CN103772501A

CN103772501A - Vegf抗体及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN103772501A
Application number: CN201410039879.0A
Authority: CN
Inventors: 何勇智; 丛聪; 代云见; 张勇侠; 李坤; 李春阳; 王保成; 秦娇荣; 赵兆; 王明蓉; 何明跃
Original assignee: Chengdu Institute of Biological Products Co Ltd
Current assignee: Chengdu Institute of Biological Products Co Ltd
Priority date: 2014-01-27
Filing date: 2014-01-27
Publication date: 2014-05-07

Abstract

本发明公开了VEGF单域抗体及其融合抗体和多聚体抗体。本发明还公开了编码前述抗体的核苷酸序列，包含该核苷酸序列的表达载体、重组菌以及前述抗体的制备方法和用途。本发明VEGF抗体分子量小，可塑性高，具有广泛的应用前景。

Description

VEGF抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及新的VEGF抗体及其制备方法和用途。

背景技术

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）为一种同源二聚体糖蛋白，在人体内具有促进血管内皮细胞分裂、增殖以及诱导血管形成等作用。VEGF会通过促进血管生成引起肿瘤快速生长，是一个重要的肿瘤药物靶标。

VEGF抗体可以与VEGF结合抑制其生理活力，进而抑制肿瘤的快速生长，另外，VEGF抗体还可以治疗老年黄斑变性疾病。常用的抗体有全抗体、Fab、单链抗体等。目前，VEGF抗体大多为全抗体，如，贝伐单抗(bevacizumab,Avastin)、HuMV833单抗、VEGF-Trap抗体，也有少部分单链抗体，如贝伐单抗的单链抗体。这些抗体药物分子量大，不易穿过血管壁，导致局部药物浓度偏低，药效受限；同时也因为分子量较大，存在免疫原性高的缺陷。

VH单域抗体是近年来出现的一类小分子抗体，其仅含有全抗体的重链可变区(VH)的一类抗体，其分子量大约为全抗体的1/10，免疫原性低，穿透性好，有利于提高靶向区域的药物浓度。但是，因单域抗体缺乏轻链可变区，难以形成抗原结合域，普遍存在无抗原结合能力或者结合能力极低的问题。

发明内容

为解决现有VEGF抗体存在的问题，本发明提供了新的VEGF抗体及其制备方法和用途。

本发明提供了VEGF单域抗体，它的氨基酸序列如SEQ ID NO:1～SEQID NO:6任意一项所示。

单域抗体，是指只有完整抗体重链可变区的抗体。

SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示的单域抗体分别命名为：Vh-VEGF(Vh)、Vh-VEGF/Y31（Y31）、Vh-VEGF/Q61（Q61）、Vh-VEGF/YDA（Vh-YDA）、Vh-VEGF/30（30）、Vh-VEGF/94（94），它们的氨基酸序列如下所示：

Vh（SEQ ID NO.1）：

MEVQLEQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINAYTGEPTYAADFKRRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSLEGGGS；分子量为14.46kD。

Y31（SEQ ID NO.2）：

MEVQLEQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTYYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINAYTGEPTYAADFKRRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSLEGGGS；分子量为14.51kD。

Q61（SEQ ID NO.3）：

MEVQLEQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTYYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINAYTGEPTYAQDFKRRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSLEGGGS；分子量为14.56kD。

Vh-YDA（SEQ ID NO.4）:

MEVQLEQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTDTYYGMGWVRQAPGKGLEWVGWINAYTGEPTYAADFKRRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSLE；分子量为14.178kD。

30（SEQ ID NO.5）:

MEVQLEQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTDTNYGMGWVRRAPGKGLEWVGWINAYTGEPTYAADFKRRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYPFLYCNSEWYFDVWGQGTLVTVSSLVGGGS；分子量为14.41kD。

94（SEQ ID NO.6）:

MEVQLEQSGGGLVQPGGSLRLSCVASGYTDTNYGMGWVRQAPGKGLEWVGWINAYTGEPTYAADFKRRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYPNFCWCSRWYFDVWGQGTLVTVSSLVGGGS；分子量为14.45kD。

本发明还提供了VEGF融合抗体，它是由前述单域抗体通过连接肽连接而成的融合抗体，或者在前述单域抗体的C末端连接Fc片段形成的融合抗体。

连接肽是一种多肽，其氨基酸序列为（GGGGS）_n，其中，n可以为1～10。优选地，所述连接肽的氨基酸序列为：GGGGSGGGGSGGGGS。

优选地，所述连接肽连接而成的融合抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，命名为：Vh-double。

Vh-double的氨基酸序列（SEQ ID NO:7）为：

MEVQLEQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINAYTGEPTYAADFKRRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSLEGGGGSGGGGSGGGGSEVQLEQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINAYTGEPTYAADFKRRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSLE；分子量为29.20kD。

优选地，所述在单域抗体的C末端连接Fc片段形成的融合抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，将其命名为Vh-Fc。

Vh-Fc的氨基酸序列为：

MEVQLEQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINAYTGEPTYAADFKRRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSLEGGGSEVQLEQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINAYTGEPTYAADFKRRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSLEGGGSPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEVTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGS；分子量为54.8kD。

本发明还提供了VEGF三聚体抗体，其单体是由前述单域抗体与异亮氨酸拉链连接而成。

三聚体抗体，是指由三个单体聚合形成的抗体。某些蛋白质分子会聚合成多聚体，多聚体中的重复单位称为单体。

其中，异亮氨酸拉链是由伸展的氨基酸组成的卷曲--α-螺旋结构，每7个氨基酸中的第7个氨基酸为异亮氨酸，异亮氨酸是疏水性氨基酸，排列在α-螺旋的一侧，所有带电荷的氨基酸残基排列在另一侧，当3个连接有异亮氨酸拉链的单域抗体平行排列时，异亮氨酸之间相互作用，形成“拉链”样结构，进而使形成三聚体。因此，带有异亮氨酸拉链连的蛋白会聚集形成三聚体。

所述异亮氨酸拉链的氨基酸序列为：

QRMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLVGER。

优选地，所述三聚体抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8或9所示。

SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示的VEGF多聚体抗体分别命名为：Vh-trime和Vh-YDA-trime。

Vh-trime的单体的氨基酸序列（SEQ ID NO:8）为：

MEVQLEQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINAYTGEPTYAADFKRRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSLEGGGGSGGGGSGGGGSQRMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLVGERGGGS；分子量为19.48kD；Vh-trime抗体是由前述单体聚合形成的三聚体抗体。

Vh-YDA-trime的单体的氨基酸序列（SEQ ID NO:9）为:

MEVQLEQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTDTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINAYTGEPTYAADFKRRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSLEGGGGSGGGGSGGGGSQRMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLVGERGGGS；分子量为19.508kD。

Vh-YDA-trime抗体是由前述单体聚合形成的三聚体抗体。

本发明进一步提供了编码上述抗体的核苷酸序列。

优选地，上述序列如SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:20所示：

SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列（编码抗体Vh）为：

ATGGAAGTGCAGCTGGAGCAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCACCTTTACCAACTATGGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGGGCTGGATTAACGCCTATACCGGCGAACCGACCTATGCGGCGGATTTTAAACGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATATCCGCATTATTATGGCAGCAGCCATTGGTATTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACCGTGAGTTCACTCGAGGGTGGCGGTAGC；

SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列（编码抗体Y31）为：

ATGGAAGTGCAGCTGGAGCAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCACCTTTACCAACTATGGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGGGCTGGATTAACTATTATACCGGCGAACCGACCTATGCGGCGGATTTTAAACGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATATCCGCATTATTATGGCAGCAGCCATTGGTATTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACCGTGAGTTCACTCGAGGGTGGCGGTAGC；

SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列（编码抗体Q61）为：

ATGGAAGTGCAGCTGGAGCAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCACCTTTACCTACTATGGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGGGCTGGATTAACGCCTATACCGGCGAACCGACCTATGCGCAGGATTTTAAACGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATATCCGCATTATTATGGCAGCAGCCATTGGTATTTTGATGTGTGGGGCCAGGGAACACTGGTCACCGTCTCTTCACTCGTGGGTGGCGGTAGC；

SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列（编码抗体Vh-YDA）为：

ATGGAAGTGCAGCTGGAGCAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCACCTTTACCAACTATGGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGGGCTGGATTAACGCCTATACCGGCGAACCGACCTATGCGGCGGATTTTAAACGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATATCCGCATTATTATGGCAGCAGCCATTGGTATTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACCGTGAGTTCACTCGAG；

SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列（编码抗体30）为：

ATGGAAGTGCAGCTGGAGCAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTTTCCTGTGCGGCCTCTGGATACACCGACACCAACTATGGCATGGGCTGGGTCCGCCGGGCTCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGGGCTGGATTAACGCCTATACCGGCGAACCGACCTATGCGGCGGATTTTAAACGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATATCCGTTCCTCTACTGCAACAGCGAGTGGTATTTTGATGTGTGGGGCCAGGGAACACTGGTCACCGTCTCTTCACTCGTGGGTGGCGGTAGC；

SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列（编码抗体94）为：

ATGGAAGTGCAGCTGGAGCAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTGGCCTCTGGATACACCGACACCAACTATGGCATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGGGCTGGATTAACGCCTATACCGGCGAACCGACCTATGCGGCGGATTTTAAACGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATATCCGAACTTCTGCTGGTGCAGCCGGTGGTATTTTGATGTGTGGGGCCAGGGAACACTGGTCACCGTCTCTTCACTCGTGGGTGGCGGTAGC；

SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列（编码抗体Vh-double）为：

ATGGAAGTGCAGCTGGAGCAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCACCTTTACCAACTATGGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGGGCTGGATTAACGCCTATACCGGCGAACCGACCTATGCGGCGGATTTTAAACGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATATCCGCATTATTATGGCAGCAGCCATTGGTATTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACCGTGAGTTCACTCGAGGGTGGTGGCGGTTCCGGCGGTGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGAAGTGCAGCTGGAGCAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCACCTTTACCAACTATGGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGGGCTGGATTAACGCCTATACCGGCGAACCGACCTATGCGGCGGATTTTAAACGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATATCCGCATTATTATGGCAGCAGCCATTGGTATTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACCGTGAGTTCACTCGAG；

SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列（编码抗体Vh-trime的单体）为：

ATGGAAGTGCAGCTGGAGCAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCACCTTTACCAACTATGGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGGGCTGGATTAACGCCTATACCGGCGAACCGACCTATGCGGCGGATTTTAAACGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATATCCGCATTATTATGGCAGCAGCCATTGGTATTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACCGTGAGTTCACTCGAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGCGCATGAAACAGATTGAAGATAAAATTGAAGAAATTCTGAGCAAAATTTATCATATTGAAAACGAAATTGCGCGCATTAAAAAACTGGTGGGCGAACGCGGCGGCGGCAGC；

SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列（编码抗体Vh-YDA-trime的单体）为：

ATGGAAGTGCAGCTGGAGCAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCACCTTTACCAACTATGGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGGGCTGGATTAACGCCTATACCGGCGAACCGACCTATGCGGCGGATTTTAAACGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATATCCGCATTATTATGGCAGCAGCCATTGGTATTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACCGTGAGTTCACTCGAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGCGCATGAAACAGATTGAAGATAAAATTGAAGAAATTCTGAGCAAAATTTATCATATTGAAAACGAAATTGCGCGCATTAAAAAACTGGTGGGCGAACGCGGCGGCGGCAGC。

SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列（编码抗体Vh-Fc）为：

ATGGAAGTGCAGCTGGAGCAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCACCTTTACCAACTATGGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGGGCTGGATTAACGCCTATACCGGCGAACCGACCTATGCGGCGGATTTTAAACGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATATCCGCATTATTATGGCAGCAGCCATTGGTATTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACCGTGAGTTCACTCGAGGGTGGCGGTAGCGAAGTGCAGCTGGAGCAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCACCTTTACCAACTATGGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGGGCTGGATTAACGCCTATACCGGCGAACCGACCTATGCGGCGGATTTTAAACGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATATCCGCATTATTATGGCAGCAGCCATTGGTATTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACCGTGAGTTCACTCGAGGGTGGCGGTAGCCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGGTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAAGGTGGCGGTAGC。

本发明还提供了含有上述核苷酸序列的表达载体。

优选地，上述表达载体为重组pET22b质粒。

本发明进一步提供了含有上述表达载体的重组菌。

优选地，所述重组菌为BL21（DE3）大肠杆菌。

本发明进一步提供了上述VEGF抗体的制备方法，包含如下步骤：

（1）取前述重组菌，接种到含有0.5～1.5%（w/v）葡萄糖、50～150mg/L氨苄青霉素的LB培养基或者YT培养基中，34～40℃培养10～15h，得菌液；

（2）按照0.5～1.5%（v/v）的接种量，将步骤（1）菌液接种至含有50～150mg/L氨苄青霉素的LB培养基或者YT培养基中，34～40℃培养至OD₆₀₀=0.6～0.8；

（3）加入IPTG至终浓度为0.2～0.4mmol/L，在20～30℃的条件下，诱导培养3～7小时；

（4）收集培养物，分离纯化，即得VEGF抗体。

LB培养基：每1L溶液中含有胰蛋白胨10g、酵母提取物5g和氯化钠10g，其余为水。

YT培养基：每1L溶液中含有胰蛋白胨16g、酵母提取物10g和氯化钠4g，其余为水。

优选地，步骤（1）中，所述培养基中葡萄糖的浓度为1%（w/v），氨苄青霉素的浓度为100mg/L；所述培养的温度是37℃；所述培养时间为12h；步骤（2）中，所述培养基中氨苄青霉素的浓度为100mg/L，所述培养的温度是37℃；步骤（3）中，IPTG的终浓度为0.3mmol/L；诱导培养的温度为25℃，时间为5小时。

本发明还提供了上述VEGF抗体在制备抗肿瘤药物或者治疗老年黄斑变性疾病的药物中的用途，其中，所述老年黄斑变性疾病是湿性老年黄斑变性疾病。

本发明通过对核苷酸序列的优化，成功地制备得到高活性的VEGF单域抗体Vh、Y31、Q61、Vh-YDA、30、94，其与VEGF的亲和常数为0.669～2.042，与阳性药物Avastin单链抗体（亲和常熟为1.001）相当或者更高，同时，它们的分子量小，可有效穿透肿瘤，免疫原性低，安全，是是一种安全、有效的抗肿瘤药物；本发明还制备得到了具有高活性的VEFG融合抗体和三聚体抗体，它们的亲和常数为1.102～2.655，为临床抗肿瘤药物提供了一种新的选择，应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1包含Vh、Vh-double、Vh-trime或Vh-Fc的可溶性蛋白的Western-Blot结果；

图2包含Vh、Vh-double、Vh-trime或Vh-Fc的可溶性蛋白的ELISA检测结果；

图3纯化的Vh的ELISA检测结果；

图4纯化的Vh-double的ELISA检测结果；

图5纯化的Vh-trime的ELISA检测结果；

图6纯化的Vh-Fc的ELISA检测结果；

图7纯化的Y31抗体、Q61抗体、Avastin的单链抗体的Western-Blot和ELISA检测结果；

图8包含Y31抗体、Q61抗体、Avastin的的可溶性蛋白的Western-Blot检测结果；

图9纯化的94抗体、30抗体、Vh-YDA抗体及其三聚体抗体Vh-YDA-trime的ELISA检测结果。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1本发明VEGF抗体的制备及其亲和性的检测

在本实施例中，制备了SEQ ID NO:1所示的单域抗体Vh及其融合蛋白Vh-double（SEQ ID NO:7所示）、三聚体Vh-trime（SEQ ID NO:8所示）、融合体Vh-Fc（SEQ ID NO:9所示），并对其分子量、亲和性等作了检测。

1、抗体的制备

1.1质粒的构建

SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列C-末端各自加入6个重复的CGU或CAC核苷酸序列，也即在各自表达的蛋白后面加了6个组氨酸组成的标签，简写为(His)₆标签，以便于对表达产物的检测，各核苷酸序列由江苏金维智生物技术公司进行全基因合成，并使用EcoRⅠ和NcoⅠ酶切，分别连入pET22b载体。

1.2质粒的转化及表达工程菌构建

电转：取50μl电转用感受态细胞BL21（DE3），加入1μl步骤1.1构建的质粒。将混合物转入预冷的电转杯中，冰上静置2-5min。电转条件为1800V/cm，电击4-5毫秒。电转产物加入250μl SOC液体培养基中，37℃，200r/min复苏1小时。取适量复苏后细胞涂布于含50mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基。37℃倒置培养过夜。

1.3阳性克隆菌的鉴定

随机挑取20个单克隆于1ml LB培养基（含50mg/L氨苄青霉素）中，37℃，280r/min过夜培养。次日，取1μl菌液做双引物PCR，并对应编号。菌落PCR反应体系为：1μl过夜培养菌液为模板，2×Taq PCR Master Mix5μl，T7terminator/B及T7forward/F正反义引物各0.25μl，去离子水补充至10μl。反应条件：94℃预变性2min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共20个循环；再72℃延伸5min。菌落PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR阳性菌用终浓度为10%的甘油保菌。

1.4克隆菌细胞培养及蛋白表达、蛋白的提取、纯化

经PCR鉴定的阳性培养菌株接种于5ml含1%葡萄糖的LB培养基（含100mg/L氨苄青霉素）中，37℃，220r/min过夜培养。过夜培养菌液按1%接种至30ml LB（含100mg/L氨苄青霉素）培养基中，37℃，220r/min振荡培养至OD600为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为0.3mmol/L，25℃，200r/min诱导培养5小时后，测定终止OD600。培养过程设立阴性对照菌株，即为含空表达载体的工程菌，其所有培养、诱导和样品处理的方法与阳性克隆菌株相同。

总蛋白检测：取相同密度的菌液，12000r/min离心1min，弃掉上清。沉淀洗涤后用40μl去离子水重悬，加入10μl5×SDS蛋白上样缓冲液，94℃加热5min，12000r/min离心1min，取上清2μl进行15%SDS-PAGE电泳检测分析。

1.4.1可溶性蛋白的抽提：将菌液5000rpm，室温离心10min，收集菌体。按5mL/g菌加入抽提试剂Bugbuster抽提可溶性蛋白，将菌体和bugbuster试剂振荡混均。将混合液置于脱色摇床室温振摇20min，4℃,13,000rpm,离心20min，收集上清。

1.4.2抗体的纯化

阳性克隆的细胞沉淀经过超声波破碎后，4℃,12600rpm离心取上清，采用GE Ni Sepharose fast flow填料纯化抗体。使用buffer A（NaH₂PO₄50mM，NaCl0.3M,Imidazole5mM，甘油10%；pH7.4）平衡及洗涤柱子，使用bufferB（NaH₂PO₄50mM，NaCl0.3M，Imidazole150mM，甘油10%；pH7.4）洗脱收集纯化样品，样品溶液放置4℃保存。

2、抗体亲和性等性能的检测

分别采用如下方法检测可溶性蛋白抽提液或纯化样品：

2.1Western Blot法检测：取可溶性蛋白抽提液或纯化样品40ul加入10μl5×SDS蛋白上样缓冲液，94℃加热5min。阴性对照样品按同样的方法进行处理。上样20μl进行SDS-PAGE电泳后，甲醇活化PVDF膜15s，浸泡于转移缓冲液中，并与滤纸一起裁剪成凝胶大小，按照顺序与凝胶叠一起，130mA，60min转膜。转膜后2%BSA封闭1h，用含0.05%Tween-20的PBST缓冲液洗涤3次，1%BSA的PBST溶液按1:8000比例稀释anti-His HRP抗体偶联物，孵育1h。PBST缓冲液洗涤3次，TMB底物显色试剂显色。

2.2亲和性检测：先用100μl浓度为1ug/μl的VEGF165抗原包被ELISA检测孔，4℃过夜。PBS缓冲液洗板3次，用含2%BSA的PBST溶液封闭，37℃孵育2h。PBST缓冲液洗板3次，抗原包被孔中加入100μl Bugbuster抽提的可溶性抗体或者纯化样品，抗体都按2聚稀释法稀释，做3个复孔（n=3），取平均值。用阴性对照菌体制备的可溶性蛋白抽提液（Bugbuster抽提液）做为阴性。室温孵育1h。用含PBST洗涤缓冲液洗板3次，然后加入100μl含1%BSA的PBST稀释的抗-His HRP抗体偶联物（1:6000），室温孵育1h。用PBST洗涤缓冲液洗涤孔板3-5次，向孔内加入100μL TMB显影试剂，室温显色5min，加入50μl1M HCl终止显色反应，ELISA酶标仪于450nm波长读数，其中阴性对照孔的值作为系统背景值扣除，使用扣除后的450nm吸光值做对稀释倍数作亲和曲线图。

3、结果：

（1）Vh：如图1a的Western-blot实验结果所示，阴性对照菌株（含空质粒的重组菌）表达的可溶性蛋白中，没有含有组氨酸标签的蛋白，而本发明工程菌（含包括SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的阳性质粒）则表达得到了含有组氨酸标签的蛋白，其分子量为16kD，与SEQ ID:1所示蛋白质（SEQID NO:11编码的蛋白质）加上(His)₆标签的分子量一致，说明本发明成功地表达得到了目标蛋白Vh。

如图2a的ELISA结果表明，阴性对照菌株（含空质粒的重组菌）表达的可溶性蛋白无VEGF抗原结合能力，而本发明重组工程菌表达的带有组氨酸标签的目的蛋白，具有非常强的VEGF抗原结合能力，说明本发明目标蛋白Vh具有非常强的VEGF抗原结合能力。

如图3的ELISA结果表明，本发明目标蛋白Vh与VEGF抗原的亲和常数为2.042，进一步说明本发明目标蛋白Vh具有很强的VEGF抗原结合能力。

实验结果说明，本发明表达得到了SEQ ID:1所示的蛋白质Vh，其具有很强的VEGF抗原结合能力，是一种高活性的VEGF抗体。

（2）Vh-double：如图1b的Western-blot实验结果所示，阴性对照菌株（含空质粒的重组菌）表达的可溶性蛋白中，没有含有组氨酸标签的蛋白，而本发明工程菌（含包括SEQ ID NO:17所示核苷酸序列的阳性质粒）则表达得到了含有组氨酸标签的蛋白，其分子量为30kD，与SEQ ID:7所示蛋白质（SEQ ID NO:17编码的蛋白质）加上(His)₆标签、连接肽(GGGGS)₃的分子量一致，说明本发明成功地表达得到了目标蛋白。

如图2b的ELISA结果表明，阴性对照菌株（含空质粒的重组菌）表达的可溶性蛋白无VEGF抗原结合能力，而本发明重组工程菌表达的带有组氨酸标签的目的蛋白，具有非常强的VEGF抗原结合能力，说明本发明目标蛋白Vh-double具有非常强的VEGF抗原结合能力。

如图4的ELISA结果表明，本发明目标蛋白Vh-double与VEGF抗原的亲和常数为1.102，进一步说明本发明目标蛋白Vh-double具有很强的VEGF抗原结合能力。

实验结果说明，本发明表达得到了SEQ ID:7所示的蛋白质Vh-double，其具有很强的VEGF抗原结合能力，是一种高活性的VEGF抗体。

（3）Vh-trime：如图1c的Western-blot实验结果所示，阴性对照菌株（含空质粒的重组菌）表达的可溶性蛋白中，没有含有组氨酸标签的蛋白，而本发明重组工程菌（含包括SEQ ID NO:18所示核苷酸序列的阳性质粒）则表达得到了含有组氨酸标签的蛋白，其分子量为22kd，与SEQ ID:8所示蛋白质单体（SEQ ID NO:18编码的蛋白质），加上(His)₆标签、异亮氨酸拉链的分子量一致。在本发明Western-blot实验条件下，Vh-trime三聚体抗体会解聚，因而Western-blot检测到单体，即表明本发明成功地表达得到了目标蛋白Vh-trime。

如图2c的ELISA结果表明，阴性对照菌株（含空质粒的重组菌）表达的可溶性蛋白无VEGF抗原结合能力，而本发明工程菌表达的带有组氨酸标签的目的蛋白，具有非常强的VEGF抗原结合能力，说明本发明目标蛋白Vh-trime具有非常强的VEGF抗原结合能力。

如图5的ELISA结果表明，本发明目标蛋白Vh-trime与VEGF抗原的亲和常数为2.655，进一步说明本发明目标蛋白Vh-trime具有很强的VEGF抗原结合能力。

实验结果说明，本发明表达得到了单体如SEQ ID:8所示的三聚体抗体Vh-trime，其具有很强的VEGF抗原结合能力，是一种高活性的VEGF抗体。

（4）Vh-Fc：如图1d的Western-blot实验结果所示，阴性对照菌株（含空质粒的重组菌）表达的可溶性蛋白中，没有含有组氨酸标签的蛋白，而本发明重组工程菌（含包括SEQ ID NO:20所示核苷酸序列的阳性质粒）则表达得到了含有组氨酸标签的蛋白，其分子量为22kd，与SEQ ID:10所示蛋白质（SEQ ID NO:20编码的蛋白质），加上(His)₆标签的分子量一致，说明本发明成功地表达得到了目标蛋白Vh-Fc。

如图2d的ELISA结果表明，阴性对照菌株（含空质粒的重组菌）表达的可溶性蛋白无VEGF抗原结合能力，而本发明工程菌表达的带有组氨酸标签的目的蛋白，具有非常强的VEGF抗原结合能力，说明本发明目标蛋白Vh-Fc具有非常强的VEGF抗原结合能力。

如图6的ELISA结果表明，本发明目标蛋白Vh-Fc具有与VEGF抗原的亲和常数为2.081，进一步说明本发明目标蛋白Vh-Fc具有很强的VEGF抗原结合能力。

实验结果说明，本发明表达了SEQ ID:10所示的蛋白质Vh-Fc，其具有很强的VEGF抗原结合能力，是一种高活性的VEGF抗体。

综上，本发明成功表达得到了Vh、Vh-double、Vh-trime、Vh-Fc抗体，它们均具有很强的VEGF抗原结合能力。

实施例2本发明VEGF抗体的制备及亲和性的检测

本实施例涉及到的抗体分别为：SEQ ID NO:4所示的单域抗体Vh-YDA及其三聚体抗体Vh-YDA-trime；SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6分别所示的单域抗体Y31、Q61、30、94，以Avastin单链抗体（scFv）作为阳性对照抗体（Avastin单链抗体按照沈倍奋等主编，《重组抗体》，科学出版社，2005年，p246-p250记载的方法构建）。

1、本发明抗体的制备

1.1质粒的构建

SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列C-末端各自加入6个重复的CGU或CAC核苷酸序列，也即在各自表达的蛋白后面加了6个组氨酸组成的标签，简写为(His)₆标签，以便于对表达产物的检测，各核苷酸序列由江苏金维智生物技术公司进行全基因合成，并使用EcoRⅠ和NcoⅠ酶切，分别连入pET22b载体。

1.2质粒的转化及表达工程菌构建

使用电转化系统将连接产物转化入感受态细胞BL21（DE3），转化步骤同实施例1中1.2，涂布平板过夜培养。

1.3阳性克隆菌的鉴定

随机挑取30个单克隆于1ml含有1%葡萄糖的2YT培养基（含50mg/L氨苄青霉素）中，37℃，280r/min过夜培养。次日，取1μl菌液做双引物PCR，并对应编号。菌落PCR反应体系同实施例1中1.3菌落PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR阳性菌用终浓度为10%的甘油保菌。

1.4克隆菌细胞培养及蛋白表达

经PCR鉴定的阳性培养菌株接种于5ml含1%葡萄糖的YT培养基（含100mg/L氨苄青霉素）中，37℃，220r/min过夜培养。过夜培养菌液按1%接种至30mlYT（含100mg/L氨苄青霉素）培养基中，37℃，220r/min振荡培养至OD600为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为0.3mmol/L，25℃，200r/min诱导培养3小时后，测定终止OD600。培养过程设立阴性对照菌株，即为含空表达载体的工程菌，其所有培养、诱导和样品处理的方法与阳性克隆菌株相同。

1.5可溶性蛋白的提取、分离纯化

同实施例1中1.4.1、1.4.2步骤。

2、检测

Western Blot检测和亲及ELISA检测，同实施例1中2.1和2.2步骤。

3、结果

（1）Y31

如图7的Western-blot实验结果所示，本发明重组工程菌（含包括SEQ IDNO:12所示核苷酸序列的阳性质粒）表达得到了含有组氨酸标签的蛋白，其分子量为16kD，与SEQ ID:2所示蛋白质（SEQ ID NO:12编码的蛋白质），加上(His)₆标签的分子量一致，说明本发明成功地表达得到了目标蛋白。

如图7的ELISA结果所示，本发明目的蛋白Y31与VEGF抗原的亲和常数为0.896，与阳性药物Avastin单链抗体的亲和常数（1.001）相当，说明其具有非常强的VEGF抗原结合能力，。

实验结果说明，本发明表达了SEQ ID：2所示的蛋白质Y31，其具有很强的VEGF抗原结合能力，与阳性药物Avastin单链抗体的结合能力相当，是一种高活性的VEGF抗体。

（2）Q61

如图7的Western-blot实验结果所示，本发明重组工程菌（含包括SEQ IDNO:13所示核苷酸序列的阳性质粒）表达得到了含有组氨酸标签的蛋白，其分子量为16kD，与SEQ ID:3所示蛋白质（SEQ ID NO:13编码的蛋白质），加上(His)₆标签的分子量一致，说明本发明成功地表达得到了目标蛋白。

如图7的ELISA结果表明，本发明目的蛋白Q61，与VEGF抗原的亲和常数为0.669，具有非常强的VEGF抗原结合能力。

实验结果说明，本发明表达了SEQ ID：3所示的蛋白质Q61，其具有很强的VEGF抗原结合能力，是一种高活性的VEGF抗体。

（3）Vh-YDA

如图8的Western-blot实验结果所示，本发明重组工程菌（含包括SEQ IDNO:14所示核苷酸序列的阳性质粒）表达得到了含有组氨酸标签的蛋白，其分子量为15kD，与SEQ ID:4所示蛋白质（SEQ ID NO:14编码的蛋白质），加上(His)₆标签的分子量一致，说明本发明成功地表达得到了目标蛋白Vh-YDA。

如图9的ELISA结果所示，本发明工程菌目的蛋白Vh-YDA，其与VEGF抗原的亲和常数为1.6，具有非常强的VEGF抗原结合能力。

实验结果说明，本发明表达了SEQ ID：4所示的蛋白质Vh-YDA，其具有很强的VEGF抗原结合能力，是一种高活性的VEGF抗体。

（4）Vh-YDA-trime

如图8的Western-blot实验结果所示，本发明重组工程菌（含包括SEQ IDNO:19所示核苷酸序列的阳性质粒）表达得到了含有组氨酸标签的蛋白，其分子量为22kd，与SEQ ID:9所示蛋白质单体（SEQ ID NO:19编码的蛋白质），加上(His)₆标签、异亮氨酸拉链的分子量一致。在本发明Western-blot实验条件下，Vh-YDA-trime三聚体抗体会解聚，因而Western-blot检测到单体，即表明本发明成功地表达得到了目标蛋白Vh-YDA-trime。

如图9的ELISA结果所示，本的目的蛋白Vh-YDA-trime，其与VEGF抗原的亲和常数为1.884，具有非常强的VEGF抗原结合能力。

实验结果说明，本发明表达了SEQ ID：9所示的蛋白质Vh-YDA-trime，其具有很强的VEGF抗原结合能力，与阳性药物Avastin单链抗体的结合能力相当，是一种高活性的VEGF抗体。

(5)30

如图8的Western-blot实验结果所示，本发明重组工程菌（含包括SEQ IDNO:15所示核苷酸序列的阳性质粒）表达得到了含有组氨酸标签的蛋白，其分子量为15kD，与SEQ ID:5所示蛋白质（SEQ ID NO:15编码的蛋白质），加上(His)₆标签的分子量一致，说明本发明成功地表达得到了目标蛋白30。

如图9的ELISA结果所示，本发明目的蛋白30与VEGF抗原的亲和常数为1.502，具有非常强的VEGF抗原结合能力。

实验结果说明，本发明表达了SEQ ID：5所示的蛋白质30，其具有很强的VEGF抗原结合能力，是一种高活性的VEGF抗体。

(6)94

如图8的Western-blot实验结果所示，本发明重组工程菌（含包括SEQ IDNO:16所示核苷酸序列的阳性质粒）表达得到了含有组氨酸标签的蛋白，其分子量为15kD，与SEQ ID:6所示蛋白质（SEQ ID NO:16编码的蛋白质），加上(His)₆标签的分子量一致，说明本发明成功地表达得到了目标蛋白94。

如图9的ELISA结果所示，本发明工程菌（含包括SEQ ID NO:16所示核苷酸序列的阳性质粒）表达的带有组氨酸标签的目的蛋白94，其与VEGF抗原的亲和常数为1.424，具有非常强的VEGF抗原结合能力。

实验结果说明，本发明表达了SEQ ID：6所示的蛋白质94，其具有很强的VEGF抗原结合能力，是一种高活性的VEGF抗体。

综上，本发明成功表达得到了Vh-YDA、Vh-YDA-trime、Y31、Q61、94、30抗体，它们均具有很强的VEGF抗原结合能力。

本发明采用基因工程的方法，成功地制备得到了VEGF单域抗体Vh、Y31、Q61、Vh-YDA、30、94，它们与VEGF的亲和力高，亲和常数为0.669～2.042，与阳性药物Avastin单链抗体（亲和常数为1.001）相当或者更高，同时，分子量小，可有效穿透肿瘤，免疫原性低，安全，是一种安全、有效的抗肿瘤药物；本发明还制备得到了Vh抗体的融合抗体、Vh抗体和Vh-YDA抗体的三聚体抗体，它们与VEGF的亲和力高，亲和常数为1.102～2.655，可用于制备抗肿瘤药物，临床应用前景良好。