抗原回收步骤（亚沸点温度下10 nM柠檬酸钠（pH 6.0））。内源性过氧化物酶活性被3%过氧化氢阻断，随后阻断血清，并在4℃下与适当抗体孵育过夜。根据制造商（Vector Laboratories, Burlingame, CA）的说明，使用VECTASTAIN^® ABC系统进行免疫染色检测。设计了四点的染色强度评分系统，以确认肺标本中磷酸化MARCKS的相对表达；得分范围为0（无表达）至3（最高强度染色），如前所述^14、27-29。根据染色强度和程度将结果分为两组：在低表达组中，0-1%的细胞出现染色（染色强度得分=0）、不到10%的细胞出现染色（染色强度得分=1）或10%-25%的细胞出现染色（染色强度得分=2）出现染色；在高表达组中，超过25%的细胞出现染色（染色强度得分=3）。

实验2

阻断MARCKS-PIP3回路以减轻慢性肺纤维化

如实验1所述，申请人发现在IPF组织和细胞中MARCKS表达和MARCKS磷酸化（磷酸-MARCKS）升高。这表明在博来霉素小鼠肺纤维化模型的体外和体内都观察到了这种现象。MARCKS水平和活性（磷酸-MARCKS）与更高的促纤维化活性相关，包括细胞增殖、细胞外基质生成、侵袭性和成纤维细胞分化。在使用靶向MARCKS活性的MPS肽处理后，申请人观察这些活动的减少。第二个重要发现是，MARCKS通过PI3K/AKT途径介导这些促纤维化效应。申请人证明该信号通路在IPF组织和细胞以及博来霉素小鼠模型中均被上调。MPS肽靶向这些活性导致AKT活性降低和下游促纤维化信号。发生这种情况的机制是通过调节细胞膜上PIP2的可用性。在未磷酸化状态下，MARCKS能够在细胞膜上结合PIP2，阻止PI3K蛋白将PIP2转化为PIP3并影响下游AKT活性。磷酸化后，MARCKS从细胞膜释放到细胞质中，释放PIP2并允许PI3K将PIP2转化为PIP3。为了证明MARCKS活性和水平的升高与PIP3水平的升高相关，申请人对IPF肺成纤维细胞和正常肺成纤维细胞进行染色，并对其进行共聚焦显微镜检查。申请人在图1C和1D中证明，与正常肺成纤维细胞相比，IPF肺成纤维细胞中的PIP3和MARCKS水平升高，并且高水平的MARCKS与高水平的PIP3相关。申请人还证明在IPF肺成纤维细胞中观察到较高的PIP3，并且图19中在MPS处理后PIP3水平降低。申请人获得多个IPF肺成纤维细胞，并用PBS或100 µM MPS肽处理12小时，并使用抗PIP3抗体进行免疫细胞化学。申请人证明在IPF肺成纤维细胞中观察到较高的PIP3水平，并且在MPS肽处理后水平降低。

此外，申请人还对MPS肽进行了修饰，以提高肽的稳定性和效力。值得注意的是，MPS-12042在效力方面表现出显著的改善。申请人在博来霉素小鼠肺纤维化模型中用目前批准的IPF治疗药物尼达尼布和MPS肽对该肽进行了测试。如图20所示，MPS-12042在减轻暴露于博莱霉素的小鼠肺中的磷酸化MARCKS和磷酸化AKT以及减少整体纤维化和细胞外基质沉积方面具有卓越的功效。

总之，这些额外的证据证明了MARCKS在调节PIP2/PI3K/PIP3/AKT活性中的作用，并且MPS肽是IPF中靶向这些活性的潜在可行的选择。

等效物

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

本文说明性描述的技术可以在没有本文未具体披露的任何一个或多个元件、限制的情况下适当实施。因此，例如，术语“由……组成”、“包括”、“包含”等被广泛的而非限制性地解读。此外，本文中使用的术语和表达已被用作描述性而非限制性的术语，使用此类术语和表达时无意排除所示和描述的特征或其部分的任何等效物，但是应当理解，在要求保护的本技术的范围内可以进行各种修改。

因此，应当理解，这里提供的材料、方法和示例是优选的方面的代表，是示例性的，并不旨在限制本技术的范围。

本文对本技术进行了广泛性和一般性的描述。属于公开范围内的每一较窄物种和亚属分组也构成本技术的一部分。这包括本技术的一般性描述，附带从属中去除任何主题的附带条件或否定限制，无论此处是否具体叙述了去除的材料。

此外，如果本技术的特征或方面是根据马库什组来描述的，本领域技术人员应当理解，本技术也因此根据马库什组的任何单个成员或成员的亚组来描述。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体明确并入，其程度与每一项单独以引用的方式并入的程度相同。如有冲突，以本说明书（包括定义）为准。

在以下权利要求中阐述了其他方面。

部分序列表

粗体的氨基酸是D-异构体。

SEQ ID NO: 40 (MPS-21010)

FSFGSFSLKKFSFRKKKNKK

SEQ ID NO: 41 (MPS-21020)

KKKKFSFGSFSLKKFSFRKKKNKK

SEQ ID NO: 42 (MPS-21026)

KKKKFAFGAFALKKFAFRKKKNKK

SEQ ID NO: 43 (MPS-31010)

KKKNKSFFGKSKKFKKKKSF

SEQ ID NO: 44 (MPS-31020)

KRFLSKKKNKSFFGKSK KFKKKKSF

SEQ ID NO: 45 (MPS-12042)

KKKKKRFAFKKAFKLAGFAFKKNKK

SEQ ID NO: 46 (MPS-12041)

KKKKKRFAFKKAFKLAGFAFKKNK

SEQ ID NO: 47 (MPS-22026)

KKKKKFAFGAFALKKFAFRKKKNKK

SEQ ID NO: 48 (MPS-11022)

KKKKKRFSFKKSFKLSGFSFKANKK

SEQ ID NO: 49 (MPS-11011)

KKKKKRFSFKASFKLSGFSFKKNKK

SEQ ID NO: 50 (MPS-11010)

KKKKKRFSFAKSFKLSGFSFKKNKK

SEQ ID NO: 51 (MPS-11006)

KKKKKAFSFKKSFKLSGFSFKKNKK

SEQ ID NO: 52 (MPS-11003)

KKAKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKK

EQ ID NO: 53 (MPS-11001)

AKKKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKK

SEQ ID NO: 54 (MPS-11200)

Ac-KKKKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKK-NH2

粗体的氨基酸是D-异构体。

SEQ ID NO: 55 (共有)

X(K/R/A)F(A/S)FRX, 其中X为任何氨基酸。

SEQ ID NO: 56 (共有)

X(K/R/A)F(A/S)FRX, 其中一个或两个X为K（赖氨酸）。

SEQ ID NO: 57 (WT MPS)

KKKKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKK

SEQ ID NO: 58

XXXRYAYXXAYX, 其中X为任何氨基酸，Y为疏水性氨基酸残基。

SEQ ID NO: 59

XXXXXRYAYXXAYXLAGYAYXXNXX, 其中X为任何氨基酸，Y为疏水性氨基酸残基。

参考文献

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序列表

<110> 加利福尼亚大学董事会

<120> MPS修饰肽及其用途

<130> 060933-0740

<140>

<141>

<150> 62/849,637

<151> 2019-05-17

<160> 86

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(3)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Ser, Ala, Pro 或 Gly

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(9)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> Ser, Ala, Pro 或 Gly

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<223> 关于替换和优选实施例的详细描述，请参见提交的说明书

<400> 1

Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Ser, Ala, Pro 或 Gly

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)

<223> Ser, Ala, Pro 或 Gly

<400> 2

Lys Lys Lys Lys Arg Phe Xaa Phe Lys Lys Xaa Phe Lys

1 5 10

<210> 3

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Ser, Ala, Pro 或 Gly

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> Ser, Ala, Pro 或 Gly

<220>

<221> MOD_RES

<222> (16)..(16)

<223> Ser, Ala, Pro 或 Gly

<220>

<221> MOD_RES

<222> (19)..(19)

<223> Ser, Ala, Pro 或 Gly

<400> 3

Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Xaa Phe Lys Lys Xaa Phe Lys Leu Xaa

1 5 10 15

Gly Phe Xaa Phe Lys Lys Asn Lys Lys

20 25

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(3)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(9)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<400> 4

Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa

1 5 10

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 5

Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 6

Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> Ala, Ile, Leu, Val, Trp 或 Tyr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Ala, Ile, Leu, Val, Trp 或 Tyr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)

<223> Ala, Ile, Leu, Val, Trp 或 Tyr

<400> 7

Lys Lys Lys Arg Xaa Ser Xaa Lys Lys Ser Xaa Lys

1 5 10

<210> 8

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(5)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(11)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (18)..(18)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (21)..(22)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (24)..(25)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<400> 8

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Leu Ser

1 5 10 15

Gly Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa

20 25

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(3)

<223> His 或 Arg

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(9)

<223> His 或 Arg

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> His 或 Arg

<400> 9

Xaa Xaa Xaa Arg Phe Ser Phe Xaa Xaa Ser Phe Xaa

1 5 10

<210> 10

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Ala, Ile, Leu, Val, Trp 或 Tyr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> Ala, Ile, Leu, Val, Trp 或 Tyr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> Ala, Ile, Leu, Val, Trp 或 Tyr

<400> 10

Lys Lys Lys Lys Lys Arg Xaa Ser Xaa Lys Lys Ser Xaa Lys Leu Ser

1 5 10 15

Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys

20 25

<210> 11

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(5)

<223> His 或 Arg

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(11)

<223> His 或 Arg

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> His 或 Arg

<220>

<221> MOD_RES

<222> (21)..(22)

<223> His 或 Arg

<220>

<221> MOD_RES

<222> (24)..(25)

<223> His 或 Arg

<400> 11

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Ser Phe Xaa Xaa Ser Phe Xaa Leu Ser

1 5 10 15

Gly Phe Ser Phe Xaa Xaa Asn Xaa Xaa

20 25

<210> 12

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 12

Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys Leu Ser

1 5 10 15

Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys

20 25

<210> 13

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 13

Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ala Phe Lys Lys Ala Phe Lys Leu Ala

1 5 10 15

Gly Phe Ala Phe Lys Lys Asn Lys Lys

20 25

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(3)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(9)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<400> 14

Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa

1 5 10

<210> 15

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(5)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(11)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (18)..(18)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (21)..(22)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (24)..(25)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<400> 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Leu Ala

1 5 10 15

Gly Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa

20 25

<210> 16

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 16

Lys Lys Lys Arg Phe Ala Phe Lys Lys Ala Phe Lys

1 5 10

<210> 17

<400> 17

000

<210> 18

<400> 18

000

<210> 19

<400> 19

000

<210> 20

<400> 20

000

<210> 21

<400> 21

000

<210> 22

<400> 22

000

<210> 23

<400> 23

000

<210> 24

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(3)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(9)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<400> 24

Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa

1 5 10

<210> 25

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(4)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(10)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<400> 25

Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa

1 5 10

<210> 26

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(5)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(11)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<400> 26

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa

1 5 10

<210> 27

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(5)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(11)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<400> 27

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Leu

1 5 10 15

<210> 28

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(5)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(11)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<400> 28

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Leu Ser

1 5 10 15

<210> 29

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(5)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(11)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<400> 29

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Leu Ser

1 5 10 15

Gly

<210> 30

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(5)

<223>任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(11)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (18)..(18)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<400> 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Leu Ser

1 5 10 15

Gly Xaa

<210> 31

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(5)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(11)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (18)..(18)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<400> 31

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Leu Ser

1 5 10 15

Gly Xaa Ser

<210> 32

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(5)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(11)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (18)..(18)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<400> 32

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Leu Ser

1 5 10 15

Gly Xaa Ser Xaa

20

<210> 33

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(5)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(11)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (18)..(18)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (21)..(21)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<400> 33

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Leu Ser

1 5 10 15

Gly Xaa Ser Xaa Xaa

20

<210> 34

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(5)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(11)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (18)..(18)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (21)..(22)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<400> 34

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Leu Ser

1 5 10 15

Gly Xaa Ser Xaa Xaa Xaa

20

<210> 35

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(5)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(11)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (18)..(18)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (21)..(22)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<400> 35

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Leu Ser

1 5 10 15

Gly Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Asn

20

<210> 36

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(5)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(11)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (18)..(18)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (21)..(22)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (24)..(24)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<400> 36

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Leu Ser

1 5 10 15

Gly Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Asn Xaa

20

<210> 37

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 37

Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys Leu Ser

1 5 10 15

Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys

20 25

<210> 38

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 38

Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Asp Phe Lys Lys Asp Phe Lys Leu Asp

1 5 10 15

Gly Phe Asp Phe Lys Lys Asn Lys Lys

20 25

<210> 39

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(3)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Ser, Ala, Pro 或 Gly

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(9)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> Ser, Ala, Pro 或 Gly

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)

<223> 任何疏水性氨基酸或不存在

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> 任何碱性氨基酸或不存在

<220>

<400> 39

Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 40

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 40

Phe Ser Phe Gly Ser Phe Ser Leu Lys Lys Phe Ser Phe Arg Lys Lys

1 5 10 15

Lys Asn Lys Lys

20

<210> 41

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 41

Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Gly Ser Phe Ser Leu Lys Lys Phe Ser

1 5 10 15

Phe Arg Lys Lys Lys Asn Lys Lys

20

<210> 42

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 42

Lys Lys Lys Lys Phe Ala Phe Gly Ala Phe Ala Leu Lys Lys Phe Ala

1 5 10 15

Phe Arg Lys Lys Lys Asn Lys Lys

20

<210> 43

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 43

Lys Lys Lys Asn Lys Ser Phe Phe Gly Lys Ser Lys Lys Phe Lys Lys

1 5 10 15

Lys Lys Ser Phe

20

<210> 44

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 44

Lys Arg Phe Leu Ser Lys Lys Lys Asn Lys Ser Phe Phe Gly Lys Ser

1 5 10 15

Lys Lys Phe Lys Lys Lys Lys Ser Phe

20 25

<210> 45

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(7)

<223> D-氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(10)

<223> D-氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(15)

<223> D-氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (18)..(21)

<223> D-氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (24)..(24)

<223> D-氨基酸

<400> 45

Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ala Phe Lys Lys Ala Phe Lys Leu Ala

1 5 10 15

Gly Phe Ala Phe Lys Lys Asn Lys Lys

20 25

<210> 46

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(2)

<223> D-氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (24)..(25)

<223> D-氨基酸

<400> 46

Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ala Phe Lys Lys Ala Phe Lys Leu Ala

1 5 10 15

Gly Phe Ala Phe Lys Lys Asn Lys Lys

20 25

<210> 47

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> D-氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> D-氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(13)

<223> D-氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (15)..(16)

<223> D-氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (18)..(20)

<223> D-氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (24)..(24)

<223> D-氨基酸

<400> 47

Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ala Phe Gly Ala Phe Ala Leu Lys Lys Phe

1 5 10 15

Ala Phe Arg Lys Lys Lys Asn Lys Lys

20 25

<210> 48

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 48

Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys Leu Ser

1 5 10 15

Gly Phe Ser Phe Lys Ala Asn Lys Lys

20 25

<210> 49

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 49

Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Ala Ser Phe Lys Leu Ser

1 5 10 15

Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys

20 25

<210> 50

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 50

Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Ala Lys Ser Phe Lys Leu Ser

1 5 10 15

Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys

20 25

<210> 51

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 51

Lys Lys Lys Lys Lys Ala Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys Leu Ser

1 5 10 15

Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys

20 25

<210> 52

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 52

Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys Leu Ser

1 5 10 15

Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys

20 25

<210> 53

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 53

Ala Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys Leu Ser

1 5 10 15

Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys

20 25

<210> 54

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 54

Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys Leu Ser

1 5 10 15

Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys

20 25

<210> 55

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> 任何氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Lys, Arg 或 Ala

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Ala 或 Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任何氨基酸

<400> 55

Xaa Xaa Phe Xaa Phe Arg Xaa

1 5

<210> 56

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> 任何氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Lys, Arg 或 Ala

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Ala 或 Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任何氨基酸

<220>

<400> 56

Xaa Xaa Phe Xaa Phe Arg Xaa

1 5

<210> 57

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 57

Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys Leu Ser

1 5 10 15

Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys

20 25

<210> 58

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(3)

<223> 任何氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> 任何疏水性氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任何疏水性氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(9)

<223> 任何氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)

<223> 任何疏水性氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> 任何氨基酸

<400> 58

Xaa Xaa Xaa Arg Tyr Ala Tyr Xaa Xaa Ala Tyr Xaa

1 5 10

<210> 59

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(5)

<223> 任何氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任何疏水性氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> 任何疏水性氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(11)

<223> 任何氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> 任何疏水性氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> 任何氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (18)..(18)

<223> 任何疏水性氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> 任何疏水性氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (21)..(22)

<223> 任何氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (24)..(25)

<223> 任何氨基酸

<400> 59

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Tyr Ala Tyr Xaa Xaa Ala Tyr Xaa Leu Ala

1 5 10 15

Gly Tyr Ala Tyr Xaa Xaa Asn Xaa Xaa

20 25

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成引物

<400> 60

tcctcatcct cccttgagaa 20

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成引物

<400> 61

atgaaggatg gctggaacag 20

<210> 62

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成引物

<400> 62

acgaagacat cccaccaatc acct 24

<210> 63

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成引物

<400> 63

agatcacgtc atcgcacaac acct 24

<210> 64

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成引物

<400> 64

agagacttgg atgaggag 18

<210> 65

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成引物

<400> 65

ctgagaatgc tggagatg 18

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成引物

<400> 66

tccacaagcg tcatgaagag 20

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成引物

<400> 67

ctctgaatcc tggcattggt 20

<210> 68

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成引物

<400> 68

aacttctcag catcacgatg ac 22

<210> 69

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成引物

<400> 69

ttgtaggagt gtcggttgtt aag 23

<210> 70

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成引物

<400> 70

ttgttgaaga agccagcatg ggtg 24

<210> 71

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成引物

<400> 71

ttaccttcac gtggccattc tcct 24

<210> 72

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸

<400> 72

gagaaggcgg tgaggctga 19

<210> 73

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸

<400> 73

tcagcctcac cgccttctc 19

<210> 74

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸

<400> 74

gaaggtaaac ggcgacgct 19

<210> 75

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸

<400> 75

agcgtcgccg tttaccttc 19

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸

<400> 76

gagcgcttct ccttcaagaa 20

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸

<400> 77

ttcttgaagg agaagcgctc 20

<210> 78

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成引物

<400> 78

gatccatggg tgcccagttc tccaagaccg cagc 34

<210> 79

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成引物

<400> 79

tctagactct ctgccgcctc cgctgggggg gct 33

<210> 80

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成引物

<400> 80

gaagcgcttt gccttcaaga agtctttcaa gctga 35

<210> 81

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成引物

<400> 81

tcagcttgaa agacttcttg aagcaaagcg cttc 34

<210> 82

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成引物

<400> 82

gaagcctttt ccttcaagaa ggctttcaag ctga 34

<210> 83

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：合成引物

<400> 83

tcagcttgaa agccttcttg aaggaaaagc gcttc 35

<210> 84

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(7)

<223> 任何氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(11)

<223> 任何氨基酸

<400> 84

Lys Lys Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Lys Xaa Xaa Lys

1 5 10

<210> 85

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 85

Pro Ser Pro Ser Asn Glu Thr Pro Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe

1 5 10 15

<210> 86

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 86

Asn Gly Gln Glu Asn Gly His Val

1 5

Claims

1.一种分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO: 45、40-56、58或59的氨基酸序列或其各自的等效物。

2.如权利要求1所述的分离的多肽，其中所述多肽包含KKKKKRFAFKKAFKLAGFAFKKNKK（SEQ ID NO: 45）或其等效物。

3.如权利要求1所述的分离的多肽，其中等效物包含与权利要求1所述的分离的多肽具有至少80%序列同一性的多肽或由与编码权利要求1所述的多肽或其互补序列的分离的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽，并且粗体的氨基酸被D-氨基酸取代，所述D-氨基酸任选地分别相对于SEQ ID No. 45、40-56、58或59的多肽未经修饰。

4.如权利要求1所述的分离的多肽，其中所述多肽选自SEQ ID No. 45-47、58或59或其等效物。

5.如权利要求4所述的分离的多肽，其中所述等效物包含与如权利要求3所述的分离的多肽具有至少80%序列同一性的多肽，或由与编码权利要求4所述的多肽或其互补序列的分离的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽，并且其中粗体的氨基酸被D-氨基酸取代并且保留D-氨基酸。

6.如权利要求1所述的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含不超过51个氨基酸。

7.如权利要求1所述的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含不超过35个氨基酸。

8.如权利要求1所述的分离的多肽，进一步包含以下中的一个或多个：促进所述分离的多肽进入细胞的氨基酸序列、靶向多肽、或赋予所述多肽稳定性的多肽。

9.一种分离的多核苷酸，其编码如权利要求1所述的分离的多肽。

10.如权利要求9所述的多核苷酸的互补序列。

11.一种分离的多核苷酸，其与权利要求9或10所述的多核苷酸具有至少80%序列同一性。

12.一种载体，其包含如权利要求9或10所述的分离的多核苷酸，以及任选的可操作地连接至所述分离的多核苷酸以用于复制和/或表达的调控序列。

13.如权利要求12所述的载体，其中所述载体为AAV载体。

14.一种宿主细胞，其包含一种或多种如权利要求1所述的分离的多肽。

15.如权利要求14所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为真核细胞或原核细胞。

16.一种组合物，其包含载体和一种或多种如权利要求1所述的分离的多肽。

17.如权利要求16所述的组合物，其中所述载体为药学上可接受的载体。

18.如权利要求16或17所述的组合物，其进一步包含化疗剂或药物，或抗纤维化剂或药物。

19.一种治疗有需要的受试者中与纤维化相关的疾病或病症的方法，包括向所述受试者施用有效量的一种或多种如权利要求1所述的分离的多肽或其等效物。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述与纤维化相关的疾病或病症选自：肺纤维化、特发性肺纤维化、博来霉素诱导的肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化、皮肤纤维化、成纤维细胞病变、活化的成纤维细胞增殖、炎症或肌成纤维细胞生成，其任选地对常规治疗无反应。

21.如权利要求19或20所述的方法，其进一步包括施用有效量的抗纤维化剂或药物，其任选地为尼达尼布和吡非尼酮。

22.一种用于在有需要的受试者中抑制癌细胞生长、治疗癌症、抑制转移、抑制癌症干细胞生长、抑制癌症干性、抑制肿瘤细胞迁移、恢复耐药癌细胞对化疗药物的敏感性中的一种或多种的方法，包括向所述受试者施用有效量的一种或多种如权利要求1所述的分离的多肽或其等效物。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述癌细胞或癌症为淋巴瘤、白血病或实体瘤。

24.如权利要求22所述的方法，其中所述癌细胞或癌症为肺癌、肝癌、肾癌、脑癌、结直肠癌、胰腺癌、骨癌或喉癌。

25.如权利要求22所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用有效量的抗癌药物或药剂。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述抗癌药物或药剂选自酪氨酸激酶抑制剂（TKI），例如EGFR和VEGFR TKI，铂类药物或免疫治疗药物。

27.一种用于在有需要的受试者中跨过血脑屏障递送多肽或其等效物的方法，包括向受试者施用有效量的如权利要求12所述的载体。

28.如权利要求19所述的方法，其中给药是局部给药于被治疗组织或全身给药。

29.如权利要求28所述的方法，其中局部给药包括外用或通过吸入疗法。

30.如权利要求28所述的方法，其中全身给药选自静脉内、颅内、吸入疗法、鼻内、阴道、直肠、口服、鞘内、皮内、直接设置或舌下。

31.如权利要求19所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述哺乳动物为犬科动物、鼠科动物、马科动物、猫科动物或人类。

33.一种试剂盒，包含一种或多种如权利要求1所述的分离的多肽或其等效物，以及使用说明书。