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CN103328973A - 双孔装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种装置，包括上室，中间室和下室，其中，所述上室通过第一孔与所述中间室连通，所述中间室通过第二孔与所述下室连通，其中，所述第一孔和第二孔的直径约1纳米到约100纳米，彼此间隔约10纳米至约1000纳米，且其中各室包括用于连接电源的电极。本发明还提供使用该装置，特别是用于多核苷酸测序的方法。

Description

双孔装置
相关申请的交叉引用
本申请根据35 USC § 119(e)要求2011年07月20日提交的序列号为61/572,843的美国临时申请的权益，并通过引用其内容全部纳入本申请。
背景技术
纳米孔(nanopore)是在脂膜中自然形成的作为蛋白质通道(生物孔)的、或是通过在固态基体中钻孔或蚀刻工程改造(固态孔)的纳米级通路。当这样的纳米孔合并入包括两个由纳米孔隔开的室的纳米装置时，可利用灵敏的膜片钳放大器施加跨膜电压，并测量通过该孔的离子电流。
纳米孔为廉价的全基因组DNA测序提供很大的希望。在这方面，可以通过电泳捕获单个DNA分子并驱使其通过孔，检测到的各捕获事件是离子电流的瞬时变化。然后当DNA通过孔通路时，可以从变化的离子电流记录内的图谱、或从纳米孔内或附近的一些其他辅助传感器推测出DNA分子序列。
原则上，纳米孔测序器在测序操作过程中无需扩增样品、使用酶和用于催化的试剂，也无需用于检测测序进程的光学器件，而其中一些或全部器件是常规合成测序方法所必需的。
纳米孔传感器是纯粹的电学装置，而且可以检测其浓度/体积不大于从血液或唾液样本中可得浓度/体积的DNA。此外，纳米孔有望大大提高所测序DNA的阅读长度，从450个碱基到大于10000个碱基。
对于纳米孔测序有两个原理障碍：(1)对于从头测序缺乏足够的灵敏度来精确确定核酸中各核苷酸身份(单核苷酸灵敏度缺乏)；和(2)缺乏在感知期间调节各核苷酸单元通过纳米孔的传输率的能力。虽然许多研究小组正研发和改善纳米孔以解决障碍1，但没有不涉及使用酶或光学器件的方法来解决障碍2，两者只能在专门的纳米孔技术中起作用，并与纯粹的电学方法相比，复杂性和成本更高。
概述
在一实施例中，提供一种装置，包括上室，中间室和下室，其中，所述上室通过第一孔与所述中间室连通，所述中间室通过第二孔与所述下室连通，其中，所述第一孔和第二孔的直径约1纳米到约100纳米，彼此间隔约10纳米至约1000纳米，且其中各室包括用于连接电源的电极。
在一方面，所述第一和第二孔大体上是同轴的。
在一方面，所述装置包括选自下组的材料：硅、氮化硅、二氧化硅、石墨烯、碳纳米管、Ti02、Hf02、Al203、金属层、玻璃、生物纳米孔、具有生物孔嵌入的膜、及它们的组合。
在一方面，所述第一孔和第二孔约0.3纳米至约100纳米深。
在一方面，所述电源配置用于在所述上室和所述中间室之间提供第一电压，和在所述中间室和所述下室之间提供第二电压，且其中所述第一电压和第二电压独立可调。
在一方面，所述电源包括电压钳系统或膜片钳系统以生成各第一和第二电压。在一方面，所述中间室调整为相对于两电压接地。在一方面，所述中间室包括介质以便在各孔和中间室内的电极之间提供导电性。
在一些方面，所述电源，如电压钳系统或膜片钳系统，进一步配置用于测量通过各孔的离子电流。
另一实施例提供一种装置，包括上室，中间室和下室；以及在各室内的电极，其中所述上室通过第一孔与所述中间室连通，所述中间室通过第二孔与所述下室连通，其中，所述第一孔和第二孔的直径约1纳米到约100纳米，彼此间隔约10纳米至约1000纳米；所述电极用于连接电压钳系统或膜片钳系统以便在各孔施加电压和测量通过各孔的离子电流，其中所述中间室内的电极连接到两电压钳或膜片钳系统的共同地线(common ground)。
在一个实施例中，还提供一种用于控制荷电聚合物跨孔运动的方法，包括：(a)将包括荷电聚合物的样品加载在上述任一实施例中的装置的上室、中间室或下室之一内，其中所述装置连接到电压钳或膜片钳系统以便在所述上室和所述中间室之间提供第一电压和在所述中间室和所述下室之间提供第二电压；(b)设置初始第一电压和初始第二电压以使所述聚合物在诸室之间移动，从而定位通过第一和第二孔的聚合物；以及(c)调整第一电压和第二电压，以致两电压产生作用力以便在受控条件下牵拉所述荷电聚合物离开所述中间室，从而所述荷电聚合物在一个方向上并以可控的方式移动通过两个孔，其中，两电压的量值不同。
在一方面，通过第一电压或第二电压或两电压的主动控制或反馈控制建立可控的传递方式，其中任一电压或两电压作为第一或第二或两离子电流测量值的反馈函数。非限定性的例子包括将第二电压保持恒定，并使用第二离子电流作为用于第一电压的反馈或主动控制的反馈，以便在任一方向上可控传送荷电聚合物。因此，在一方面，基于所测量的通过所述第二孔的离子电流调整所述第一电压。
在一方面，将样品加载到上室中，设置初始第一电压将荷电聚合物从上室牵拉至中间室，设置初始第二电压将聚合物从中间室牵拉至下室。
在另一方面，将样品加载到中间室中，设置初始第一电压将荷电聚合物从中间室牵拉至上室，设置初始第二电压将荷电聚合物从中间室牵拉至下室。
在一方面，荷电聚合物为多核苷酸或多肽。在一方面，荷电聚合物是多核苷酸，例如，但不限于，双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、双链RNA(dsRNA)、单链RNA(ssRNA)或DNA-RNA杂交体。
在一方面，在步骤(c)，调整的第一电压和第二电压在量值上是两电压间差异的约10倍至约10000倍。
在一方面，所述方法进一步包括当聚合物的单体单元穿过其中一孔时，通过测量穿过该孔的离子电流来识别该单体单元。在一方面，所述单体单元是核苷酸。在另一方面，所述单体单元是核苷酸对。在一些方面，单核苷酸和核苷酸对可以在一个分子中检测。例如，这样的分子可以在较长和其他单链多核苷酸中具有双链体区段，其中所述双链体区段部分或全部通过沃森克里克互补碱基配对形成。
在一方面，单体结合到分子，如DNA结合蛋白或纳米粒子。DNA结合蛋白的非限制实例包括RecA和序列特异性DNA结合蛋白，如噬菌体λ阻遏物、NF-κB和p53。纳米粒子的非限制性例子包括量子点和荧光标记物。
在一方面，聚合物在其一末端附着于固体支持物，如珠。
还有的另一实施例提供用于检测多核苷酸序列的方法，包括：(a)将包括多核苷酸的样品加载在任一上述实施例所述装置的上室内，其中所述装置连接到电压钳或膜片钳系统以便在所述上室和所述中间室之间提供第一电压和在所述中间室和所述下室之间提供第二电压，其中所述多核苷酸任选在其一末端连接于固体支持物；(b)设定初始第一电压和初始第二电压，以致所述多核苷酸从所述上室移动到所述中间室，从所述中间室移动到所述下室，从而定位穿过所述第一孔和第二孔的所述聚合物；(c)调节所述第一电压和所述第二电压以致两电压产生作用力以便在可控条件下牵拉所述多核苷酸离开所述中间室，其中所述两电压在量值上不同，以致所述多核苷酸在一个方向上以可控方式移动穿过两孔；和(d)当所述核苷酸穿过孔之一时，通过测量穿过该孔的离子电流识别穿过该孔的多核苷酸的各核苷酸。
附图简要描述
附图仅通过举例的方式描述提供的实施例，其中：
图1(I)-(Ⅲ)示出两孔(双孔)装置。(I)用于各孔独立电压控制(V1,V2)和电流测量(I1,I2)的双孔芯片和双放大器电子配置的示意图。除了共同孔，诸室(A-C)在体积上隔开。可用的芯片参数是孔间距离10-500纳米，膜厚度0.3-50纳米，孔径1-100纳米。(Ⅱ)电学上，通过构建最大程度降低所有接入电阻以便有效去耦I1和I2的装置，V1和V2主要在各纳米孔电阻上。(Ⅲ)竞争电压(competing voltage)将用于控制，蓝色箭头显示各电压作用力(voltage force)的方向。假设孔隙具有相同电压力影响，用|V1|=|V2|+δV，调节δV值>0(<0)用于在V1(V2)方向可调谐的运动。实际上，对于给定的两孔芯片，虽然V1=V2时各孔的电压诱导力并不会完全相同，但校准实验可确定产生相同牵拉力所需的电压偏差，然后可利用围绕该偏差的变化进行方向控制；和
图2示出具有室A、室B和室C的两孔壳体装置的外部视图，各室具有用于流体进入和样本加载的通路。双孔芯片放置在两密封垫之间，壳体装置的各部分具有各密封垫部，并且两部分绕铰链(中间顶部)旋转以在芯片周围打开和关闭所述壳体。
某些或所有附图是范例的示意图，因此，它们不需要描述所示元件的实际相对大小或位置。为清楚理解示出一个或多个实施例的目的而提供附图，它们不用于限制后附权利要求的范围或含义。
详细描述
本申请中，文本涉及出现的组成，组合物和方法的各种实施例。描述的各种实施例意味着提供各种示例性的实施例，不应该被解释为替代品的描述。相反，应注意本文所提供的各种实施例的描述可能是重叠的范围。本文所讨论的实施例仅仅是说明性的，并不意味着限制本发明的范围。
此外本申请中，各种出版物，专利和公布的专利说明书通过引用作为参考。因此这些出版物，专利和公布的专利说明书的披露内容通过引用合并到本申请中以更充分地描述本发明所属领域的状况。
如说明书和权利要求书中所用，除非上下文清楚地另有规定，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数形式。例如，术语“一电极”包括多种电极，包括它们的混合物。
如本文所用，术语“包括”旨在表示装置和方法包括所列举的组件或步骤，但不排除其他的。当用于限定装置和方法时，“基本上由……组成”将意味着从该组合中排除任何实际意义的其他零件或步骤。“由……组成”将意味着排除其他零件或步骤。这些转换术语各自限定的实施例落在本发明的范围内。
全部数字称号，例如，距离、尺寸、温度、时间、电压和浓度，包括范围，是近似值，可改变(+)或(-)0.1的增量。虽然并不总是明确地指出，但应当理解，术语“约”在所有数值之前。虽然并不总是明确说明，但还应当理解，本文描述的零件仅仅是示例性的，它们的等价物是现有技术中已知的。
双孔装置
本申请的一个实施例提供两孔装置。该装置包括三个室和使诸室之间流体连通的两个孔。此外，各室包括用于连接电源的电极，以便在诸室之间的各孔上产生不同的电压。
依照本申请的一个实施例，提供一种装置，包括上室、中间室和下室，其中所述上室通过第一孔与所述中间室连通，并且所述中间室通过第二孔与所述下室连通，其中所述第一孔和第二孔的直径约1纳米至约100纳米，彼此间隔约10纳米至约1000纳米，且其中各室包括用于连接电源的电极。
参考图1(I)，装置包括上室(室A)，中间室(室B)和下室(室C)。通过各具有独立孔(111和112)的两独立层或膜(101和102)分隔室。此外，各室包含用于连接电源的电极(121，122和123)。很明显，上、中间和下室的注释是相对而言的，并不表示，例如，上室相对于地面置于中间室或下室上方，或反之亦然。
各孔(111和112)独立地具有允许小或大分子或微生物通过的尺寸。在一方面，各孔的直径至少约1纳米。或者，各孔的直径为至少约为2纳米、3纳米、4纳米、5纳米、6纳米、7纳米、8纳米、9纳米、10纳米、11纳米、12纳米、13纳米、14纳米、15纳米、16纳米、17纳米、18纳米、19纳米、20纳米、25纳米、30纳米、35纳米、40纳米、45纳米、50纳米、60纳米、70纳米、80纳米、90纳米或100纳米。
在一方面，孔的直径不大于约100纳米。或者，孔的直径不超过约95纳米、90纳米、85纳米、80纳米、75纳米、70纳米、65纳米、60纳米、55纳米、50纳米、45纳米、40纳米、35纳米、30纳米、25纳米、20纳米、15或10纳米。
在一方面，孔具有约1纳米到约100纳米的直径，或者约2纳米到约80纳米，或约3纳米到约70纳米，或约4纳米到约60纳米，或约5纳米到约50纳米，或约10纳米到约40纳米，或约15纳米到约30纳米。
在一些方面，孔基本上为圆的形状。如本文所用“基本上为圆的”是指至少约80%或90%是圆柱形式的形状。在一些实施例中，孔是正方形、矩形、三角形、椭圆形或六角形。
各孔(111和112)独立地具有深度。在一方面，各孔具有至少约0.3纳米的深度。或者，各孔的深度至少约为0.6纳米、1纳米、2纳米、3纳米、4纳米、5纳米、6纳米、7纳米、8纳米、9纳米、10纳米、11纳米、12纳米、13纳米、14纳米、15纳米、16纳米、17纳米、18纳米、19纳米、20纳米、25纳米、30纳米、35纳米、40纳米、45纳米、50纳米、60纳米、70纳米、80纳米或90纳米。
在一方面，各孔的深度不超过约100纳米。或者，深度不超过约95纳米、90纳米、85纳米、80纳米、75纳米、70纳米、65纳米、60纳米、55纳米、50纳米、45纳米、40纳米、35纳米、30纳米、25纳米、20纳米、15或10纳米。
在一方面时，孔的深度为约1纳米到约100纳米，或者约2纳米到约80纳米，或约3纳米到约70纳米，或约4纳米到约60纳米，或约5纳米到约50纳米，或约10纳米到约40纳米，或约15纳米到约30纳米。
在一方面，孔间距为约10纳米到约1000纳米。在一方面，该距离为至少约10纳米，或任选地至少约20纳米、30纳米、40纳米、50纳米、60纳米、70纳米、80纳米、90纳米、100纳米、150纳米、200纳米、250纳米或300纳米。在另一方面，该距离不超过约1000纳米、900纳米、800纳米、700纳米、600纳米、500纳米、400纳米、300纳米、250纳米、200纳米、150纳米或100纳米。在还有的另一方面，该距离为约20纳米到约800纳米，约30纳米到约700纳米，约40纳米到约500纳米，或约50纳米到约300纳米。
两孔可以设置在任何位置，只要它们允许流体在诸室之间连通并具有规定的尺寸和间距。在一方面，孔设置成它们之间不存在直接障碍。在一方面，孔还基本上是同轴的，如图1(I)所示。
在一方面，装置通过诸室中的电极连接到一个或多个电源。在一些方面，电源由给各孔提供电压、还可以独立测量通过各孔的电流的电压钳或膜片钳组成。在这方面，电源可以将中间室设置为两个电压源的共同接地。在一方面，电源配置为在上室(例如，图1(I)中室A)和中间室(例如，图1(I)中室B)之间提供第一电压，以及在中间室和下室(例如，图1(I)中室C)之间提供第二电压。
在一些方面，第一电压和第二电压是独立可调的。在一方面，中间室调整到相对于两个电压接地(示于图1(I-Ⅲ))。在一方面，中间室包括在各孔和中间室内的电极之间提供导电性的介质。在一方面，中间室包括在各孔和中间室内的电极之间提供电阻的介质。相对于纳米孔电阻，保持此类电阻足够小对于孔上两电压和电流的去耦是有用的，从而有助于独立调节电压。
电压调节可以被用来控制室内带电粒子的运动。举例来说，当两电压都设置在相同方向，合适的带电粒子可以循序地从上室移动到中间室，到下室，或相反方向其他通路。另外，带电粒子可以从上室或下室移动到中间室，并保持在那里。
调节装置中的电压对于控制大分子，如荷电聚合物(其足够长从而能同时穿过两孔)的移动特别有用。在该方面，可以通过电压的相对量值和方向控制分子的运动和运动速度，这将在下面进一步描述。
该装置可以包含适合用于保持液体样品，特别是生物样品的材料，和/或适合纳米制造的材料。在一方面，这样的材料包括电介质材料，例如，但不限于，硅、氮化硅、二氧化硅、石墨烯、碳纳米管、Ti02、Hf02、Al203或其它的金属层，或者这些材料的任何组合。例如，石墨烯单片形成～0.3纳米厚的膜，可以用作承孔膜。
可以通过各种手段和方法制造微流体性和容纳两孔微流体芯片的装置。对于包括两平行膜的微流体芯片，可以采用单光束对两膜同时钻孔以形成两个同轴孔，但与任何合适的对齐技术配合在膜的各面使用不同的光束也是可行的。总体而言，壳体确保室A-C的封闭隔离。在一方面，该壳体在电压电极(两源和一接地)和纳米孔之间提供最小接入电阻，以确保各电压主要施加在各孔上。
在一方面，图2示出了装置的另一个实施例的外部视图。图2中，装置包含微流体芯片(标示为“双核芯片”)，包括通过隔离片(spacer)连接的两个平行膜。各膜包含利用单光束通过膜中心钻的孔(未示出)。此外，装置优选具有用于芯片的特氟
Figure BDA00003525971400081
壳体。该外壳可确保室A-C封闭隔离，并为电极提供最小接入电阻以确保各电压主要施加在各孔上。
更具体地，可以用具有5-100纳米厚的硅、氮化硅或二氧化硅窗口的TEM(透射电子显微镜)栅格制造承孔膜。隔离片可以用于隔开膜，使用绝缘体(SU-8，光致抗蚀剂，PECVD氧化物，ALD氧化物，ALD氧化铝)或蒸发的金属(银，金，铂)材料，并在两膜之间室B的其他含水部分内占有小体积。固定器固定在包括室B最大体积分数的水浴内。室A和室C可通过较大直径的通道(接入电阻低)达到，该通道通往膜密封处。
可利用聚焦的电子或离子束通过膜钻孔，从而自然地将它们对齐。通过将恰当的光束聚焦到各层，孔也可被雕刻(收缩)到更小的尺寸。考虑到对于给定方法和膜厚度可能的钻孔深度，还可采用任何单纳米孔钻孔方法在两膜内钻对孔。为进一步精制膜厚度，还可能预钻微孔到规定的深度，然后通过膜的其余部分(得到)纳米孔。
在另一方面，在两孔方法(Hall等，Nat.Nanotech.,5(12):874-7,2010)的任一或两个纳米孔中可采用将生物纳米孔插入固态纳米孔以形成混合孔隙。生物孔可以增加离子电流检测的灵敏度，且在两孔装置中仅需要捕获或控制单链多核苷酸，例如用于测序时，是有用的。
采用两孔装置控制分子运动
由于装置的孔上存在电压，带电分子可以通过室间的孔移动。移动的速度和方向可以通过电压的量值和方向控制。另外，因为可独立调整两电压中的每一个，在各室中带电分子的运动和速度可以精确地控制。
例如，可利用该装置以受控方式混合两带正电荷的分子。为此，最初第一分子装入上室，第二分子装入下室。第一孔上的第一电压可以诱导第一分子从上室移动进入中间室。同样，在与第一电压相反的方向，第二电压可以诱导第二分子从下室移动入中间室。由于电压方向相反，两分子将保持在中间室以彼此反应。另外，通过调节电压的相对量值可以微调各分子的流入速度，导致可控的反应。
另一个例子涉及长度大于包括两孔深度加上两孔间距的组合距离的荷电聚合物，如多核苷酸。例如，1000bp的双链DNA(dsDNA)的长度为～340纳米，远远长于间隔20纳米的两个10纳米长的孔的40纳米的跨距。在第一步骤中，多核苷酸装入上室或下室。由于在生理条件下(～pH7.4)带负电荷，多核苷酸可以移动通过施加电压的孔。因此，在第二步骤中，将同一方向以及相同或相似量值的两个电压施加于孔以便诱导多核苷酸移动依次通过两孔。
在多核苷酸大致达到第二孔之时，改变两电压或其中一个。由于多核苷酸的长度大于两个孔的距离，当多核苷酸到达第二孔隙时，它也在第一孔中。因此，立即改变第一孔的电压方向将产生将多核苷酸牵拉离开第二孔的作用力(示于图1(Ⅲ))。
此时，如果第一孔的电压诱导作用力的量值小于第二孔的电压诱导作用力的量值，则多核苷酸将继续朝着第二孔穿过两个孔，但是速度较低。在这方面，容易理解多核苷酸运动的速度和方向可以通过两个电压的方向和量值控制。这样的精细运动控制具有广泛的应用，将在下面进一步描述。
因此，在一方面提供用于控制荷电聚合物通过孔运动的方法。该方法需要(a)将包括荷电聚合物的样品记载在任一上述实施例的装置的上室、中间室或下室之一，其中所述装置连接到在上室和中间室之间提供第一电压以及在中间室和下室之间提供第二电压的电源；(b)设置初始第一电压和初始第二电压以使聚合物在室之间移动，从而定位通过第一和第二孔的聚合物；以及(c)调整第一电压和第二电压，以使两电压产生作用力在受控条件下牵拉荷电聚合物离开中间室(电压竞争模式)，其中两电压量值不同，以致荷电聚合物在任一方向并以受控方式移动通过两个孔。
为在步骤(c)中建立电压竞争模式，对于使用的各两孔装置，要测定在各孔由各电压产生的相应作用力，这可以采用校对实验通过观察不同电压值对多核苷酸运动(通过感测多核苷酸的可检测的特征和已知位点可以测定该运动，在这个临时文件中稍后详述这些特征的实施例)的影响来完成。例如，如果各公用电压的作用力相等，那么在各孔(相对于接地的中间室，在上室和下室内具有公用极)使用相同电压值在缺乏热搅动的情况下产生零净运动(以下讨论布朗运动的存在和影响)。如果各公用电压的作用力不相等，那么实现相同的力需要在公用电压的作用力较弱的孔处鉴别和使用较高电压。需要对各两孔装置和特定荷电聚合物或分子作电压竞争模式的校准，它们通过各孔的特征影响作用力。
在一方面，将样品加载到上室中，设置初始第一电压将荷电聚合物从上室牵拉到中间室，设置初始第二电压将荷电聚合物从中间室牵拉到下室。同样，样品可先装入下室。
在另一方面，将样品加载到中间室中，设置初始第一电压将荷电聚合物从中间室牵拉到上室，设置初始第二电压将荷电聚合物从中间室牵拉到下室。
在一些方面，荷电聚合物是多核苷酸或多肽。在具体的方面，荷电聚合物是多核苷酸。多核苷酸的非限制性实例包括双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA和DNA-RNA杂交体。
在一方面中，在步骤(c)，调整的第一电压和第二电压在量值上是两电压间差异的约10倍至约10000倍。例如，两个电压分别为90毫伏和100毫伏。电压(～100毫伏)量值是它们差异10毫伏的约10倍。在一些方面，电压量值为它们之间差异的至少约15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍、500倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍或9000倍高。在一些方面，电压量值不超过它们之间差异的约10000倍、9000倍、8000倍、7000倍、6000倍、5000倍、4000倍、3000倍、2000倍、1000倍、500倍、400倍、300倍、200倍或100倍高。
在一方面，在步骤(c)使用专用的硬件和软件通过主动控制或反馈控制在时钟速率(clock rate)高达数百兆赫进行第一电压和第二电压的实时或在线调整。第一电压或第二电压或两电压的自动控制是基于第一或第二离子电流测量值或二者的反馈。
采用两孔装置进行分子分析
本申请的两孔装置可以用于实施我们的分子或粒子分析，通过施加在孔上的受控电压使得分子或粒子在装置内移动或停留。在一方面，在任一孔或两孔进行分析。各电压钳或膜片钳系统测量通过各孔的离子电流，该测量的电流用于检测是否存在通过的带电粒子或分子，或通过的带电粒子或分子的任何相关特征。
如上文所述，多核苷酸可以通过具有相同方向的两电压装入两个孔。在这个例子中，一旦施加在第一孔的电压的方向逆转，而新的电压诱导作用力在量值上比施加在第二孔的电压诱导作用力略小，多核苷酸将继续在相同方向移动，但速度明显较低。在这方面，给第二孔提供电压的放大器还测量通过第二孔的电流，接着离子电流测定穿过孔的核苷酸的身份，因各不同的核苷酸穿过时会引起不同的电流信号(如，基于离子电流振幅的变化)。因此，识别多核苷酸中的各核苷酸就揭示了多核苷酸的序列。
在某些方面，反复可控传递以便重新测序多核苷酸进一步提高了测序的质量。对于在各个方向的受控传递，各电压交替变大。还可以设想的是通过两孔的两电流是与提高的准确度相关。可以预期布朗运动可能会导致分子运动的波动，影响分子的受控传递。然而，可通过，例如DNA测序期间的DNA反复受控传递和求测序测量值的平均值来最大程度降低或避免这些的影响。更进一步地，可以预期布朗运动对大分子如多核苷酸或多肽的受控运动的影响将是显著的，特别是当竞争力拉开大分子，在分子内产生张力之时。
这样的方法为现有技术没有解决的问题提供了较佳的方案。
例如，已知实现纳米孔测序所需的精确感测和可控传递有两个竞争障碍。一是需要孔上有较高的电压以提供足够的测序灵敏度。另一方面，高电压导致多核苷酸快速通过孔，没有足够的时间用于识别各核苷酸。
更具体地，纳米孔测序平台要求将多核苷酸通过孔的速率控制在1毫秒/核苷酸(nt)或更慢，同时还产生序列敏感电流。这需要足够高的信噪比来检测电流信号(高电压更好)，但需要足够慢的分子通过孔的运动以确保测量在记录带宽内(低电压更好)。在单孔实施方式中，多核苷酸速度与电压成比例，因此更高的电压对于检测更好，但是对于降低多核苷酸速度更糟：在促进多核苷酸捕获的电压下，速率是1μs/nt且更快(>1000倍快)。另一方面，较低的电压降低检测性能，也增加布朗运动导致的速率波动，而这将破坏阅读精确度。
除本说明书的记载，目前没有不涉及使用酶或光学器件(两者仅在特定的纳米孔技术中起作用)而解决这些障碍的方法。
已提出一些方法来解决低电压下与感测能力缺乏相关的问题。一是工程改造生物纳米孔以提高其灵敏度。另一种是使用石墨烯膜，作为单一层其比ssDNA中核苷酸间的距离更薄。还有另一个是使用在靠近纳米孔测量的辅助电流(例如，隧穿电流)。
在第一方法已经测试过生物纳米孔。α-溶血素纳米孔是研究中最常用的生物孔。研究已表明α-溶血素可以分辨均聚物内的单核苷酸取代和其他所有碱基DNA内的碱(1′,2′-脱氧)残基。但是在杂聚DNA内，利用野生型(WT)α-溶血素不可能有单核苷酸灵敏度，因在通路内离子电流被～10个核苷酸影响。必须对α-溶血素作蛋白工程改造来提高它对于DNA分析和测序的灵敏度。一个这样的突变孔采用共价连接分子接头的α-溶血素，其能够以高精度识别四个核苷5′-单磷酸分子(Clarke等，Nat.Nanotech，4(4):265-70，2009)。但是，对于测序通过孔的完整杂聚ssDNA，这种突变孔看来不具灵敏度。
另一种示例性的生物孔是MspA，具有漏斗状的外形，将离子电流的感受聚焦到通道的底部。此外，通过使用酶可以实现DNA通过MspA和α-溶血素的速率下降。如Manrao等，Nature Biotechnology,30:349-53,2012中的图1所示，使用位于MspA纳米孔上的酶实现DNA通过速率降低。然而，这将导致在非确定性感应持续，回溯诱导反复读取，以及无法感测均聚区。利用α-溶血素开发了phi29聚合酶介导的DNA易位机制(Cherf等，Nat.Biotech.，30(4):344-8，2012)，并在更敏感的MspA纳米孔上实现(Manrao等,NatureBiotechnology,30:349-53,2012)。聚合催化易位的逐步速率是2.5-40nt/秒，满足DNA速率降低的要求。然而，虽然生物孔上的酶可以降低易位速率，但是对各核苷酸停留时间缺乏控制，这将使盲法跟踪重复非常困难，难以区分单核苷酸阅读上的长时间停留。在灵敏度方面，如Manrao等人，NatureBiotechnology,30:349-53，2012的图3中所示，采用MspA上的phi29可以实现阅读重复的DNA模板。图(3a)示出重复的CAT三核苷酸构成的DNA模板的实例性曲线(trace)，除了序列中间一个CAG三联子。“*”表示作为两水平间重复的转换而检测到的“切换(toggles)”(通过人工分析)，这是酶为基础的控制方法固有的，并导致读取错误。图(3b)还示出(3a)的理想化情况，平均电流水平与已知的DNA序列相一致，移除(3a)中所示的测量持续时间的偏差。理想化情况显示由单个dG取代打断的三水平重复模式。单个dG取代影响四水平，其中最接近取代的偏差最大，暗示剩余电流主要受～4个核苷酸影响。通过MspA的离子电流被最接近极限孔径(limiting aperture)的～4个核苷酸影响对于识别序列增加了相当大的复杂性。虽然可以理想地建立反映44=256种组合中每一个的不同电流振幅的库，但如现有技术所暗示的，这个库将是难以实现的。原因是，识别通路电流记录中的步骤易位需要半振幅法的信噪比(SNR)至少为2(用马尔可夫方法SNR≥1.5)。在记录带宽上RMS噪声为0.5pA时，振幅移位必须至少1pA以具有所需的SNR，从而导致用MspA的40pA振幅范围内仅有～40个可检测水平。此外，将观察到少于40个水平，由于该范围不会统一利用，虽然进一步滤波可以降低噪声以增加振幅识别，但它也导致丢失更多已存在的更快ssDNA运动变化。
目前，没有纳米孔能使得离子电流感测可以提供用于核酸测序的单核苷酸灵敏度。不过，生物孔和固态孔(石墨烯)灵敏度的改善是活跃和进行中的研究领域。一个问题是离子电流感测不允许直接跟踪通过均聚区域(碱基重复)的进展情况，因为均聚ssDNA通过孔的运动没有清晰的信号/核苷酸。跟踪重复序列是必要的，例如，因为人类线粒体DNA内特定的单核苷酸重复(7，9nt)的缺失和插入已经参与各类肿瘤(Sanchez-Cespedes等,Cancer Research,61(19):7015-7019,2001)。虽然生物孔上的酶可以减少易位速率，但缺乏对各核苷酸停留时间的控制。另一方面，使用具有两孔控制的恒定传递速率，非确定的停留被消除，可以准确估计重复序列长度。多次重新阅读重复部分还可以改善估计误差和识别误差界(error bound)，且无需逆转由酶引起的聚合化学反应就可以做到。
最近的一项研究表明采用单纳米孔，仅通过降低电压不能实现降低速率(Lu等，Biophysical Journal,101(1):70-9,2011)。相反，当电压降低，因布朗运动增加速率波动，单链DNA(ssDNA)的速率变得更随机(包括回溯)。研究还表明需要高电压作用力来抑制或将混淆测序测量值的布朗运动诱导的速率波动，即使使用理想化的单核苷酸敏感的纳米孔传感器。
本发明基于两孔装置的测序方法为这些问题提供方便的解决方案以及胜过现有方法的额外优点。与具有足够测序灵敏度的一个或两个孔一致的是，在高或低电压下，两孔控制解决单纳米孔实施中测序速率控制问题。这样的孔可以包括容纳在固态基板内的生物孔，跨固态基板形成的膜内的生物孔或固态孔(例如，在石墨烯、硅或其它基板内)。在一方面，生物孔如MspA上的酶如phi29可用于一个或两个孔，利用为测序产生大信号的高电压和在各酶上产生作用力的低差分电压(low differential voltage)，足以在各孔顶上原位保留住酶，并允许聚合催化DNA运动，但没有大到使得酶停顿或解离。这样的配置可以通过显著提高测量信号并允许两孔同时读取DNA的一个链来改进Cherf等，Nat.Biotech.，30(4):344-8，2012和Manrao等，Nat.Biotech.，30:349-53，2012中的方法。
另外，本发明的方法使用离子电流感测可以在孔处产生足够高的电压以确保在孔处的检测灵敏度。高电压充分抑制布朗运动以保证通过各孔的恒定速度是可能的，各孔外DNA的配置会在各方向上影响DNA运动能。此外，可以调谐在方法(图1(Ⅲ))中使用的电压竞争，使得分子在孔中停留足够的时间以允许分子分析。更进一步地，本发明的方法不需要酶，光学器件或DNA上的附着物。因此，本方法能高信噪比地检测通过纳米孔的电流，同时调节分子传递速率，这是单纳米孔实施中不具备的能力。
本方法可以用来识别荷电聚合物中单体的组成。在一方面，当聚合物是单链DNA或RNA，单体单元是核苷酸。在另一方面，当聚合物是双链的，单体单元可以是核苷酸对。
在一方面，本方法可以用于识别聚合物的修饰情况，如结合到单体的分子，特别是当结合分子带电时。但是，由于即使是中性分子也可以凭借其大小改变离子电流，因此结合的分子不一定要带电。
在另一方面，修饰包括将某分子结合到聚合物。例如，对于DNA分子，结合分子可以是DNA结合蛋白，如RecA、NF-кB和p53。在还有的另一方面，修饰是结合到特定单体或片段的粒子。例如，可以通过装置检测为基因分型或DNA作图的目的结合到特定DNA位点的量子点或荧光标记物。因此，本申请的装置还为基因分型或DNA作图提供廉价的方式，不限于此。
在一方面，聚合物在其一末端，该聚合物附着到固体支持物，如珠。
在一实施例中还提供一种用于确定多核苷酸序列的方法，包括：(a)将包括多核苷酸的样品加载在任一上述实施例的装置的上室内，其中所述装置连接到用于在所述上室和所述中间室之间提供第一电压以及在所述中间室和所述下室之间提供第二电压的电源，其中所述多核苷酸任选在其一末端附着到固体支持物；(b)设置初始第一电压和初始第二电压以使所述多核苷酸从所述上室移动到所述中间室，从所述中间室到所述下室，从而定位通过第一和第二孔的聚合物；(c)调整所述第一电压和第二电压以使两电压产生作用力从而在受控条件下从所述中间室牵离所述多核苷酸，其中两电压在量值上是不同的，以使所述多核苷酸在一个方向并以可控的方式移动通过两个孔；和(d)当多核苷酸的各核苷酸通过孔之一时，通过测量穿过该孔的离子电流来识别通过该孔的核苷酸。
实施例
通过参考下面的实施例进一步限定本发明。对于本领域技术人员来说，在不偏离当前发明范围的情况下，实现对路线和方法的众多修改是显而易见的。
实施例1孔内单个dsDNA分子的捕获和控制
本实施例说明将进入两孔装置的各孔的DNA捕获(事件)不难检测为所测得各独立离子孔电流的变化(情况)。
本实施例示出双孔捕获，使用具有或没有附着到一末端的珠的dsDNA。还探讨使用珠系ssDNA的实验。
DNA捕获和停留后，最接近珠的孔电压(V1,图1(I)，在从室A捕获时)可以逆转，并增大直到DNA上的竞争力将它拉回到室A。在任一孔的离子电流不难在实验过程中检测DNA的捕获和离去。
当使用珠时，珠具有合适的大小防止珠通过任一孔或两孔。本领域已经研发出确保珠DNA之比为1比1的方法。例如，偶联于生物素化的DNA双链体(或ssDNA)的单价链霉亲和素涂布量子点(QDs；QD655，(英杰公司)Invitrogen)可以提供直径范围在20-30纳米的珠，使用金粒子或乳胶可能得到较大的珠(30-100纳米)。在设计实验时可以考虑珠对流体力学和电荷的影响，因它与捕获速率有关。
无珠情况下，dsDNA以～0.1ms/kbp通过孔。可以使用长度为500bp和4kbp的DNA和λ噬菌体dsDNA分子(～48kbp)。DNA样本可以从室A传递到两孔，对各孔使用公共电压极性以促进从室A进行捕捉及通过室B进入室C(图1(I))。大持续长度(persistence length)的dsDNA(一库恩长度为100纳米)确保各孔内DNA区段可能完全延伸且是棒状的。可以改变电压和离子浓度以确定足够的捕获速率。还可以在各室内使用不同的缓冲离子浓度以提高或改变捕获速率，以及记录各孔内DNA出现的电导变化值。
使用10纳米和更大的纳米孔直径可最大限度减少dsDNA和纳米孔壁之间的相互作用(例如，摩擦和附着)。对于较大的孔，虽然dsDNA可以以未折叠或折叠结构捕获，但在较高电压使用较短的dsDNA(≤3kbp)，更可能是单列(未折叠)结构。对于500纳米或更小的孔内距离，可以预计在1M KCl内，就电压至少为200mV而言，在第一孔捕获后(在室A和B之间)，双孔捕获的可能性非常高。
对于6-15纳米的孔直径、120-500mv的电压且dsDNA至少为4kbp长，其中电压影响主导热扩散且导致高捕获可能性的径向距离估计为至少900纳米(大于孔间距)(Gershow和Golovchenko,Nature Nanotechnology,2:775-779,2007)。这些发现支持了在dsDNA单(第一)孔捕获后，dsDNA迅速双孔捕获的可能性很高。
通过两孔的DNA捕获和控制可以得益于主动控制硬件和实时算法。发明人已经开发了用于DNA控制的主动控制硬件/软件。参见，例如，Gyarfas等，Biophys.J.,100:1509-16，2011；Wilson等，ACS Nano.,3(4):995-1003，2009和Benner等，Nat.Nanotech.,2007，2(11):718-24,2007。有用的软件为LabVIEW软件(版本8，美国国家仪器公司，奥斯汀，德克萨斯州)，在FPGA(现场可编程门阵列)系统(PCI-7831R，美国国家仪器公司)上实施。引用的FPGA可以同时控制最多4台放大器。此外，用于在PC上数字化和记录数据的AxonDigidata 1440A数据采集系统具有16输入通道，足以为最多8个放大器平行记录电压和电流。与用于实时控制和测试的硬件/软件相配合的其他的实时操作系统也可以用于控制放大器，数字化和记录数据。
发明人还开发了一种低噪声电压钳放大器，名为“纳米钳”(Nanoclamp)(Kim等，IEEE Trans.On Biom.Circ.And Syst.待刊,2012年5月；Kim等,Elec.Lette.,47(15):844-6,2011年7月；和Kim等,Proceedings of the IEEE International SoC Design Conference(ISOCC),2010年11月)以功能化和优化一个或多个纳米孔在小型和多通道设备中的应用。任何其他商用台式电压钳或膜片钳放大器，或集成的电压钳或膜片钳放大器可用于两孔控制和测量。
对于各种固态孔材料和直径，0.1-10kbp需要～1毫秒以易位。采用FPGA控制的放大器，可以在0.020毫秒内检测捕获和启动竞争电压控制，远快于1kbp DNA的1毫秒总通过时间，因此，也很有可能在DNA(无珠附着)逃脱前启动控制方法。作为控制示范，分子从孔离去时间和方向可以示为竞争电压的量值和其间差异的函数关系(图1(Ⅲ))。单孔实验中，通过实验观察到通过孔的长dsDNA(>1kbp)的速度有较大波动，这些波动太大从而不能归因于扩散布朗运动。在Lu等，Biophysical Journal，101(1)：70-79，2011中，将净速度波动(即DNA长度除以总通过时间)的主要来源建模为由于电压诱导粘性阻力影响影响还没在孔内的DNA部分(除了孔内的部分外)，其中吸引的电压区域延伸。该模型相当不错地匹配实验数据。值得注意的是，如果捕获后，dsDNA物质中心与孔共线，净速度更快，但如果它偏离孔，净速度较慢。当两孔装置内的竞争电压接合时，dsDNA速度不受该粘性阻力诱导的扰动影响，除非电压差足够高。原因是通过两孔的dsDNA捕获和竞争电压接合后，两孔之间的dsDNA将完全延伸并为棒状，因此不能接合以便在临近任一内部孔入口创建结构。另一方面，各局部孔电压常迫使孔外侧上的dsDNA结构离开中间室，因此不太可能打乱孔进入动力学特征。这种结构可能会影响到可控的传递动力学性质，可利用校准实验来量化它。
由随机横向DNA运动引起的作用力不确定性可能是最小的。此外，电压力在DNA运动相反的方向上导致电渗流(EOF)，从而导致与没有诱导的反粒子流动存在时相比，DNA的移动慢。由于不同的分子径向位置可以在纳米孔内产生不同的EOF场，一个问题是，波动期间有效的电荷密度和因此的净驱动力在DNA径向位置的改变是否充分以引起速度波动。据认为，对于孔壁与DNA之间1纳米或更长的距离，1M氯化钾中有效的DNA电荷密度是稳定的。
此外，SiN纳米孔具有本质上排斥DNA的表面负电荷。因此，虽然通过使用直径大于几纳米的SiN孔，分子将经历径向位置波动，但当在两孔机构内使用两竞争电压时各恒定电压值将在两孔中每一个上导致恒定的有效作用力从而在较大作用力的方向导致恒定的速率是可能的。其他孔材料表面的处理可以产生与SiN相当的效果。
可通过增大竞争电压降低布朗运动导致的随机平移DNA运动所诱导的速度不确定性。可以实施实验以确定是否将发生这样的降低。单纳米孔研究(Lu等,Biophysical Journal,101(1):70-79,2011)支持提高竞争力可以降低由布朗运动导致的不确定性。该研究分析了由布朗运动引起的在快速时间尺度(纳秒级)上发生的速度波动以及这样的波动导致的测序错误。假定假设的和理想化的单核苷酸传感器(在>22MH带宽无噪声检测)，布朗运动单独导致75％的读取错误。用于预测误差的相关参数为kBT/F*(0.34纳米)，是热能与使得DNA易位核苷酸间距α(0.34纳米)所作功之比。在该比例中，力F=Vλ，是驱动DNA的电压乘电荷密度λ(对于dsDNA，0.2e-/bp)。对于目前的控制方法，增加电压50X导致5%的读取错误，采用较高的电压进一步增大错误。但是，采用单孔，由于平均速率
Figure BDA00003525971400171
为F*d/(kBT)具有扩散常数d，DNA速度也随F增加，对测序带宽寄予更不切实际的要求。
为了保持22MHz带宽，采用单纳米孔，作用力增加50X必须匹配溶液粘度增加50X以维持相同的。然而，实际上，对于单核苷酸测序，22MHz带宽已远高于已经证明或预计证明的任何实验性纳米孔平台。此外，采用单纳米孔，增大粘度可以放慢DNA最多10X(Fologea等，Nano Lett.,5(9):1734-7，2005)。使用两孔平台，各电压可以保持足够高，这可以抑制由布朗运动引起的波动，而决定净DNA速度的差分电压可以调节以确保控制速率在实际测序带宽(标称1千赫兹)内。抑制布朗运动引起速度波动的备选方法是使用反馈控制。在一方面，用10千赫兹带宽的第二孔电流反馈驱动10千赫兹带宽的第一孔隙电压，可以补偿布朗运动从而在这些千赫兹闭合回路带宽控制DNA上的可检测特征保持在或邻近第二孔处。这种能力是对在两维空间内抑制布朗运动的反布朗运动电动力(ABEL)阱的一维模拟，在赫兹闭合回路带宽通过附着到分子的珠的光学驱力起作用(Wang和Moerner,ACS Nano,5:5792-9,2011)。
实施例2结合到DNA的RecA丝的检测与定位
本实施例示出两孔装置可以用于对DNA结合蛋白与dsDNA的结合情况制图，和用于具有或未结合特定序列的蛋白质。
如实施例1所示，可以从室A捕获DNA样本。RecA蛋白催化ATP依赖的DNA链交换反应，该反应将断裂DNA和无损DNA的互补区域配对。使用水解不佳的ATP类似物ATPγS，当首先在生理盐水中组装时，结合到daDNA的RecA丝在高盐(如1M氯化钾)条件下是非常稳定的。ATPγS水解缓慢，作为替代，本实施例还使用ADP-AIF4(四氟化铝)，它完全不翻转，且导致RecA更紧密结合到DNA。
通过20-30纳米的纳米孔检测结合到λ-DNA的RecA丝已有例子(Kowalczyk等，Nano Lett.,10(1):324-8，2010；Smeets等，Nano Lett.,9(9):3089-95,2009；和Hall等，Nano Lett.,9(12):4441-5,2009)，但是由于易位率和测量SNR之间的偶联，使用单纳米孔不能分辨长度小于20bp(6或更少的RecA蛋白)的丝。
本实施例的初步实验使用已经暴露于各种浓度的RecA的珠结合和未结合的λ-DNA，从而产生几乎未包被、部分包被或全包被的DNA。各孔电流的实时监控可以用于测量可控传递的进程，并与丝的位置作图相关联。各DNA的重复测量将提高RecA作图的准确性。
当RecA结合到DNA，增加的电荷和容量，在高盐条件的稳定性，使其成为使用推荐的仪器在可控传递期间尝试检测和位置作图的理想候选。
也可尝试不使用结合珠来控制RecA结合DNA从而使得易位停滞。与实施例1中的dsDNA实验一样，在DNA退出纳米孔之前，可采用主动电压控制来立即启动竞争电压控制。因结合到DNA的荷电物质影响DNA在电场中的移动性，通过改变DNA的刚度和净电荷，运动控制调谐实验能够检测结合到dsDNA的RecA对用于控制dsDNA运动的力平衡的影响。
这个例子可以证明在低RecA浓度下，可以在高SNR和足够慢的可控速率下检测最短可观察的丝长度，以致可以检测任何孤立的结合RecA蛋白，如果存在的话。
因此两孔装置为基础研究提供了全新的单分子仪器，由于可以检验检测其他蛋白结合RecA-DNA丝的能力，这将增加丝宽度，从而通过观测电流的降低作检测。例如，结合到RecA-DNA丝的蛋白包括LeXA和噬菌体λ阻遏蛋白，使用RecA感测细胞的状态并开启或关闭下游调控事件
校准实验涉及检测结合到DNA上特定序列(位点)的蛋白，以致于随后可利用蛋白诱导的电流变化来估计DNA通过孔的速度和速率控制性能。结合到dsDNA上特定位点的蛋白实例包括Lac阻遏蛋白(结合到21bp片段)，噬菌体λ阻遏蛋白(其在λ-DNA上具有多个操作位点)和其他蛋白。
实施例3单链DNA内双链区段的检测与定位
本实施例示出具有不同长度双链区段的最多10kb的ssDNA的产生。
在第一步，可以通过长片段PCR(long range PCR)产生10kbp的dsDNA。链的一末端生物素化用于珠附着，且通过化学变性分开诸链。然后无珠的10kbssDNA作为两孔实验中的检测链。具有所需大小的互补单链区段可以通过PCR产生，然后作珠捕获和链分离。
可以使用不同长度的并且在所测量10kb ssDNA内多个位点的ssDNA片区，从一组100nt区段开始。通过单固态孔的离子电流用于区分dsDNA和ssDNA均聚物，以及嘌呤和嘧啶均聚物(Skinner等,Nano Lett.,9(8):2953-60,2009年1月)。因此，使用两孔装置在足够高的电压下，区分DNA中单和双链区段的可能性高。使用杂交辅助方法(尽管所提出的该方法依赖于昂贵的杂交辅助方法)，对ssDNA与dsDNA片段作图能够进行纳米孔测序，可以用于揭露长距离靶DNA序列的位置和身份(靶向测序)。还可以探索利用单链DNA结合(SSB)蛋白，因通过结合到ssDNA并产生高于dsDNA的阻抗，珠将进一步放大ssDNA与dsDNA的离子电流差异。
实施例4长ssDNA的捕获和控制以及RecA的定位
本实施例示出长ssDNA的捕获和控制以及结合到ssDNA的RecA丝的检测和定位。此外，本实施例还示出两孔装置能够检测ssDNA内嘌呤与嘧啶的均聚区段。
如Stefan等,Nano Lett.,10:1414-20,2010中所示，可以在20纳米SiN膜内对通过10纳米孔7kb ssDNA实施随机解缠结(stochastic detangling)。虽然Stefan等2010中的单纳米孔方法利用缠结的ssDNA和孔/膜表面之间的机械接触力解开ssDNA，但预期双孔竞争电压设置能够在足够高的竞争电压下，通过各电压作用力对最接近各孔的DNA主链的作用，迫使ssDNA在诸孔附近或其之间因电泳作用而解缠结。
对于长ssDNA分子的最终测序，通过两孔设置的ssDNA的解缠结和其后精确控制其速率是重要的。在足够高的电压(～400毫伏)下，区分ss-DNA内嘌呤和嘧啶均聚区段是可能的(Skinner等,Nano Lett.,9(8):2953-60,2009年1月)，这对于诊断应用和可能的肿瘤研究是有价值的。
本实施例还探讨RecA或者可能的其他单链DNA结合(SSB)蛋白作为可检测的“减速脊(speed-bump)”的用途，这些减速脊可通过结合到ssDNA和产生更大的阻抗与ssDNA离子电流区分。这些减速脊能直接量化可能的受控ssDNA速度，进而将证明可以实现所需的1毫秒/nt。由于RecA不需要结合到特定三核苷酸序列位点，但优先结合到TGG重复序列，且往往结合已经形成RecA丝的位置，校准实验将需要使用确实结合特定已知序列位点的其他ssDNA结合分子。需要具有当它们通过各孔时可检测的已知结合位点以检测竞争电压值决定的分子速度。非限制性的例子是使用杂交到一个或多个已知位点的双链(或珠系双链)，从该位点电流变化被用于检测各双链通过各孔的，然后估计对于选择的电压值的穿过链速度。随后，RecA丝可以在这样的分子上形成并作检测，保持一个或多个双链特征作为相对于RecA丝能被检测且它们的位置能推测的基准检测点。
通过将荧光标记物掺入dsDNA(Xiao等，US专利号7771944B2，2010年)来检测基因单倍型和DNA作图的方法也可以使用两孔装置，因为珠标记物(如量子点或任何荧光标记物)是庞大的，并将产生电流变化，正如dsDNA上的结合蛋白那样。此外，两孔方法比使用高分辨成像方法(即全内反射荧光显微镜)检测标记物位置和对其作图更简单且便宜得多。还应注意到在受控传递期间由布朗运动引起的任何速率波动用于检测更大的特征物(蛋白、双链、珠附着物)比用于检测更小的特征物害处更少。
应当理解的是，虽然已结合上述实施例描述本发明，但前面的描述和实施例是用来说明而不是限制本发明的范围。本发明范围之内的其他方面，优点和修改，对于本发明相关领域的技术人员来说是显而易见。

Claims (26)

1.一种装置，包括上室，中间室和下室，
其中，所述上室通过第一孔与所述中间室连通，所述中间室通过第二孔与所述下室连通，
其中，所述第一孔和第二孔的直径约1纳米到约100纳米，彼此间隔约10纳米至约1000纳米，且
其中，各室包括用于连接电源的电极。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述第一孔和第二孔基本上是同轴的。
3.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述装置包括选自下组的材料：硅、氮化硅、二氧化硅、石墨烯、碳纳米管、Ti02、Hf02、Al203、金属层、玻璃、生物纳米孔、具有生物孔插入物的膜、以及它们的组合。
4.根据任一前述权利要求所述的装置，其特征在于，所述第一孔和所述第二孔的深度是约0.3纳米至约100纳米。
5.根据任一前述权利要求所述的装置，其特征在于，所述电源配置用于在所述上室和所述中间室之间提供第一电压，以及在所述中间室和所述下室之间提供第二电压，且其中所述第一电压和所述第二电压是独立可调的。
6.根据权利要求5所述的装置，其特征在于，基于检测到的穿过所述第二孔的离子电流调整所述第一电压。
7.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，所述电源包括电压钳系统或膜片钳系统以生成各第一电压和第二电压。
8.根据权利要求6或7所述的装置，其特征在于，相对于所述两个电压，所述中间室被调整为接地。
9.根据任一前述权利要求所述的装置，其特征在于，所述中间室包括在各孔和所述中间室内的电极之间提供导电性的介质。
10.根据任一前述权利要求所述的装置，其特征在于，所述电源进一步配置用于测量通过各孔的离子电流。
11.一种装置，包括上室，中间室，下室和各室内的电极，
其中，所述上室通过第一孔与所述中间室连通，所述中间室通过第二孔与所述下室连通，且其中所述第一孔和第二孔的直径约1纳米到约100纳米，彼此间隔约10纳米至约1000纳米；
所述电极用于连接电压钳系统或膜片钳系统以在各孔施加电压和测量通过各孔的离子电流，其中所述中间室内的电极连接到所述两电压钳系统或膜片钳系统的共同接地线。
12.一种用于控制荷电聚合物通过孔移动的方法，包括：
(a)将包括荷电聚合物的样品加载在权利要求11所述的装置的所述上室、中间室或下室之一内，其中所述装置连接到在所述上室和所述中间室之间提供第一电压以及在所述中间室和所述下室之间提供第二电压的电压钳或膜片钳系统；
(b)设置初始第一电压和初始第二电压以使所述聚合物在诸室之间移动，从而定位通过所述第一和第二孔的所述聚合物；以及
(c)调整所述第一电压和第二电压，以致两电压产生作用力以便在受控条件下牵拉所述荷电聚合物离开所述中间室，其中，所述两电压在量值上不同，从而使所述荷电聚合物在一个方向并以可控的方式移动通过两个孔。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述样品加载到所述上室，所述初始第一电压设置为将所述荷电聚合物从所述上室牵拉至所述中间室，且所述初始第二电压设置为将所述聚合物从所述中间室牵拉至所述下室。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述样品加载到所述中间室，所述初始第一电压设置为将所述荷电聚合物从所述中间室牵拉至所述上室，且所述初始第二电压置为将所述荷电聚合物从所述中间室牵拉至所述下室。
15.根据权利要求12或14所述的方法，其特征在于，所述荷电聚合物为多核苷酸或多肽。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述荷电聚合物为多核苷酸。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸选自下组：双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA和DNA-RNA杂交体。
18.根据权利要求12-17任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(c)，调整的第一电压和第二电压在量值上是两电压之间差异的约10倍至约10000倍。
19.根据权利要求12-18任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括当所述聚合物的单体单元穿过其中一孔时，通过测量穿过该孔的离子电流来识别所述单体单元。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述单体单元是核苷酸。
21.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述单体单元是核苷酸对。
22.根据权利要求18-21任一项所述的方法，其特征在于，所述单体结合到分子。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述分子是DNA结合蛋白或纳米粒子。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述DNA结合蛋白是序列特异性DNA结合蛋白。
25.根据权利要求12-24任一项所述的方法，其特征在于，所述聚合物在其一末端附着到固体支持物。
26.一种用于检测多核苷酸序列的方法，包括：
(a)在权利要求11所述的装置的上室内加载包括多核苷酸的样品，其中所述装置连接到用于在所述上室和所述中间室之间提供第一电压，以及在所述中间室和所述下室之间提供第二电压的电压钳或膜片钳系统，其中所述多核苷酸任选在其一末端附着到固体支持物；
(b)设置初始第一电压和初始第二电压以使所述多核苷酸从所述上室移动到所述中间室，从所述中间室到所述下室，从而定位穿过所述第一和第二孔的聚合物；以及
(c)调整所述第一电压和第二电压，以使两电压产生作用力从而在受控条件下从所述中间室牵拉所述多核苷酸，其中所述两电压在量值上不同，从而使所述多核苷酸在一个方向并以受控方式移动穿过两个孔；和
(d)当所述核苷酸穿过孔之一时，通过测量穿过该孔的离子电流识别穿过该孔的多核苷酸的各核苷酸。
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