CN114107461A - 环状rna标志物及其在诊断和预测复发性流产病理妊娠中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种环状RNA标志物及其在诊断和预测复发性流产病理妊娠中的应用。具体地，本发明提供了环状RNA标志物环状RNA hsa_circ_0007291及其检测试剂在复发性流产(RSA)的诊断和预测中的应用，包括用于制备诊断/预测RSA的诊断试剂或试剂盒。研究表明，本发明的环状RNA标志物可作为诊断RSA和预测RSA发生的标记物，具有高灵敏度和特异性。

Description

环状RNA标志物及其在诊断和预测复发性流产病理妊娠中的 应用

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，更具体地，涉及环状RNA标志物及其在诊断和预测复发性流产RSA病理妊娠中的应用。

背景技术

复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)是指女性与同一性伴侣发生至少2次的自发性流产^[1]。绝大多数RSA发生在妊娠早期，一般在孕10周以内^[2]。导致RSA的病因多样而复杂，其中已知的原因包括内分泌功能异常、解剖学因素、遗传学因素、免疫学因素、感染性疾病、父母双方高龄等；另有约50％的RSA原因不明^[3]。而临床上对于如何诊断和/或预测RSA的发生的研究，仍是空白。

环状RNAs(circular RNAs,circRNAs)是一类新型的具有调控作用的竞争性内源性非编码RNAs分子，广泛存在于真核细胞质中。与传统的线性RNA(linear RNA，含5'和3'末端)不同，circRNAs呈闭合环状结构，不易被核酸外切酶降解，表达更稳定，具有丰度高、结构稳定和组织特异性等特征^[4]。在功能上，近年的研究表明，circRNA分子富含microRNA(miRNA)结合位点，在细胞中起到miRNA海绵(miRNA sponge)的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平，这一作用机制被称为竞争性内源RNA(ceRNA)机制^[4,5]。

通过与疾病关联的miRNA相互作用，circRNA在疾病中发挥着重要的调控作用。随着在临床疾病如糖尿病、癌症、心血管疾病和神经系统疾病上的应用^[6-9]，circRNA为疾病治疗提供重要的研究新思路和治疗靶点。同时circRNA具有广泛性、保守性、组织特异性以及稳定性等特点，使其在作为疾病筛查和治疗的标志物上具有巨大潜力，并且随着高通量测序和分子生物信息学技术的快速发展，预示着它在未来会成为新型的生物标志物。目前研究发现，circRNAs在胚胎发育过程中的表达呈现出显著的动态变化，其宿主基因在人胚胎中丰富存在与DNA损伤修复、细胞器和染色体结构、细胞周期进程及代谢调节等过程息息相关^[10]，circRNAs可能参与胚胎植入失败的病理过程^[11]，在RSA患者和正常绒毛组织中circRNAs存在显著差异^[12]。多项研究均提示了circRNAs在胚胎发育和妊娠建立过程中可能具有独特而重要的功能。虽然其确切的作用机制有待阐明，但circRNAs作为鉴别RSA的候选分子在临床应用上具有广阔前景已经显露出来。

综上所述，从现有的研究可以看出，目前人们对RSA的诊断和/预测方法知之甚少。因此，本领域急需能够用于RSA诊断和/或预测的分子标志物，同时也为RSA发病机制的研究及其生物标志分子的筛选鉴定提供新的视角。

发明内容

本发明的目的是提供高灵敏度和高特异性地诊断和/或预测复发性流产(RSA)的特异标志物和检测方法。

具体地，本发明提供了环状RNA hsa_circ_0007291作为在诊断和/或预测复发性流产病理妊娠的标志物的应用。

本发明的第一方面，提供了一种复发性流产(RSA)病理妊娠标志物环状RNA或其检测试剂的用途，所述的环状RNA为hsa_circ_0007291，用于制备一诊断试剂或试剂盒，所述诊断试剂或试剂盒用于(a)诊断复发性流产RSA，和/或(b)预测复发性流产RSA发生。

在另一优选例中,所述的检测试剂包括：

(a)RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291或其cDNA；和/或

(b)特异性扩增RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291的引物或引物对、探针或芯片(如核酸芯片)。

在另一优选例中，所述的诊断包括早期诊断、辅助性诊断、或其组合。

在另一优选例中，所述RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291来源于哺乳动物。

在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人和非人哺乳动物，较佳地包括灵长动物(如人)。

在另一优选例中，所述RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291来源于人。

在另一优选例中，所述RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

在另一优选例中，所述检测是针对离体样本的检测。

在另一优选例中，所述的离体样本选自下组：血清样本、组织样本、或其组合。

在另一优选例中，所述组织样本为绒毛组织样本。

在另一优选例中，所述检测是检测血清和/或组织样本中环状RNA hsa_circ_0007291的存在与否和/或表达量。

在另一优选例中，所述标志物的表达水平显著高于正常人群水平，则提示检测对象患有RSA。

在另一优选例中，如果被检测样本中RSA标志物浓度C1显著高于对照参比值C0，则该被检测对象发生RSA的几率大于一般人群。

在另一优选例中，所述“显著高于”指C1/C0的比值≥1.5，较佳地≥2，更佳地≥3。

在另一优选例中，所述的检测试剂为PCR引物对。

在另一优选例中，所述的PCR引物对为：

5'-CAGCTCGCTGCTCATGTCT-3'，SEQ ID NO：2；和

5'-TCTACTGCCAGGAGGTTCTTG-3'，SEQ ID NO：3。

在另一优选例中，所述上游引物的GC含量为57.9％，TM值为56.7。

在另一优选例中，所述下游引物的GC含量为52.4％，TM值为57.0。

其中，所述GC含量是指在DNA 4种碱基中，鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率。

在本发明的第二方面，提供了一种用于诊断复发性流产(RSA)的试剂盒，所述的试剂盒含有一检测试剂，所述检测试剂用于检测RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291；以及说明书，其中所述说明书注明所述试剂盒用于(a)诊断RSA，和/或(b)预测RSA发生。

在另一优选例中，所述试剂盒含有RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291作为对照品或质控品。

在另一优选例中，所述的对照品或质控品为RNA或DNA。

在另一优选例中，所述的对照品或质控品选自下组：全长SEQ ID No:1或其片段P1、全长SEQ ID No:4或其片段P2，其中，所述的片段P1和P2均含有拼接位点(优选地含有GCGGTATG，其中GT为拼接位点的核苷酸)。

在另一优选例中，所述的对照品或质控品为SEQ ID No:5。

在另一优选例中，所述的试剂为PCR引物对，并且所述引物对用于扩增环状RNAhsa_circ_0007291。

在另一优选例中，所述的检测试剂为PCR引物对，所述引物对为SEQ ID No:2和SEQID No:3。

在另一优选例中，所述的说明书包含以下内容：如果检测对象的血清和/或组织样本中环状RNA hsa_circ_0007291的表达量显著高于对照参比值，该检测对象可初步判断为RSA患者或发生RSA的可能性高于普通人群。

在另一优选例中，所述对照参比值是健康人群和/或一般人工流产人群的血清和/或组织样本中环状RNA hsa_circ_0007291的表达量。

在本发明的第三方面，提供了一种检测方法，包括以下步骤：

(a)提供来自检测对象的离体的检测样本，所述检测样本为血清样本和/或组织样本；

(b)检测所述检测样本中环状RNA hsa_circ_0007291的表达量或水平；和

(c)将所述RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291的表达量或水平与对照参比值进行比较；其中，如果检测样本中RNA hsa_circ_0007291的表达量或水平显著高于对照参比值，则提示该检测对象为RSA患者或发生RSA的可能性高于普通人群。

在另一优选例中，所述的样本来自一检测对象。

在另一优选例中，所述的检测对象为人。

在另一优选例中，所述表达量采用定量PCR法检测。

在另一优选例中，如果RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291的表达量显著高于对照参比值，则该检测对象发生RSA的几率大于普通人群。

在另一优选例中，所述的对照参比值为健康人群中相同样本中的RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291的表达量。

在另一优选例中，所述的对照参比值为一般人工流产人群中相同样本中的RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291的表达量。

在另一优选例中，所述样本为血清样本。

在另一优选例中，所述样本为组织样本。

在另一优选例中，所述的方法为非诊断的和非治疗的方法。

在本发明的第四方面，提供了一种诊断RSA的方法，包括以下步骤：

a)提供一来自待测对象的测试样本，所述的测试样本选自下组：血清样本、组织样本或其组合；

b)检测所述测试样本中RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291的表达量；和

c)将所述的RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291的表达量与对照参比值进行比较。

其中所述样本中RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291的表达量显著高于对照参比值，则表明所述待测对象为RSA患者或发生RSA的几率高于普通人群。

在另一优选例中，在步骤(b)中，所述的检测包括PCR(如Q-PCR，ddPCR)、测序、或其组合。

在另一优选例中，所述的诊断包括早期诊断、辅助性诊断、或其组合。

在另一优选例中，所述的待测对象包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的普通人群包括健康人群和/或一般人工流产人群。

在另一优选例中，所述的待测对象为成年女性。

在另一优选例中，所述的待测对象为未发生流产的对象。

在另一优选例中，所述的待测对象为已发生过流产的对象。

在另一优选例中，所述环状RNA hsa_circ_0007291的表达量利用定量PCR检测，并进行数据处理，所述数据处理根据所述待测对象的环状RNA hsa_circ_0007291的表达量确定所述待测对象是否为RSA患者。

在本发明的第五方面，提供了一种RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291的用途，用作诊断RSA和/或预测RSA发生的标志物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了hsa_circ_0007291结构以及hsa_circ_0007291与基因组序列的拼接关系，以及含拼接位点的PCR扩增产物的测序结果。CDS表示该环状RNA来自编码区。F和R分别代表该基因特异性引物的位置，箭头代表引物引发的方向。

图2显示了采用Real-time PCR检测RSA患者绒毛组织和人工流产患者绒毛组织中hsa_circ_0007291的差异表达图。其中N表示样品数量。

图3显示了RSA患者绒毛组织中hsa_circ_0007291检测结果的ROC曲线。

图4显示了采用Real-time PCR检测RSA患者血清和人工流产患者血清中hsa_circ_0007291的差异表达图。其中N表示样品数量。

图5显示了RSA患者血清中hsa_circ_0007291检测结果的ROC曲线。

图6显示了对应于hsa_circ_0007291的DNA序列(SEQ ID No:4)以及引物(SEQ IDNo:2和3)的位置，其中，下划线为引物位置。

图7显示了采用SEQ ID No:2和3所获得的扩增产物的序列(SEQ ID No:5)。该扩增产物包含了hsa_circ_0007291(SEQ ID No:1或4)的拼接位点的序列。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现了一类存在于血清和/或绒毛组织中的RSA标志物，所述标志物为环状RNA hsa_circ_0007291。所述RSA标志物在RSA患者的血清和/或绒毛组织中特异性高表达，因此可用作RSA诊断(尤其是早期诊断和/或辅助诊断)的特异性标志物。实验结果显示，与正常人群相比，环状RNA hsa_circ_0007291在RSA患者中的表达量显著升高，可以作为诊断RSA的标志物。基于此完成了本发明。

术语说明

本文中使用的术语“样品”或“样本”是指与受试者特异地相关联的材料，从其中可以确定、计算或推断出与受试者有关的特定信息。样本可以全部或部分由来自受试者的生物材料构成。

如本文所用，术语“表达”表示环状RNA从基因或基因部分的产生。

如本文所用，术语“RSA”指复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion)。

RSA标志物

如本文所用，术语“本发明的标志物”、“本发明的RSA标志物”、“本发明的环状RNA标志物”、或“本发明的环状RNA标志物hsa_circ_0007291”可互换使用，指环状RNA hsa_circ_0007291或其对应的核酸序列。所述术语包括全长的hsa_circ_0007291或其片段(只要该片段可以将hsa_circ_0007291与其他核酸区别开)。此外，该术语还包括RNA形式、或其cDNA形式或DNA形式的核酸分子。此外，该术语还包括单链或双链、正义链和反义链形式的核酸分子。此外，该术语还包括环状或线性的标志物核酸分子。此外，该术语还包括全长或非全长的RNA hsa_circ_0007291，其中非全长的序列含有拼接位点(如含有GCGGTATG，其中GT为拼接位点的核苷酸)，且长度通常大于20bp。

优选地“环状RNA hsa_circ_0007291”是指呈一类封闭环状的非编码RNA，尤其是人绒毛组织或血清中的hsa_circ_0007291。

在本发明的一个具体实施例中，hsa_circ_0007291为人绒毛组织样品中的hsa_circ_0007291。

在本发明的另一个具体实施例中，hsa_circ_0007291为人血清样本中的hsa_circ_0007291。

在本发明的一个具体实施例中，所述的环状RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，起始两个核苷酸与最末两个核苷酸为环结合位点。

所述环状RNA hsa_circ_0007291的的核苷酸序列全长为785bp，如SEQ ID NO:1所示。

UAUGUGGGUGCCCCGGUGGCUUAUGUCCAGCAGAUAUUUGUGAAGUCCUCAGUGUUUCCCUGGCACAAGAACCUCCUGGCAGUAGAUGUAUUUCGUUCACCUUUGUCCCGGGCAUUCCAACUGGUGGAGGAGAUCCGGAACCACGUGCUGAGAGACAGCUCUGGGAUCAGGAGCUUGGAGGAGUUGUGUCUGCAAGUGACCGACCUGCUGCCAGGCCUUAGGAAGCUCAGGAACCUACUCCCUGAGCAUGGAUGCCUGCUGCUGUCCCCUGGGAACUUCUGGCAGAAUGACUGGGAACGCUUCCAUGCUGAUCCUGACAUCAUUGGGACCAUCCACCAGCACGAGCCUAAAACCCUGCAGACUUCAGCCACACUCAAAGACUUGUUAUUUGGUGUUCCUGGGAAGUACAGCGGGGUGAGCCUCUACACCAGGAAGAGGAUGGUCUCCUACACCAUCACCCUGGUCUUCCAGCACUACCAUGCCAAGUUCCUGGGCAGCCUGCGUGCCCGCCUGAUGCUUCUGCACCCCAGCCCCAACUGCAGCCUUCGGGCGGAGAGCCUGGUCCACGUGCACUUCAAGGAGGAGAUUGGUGUCGCUGAGCUCAUCCCCCUUGUGACCACCUACAUCAUCUUGUUUGCCUACAUCUACUUCUCCACGCGGAAGAUCGACAUGGUCAAGUCCAAGUGGGGGCUGGCCCUGGCUGCCGUGGUCACAGUGCUCAGCUCGCUGCUCAUGUCUGUGGGACUCUGCACACUCUUCGGCCUGACGCCCACCCUCAAUGGCGG(SEQ ID NO:1)

其对应的DNA序列与SEQ ID No:1是对应的(U改为T)，如SEQ ID No:4所示：

TATGTGGGTGCCCCGGTGGCTTATGTCCAGCAGATATTTGTGAAGTCCTCAGTGTTTCCCTGGCACAAGAACCTCCTGGCAGTAGATGTATTTCGTTCACCTTTGTCCCGGGCATTCCAACTGGTGGAGGAGATCCGGAACCACGTGCTGAGAGACAGCTCTGGGATCAGGAGCTTGGAGGAGTTGTGTCTGCAAGTGACCGACCTGCTGCCAGGCCTTAGGAAGCTCAGGAACCTACTCCCTGAGCATGGATGCCTGCTGCTGTCCCCTGGGAACTTCTGGCAGAATGACTGGGAACGCTTCCATGCTGATCCTGACATCATTGGGACCATCCACCAGCACGAGCCTAAAACCCTGCAGACTTCAGCCACACTCAAAGACTTGTTATTTGGTGTTCCTGGGAAGTACAGCGGGGTGAGCCTCTACACCAGGAAGAGGATGGTCTCCTACACCATCACCCTGGTCTTCCAGCACTACCATGCCAAGTTCCTGGGCAGCCTGCGTGCCCGCCTGATGCTTCTGCACCCCAGCCCCAACTGCAGCCTTCGGGCGGAGAGCCTGGTCCACGTGCACTTCAAGGAGGAGATTGGTGTCGCTGAGCTCATCCCCCTTGTGACCACCTACATCATCTTGTTTGCCTACATCTACTTCTCCACGCGGAAGATCGACATGGTCAAGTCCAAGTGGGGGCTGGCCCTGGCTGCCGTGGTCACAGTGCTCAGCTCGCTGCTCATGTCTGTGGGACTCTGCACACTCTTCGGCCTGACGCCCACCCTCAATGGCGG(SEQ ID NO:4)

环状RNA hsa_circ_0007291与基因组序列的拼接关系和结构如图1所示。所述环状RNA hsa_circ_0007291由SCAP基因4-8外显子剪切环化而成。所述环状RNA hsa_circ_0007291对应的DNA序列来源于人类的第3染色体反义链上chr3:47466974-47470160。

SCAP基因位于人3号染色体短臂，编码甾醇调控元件结合蛋白裂解活化蛋白(SREBP Cleavage-Activating Protein)。

检测方法

基于RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291在血清和/或组织样本中高表达，本发明还提供了相应的诊断RSA的方法。

本发明涉及定量检测人RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291的表达水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291表达水平，可以用于诊断(包括辅助诊断)是否存在RSA。

一种优选的方法是对RNA或cDNA，进行定量PCR检测。

根据本发明的实验结果，一种优选的诊断RSA患者的方法是基于环状RNA hsa_circ_0007291的表达水平。优选地，该方法包括以下判断方法：如果检测对象的血清和/或组织样本中环状RNA hsa_circ_0007291的表达水平显著高于正常人群和/或一般人工流产人群，则该检测对象可被初步判断为患有RSA。

检测试剂盒

基于RSA标志物与RSA的相关性，因此RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291可以作为RSA的一种诊断标志物。

本发明还提供了一种诊断RSA的试剂盒，所述的试剂盒含有一检测试剂，所述检测试剂用于检测RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291。优选地，所述试剂盒含有本发明的RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291；或者含有特异性扩增RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291的引物或引物对、探针或芯片。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括说明书，所述说明书注明所述试剂盒用于诊断RSA和/或预测RSA的发生。

ROC曲线

ROC曲线为接受者操作特性曲线(receiver operating characteristic curve)的简称，多应用在医学领域，判断某种因素对于某种疾病的诊断是否有诊断价值。ROC曲线图反映了敏感性与特异性之间的关系，横坐标X轴为1-特异性，也称为假阳性率(误报率)，X轴越接近零准确率越高；纵坐标Y轴称为敏感度，也称为真阳性率(敏感度)，Y轴越大代表准确率越好。根据曲线位置，整个图被划分成两部分，曲线下方部分的面积被称为AUC(AreaUnder Curve)，用来表示预测准确性，AUC值越高，即曲线下方面积越大，说明预测准确率越高。曲线越接近左上角(X越小，Y越大)，预测准确率越高。

本发明的主要优点：

1.本发明人首次发现环状RNA hsa_circ_0007291与RSA病理妊娠相关，可作为复发性流产(RSA)的特异性标志物。

2.通过对血清和/或绒毛组织样本的检测，获得本发明环状特异性标志物的表达情况，从而用于诊断和/或预测RSA病理妊娠情况。

3.本发明的用于RSA诊断和/或预测的环状RNA分子，为RSA发病机制的研究及其生物标志分子的筛选鉴定提供新的视角。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

材料与方法

研究对象

选择于医院计划生育门诊就诊的复发性流产患者，按下列纳入标准招募研究对象：

复发性流产组(RSA组)：与同一性伴侣连续发生2次或以上自然流产(包括本次妊娠)；本次妊娠过程中尚未发生腹疼、阴道出血及阴道排出物；在既往或后继诊疗过程中已经排除感染、解剖、内分泌及夫妇染色体核型异常，排除女方自身免疫性疾病，血栓性疾病及相关疾病家族史，排除男方精液异常。

经研究对象知情同意后，收集复发性流产和人工流产患者绒毛组织以及，RSA患者血清和人工流产患者血清。将收集到的绒毛组织和血清样品冻存于-80℃冰箱。

绒毛组织RNA提取

将预先收集在TRIZOL中的患者绒毛组织从-80℃冰箱取出后放入研钵中在液氮中用研棒研磨碎，待组织研成液体状时，室温放置5分钟。吸取液体，4℃条件下12000rpm离心5分钟后，收集上清，按TRIZOL/ml加入200μl氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置2-3分钟，4℃条件下12000rpm离心15分钟。吸取上层水相，按TRIZOL/ml加入500μl异丙醇，室温放置10分钟。放置结束后，4℃条件下12000rpm离心10分钟，弃上清，可见RNA沉于管底。按TRIZOL/ml加入1ml 75％乙醇，Vortex涡旋混合仪悬浮沉淀，4℃条件下12000rpm离心5分钟，弃上清，室温干燥沉淀5-10分钟。使用50μl体积DEPC处理水溶解RNA沉淀，测量浓度和OD260/280值，对RNA进行定量及质量分析。

血液RNA提取

使用miRNeasy Serum/Plasma试剂盒(Qiagen)，按照试剂盒说明书提取RNA。先解冻血清样品，取用200μl，加5倍体积QIAzol裂解试剂，涡旋或吹打混匀，室温(15-25℃)孵育5分钟。加与血清等体积量的氯仿，盖上盖子，剧烈震荡15秒，室温孵育2-3分钟后，4℃条件下12000g离心15分钟，吸取上层水相，按照1.5倍体积加入无水乙醇，吹打混匀。移取700μl至RNeasy MinElute离心柱中，室温条件下8000g离心15秒，弃流出液；加500μl BufferRPE，室温条件下8000g离心15秒，弃流出液；加500μl 80％乙醇，室温条件下8000g离心2分钟，弃流出液和收集管；将离心柱放入一个新的2ml收集管中，全速离心5分钟，弃流出液和收集管；将离心柱放入一个新的2ml收集管中，全速离心5分钟，弃流出液和收集管。将离心柱放入一个新的1.5ml EP管中，加14μl RNase-free水至离心柱中心，全速离心1分钟，洗脱得到RNA。测量RNA浓度和OD 260/280值，对所得RNA进行定量及质量分析。

RT-PCR反应

按照反转录试剂盒(Thermo scientific，货号：K1682)说明书配制反应体系并进行RT-PCR反应，所有操作均在冰浴中进行。具体反应体系配制以及操作步骤见表1。

表1

Real Time荧光定量PCR反应

绒毛组织RNA的RT产物，用ddH₂O稀释10倍，即：2μl RT产物+18μl ddH₂O；血清RNA的RT产物，用ddH₂O稀释1.5倍，即：20μl RT产物+10μl ddH₂O。所用引物(SEQ ID No:2和SEQ IDNo:3)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，按说明书进行操作，冻干粉配用Rnase-free的水配制成100μM的引物储存液后，分装存储；使用前，稀释10倍(45μl水+5μl储存液)，配制成10μM的工作液。按表2建立20μl的PCR反应体系：

表2

稀释后的RT产物	1.0μl
		SYBR Green Mix	10μl
Forward primer(10uM)	0.4μl
		Reverse primer(10uM)	0.4μl
ddH<sub>2</sub>O	8.2μl
		总体积	20μl

为了减少或避免加样误差，实际操作中先准备混合物后再分别加入不同引物。设置3个复孔。按表3设置热循环参数：

表3

程序结束后存储数据并关闭软件和仪器。本发明中使用的实时荧光定量PCR仪为瑞士Roche公司的

480II Real-Time PCR System。

数据处理

Real Time荧光定量PCR反应得到的原始数据按照以下公式处理：

ΔCt＝(目的基因Ct值-内参Ct值)的平均值

ΔΔCt＝(RSA组目的基因ΔCt-对照组目的基因ΔCt)的平均值

相对表达量＝(2^-ΔΔCt)的平均值。

统计学分析

统计学分析采用SPSS,version 21.0(SPSS Inc.,IL,USA)结合GraphPad Prismversion 6(Inc.,San Diego,CA,USA)软件，数据的正态性通过Shapiro-Wilk检验分析，病例组和对照组数据都符合正态分布的情况下，采用独立样本t-检验，不符合的数据采用非参数Mann–Whitney U检验，数据表示为均值±标准误，P<0.05(双尾)认为具有统计学差异。

实施例1

绒毛组织环状RNA hsa_circ_0007291表达水平的实时荧光定量PCR检测

按照上述招募标准，收集了复发性流产患者绒毛组织26例，人工流产患者绒毛组织24例。分别提取上述绒毛组织的RNA，使用实时荧光定量PCR检测两组共50例绒毛组织中环状RNA hsa_circ_0007291的表达水平。根据检测结果计算两组绒毛组织环状RNA hsa_circ_0007291的相对表达量，进行统计分析。

采用SEQ ID No:2和3为引物所获得的扩增产物的长度为152bp，经测序验证其序列如SEQ ID No:5和图7所示。序列分析表明，该扩增产物对应于RNA hsa_circ_0007291(SEQ ID No:1或4)，SEQ ID No:2和3与SEQ ID No:4的位置关系示于图6。

进一步研究表明，RNA hsa_circ_0007291来自于来源于人类的第3染色体反义链上chr3:47466974-47470160。

结果如图2所示，复发性流产绒毛组织环状RNA hsa_circ_0007291的相对表达量显著高于人工流产绒毛组织，P＝0.0163，具有显著的统计学差异。

同时，对结果进行ROC曲线分析，发现ROC曲线下面积为0.697，如图3所示。

实施例2

血清环状RNAhsa_circ_0007291表达水平的实时荧光定量PCR检测

按照上述招募标准，收集了复发性流产患者血清样品12例，人工流产患者血清样品13例。分别提取上述血清样品的RNA，使用实时荧光定量PCR检测两组共25例绒毛组织中环状RNA hsa_circ_0007291的表达水平。根据检测结果计算两组血清样品环状RNA hsa_circ_0007291的相对表达量，进行统计分析。

采用SEQ ID No:2和3为引物所获得的扩增产物的长度为152bp，经测序验证其序列如SEQ ID No:5和图7所示。

结果如图4所示，复发性流产血清环状RNA hsa_circ_0007291的相对表达量显著高于人工流产血清，P＝0.0040，具有显著的统计学差异。

同时，对结果进行ROC曲线分析，发现ROC曲线下面积为0.827，如图5所示。

综合以上结果，表明使用本申请提供的特异性扩增引物得到的扩增产物为单一条带，无非特异性扩增，所述特异性扩增引物能够作为该种检测的特异性标志物，所述环状RNA hsa_circ_0007291可以用作RSA鉴定的分子标志物。其中在组织中的检测敏感度可达50.0％，特异性可达91.7％，在血清中的检测敏感度可达75.0％，特异性可达84.6％。

实施例3

用于检测复发性流产(RSA)的试剂盒

制备一试剂盒，所述的试剂盒含有以下特异性扩增环状RNA hsa_circ_0007291的引物以及说明书：

5'-CAGCTCGCTGCTCATGTCT-3'，SEQ ID NO：2；和

5'-TCTACTGCCAGGAGGTTCTTG-3'，SEQ ID NO：3。

其中所述说明书注明所述试剂盒用于(a)诊断RSA，和/或(b)预测RSA发生。

参考文献

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在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海市计划生育科学研究所

<120> 环状RNA标志物及其在诊断和预测复发性流产病理妊娠中的应用

<130> P2020-0007

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 785

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

uaugugggug ccccgguggc uuauguccag cagauauuug ugaaguccuc aguguuuccc 60

uggcacaaga accuccuggc aguagaugua uuucguucac cuuugucccg ggcauuccaa 120

cugguggagg agauccggaa ccacgugcug agagacagcu cugggaucag gagcuuggag 180

gaguuguguc ugcaagugac cgaccugcug ccaggccuua ggaagcucag gaaccuacuc 240

ccugagcaug gaugccugcu gcuguccccu gggaacuucu ggcagaauga cugggaacgc 300

uuccaugcug auccugacau cauugggacc auccaccagc acgagccuaa aacccugcag 360

acuucagcca cacucaaaga cuuguuauuu gguguuccug ggaaguacag cggggugagc 420

cucuacacca ggaagaggau ggucuccuac accaucaccc uggucuucca gcacuaccau 480

gccaaguucc ugggcagccu gcgugcccgc cugaugcuuc ugcaccccag ccccaacugc 540

agccuucggg cggagagccu gguccacgug cacuucaagg aggagauugg ugucgcugag 600

cucauccccc uugugaccac cuacaucauc uuguuugccu acaucuacuu cuccacgcgg 660

aagaucgaca uggucaaguc caaguggggg cuggcccugg cugccguggu cacagugcuc 720

agcucgcugc ucaugucugu gggacucugc acacucuucg gccugacgcc cacccucaau 780

ggcgg 785

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagctcgctg ctcatgtct 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tctactgcca ggaggttctt g 21

<210> 4

<211> 785

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

tatgtgggtg ccccggtggc ttatgtccag cagatatttg tgaagtcctc agtgtttccc 60

tggcacaaga acctcctggc agtagatgta tttcgttcac ctttgtcccg ggcattccaa 120

ctggtggagg agatccggaa ccacgtgctg agagacagct ctgggatcag gagcttggag 180

gagttgtgtc tgcaagtgac cgacctgctg ccaggcctta ggaagctcag gaacctactc 240

cctgagcatg gatgcctgct gctgtcccct gggaacttct ggcagaatga ctgggaacgc 300

ttccatgctg atcctgacat cattgggacc atccaccagc acgagcctaa aaccctgcag 360

acttcagcca cactcaaaga cttgttattt ggtgttcctg ggaagtacag cggggtgagc 420

ctctacacca ggaagaggat ggtctcctac accatcaccc tggtcttcca gcactaccat 480

gccaagttcc tgggcagcct gcgtgcccgc ctgatgcttc tgcaccccag ccccaactgc 540

agccttcggg cggagagcct ggtccacgtg cacttcaagg aggagattgg tgtcgctgag 600

ctcatccccc ttgtgaccac ctacatcatc ttgtttgcct acatctactt ctccacgcgg 660

aagatcgaca tggtcaagtc caagtggggg ctggccctgg ctgccgtggt cacagtgctc 720

agctcgctgc tcatgtctgt gggactctgc acactcttcg gcctgacgcc caccctcaat 780

ggcgg 785

<210> 5

<211> 152

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

cagctcgctg ctcatgtctg tgggactctg cacactcttc ggcctgacgc ccaccctcaa 60

tggcggtatg tgggtgcccc ggtggcttat gtccagcaga tatttgtgaa gtcctcagtg 120

tttccctggc acaagaacct cctggcagta ga 152

Claims (10)

1.一种复发性流产(RSA)病理妊娠标志物环状RNA或其检测试剂的用途，所述的环状RNA为hsa_circ_0007291，其特征在于，用于制备一诊断试剂或试剂盒，所述诊断试剂或试剂盒用于(a)诊断复发性流产RSA，和/或(b)预测复发性流产RSA发生。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测试剂包括：

(a)RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291或其cDNA；和/或

(b)特异性扩增RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291的引物或引物对、探针或芯片。

3.如权利要求1所述的用途,其特征在于，所述RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测是针对离体样本的检测。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的离体样本选自下组：血清样本、组织样本、或其组合。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测试剂为PCR引物对。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的PCR引物对为：

5'-CAGCTCGCTGCTCATGTCT-3'，SEQ ID NO：2；和

5'-TCTACTGCCAGGAGGTTCTTG-3'，SEQ ID NO：3。

8.一种用于诊断复发性流产(RSA)的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有一检测试剂，所述检测试剂用于检测RSA标志物环状RNA hsa_circ_0007291；以及说明书，其中所述说明书注明所述试剂盒用于(a)诊断RSA，和/或(b)预测RSA发生。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有RSA标志物环状RNAhsa_circ_0007291作为对照品或质控品；和/或

所述的检测试剂为PCR引物对，所述引物对为SEQ ID No:2和SEQ ID No:3。

10.如权利要求8所述试剂盒，其特征在于，所述的说明书包含以下内容：如果检测对象的血清和/或组织样本中环状RNA hsa_circ_0007291的表达量显著高于对照参比值，该检测对象可初步判断为RSA患者或发生RSA的可能性高于一般人群。

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