CN114107154B - 一种生产莽草酸的重组菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生产莽草酸的重组菌，表达调控细胞不对称分裂的靶点基因和调控莽草酸生产的靶点基因；调控细胞不对称分裂的靶点基因包括编码细胞骨架蛋白PopZ的基因popZ，调控莽草酸生产的靶点基因包括编码DAHP合成酶的基因aroG，编码3‑脱氢奎宁酸合酶的基因aroB和编码转酮醇酶的基因tktA。本发明的重组菌实现了从头合成莽草酸，底物为葡萄糖，价格低廉，且该菌株在7.5L发酵罐发酵后，莽草酸最高产量为88.1g/L，得率为0.33g/g，生产强度为1.1g/L/h。

Description

一种生产莽草酸的重组菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种生产莽草酸的重组菌及其构建方法和应用。

背景技术

莽草酸是一种良好的医药中间体，通过影响花生四烯酸代谢，抑制血小板聚集，抑制动、静脉血栓及脑血栓形成，并具有抗炎、镇痛作用，还可作为抗病毒、抗血栓、抗脑缺血和抗癌药物。莽草酸还是微生物代谢的重要中间体，是合成生物碱、芳香族氨基酸和吲哚衍生物等的原料，具有极高的应用价值。近年来，莽草酸作为临床上对抗禽流感的唯一有效药物达菲的合成前体而倍受关注。

莽草酸途径广泛存在于植物、细菌等微生物中，利用微生物工程菌合成莽草酸，在生产规模、生产工艺与生产周期等方面具有显著优势，因此成为国内外很多医药公司与实验室研究的热点。莽草酸途径是以磷酸烯醇式丙酮酸、4-磷酸赤藓糖为起始底物，在生物体内经过一系列催化酶的催化作用生成莽草酸，然后再以莽草酸为中间化合物合成一系列芳香族类化合物，如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等的过程。生物细胞以葡萄糖为初始底物，在经过糖酵解途径合成磷酸烯醇式丙酮酸的同时，通过戊糖磷酸途径合成4-磷酸赤藓糖。生物体内的莽草酸途径以磷酸烯醇式丙酮酸与4-磷酸赤藓糖为起始化合物，在3-脱氧-D-阿拉伯糖-庚酸-7-磷酸(简称DAHP)合成酶的作用下缩合形成3-脱氧-D-阿拉伯糖-庚酸-7-磷酸。DAHP经过3-脱氢奎宁酸(简称 DHQ)合酶的催化作用生成3-脱氢奎宁酸，DHQ在3-脱氢奎宁酸脱水酶的作用下生成3-脱氢莽草酸(简称DHS)。DHS在莽草酸脱氢酶的作用下生成莽草酸(简称SA)。莽草酸经莽草酸激酶催化生成莽草酸-3-磷酸(简称简称S3P)。随后，在一系列酶的催化下，经过分支酸(简称CHA)分别转化为芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。

目前生产莽草酸的方法主要有控制路径酶的强度表达、调节辅因子的供给、优化底盘菌株和发酵条件优化，如：(i)设计基于群体感应的路径独立的动态调控系统，使细胞生长与莽草酸生产解离，以实现105mg/L莽草酸的有效积累；(ii)调节蛋白酶降解，结合生长期启动子和稳定期启动子，使细胞生长与莽草酸生产解离，产生12.63g/L莽草酸；(iii)利用生长阻滞细胞反应在谷氨酸棒状杆菌中获得最高的莽草酸产量(141g/L)。但是存在含量低、下游分离困难、耗时长、污染大的问题。因此，仍需寻找一种新的生产莽草酸的方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种调控细胞不对称分裂改善莽草酸生产性能的策略，利用细胞骨架蛋白调控细胞不对称分裂，调节不同的细胞功能，通过引入靶向细胞不对称分裂，解离细胞生长与生产，使得莽草酸积累变多。

本发明的第一个目的是提供一种生产莽草酸的重组菌，表达调控细胞不对称分裂的靶点基因和调控莽草酸生产的靶点基因；调控细胞不对称分裂的靶点基因包括编码细胞骨架蛋白PopZ的基因popZ，调控莽草酸生产的靶点基因包括编码DAHP合成酶的基因aroG，编码3-脱氢奎宁酸合酶的基因 aroB和编码转酮醇酶的基因tktA。本发明中，基因表达顺序为aroB、aroG 和tktA，同时敲除了莽草酸激酶I和II(aroK和aroL基因)。

进一步地，上述重组菌以菌株GL0002为宿主。该乳酸生产菌株已记载于Guo L,Zhang F,Zhang C,Hu G,Gao C,Chen X,et al.Enhancement of malate productionthrough engineering of the periplasmic rTCA pathway in Escherichiacoli.Biotechnol Bioeng 2018,115(6):1571-1580.。

进一步地，重组菌以pETac-PopZ和PJ01-GAB为表达载体，其中，表达载体pETac-PopZ以pETac为载体连接了基因popZ，表达载体PJ01-GAB 以PJ01为载体依次连接了基因aroB、基因aroG和基因tktA。

进一步地，表达载体由含有B0034RBS的基因片段通过同源重组的方式插入至载体中得到。如表达载体PJ01-GAB由含有B0034RBS的aroB基因、含有B0034RBS的aroG基因和含有B0034RBS的tktA基因通过同源重组的方式依次插入至PJ01载体中得到。

进一步地，编码细胞骨架蛋白PopZ的基因popZ的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，编码DAHP合成酶的基因aroG的核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

进一步地，编码3-脱氢奎宁酸合酶的基因aroB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，编码转酮醇酶的基因tktA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步地，调控细胞不对称分裂的靶点基因和调控莽草酸生产的靶点基因的表达方式为游离表达。

本发明的第二个目的是提供上述重组菌的构建方法，包括以下步骤：

将popZ片段插入到质粒pETac中，得到重组质粒pETac-PopZ；将aroB、 aroG、tktA片段利用质粒PJ01依次串联构建重组质粒PJ01-GAB；将重组质粒pETac-PopZ和重组质粒PJ01-GAB转化入菌株GL0002中构建得到重组菌。

具体地，重组质粒PJ01-GAB的构建方法为：

(1)以商业化质粒pTargetF(Addgene Plasmid#62226)为基础，采用全质粒PCR的方式，在rrnB T1终止子后插入T7Te终止子序列，以减少泄露表达；进一步地，采用全质粒PCR的方式，去除sgRNA表达框，获得仅含有Pj23119组成型启动子和双终止的工程质粒pJ01；

(2)以大肠杆菌MG1655基因组为载体，分别扩增获得含有B0034RBS 的aroB^opt、aroG^fbr、tktA片段，将aroB^opt片段采用多片段一步同源重组的方式，插入至PJ01的表达框中，获得PJ01-B质粒，以相同的方法，将aroG^fbr、 tktA两个片段采用多片段一步同源重组的方式，插入至PJ01的表达框中，获得PJ01-GAB质粒；

具体地，重组质粒pETac-PopZ质粒的构建方法为：

以大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655基因组为载体，设计含有 B0034RBS的引物，扩增获得含有B0034RBS的来源于Caulobacter crescentus 的popZ基因，通过BamH1单酶切pETac质粒中，利用同源重组获得 pETac-PopZ质粒。

本发明的第三个目的是提供一种生产莽草酸的方法，采用上述重组菌发酵生产莽草酸。

进一步地，发酵的培养基包括NBS无机盐培养基。

进一步地，发酵条件为35-38℃，200-220rpm，菌株发酵初始OD₆₀₀为 0.04-0.1，发酵70-90h，如75h；或35-38℃，480-530rpm，接种量为5-10％，装液量为30-50％，pH为6.0-7.0，菌株发酵初始OD₆₀₀为0.04-0.3，通气量为1-2vvm，发酵72-100h，本发明的一个实施例中发酵了80h。

上述重组菌可用于制备蛋白，如调控细胞不对称分裂的靶点基因对应的蛋白、调控莽草酸生产的靶点基因对应的蛋白及融合蛋白等；以及可用于制备莽草酸及含有莽草酸的产品。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明构建的重组菌表达了调控细胞不对称分裂的靶点基因和调控莽草酸生产的靶点基因，能够实现将微生物法从头合成转化为莽草酸，底物为葡萄糖，价格低廉，莽草酸产量、得率和生产强度分别达到88.1g/L、0.33g/g，和1.1g/L/h。其中莽草酸产量是大肠杆菌生产莽草酸产量中最高，比目前报道过的产量高出5％左右。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。

图1为细胞不对称分裂参数调控情况；

图2为莽草酸的生产路径；

图3为摇瓶发酵75h内对照组CT和实验组GS生产莽草酸的量；

图4为发酵罐发酵80h时生产莽草酸的量。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述实施例中所涉及的材料与方法如下：

质粒构建采用经典分子生物手段进行。

细胞形态学参数检测使用荧光显微镜(Nikon microscop,80i)进行测定，控制环境温度30度。

种子培养基：LB培养基，成分包含蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。

发酵培养基：成分包含标准发酵培养基(NBS培养基，1L)，含K₂HPO₄ (7.5g)、铁铵(III)柠檬酸(0.3g)、柠檬酸一水(2.1g)、L-苯丙氨酸(0.7g)、L- 酪氨酸(0.7g)、L-色氨酸(0.35g)、浓H₂SO₄(1.2mL)。高压前加入浓氨水将发酵培养基调至pH 7.0。以下补充物是在发酵开始前立即添加的:葡萄糖、 MgSO₄(0.24g)、对羟基苯甲酸(0.010g)、对氨基苯甲酸钾(0.010g)、2,3-二羟基苯甲酸(0.010g)及微量矿物质(NH₄)₆(Mo₇O₂₄)·4H₂O(0.0037g)、ZnSO₄、7H₂O(0.0029g)、H₃BO₃(0.0247g)、CuSO₄、5H₂O(0.0025g)、MnCl₂、4H₂O (0.0158g)，甲基-α-d-吡喃葡萄糖苷最终浓度为1mM。分别对葡萄糖、MgSO₄和甲基-α-d-吡喃葡萄糖苷溶液进行高压灭菌，用0.22μM膜对芳香维生素和微量矿物质溶液进行灭菌。在加入发酵培养基之前，通过KOH调节到pH 7，并通过0.22μm膜进行灭菌。根据需要添加消泡剂(Sigma204)。

发酵样品制备：取发酵液样品，12000rpm离心5min，取上清液稀释后，过0.22μm水系膜过滤，滤液作为用来液相色谱分析。

聚乳酸含量的测定：戴安高效液相色谱仪(配紫外可见检测器)，采用伯乐AminexHPX-87H(300×7.8mm，9μm)色谱柱，流动相为浓度0.005M 的H₂SO₄，流动相经0.22μm滤膜过滤，超声脱气，流速为0.6mL/min，柱温为35℃，在紫外检测波长210nm下检测。

实施例1不对称分裂基因的筛选

将编码细胞不对称分裂的popZ基因和绿色荧光蛋白gfp基因(gfp基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)进行融合，获得GFP-PopZ蛋白，采用融合PCR的方式在基因前面的ATG位置加上B0034RBS。将上述PCR产物回收，并与载体pETac质粒通过BamH1和Sal1酶切位点，进行双酶切同源重组，获得重组质粒pETac-GFP-PopZ。根据同样原理构建pETac-GFP质粒。

将获得的重组质粒pETac-GFP-PopZ和pETac-GFP分别导入感受态细胞 E.coliJM109中，分别获得含有细胞不对称分裂基因pETac-GFP-PopZ和 pETac-GFP质粒的菌株。

在LB培养基中，使用荧光显微镜对上述菌株进行细胞不对称分裂参数的评估。结果如图1所示。由图1A-D可知，表达GFP-PopZ融合蛋白，使得GFP能够在细胞某一极堆积。并且通过荧光显微镜的软件分析，表达 GFP-PopZ融合蛋白菌株的相对GFP荧光分布呈现某一端较高，而对照组呈现均匀的GFP荧光分布。进一步，分析了菌株的相对极点数目(1E)和不对称度(1F)，其中表达GFP-PopZ融合蛋白菌株的相对极点数目和不对称度分别达到92％和3.8。结果表明，表达PopZ能够有效的完成不对称细胞分裂。

实施例2摇瓶发酵生产莽草酸

将已经构建好的表达莽草酸合成路径(图2)相关基因的载体PJ01-GAB 和pETac-PopZ导入莽草酸生产底盘S1(菌株GL0002)感受态细胞中，获得带有PJ01-GAB和pETac-PopZ的莽草酸生产底盘获得GS菌株。

莽草酸发酵条件为37℃，220rpm，菌株发酵初始OD₆₀₀为0.1，发酵 75h。

将上述莽草酸生产菌株置于NBS培养基中培养，对含量进行鉴定。结果如图3所示，随着细菌培养时间的延长，对照组CT的莽草酸含量可增多至18.2g/L，得率达到0.29g/g。实验组的GS菌株莽草酸含量可增多至28.2 g/L，得率达到0.33g/g，分别比对照组提高54.9％和13.8％。

实施例3发酵罐发酵生产莽草酸

在7.5L发酵罐中检测GS菌株的发酵性能。莽草酸发酵条件为38℃， 480rpm，接种量为5％，装液量为46％，pH为7.0，菌株发酵初始OD₆₀₀为 0.3，通气量为1vvm，发酵80h。

如图4所示，发酵结束时，莽草酸产量和得率分别达到88.1g/L和0.33 g/g。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种生产莽草酸的重组菌及其构建方法和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 534

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

atgagcgatc agagccagga accgaccatg gaagaaattc tggcgagcat tcgccgcatt 60

atttccgagg acgacgctcc tgccgagccc gcagcagagg ctgctcctcc cccaccccca 120

gaaccagaac cggaaccggt gagctttgat gatgaagtgc tggaactgac cgatccgatt 180

gcaccagagc ctgagctacc accgctggaa accgtgggcg atattgatgt gtatagtcca 240

cctgagcccg aatcggaacc cgcttacaca cctccaccag cggcgccggt gtttgatcgc 300

gatgaggtag ctgagcaact tgtcggtgta tccgccgcga gcgcagcggc gtcagcgttc 360

ggaagcctga gcagcgcgct gctgatgccg aaagatggcc gcaccctgga agatgtggtg 420

cgcgaactgc tgcgcccgct gctgaaagaa tggctggatc agaacctgcc gcgcattgtg 480

gaaaccaaag tggaagaaga agtgcagcgc attagccgcg gccgcggcgc gtaa 534

<210> 2

<211> 1053

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60

gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120

aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180

tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240

gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300

acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360

gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420

gcaggtgagt ttctcaatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480

gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct 540

tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600

aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660

gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720

tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780

caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840

gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900

gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960

ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020

ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa 1053

<210> 3

<211> 1089

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

atggagcgta ttgtcgttac tctcggggaa cgtagttacc caattaccat cgcatctggt 60

ttgtttaatg aaccagcttc attcttaccg ctgaaatcgg gcgagcaggt catgttggtc 120

accaacgaaa ccctggctcc tctgtatctc gataaggtcc gcggcgtact tgaacaggcg 180

ggtgttaacg tcgatagcgt tatcctccct gacggcgagc agtataaaag cctggctgta 240

ctcgataccg tctttacggc gttgttacaa aaaccgcatg gtcgcgatac tacgctggtg 300

gcgcttggcg gcggcgtagt gggcgatctg accggcttcg cggcggcgag ttatcagcgc 360

ggtgtccgtt tcattcaagt cccgacgacg ttactgtcgc aggtcgattc ctccgttggc 420

ggcaaaactg cggtcaacca tcccctcggt aaaaacatga ttggcgcgtt ctaccaacct 480

gcttcagtgg tggtggatct cgactgtctg aaaacgcttc ccccgcgtga gttagcgtcg 540

gggctggcag aagtcatcaa atacggcatt attcttgacg gtgcgttttt taactggctg 600

gaagagaatc tggatgcgtt gttgcgtctg gacggtccgg caatggcgta ctgtattcgc 660

cgttgttgtg aactgaaggc agaagttgtc gccgccgacg agcgcgaaac cgggttacgt 720

gctttactga atctgggaca cacctttggt catgccattg aagctgaaat ggggtatggc 780

aattggttac atggtgaagc ggtcgctgcg ggtatggtga tggcggcgcg gacgtcggaa 840

cgtctcgggc agtttagttc tgccgaaacg cagcgtatta taaccctgct caagcgggct 900

gggttaccgg tcaatgggcc gcgcgaaatg tccgcgcagg cgtatttacc gcatatgctg 960

cgtgacaaga aagtccttgc gggagagatg cgcttaattc ttccgttggc aattggtaag 1020

agtgaagttc gcagcggcgt ttcgcacgag cttgttctta acgccattgc cgattgtcaa 1080

tcagcgtaa 1089

<210> 4

<211> 1992

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

atgtcctcac gtaaagagct tgccaatgct attcgtgcgc tgagcatgga cgcagtacag 60

aaagccaaat ccggtcaccc gggtgcccct atgggtatgg ctgacattgc cgaagtcctg 120

tggcgtgatt tcctgaaaca caacccgcag aatccgtcct gggctgaccg tgaccgcttc 180

gtgctgtcca acggccacgg ctccatgctg atctacagcc tgctgcacct caccggttac 240

gatctgccga tggaagaact gaaaaacttc cgtcagctgc actctaaaac tccgggtcac 300

ccggaagtgg gttacaccgc tggtgtggaa accaccaccg gtccgctggg tcagggtatt 360

gccaacgcag tcggtatggc gattgcagaa aaaacgctgg cggcgcagtt taaccgtccg 420

ggccacgaca ttgtcgacca ctacacctac gccttcatgg gcgacggctg catgatggaa 480

ggcatctccc acgaagtttg ctctctggcg ggtacgctga agctgggtaa actgattgca 540

ttctacgatg acaacggtat ttctatcgat ggtcacgttg aaggctggtt caccgacgac 600

accgcaatgc gtttcgaagc ttacggctgg cacgttattc gcgacatcga cggtcatgac 660

gcggcatcta tcaaacgcgc agtagaagaa gcgcgcgcag tgactgacaa accttccctg 720

ctgatgtgca aaaccatcat cggtttcggt tccccgaaca aagccggtac ccacgactcc 780

cacggtgcgc cgctgggcga cgctgaaatt gccctgaccc gcgaacaact gggctggaaa 840

tatgcgccgt tcgaaatccc gtctgaaatc tatgctcagt gggatgcgaa agaagcaggc 900

caggcgaaag aatccgcatg gaacgagaaa ttcgctgctt acgcgaaagc ttatccgcag 960

gaagccgctg aatttacccg ccgtatgaaa ggcgaaatgc cgtctgactt cgacgctaaa 1020

gcgaaagagt tcatcgctaa actgcaggct aatccggcga aaatcgccag ccgtaaagcg 1080

tctcagaatg ctatcgaagc gttcggtccg ctgttgccgg aattcctcgg cggttctgct 1140

gacctggcgc cgtctaacct gaccctgtgg tctggttcta aagcaatcaa cgaagatgct 1200

gcgggtaact acatccacta cggtgttcgc gagttcggta tgaccgcgat tgctaacggt 1260

atctccctgc acggtggctt cctgccgtac acctccacct tcctgatgtt cgtggaatac 1320

gcacgtaacg ccgtacgtat ggctgcgctg atgaaacagc gtcaggtgat ggtttacacc 1380

cacgactcca tcggtctggg cgaagacggc ccgactcacc agccggttga gcaggtcgct 1440

tctctgcgcg taaccccgaa catgtctaca tggcgtccgt gtgaccaggt tgaatccgcg 1500

gtcgcgtgga aatacggtgt tgagcgtcag gacggcccga ccgcactgat cctctcccgt 1560

cagaacctgg cgcagcagga acgaactgaa gagcaactgg caaacatcgc gcgcggtggt 1620

tatgtgctga aagactgcgc cggtcagccg gaactgattt tcatcgctac cggttcagaa 1680

gttgaactgg ctgttgctgc ctacgaaaaa ctgactgccg aaggcgtgaa agcgcgcgtg 1740

gtgtccatgc cgtctaccga cgcatttgac aagcaggatg ctgcttaccg tgaatccgta 1800

ctgccgaaag cggttactgc acgcgttgct gtagaagcgg gtattgctga ctactggtac 1860

aagtatgttg gcctgaacgg tgctatcgtc ggtatgacca ccttcggtga atctgctccg 1920

gcagagctgc tgtttgaaga gttcggcttc actgttgata acgttgttgc gaaagcaaaa 1980

gaactgctgt aa 1992

<210> 5

<211> 720

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

Claims (8)

1.一种生产莽草酸的重组菌，其特征在于：所述重组菌以菌株GL0002为宿主，敲除了编码莽草酸激酶I的基因aroK和编码莽草酸激酶II的基因aroL，并表达了调控细胞不对称分裂的靶点基因和调控莽草酸生产的靶点基因；

所述调控细胞不对称分裂的靶点基因包括编码细胞骨架蛋白PopZ的基因popZ，所述调控莽草酸生产的靶点基因依次为编码3-脱氢奎宁酸合酶的基因aroB、编码DAHP合成酶的基因aroG和编码转酮醇酶的基因tktA；

所述编码细胞骨架蛋白PopZ的基因popZ的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述编码DAHP合成酶的基因aroG的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述编码3-脱氢奎宁酸合酶的基因aroB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述编码转酮醇酶的基因tktA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌以pETac-PopZ和PJ01-GAB为表达载体，其中，所述pETac-PopZ以pETac为载体连接了基因popZ，所述PJ01-GAB以PJ01为载体依次连接了基因aroB、基因aroG和基因tktA。

3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述表达载体的构建方法为：将含有B0034RBS的基因popZ插入至pETac载体中得到pETac-PopZ；将含有B0034RBS的基因aroB、aroG和tktA依次插入至PJ01载体中得到PJ01-GAB。

4.权利要求1-3任一项所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

将popZ插入到质粒pETac中，得到重组质粒pETac-PopZ；将aroB、aroG、tktA片段利用质粒PJ01依次串联构建重组质粒PJ01-GAB；将所述重组质粒pETac-PopZ和重组质粒PJ01-GAB转化入菌株GL0002中构建得到所述重组菌；

所述popZ的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述aroG的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述aroB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述tktA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.一种生产莽草酸的方法，其特征在于：采用权利要求1-3任一项所述的重组菌发酵生产莽草酸。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述发酵的条件为35-38℃，480-530rpm，接种量为5-10％，装液量为30-50％，pH为6.0-7.0，菌株发酵初始OD₆₀₀为0.04-0.3，通气量为1-2vvm，发酵72-100h。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述发酵的条件为35-38℃，200-220rpm，菌株发酵初始OD₆₀₀为0.04-0.1，发酵70-90h。

8.权利要求1-3任一项所述的重组菌在制备莽草酸或含有莽草酸的产品中的应用。

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