CN103773740A

CN103773740A - 猪呼吸与繁殖综合征病毒复制缺陷性病毒疫苗株的构建及应用

Info

Publication number: CN103773740A
Application number: CN201310703956.3A
Authority: CN
Inventors: 宋长绪; 蒋智勇; 蔡汝健; 李艳; 刘燕玲; 张乐宜
Original assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-12-19
Filing date: 2013-12-19
Publication date: 2014-05-07
Anticipated expiration: 2033-12-19
Also published as: CN103773740B

Abstract

本发明属于疫苗制备领域，具体涉及一种猪呼吸与繁殖综合征病毒复制缺陷性病毒疫苗株的构建及应用。本发明中将猪呼吸与繁殖综合征病毒（PRRSV）Jiangxi-3株缺失部分Nsp9基因，得到复制缺陷性的Jiangxi-3株感染性克隆，同时将PRRSV的Nsp9基因克隆入Marc-145细胞，使其稳定表达Nsp9蛋白，将复制缺陷的PRRSV Jiangxi-3株感染性克隆转染表达Nsp9蛋白的Marc-145细胞，拯救出具有复制能力的rVJiangxi-3毒株，获得复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株。本发明所获得的疫苗具有良好的免疫原性，可同时保护PRRSV经典株和高致病性变异株的感染。

Description

猪呼吸与繁殖综合征病毒复制缺陷性病毒疫苗株的构建及应用

技术领域

本发明属于疫苗制备领域，具体涉及一种利用Nsp9基因缺失构建PRRSV（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，猪呼吸与繁殖综合征病毒）复制缺陷性病毒疫苗株的方法及其在疫苗生产方法中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是20世纪80年代末发现的一种高度传染性疾病，引起妊娠母猪的流产、死胎、木乃伊胎等生殖障碍，以及各种年龄猪（特别是仔猪）的呼吸道疾病。1987年美国首先报道了该病的发生。随后短短几年时间内，迅速遍及全球各养猪业发达的国家和地区。1996年，哈尔滨兽医研究所首次从国内疑似PRRS病例中分离到PRRS病毒，从而证实了本病在我国的存在。1991年，Lelystad的荷兰中央兽医研究所的Wensvoort博士用猪肺泡巨噬细胞首次分离到病原，并命名为Lelystad病毒（PRRSV欧洲型代表株）。1992年美国研究人员用CL2621细胞也分离到PRRSV美洲型代表株（VR-2332）。通过对这种病毒的形态、结构和抗原性等的研究，证明其为一种新发现的病毒。

其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），属于新成立的尼多病毒目（order Nidovirales）、动脉炎病毒科（family Arteriviridae）、动脉炎病毒属（genus Arterivirus）。PRRSV不同分离株核苷酸序列存在广泛而明显的变异，依据血清学试验及结构基因序列分析结果可将PRRSV划分为两种基本的基因型：欧洲型（Ⅰ型）和美洲株（Ⅱ型），前者主要流行于欧洲地区，而后者主要流行于美洲和亚太地区。但丹麦、斯洛伐克、加拿大已分别出现了两型PRRSV的感染。并且，丹麦发生的美洲型PRRSV的流行是由于美洲型PRRSV弱毒苗毒力返强的结果。虽然二个基因型的基因组核苷酸一致性仅55%～70%，但其形态结构、复制特点、细胞嗜性、流行传播方式及其引发的疾病特征等生物学特性均相同。

我国自2006年以来，由PRRSV变异株引起的“猪高致病性蓝耳病”是一种新型烈性传染病，它以流行广、传播快、发病率和致死率高、现行疫苗无保护作用为特征，而与经典猪蓝耳病截然不同，截止目前，本病已在我国20多个省份流行，最近我省部分中小猪场也未能幸免，沉重地打击了我国我省的养猪业，其经济损失已达到亿万元计。2008年高致病性猪蓝耳病在全国的流行较少，但2009下半年开始又出现了高致病性猪蓝耳病的爆发流行，在我国的北方省份如河南、安徽、山东等流行严重，造成了很大的经济损失。

在PRRSV中，ORF1是最大的1个阅读框，长约12kb，包括ORF1a和ORF1b，约占病毒基因组的80%，为病毒的非结构蛋白编码区，Nsp9基因位于ORF1b上主要编码RNA依赖性的RNA聚合酶（RNA－dependent RNA polymerase，RdRp），参与病毒复制过程，高度保守。Nsp9的生物学功能与病毒的生物学以及临床特征有何关系尚不清楚。反向遗传技术为研究RNA病毒的复制、致病性、蛋白功能、病毒与宿主的相互作用以及开发新型疫苗和病毒载体提供了一个很好的技术平台。Siao-Kun Wan Welch等构建了分别缺失ORF2和ORF4的PRRSV复制缺陷性病毒疫苗株，但免疫猪后只产生较弱的免疫反应（Welch,S.K.,et al.,Construction and evaluation of genetically engineered replication-defective porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccine candidates.Vet Immunol Immunopathol,2004.102(3):p.277-90.）。

猪繁殖与呼吸综合征（或猪蓝耳病）疫苗的研发是一个世界性难题，活疫苗普遍存在毒力偏强的问题，而灭活疫苗存在的主要问题是免疫效力欠佳。尽管目前针对PRRS的疫苗研究种类繁多，但没有一种疫苗可对猪体产生理想的安全保护作用。因此当前迫切需要研究出一种安全有效，免疫谱广的疫苗。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的问题及缺点，本发明的首要目的在于提供一种构建病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法。发明所应用的菌株为PRRSV Jiangxi-3株(GenBank Accession Number:EU200961.1)，通过将Nsp9（Nonstructural protein9）基因进行部分缺失，实现PRRSV的复制性缺陷特性。

本发明的另一目的在于提供上述方法制备获得的病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株。

本发明的再一目的在于提供上述病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种构建病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法，具体包含为：将PRRSV Jiangxi-3株缺失部分Nsp9基因，得到复制缺陷性的Jiangxi-3株感染性克隆，同时将PRRSV Jiangxi-3毒株的Nsp9基因克隆入Marc-145细胞，使其稳定表达Nsp9蛋白，将复制缺陷的PRRSV Jiangxi-3株感染性克隆转染表达Nsp9蛋白的Marc-145细胞，拯救出具有复制能力的rVJiangxi-3毒株，获得复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株。

所述的PRRSV Jiangxi-3株来源于2006年“高热病”期间从江西省猪场分离鉴定(GenBank Accession Number:EU200961.1)，该菌株已发表文献为：猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株Jiangxi-3的全基因组序列分析，上海交通大学学报（农业科学院），2009年2期。

所述的将PRRSV Jiangxi-3株缺失部分Nsp9基因为运用反向遗传操作和基因重组技术实现。

所述的缺失部分Nsp9基因优选为缺失PRRSV Jiangxi-3株基因组序列GenBank Accession Number EU200961.1的自5’末端第8241至8342位所示的102nt的核苷酸片段；

优选的，在将Jiangxi-3株Nsp9基因缺失102nt核苷酸的基础上，再在GenBank Accession Number EU200961.1的自5’末端第8241至8342位中插入限制性内切酶位点；所述的限制性内切酶位点优选为限制性内切酶SbfⅠ位点；

所述的rVJiangxi-3毒株可在稳定表达Nsp9蛋白的Marc-145细胞上稳定传代培养，但不能在猪体内或不表达Nsp9基因的细胞系中复制传代。

一种病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株由上述方法制备获得，该病毒疫苗株可在稳定表达Nsp9蛋白的Marc-145细胞上稳定传代培养，但不能在猪体内或不表达Nsp9基因的细胞系中复制传代。

上述病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株在制备预防和/或治疗猪呼吸与繁殖综合征疫苗中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明通过CMV启动子控制下的体外转录和脂质体介导的直接转染稳定表达Nsp9蛋白的Marc-145细胞，获得了稳定传代的复制缺陷性的PRRSV Jiangxi-3株拯救病毒rVJiangxi-3，其基因组的Nsp9编码区中缺失长度为102nt的核苷酸片段。在缺失区中引入了限制性酶切位点SbfⅠ使建立血清学和分子生物学诊断方法成为可能。引入的唯一限制性酶切位点SbfⅠ也使后续分子操作更加方便。所以rVJiangxi-3可成为PRRS标记疫苗和动脉炎病毒载体的理想候选对象，有效解决了此类疫苗存在的上述问题。

2.拯救的PRRSV克隆病毒rVJiangxi-3在体外具有良好的遗传稳定性，与亲本病毒PRRSV Jiangxi-3相比，在稳定表达Nsp9蛋白的Marc-145细胞上的复制与增殖没有显著差别，而在不表达Nsp9蛋白的Marc-145细胞上培养不增殖不产生病变。

3.动物感染试验表明，rVJiangxi-3株的致病性比亲本病毒低，对猪不产生任何临床症状，由于在猪体内病毒不能复制，但可以表达其编码的结构蛋白和非结构蛋白刺激猪体产生免疫反应。在构建的复制缺陷性的rVJiangxi-3株在其Nsp9基因内缺失了34个氨基酸，可以缺失的多肽开发鉴别诊断方法。

4.疫苗效力试验显示，本发明利用病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株制备获得的疫苗具有高的疫苗效力，病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗第5代（10^5.5TCID50）经5倍稀释后，仍然对猪繁殖与呼吸综合征（或猪蓝耳病）的防治具有显著的效果。

5.发明构建的猪呼吸与繁殖综合征病毒复制缺陷性病毒具有良好的免疫原性，可同时保护猪呼吸与繁殖综合征病毒经典株和高致病性变异株的感染。

附图说明

图1为Jiangxi-3株复制缺陷性病毒感染性克隆构建示意图。

图2为Jiangxi-3株拯救病毒间接免疫荧光鉴定图。其中，A为rVJiangxi-3d102感染Marc-145细胞36小时后IFA鉴定结果；B为rVJiangxi-3d102感染Marc-145-Nsp9细胞36小时后IFA鉴定结果。

图3为PRRSV分别在Marc-145细胞和稳定表达Nsp9的Marc-145细胞上的生长曲线。

图4为rVJiangxi-3（第20代）与PRRSV Jiangxi-3Nsp9编码区的部分序列比较。

图5为拯救病毒免疫仔猪抗体的动态变化。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明的PRRSV Jiangxi-3株复制缺陷性病毒疫苗株，所使用的原始毒株Jiangxi-3株来源于2006年“高热病”期间从江西省某猪场分离鉴定(GenBank Accession Number:EU200961.1)，（已发表文献为：猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株Jiangxi-3的全基因组序列分析，上海交通大学学报（农业科学院），2009年2期），利用反向遗传操作和基因重组技术将Jiangxi-3株缺失部分Nsp9基因，得到复制缺陷性的Jiangxi-3株感染性克隆，同时将Jiangxi-3毒株的Nsp9基因克隆入Marc-145细胞，使其稳定表达Nsp9蛋白，复制缺陷性PRRSV Jiangxi-3株感染性克隆转染表达Nsp9蛋白的Marc-145细胞，拯救出具有复制能力的rVJiangxi-3毒株，此毒株可在稳定表达Nsp9蛋白的Marc-145细胞上稳定传代培养，但不能在猪体内或不表达Nsp9基因的细胞系中复制传代。

实施例1：含有Nsp9缺失编码区的重组载体pACYC-Jiangxi-3d102的构建

本实施例是PRRSV Jiangxi-3基因组全长cDNA将Nsp9编码区中缺失长度为102bp的核苷酸片段，并将其克隆到质粒pACYC177载体中得到重组载体。所述核苷酸片段的核苷酸序列如GenBank Accession Number EU200961的自5’未端第8241至8342位所示。

1、含有Nsp9缺失编码区的核苷酸片段的重组载体的构建

根据Jiangxi-3全序列(GenBank序列号EU200961)和质粒载体pACYC177的限制性酶切位点，用软件设计克隆和检测引物（如表1），引物由上海英骏生物技术公司合成。

表1用于构建PRRSV Jiangxi-3株感染性克隆的引物序列

在PRRSV Jiangxi-3株全基因组序列测定的基础上，分析其基因组和克隆载体的酶切位点，利用Jiangxi-3株核酸序列自5’未端第6465位AflⅡ、第11883位AscⅠ、第13122位SalⅠ设计8对引物扩增出相互重叠的4段核酸片段，分别命名为FA、FB、FC、FD。扩增基因组5’端即FA段所用引物FA-F的5’端引入限制性内切酶MluⅠ酶切位点，在扩增基因组3’端poly(A41)即FD段所用引物FD-R中引入PacI酶切位点，其构建方法如图1所示。

2.pACYC177载体的改造

pACYC177载体含有Amp和Kan抗性基因，移除pACYC177载体的BamHⅠ和BglⅡ两位点间的序列，为了便于PRRSV全基因组的插入，在BamHⅠ和BglⅡ两位点间插入新的酶切位点NotⅠ、MluⅠ、AflⅡ、AscⅠ、SalⅠ和PacⅠ。为达此目人工合成了一段多克隆位点核酸序列，其序列ATCGGATCCAATGCGGCCGCTAGCTCGACGCGTAAGCATCTTAAGCGATC CAGGCGCGCCGGTATGCGTCGACCTTGGACTTAATTAAGTCGAATGCCCT TCCGGCATACTG，序列中有下划线的序列依次BamHⅠ、NotⅠ、MluⅠ、AflⅡ、AscⅠ、SalⅠ、PacⅠ和BglⅡ的识别序列。将这段接头（Linker）序列用BamHⅠ和BglⅡ进行酶切然后克隆于pACYC177载体，替换pACYC177载体中BamHⅠ和BglⅡ两位点间原有序列,将此载体命名为pACYC-Linker载体。

PRRSV Jiangxi-3株全基因组前引入CMV启动子，并使PRRSV5’端第一碱基置于CMV启动子的转录起始位点，目的是使转录正好从PRRSV Jiangxi-3株全基因组5’端开始，CMV启动子用引物CMV-F和CMV-R以含CMV启动子的质粒载体如pVax(美国Invitrogen公司)为模板进行扩增，引物CMV-F引入了NotⅠ酶切位点，引物CMV-Ｒ引入了MluⅠ酶切位点。改造后的pACYC177载体名为pACYC-CMV-Linker载体。

3.Nsp9编码区缺失102bp核苷酸片段的构建

如图1所示Nsp9位于PRRSV Jiangxi-3株全基因组的片段B上，利用表1中2对引物FB-F、Nsp9-dR和Nsp9-dF、FB-R分别扩增出片段B中Nsp9编码缺失区前后端的序列，然后以这两段PCR产物为模板用引物FB-F和FB-R配对扩增出Nsp9编码区缺失102bp核苷酸片段B，获得的带有Nsp9编码区缺失102bp核苷酸的片段B命名为FBd102，在引物Nsp9-dR和Nsp9-dF的5’端添加了限制性内切酶SbfⅠ的识别序列CCTGCAGG（表1中下划线表示），扩增得到的片段就引入限制性内切酶SbfⅠ可作为遗传标志。

4.含有Nsp9缺失编码区的PRRSV Jiangxi-3株全基因组重组载体的构建

（1）病毒基因组RNA提取和cDNA的合成

病毒基因组RNA提取采用TaKaRa公司(中国大连)的病毒RNA/DNA提取试剂盒按照试剂盒说明书进行，提取的RNA最后溶解在40μL超纯水中。

cDNA的合成:按照美国Invitrogen公司反转录试剂盒说明书进行，分别将表1中引物FD-R、引物FC-R和FB-R(10μM)0.5μL，再加入dNTP1μL(10μM each)与6μL RNA样品、5.5μL dd H₂O混合均匀，在PCR仪中加热到65℃5min，取出迅速放入冰水中2min，然后加入4μL5×RT-PCR Buffer，1μL DDT，1μL RNaseOUT，反转录酶SuperscriptTMⅢ1μL(100u／μL)，混匀，在PCR仪中于55℃反转录60min，70℃10min，反应结束后取出立即使用或-20℃冻存备用。

（2）病毒基因组分段PCR扩增

PCR扩增参照美国Fermentas公司的TransStart FastPfu产品说明书进行。每个PCR反应体系为50μl，包括5×TransStart FastPfu Buffer10μl，dNTP(2.5mM each)4μl，TransStart FastPfu1.5μl，上、下游引物各2μl(10μM)，cDNA2μl，补充水至50μl。按常规PCR条件一般为95℃1mins；95℃30secs，55℃，30secs，72℃5mins，运行35个循环；最后72℃10mins。退火温度和延伸时间以每对引物的Tm值及其扩增片段的长度作相应调整。

（3）PRRSV Jiangxi-3株全长cDNA的拼接

分别将FA、FBd102、FC、FD核苷酸片段的PCR产物电泳回收用相应的限制性内切酶进行酶切反应，电泳回收酶切后的PCR产物，将各片段按照常规克隆方法依次克隆入pACYC-CMV-Linker载体中，构建后的重组质粒pACYC-CMV-Jiangxi-3d102基因序列如图1所示。

（4）全基因组cDNA克隆的测序鉴定

将构建的全基因组cDNA克隆pACYC-CMV-Jiangxi-3d102送上海英骏生物公司进行PRRSV Jiangxi-3株全基因组的测序，将所测序列与原始病毒核酸序列比对，找出突变的核苷酸位点。

实施例2:Nsp9稳定表达细胞系的构建

1.重组质粒pIRESpuro-Nsp9的构建

真核表达质粒pIRESpuro2购自美国Clonetec公司；Marc-145细胞购自美国ATCC公司。根据GenBank中的Jiangxi-3（EF398047）Nsp9基因序列设计一对引物：Nsp9-F：5′-ATCGCTAGCATGCTAGCCGCCAGCGGCT，Nsp9-R：5′-ATCGCGGCCGCTTATTCTCATGATTGGACCTGAGT。为了便于克隆在引物Nsp9-F和Nsp9-R中分别引入了NheⅠ和NotⅠ限制性酶切位点(下划线为酶切位点)，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。按照常规方法进行Nsp9基因的PCR扩增、Nsp9基因片段和质粒pIRESpuro2的NheⅠ和NotⅠ限制性酶切连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后经过提取质粒进行限制性酶切和测序鉴定，获得的重组质粒命名为pIRESpuro-Nsp9。

2.稳定表达Nsp9基因Marc-145细胞株的筛选

将Marc-145细胞约1～3x105个细胞传代至6孔板，培养至汇合度约为60％-80％时用于转染，转染方法按照美国Invitrogen公司Lipofectamine^TM2000转染试剂盒操作说明书进行。转染24小时后加入1mg/L嘌呤霉素为压力筛选培养液继续培养，每孔1mL，每3天换一次培养液，持续嘌呤霉素筛选2周后，细胞培养板中转染pIRESpuro-Nsp9的孔可见有抗性细胞生长。待Marc-145空白细胞对照组细胞在含有嘌呤霉素的培养液中培养至全部死亡后改用含最低致死浓度嘌呤霉素(0.5mg/L)的培养基进行维持筛选1-2周，利用有限稀释法在96孔板中用含嘌呤霉素(0.5mg/L)RPMI-1640培养液培养，其中有13孔细胞获得了增殖，将这13孔细胞分别扩大培养，其中部分冻存，其余的扩大培养作后续鉴定实验。

3.表达Nsp9基因的Marc-145细胞株的鉴定

PCR鉴定：提取上述扩大培养的13株Marc-145细胞基因组DNA，利用与扩增Nsp9基因相同的1对引物，通过PCR方法鉴定Nsp9基因是否整合到Marc-145细胞中，PCR结果显示有9株的基因组中扩增出了Nsp9基因，表明这9株Marc-145细胞株含有Nsp9基因。

间接免疫荧光（IFA）鉴定：培养筛选后的Marc-145细胞，80%冷丙酮固定后，封闭30min，PBS洗3次，加入用0.5%PBST100倍稀释的PRRSV抗血清，于37℃作用1h后，用含有0.5%PBST清洗3次，每次5min，加入1:100倍稀释的FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体于37℃作用30min后，PBST清洗3次，用荧光显微镜观察结果。结果显示PCR鉴定含有Nsp9基因的9株Marc-145细胞株可以观察到特异性的荧光，表明这9株Marc-145细胞株表达了Nsp9基因，将表达量最高的一株Marc-145细胞命名Marc-145-Nsp9细胞，获得的这株细胞用作PRRSV Jiangxi-3株复制缺陷性病毒的拯救。

实施例3:复制缺陷性病毒的制备

1.复制缺陷性病毒的转染及拯救

将Marc-145-Nsp9细胞传代于6孔板中，用含体积分数10％小牛血清的RPMI-1640培养液培养过夜，待长至60％～70％汇合度且均匀时用于转染。转染所用的质粒pACYC-CMV-Jiangxi-3d102用美国QIAGEN公司的Spin MiniPrep Kit试剂盒抽提，然后用分光光度计测定质粒的含量。质粒的抽提步骤按照质粒提取试剂盒说明书进行操作。转染方法按照美国Invitrogen公司Lipofectamine^TM2000转染试剂盒操作说明书进行。转染24小时后取转染上清接种Marc-145-Nsp9细胞单层，接种后加含体积分数2%血清的RPMI-1640培养液培养4-5天，细胞出现明显的，最初呈现局灶性细胞聚集、变圆、皱缩，逐渐脱离细胞单层，最后崩解、脱落，拯救的病毒为第二代（F2），将此获得的病毒命名为rVJiangxi-3d102，然后继续在Marc-145-Nsp9细胞上培养拯救病毒至20代（F3～F20）。

2.复制缺陷性病毒的生长动力学分析

将PRRSV Jiangxi-3株第20代、rVJiangxi-3d102第20代分别以病毒感染复数（Multiplicity of infection，MOI)为0.1分别感染Marc-145细胞株和Marc-145-Nsp9细胞，在12、24、36、48、72h收集细胞上清，每次收取200μL，同时补充200μL新的维持液。将收获的上清作10倍稀释(10^-1～10^-8)，将各稀释度的病毒液接种于96孔板中已长成单层的MARC-145细胞进行TCID50试验。按Reed-Muench法计算病毒的TCID50，并用GraphPad软件绘制病毒的生长曲线。病毒生长动力学曲线如图3所示，结果表明rVJiangxi-3d102与亲本毒株PRRSV Jiangxi-3株有相似的生长周期。

3.复制缺陷性病毒的鉴定

重组病毒的RT-PCR鉴定：取上述培养的复制缺陷性病毒第5代（F5）、第10代（F10）、第15代（F15）和第20代（F20）病毒培养液各200μL提取病毒RNA用引物Seq-F和Seq-R进行RT-PCR扩增Nsp9基因缺失部位两端的序列，并将扩增的RT-PCR产物进行测序分析，结果显示拯救的病毒Nsp9基因缺失102bp碱基与设计相符，表明所拯救的病毒具有很好的遗传稳定性。其中，rVJiangxi-3d102（第20代）与PRRSV Jiangxi-3Nsp9编码区的部分序列比较结果见图4。

复制缺陷性病毒的间接免疫荧光(IFA)鉴定：IFA方法与实施例2中表达Nsp9基因的Marc-145细胞株的鉴定方法相同，所用的抗体为PRRSV免疫猪血清。结果如图2所示，图2A为rVJiangxi-3d102感染Marc-145细胞36小时后IFA鉴定结果，结果没有特异性荧光，表明rVJiangxi-3d102不能在Marc-145细胞上复制，图2B为rVJiangxi-3d102感染Marc-145-Nsp9细胞36小时后进行的IFA鉴定，结果可见有特异性荧光，表明rVJiangxi-3d102获得了拯救并能在Marc-145-Nsp9细胞中复制。

复制缺陷性病毒复制缺陷性的鉴定：将rVJiangxi-3d102分别在长在单层的Marc-145-Nsp9细胞和Marc-145细胞中培养4天，在显微镜下观察到Marc-145-Nsp9细胞产生了明显的病变，而Marc-145细胞没有产生任何病变。

实施例4：猪呼吸与繁殖综合征复制缺陷性疫苗株用来生产疫苗的方法

所述的猪呼吸与繁殖综合征复制缺陷性疫苗株用来生产疫苗的方法，按以下步骤进行：

（1）制苗用细胞的传代与培养：将稳定表达Nsp9的Marc-145细胞系经EDTA－胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；

（2）细胞毒种的繁殖：将rVJiangxi-3d102株病毒液按1/10的体积量接入已经生成单层的细胞瓶，吸附1小时后，加入细胞维持液于细胞单层，继续培养，当70－80%细胞出现病变后收获，收获的毒液冻融2－3次后置－15℃以下保存，取少量做半成品检验。

（3）配苗、分装及冻干：将检验合格的病毒培养液，与常规稳定剂按1：1的体积比混合，充分摇匀，定量分装；每头份含细胞毒液不少于10^5.5TCID50，分装后迅速进行冷冻干燥即得成品。

本发明生产的疫苗株在细胞上的特性：以pACYC177质粒为载体，插入中国高致病性猪蓝耳病毒Jiangxi-3株除Nsp9部分序列外的完整的核酸序列，与之配套的疫苗生产细胞系为克隆了Jiangxi-3株Nsp9全基因的Marc-145细胞系，获得的复制缺陷性疫苗株可在此细胞系内稳定地增殖，使细胞在72小时左右产生细胞病变，在细胞上连续传代20代，病毒的增殖特性没有发生变化，基因结构也没有发生变化。

一、疫苗对本动物的安全性：

1、猪蓝耳病复制缺陷性疫苗（第5代）（10^5.5TCID50）分别感染30日龄10头健康仔猪，感染剂量为3ml/头猪，滴鼻2ml，颈部肌肉注射1ml，感染后每天上下午各测1次体温，观察临床症状，30日后，取5头宰杀后解剖观测其肺脏及其他器官的变化。

结果所有10头猪均无体温升高，全部猪存活。解剖的5头猪所有内脏器官无肉眼可见病理变化。

2、用猪蓝耳病复制缺陷性疫苗（第10代）（10^5.6TCID50）分别感染35日龄10头健康仔猪，感染剂量为3ml/头猪，滴鼻2ml，颈部肌肉注射1ml，感染后每天上下午各测1次体温，观察临床症状，21日后，取5头宰杀后解剖观测其肺脏及其他器官的变化。

结果民有10头猪均无体温升高，全部猪存活。解剖的5头猪所有内脏器官无肉眼可见病理变化。

3、病毒恢复复制能力

将PRRSV rVJiangxi-3株在猪体内连续回传5代，没有发现病毒恢复复制的现象。

结果表明：用猪蓝耳病复制缺陷性疫苗对猪安全。

二、猪蓝耳病复制缺陷性rVJiangxi-3d102株疫苗效力试验：

1、使用猪蓝耳病复制缺陷性疫苗（rVJiangxi-3d102株第5代）（10^5.5TCID50）免疫20头健康仔猪，35日后攻毒，攻毒后观察21天，宰杀后解剖观测其肺脏及其他器官的变化。试验结果如下：

安全性：所有免疫猪在疫苗接种后的35日内，均无体温上升，也无临床症状。证明疫苗安全。

免疫保护：免疫后抗体检测结果如图5所示，免疫2周后抗体检测100%阳性，第4周达到最高；攻击强毒后，所有免疫猪均健活，三组免疫猪的体重增加明显高于对照猪。免疫猪的肺部病变保护率为85%。

2、使用两组猪蓝耳病复制缺陷性疫苗（rVJiangxi-3d102株第5代）（10^5.5TCID50）5倍稀释后，每批各免疫10头36日龄健康仔猪，颈部肌肉注射2ml。每天测1次体温，观察临床症状，21日宰杀后解剖观测其肺脏及其他器官的变化。试验结果如下：

免疫组一组1/10发病，1/10死亡，另一组2/10发病，0/10死亡，对照猪10/10发病，8/10死亡。

结果表明：用猪蓝耳病复制缺陷性疫苗免疫猪可产生良好的保护效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种构建病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法，其特征在于具体包含为：将PRRSV Jiangxi-3株缺失部分Nsp9基因，得到复制缺陷性的Jiangxi-3株感染性克隆，同时将PRRSV Jiangxi-3毒株的Nsp9基因克隆入Marc-145细胞，使其稳定表达Nsp9蛋白，将复制缺陷的PRRSV Jiangxi-3株感染性克隆转染表达Nsp9蛋白的Marc-145细胞，拯救出具有复制能力的rVJiangxi-3d102毒株，获得复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株。

2.根据权利要求1所述的构建病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法，其特征在于：所述的PRRSV Jiangxi-3株来源于2006年“高热病”期间从江西省猪场分离鉴定，其GenBank Accession Number:EU200961.1。

3.根据权利要求1所述的构建病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法，其特征在于：所述的将PRRSV Jiangxi-3株缺失部分Nsp9基因为运用反向遗传操作和基因重组技术实现。

4.根据权利要求1所述的构建病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法，其特征在于：所述的缺失部分Nsp9基因为缺失PRRSV Jiangxi-3株基因组序列GenBank Accession Number EU200961.1的自5’末端第8241至8342位所示的102nt的核苷酸片段。

5.根据权利要求1所述的构建病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法，其特征在于：所述的缺失部分Nsp9基因为缺失PRRSV Jiangxi-3株基因组序列GenBank Accession Number EU200961.1的自5’末端第8241至8342位所示的102nt的核苷酸片段，并且在第8241至8342位中插入限制性内切酶位点。

6.根据权利要求5所述的构建病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法，其特征在于：所述的限制性内切酶位点为限制性内切酶SbfⅠ位点。

7.一种病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株由权利要求1～6任一项所述的方法制备获得。

8.权利要求7所述的病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株在制备预防和/或治疗猪呼吸与繁殖综合征疫苗中的应用。