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CN103328502A - 治疗fgf21相关的病症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有改进的药学性能的成纤维细胞生长因子21(FGF21)的新多肽和蛋白变体的鉴定。也公开了治疗FGF21相关的病症，包括代谢病况的方法。

Description

治疗FGF21相关的病症的方法
发明领域
本发明涉及具有改进的药物性能的成纤维细胞生长因子21(FGF21)的新多肽。也公开了治疗FGF21相关病症，例如肥胖、1型和2型糖尿病、胰腺炎、血脂异常、非醇性脂肪性肝炎(NASH)、胰岛素抗性、高胰岛素血症、葡萄糖不耐受、高血糖症、代谢综合征和其他代谢病症的方法，和降低垂危患者的死亡率和发病率的方法。
发明背景
成纤维细胞生长因子(FGF)家族的特征是22个遗传不同的同源配体，这些配体被分为7个亚家族。根据发表的文献，目前FGF家族由至少23个成员，FGF-1至FGF-23组成(Reuss等人，Cell Tissue Res.313：139-157(2003)。
FGF-21是从小鼠胚胎中分离的并与FGF-19和FGF-23最接近。此FGF亚家族调节对经典FGF来说不常见的多种生理过程，即能量和胆汁酸体内平衡，葡萄糖和脂代谢，和磷酸盐以及维生素D的体内平衡。此外，与经典FGF不同，此亚家族以内分泌形式起作用。(Moore，D.D.(2007)Science316，1436-8)。已有报导，成纤维细胞生长因子21(FGF21)优先在肝中表达(Nishimura等人，Biochimica et Biophysica Acta，1492：203-206，(2000)；专利公开WO01/36640；和专利公开WO01/18172)，并被描述为用于缺血性血管疾病、伤口愈合和与肺、支气管或肺泡细胞功能丧失相关的疾病和许多其他病症的治疗。
FGF21已被鉴定为有力的代谢调节物。对患有饮食诱导的或遗传性肥胖和糖尿病的啮齿动物和恒河猴全身施用FGF21显出了强抗高血糖作用和降甘油三酯作用，并降低了体重。(Coskun，T，等人(2008)Endocrinology149：6018-6027；Kharitonenkov，A，等人(2005)Journal of ClinicalInvestigation115：1627-1635；Kharitonenkov，A，等人(2007)Endocrinology148：774-781；Xu，J，等人(2009)Diabetes58：250-259)。FGF21是209个氨基酸的多肽，含有28个氨基酸的前导序列。人FGF21与小鼠FGF21具有约79％的氨基酸同一性，与大鼠FGF21具有约80％的氨基酸同一性。
尽管FGF-21激活FGF受体和包括FRS2a和ERK的下游信号传递分子，从未检测到FGFR和FGF-21的直接相互作用。此外，多种非脂肪细胞不响应FGF-21，即使它们表达多种FGFR同种型。所有这些数据提示，辅因子可能通过FGFR介导FGF-21信号传递。最近的研究已将在肝、脂肪细胞和胰腺中高表达的β-klotho鉴定为细胞响应FGF-21的决定因素(Kurosu，H.等人(2007)J Biol Chem282，26687-95)。β-klotho优先结合FGFR1c和FGFR4。β-klotho-FGFR复合物，而不是单独的FGFR，在体外结合FGF-21(Kharitonenkov，A.等人(2008)J Cell Physiol215，1-7)。在FGF-23-klotho-FGFR系统中也鉴定出类似的机制(Urakawa，I.等人(2006)Nature444，770-4)。
在小鼠3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取测定中首次鉴定了FGF-21的生物活性(Kharitonenkov，A.等人(2005)J Clin Invest115，1627-35)。随后，FGF-21显示诱导胰岛素非依赖性葡萄糖摄取和GLUT1表达。也有研究显示，FGF-21在一系列糖尿病啮齿动物模型中减轻高血糖症。此外，发现过表达FGF-21的转基因小鼠对饮食诱导的代谢异常有抗性，包括降低的体重和脂肪量，和胰岛素敏感性增强(Badman，M.K.等人(2007)Cell Metab5，426-37)。对患糖尿病的非人灵长动物施用FGF-21导致空腹血糖、甘油三酯、胰岛素和胰高血糖素水平的降低，并导致脂蛋白谱的显著提高，包括HDL胆固醇的近80％的增加(Kharitonenkov，A.等人(2007)Endocrinology148，774-81)。重要的是，在此NHP研究期间的任意点未观察到低血糖症。此外，最近的研究将FGF-21鉴定为帮助控制对空腹状态的适应的重要内分泌激素。这提供了在PPARα下游的以前缺失的环节，通过此环节肝与身体其他部分沟通调节能量体内平衡的生物学。
FGF-21调节脂肪(脂解)、肝(脂肪酸氧化和生酮作用)和脑(麻木)的组合的观察结果，将其确定为响应空腹的主要内分泌调节物(Kharitonenkov，A.&Shanafelt，A.B.(2008)BioDrugs22，37-44)。然而，直接使用FGF-21作为生物治疗剂的问题是其半寿期非常短。在小鼠中，人FGF21的半寿期是0.5至1小时，在食蟹猴中的半寿期是2至3小时。
为了开发在1型和2型糖尿病和其他代谢病况的治疗中用作治疗剂的FGF21蛋白，增加半寿期和稳定性将是理想的。具有增强的半寿期和稳定性的FGF21蛋白将允许对被施用此蛋白质的患者较不频繁的给药。明显地，需要开发治疗蛋白FGF21的稳定的水性蛋白质制剂。
可作为多用、无菌药物制剂使用FGF21。但是，已确定在这些条件下，防腐剂，即间甲酚对其稳定性具有不利影响。本发明通过本发明的FGF21变体克服了物理不稳定性的显著障碍，所述变体在药物制剂条件下比野生型FGF21更稳定，较不易受蛋白质水解和酶促降解，且较少可能聚集和形成复合物。
因此，本发明的FGF21变体提供了稳定的药理学蛋白质制剂，所述稳定的药理学蛋白质制剂用于治疗FGF21相关疾病，例如肥胖、2型糖尿病、1型糖尿病、胰腺炎、血脂异常、非醇性脂肪性肝炎(NASH)、胰岛素抗性、高胰岛素血症、葡萄糖不耐受、高血糖症、代谢综合征、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、中风、心力衰竭、冠心病、肾病、糖尿病并发症、神经病、胃轻瘫和其他代谢疾病，和降低垂危患者的死亡率和发病率。
发明概述
本发明涉及鉴定成纤维细胞生长因子21(FGF21)的新多肽和蛋白变体，所述新多肽和蛋白变体具有提高的药物性能，例如在药物制剂条件下比野生型FGF21更稳定，较不易受蛋白质水解和酶促降解，且较少可能聚集和形成复合物。也公开了治疗FGF21相关疾病，包括代谢病况的方法。
本发明的FGF21蛋白变体可用作每周一次的血管注射剂，单独使用或与改善1型和2型糖尿病患者的血糖控制、体重和脂谱的口服抗糖尿病剂组合使用。在第一个方面，本发明提供了成纤维细胞生长因子21(FGF21)的多肽和蛋白变体，其包括但不限于表1中列出的一条或多条序列，和其他本文描述的序列。表1的所述FGF21变体包含具有多个位点特异性内部修饰的N-端截短4个氨基酸的成熟FGF21野生型蛋白(即成熟FGF21序列(SEQ ID NO：3)的N-端截短4个残基的形式)。相对全长FGF21蛋白序列(NCBI参考序列号NP_061986.1)编号表1的变体；例如，变体1(SEQ IDNO：5)的第一位的天冬氨酸残基对应SEQ ID NO：1的残基号33(和成熟FGF21序列(SEQ ID NO：3)的残基号5)。
表1.FGF21变体、氨基酸序列和相对野生型FGF21(SEQ ID NO：1)的氨基酸变化列表。
Figure BDA00003530656600051
Figure BDA00003530656600061
Figure BDA00003530656600071
Figure BDA00003530656600091
其他实施方案涉及编码本发明多肽和蛋白变体的多核苷酸，含有所述多核苷酸的载体和携带所述载体的宿主细胞。
本文提供了用于生成所述多肽和蛋白变体的方法，其中此类方法涉及修饰野生型FGF21蛋白，通过例如截短野生型FGF21蛋白，和在野生型FGF21蛋白内的目的位置处位点特异性掺入氨基酸。所述修饰增强了本发明变体相对野生型FGF21蛋白的生物学性能，以及在有些情况下充当附着点，例如，用于标签和蛋白质半寿期延长剂，和为了将所述变体粘附在固体支持物表面。本发明的相关实施方案是生产能够生产所述多肽和蛋白变体的细胞的方法，和生产含有编码所述变体的DNA的载体的方法。
在多个实施方案中，本文公开的多肽和蛋白变体可包含(a)氨基端截短不多于8个氨基酸残基，其中多肽能够降低哺乳动物中的血糖；(b)羧基端截短不多于12个氨基酸残基，其中多肽能够降低哺乳动物中的血糖；或(c)氨基端截短不多于8个氨基酸残基和羧基端截短不多于12个氨基酸残基，其中多肽能够降低哺乳动物中的血糖。
在一些实施方案中，在相对野生型FGF21进行的位点特异性氨基酸修饰的位置处，或在与野生型FGF21共有的氨基酸位置处，本文公开的多肽和蛋白变体可与一种或多种聚合物(例如聚乙二醇(PEG)或聚唾液酸)共价连接。在其他实施方案中，任选地通过接头，例如GS或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：4)，本发明的多肽可与异源氨基酸序列融合。异源氨基酸序列可为IgG恒定结构域或其片段(例如Fc区)、人血清白蛋白(HSA)，或白蛋白结合多肽。本文公开的此类融合多肽也可形成多聚体。
在一些实施方案中，融合异源氨基酸序列(例如HSA，Fc，等等)与本发明的蛋白变体的氨基端融合。在其他实施方案中，融合异源氨基酸序列(例如HSA，Fc，等等)与本发明的蛋白变体的羧基端融合。
另一个实施方案涉及治疗患者的方法，所述患者表现出一种或多种FGF21相关疾病，例如肥胖、2型糖尿病、1型糖尿病、胰腺炎、血脂异常、非醇性脂肪性肝炎(NASH)、胰岛素抗性、高胰岛素血症、葡萄糖不耐受、高血糖症、代谢综合征、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、中风、心力衰竭、冠心病、肾病、糖尿病并发症、神经病、胃轻瘫和其他代谢疾病，所述方法包括对需要此类治疗的所述患者施用治疗有效量的一种或多种本发明的人FGF21多肽和蛋白变体或其药物组合物。
本发明也提供了包含本文公开的多肽和蛋白变体和可药用的制剂的药物组合物。此类药物组合物可用于治疗代谢疾病的方法，且所述方法包括对需要其的人患者施用本发明的药物组合物。可治疗的代谢疾病的非限制性实例包括1型和2型糖尿病和肥胖。
在本发明的以下详细描述中将阐明本发明的这些和其他方面。
附图简述
图1是显示在用聚乙二醇化的野生型FGF21和本发明的FGF21变体治疗ob/ob小鼠12天后，肝中甘油三酯水平的下降的图示。使用Qiagen组织研磨仪(具有一个5-mm的珠)，在比例为1000∶5的异丙醇∶丁基羟基甲苯(BHT或2，6-二叔丁基-4-甲酚)中搅匀肝样品(＜50mg)。搅匀后，在室温轻摇样品45分钟，然后在4℃以6000rpm离心10分钟。收集上清并使用Wako甘油三酯测定试剂盒测定甘油三酯含量。
图2是显示在受治疗12天的ob/ob小鼠中FGF21-WT-R154C-PEG和FGF21-V76-154C-PEG的血浆暴露的图示。在0h时点后第1，4，8和11天皮下给药FGF21-WT-R154C-PEG和FGF21-V76-154C-PEG。
图3A和3B显示了野生型FGF21(图A)和FGF21-V76-154C-PEG(图B)的ob/ob小鼠血浆稳定性。野生型FGF21样品对pERK活性(“背景活性”)的平均血浆贡献是28％(范围是12-49％)，FGF21-V76-154C-PEG样品的平均血浆贡献是58％(范围是46-75％)。
发明详述
开发蛋白质药物，例如包括本发明的FGF21蛋白变体的FGF21的一个重大挑战是解决其物理和化学不稳定性。蛋白质的组成多样性和特征限定了特定行为，例如折叠、构象稳定性和解折叠/变性。当利用水性蛋白质溶液开发药物制剂条件时，必须解决此类特征以稳定蛋白质(Wang，W.，Int.J.of Pharmaceutics，18，(1999))。稳定目的治疗蛋白，例如本发明的FGF21蛋白变体的期望效果是增加对蛋白质水解和酶促降解的抗性，从而提高蛋白质稳定性和减少蛋白质聚集。
特别地，在药物蛋白质开发中，在旨在为无菌、多用制剂的胃肠外药物制剂中，抗微生物防腐剂例如苯酚、间甲酚、羟苯甲酸甲酯、间苯二酚和苄醇是必需的。不幸地是，这些化合物经常不利地影响蛋白质产品的稳定性，特别是引起缔合和聚集(Maa等人，Int.J.of Pharmaceutics140：155-168(1996)；Lam等人，Pharm.Res.14(6)：725-729(1997))。
本发明的FGF21多肽和蛋白变体全长、野生型FGF21多肽的修饰形式，所述全长、野生型FGF21多肽是本领域已知的。例如当必须比较FGF21野生型序列和蛋白变体时，FGF21野生型序列将充当参考序列(SEQ IDNO：1)。FGF21野生型序列具有NCBI参考序列号NP_061986.1，并可见于此类公开的专利中。例如转让给Chiron公司的US6，716，626B1。
Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser
 1               5                  10                  15
Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala His ProIle Pro
            20                  25                  30
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr
        35                  40                  45
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu GluIle Arg
    50                  55                  60
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val
                85                  90                  95
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
        115                 120                 125
Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
    130                 135                 140
His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly
145                 150                 155                 160
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
                165                 170                 175
Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
            180                 185                 190
Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
        195                 200                 205
Ser
209
编码全长FGF21多肽的对应的cDNA序列(NCBI参考序列号NM_019113.2)显示如下(SEQ ID NO：2)
  1 atggactcgg acgagaccgg gttcgagcac tcaggactgt gggtttctgt gctggctggt
 61 cttctgctgg gagcctgcca ggcacacccc atccctgact ccagtcctct cctgcaattc
121 gggggccaag tccggcagcg gtacctctac acagatgatg cccagcagac agaagcccac
181 ctggagatca gggaggatgg gacggtgggg ggcgctgctg accagagccc cgaaagtctc
241 ctgcagctga aagccttgaa gccgggagtt attcaaatct tgggagtcaa gacatccagg
301 ttcctgtgcc agcggccaga tggggccctg tatggatcgc tccactttga ccctgaggcc
361 tgcagcttcc gggagctgct tcttgaggac ggatacaatg tttaccagtc cgaagcccac
421 ggcctcccgc tgcacctgcc agggaacaag tccccacacc gggaccctgc accccgagga
481 ccagctcgct tcctgccact accaggcctg ccccccgcac tcccggagcc acccggaatc
541 ctggcccccc agccccccga tgtgggctcc tcggaccctc tgagcatggt gggaccttcc
601 cagggccgaa gccccagcta cgcttcctga
成熟的FGF21序列缺乏前导序列，并也可包括多肽的其他修饰，例如氨基端(有或没有前导序列)和/或羧基端的蛋白水解加工，从较大的前体切割较小的多肽，N-连接和/或O-连接的糖基化，和本领域技术人员理解的其他翻译后修饰。成熟FGF21序列的代表性实例具有以下序列(SEQ IDNO：3，其代表全长FGF21蛋白质序列的氨基酸位置29-209(NCBI参考序列号NP_061986.1))：
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
                 5                  10                  15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
             20                  25                  30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
         35                  40                  45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
     50                  55                  60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
 65                  70                  75                  80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
                 85                  90                  95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
            100                 105                 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
        115                 120                 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
    130                 135                 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145                 150                 155                 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser
                165                 170                 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
            180
编码成熟FGF21多肽(SEQ ID NO：3)的对应的cDNA序列显示如下(SEQ ID NO：47)：
  1 caccccatcc ctgactccag tcctctcctg caattcgggg gccaagtccg gcagcggtac
 61 ctctacacag atgatgccca gcagacagaa gcccacctgg agatcaggga ggatgggacg
121 gtggggggcg ctgctgacca gagccccgaa agtctcctgc agctgaaagc cttgaagccg
181 ggagttattc aaatcttggg agtcaagaca tccaggttcc tgtgccagcg gccagatggg
240 gccctgtatg gatcgctcca ctttgaccct gaggcctgca gcttccggga gctgcttctt
301 gaggacggat acaatgttta ccagtccgaa gcccacggcc tcccgctgca cctgccaggg
360 aacaagtccc cacaccggga ccctgcaccc cgaggaccag ctcgcttcct gccactacca
421 ggcctgcccc ccgcactccc ggagccaccc ggaatcctgg ccccccagcc ccccgatgtg
481 ggctcctcgg accctctgag catggtggga ccttcccagg gccgaagccc cagctacgct
541 tcctga
蛋白质表达领域的技术人员将认识到，为在大肠杆菌中表达，可在任意FGF21蛋白变体的N-端处引入甲硫氨酸或甲硫氨酸-精氨酸序列，并且在本发明的上下文中设想了这种情况。
将术语“FGF21蛋白变体，”“人FGF21变体，”“FGF21多肽或蛋白变体，”“变体，”“FGF21突变体，”或任意类似术语定义为包含人FGF21，其中天然存在的(即野生型)FGF21氨基酸序列已被修饰，例如，其中野生型蛋白质的至少一个氨基酸已被另一个氨基酸替换，和/或被移除。另外，变体可包括相对野生型FGF21蛋白的N-和/或C-端截短。一般来说，变体具有野生型蛋白的一些经修饰的结构或功能上的性能。例如，变体在浓缩溶液中可具有增强或提高的物理稳定性(例如，疏水性介导的聚集较少)，当与血浆孵育时具有增强或提高的血浆稳定性，或当维持有利的生物活性谱时具有增强或提高的生物活性。
构成本发明的FGF21多肽和蛋白变体和野生型FGF21的差异的可接受的氨基酸替换和修饰包括但不限于，一个或多个氨基酸替换，包括用非天然存在的氨基酸类似物替换，和截短。因此，FGF21蛋白变体包括但不限于，如本文描述的定点FGF21突变体、截短的FGF21多肽、蛋白水解抗性FGF21突变体、减少聚集的FGF21突变体，FGF21组合突变体和FGF21融合蛋白。
变体可具有与药物防腐剂(例如间甲酚、苯酚、苄醇)的增加的相容性，因此使得能够制备在储存期间维持蛋白质的生理化学性能和生物学活性的保藏的药物制剂。因此相对野生型FGF21具有增强的药物稳定性的变体在生理和保藏的药物制剂条件下都在浓缩溶液中具有提高的物理稳定性，同时维持生物效能。通过非限制性实例，本发明的变体比其野生型对应物可对蛋白水解和酶促降解更具抗性；可具有提高的稳定性；和可较少可能聚集。如本文中使用的这些术语不是互相排斥或限制性的，给定的变体完全有可能具有野生型蛋白的一种或多种经修饰的性能。
本发明也涵盖核酸分子，所述核酸分子编码FGF21多肽或蛋白变体，或下述变体，所述变体包含与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少约95％(备选地96％，备选地97％，备选地98％，备选地99％)同一的氨基酸序列，但其中赋予FGF21蛋白变体期望的性能(例如蛋白水解抗性、增加的半寿期或聚集减少性能及其组合)的特定残基未被进一步修饰。换句话说，除了在FGF21突变体序列中已被修饰以赋予蛋白水解抗性、聚集减少或其他性能的残基以外，约5％(备选地4％，备选地3％，备选地2％，备选地1％)的FGF21突变体序列中的所有其他氨基酸残基可被修饰。此类FGF21突变体具有野生型FGF21多肽的至少一种活性。
本发明也涵盖核酸分子，所述核酸分子包含与SEQ ID NO：47的核苷酸序列至少约95％(备选地96％，备选地97％，备选地98％，备选地99％)同一的核苷酸序列，但其中编码这样的氨基酸残基的核苷酸未被进一步修饰，所述氨基酸残基赋予被编码的FGF21蛋白变体的蛋白水解抗性、聚集减少或其他性能。换句话说，除了编码在FGF21突变体序列中已被修饰以赋予蛋白水解抗性、聚集减少或其他性能的残基的核苷酸以外，约5％(备选地4％，备选地3％，备选地2％，备选地1％)的FGF21突变体序列中的所有其他核苷酸可被修饰。此类核酸分子编码FGF21突变体多肽，所述多肽具有野生型FGF21多肽的至少一种活性。
本文提供了用于生成本发明的FGF21多肽和蛋白变体的方法，其中此类方法涉及野生型FGF21蛋白的位点特异性修饰，所述修饰通过例如野生型FGF21蛋白的截短，和在野生型FGF21蛋白内的目的位置处位点特异性掺入氨基酸进行。所述修饰增强了本发明变体相对野生型FGF21蛋白的生物性能，以及在有些情况下，充当附着点，例如用于标签和蛋白质半寿期延长剂，和为了将所述变体粘附在固体支持物表面。本发明的相关实施方案是生产能够生产所述多肽和蛋白变体的细胞的方法，和生产含有编码所述变体的DNA的载体的方法。
在某些实施方案中，此类位点特异性修饰用于将聚乙二醇(PEG)附着至蛋白质、多肽和/或肽。在其他实施方案中，此类位点特异性修饰用于将PEG-胆固醇缀合物(包括微团和脂质体)附着至蛋白质、多肽和/或肽。在其他实施方案中，此类位点特异性修饰用于将糖附着至(糖基化)蛋白质、多肽和/或肽。
在其他实施方案中，此类位点特异性修饰用作用于生产FGF21野生型和/或变体多聚体(例如，二聚体(同源二聚体或异源二聚体)或三聚体)的附着手段。这些多聚FGF21分子可另外具有例如PEG、糖和/或PEG-胆固醇缀合物的基团，所述基团与其他蛋白质例如Fc、HSA等的氨基端或羧基端附着或融合。
在其他实施方案中，此类位点特异性修饰用于生产蛋白质、多肽和/或肽，其中位点特异性地掺入的吡咯赖氨酸或吡咯赖氨酸类似物的位置允许此类蛋白质、多肽和/或肽的受控的取向和附着至固体支持物的表面上，或附着例如PEG、糖和/或PEG-胆固醇缀合物的基团。
在其他实施方案中，此类位点特异性修饰用于位点特异性地交联蛋白质、多肽和/或肽，从而形成异源寡聚体，包括但不限于异源二聚体和异源三聚体。在其他实施方案中，此类位点特异性修饰用于位点特异性地交联蛋白质、多肽和/或肽，从而形成蛋白质-蛋白质缀合物、蛋白质-多肽缀合物、蛋白质-肽缀合物、多肽-多肽缀合物、多肽-肽缀合物或肽-肽缀合物。
定义
在此文件通篇使用多个定义。大多数词具有本领域技术人员理解的这些词的含义。总体来说，如本领域技术人员通常理解地，下文或在此文件别处特别定义的词具有在本发明上下文中提供的含义。
如本文所用，术语“FGF21”指成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族的一个成员。FGF21的氨基酸序列(GenBank登录号NP_061986.1)在SEQ IDNO：1中示出，其对应的多核苷酸序列在SEQ ID NO：2中示出(NCBI参考序列号NM_019113.2)。
如本文所用，术语“FGF21受体”指FGF21的受体(Kharitonenkov，A，等人(2008)Journal of Cellular Physiology215：1-7；Kurosu，H，等人(2007)JBC282：26687-26695；Ogawa，Y，等人(2007)PNAS104：7432-7437)。
术语“FGF21多肽”指在人中表达的天然存在的多肽。为了此公开的目的，术语“FGF21多肽”可互换使用，指任意全长FGF21多肽，例如SEQ IDNO：1，其由209个氨基酸残基组成且其由SEQ ID NO：2的核苷酸序列编码；多肽的任意成熟形式及其变体，所述多肽的任意成熟形式由181个氨基酸残基组成，且其中在全长FGF21多肽的氨基端末端处的28个氨基酸残基(即其构成信号肽)已被移除。
术语“分离的核酸分子”指本发明的核酸分子，所述核酸分子(1)已与至少约50％的蛋白质、脂类、碳水化合物或其他材料分离，所述蛋白质、脂类、碳水化合物或其他材料是当从来源细胞中分离总核酸时与所述核酸分子一起被天然发现的(2)不与“分离的核酸分子”天然连接的多核苷酸的整体或部分连接，(3)与不天然连接的多核苷酸有效连接，或(4)不天然作为较大的多核苷酸序列的一部分存在。优选地，本发明的分离的核酸分子基本不含将干扰其在多肽生产中的用途或其治疗、诊断、预防或研究用途的任意其他污染核酸分子或在其天然环境中可发现的其他污染物。
使用术语“载体”指用于将编码信息转移至宿主细胞的任意分子(例如核酸、质粒或病毒)。
术语“表达载体”指适于转化宿主细胞且含有指导和/或控制插入的异源核酸序列的表达的核酸序列的载体。表达包括但不限于例如转录、翻译和RNA剪接(如果存在内含子)的过程。
本文使用术语“有效连接”指侧翼序列的排列，其中配置和组装所述侧翼序列以发挥其通常的功能。因此，与编码序列有效连接的侧翼序列可能够影响编码序列的复制、转录和/或翻译。例如，当启动子能够指导编码序列的转录时，编码序列与启动子有效连接。侧翼序列不需要与编码序列是连续的，只要其正确发挥功能。因此，例如在启动子序列和编码序列之间可存在间隔的非翻译而转录的序列，并且仍然可以将启动子序列视为与编码序列“有效连接”。
使用术语“宿主细胞”指已被核酸序列转化的，或能够被核酸序列转化的，然后能够表达选定的目的基因的细胞。术语包括亲本细胞的后代，无论后代是否在形态学或基因组成上与原始亲本相同与否，只要存在选定的基因。
本文使用的术语“氨基酸”指天然存在的氨基酸、非天然氨基酸和以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物，均处于其D和L立体异构体，如果它们的结构允许此类立体异构形式的话。本文通过其名称或IUPAC-IUB生化命名法委员会推荐的其公知的三字母符号或单字母符号提及氨基酸。
当关于生物材料例如核酸分子、多肽、宿主细胞等使用时，术语“天然存在的”指在自然界发现的并且未经人操纵的材料。相似地，本文中使用的“非天然存在的”指在自然界找不到的或已在结构上被人修饰或合成的材料。当关于核苷酸使用时，术语“天然存在的”指碱基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。当关于氨基酸使用时，术语“天然存在的”指20种常规氨基酸(即，丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y))，以及硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸(PYL)和吡咯啉-羧基-赖氨酸(PCL)。
吡咯赖氨酸(PYL)是在甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)家族的产甲烷古菌的甲胺甲基转移酶中天然发现的氨基酸。吡咯赖氨酸是在各自mRNA中的符合读框的UAG密码子处共翻译掺入的赖氨酸类似物，并且其被认为是第22个天然氨基酸。
如至少在PCT专利公开WO2010/48582(申请人IRM，LLC)中所描述的，在大肠杆菌中尝试生物合成吡咯赖氨酸(PYL)导致“去甲基化的吡咯赖氨酸”的形成，本文中称为吡咯啉-羧基-赖氨酸，或PCL。本文中使用的“PCL”指PCL-A或PCL-B。
本文中使用的术语“非天然氨基酸”和“非自然氨基酸”可互换地用于表示不能在任意生物中使用来自相同或不同的任意生物的未修饰或修饰的基因生物合成地生成的氨基酸结构。此术语指在天然存在的(野生型)FGF21蛋白序列或本发明的FGF21变体序列中不存在的氨基酸残基。这包括但不限于不是20种天然存在的氨基酸、硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸(PYL)，或吡咯啉-羧基-赖氨酸(PCL)之一的经修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物。可通过替换天然存在的氨基酸，和/或通过在天然存在的(野生型)FGF21蛋白序列或本发明的FGF21变体的序列中插入非天然氨基酸引入此类非天然氨基酸残基。也可掺入非天然氨基酸使得给予FGF21分子期望的功能性，例如连接功能部分(例如PEG)的能力。
另外，认为此类“非天然氨基酸”需要经修饰的tRNA和经修饰的tRNA合成酶(RS)以掺入蛋白质中。通过Schultz等人开发的选择方法或通过随机或定向突变生成这些“选定的”正交tRNA/RS对。作为示例，吡咯啉-羧基-赖氨酸是“天然氨基酸”，因为其是通过从一种生物转移进宿主细胞的基因生物合成地生成的，且因为其是通过使用天然的tRNA和tRNA合成酶基因掺入蛋白质中的，而对氨基苯丙氨酸(见Generation of abacterium with a21amino acid genetic code，Mehl RA，Anderson JC，Santoro SW，Wang L，Martin AB，King DS，Horn DM，Schultz PG.J AmChem Soc.2003Jan29；125(4)：935-9)是“非自然氨基酸”，因为尽管其是生物合成地生成的，但其是通过“选定的”正交tRNA/tRNA合成酶对掺入蛋白质中的。
经修饰的被编码的氨基酸包括但不限于，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、O-磷酸丝氨酸、吖丁啶羧酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸、2，4-二氨基异丁酸、锁链素、2，2′-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基缬氨酸、萘基丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、戊基甘氨酸、哌啶酸和硫代脯氨酸。术语“氨基酸”也包括在某些生物中为代谢物的、但不是掺入蛋白质中的由遗传密码编码的天然存在的氨基酸。此类氨基酸包括但不限于，鸟氨酸、D-鸟氨酸和D-精氨酸。
本文中使用的术语“氨基酸类似物”指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，仅作为示例，与氢、羧基、氨基和R基结合的α-碳。氨基酸类似物包括下述天然和非自然氨基酸，其被可逆或不可逆地化学阻断，或其C-端羧基，其N-端氨基和/或其侧链功能基团被化学修饰。此类类似物包括但不限于，甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、S-(羧甲基)-半胱氨酸、S-(羧甲基)-半胱氨酸亚砜、S-(羧甲基)-半胱氨酸砜、天冬氨酸-(β-甲酯)、N-乙基甘氨酸，丙氨酸甲酰胺、高丝氨酸、正亮氨酸和甲硫氨酸甲基锍。
本文中使用的术语“氨基酸模拟物”指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的化学化合物。
术语“生物活性FGF21变体”指具有野生型FGF21多肽的活性(例如降低血糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇；减轻体重；和提高葡萄糖耐受性、能量消耗或胰岛素敏感性的能力)的本文描述的任意FGF21多肽变体，不管已引入的FGF21多肽变体的修饰的类型或数量。然而，具有相对于野生型FGF21多肽稍微降低的FGF21活性水平的FGF21多肽变体也被视为生物活性FGF21多肽变体。
术语“有效量”和“治疗有效量”每者指用于支持野生型FGF21多肽的一种或多种生物活性(例如降低血糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平的能力；减少肝甘油三酯或脂水平的能力；减轻体重的能力；或提高葡萄糖耐受性、能量消耗或胰岛素敏感性的能力)的可观察到的水平的FGF21蛋白变体的量。例如，对表现出、罹患或倾向罹患FGF21相关疾病(例如1型和2型糖尿病、肥胖或代谢综合征)的患者施用的“治疗有效量”是此类量，所述量诱导、减轻或导致病理症状、疾病进展、与上述疾病相关的生理病况或受制于上述疾病的抗性的改善。为了本发明的目的，“对象”或“患者”优选地是人，但也可为动物，更具体地，伴侣动物(例如狗、猫等)、农场动物(例如奶牛、绵羊、猪、马等)和实验室动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠等)。
本文中使用的术语“可药用的载剂”或“生理上可接受的载剂”指适于完成或增强FGF21蛋白变体的递送的一种或多种制剂材料。
术语“抗原”指分子或分子部分，所述分子或分子部分能够被抗体结合，并且额外地能够在动物中用于生产能够结合该抗原的表位的抗体。抗原可具有一个或多个表位。
术语“天然Fc”指包含从全抗体的消化得到的或通过其他手段生产的非抗原结合片段的序列的分子或序列，所述分子或序列为单体或多聚体形式，并可含有铰链区。天然Fc的原始免疫球蛋白源优选为人源，并且可为任意免疫球蛋白，但优选IgG1和IgG2。天然Fc分子由可通过共价(即二硫键)和非共价缔合而连接为二聚体或多聚体形式的单体多肽组成。取决于类别(例如IgG，IgA和IgE)或亚类(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgA1和IgGA2)，天然Fc分子的单体亚基之间的分子间二硫键的数目的范围为从1至4。天然Fc的一个实例是从IgG的木瓜蛋白酶消化得到的二硫键连接的二聚体(见Ellison等人，1982，Nucleic Acids Res.10：4071-9)。本文使用的术语“天然Fc”对单体、二聚体和多聚体形式通用。术语“Fc变体”指这样的分子或序列，所述分子或序列是从天然Fc修饰而来的，但仍然涵盖补救受体FcRn(新生的Fc受体)的结合位点。国际公开号WO97/34631和WO96/32478描述了示例性的Fc变体，以及与补救受体的相互作用，并在此引入作为参考。因此，术语“Fc变体”可包含从非人天然Fc人源化而来的分子或序列。此外，天然Fc包含可被移除的区域，因为所述区域提供了本发明的FGF21突变体的融合分子不需要的结构特征或生物活性。因此，术语“Fc变体”包含这样的分子或序列，所述分子或序列缺少一个或多个天然Fc位点或残基，或其中一个或多个Fc位点或残基已被修饰，所述被修饰的Fc位点或残基影响或参与：(1)二硫键形成，(2)与选定的宿主细胞的不相容性，(3)在选定的宿主细胞中表达后的N-端异质性，(4)糖基化，(5)与补体的相互作用，(6)与补救受体以外的Fc受体结合，或(7)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在下文中进一步详细描述Fc变体。
术语“Fc结构域”涵盖天然Fc和Fc变体和上文定义的序列。对Fc变体和天然Fc分子而言，术语“Fc结构域”包括从全抗体的消化得到的或通过其他手段生产的处于单体或多聚体形式的分子。在本发明的一些实施方案中，通过例如在Fc结构域和FGF21序列之间的共价键，Fc结构域可以与FGF21或FGF21突变体(包括FGF21或FGF21突变体的截短形式)融合。此类融合蛋白可通过Fc结构域的缔合形成多聚体，并且这些融合蛋白及其多聚体都是本发明的方面。
术语″聚乙二醇″或″PEG″指聚(亚烷基)乙二醇化合物或其衍生物，具有或不具有偶联剂或偶联或活化部分的衍生化。
术语“FGF21相关疾病”和本文中类似使用的术语包括但不限于，肥胖、1型和2型糖尿病、胰腺炎、血脂异常、非醇性脂肪性肝炎(NASH)、胰岛素抗性、高胰岛素血症、葡萄糖不耐受、高血糖症、代谢综合征、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、中风、心力衰竭、冠心病、肾病、糖尿病并发症、神经病、胃轻瘫和其他代谢病症。
″2型糖尿病″是这样的病况，其特征在于过量的葡萄糖生产，尽管可获得胰岛素，和作为不足的葡萄糖清除的结果，循环葡萄糖水平维持极高。
“1型糖尿病”是这样的病况，其特征在于由胰岛素完全缺乏引起的高血糖水平。这在身体的免疫系统攻击胰腺中的产胰岛素β细胞并将所述细胞破坏时发生。然后胰腺产生很少的胰岛素或不产生胰岛素。
“胰腺炎”是胰腺的炎症。
“血脂异常”是脂蛋白代谢的病症，包括脂蛋白过度产生或缺乏。血脂异常可表现为血液中的总胆固醇、低密度脂蛋白(LDL)胆固醇和甘油三酯浓度升高，和高密度脂蛋白(HDL)胆固醇浓度的减少。
“非醇性脂肪性肝炎(NASH)”是肝疾病，不与醇消耗有关，其特征在于肝细胞的脂肪变化，伴随小叶内炎症和纤维化。
″葡萄糖不耐受″或，受损的葡萄糖耐受(IGT)是与增加的心血管病理的风险相关的血糖代谢障碍的前糖尿病状态。前糖尿病状况阻止对象将葡萄糖有效移入细胞并作为有效能量来源利用，导致血液中升高的葡萄糖水平和一定程度的胰岛素抗性。
将″高血糖症″定义为血液中糖(葡萄糖)过量。
″低血糖症″，又称低血糖，当你的血糖水平降得过低以至于不能提供你身体活动的足够能量时发生。
将″高胰岛素血症″定义为血液中的胰岛素高于正常水平。
将″胰岛素抗性″定义为此类状态，其中正常量的胰岛素产生低于正常的生物响应。
″肥胖″就人对象而言，可被定义为体重超过给定群体的理想体重的20％(R.H.Williams，Textbook of Endocrinology，1974，第904-916页)。
″代谢综合征″可被定义为以下迹象中的至少三种的组：腹部肥胖——在大多数男性中，40英寸的腰围或更大；高血糖——空腹后至少110毫克/公升(mg/dl)；高甘油三酯——血流中至少150mg/dL；低HDL——低于40mg/dl；和130/85mmHg或更高的血压。
“高血压”或高血液压力指全身动脉血压力短暂或持续升高至可能诱导心血管损伤或其他不利后果的水平。高血压已被任意地定义为高于140mmHg的收缩血液压力或低于90mmHg的舒张血液压力。
“心血管疾病”是与心脏或血管相关的疾病。
当斑在将血液运送到头、器官和肢体的动脉中积累时，发生“外周动脉疾病”。随时间，斑可使动脉硬化和变窄，这限制了富含氧气的血液流动到器官和身体的其他部分。
“动脉粥样硬化”是血管疾病，其特征在于在大中型动脉的内膜中不规则分布的脂沉积物，导致动脉腔变窄并最终进行至纤维化和钙化。病变通常是局灶性的且缓慢发展和间歇进行。血流的限制导致大多数临床表现，所述临床表现根据病变的分布和严重性而不同。
“中风”是任意急性临床事件，其与持续长于24小时的脑循环损伤有关。中风涉及不可逆的脑损害，症状的类型和严重性取决于循环受损的脑组织的位置和程度。
“心力衰竭”，又称充血性心力衰竭是这样的病况，其中心脏不再能够将足够的血液泵入身体其他部位。
“冠心病”，又称冠状动脉病，是供应血液和氧气至心脏的小血管变窄。
“肾病”或肾病变是任意肾病。糖尿病性肾病是1型或2型糖尿病患者中发病率和死亡率的主要原因。.
“糖尿病并发症”是由高血糖水平引起的其他身体功能的问题，例如肾、神经(神经病)、脚(脚溃疡和循环不良)和眼(例如视网膜病)。糖尿病也增加心脏病以及骨和关节疾病的风险。糖尿病的其他长期并发症包括皮肤问题、消化问题、性功能障碍和牙齿和牙龈的问题。
“神经病”是涉及颅神经或外周或自主神经系统的任意疾病。
“胃轻瘫”是胃蠕动虚弱，这导致肠的延迟排空。
本发明涵盖的垂危患者一般经历不稳定的代谢过盛状态。此不稳定的代谢状态是由于底物代谢的变化，所述变化可导致一些营养物的相对缺乏。一般存在增加的脂肪和肌肉的氧化。
此外，垂危患者优选地为经历全身炎症反应综合征或呼吸窘迫的患者。发病率降低表示降低垂危患者发展另外的疾病、病况或症状的可能性或降低另外的疾病、病况或症状的严重度。例如，降低发病率可对应于菌血症或脓毒症或与多器官衰竭相关的并发症的发生率的减少。
本文中使用的单数形式″a，″″an″和″the″包括复数提及物，除非文中明确另外指示。因此，例如提及“抗体”包括2个或多个此类抗体的混合物。
本文中使用的术语“约”指数值的+/-20％、+/-10％或+/-5％。
术语″多肽″和″蛋白质″可互换使用，指任意长度的氨基酸的聚合形式，其可包括编码的和非编码的氨基酸，化学或生化修饰或衍生化的氨基酸，和具有经修饰的肽骨架的多肽。术语包括融合蛋白，包括但不限于，具有异源氨基酸序列的融合蛋白，具有异源和同源前导序列的融合物，具有或不具有N-端甲硫氨酸残基的融合物；免疫标记的蛋白质；等等。
术语“个体”、“对象”、“宿主”和“患者”可互换使用，指需要诊断、治疗或疗法的任意对象，特别是人。其他对象可包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等等。在一些优选的实施方案中，对象是人。
本文中使用的术语“样品”指来自患者的生物材料。由本发明测定的样品不限于任何特别的类型。作为非限制性实例，样品包括单细胞、多细胞、组织、肿瘤、生物液、生物分子或，任意上述材料的上清或提取物。实例包括用于活检而移取的组织、在切除术中移取的组织、血液、尿、淋巴组织、淋巴液、脑脊液、粘液和粪便样品。使用的样品将根据测定形式、检测方法和待测定的肿瘤、组织、细胞或提取物的本质而不同。制备样品的方法是本领域熟知的并可容易地调整以得到与所利用的方法相容的样品。
本文中使用的术语“生物分子”包括但不限于，多肽、核酸和糖类。
本文中使用的术语“调节”指在细胞内部、外部或表面上的基因、蛋白质或任意分子的质或量的变化。变化可为分子的表达或水平的增加或减少。术语“调节”也包括改变生物功能/活性的质或量，所述生物功能/活性包括但不限于，降低血糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平的能力；减少肝脂或肝甘油三酯水平的能力；减轻体重的能力；和提高葡萄糖耐受性、能量消耗或胰岛素敏感性的能力。
本文中使用的术语“调节物”指调节与FGF21相关病症(例如1型或2型糖尿病或代谢病况如肥胖)相关的一种或多种生理或生化事件的组合物。所述事件包括但不限于，降低血糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平的能力；减少肝脂或肝甘油三酯水平的能力；减轻体重的能力；和提高葡萄糖耐受性、能量消耗或胰岛素敏感性的能力。
“基因产物”是基因表达或生产的生物聚合产物。基因产物可为，例如未剪接的RNA、mRNA、剪接变体mRNA、多肽、经翻译后修饰的多肽、剪接变体多肽等等。此术语也涵盖使用RNA基因产物作为模板(即RNA的cDNA)产生的生物聚合产物。可酶促、重组、化学产生基因产物，或在基因天然存在的细胞内产生基因产物。在一些实施方案中，如果基因产物是蛋白质的，其表现出生物活性。在一些实施方案中，如果基因产物是核酸，其可被翻译为表现出生物活性的蛋白质的基因产物。
本文中使用的“FGF21活性的调节”指FGF21活性的增加或减少，所述活性的增加或减少可以是，例如活性剂与FGF21多核苷酸或多肽的相互作用，FGF21转录和/或翻译的抑制(例如，通过反义或siRNA与FGF21基因或FGF21转录物的相互作用，通过促进FGF21表达的转录因子的调节)等等的结果。例如，生物活性的调节指生物活性的增加或降低。可通过下述手段评估FGF21活性，包括但不限于，测定对象中的葡萄糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇的水平，评估FGF21多肽水平，或通过评估FGF21转录水平。也可通过测量FGF21下游生物标志物的水平，和测量FGF21信号传递的增加完成FGF21活性的比较。也可通过测量：细胞信号传递；激酶活性；脂肪细胞的葡萄糖摄取；血胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平波动；肝脂或肝甘油三酯水平改变；FGF21和FGF21受体之间的相互作用；或FGF21受体的磷酸化评估FGF21活性。在一些实施方案中FGF21受体的磷酸化可为酪氨酸磷酸化。在一些实施方案中FGF21活性的调节可导致FGF21相关表型的调节。
本文中使用的“FGF21下游生物标志物”是基因或基因产物，或基因或基因产物的可测量的记号。在一些实施方案中，是FGF21的下游标志物的基因或活性表现出改变的表达水平，或在血管组织中。在一些实施方案中，在存在FGF21调节物时，下游标志物的活性改变。在一些实施方案中，当FGF21受本发明的FGF21调节物干扰时，下游标志物表现出改变的表达水平。FGF21下游标志物包括但不限于，葡萄糖或2-脱氧-葡萄糖的摄取，pERK和其他经磷酸化的或乙酰化的蛋白质或NAD水平。
本文中使用的术语“上调”指活性或量的增加、活化或刺激。例如，在本发明的上下文中，FGF21调节物可增加FGF21受体的活性。在一个实施方案中，FGFR-1c或FGFR-4之一或二者都响应FGF21调节物而上调。上调也可指FGF21相关的活性，例如降低血糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平的能力；减少肝脂或肝甘油三酯水平的能力；减轻体重的能力；提高葡萄糖耐受性、能量消耗或胰岛素敏感性的能力；或导致FGF21受体的磷酸化的能力；或增加FGF21下游标志物的能力。FGFR21受体可为FGFR-1c或FGFR-4之一或二者。上调可为与对照相比较至少25％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少400％或至少500％。
本文中使用的术语“N-端”指蛋白质的至少前10个氨基酸。
本文中使用的术语“N-端结构域”和“N-端区域”可互换使用，指从蛋白质的第一个氨基酸开始，到蛋白质的N-端半中的任意氨基酸处结束的蛋白质片段。例如，FGF21的N-端结构域是从SEQ ID NO：1的第1位氨基酸至SEQ ID NO：1的约第10-105位氨基酸之间的任意氨基酸。
本文中使用的术语“C-端”指蛋白质的至少后10个氨基酸。
本文中使用的术语“C-端结构域”和“C-端区域”可互换使用，指从蛋白质C-端半的任意氨基酸开始，到蛋白质的最后一个氨基酸处结束的蛋白质片段。例如，FGF21的C-端结构域是从SEQ ID NO：1的第105位氨基酸至约第200位氨基酸的任意氨基酸处开始，到SEQ ID NO：1的第209位氨基酸处结束。
本文中使用的术语“结构域”指有助于生物分子的已知或疑似功能的生物分子的结构部分。结构域可与区域或其部分共同扩展，也可将与特定区域不同的生物分子的部分另外并入该区域的全部或部分。
本文中使用的术语“信号结构域”(又称“信号序列”或“信号肽”)指位于前体蛋白(经常为膜结合或分泌的蛋白质)N-端区域的连续的一段氨基酸序列中的肽结构域，并涉及翻译后蛋白质转运。在许多情况下，在分选过程完成后，通过特化的信号肽酶从全长蛋白质上移除信号结构域。每个信号结构域为前体蛋白指定细胞中的特定目的地。FGF21的信号结构域是SEQ ID NO：1的第1-28位氨基酸。
本文中使用的术语“受体结合结构域”指与膜结合受体蛋白接触，导致细胞响应(例如信号传递事件)的蛋白质的任意部分或区域。
本文中使用的术语“配体结合结构域”指保留相应的FGF21天然序列的至少一种定性结合活性的蛋白质的任意部分或区域。
术语“区域”指生物分子一级结构的物理上连续的部分。在蛋白质的情况下，由该蛋白质的氨基酸序列的连续部分定义区域。在一些实施方案中，“区域”与生物分子的功能相关。
本文中使用的术语“片段”指生物分子一级结构的物理上连续的部分。在蛋白质的情况下，部分由该蛋白质的氨基酸序列的连续部分定义，并指至少3-5个氨基酸、至少8-10个氨基酸、至少11-15个氨基酸、至少17-24个氨基酸、至少25-30个氨基酸和至少30-45个氨基酸。在寡核苷酸的情况下，部分由该寡核苷酸的核酸序列的连续部分定义，并指至少9-15个核苷酸、至少18-30个核苷酸、至少33-45个核苷酸、至少48-72个核苷酸、至少75-90个核苷酸和至少90-130个核苷酸。在一些实施方案中，生物分子的部分具有生物活性。在本发明的上下文中，FGF21多肽片段不包含在SEQ ID NO：1中示出的整个FGF21多肽序列。
“天然序列”多肽是与天然来源的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此类天然序列多肽可从自然界分离，也可通过重组或合成手段产生。因此，天然序列多肽可具有天然存在的人多肽、鼠多肽或来自任意其他哺乳动物物种的多肽的氨基酸序列。
本文中使用的短语“同源核苷酸序列”或“同源氨基酸序列”或其变异物指通过在核苷酸水平或氨基酸水平上的，具有至少指明的百分比的同源性表征的序列，且可与“序列同一性”互换使用。同源核苷酸序列包括编码蛋白质同种型的那些序列。例如，作为RNA的可变剪接的结果，此类同种型可在相同器官的不同组织中表达。备选地，同种型可由不同基因编码。同源核苷酸序列包括编码除人以外的物种(包括但不限于哺乳动物)的蛋白质的核苷酸序列。同源核苷酸序列也包括但不限于，本文示出的核苷酸序列的天然存在的等位基因变异和突变。同源氨基酸序列包括这样的氨基酸序列，其含有保守氨基酸替换且所述多肽具有相同的结合和/或活性。在一些实施方案中，如果其具有至少60％，70％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性，核苷酸或氨基酸序列是同源的，。在一些实施方案中，如果其具有1-10，10-20，20-30，30-40，40-50，或50-60个核苷酸/氨基酸替换、添加或缺失，核苷酸或氨基酸序列是同源的。在一些实施方案中，同源氨基酸序列具有不多于5个或不多于3个的保守氨基酸替换。
百分比同源性或同一性可通过例如Gap程序(UNIX，GeneticsComputer Group，University Research Park，Madison WI的Wisconsin序列分析软件包，版本8)测定，使用默认设置，所述程序使用Smith和Waterman算法(Adv.Appl.Math.，1981，2，482-489)。在一些实施方案中，探针和靶之间的同源性在约75％至约85％之间。在一些实施方案中，核酸具有与SEQ ID NO：2或其部分至少约95％，约97％，约98％，约99％和约100％同源的核苷酸。
同源性也可为多肽水平。在一些实施方案中，多肽与SEQ ID NO：1或其部分约95％，约97％，约98％，约99％和约100％同源。用2条序列比对中的精确匹配数除以“发明序列”或“外源序列”的长度(无论哪个是最短的)来计算本发明的FGF21变体(“发明序列”例如变体1或SEQ IDNO：5)和不同氨基酸序列(“外源序列”例如L174变为P174的SEQ ID NO：1)的同一性程度或同一性。将结果以百分比同一性表示。例如，变体1(SEQID NO：5)与L174变为P174的野生型FGF21(L174变为P174的SEQ IDNO：1)具有94.9％的同一性。这2条序列具有168个相同的氨基酸，总长度为177个氨基酸。因此，百分比同一性为(168/177)x100＝94.9％。
本文中使用的术语“混合”指将在相同的区域中一种或多种化合物、细胞、分子等组合在一起的过程。这可例如在试管、培养皿或允许混合一种或多种化合物、细胞或分子的任意容器中进行。
本文中使用的术语“基本纯化的”指从其天然环境移除的，并且至少60％、至少75％和至少90％不含与其天然相关的其他成分的化合物(例如多核苷酸或多肽或抗体)。
术语“可药用的载剂”指用于施用治疗剂，例如抗体或多肽、基因和其他治疗剂的载剂。此术语指这样的任何药物载剂，其自身不诱导对接受组合物的个体有害的抗体的生产，且其可施用而没有过度毒性。合适的载剂可为大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂聚集物和无活性的病毒颗粒。此类载剂是本领域普通技术人员熟知的。在治疗组合物中的可药用的载剂可包括液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。在此类运载体中也可存在辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等等。
通过半胱氨酸残基提供的天然存在的二硫键一般提高蛋白质的热力学稳定性。如所测量的熔解温度的增加，增加的热力学稳定性的成功实例是酶T4溶菌酶(Matsumura，等人，PNAS86：6562-6566(1989))和芽胞杆菌RNA酶(Johnson等人，J.Mol.Biol.268：198-208(1997))的多二硫键突变体。本发明的一个方面是在存在防腐剂时的FGF21的物理稳定性增强，这是通过变体内的二硫键的存在实现的，所述二硫键约束了野生型FGF21的柔性，并从而限制防腐剂接近蛋白质的疏水核心。
因此本发明的第二个方面提供了具有增强的药物稳定性的人FGF21的变体或其生物活性肽，所述增强的药物稳定性是通过掺入额外的二硫键(例如通过将半胱氨酸残基掺入或替换进入野生型FGF21蛋白或本发明的多肽和蛋白变体中)产生的。本领域技术人员将认识到，除了本文描述的建议的实施方案以外，可利用天然半胱氨酸，半胱氨酸103和半胱氨酸121作为引入可给予提高性能的新的二硫键的座位。
这包括半胱氨酸替换了2个或多个以下残基的FGF-21：谷氨酰胺46、精氨酸47、酪氨酸48、亮氨酸49、酪氨酸50、苏氨酸51、天冬氨酸52、天冬氨酸53、丙氨酸54、谷氨酰胺55、谷氨酰胺56、苏氨酸57、谷氨酸58、丙氨酸59、组氨酸60、亮氨酸61、谷氨酸62、异亮氨酸63、缬氨酸69、甘氨酸70、甘氨酸71、丙氨酸72、丙氨酸73、亮氨酸144、组氨酸145、亮氨酸146、脯氨酸147、甘氨酸148、天冬酰胺149、赖氨酸150、丝氨酸151、脯氨酸152、组氨酸153、精氨酸154、天冬氨酸155、脯氨酸156、丙氨酸157、脯氨酸158、精氨酸159、甘氨酸160、脯氨酸161、丙氨酸162、精氨酸163、苯丙氨酸164，其中氨基酸的编号基于全长209个氨基酸的hFGF21序列SEQ ID NO：1。
此外，除了在Cys103-Cys121处天然存在的二硫键以外，为人FGF21的变体，或其生物活性的肽提供了经改造的二硫键，如下所示：
Gln46Cys-Ala59Cys，Gln46Cys-His60Cys，Gln46Cys-Leu61Cys，
Gln46Cys-Glu62Cys，Gln46Cys-Ile63Cys，Arg47Cys-Ala59Cys，Arg47Cys-His60Cys，
Arg47Cys-Leu61Cys，Arg47Cys-Glu62Cys，Arg47Cys-Ile63Cys，Tyr48Cys-Ala59Cys，
Tyr48Cys-His60Cys，Tyr48Cys-Leu61Cys，Tyr48Cys-Glu62Cys，Tyr48Cys-Ile63Cys，
Leu49Cys-Ala59Cys，Leu49Cys-His60Cys，Leu49Cys-Leu61Cys，Leu49Cys-Glu62Cys，
Leu49Cys-Ile63Cys，Tyr50Cys-Ala59Cys，Tyr50Cys-His60Cys，Tyr50Cys-Lue61Cys，
Tyr50Cys-Glu62Cys，Tyr50Cys-Ile63Cys，Leu144Cys-Gly160Cys，Leu144Cys-Pro161Cys，
Leu144Cys-Ala162Cys，Leu144Cys-Arg163Cys，Leu144Cys-Phe164Cys，His145Cys-
Gly160Cys，His145Cys-Pro161Cys，His145Cys-Ala162Cys，His145Cys-Arg163Cys，His145Cys-
Phe164Cys，Leu146Cys-Gly160Cys，Leu146Cys-Pro161Cys，Leu146Cys-Ala162Cys，
Leu146Cys-Arg163Cys，Leu146Cys-Phe164Cys，Pro147Cys-Gly160Cys，Pro147Cys-
Pro161Cys，Pro147Cys-Ala162Cys，Pro147Cys-Arg163Cys，Pro147Cys-Phe164Cys，
Gly148Cys-Gly160Cys，Gly148Cys-Pro161Cys，Gly148Cys-Ala162Cys，Gly148Cys-
Arg163Cys，Gly148Cys-Phe164Cys，Thr57Cys-Val69Cys，Thr57Cys-Gly70Cys，Thr57Cys-
Gly71Cys，Thr57Cys-Ala72Cys，Thr57Cys-Ala73Cys，Glu58Cys-Val69Cys，Glu58Cys-
Glu70Cys，Glu58Cys-G71Cys，Glu58Cys-Ala72Cys，Glu58Cys-Ala73Cys，Ala59Cys-Val69Cys，
Ala59Cys-Gly70Cys，Ala59Cys-Gly71Cys，Ala59Cys-Ala72Cys，Ala59Cys-Ala73Cys，
His60Cys-Val69Cys，His60Cys-Gly70Cys，His60Cys-Gly71Cys，His60Cys-Ala72Cys，
His60Cys-Ala73Cys，Leu61Cys-Val69Cys，Leu61Cys-Gly70Cys，Leu61Cys-Gly71Cys，
Leu61Cys-Ala72Cys，Leu61Cys-Ala73Cys，Arg47Cys-Gly148Cys，Tyr48Cys-Gly148Cys，
Leu49Cys-Gly148Cys，Tyr50Cys-Gly148Cys，Thr51Cys-Gly148Cys，Asp52Cys-Gly148Cys，
Asp53Cys-Gly148Cys，Ala54Cys-Gly148Cys，Gln55Cys-Gly148Cys，Gln56Cys-Gly148Cys，
Thr57Cys-Gly148Cys，Glu58Cys-Gly148Cys，Arg47Cys-Asn149Cys，Tyr48Cys-Asn149Cys，
Leu49Cys-Asn149Cys，Tyr50Cys-Asn149Cys，Thr51Cys-Asn149Cys，Asp52Cys-Asn149Cys，
Asp53Cys-Asn149Cys，Ala54Cys-Asn149Cys，Gln55Cys-Asn149Cys，Gln56Cys-Asn149Cys，
Thr57Cys-Asn149Cys，Glu58Cys-Asn149Cys，Arg47Cys-Lys150Cys，Tyr48Cys-Lys150Cys，
Leu49Cys-Lys150Cys，Tyr50Cys-Lys150Cys，Thr51Cys-Lys150Cys，Asp52Cys-Lys150Cys，
Asp53Cys-Lys150Cys，Ala54Cys-Lys150Cys，Gln55Cys-Lys150Cys，Gln56Cys-Lys150Cys，
Thr57Cys-Lys150Cys，Glu58Cys-Lys150Cys，Arg47Cys-Ser151Cys，Tyr48Cys-Ser151Cys，
Leu49Cys-Ser151Cys，Tyr50Cys-Ser151Cys，Thr51Cys-Ser151Cys，Asp52Cys-Ser151Cys，
Asp53Cys-Ser151Cys，Ala54Cys-Ser151Cys，Gln55Cys-Ser151Cys，Gln56Cys-Ser151Cys，
Thr57Cys-Ser151Cys，Glu58Cys-Ser151Cys，Arg47Cys-Pro152Cys，Tyr48Cys-Pro152Cys，
Leu49Cys-Pro152Cys，Tyr50Cys-Pro152Cys，Thr51Cys-Pro152Cys，Asp52Cys-Pro152Cys，
Asp53Cys-Pro152Cys，Ala54Cys-Pro152Cys，Gln55Cys-Pro152Cys，Gln56Cys-Pro152Cys，
Thr57Cys-Pro152Cys，Glu58Cys-Pro152Cys，Arg47Cys-His153Cys，Tyr48Cys-His153Cys，
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本发明的第三个方面提供了人FGF21的变体或其生物活性肽，其包含在本发明的第一个实施方案中提示的任意氨基酸位置处的任意带电荷的和/或极性但不带电荷的氨基酸的替换和在本发明的第二个实施方案中提示的2个或多个氨基酸位置处的半胱氨酸替换的组合。
本领域众所周知，开发蛋白质药物的重大挑战是解决蛋白质的物理和化学不稳定性。当蛋白质药物制剂旨在为要求稳定、浓缩和防腐的溶液，同时维持有利的生物活性谱的多用、可注射制剂时，这一点更为明显。野生型FGF21的详细的生物物理表征证明，当暴露于胁迫条件，例如高温或低pH时，浓缩的蛋白质溶液(＞5mg/ml)导致加速缔合和聚集(即差的物理稳定性和生物制药性能)。将FGF21的浓缩的蛋白质溶液暴露于药物防腐剂(例如间甲酚)也对物理稳定性具有负面影响。
因此，本发明的一个实施方案是在生理和保藏的制剂条件下均增强浓缩的溶液的物理稳定性，同时维持化学稳定性和生物效能。认为缔合和聚集可能由疏水相互作用导致，因为在给定的蛋白质浓度下，温度和离子强度上对物理稳定性具有相当大的影响。在很大程度上，靶向非保守的、推测暴露于表面的氨基酸残基。分析了这些残基的局部环境，选择认为对结构不重要的残基进行诱变。起始特定改变的一种方法是通过引入谷氨酸残基进一步降低蛋白质的pI(“谷氨酸扫描”)。假定引入带电荷的取代基将通过电荷-电荷排斥抑制疏水介导的聚集并可能提高防腐剂相容性。另外，本领域技术人员将也认识到，通过引入正电荷，伴随或不伴随负电荷的降低，随着足够程度的诱变pI能够迁移到碱性pH范围，从而允许电荷-电荷排斥。
尽管本发明的实施方案涉及在生理和保藏的药物制剂条件下的物理和化学稳定性，维持变体相比野生型FGF21的生物效能也是重要的考虑因素。因此，通过如在体外3T3-L1脂肪细胞2-DOG摄取细胞测定(实施例3)中所测量的变体影响葡萄糖摄取的能力，和/或如在体内ob/ob小鼠测定(实施例5)中所测量的降低血浆葡萄糖水平以及血浆甘油三酯的能力定义本发明的变体的生物效能。
根据本发明施用的FGF21变体可通过本领域已知的任意手段生成和/或分离。生产变体的最优选方法是通过重组DNA技术并且是本领域技术人员熟知的。此类方法在Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley&Sons，Inc.)中描述，将其引入本文作为参考。
另外，优选的实施方案包括源自本文描述的变体的生物活性肽。此类肽将含有至少一种描述的替换且变体将拥有生物活性。肽可通过本领域技术人员已知的任意和所有手段产生，手段的示例包括但不限于酶促消化、化学合成或重组DNA技术。
本领域已证明，某些成纤维细胞生长因子的肽的片段具有生物活性。见例如Baird等人，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)85：2324-2328(1988)，和J.Cell.Phys.Suppl.5：101-106(1987)。因此，变体片段或肽的选择是基于本领域已知的标准。例如，已知二肽基肽酶IV(DPP-IV)是丝氨酸型蛋白酶，其涉及神经肽、内分泌肽和细胞因子的失活(Damme等人Chem.Immunol.72：42-56，(1999))。FGF21的N-端(HisProIlePro)含有可能是DPP-IV的底物的2个二肽，导致在N-端截短4个氨基酸的FGF21片段。出乎意料地，已证明此野生型FGF21片段保留了生物活性(表2)，因此在N-端截短至多4个氨基酸的本发明的变体是本发明的实施方案。
本发明也涵盖编码上述变体的多核苷酸，所述多核苷酸可为RNA形式，或DNA形式，所述DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA。DNA可为双链或单链。作为遗传密码冗余性或简并性的结果，编码本发明变体的编码序列可变化。
编码本发明的变体的多核苷酸可包括以下序列：仅变体的编码序列，变体的编码序列和另外的编码序列例如功能性多肽，或前导或分泌序列或原蛋白质序列；变体的编码序列和非编码序列，例如内含子或变体编码序列的5’和3’的非编码序列。因此术语“编码变体的多核苷酸”涵盖这样的多核苷酸，所述多核苷酸可不仅包括变体的编码序列，而且包括多核苷酸，所述多核苷酸包括另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及描述的多核苷酸的变体，所述变体编码多肽的片段、类似物和衍生物，所述多肽含有指示的替换。多核苷酸变体可为天然存在的人FGF21序列的等位基因变体，非天然存在的变体，或上述截短的变体。因此，本发明也包括编码上述变体的多核苷酸，以及此类多核苷酸的变体，所述变体编码公开的变体的片段、衍生物或类似物。此类核苷酸变体包括缺失变体、替换变体、截短变体和添加或插入变体，只要存在第一或第二个实施方案的至少一个指示的氨基酸替换。
在序列已与表达控制序列有效连接(即置于确保表达控制序列起作用的位置)后，本发明的多核苷酸将在宿主中表达。这些表达载体一般可在宿主生物中作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分复制。通常表达载体将含有选择标志物，例如四环素、新霉素和二氢叶酸还原酶，以允许检测用期望的DNA序列转化的细胞。FGF21变体可在哺乳动物细胞、昆虫、酵母、细菌或其他细胞中在适当的启动子控制下表达。也可应用无细胞翻译系统使用源自本发明的DNA构建体的RNA生产此类蛋白质。
大肠杆菌是对克隆本发明的多核苷酸特别有用的原核宿主。适于使用的其他微生物宿主包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和沙雷氏菌属(Serratia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链球菌属(Streptococcus)和葡萄球菌属(Staphylococcus)的多个物种，尽管也可应用其他宿主作为选择。在这些原核宿主中也可制备表达载体，所述表达载体通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)。另外，也可存在任意数量的熟知的启动子，例如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统，或来自噬菌体λ或T7的启动子系统。启动子一般控制表达，任选地具有操纵子序列，并具有核糖体结合位点序列等，用于转录和翻译的起始和结束。
蛋白质表达领域技术人员将认识到，为在大肠杆菌中表达，可在成熟序列(SEQ ID NO：3)的N-端引入甲硫氨酸或甲硫氨酸-精氨酸序列，并在本发明的上下文中设想了这种情况。因此，除了另外指出，在大肠杆菌中表达的本发明的变体在N-端具有引入的甲硫氨酸序列。
其他微生物，例如酵母或真菌也可用于表达。巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)是优选的酵母宿主的实例，所述酵母宿主具有合适的载体，所述载体具有表达控制序列，例如启动子，包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖解酶，和复制起点、终止序列等等，根据需要。黑曲霉(Aspergillus niger)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和裂褶菌(Schizophyllum commune)是真菌宿主的实例，尽管也可应用其他真菌作为选择。
也可使用哺乳动物组织细胞培养物表达和生产本发明的多肽。实际上优选真核细胞，因为本领域已开发了许多能够分泌完整变体的合适的宿主细胞系，并包括CHO细胞系、多种COS细胞系、NSO细胞、叙利亚仓鼠卵巢细胞系、HeLa细胞或人胚胎肾细胞系(即HEK293，HEK293EBNA)。
这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，例如复制起点、启动子、增强子和必需的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止序列。优选的表达控制序列是源自SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒、Raus肉瘤病毒等的启动子。优选的聚腺苷酸化位点包括源自SV40和牛生长激素的序列。
可通过熟知的方法将含有目的核苷酸序列(例如，FGF21变体和表达控制序列)的载体转移进入宿主细胞，所述方法根据细胞宿主的类型而变。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主。
可应用多种蛋白质纯化方法并且此类方法是本领域已知的并描述在，例如Deutscher，Methods in Enzymology182：83-9(1990)和Scopes，ProteinPurification：Principles and Practice，Springer-Verlag，NY(1982)中。选择的(一个或多个)纯化步骤将取决于，例如用于FGF21变体的生产方法的性质。
应以符合良好医疗实践的方式配制和给药含有FGF21变体的组合物，考虑到患者的临床情况，FGF21变体组合物的递送位点，施用方法，施用时间表和从业者已知的其他因素。因此通过此类注意事项确定为了本文目的的FGF21变体的“治疗有效量”。
本发明的FGF21变体的药物组合物可通过实现以下一般预期目的的任意手段施用：用于治疗1型和2型糖尿病、肥胖、代谢综合征或垂危患者。本文使用的术语“胃肠外”指包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注的施用模式。施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重，同时治疗的种类(如果有的话)，治疗频率和期望效果的性质。在本发明范围内的组合物包括所有下述组合物，其中FGF21变体以有效实现治疗1型或2型糖尿病、肥胖或代谢综合征的期望医疗效果的量存在。尽管个体需要可在一名患者另一名之间有变化，决定所有组分的有效量的最优范围在普通技能的临床医生的能力之内。
可根据已知方法配制本发明的FGF21变体以制备药学有效的组合物。期望的制剂将是稳定的冻干的产品，所述冻干的产品与具有任选的可药用载剂、防腐剂、赋形剂或稳定剂的合适的稀释剂或高纯度水性溶液重构[Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版(1980)]。本发明的变体可与可药用的缓冲液组合，并且将pH调节为提供可接受的稳定性和可用于施用的pH。
用于胃肠外施用，在一个实施方案中，一般通过在单位剂量的可注射形式(溶液、悬浮液或乳液)中以期望的纯度混合一种或多种FGF21变体和可药用的载剂，即在应用的剂量和浓度上对接受者无毒的且与制剂的其他成分相容的载剂，配制FGF21变体。优选地，可加入一种或多种可药用的抗菌剂。苯酚、间甲酚和苄醇是优选的可药用抗菌剂。
任选地，可加入一种或多种可药用的盐以调节离子强度或渗涨度。可加入一种或多种赋形剂以进一步调节制剂的等渗性。甘油、氯化钠和甘露醇是等渗性调节赋形剂的实例。
如由良好医疗实践和个体患者的临床病况所确定的，本领域技术人员可容易地优化包含FGF21变体的治疗组合物的药学有效剂量和施用方案。本发明的FGF21变体用于成人的典型剂量范围为从约0.01mg/天至约1000mg/天(或约0.05mg/周至约5000mg/周，每周施用1次)。优选地，剂量范围为从约0.1mg/天至约100mg/天(或约0.5mg/周至约500mg/周，每周施用1次)，更优选地为从约1.0mg/天至约10mg/天(或约5mg/周至约50mg/周，每周施用1次)。最优选地，剂量为约1-5mg/天(或约5mg/周至约25mg/周，每周施用1次)。施用的FGF21变体的合适剂量将通过更快和更有效的葡萄糖利用导致血糖水平的降低和能量消耗的增加，并因此对于治疗1型和2型糖尿病、肥胖和代谢综合征是有用的。
此外，因为高血糖症和胰岛素抗性在给予营养支持的垂危患者中常见，一些ICU施用胰岛素以治疗在饲养的垂危患者中的过度的高血糖症。事实上，最近的研究证明，使用外源胰岛素维持血糖处于不高于110mg/公升的水平减少了外科加强监护病房中垂危患者中的发病率和死亡率，不管他们是否具有糖尿病病史(Van den Berghe，等人N Engl J Med.，345(19)：1359，(2001))。因此，本发明的FGF21变体独特地适于帮助代谢不稳定的垂危患者恢复代谢稳定性。FGF21变体的独特性在于，其刺激葡萄糖摄取和增强胰岛素敏感性，但不诱导低血糖症。
在本发明的另一个方面，考虑了FGF21变体，其用作治疗1型和2型糖尿病、肥胖、代谢综合征或垂危患者的药物。
现已详细描述了本发明，通过参考以下实例将更清楚地理解本发明，仅为了说明的目的在本文中包括这些实例，并不旨在限制本发明。
除非另外指示，本发明的实践将应用本领域技术内的化学、生物学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法。在文献中充分解释了此类技术。见，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton，Pennsylvania：Mack Publishing Company，1990)；Methods InEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan，编，Academic Press，Inc.)；和Handbook of Experimental Immunology，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell，编，1986，Blackwell Scientific Publications)；和Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，1989)。
位点特异性FGF21突变体
术语“位点特异性FGF21突变体”或“经替换的FGF21突变体”指这样的FGF21突变体多肽及其变体，其具有与天然存在的FGF21多肽序列(例如SEQ ID NO：1)的氨基酸序列不同的氨基酸序列。可通过在FGF21多肽的特别的位置引入保守或非保守氨基酸替换并使用天然或非天然存在的氨基酸生产位点特异性FGF21突变体。
“保守氨基酸替换”可涉及用非天然残基(即，在野生型FGF21多肽序列的给定位置处找不到的残基)替换天然氨基酸残基(即，在野生型FGF21多肽序列的给定位置处找到的残基)，使得对该位置处的氨基酸残基的极性或电荷影响很小或没有影响。保守氨基酸替换也涵盖非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而非通过在生物系统中合成来掺入。这包括模拟肽(peptidomimetics)，和氨基酸部分的其他反向的或倒置的形式。
天然存在的残基可基于共同的侧链性质分类：
(1)疏水的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水的：Cys，Ser，Thr；
(3)酸性的：Asp，Glu；
(4)碱性的：Asn，Gln，His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香的：Trp，Tyr，Phe；和
(7)硒代半胱氨酸，吡咯赖氨酸(PYL)和吡咯啉-羧基-赖氨酸(PCL)。
保守替换可涉及这些类之一的成员与同一类的另一个成员的交换。非保守替换可涉及这些类之一的成员与另一类的成员的交换。
期望的氨基酸替换(保守或非保守的)可由本领域技术人员在期望这些替换时决定。
截短的FGF21多肽
本发明的一个实施方案涉及成熟FGF21多肽(SEQ ID NO：3)的截短形式。本发明的此实施方案来自鉴定截短的FGF21多肽的研究，所述截短的FGF21多肽能够提供与成熟FGF21多肽的未截短的形式相似的，在某些情况下更高的活性。
本文中使用的术语“截短的FGF21多肽”指这样的FGF21多肽，其中已从FGF21多肽的氨基端(或N-端)末端移除了氨基酸残基，已从FGF21多肽的羧基端(或C-端)末端移除了氨基酸残基，或已从FGF21多肽的氨基端和羧基端末端都移除了氨基酸残基。如本文描述制备本文公开的多种截短。
可使用体外磷酸-ERK测定法测定N-端截短的FGF21多肽和C-端截短的FGF21多肽的活性。在实施例中可找到用于检测截短的FGF21多肽活性的体外测定的具体细节。
也可在体内测定，例如ob/ob小鼠中评估本发明的截短的FGF21多肽的活性。一般地，为了评估截短的FGF21多肽的体内活性，可对测试动物腹膜内施用截短的FGF21多肽。在期望的孵育期后(例如1小时或更长)，可抽取血样，并可测量血糖水平。
a.N-端截短
在本发明的一些实施方案中，N-端截短包含成熟FGF21多肽的N-端末端的1，2，3，4，5，6，7或8个氨基酸残基。具有少于9个氨基酸残基的N-端截短的截短的FGF21多肽保留了成熟FGF21多肽降低个体中血糖的能力。因此，在特别的实施方案中，本发明涵盖成熟FGF21多肽或FGF21蛋白变体的截短的形式，所述成熟FGF21多肽或FGF21蛋白变体具有1，2，3，4，5，6，7或8个氨基酸残基的N-端截短。
b.C-端截短
在本发明的一些实施方案中，C-端截短包含成熟FGF21多肽的C-端末端的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个氨基酸残基。具有少于13个氨基酸残基的C-端截短的截短的FGF21多肽在体外ELK-荧光素酶测定中表现出了野生型FGF21效力的至少50％的效力(Yie J.等人FEBS Letts583：19-24(2009))，提示这些FGF21突变体保留了成熟FGF21多肽降低个体中血糖的能力。因此，在特别的实施方案中，本发明涵盖成熟FGF21多肽或FGF21蛋白变体的截短形式，所述成熟FGF21多肽或FGF21蛋白变体具有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个氨基酸残基的C-端截短。
c.N-端和C-端截短
在本发明的一些实施方案中，截短的FGF21多肽可具有N-端和C-端截短的组合。具有N-端和C-端截短的组合的截短的FGF21多肽共享单独具有N-端或C-端截短的对应的截短的FGF21多肽的活性。换句话说，具有少于9个氨基酸残基的N-端截短和少于13个氨基酸残基的C-端截短的截短的FGF21多肽拥有与具有少于9个氨基酸残基的N-端截短的截短的FGF21多肽或具有少于13个氨基酸残基的C-端截短的截短的FGF21多肽相似或更高的降血糖活性。因此，在特别的实施方案中，本发明涵盖成熟FGF21多肽或FGF21蛋白变体的截短形式，所述成熟FGF21多肽或FGF21蛋白变体具有1，2，3，4，5，6，7或8个氨基酸残基的N-端截短和1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个氨基酸残基的C-端截短。
与所有本发明的FGF21变体一样，截短的FGF21多肽可任选地包含氨基端甲硫氨酸残基，所述甲硫氨酸残基可通过定向突变引入，或是细菌表达过程的结果。
可如在本文描述的实施例中描述的制备本发明的截短的FGF21多肽。本领域熟悉标准分子生物学技术的普通技术人员可应用该知识，与目前的公开内容结合，制备和使用本发明的截短的FGF21多肽。标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养和转化(例如，电穿孔、脂转染)。见例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，见上，出于任何目的将其并入本文作为参考。可根据制造商的说明书，根据本领域通常实现的，或根据本文描述的进行酶促反应和纯化技术。除非提供具体定义，本文描述的有关分析化学、合成有机化学和医药和药物化学使用的命名法和实验室程序和技术是本领域熟知和通常使用的。标准技术可用于化学合成；化学分析；药物制备、配制和递送；和患者的治疗。
本发明的截短的FGF21多肽也可与另一种实体融合，所述实体可给予截短的FGF21多肽额外的性能。在本发明的一个实施方案中，截短的FGF21多肽可与IgG恒定结构域或其片段(例如，Fc区)、人血清白蛋白(HSA)或白蛋白结合多肽融合。此类融合可使用已知的分子生物学方法和/或本文提供的指导完成。此类融合多肽的益处，以及制备此类融合多肽的方法在本文中更详细地讨论。
FGF21融合蛋白
本文中使用的术语“FGF21融合多肽”或“FGF21融合蛋白”指在本文描述的任意FGF21蛋白变体的N-端或C-端处的一个或多个氨基酸残基(例如异源蛋白质或肽)的融合物。
异源肽或多肽包括但不限于，允许检测和/或分离FGF21蛋白变体的表位；跨膜受体蛋白或其部分，例如胞外结构域或跨膜和胞内结构域；配体或其结合跨膜受体蛋白的部分；酶或其催化活性部分；促进寡聚化的多肽或肽，例如亮氨酸拉链结构域；增加稳定性的多肽或肽，例如免疫球蛋白恒定区；功能性或非功能性抗体，或其重或轻链；和具有与本发明的FGF21蛋白变体不同的活性，例如治疗活性的多肽。本发明也涵盖与人血清白蛋白(HSA)融合的FGF21突变体。
可通过在FGF21蛋白变体的N-端或C-端融合异源序列制备FGF21融合蛋白。本文中描述的异源序列可为氨基酸序列或含有非氨基酸的聚合物。异源序列可直接融合至FGF21蛋白变体或通过接头或衔接分子。接头或衔接分子可为一个或多个氨基酸残基(或-mer)，例如1，2，3，4，5，6，7，8或9个残基(或-mer)，优选地从10至50个氨基酸残基(或-mer)，例如10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45或50个残基(或-mer)，和更优选地从15至35个氨基酸残基(或-mer)。接头或衔接分子也可被设计为具有允许融合部分的分离的DNA限制性内切酶或蛋白酶的切割位点。
a.Fc融合物
在本发明的一个实施方案中，FGF21蛋白变体与人IgG的Fc区的一个或多个结构域融合。抗体包含2个功能上独立的部分，结合抗原的可变结构域，其被称为“Fab”，和涉及效应子功能例如补体激活和吞噬细胞攻击的恒定结构域，其被称为“Fc”。Fc具有长血清半寿期，而Fab是短寿的(Capon等人，1989，Nature337：525-31)。当与治疗蛋白连接在一起时，Fc结构域可提供较长的半寿期或并入此类功能例如Fc受体结合、蛋白质A结合、补体固定，和可能甚至胎盘转运(Capon等人，1989)。
体内药代动力学分析提示，由于快速清除和体内降解，人FGF21在小鼠中具有约0.5至1小时的短半寿期。因此，为了延长FGF21的半寿期，将Fc序列与FGF21多肽的N-或C-端末端融合。Fc区与野生型FGF21的融合，特别是Fc与野生型FGF21的N端融合没有如预料地延长半寿期，然而这导致对FGF21的体内蛋白水解降解的研究并鉴定出对此类降解具有抗性的FGF21突变体。
贯穿本文公开内容，Fc-FGF21指这样的融合蛋白，其中Fc序列与FGF21的N-端融合。类似地，贯穿本文公开内容，FGF21-Fc指这样的融合蛋白，其中Fc序列与FGF21的C-端融合。
可通过例如使用蛋白质A亲和柱纯化得到的FGF21融合蛋白。已发现与Fc区融合的肽和蛋白质比未融合的对应物表现出基本更长的体内半寿期。与Fc区的融合也允许融合多肽的二聚化/多聚化。Fc区可为天然存在的Fc区，或可被改变以提高某些品质，例如治疗品质、循环时间或聚集减少。
在国际公开号WO00/024782中详细讨论了通过与抗体的“Fc”结构域融合对蛋白质治疗剂的有效修饰，在此以其整体并入作为参考。此文件讨论了与“运载体”例如聚乙二醇(PEG)、葡聚糖或Fc区的连接。
b.融合蛋白接头
当形成本发明的融合蛋白时，可应用接头，但不是必要的。当存在时，接头的化学结构可能不是重要的，因为其主要充当间隔子。接头可由通过肽键连接在一起的氨基酸组成。在本发明的一些实施方案中，接头由通过肽键连接的1至20个氨基酸组成，其中氨基酸选自20个天然存在的氨基酸。在多个实施方案中，1-20个氨基酸选自氨基酸甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。在一些实施方案中，接头大多由非空间阻碍型氨基酸，例如甘氨酸和丙氨酸组成。在一些实施方案中，接头是聚甘氨酸、聚丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸的组合(例如聚(Gly-Ala))或甘氨酸和丝氨酸的组合(例如聚(Gly-Ser))。尽管已发现15个氨基酸残基的接头对于FGF21融合蛋白特别有效，本发明设想任意长度或成分的接头。
本文描述的接头是示例性的，并且本发明设想长得多的且包括其他残基的接头。本发明也设想非肽接头。例如，可使用例如烷基接头。这些烷基接头可进一步被任意非空间阻碍型基团取代，所述基团包括但不限于低级烷基(例如，C1-C6)、低级酰基、卤素(例如Cl、Br)、CN、NH2或苯基。示例性非肽接头是聚乙二醇接头，其中接头具有100至5000kD，例如100至500kD的分子量。
经化学修饰的FGF21突变体
鉴于本文描述的公开内容，本领域技术人员可制备本文描述的FGF21蛋白变体的经化学修饰的形式，包括本文描述的FGF21的截短的形式。改造此类经化学修饰的FGF21突变体，使得经化学修饰的FGF21突变体与未经修饰的FGF21突变体在与FGF21突变体天然附着的分子的类型或位置上不同。经化学修饰的FGF21突变体可包括通过缺失一个或多个天然附着的化学基团形成的分子。
在一个实施方案中，可通过一种或多种聚合物的共价附着修饰本发明的FGF21蛋白变体。例如，选定的聚合物通常是水溶性的，如此使得其附着的蛋白质不在水相环境(例如生理环境)中沉淀。合适的聚合物的范围包括聚合物的混合物。优选地，为了终产物制品的治疗用途，聚合物将是可药用的。与本发明的FGF21蛋白变体缀合的非水溶性聚合物也形成本发明的方面。
每种示例聚合物可为任意分子量且可为分支的或非分支的。每种聚合物通常具有约2kDa至约100kDa之间的平均分子量(术语“约”指示在水溶性聚合物的制品中，一些分子比陈述的分子量重，而一些比陈述的分子量轻)。每种聚合物的平均分子量优选地在约5kDa和约50kDa之间，更优选地在约12kDa和约40kDa之间，并且最优选地在约20kDa和约35kDa之间。
合适的水溶性聚合物或其混合物包括但不限于，N-连接的或O-连接的碳水化合物、糖、磷酸盐、聚乙二醇(PEG)(包括已用于衍生化蛋白质的PEG形式，包括单(C1-C10)、烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇)、单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖(例如，例如约6kD的低分子量葡聚糖)、纤维素或其他基于碳水化合物的聚合物、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇。本发明也涵盖可用于制备共价附着的FGF21蛋白变体多聚体的双功能交联分子。本发明也涵盖与聚唾液酸共价附着的FGF21突变体。
在本发明的一些实施方案中，共价或化学修饰FGF21突变体以包括一种或多种水溶性聚合物，所述聚合物包括但不限于，聚乙二醇(PEG)、聚氧乙二醇或聚丙二醇。见例如，美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；和4,179,337。在本发明的一些实施方案中，FGF21突变体包含一种或多种聚合物，所述聚合物包括但不限于，单甲氧基聚乙二醇、葡聚糖、纤维素、另一种基于碳水化合物的聚合物、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇或此类聚合物的混合物。
在本发明的一些实施方案中，用PEG亚基共价修饰FGF21突变体。在一些实施方案中，在FGF21突变体的一个或多个特定位置(例如，在N-端)结合一种或多种水溶性聚合物。在一些实施方案中，在FGF21突变体的一个或多个侧链上随机附着一种或多种水溶性聚合物。在一些实施方案中，使用PEG提高FGF21突变体的治疗能力。例如，在美国专利号6,133,426中讨论了若干此类方法，出于任何目的将所述文献在此并入作为参考。
在其中聚合物是PEG的本发明的实施方案中，PEG基团可为任意便利的分子量，且可为线性或分支的。PEG基团的平均分子量的范围将优选地在从约2kD至约100kDa，更优选地从约5kDa至约50kDa，例如10，20，30，40，或50kDa。PEG基团将一般通过PEG部分上的反应性基团(例如醛、氨基、巯基或酯基)经酰化或还原性烷基化至FGF21突变体上的反应性基团(例如醛、氨基、巯基或酯基)附着至FGF21突变体。
分支的PEG衍生物，又称“Y形”PEG衍生物，含有附着于中心核的2条线性甲氧基PEG链。这些“Y形”PEG衍生物的空间庞大结构将有助于经修饰的分子的单点附着。作为实例，三种“Y形”PEG衍生物是Y-NHS-40K(用于胺聚乙二醇化)；Y-MAL-40K(用于硫醇聚乙二醇化)；和Y-ALD-40K(例如，Y-AALD-40K和Y-PALD-40K)(用于N-端聚乙二醇化)。用于胺聚乙二醇化，“Y形”NHS酯将与生物活性分子中的(一个或多个)赖氨酸的氨基或N-端胺反应以生产(一个或多个)稳定的酰胺键。此NHS酯将与靶分子于pH7-8偶联。用于硫醇聚乙二醇化，“Y形”马来酰亚胺将与生物活性分子中的巯基反应生成稳定的3-硫代琥珀酰亚胺醚键。在存在其他功能性基团时，此马来酰亚胺将与靶分子于pH5.0-6.5偶联。用于N-端聚乙二醇化，“Y形”醛将优选地与生物活性分子中的N-端胺反应，以在存在还原剂例如氰基硼氢化钠时产生稳定的胺键。此醛将与靶分子的N-端胺于pH5-8偶联。通过例如JenKem Technology可获得进行分支的聚乙二醇化的试剂。
可使用本领域已知的任意聚乙二醇化反应具体地进行包括本发明的FGF21突变体的多肽的聚乙二醇化。此类反应在例如以下参考中描述：Francis等人，1992，Focus on Growth Factors3：4-10；欧洲专利号0154316和0401384；和美国专利号4,179,337。例如可经由与本文描述的反应性聚乙二醇分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行聚乙二醇化。对于酰化反应，选定的聚合物应具有单个反应性酯基。对于还原性烷基化，选定的聚合物应具有单个反应性醛基。反应性醛基为例如水稳定的聚乙二醇丙醛，或其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(见例如，美国专利号5,252,714)。
在本发明的一些实施方案中，用于将PEG基团附着至多肽的有效策略涉及通过在溶液中形成缀合键组合肽和PEG部分，所述肽和PEG部分每者具有彼此相互反应的特别的功能性。肽可使用常规固相合成容易地制备。在特定位点使用合适的功能性基团“预活化(preactivate)”肽。在与PEG部分反应前，纯化和充分表征前体。肽与PEG的连接通常在水性相中进行，并可通过反相分析型HPLC容易地监控。经聚乙二醇化的肽可通过制备型HPLC容易地纯化并通过分析型HPLC、氨基酸分子和激光解吸质谱表征。
多糖聚合物是可用于蛋白质修饰的另一类水溶性聚合物。因此，与多糖聚合物融合的本发明的FGF21突变体形成本发明的实施方案。葡聚糖是由主要通过α1-6键连接的葡萄糖的个体亚基组成的多糖聚合物。可获得在多个分子量范围内的葡聚糖自身，并可容易地获得从约1kD至约70kD的分子量的葡聚糖。葡聚糖是合适的水溶性聚合物，其自身用作载体或与另一种载体(例如，Fc)组合。见，例如，国际公开号WO96/11953。已报导了与治疗性或诊断性免疫球蛋白缀合的葡聚糖的用途。见，例如，欧洲专利公开号0315456，所述文献在此并入作为参考。本发明也涵盖约1kD至约20kD的葡聚糖的用途。
一般地，可在用于使蛋白质与经活化的聚合物分子反应的任意合适条件下进行化学修饰。制备经化学修饰的多肽的方法将一般包括以下步骤：(a)在其中FGF21蛋白变体变得与一个或多个聚合物分子附着的条件下使多肽与经活化的聚合物分子(例如聚合物分子的反应性酯或醛衍生物)反应，和(b)获得反应产物。最佳反应条件将基于已知的参数和期望的结果决定。例如，聚合物分子与蛋白质的比例越大，则附着的聚合物分子的百分比越大。在本发明的一个实施方案中，经化学修饰的FGF21突变体可具有在氨基端的单个聚合物分子部分(见，例如，美国专利号5,234,784)。
在本发明的另一个实施方案中，FGF21蛋白变体可与生物素化学偶联。然后允许生物素/FGF21蛋白变体与抗生物素蛋白结合，得到四价抗生物素蛋白/生物素/FGF21蛋白变体。FGF21蛋白变体也可与二硝基苯酚(DNP)或三硝基苯酚(TNP)共价偶联，并且得到的缀合物与抗DNP或抗TNP-IgM沉淀形成10价的十聚体缀合物。
一般地，通过施用本发明的经化学修饰的FGF21突变体可减轻或调节的病况包括本文描述的FGF21蛋白变体的病况。然而，本文公开的经化学修饰的FGF21突变体相比未经修饰的FGF21突变体可具有另外的活性、增强或降低的生物活性或其他特征，例如增加或减少的半寿期。
FGF21突变体的治疗组合物及其施用
包含FGF21突变体的治疗组合物在本发明的范围内，并且是鉴于鉴定了表现出增强的性能的若干突变体FGF21序列而特别设想的。此类FGF21突变体药物组合物可包含与选定的适用于施用模式的制药上或生理上可接受的制剂混合的治疗有效量的FGF21蛋白变体。
可用的制剂材料优选地在应用的剂量和浓度上对接受者无毒。
药物组合物可含有用于修饰、维持或保持例如组合物的pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌、稳定性、溶解或释放速率、吸附或穿透的制剂材料。合适的制剂材料包括但不限于，氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)、抗微生物剂、抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)、缓冲剂(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)、填充剂(例如甘露醇或甘氨酸)、螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))、络合剂(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精、或羟丙基-β-环糊精)、填料、单糖、二糖和其他碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、亲水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、成盐平衡离子(例如钠)、防腐剂(例如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、羟苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)、溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(例如甘露醇或山梨醇)、悬浮剂、表面活性剂或湿润剂(例如普郎尼克；PEG；山梨聚糖酯类；聚山梨醇酯类例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；Triton；氨丁三醇；卵磷脂；胆固醇或tyloxapal)、稳定性增强剂(例如蔗糖或山梨醇)、渗涨度增强剂(例如碱金属卤化物；优选氯化钠或钾；或甘露醇山梨醇)、递送运载体、稀释剂、赋形剂和/或药物佐剂(见例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences(第18版，A.R.Gennaro，编，Mack Publishing Company1990)及其后来版本，处于任何目的在此并入作为参考)。
最佳药物组合物将由熟练技术人员根据例如计划施用途径、递送形式和期望的剂量决定(见例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，见上)。此类组合物可影响FGF21蛋白变体的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
药物组合物中的主要运载体或载剂在本质上可为水性或非水性的。例如用于注射的合适的运载体或载剂可为水、生理盐水或人工脑脊液，可能补充了胃肠外施用的组合物中常见的其他材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性运载体。其他示例性药物组合物包含约pH7.0-8.5的Tris缓冲液，或约pH4.0-5.5的醋酸缓冲液，其可还包括山梨醇或合适的替代物。在本发明的一个实施方案中，可通过混合处于冻干的块状或水性溶液的形式的具有期望纯度的选定的组合物和任选的制剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences，见上)，制备用于储存的FGF21蛋白变体组合物。此外，可使用合适的赋形剂例如蔗糖将FGF21蛋白变体产品配制为冻干产物。
可选择FGF21蛋白变体药物组合物用于胃肠外递送。备选地，可选择组合物用于吸入或通过消化道递送，例如口服。制备此类可药用的组合物的是在本领域技术范围内的。
制剂组分以对于施用位点可接受的浓度存在。例如使用缓冲剂将组合物维持在生理pH或略低的pH，通常在从约5至约8的pH范围内。
当考虑胃肠外施用时，用于此发明的治疗组合物可处于无热原、胃肠外可接受的水性溶液形式，其包含在可药用的运载体中的期望的FGF21蛋白变体。用于胃肠外注射的特别合适的运载体是无菌蒸馏水，其中将FGF21蛋白变体配制为适当防腐的无菌、等渗溶液。而另一种制品可涉及期望的分子与提供产品的受控和持续释放的活性剂(例如可注射微球、生物可侵蚀颗粒、聚合化合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠或脂质体)的制剂，然后所述产品可通过积存注射(depot injection)递送。也可使用透明质酸，并且这可具有促进在循环中的持续时间的作用。用于引入期望分子的其他合适手段包括可植入的药物递送装置。
在一个实施方案中，可配制用于吸入的药物组合物。例如，可将FGF21蛋白变体配制为用于吸入的干粉。也可配制具有推进剂的FGF21蛋白变体吸入溶液用于气溶胶递送。在另一个实施方案中，可使溶液雾化。在国际公开号WO94/20069中进一步描述了肺施用，其描述了经化学修饰的蛋白质的肺递送。
也考虑可口服施用某些制剂。在本发明的一个实施方案中，以此方式施用的FGF21蛋白变体可被配制为具有或不具有在固体剂型(例如片剂和胶囊)的混合中惯常使用的那些载剂。例如，当生物利用度最大化和前全身(pre-systemic)降解最小化时，胶囊可被设计为在胃肠道中的点释放制剂的活性部分。也可包括协助FGF21蛋白变体吸收的额外活性剂。也可应用稀释剂、调味品、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘结剂。
另一种药物组合物可涉及与适于制造片剂的无毒赋形剂混合的有效量的FGF21蛋白变体。通过在无菌水或另一种合适的运载体中溶解片剂，可制备单位剂量形式的溶液。合适的赋形剂包括但不限于，惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，例如淀粉、明胶或或阿拉伯树胶；或润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
额外的FGF21蛋白变体药物组合物对本领域技术人员而言是显而易见的，包括在持续或受控递送制剂中包含FGF21蛋白变体的制剂。配制多种其他持续或受控递送工具(例如脂质体运载体、生物可侵蚀微粒或多孔珠和积存注射)的技术也是本领域技术人员公知的(见例如，国际公开号WO93/15722，其描述了用于递送药物组合物的多孔聚合微粒的受控释放，和Wischke&Schwendeman，2008，Int.J Pharm.364：298-327，和Freiberg&Zhu，2004，Int.J Pharm.282：1-18，其讨论了微球/微粒的制备和用途)。
持续释放制品的额外的实例包括处于成形物品(例如薄膜或微胶囊)的形式的半渗透聚合物基质。持续释放基质可包括聚酯、水凝胶、聚交酯(美国专利号3,773,919和欧洲专利号0058481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸盐的共聚物(Sidman等人，1983，Biopolymers22：547-56)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，1981，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277和Langer，1982，Chem.Tech.12：98-105)、乙烯醋酸乙烯酯(Langer等人，见上)或聚D-3-羟基丁酸(欧洲专利号0133988)。持续释放组合物也可包括脂质体，所述脂质体可通过本领域已知的若干方法中的任一种制备。见例如，Epstein等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3688-92；和欧洲专利号0036676，0088046和0143949。
待用于体内施用的FGF21蛋白变体药物组合物通常必须是无菌的。这可由通过无菌滤膜过滤实现。在组合物是冻干的情况下，可在冻干和重构之前或之后实施使用此方法的灭菌。用于胃肠外施用的组合物可以冻干的形式或在溶液中储存。另外，一般将胃肠外组合物放置在具有无菌进入口的容器，例如具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉溶液袋或小瓶中。
一旦已经配制了药物组合物，其可作为溶液、悬浮液、凝胶、乳剂、固体或作为脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。此类制剂可以即用形式或以在施用前需要重构的形式(例如冻干形式)储存。
在特定的实施方案中，本发明涉及生产单次剂量施用单位的试剂盒。每个试剂盒可含有具有干蛋白质的第一容器和具有水性制剂的第二容器。本发明范围内也包括含有单室和多室的预填充注射器(例如，液体注射器和lyosyringes)。
待治疗地应用的FGF21蛋白变体药物组合物的有效量将取决于，例如治疗环境和目的。本领域技术人员将理解，用于治疗的合适的剂量水平将因此部分地取决于递送的分子、FGF21蛋白变体应用的适应征、施用途径和患者的体形(体重、体表或器官大小)和状况(年龄和一般健康)。因此，临床医生可测定剂量和修改施用途径以得到最佳治疗效果。取决于上述因素，典型的剂量范围可从约0.1μg/kg至多达约100mg/kg或更多。在其他实施方案中，剂量范围可从0.1μg/kg多至约100mg/kg；或1μg/kg多至约100mg/kg；或5μg/kg，10μg/kg，15μg/kg，20μg/kg，25μg/kg，30μg/kg，35μg/kg，40μg/kg，45μg/kg，50μg/kg，55μg/kg，60μg/kg，65μg/kg，70μg/kg，75μg/kg，多至约100mg/kg。在另一个实施方案中，剂量可为50μg/kg，100μg/kg，150μg/kg，200μg/kg，250μg/kg，300μg/kg，350μg/kg，400μg/kg，450μg/kg，500μg/kg，550μg/kg，600μg/kg，650μg/kg，700μg/kg，750μg/kg，800μg/kg，850μg/kg，900μg/kg，950μg/kg，100μg/kg，200μg/kg，300μg/kg，400μg/kg，500μg/kg，600μg/kg，700μg/kg，800μg/kg，900μg/kg，1000μg/kg，2000μg/kg，3000μg/kg，4000μg/kg，5000μg/kg，6000μg/kg，7000μg/kg，8000μg/kg，9000μg/kg或10mg/kg。
给药频率将取决于使用的制剂中的FGF21蛋白变体的药代动力学参数。通常，临床医生将施用组合物直到达到实现期望的效果的剂量。因此可以作为单次剂量，或作为随时间的2次或多次剂量(所述剂量可含有或可不含有相同量的期望的分子)，或作为经由植入装置或导管的连续输注施用组合物。由本领域普通技术人员常规地进行合适剂量的进一步完善，这是他们进行的常规任务范围内的。通过使用合适的剂量-响应数据确定合适的剂量。
药物组合物的施用途径依照已知方法，例如，口服；通过静脉内、腹膜内、大脑内(实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内、门内或病灶内途径注射；通过持续释放系统(也可是注入的)；或通过植入装置。当期望时，可通过丸注射或连续输注，或通过植入装置施用。
可选地或额外地，可通过植入上面已经吸收或封装了期望的分子的膜、海绵、或其他合适材料局部施用组合物。当使用植入装置时，可将装置植入任意合适的组织或器官中，并可通过扩散、定时释放的丸剂或连续施用递送期望的分子。
FGF21多肽突变体的治疗用途
FGF21蛋白变体可用于治疗、诊断、减轻或预防许多疾病、病症或病况，包括但不限于代谢疾病。在一个实施方案中，待治疗的代谢疾病是糖尿病，例如，2型糖尿病。在另一个实施方案中，代谢病症是肥胖。其他实施方案包括代谢病况或病症，例如1型糖尿病、胰腺炎、血脂异常、非醇性脂肪性肝炎(NASH)、胰岛素抗性、高胰岛素血症、葡萄糖不耐受、高血糖症、代谢综合征、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、中风、心力衰竭、冠心病、肾病、糖尿病并发症、神经病、胃轻瘫和其他代谢疾病。
在应用中，通过对需要其的患者施用治疗有效剂量的量的本文描述的FGF21蛋白变体可治疗病症或病况，例如1型或2型糖尿病或肥胖。可如本文描述的进行施用，例如通过静脉内注射、腹膜内注射、肌肉内注射或以片剂或液体制剂形式口服。在大多数情况下，如本文描述的，期望的剂量可由临床医生确定，并可代表FGF21突变体多肽的治疗有效剂量。对本领域技术人员而言显而易见的是，FGF21突变体多肽的治疗有效剂量将尤其取决于施用时间表，施用的抗原的单位剂量，核酸分子或多肽是否与其他治疗剂组合施用，接受者的免疫状态和健康。本文中使用的术语“治疗有效剂量”表示在研究者、医生或其他临床医生研究的组织系统、动物或人中引起生物学或药物响应的FGF21突变体多肽的量，所述响应包括受治疗的疾病或病症的症状的减轻。
药物组合物
本发明也提供了包含一种或多种本文描述的FGF21变体或突变体和可药用的载剂的药物组合物。在一些实施方案中，将药物组合物制备为液体溶液或悬浮液形式的可注射剂；也可制备适于在注射前溶解或悬浮在液体载剂中的固体形式。在可药用的载剂的定义内包括脂质体。在药物组合物中也可存在可药用的盐，例如，无机酸盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等等；和有机酸盐，例如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等。在Remington：The Science and Practice of Pharmacy(1995)Alfonso Gennaro，Lippincott，Williams，&Wilkins中可获得可药用的赋形剂的充分讨论。
融合蛋白和FGF21衍生的肽化合物
在另一个实施方案中，可将本发明的FGF21变体制备为融合蛋白或衍生自FGF21变体氨基酸序列的肽化合物。可使用本领域已知的标准技术制备此类融合蛋白和肽化合物。例如，可通过使用标准肽合成技术的化学合成制备肽化合物，并然后通过多种本领域已知的用于将肽引入细胞的工具(例如，脂质体等)将所述肽化合物引入细胞。
可通过进行肽修饰提高本发明的融合蛋白或肽化合物的体内半寿期，例如在FGF21变体中添加N-连接的糖基化位点，或例如，通过赖氨酸-单聚乙二醇化或半胱氨酸-单聚乙二醇化将FGF21变体与聚乙二醇(PEG；聚乙二醇化)缀合。已证明此类技术有利于延长治疗性蛋白质药物的半寿期。预期本发明的FGF21变体的聚乙二醇化将导致类似的药学优势。
另外，可通过引入非天然氨基酸在本发明的多肽的任意部分实现聚乙二醇化。可通过在Deiters等人，J Am Chem Soc125：11782-11783，2003；Wang和Schultz，Science301：964-967，2003；Wang等人，Science292：498-500，2001；Zhang等人，Science303：371-373，2004或在美国专利号7,083,970中描述的技术引入某些非天然氨基酸。简单地说，这些表达系统中的一些涉及定点诱变以在编码本发明多肽的开放阅读框中引入无义密码子，例如琥珀TAG。然后将此类表达载体引入宿主中，所述宿主可利用特异性针对引入的无义密码子并装载了选择的非天然氨基酸的tRNA。对将部分缀合至本发明的多肽的目的有利的特别的非天然氨基酸包括具有乙炔和叠氮侧链的氨基酸。然后，含有这些新氨基酸的FGF21变体可在蛋白质中的这些选择的位点处被聚乙二醇化。
实施例
实施例1：FGF21变体蛋白的制备和聚乙二醇化。
FGF21变体的表达构建体：将FGF21变体克隆进Achmuller等人(2007)(Nature Methods4：1037-1043)描述的经修饰的大肠杆菌表达载体pET30a中，以在FGF21(aa33-209)的N端生成与后接Npro-EDDIE标签的六组氨酸标签的符合读框的融合物。
FGF21变体的表达和纯化：将pET30a-His-Npro-EDDIE-FGF21表达质粒转化进大肠杆菌BL21Star(DE3)感受态细胞(Invitrogen)。在50mL含50μg/mL卡那霉素的Terrific Broth(TB)中于37℃进行新鲜转化的细胞单菌落的过夜培养。将预培养物转移进1L具有卡那霉素的TB培养基并在带挡板的摇瓶中于37℃培养，250rpm振荡。培养6小时后，通过加入终浓度为1mM的IPTG诱导FGF21的表达，并于37℃过夜培养培养物。然后收获细胞并在50mL冰冷的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8，150mM NaCl，1mM EDTA)中重悬，然后使用microfluidizerTM裂解。
通过以30,000x g于4℃离心1小时沉淀内含体(IB)。用50mMTris-HCl，pH8，150mM NaCl洗涤IB，然后在30mL溶解缓冲液(10mMTris-HCl，pH8，100mM NaH2PO4，6M GnHCl)中溶解。通过以30,000xg于25℃离心1小时澄清溶解的IB。将IB溶液装载至用溶解缓冲液平衡的5mL Ni-NTA高效树脂柱(GE Healthcare)。通过将pH降低至4.5洗脱与树脂结合的蛋白质。通过调节pH和加入浓度为20mM的二硫苏糖醇(DTT)调整洗脱液。将经调整的洗脱液缓慢稀释到1L重折叠缓冲液(50mMTris-HCl，pH8，0.5M精氨酸，20mM DTT)中，然后于4℃孵育2天。使用超滤法浓缩稀释的样品并将缓冲液交换为20mM Tris-HCl，pH9。将浓缩的样品装载至10mL column of用20mM Tri-HCl(pH9)平衡的Q琼脂糖快速流动树脂柱(GE Healthcare)。
在用平衡缓冲液洗涤树脂后，用20mM Tris-HCl，pH9，500mM NaCl洗脱与树脂结合的蛋白质。为了从经重折叠的FGF21蛋白质中移除切割下的His-Npro融合片段和任意未切割的融合蛋白，将洗脱液装载至用20mMTris，pH8.0，50mM咪唑平衡的5mL Ni-NTA高效树脂柱，并收集含有FGF21的流出级分。为降低内毒素水平，用以10mM Tris，pH8，50mM咪唑，500mM NaCl，1mM CaCl2中平衡的EndoTrap HD树脂(Hyglos)处理FGF21级分。针对PBS透析低内毒素样品，然后用0.22μm滤器灭菌。在液氮中速冻经纯化的FGF21蛋白并储存在-80℃。通过在280nm处的吸光度测定蛋白质浓度，使用9362M-1cm-1作为FGF21的摩尔消光系数。通过HPLC，SDS-PAGE和液相色谱-质谱测定蛋白质纯化和完整性。
FGF21变体的半胱氨酸聚乙二醇化：hsFGF21(R154C)变体具有通过改造的光胱氨酸二聚化的倾向；因此，在聚乙二醇化之前，用5mM巯基乙胺在冰上温和还原蛋白质溶液(通常为5mg/ml，在Tris缓冲液中)，并立即在20mM Tris，pH7中脱盐。然后立即用1.5当量的40kDa分支的马来酰亚胺-PEG试剂(NOF货号GL2-400MA，来自Sunbright系列)在冰上对新鲜还原的蛋白质(通常为3mg/ml)进行聚乙二醇化3小时。最后通过阴离子交换色谱(MonoQ)纯化经聚乙二醇化的蛋白质，总产率为约25％。
FGF21变体的N-端聚乙二醇化：FGF21变体和40kDa分支的PEG试剂(NOF货号GL2-400AL3，来自Sunbright系列；与FGF21摩尔比为3∶1)的终浓度分别为3-4mg/mL和9-12mg/mL。缓冲液为50mM醋酸钠，pH6.0，25mM氯化钠和40mM氰基硼氢化钠。反应混合物于4℃温和翻滚44小时，在若干时间点监控反应转化。在20小时的近似转化为50％，在44小时为70％。
实施例2：人FGF21二硫化物变体的生成。
克隆文库：通过在载体唯一的BamHI位点中加入β-内酰胺酶表达盒修饰载体pGAPZalphaA(Invitrogen，Carlsbad，CA)。如Hribar，等人(2008)BioTechniques44：477-84描述的生成β-内酰胺酶表达盒。将编码氨基酸33至209的人FGF21cDNA克隆进经修饰的pGAPZ alphaA载体的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子之后，使其符合包括α交配因子分泌信号序列、六组氨酸亲和纯化标签和烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶识别序列的N-端序列的读框。生成了hFGF21构建体文库，每个构建体具有在野生型序列中的Cys103和Cys121和突变为半胱氨酸的2个野生型氨基酸。通过使用编码替换野生型氨基酸的半胱氨酸的引物生成hFGF21氨基酸33-209编码区的PCR片段构建文库。将PCR片段设计为使其彼此或与线性化的经修饰的pGAPZalphaA载体共有16个碱基的相同序列，使它们能使用In-Fusion酶(Takara Bio Co USA)连接。在用于酵母菌株生成前，确认每个构建体的序列。
生成酵母菌株：通过如Yao等人(2009)J Biotechnol.Jan15；139(2)：131-6描述的破坏YPS1基因来修饰巴斯德毕赤酵母菌株SMD1168H(Invitrogen)。经修饰的菌株(SMD1168H delta YPS1)对300μg/mL杀稻瘟素具有抗性。用Avr II消化5-10μg序列经确认的质粒DNA，并将所述DNA与根据Invitrogen的pGAPZα-A手册制备的SMD1168Hdelta YPS1细胞混合。在0.2cm比色皿(Bio-Rad，Hercules，CA)中混合细胞和经线性化的质粒。在冰上孵育具有细胞和经线性化的质粒的比色皿5分钟。使用Gene Pulser-II(Bio-Rad)对比色皿施以脉冲，将电压设为1.5kV，电容设为25μF，脉冲控制器设为400Ohms。
脉冲后立即将1mL冰冷的1M山梨醇加入比色皿，并将其内含物转移至无菌15mL试管。将试管置于30℃孵育2小时，不振荡。将经电穿孔的细胞铺展在含100μg/mL博莱霉素(zeo)的YPDS(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，1M山梨醇和2％琼脂)板上。于30℃孵育板3-10天，直到形成菌落。每个构建体挑选24个菌落并用于在96孔深孔板中接种含100μg/mL博莱霉素的1mL YPD生长培养基。在摇床(SheldonManufacturing，Cornelius，OR)上以900RPM于30℃过夜孵育板。从每个培养物中移取10μL等分试样并在96孔深孔板中在990μL PBS(pH7.4)中稀释。
为比色测定β-内酰胺酶活性，将50μL1∶100稀释的培养物转移进96孔微滴定板中。将头孢硝噻吩(1mg；EMD Chemicals，Gibbstown，NJ)溶解在100μL DMSO中并在1.9mL PBS中稀释以得到1mM的工作溶液。将头孢硝噻吩工作溶液(50uL)加入每个孔，终浓度为500uM。在加入头孢硝噻后，将板在黑暗中于室温孵育5分钟。在Spectramax Plus微滴定板阅读器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上测量492nm处的吸光度以测定β-内酰胺酶活性。对于每个构建体制备具有最高β-内酰胺酶活性的2个菌株的甘油储存物并储存在-80℃。
hFGF21二硫化物变体的小规模表达和纯化：使用每个构建体的具有最高β-内酰胺酶比活性的2个菌株的hFGF21二硫化物变体甘油储存物在96孔深孔板中接种1mL缓冲复合葡萄糖培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾，pH6.0，1.34％YNB，4x10-5％生物素，2％葡萄糖和2％酪蛋白氨基酸)。在30℃以900RPM振荡(Sheldon Manufacturing，Cornelius，OR)培养培养物约48小时，直至细胞生长达到饱和。使用饱和培养物的等分试样(25uL)在24孔深孔板中接种5mL缓冲复合葡萄糖培养基。在摇床(Sheldon Manufacturing，Cornelius，OR)中以350RPM于30℃过夜培养板。约24小时后以2500xg离心板15分钟。吸出沉淀细胞的培养基并添加至具有10kDa截断膜的Amicon ultra-15离心过滤单元(Millipore，Billerica，MA)。对浓缩器中的培养基添加10mL含有10mM咪唑和1X Halt无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Thermo，Rockford，IL)的PBS，pH7.4使总体积达到15mL。
在Sorvall Legend RT plus离心机(Thermo)中以4000RMP离心过滤单元30分钟。丢弃浓缩器流出物并向经浓缩的培养基添加约13mL PBS，pH7.4。以4000RMP离心过滤单元30分钟。将经浓缩的缓冲液交换的样品装载至镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)离心柱(Qiagen，Valencia，CA)。在Sorvall Legend Micro21R离心机(Thermo)中以270x g(1600rpm)离心柱5min，然后用600uL含10mM咪唑的PBS，pH7.4洗两次。用200uL含300mM咪唑的PBS，pH7.4洗脱经6HIS标记的hFGF21变体。
hFGF21二硫化物变体的中等规模表达和纯化：当在双点pERK细胞测定(10和100nM)中检测时，使用表达具有最高活性的FGF21二硫化物变体的菌株的hFGF21二硫化物变体的甘油储存物在50mL无菌试管中接种含有100μg/mL博莱霉素的5mL缓冲复合葡萄糖培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾，pH6.0，1.34％YNB，4x10-5％生物素，2％葡萄糖和2％酪蛋白氨基酸)。在30℃以250RPM振荡培养培养物约48小时，直至细胞生长达到饱和。使用饱和培养物的等分试样(50uL)在250mL超产量烧瓶(Thomson Instrument Co，Oceanside，CA)中接种100mL缓冲复合葡萄糖培养基。在摇床中以300RPM于30℃过夜培养烧瓶。约24小时后以2500xg离心细胞15分钟。吸出沉淀细胞的培养基(80mL)并将所述培养基添加至具有10kDa截断膜的Centricon-70离心过滤单元(Millipore，Billerica，MA)。在Sorvall Legend RT plus离心机(Thermo)中以4000RMP离心过滤单元30分钟。将剩余的经澄清的培养基(约20mL)添加至Centricon-70离心过滤器，并通过添加含10mM咪唑和1X无EDTA的Halt蛋白酶抑制剂混合物的PBS，pH7.4使过滤器中的总体积增加到80mL。以4000rpm再次离心过滤单元30分钟。通过加入含10mM的PBS，pH7.4使过滤器中的浓缩培养基的体积增加到80mL。以4000rpm再次离心过滤单元30分钟。
将经浓缩的缓冲液交换的样品装载至1mL经含10mM咪唑的PBS，pH7.4预平衡的His-Gravitrap柱(GE Lifesciences，Piscataway，NJ)上。用10mL含20mM咪唑的PBS，pH7.4洗柱。用2.5mL含300mM咪唑的PBS，pH7.4洗脱6HIS标记的hFGF21变体。将2.5mL洗脱缓冲液应用于经25mL含10mM咪唑的PBS，pH7.4预平衡的10mL PD-10脱盐柱。用3.5mL含10mM咪唑的PBS，pH7.4从脱盐柱上洗脱6HIS标记的二硫化物变体。
通过添加ProTEV蛋白酶(250单位；Promega，Madison，WI)并在室温孵育样品2小时并在4℃过夜孵育样品，从经脱盐的经亲和纯化的hFGF21二硫化物变体中移除6HIS标签。将标签切除的hFGF21二硫化物变体装载至1mL用含10mM咪唑的PBS，pH7.4预平衡的His-Gravitrap柱。收集含有标签经切除的hFGF21二硫化物变体的流出液。用5mL含10mM咪唑的PBS，pH7.4洗His-Gravitrap柱。收集柱流出液并加至来自标签切割反应的流出液。用具有10kDa截断膜的Amicon ultra-15离心过滤器将混合的流出液样品(约8.5mL)浓缩至约1mL。将浓缩的hFGF21二硫化物变体冷冻在-80℃，直到在pERK细胞测定中被测定。
实施例3：测量2-脱氧葡萄糖(2-DOG)的摄取。
最近有研究显示在存在和缺乏胰岛素时，FGF21刺激小鼠3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖摄取，并以剂量依赖方式在ob/ob和db/db小鼠和8周龄ZDF大鼠中降低餐后和空腹血糖、甘油三酯和胰高血糖素水平，因此提供了使用FGF21作为治疗糖尿病和肥胖的疗法的基础(见，例如，专利公开WO03/011213，和Kharitonenkov等人，(2005)Jour.of Clinical Invest.115：1627-1635)。也观察到FGF21在3T3-L1脂肪细胞中刺激FGFR-1和FGFR-2的酪氨酸磷酸化。
3T3-L1成纤维细胞购自ATCC(货号CL173)。在150cm培养皿中培养细胞至汇合，并在补充了10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的高葡萄糖DMEM(Invitrogen#11995065)中再维持4天。然后在补充了4μg/ml胰岛素(Sigma货号I-5500)，115μg/ml IBMX(Sigma货号I5879)和0.0975μg/ml地塞米松(Sigma货号D1756)的上述培养基中分化3天，之后用完全DMEM替换分化培养基。在培养基替换后第二天将1板分化的3T3-L1脂肪细胞接种在4个96孔板上。
然后用FGF21-WT和FGF21变体(变体列表见表2；30pM至100nM是一般使用的浓度范围)在完全培养基中过夜处理脂肪细胞。用FGF21样品处理的脂肪细胞在每孔50μl KRH缓冲液(0.75％NaCl；0.038％KCl；0.0196％CaCl2；0.032％MgSO4；0.025M Hepes，pH7.5；0.5％BSA；2mM丙酮酸钠)中血清饥饿2小时。空白孔添加1μl(终浓度5μg/ml)细胞松弛素B15分钟。以1∶20在5.1mM冷的2-DOG中稀释[3H]-2-DOG(20.6mci/mmol，1mci/ml)，对细胞添加1μl/孔经稀释的2-DOG并孵育5分钟。用100μl/孔KRH缓冲液洗三次细胞。对细胞添加40μl/孔的1％SDS并振荡细胞至少10分钟。加入200μl/孔的闪烁液，并过夜振荡板并在β-微板阅读器中读板。将从用细胞松弛素B处理的整列/行获得的值平均化并将其从所有其他值中减去。通过GraphPad prism软件分析数据，其结果总结在表2中。
表2.在3T3-L1脂肪细胞2-脱氧葡萄糖(2-DOG)摄取测定中FGF21WT和FGF21变体的EC50值和相对效能(倍数-WT)的总结。
Figure BDA00003530656600621
Figure BDA00003530656600631
(1)“倍数-WT”是在相同的实验中“头对头(head to head)”进行的FGF21变体与FGF21-WT的EC50值的比例。
实施例4：在细胞Western(ICW)测定中的pERK。在高葡萄糖DMEM，10％FBS，1％PS和600ng/ml G418中培养稳定转染了人β-klotho的HEK293细胞，以30,000细胞/孔在聚-D-赖氨酸包被的96孔板(BDbioscience，356640)中接种过夜。在高葡萄糖DMEM，0.5％BSA和10mMHEPES中血清饥饿细胞4小时。在饥饿培养基中将WT FGF21和FGF21变体(变体列表见表3)稀释为多个浓度(100pM至300nM是一般使用的浓度范围)。用FGF21刺激细胞10分钟。在FGF21刺激后，从孔中吸出培养基，并用100μl冷PBS洗一次细胞，然后用100μl4％甲醛在室温固定15分钟，接着与100μl冰冷的甲醇再孵育10分钟。
固定后，用在PBS中的0.3％Triton X-100洗4次细胞，每次5分钟。于室温对经通透化的细胞添加150μl Odyssey封闭缓冲液1.5小时。在Odyssey封闭缓冲液中将磷酸-ERK(pERK)抗体稀释到0.17μg/ml的浓度(1∶200稀释，或指示的稀释度)，并将总ERK(tERK)抗体稀释到2.2μg/ml的浓度(1∶200稀释，或指示的稀释度)。对每孔加入50μl，留出1列仅用二抗处理用于标准化背景。用湿纸巾和盖子覆盖板以避免蒸发，然后在4℃孵育过夜。
然后，吸去一抗，并用在PBS中的0.3％Tween20洗4次细胞，每次5分钟。在洗涤过程中，在Odyssey封闭缓冲液中制备含有1∶1000稀释(或指示的稀释度)的山羊抗小鼠Alexa680和1∶1000稀释(或指示的稀释度)的IRDye800山羊抗兔抗体的二抗反应混合物。一旦完成洗涤，对每孔加入40μl反应混合物。用黑色盖子覆盖板以使二抗避光，在摇床上室温孵育板1小时。最后用在PBS中的0.3％Tween20再洗4次细胞，每次5分钟，然后在LI-COR Bioscience Odyssey红外成象系统(Li-Cor Biosciences，Lincoln，NE)上在700nm(红色)和800nm(绿色)通道中扫描。Alexa680对tERK染色远红外荧光(发射波长668nm)，而IRDye800对pERK染色绿色荧光(发射波长800nm)。为了消除荧光背景，将从仅用二抗处理的整列/行得到的值平均化并将其从板上得到的所有其他值中减去。为了归一化在每个样品中存在的pERK量，将每孔中的pERK值除以tERK的值。通过GraphPad prism软件分析数据，其结果总结在表3中。
表3.使用用人β-klotho稳定转染的HEK293细胞的pERK细胞测定中FGF21WT和FGF21变体的EC50值和相对效能(倍数-WT)的总结。
Figure BDA00003530656600651
Figure BDA00003530656600661
(1)“倍数-WT”是在相同的实验中“头对头”进行的FGF21变体相对FGF21-WT的EC50值的比例。
实施例5：FGF21和FGF21变体的体内测试——药效动力学和血浆暴露。ob/ob小鼠是用于2型糖尿病的小鼠模型。该小鼠缺乏有功能的瘦素，并且特征在于高血糖症、胰岛素抗性、摄食过量、肝性脂肪变性和肥胖。使用雄性ob/ob小鼠(10-13周龄)测量下述对血糖的影响：(1)野生型FGF21，(2)FGF21变体，(3)聚乙二醇化的野生型FGF21，和(4)聚乙二醇化的FGF21变体。
皮下施用1mg/kg和4ml/kg的野生型FGF21、变体FGF21或PBS载剂，每天一次施用5天。在研究的第一天测量尾血糖和体重，根据在组中匹配的平均血糖和体重将小鼠分为不同组(每组n＝8)。使用血糖仪(OneTouch)在第1，3和5天给药前和给药后2和4小时测量血糖。这些研究的结果总结在表4中。
表4.在ob/ob小鼠中的5天筛选研究期间FGF21变体的总血糖AUC的百分比降低。
Figure BDA00003530656600671
(1)“相比WT的倍数变化”是在相同实验中“头对头”进行的FGF21变体的“葡萄糖AUC减少”与FGF21-WT的“葡萄糖AUC减少”的比例。
对小鼠皮下施用1mg/kg的聚乙二醇化FGF21野生型，0.3，1或3mg/kg的聚乙二醇化FGF21变体，或4ml/kg的PBS载体，1周2次施用2周。在研究的第一天测量尾血糖和体重，根据在组中匹配的平均血糖和体重将小鼠分为不同组(每组n＝8)。使用血糖仪在第1，4，8和11天给药前和给药后4小时测量血糖。在每次剂量后24小时，第2，5，9和12天进行额外的血糖测量。在第1天给药前和第12天，最后一次剂量后24小时测量血浆胰岛素。在第1天给药前和第5天，第二次剂量后24小时测量血浆甘油三酯。这些研究的结果总结在表5中。
表5.在ob/ob小鼠的12天研究期间聚乙二醇化的FGF21野生型(WT)和变体的血浆葡萄糖、胰岛素、甘油三酯(TG)、体重(BW)增加、肝TG/脂相对载体的％变化。
Figure BDA00003530656600681
如在表5中所示，V76-154C-PEG变体表现出优秀的体内代谢谱。V76-154C-PEG也表现出较之FGF21-WT-R154C-PEG(-7％的肝甘油三酯变化，与载体对照组无显著差异；图1)的优秀的降低肝甘油三酯的性能(-25％的肝甘油三酯变化，与载体对照组有显著差异；图1)。当在相同的研究中都以1mg/kg给药时(WT-R154C-PEG，实验3)，2种化合物的血浆暴露(图2)是相同的，且其他效力端点(总葡萄糖AUC、血浆胰岛素、体重增加和血浆甘油三酯)无显著差异。
实施例6：使用野生型FGF21和聚乙二醇化的FGF21变体的血浆稳定性测定。
为了测定野生型FGF21(FGF21-WT)较之聚乙二醇化的FGF21变体的血浆稳定性，进行了血浆稳定性测定。将10μl FGF21-WT(4.84mg/ml)和35.5μl FGF21-V76-154C-PEG(2.12mg/ml)添加至90μl和264.5μl ob/ob小鼠血浆(90％和88％的血浆)。每种样品制成5份等分试样并孵育1小时、4小时、24小时、48小时和72小时。将血浆处理的样品储存于4℃直至收集了所有时间点的样品。将9μl血浆处理的FGF21-WT和27μl血浆处理的FGF21-V76-154C-PEG添加至750μl培养基(具有1.2％血浆的300nMFGF21-WT和具有3.6％血浆的450nM FGF21-V76-154C-PEG)并在培养基中连续稀释8次。用蛋白质处理稳定转染了人β-klotho的HEK293细胞10分钟，接着进行pERK ICW的标准方案。也包括未处理的FGF21-WT，FGF21-V76-154C-PEG和1.2％和3.6％小鼠血浆作为对照。这些实验的结果图示在图3A和3B中。
当与小鼠血浆在37℃孵育时，FGF21-WT在短时间范围(1-4小时)内失去活性，相比之下，当与小鼠血浆在37℃孵育时V76-154C-PEG保留了其全部活性至少72小时。
尽管已参考其特定实施方案描述了本发明，本领域技术人员应当理解可进行多种改变和替换等同物，而不背离本发明的真实精神和范围。另外，可进行许多修改以使特别的情况、材料、物质组合物、方法、一个或多个方法步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有此类修改都包含在本发明的范围内。
Figure IDA00003530657100011
Figure IDA00003530657100031
Figure IDA00003530657100041
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Claims (25)

1.多肽变体，所述多肽变体具有序列，所述序列选自表1中的序列的组。
2.权利要求1的变体，其中变体还包含以下修饰中的一种或多种：(a)不多于8个氨基酸残基的氨基端截短；和(b)不多于12个氨基酸残基的羧基端截短。
3.权利要求1的变体，其中变体与聚乙二醇(PEG)或聚唾液酸共价连接。
4.权利要求3的变体，其中变体还包含与变体的半胱氨酸共价连接的分支的40kDa PEG基团。
5.权利要求1的变体，其中变体与异源氨基酸序列融合，所述异源氨基酸序列由下述中的一种组成：IgG恒定结构域或其片段；人血清白蛋白(HSA)；和白蛋白结合多肽。
6.权利要求5的变体，其中异源氨基酸序列与变体的氨基端融合。
7.权利要求5的变体，其中异源氨基酸序列与变体的羧基端融合。
8.多聚体，所述多聚体由权利要求1的变体中的至少一种组成。
9.权利要求8的多聚体，其中多聚体是同源二聚体。
10.多肽或蛋白质变体，所述多肽或蛋白质变体包含变体76(V76)。
11.权利要求10的变体，其中变体在第154位的半胱氨酸残基处具有聚乙二醇化
12.权利要求11的变体，其中变体还包含在第154位处的分支的40kDa PEG基团。
13.药物组合物，所述药物组合物包含变体，所述变体选自由表1中的序列组成的组。
14.权利要求13的药物组合物，所述药物组合物还包含在第154位的半胱氨酸残基处具有聚乙二醇化的变体76(V76)。
15.治疗患者的方法，所述方法包括对所述患者施用治疗有效量的成纤维细胞生长因子21(FGF21)多肽或蛋白质变体，其中所述患者表现出一种或多种FGF21相关的病症。
16.权利要求15的方法，其中FGF21相关的病症由以下一种或多种组成：肥胖、1型和2型糖尿病、胰腺炎、血脂异常、非醇性脂肪性肝炎(NASH)、胰岛素抗性、高胰岛素血症、葡萄糖不耐受、高血糖症、代谢综合征和其他代谢病症。
17.权利要求16的方法，其中FGF21相关的病症由1型糖尿病组成。
18.权利要求16的方法，其中FGF21相关的病症由2型糖尿病组成。
19.治疗患者的方法，所述方法包括对所述患者施用包含治疗有效量的成纤维细胞生长因子21(FGF21)多肽或蛋白质变体的药物组合物，其中所述患者表现出一种或多种FGF21相关的病症。
20.治疗患者的方法，所述方法包括对所述患者施用治疗有效量的成纤维细胞生长因子21(FGF21)多肽或蛋白质变体，其中所述患者表现出一种或多种FGF21相关的病症，其中所述变体还包含在第154位的半胱氨酸残基处具有聚乙二醇化的变体76(V76)。
21.权利要求20的方法，其中FGF21相关的病症由以下一种或多种组成：肥胖、1型和2型糖尿病、胰腺炎、血脂异常、非醇性脂肪性肝炎(NASH)、胰岛素抗性、高胰岛素血症、葡萄糖不耐受、高血糖症、代谢综合征和其他代谢病症。
22.权利要求21的方法，其中FGF21相关的病症由1型糖尿病组成。
23.权利要求21的方法，其中FGF21相关的病症由2型糖尿病组成。
24.在有需要的患者中减轻高血糖症、高胰岛素血症、肝脂和体重增加中的一种或多种的方法，所述方法包括对所述患者施用治疗有效量的成纤维细胞生长因子21(FGF21)多肽或蛋白质变体。
25.权利要求24的方法，其中变体还包含在第154位的半胱氨酸残基处具有聚乙二醇化的变体76(V76)。
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