CN103525753B - 一种内皮克隆形成细胞的分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种内皮克隆形成细胞的分离方法，包括如下步骤：（1）酶消化：取脐带，用碱性或中性缓冲液冲洗脐带静脉至流出的液体透明，在脐带静脉中充入胶原酶或者胶原酶与胰酶的混合酶，消化15～60min，收集消化液；（2）机械刮取：将脐带静脉剖开，暴露出脐带静脉内表面，用细胞刮刮取脐带静脉内表面3～10分钟，用碱性或中性缓冲液洗涤，收集洗涤液；（3）将步骤（1）的消化液和步骤（2）的洗涤液合并，离心，去上清，即可。本发明内皮克隆形成细胞的分离方法，可以从脐带静脉中有效分离内皮克隆形成细胞，临床应用前景优良。

Description

一种内皮克隆形成细胞的分离方法

技术领域

本发明涉及内皮克隆形成细胞的分离方法。

背景技术

内皮祖细胞是内皮细胞的前体细胞，在维持血管内皮环境稳定中扮演着重要的角色。根据内皮祖细胞（EPCs）克隆形态、出现时间先后和细胞增殖潜力，体外培养的外周血MNCs可分化出早期和晚期EPCs。内皮克隆形成细胞是近年来发现的一种晚期EPCs亚群，因具有更强的增殖能力及血管形成能力，是理想的移植种子细胞。内皮克隆形成细胞可以从骨髓、脐带血、外周血、脐带等多种组织当中分离获得。

脐带静脉含有大量的内皮克隆形成细胞，取材容易，操作简单，是分离内皮克隆形成细胞的良好来源。目前，通常采取酶消化法或机械刮取法，从脐带静脉上获取内皮克隆细胞，接种到适合的培养基中培养。但是，采用机械刮取的方法，内皮克隆形成细胞与胶原组织不能成功分离，分离效率低，而酶消化法的分离也往往不够彻底，分离效率低。

建立一种高效的内皮克隆形成细胞分离培养方法，对临床大规模应用有重要的意义。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种新的内皮克隆形成细胞的分离方法。

本发明内皮克隆形成细胞的分离方法，包括如下步骤：

（1）酶消化：取脐带静脉，用碱性或中性缓冲液灌注冲洗至流出的液体透明，灌入胶原酶或者胶原酶与胰酶的混合酶，封闭两端，消化15～60min，打开两端，收集消化液；

（2）机械刮取：将脐带静脉剖开，暴露出脐带静脉内表面，用细胞刮刮取脐带静脉内表面3～10分钟，再用碱性或中性缓冲液洗涤，收集洗涤液；

（3）将步骤（1）的消化液和步骤（2）的洗涤液合并，离心，去上清，即可。

步骤（1）中，所述碱性或中性缓冲液是PBS缓冲液、DPBS缓冲液或者Hanks缓冲液。

步骤（1）中，所述胶原酶是II型胶原酶。

步骤（1）中，所述胶原酶的浓度为0.2%，所述胰酶的浓度为0.5%，胶原酶与胰酶的体积比为1:1。

步骤（1）中，所述消化的温度为37℃。

步骤（1）中，所述消化的时间是15～30min。

步骤（2）中，所述刮取的时间是5分钟。

步骤（2）中，所述碱性或中性缓冲液是PBS缓冲液、DPBS缓冲液或者Hanks缓冲液。

步骤（2）中，所述缓冲液的用量为脐带静脉长度的0.5～1.5倍（ml/cm）。优选地，所述缓冲液的用量为脐带静脉长度的1倍（ml/cm）。

本发明内皮克隆形成细胞的分离方法，通过酶消化工艺和机械刮取工艺的特定组合，有效地将内皮克隆形成细胞从脐带静脉组织中分离，获得的细胞数量多，分离效率高，临床应用前景优良。

下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

附图说明：

图1为P0代细胞形态特征；

图2为内皮克隆形成细胞细胞表面标志检测；

图3为内皮克隆形成细胞的LDL内吞实验，图中的光信号为内皮克隆形成细胞内吞后的LDL在激光的激发下发出的阳性信号；

图4为内皮克隆形成细胞的体外血管形成实验。

具体实施方式：

实施例1 本发明内皮克隆形成细胞的分离方法

脐带取自足月顺产或剖腹产的健康产妇，采集后放于含双抗的PBS溶液中4℃保存，48h内处理。反复清洗，并用磷酸缓冲液PBS灌注冲洗脐带静脉，直至流出液体透明。

用止血钳夹住脐带一端，用移液枪将II型胶原酶（浓度0.2%）加入并充满脐带静脉，用止血钳夹住脐带另一端；37℃摇床消化30分钟；消化完成后，取下止血钳，收集消化液到50ml离心管中；将脐带沿脐带静脉剖开，暴露出脐带静脉内表面，用细胞刮轻刮脐带静脉5分钟；用PBS溶液清洗，所述缓冲液的用量为脐带静脉长度的1倍（ml/cm），收集洗涤液与离心管中。

将收集细胞的离心管在4℃、500g的条件下，离心5分钟，即可。

实施例2 本发明内皮克隆形成细胞的分离方法

脐带取自足月顺产或剖腹产的健康产妇，采集后放于含双抗的DPBS缓冲液中4℃保存，48h内处理。反复清洗，并用磷酸缓冲液PBS灌注冲洗脐带静脉，直至流出液体透明。

用止血钳夹住脐带一端，用移液枪将II型胶原酶（浓度0.2%）加入并充满脐带静脉，用止血钳夹住脐带另一端；37℃摇床消15分钟；消化完成后，取下止血钳，收集消化液到50ml离心管中；将脐带沿脐带静脉剖开，暴露出脐带静脉内表面，用细胞刮轻刮脐带静脉3分钟；用DPBS缓冲液清洗，所述缓冲液的用量为脐带静脉长度的1.5倍（ml/cm），收集洗涤液与离心管中。

将收集细胞的离心管在4℃、500g的条件下，离心5分钟，即可。

实施例3 本发明内皮克隆形成细胞的分离方法

脐带取自足月顺产或剖腹产的健康产妇，采集后放于含双抗的Hanks缓冲液中4℃保存，48h内处理。反复清洗，并用磷酸缓冲液PBS灌注冲洗脐带静脉，直至流出液体透明。

用止血钳夹住脐带一端，用移液枪将II型胶原酶（浓度0.2%）与胰酶（浓度为0.5%）按1：1（v/v）组成的混合酶（双酶），加入并充满脐带静脉，用止血钳夹住脐带另一端；37℃摇床消60分钟；消化完成后，取下止血钳，收集消化液到50ml离心管中；将脐带沿脐带静脉剖开，暴露出脐带静脉内表面，用细胞刮轻刮脐带静脉10分钟；用Hanks缓冲液清洗，所述缓冲液的用量为脐带静脉长度的0.5倍（ml/cm），收集洗涤液与离心管中。

将收集细胞的离心管在4℃、500g的条件下，离心5分钟，即可。

实施例4 不同内皮克隆形成细胞的分离方法的比较

1、材料与方法

脐带取自足月顺产或剖腹产的健康产妇，采集后放于含双抗的PBS溶液中4℃保存，48h内处理。反复清洗，并用磷酸缓冲液PBS灌注冲洗脐带静脉，直至流出液体透明。分别用不同的方法进行分离。

A.酶消化法：用止血钳夹住脐带一端，用移液枪将II型胶原酶（0.2%）加入并充满脐带静脉，用止血钳夹住脐带另一端；37℃摇床消化15分钟；消化完成后，取下止血钳，收集消化液到50ml离心管中，再用PBS溶液冲洗静脉，PBS溶液的用量为脐带静脉长度的1倍（ml/cm），收集洗涤液到离心管。

B.机械刮取法：将脐带沿脐带静脉剖开，暴露出脐带静脉内表面，用细胞刮刮脐带静脉5分钟；用PBS溶液清洗，PBS溶液的用量为脐带静脉长度的1倍（ml/cm），收集洗涤液于离心管中。

C.本发明方法（酶消化+机械刮取法）：用止血钳夹住脐带一端，用移液枪将II型胶原酶（0.2%）加入并充满脐带静脉，用止血钳夹住脐带另一端；37℃摇床消化30分钟；消化完成后，取下止血钳，收集消化液到50ml离心管中；将脐带沿脐带静脉剖开，暴露出脐带静脉内表面，用细胞刮刮脐带静脉5分钟；用PBS清洗，PBS溶液的用量为脐带静脉长度的1倍（ml/cm），收集洗涤液与离心管中。

三种方法处理后，收集细胞的离心管分别4℃，500g，离心5分钟。分别用EGM2-MV培养基重悬，接种到I型鼠尾胶原铺板后的35mm培养皿中，按每2cm脐带接种一个35mm皿的量接种细胞，置于37℃，体积分数5%的CO₂饱和湿度培养箱中培养。根据细胞生长情况，每2-3天全量换液一次。生长最快组别的细胞达到90%汇合度时，用0.05%的胰酶/EDTA消化，计数比较各组P0代细胞的数量。

2、实验结果

如图1所示，本发明方法获得的细胞形态呈铺路石状，折光较好，属于内皮克隆形成细胞。

三种方法获得的内皮克隆形成细胞P0代数量如表1所示：

表1 不同方法获得的细胞数量比较

	P0代收获量（万）
		机械刮取	8.5
胶原酶消化	13.8
		胶原酶消化+机械刮取	31.5

如表1所示，机械刮取法和酶消化法获得的P0代细胞仅分别为8.5万和13.8万，而本发明的方法采用酶消化法和机械刮取相结合的工艺，得到P0代细胞为31.5万，是单独采用前二种方法的3.7倍和2.3倍。

本发明方法获得的内皮克隆形成细胞数量，非常显著高于单独使用机械刮取法和酶消化法获得的内皮克隆形成细胞数量，说明本发明通过将机械刮取法和酶消化法进行组合，非常显著地提高了内皮克隆形成细胞的分离效率。

实施例5 本发明内皮克隆形成细胞分离方法的优化

1、实验方法

其余条件同实施例1，消化酶分别为0.2%II型胶原酶（单酶），或者0.2%II型胶原酶与0.5%胰酶按1：1混合组成的双酶；消化时间分别为15分钟、30分钟和60分钟。

生长最快组别的细胞达到90%汇合度时，用0.05%的胰酶/EDTA消化，计数比较各组P0代细胞的数量。

2、实验结果

用不同的酶消化条件消化后，再刮取收集细胞。双酶消化后，经过培养获得了更多的细胞（表2）。

表2 采用胶原酶消化+机械刮取的方法，对不同的酶消化条件进行优化的结果

15min30min60min胶原酶11.8万24.0万3.3万胰酶+胶原酶31.5万24.8万2.8万

如表2所示，单独采用II型胶原酶消化时，获得的细胞数量随着消化时间的延长，先增加后降低，消化30min时，获得的细胞数量最多，为24.0万；用胰酶和II型胶原酶的混合酶消化时，获得的细胞数量随着消化时间的延长而降低，消化15mim时，获得的细胞数量最多，为31.5万，优于单独采用II型胶原酶消化获得的细胞数量。

实验结果说明，采用胰酶和II型胶原酶的混合酶消化15min，获得的内皮克隆形成细胞数量最多。

实施例6 本发明方法分离的内皮克隆形成细胞的鉴定

1、实验方法

（1）内皮克隆形成细胞的传代培养

取实施例3本发明方法获得的P0代细胞，按10000个/cm²按的密度进行传代接种。传代培养过程中，每3天全量换液，直至贴壁细胞达到90%汇合度时，重复上述操作进行传代。

（2）内皮克隆形成细胞表面标志检测

酶消化+机械刮取法分离培养的P5代细胞常规消化后，以PE标记的CD14、CD73、VEGFR2，FITC标记的CD31、CD90、CD34、CD45抗体及其相应的同型对照标记细胞，进行流式检测。

（3）内皮克隆形成细胞低密度脂蛋白（LDL）内吞实验

酶消化+机械刮取法分离培养的P5代细胞生长到汇合度达70%时，加入10μg/ml Dil-Ac标记的LDL，37℃孵育4小时；移去培养基，PBS洗涤3次，用3%多聚甲醛在室温固定30分钟；用PBS反复清洗3次，在荧光显微镜下观察。

（4）内皮克隆形成细胞体外血管形成实验

将Matrigel放在冰上，过夜融化；将融化后的Matrigel加入预冷的24孔板中，37℃孵育1小时；将P5代内皮克隆形成细胞用0.05%的胰酶/EDTA消化，按10000个细胞每孔的量接种到准备好的Matrigel培养板中；置于37℃，体积分数5%的CO2饱和湿度培养箱中培养4小时后，取出在显微镜下观察管状结构形成情况。

2、实验结果

实验结果如图2～图4所示：

如图2所示，P5代的内皮克隆形成细胞的细胞表面表达CD31、VEGFR2和CD73标志；不表达CD14、CD90、CD45，而CD34呈弥散型的表达，符合文献报道的内皮克隆形成细胞的表面标志表达的特征。

如图3所示，与标记后的LDL孵育后，对后者进行内吞，在激光的激发下呈现荧光信号，显示细胞具有正常的LDL内吞功能。

如图4所示，在Matrigel培养表面上，形成管状结构，并且相互连接，形成网状，显示了细胞具有很强的体外血管形成能力。

实验结果说明，本发明分离得到的细胞，具有内皮克隆形成细胞的表面标志物，具有LDL内吞功能和很强的体外血管形成能力，属于内皮克隆形成细胞。

实验结果说明，本发明方法可以从脐带静脉中，有效分离内皮克隆形成细胞，获得的细胞数量多，应用前景良好。

Claims (7)

1.一种内皮克隆形成细胞的分离方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)酶消化：取脐带静脉，用碱性或中性缓冲液灌注冲洗至流出的液体透明，灌入胶原酶或者胶原酶与胰酶的混合酶，封闭两端，消化15～60min，打开两端，收集消化液；

(2)机械刮取：将脐带静脉剖开，暴露出脐带静脉内表面，用细胞刮刮取脐带静脉内表面3～10分钟，再用碱性或中性缓冲液洗涤，收集洗涤液；

(3)将步骤(1)的消化液和步骤(2)的洗涤液合并，离心，去上清，即可；

步骤(1)中，所述胶原酶是II型胶原酶；

步骤(1)中，所述胶原酶的浓度为0.2％，所述胰酶的浓度为0.5％，胶原酶与胰酶的体积比为1:1；

步骤(1)中，所述消化的温度为37℃。

2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(1)中，所述碱性或中性缓冲液是PBS缓冲液、DPBS缓冲液或者Hanks缓冲液。

3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(1)中，所述消化的时间是15～30min。

4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(2)中，所述刮取的时间是5分钟。

5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(2)中，所述碱性或中性缓冲液是PBS缓冲液、DPBS缓冲液或者Hanks缓冲液。

6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(2)中，每厘米脐带静脉用0.5～1.5ml缓冲液洗涤。

7.根据权利要求6所述的分离方法，其特征在于：每厘米脐带静脉用1ml缓冲液洗涤。