CN103013846B - 一种白念珠菌CaESA1基因的用途及缺失CaESA1基因的白念珠菌减毒株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种白念珠菌CaESA1基因的用途及缺失CaESA1基因的白念珠菌减毒株。本发明公开了白念珠菌CaESA1基因的用途，为用于制备esa1/esa1缺失株，或者用于制备、筛选白念珠菌治疗药物。本发明还公开了一种白念珠菌减毒株，所述减毒株中CaESA1基因不表达。本发明研究了白念珠菌基因CaESA1对菌丝生长和菌株毒性的影响，并成功构建了一种白念珠菌减毒株，本发明的白念珠菌菌丝生长和毒性相关因子基因CaESA1和白念珠菌减毒株均可用于制备或筛选白念珠菌治疗药物。

Description

一种白念珠菌CaESA1基因的用途及缺失CaESA1基因的白念珠菌减毒株

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种白念珠菌CaESA1基因的用途及缺失CaESA1基因的白念珠菌减毒株。

背景技术

白念珠菌（Candida albicans）是一种临床上分离到的一种机会性人体致病真菌，在免疫下调的病人中，如器官移植病人，艾滋病毒感染者等，可以引起广泛的浅部和深部系统感染，感染部位包括口腔，女性阴道等，引起鹅口疮，阴道炎等疾病，也可以侵入表皮和内皮细胞进入血液到达内脏器官，如肾脏，脑部等，导致败血症，严重可以导致死亡（Odds,F.C.1994.JAmAcadDermatol.31:S2-S5）。

白念珠菌在不同的生长条件下，呈现不同的生长形态，包括菌体（yeast form），假菌丝（pseudohyphae）和菌丝（hyphae）。各种形态之间的相互转化能力直接影响白念珠菌的致病能力（Odds,F.C.1985.Crit Rev Microbiol.12:45-93;Brown,A.J.P.et al.1999.TrendsMicrobiol.7:334-338），而形态转换缺陷的菌株其系统感染能力下降或消失（Lo,H.J.et al,1997.Cell.90:939-949;Braun,B.R.et al.2001.EMBO J.20:4753-61;Hwang,C.S.et al.2003.Mol Microbiol.47:1029-43）。

最近有些实验室利用减毒菌株作为疫苗来免疫小鼠，取得了比较好的效果，并对其进行了深入的生物化学分析，为疫苗的研制提供了理论基础（Elena FA et al,Proteomics2004,4,3007-3020;Elena FA et al,Proteomics2004,4,1204-1215）。许多培养条件可以引起白念珠菌的形态转换，包括血清，温度，pH值，氮源利用以及氧压等等。细胞内调节白念珠菌形态转换的分子机制主要有MAPK途径（mitogen-activaied protein kinase pathway）和cAMP/PKA途径（cAMP-dependent protein kinase A pathway）。同时还发现Cph2介导的，Efg1介导的以及pH应答的信号途径也都和白念珠菌的形态发生相关（Lane,S.et al.2001.MolCell Biol.21:6418-28;Stoldt,V.R.,et al.1997.EMBO J.16:1982-1991;El Barkani,A.et al.2000.Mol Cell Biol.20:4635-4647）。在白念珠菌中还存在具有抑制作用的信号途径，主要是由Tup1介导的信号转导途径，依靠特异性DNA结合抑制因子Rfg1，Nrg1等来发挥作用（Kadosh,D.et al.2001.Mol Cell Biol.21:2496-2505;Braun,B.R.et al.2001.EMBO J.20:4753-4761）。而近些年来的研究表明，染色质重塑复合物Swi/Snf也在调控白念珠菌的菌丝发育以及毒性发挥中起重要的作用（MAO et al FEBS Lett580,2615-2622）。

发明内容

本发明的目的在于公开CaESA1基因在白念珠菌菌丝生长调控以及致病机理研究领域的用途，并构建获得一种白念珠菌减毒菌株。

本发明首先公开了白念珠菌CaESA1基因的用途，为用于制备CaESA1基因不表达的白念珠菌esa1/esa1缺失株，或者用于制备、筛选白念珠菌治疗药物。

本发明的CaESA1基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。本发明的CaESA1基因为白念珠菌菌丝生长和毒性相关基因，其序列含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

较优的，本发明所述esa1/esa1缺失株为白念珠菌的减毒株。在所述白念珠菌esa1/esa1缺失株中CaESA1基因不表达。

本发明所述白念珠菌治疗药物为以CaESA1基因为治疗靶基因，使CaESA1基因不表达的药物、或者以CaESA1基因表达的蛋白为拮抗对象的药物；或者以CaESA1基因和其他基因共同作为靶基因加以沉默的药物。以CaESA1基因为靶点，筛选或制备使该基因不表达的药物，用于使白念珠菌失去毒性，从而治疗白念珠菌感染。例如，该白念珠菌治疗药物可以通过RNA干扰或者基因重组的方法使CaESA1基因不表达；或者通过制备CaEsa1蛋白拮抗剂，使CaESA1基因表达的蛋白不发挥作用。

本发明第二方面公开了一种白念珠菌减毒株，为白念珠菌esa1/esa1缺失株，所述减毒株中CaESA1基因不表达。

进一步的，本发明的白念珠菌减毒株属于NuA4乙酰转移酶基因缺失株。

较优的，所述白念珠菌esa1/esa1缺失株中，CaESA1基因通过同源重组的方法敲除。与野生型白念珠菌相比，所述减毒株中组蛋白H4的乙酰化水平降低。

较优的，与野生型白念珠菌相比，所述减毒株中菌丝生长相关基因和热休克基因的表达下降。所述菌丝生长相关基因选自HWP1基因或ECE1基因，所述热休克基因选自HSP70基因、HSP90基因或HSP104基因。

本发明第三方面公开了前述白念珠菌减毒株的构建方法，其步骤如下：

1）PCR敲除法：通过PCR的方法扩增含有ESA1基因侧翼片段的HIS1基因，然后将扩增获得的HIS1基因转化白念珠菌，通过同源重组的方法敲除白念珠菌染色体上的一个CaESA1拷贝，获得单拷贝缺失株；

2）URA-BLAST敲除法：体外构建敲除质粒，所述敲除质粒中含有与CaESA1开放阅读框同源的重组片段，并且该重组片段中含有HisG-URA3-HisG筛选片段；利用敲除质粒通过同源重组的方法敲除所述单拷贝缺失株的染色体中另一个CaESA1拷贝与，筛选获得的重组子即为双拷贝缺失株esa1/esa1。

较优的，步骤1）所述HIS1基因来自质粒pGEM-HIS1。可以通过PCR的方法扩增获得，该HIS1基因可作为筛选标记，使转化菌株能在His缺失的培养基中生长。

较优的，步骤2）所述敲除质粒的构建所采用的质粒为pCUB6。

较优的，步骤2）所述筛选是采用含5-氟乳清酸的平板对重组菌株进行压力筛选。

本发明最后还公开了前述白念珠菌减毒株在研究白念珠菌发育及毒性功能中的应用，或者在制备或筛选白念珠菌治疗药物中的应用。

本发明的白念珠菌减毒株相对于野生型白念珠菌，其组蛋白H4的乙酰化水平降低；无法形成菌丝；白念珠菌减毒株中热休克基因（HSP70，HSP90和HSP104）的表达量大大下降，HWP1和ECE1基因的表达量也下降；对DNA损伤诱导试剂和氧化剂更为敏感，并且丧失毒性。

有益效果：本发明研究了白念珠菌基因CaESA1对菌丝生长和菌株毒性的影响，并成功构建了一种白念珠菌减毒株，在本发明的减毒株中CaESA1基因不表达。本发明的白念珠菌菌丝生长和毒性相关因子基因CaESA1和白念珠菌减毒株均可用于制备或筛选白念珠菌治疗药物。

附图说明

图1：白念珠菌CaESA1基因的敲除策略

图2：重组子基因型的PCR检测结果

图3：白念珠菌CaESA1基因的敲除对细胞生长的影响

图4：白念珠菌CaESA1基因的敲除对组蛋白H4乙酰化水平的影响

图5：白念珠菌CaESA1基因的敲除对菌丝发育的影响

图6：白念珠菌CaESA1基因的敲除对基因表达的调控

图7：DNA损伤试剂以及H₂O₂对白念珠菌esa1/esa1缺失株的影响

图8：CaESA1基因的敲除对白念珠菌毒性的影响

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

白念珠菌（Candida albicans）是一种人体机会性致病真菌，能引起广泛的深部和浅部感染，但是其真正的致病因子和致病机理没有完全研究清楚。MYST乙酰转移酶家族蛋白是一类具有重要功能的蛋白，在细胞的生长于分化中起重要作用，这类蛋白包含一个序列与结构上保守的结构域，称之为MYST结构域（名称来源于最初发现的四个蛋白：MOZ，Ybf2，Sas2和TIP60）。TIP60是人类MYST家族的乙酰转移酶，TIP60的突变引发多种疾病。白念珠菌中MYST家族TIP60蛋白同源物及其对应的基因尚未报道，根据白念珠菌基因组序列（http://www.candidagenome.org/），利用生物信息学比较分析，我们在白念珠菌的基因组序列中发现一个功能未知的新基因（orf19.5416），该基因编码的产物与酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae）MYST乙酰转移酶家族蛋白Esa1具有最高的同源性，因此命名为白念珠菌CaESA1基因，对应的蛋白命名为白念珠菌CaEsa1蛋白。酿酒酵母Esa1蛋白是MYST乙酰转移酶复合物NuA4复合物中的核心酶，与人类TIP60蛋白同源。

本发明的白念珠菌ESA1基因用CaESA1表示，在不会与酿酒酵母ESA1基因混淆的情况下也用ESA1表示，白念珠菌Esa1蛋白用CaEsa1表示，在不会与酿酒酵母Esa1蛋白混淆的情况下也用Esa1表示，白念珠菌CaESA1基因缺失株用caesa1/caesa1表示，在不会与酿酒酵母ESA1基因缺失株混淆的情况下也用esa1/esa1表示。

基本实验方法：

方法1：白念珠菌基因组DNA抽提

白念珠菌培养过夜用ddH₂O洗1次，悬浮在500μl溶液A中（1M山梨醇,100mM EDTApH8.0），加入5μl20mg/ml的Zymolase，37°C放置1小时后，高速离心去上清，细胞用500μlof TE buffer（20mM Tris·HCl pH7.5,1mM EDTA）洗一次，悬浮在350μl of TE buffer中，并加入90μl of溶液B（250mM EDTA pH8.0,400mM Tris·HCl pH8.0,2%SDS）,65°C放置30分钟，加入80μlof5M KAc，冰上放置1小时，高速离心5分钟，吸取上清并加入1ml的无水乙醇，－20°C放置20分钟，高速离心5分钟，沉淀用70％乙醇洗一次，离心后烘干。

方法2：RNA反转录以及实时定量分析分析

各菌株在YPD，30℃中培养至对数生长期后期，转接至YPD起始OD＝0．05，并在相应温度下培养指定时间，用热酚法抽提白念珠菌总RNA。按照反转录试剂盒TOYOBO的指示，将野生型和caesa1/caesa1缺失株在各种条件下抽提出来的RNA反转录为cDNA。将100ngcDNA，和25μM引物以及TOYOBO实时定量PCR试剂盒中试剂混合，在applied system仪器中运行实时定量PCR程序。程序运行至结束，分析定量PCR的结果。

方法3：白念珠菌的转化

准备PEG／LiAc溶液（pH7.5）10m1；在1.5mI Eppendof管中依次加入质粒5μg，10μl10mg/ml鱼精DNA，混匀；加入0．1ml感受态细胞和0．6m1PEG／LiAc，votex混匀；30℃200rpm培养30min；加入70μl DMSO，轻轻混匀；42℃热冲击15min，期间不时轻轻摇匀；冰浴2min：高速离心15s，吸掉上清，用0.2m1TE重悬细胞；涂布于适当的营养筛选SD平板上。

方法4：DNA损伤检验

将对数期生长的细胞依次稀释10倍，将其中的5μl点到YPD，以及YPD分别含有25mM HU，30μg/ml CPT，0.02%MMS，在22℃培养56小时。

方法5：细胞数目倍增速度测算

将野生型和caesa1/caesa1缺失株培养在25℃液体YPD中过夜16小时，稀释至新鲜培养基，移入各个培养温度：35℃,30℃,25℃,22℃,16℃,10℃，分别每隔1小时，1.2小时，1.5小时，1.8小时，2.5小时和5小时测定细胞的OD600值，代入log值，算出细胞数目倍增的时间。

方法6：Western杂交

白念珠菌在SD培养基中于30°C培养至饱和，按A₆₀₀0.05转接于SD培养基中，30°C振荡8-16h，至A₆₀₀为0.6-1.0。100ml培养物离心收集，10ml无菌水洗一次。以下步骤均在4°C进行。白念珠菌细胞重悬于0.5ml白念珠菌细胞裂解液(10mM Tris-HCl,pH8,250mM NaCl,0.1%NP-40,0.5mM DTT,0.5mM phenylmethylsulfonyl fluoride,2mMbenzamidine,0.5g/ml leupeptin,1.4g/ml pepstatin,2.4g/ml chymostatin,and17g/mlaprotinin)，加入0.4g酸洗玻璃珠（425-600m，Sigma）。在振荡器FP120上振3次，每次30s，间隔冰浴5min。裂解液12,000rpm离心5min，上清再离心5min，收集上清并测定蛋白浓度，-70°C保存。取20μl白念珠菌细胞抽提物，重悬在2×蛋白质电泳上样缓冲液中，进行SDS-PAGE电泳。用湿法将蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶粉的TBS-T溶液封闭膜2-3小时，一抗4°C结合过夜。用TBS-T室温洗膜1次，5分钟。用相应的抗组蛋白H4Ac、H4K5Ac、H4K12Ac、H4K16Ac(Abcam)、H4(Sigma)等的二抗于室温结合1小时，再用TBS-T洗膜四次，每次5分钟，用ECL试剂显色。

实施例1白念珠菌中CaESA1基因的敲除

为了研究白念珠菌CaESA1基因在白念珠菌形态发生和毒性表现中的功能，首先在白念珠菌中敲除CaESA1基因。图1显示了基因敲除的策略。第一步采用PCR法敲除第一个拷贝的CaESA1基因，并因此代入HIS1基因。第二步，体外构建CaESA1基因敲除质粒，通过同源重组的方法，把染色体中第二个拷贝的CaESA1基因中的1.5kb DNA同源片段用HisG-URA3-HisG替换。在含5-氟乳清酸（5-f1uoro-orotic acid，5-FOA）平板上，通过压力筛选，使两个同向HisG同源序列得以重组，从而环出筛选标志基因URA3和一个拷贝HisG序列，丢失了URA3筛选标志基因的重组子可以在5-FOA平板上筛选得到（Boeke et al.1984.Mol Gen Genet.197:345–346），该重组子可以进行第二轮的转化进而敲除第二条染色体上的CaESA1基因。所得重组子的基因型用PCR检测确定（图2）。

具体方法如下：

一、第一条染色体上CaESA1基因的敲除

1、PCR法敲除敲除第一个拷贝

1）实验方法

采用5’引物F1：

5'-ACTGTCCATCAATCAATCAAAAACGAAAAAGACAATAACACCGACAACAAGTAATACATC Gttttcccagtcacgacgtt(SEQ ID NO:3)

和3’引物R1：

5'-TCTGGTTTAAGATTATTGACATGCCATGGCGATAAAAGTATTAGAATATGGGGAACATCtgtggaattgtgagcggata(SEQ ID NO:4)

从质粒pGEM-HIS1扩增出带有60bp目的基因的重组片段以及中间包含的HIS1标志基因，将该PCR产物乙醇沉淀后，定量至300ng/μl,利用常规白念珠菌转化方法转化2.5μg左右的PCR产物至白念珠菌中。

2）PCR敲除法检测方法如下：

采用5’引物CF1：5’-GACAGTTGCTAGTTGAAAAGA(SEQ ID NO:5)和3’引物CR1：5’-ttcttcaattcgtccattaca(SEQ ID NO:6)筛选PCR敲除后，5’端正确整合的转化子，实验结果见图2。

采用5’引物CF2：5’-ttcttcaattcgtccattaca(SEQ ID NO:7)和3’引物CR2：5’-GATGCTGGGATTTGGAAAGAA(SEQ ID NO:8)筛选PCR敲除后，3’端正确整合的转化子，实验结果见图2。

获取PCR敲除成功的转化子即为单拷贝缺失株（ESA1/esa1），然后利用URA-BLAST法进一步敲除该基因的第二个拷贝。

2、URA-BLAST敲除法

1）实验方法

首先，采用5’引物F2：5'-tgca agatct ctgcag GAAATGCTTTTGTGCAGTGAAC(SEQ IDNO:9)和3’引物R2：5'-tgca agatct GATGTATTACTTGTTGTCGGTG(SEQ ID NO:10)从白念珠菌基因组DNA中扩增约0.5kb的片段，连接到质粒pCUB6（Fonzi,W. A.,and M.Y. Irwin.1993.Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans.Genetics134:717-28.的BglII位点。

然后，利用5’引物F3：5'-cgat ggatcc GATGTTCCCCATATTCTAATAC(SEQ ID NO:11)，以及3’引物R3：5'-cgat gcatgc ctgcagCTGATTATAACGATCCACAGGT(SEQ ID NO:12)从白念珠菌基因组DNA中扩增约0.5kb的片段，继续连接到质粒pCUB6的BamHⅠ/SphⅠ位点,将该质粒命名为敲除质粒pKO-CaESA1，在此质粒中CaESA1开放阅读框(open readingframe ORF)中约1.6kb DNA片段被HisG-URA3-HisG替代。

采用构建的敲除质粒pKO-CaESA1约200μg，取50μg以PstⅠ酶切过夜，获得线性化质粒，乙醇沉淀，取8μg转化第一轮PCR法敲除成功的转化子，在缺少尿嘧啶的合成培养基上可以筛选到转入质粒的转化子。通过pCaESA1-KO质粒的上游0.5kb和下游0.5kb两个同源片段和基因组上CaESA1的同源片段重组，可以把染色体上的CaESA1基因中的1.6kb DNA同源片段用HisG-URA3-HisG给替换掉，从而破坏染色体上的CaESA1基因。正确插入的转化子通过PCR分析确定，然后将正确插入的转化子涂在含5-氟乳清酸(5-f1uorooroticacid5-FOA)平板上。由于5-氟乳清酸对含有URA3的菌株来说是具有毒性的，所以可以通过两个同向HisG同源序列在同一条染色体上的重组而将URA3环出。那么在含5-氟乳清酸(5-f1uoro-orotic acid5-FOA)平板上长出的都是丢失了URA3筛选标记的重组菌。该重组菌可以进行下一轮的遗传操作。

2）URA-BLAST法敲除CaESA1基因第二个拷贝的具体检测方法如下：

利用5’引物CF3：5’-GATCTCCGTTTTATAAGGGAA(SEQ ID NO:13)，以及3’引物CR3：5’-gacttcgacagaaccatttaa(SEQ ID NO:14)检测URA-BLAST法敲除CaESA1基因第二个拷贝后，5’端正确整合的转化子，实验结果见图2。

利用5’引物CF4：5’-gtttaagcgatgattcacgag(SEQ ID NO:15)，以及3’引物CR4：5’-GGTGGGAAAGACTGTGTCGTA(SEQ ID NO:16)，检测URA-BLAST法敲除CaESA1基因第二个拷贝后，3’端正确整合的转化子，实验结果见图2。

3、双拷贝缺失菌株的鉴定

采用如下引物进行检测：利用5’引物CF5：5’-ATGGCGGTAGCAGAAATCAA(SEQ IDNO:17)，以及3’引物CR5：5’-TTACCACCCAAACCGTAATT(SEQ ID NO:18)检测CaESA1基因的开放阅读框，实验结果如图2所示。

图2结果表明经过两轮的敲除，成功获得CaESA1基因的双拷贝缺失株caesa1/caesa1（也可以表示为esa1/esa1）。

表1白念珠菌中CaESA1基因敲除实验的引物

实施例2白念珠菌CaESA1基因的敲除对细胞生长的影响

1.实验方法

1）空质粒回复株（esa1/esa1+V)的制备：

将空质粒pBA1(Cao,F.,S.Lane,P.P.Raniga,Y. Lu,Z.Zhou,K.Ramon,J.Chen,and H.Liu.2006.The Flo8transcription factor is essential for hyphal development and virulence inCandida albicans.Mol Biol Cell17:295-307.)导入白念珠菌双缺失菌株esa1/esa1，得到空质粒回复株。

2）ESA1基因回复株（esa1/esa1+ESA1)的制备：

利用5’引物F4：5’-gtttaagcgatgattcacgag(SEQ ID NO:19)，以及3’引物R4：5’-GGTGGGAAAGACTGTGTCGTA(SEQ ID NO:20)，从白念珠菌基因组DNA中扩增1.6kbCaESA1基因，将扩增出的CaESA1基因插入pBA1的BglII-ClaI酶切位点，获得回复质粒pBA1-ESA1，将回复质粒pBA1-ESA1转入白念珠菌双缺失菌株esa1/esa1，得到ESA1基因回复株。

我们将野生型菌株（WT，SC5314)、实施例1制备的单拷贝缺失株（ESA1/esa1）、实施例1制备的双拷贝缺失株（esa1/esa1）、空质粒回复株（esa1/esa1+V)以及ESA1基因回复株（esa1/esa1+ESA1)等五株菌株以梯度稀释（连续稀释10倍）的方式，点在固体YPD平板上，分别在37℃，35℃，30℃，25℃，16℃和4℃的温度调节下进行培养，37℃培养2天，35℃培养2天，30℃培养3天，25℃培养3天，16℃培养5天，4℃培养14天。

2.实验结果及分析

实验结果如图3所示，ESA1的缺失不会导致白念珠菌死亡，但是影响细胞的生长速度。与野生型菌株相比，当温度高于室温时，esa1/esa1缺失株细胞的生长速度放缓，升高至37℃，细胞生长停滞；而低于室温时细胞生长速度加快，在4度时还能生长，而野生型菌株则在4度时进入静止期而停止生长。说明caesa1/caesa1基因缺失株细胞的生长速度呈现温度依赖现象，高于室温（22°C）生长速度比野生型菌株慢，低于室温生长速度则比野生型菌株快（图3）。

实施例3白念珠菌CaESA1基因的敲除导致组蛋白H4的乙酰化水平降低

1.实验方法

为了检测CaESA1基因的缺失是否对胞内组蛋白H4的乙酰化水平产生影响，我们将野生型菌株（SC5314）以及实施例1制备的caesa1/caesa1缺失株分别在35℃，30℃，25℃，16℃的YPD培养基中分别培养后（35℃培养2天，30℃培养3天，25℃培养3天，16℃培养5天），抽提它们的总蛋白，利用免疫共沉淀法和Western-blot检测组蛋白H4，乙酰化的组蛋白H4以及组蛋白H4N末端特定Lys位点的乙酰化在胞内的表达水平。

2.实验结果

实验结果显示，与野生型细胞相比，caesa1/caesa1缺失株的细胞中组蛋白H4的乙酰化水平显著下降（图4），同时，组蛋白H4的第5位和第12位Lys的乙酰化水平也随之大大下降，但是组蛋白H4的第16位Lys的乙酰化水平并没有发生显著的变化，可能是由于在白念珠菌中存在功能冗余的乙酰转移酶可以乙酰化组蛋白H4的第16位Lys。同时证明温度不会改变乙酰化的图式（图4）。

以上的结果表明，相比于野生型细胞，白念珠菌caesa1/caesa1缺失株的细胞内，NuA4复合物的催化活性显著下降，证明CaEsa1具有组蛋白乙酰转移酶（HAT，histoneacetyltransferases）催化活性。

实施例4白念珠菌乙酰转移酶Esa1对菌丝发育的影响

1.实验方法

液体培养：采用液体YPD培养基，或者加了10wt%血清的YPD培养基，在25℃、30℃、35℃分别培养野生型菌株（SC5314）和caesa1/caesa1缺失株，25℃和30℃分别培养6h，35℃喜爱培养3.5h，观察菌丝发育情况。

菌丝包埋：采用固体YPD培养基在25℃、35℃分别培养野生型菌株（SC5314）和caesa1/caesa1缺失株1～3天，观察菌丝发育情况。

2.实验结果

在液体YPD+10wt%血清和35°C菌丝诱导条件下，野生型菌株（SC5314）能形成很好的真菌丝，而caesa1/caesa1缺失株却以酵母态生长，不能形成菌丝（图5A）。

包埋条件下的菌丝形成状况，包括高温包埋（35℃）和低温包埋（25℃）两个条件。结果与血清诱导条件下一样，缺失乙酰转移酶Esa1之后，阻断白念珠菌在包埋条件下的菌丝发育（图5B），说明CaEsa1对白念珠菌的菌丝形成是必需的。

实施例5白念珠菌乙酰转移酶Esa1对基因表达的调控

1.实验方法

白念珠菌从酵母态到菌丝态的转变伴随着一些菌体特异基因表达的关闭和菌丝特异基因表达的开放。HWP1基因编码一个细胞壁蛋白，作为白念珠菌细胞表面一个重要的黏附因子，是哺乳细胞谷胺酰氨转移酶的底物，而且HWP1mRNA在菌丝形成的过程中被不断诱导合成。

将野生型菌株（SC5314）和caesa1/caesa1缺失株分别在液体YPD培养基或者液体YPD+10wt%血清培养基，25℃温度下培养至对数生长期后期，转接至新的相同培养基中，调节菌体起始浓度的OD值为0.05。在相应温度（25℃、30℃、35℃）下培养指定时间（25℃培养6小时、30℃培养6小时、35℃培养6小时，35℃培养,3小时用于菌丝诱导，35℃培养0.5小时用于热激诱导），用热酚法抽提白念珠菌总RNA。按照反转录试剂盒TOYOBO（购自日本TOYOBO公司）的指示，分别将野生型和caesa1/caesa1缺失株抽提出的总RNA反转录为cDNA。将100ng cDNA，和25μM引物利用applied system仪器运行实时定量PCR程序，进行定量PCR分析，PCR扩增的引物序列如表2所示。

表2RT-PCR引物

引物	序列	序列编号
			F(HWP1)	GTTTGTACCGAAAGTGAAGT	SEQIDNO：21
R(HWP1)	TTCTGAACCAGCAGGAATTG	SEQIDNO：22
			F(ECE1)	TTCAACATGAAGAGAGATGT	SEQIDNO：23
R(ECE1)	GGTAACAAGAGAGAAGATAT	SEQIDNO：24
			F(HSP70)	GTTTCATTATTAGCCATTGA	SEQIDNO：25
R(HSP70)	GAAATTGATTCCTTATATGA	SEQIDNO：26
			F(HSP90)	TTGGACAAAATCAGATACCA	SEQIDNO：27
RHSP90)	ACCAAATCCTTTATGGAAGC	SEQIDNO：28
			F(HSP104)	AGGCCAATTCGCAATTGTTA	SEQIDNO：29
R(HSP104)	GTGTTAACGAAGGCCAACAA	SEQIDNO：30

2.实验结果

实验结果见表6，定量RT-PCR实验表明，在YPD菌体培养条件下野生型菌株和caesa1/caesa1缺失菌株不表达HWP1，而在含血清培养基的菌丝诱导条件下，野生型菌株中HWP1被诱导大量表达，而caesa1/caesa1缺失株中HWP1的表达量大大下降(图6A)，与HWP1相似，另外一个菌丝特异性基因ECE1，在caesa1/caesa1缺失株中也几乎不表达(图6A)。同时我们检测了热休克基因的表达，野生型菌株相比，在caesa1/caesa1缺失株中三个HSP70，HSP90和HSP104热休克基因的表达量都大大下降(图6B)。

实施例6DNA损伤试剂以及H₂O₂对白念珠菌esa1/esa1缺失株的影响

1.DNA损伤试剂对白念珠菌esa1/esa1缺失株的影响

在DNA复制过程中，NuA4乙酰转移酶复合物参与DNA损伤修复。DNA损伤试剂MMS(methyl methanesulfonate，甲基磺酸甲酯)，HU(hydroxyurea，羟基脲)，CPT(camptothecin,喜树碱)都能对DNA造成损伤。

含DNA损伤诱导试剂的固体YPD：制备分别含有10mM的HU、0.01wt%的MMS，15ug/ml的CTP的固体YPD。

将野生型菌株(SC5314)与caesa1/caesa1缺失株点在含有不同DNA损伤诱导试剂的固体YPD平板上，并且每种菌以十倍梯度稀释度进行点样；以YPD在室温（rt）下生长作为对照；室温培养56小时之后，野生型菌株能够生长，说明其DNA修复机制可以弥补DNA损伤试剂引发的损害，而esa1/esa1缺失株在含DNA损伤试剂的培养基中几乎不能生长，这说明esa1/esa1缺失株细胞内DNA修复系统缺陷(图7)。结果表明野生型菌株具备修复功能，能够生存，但是白念珠菌caesa1/caesa1缺失株细胞存在DNA损伤修复缺陷，对DNA损伤敏感。

2.DNA损伤试剂对白念珠菌esa1/esa1缺失株的影响

将野生型菌株(SC5314)与caesa1/caesa1缺失株点在含有2mM H₂O₂的固体YPD平板上，在室温培养56小时之后，野生型菌株能够生长，而esa1/esa1缺失株几乎不能生长(图7)，结果表明野生型菌株具备抵抗氧化损伤的功能，能够生存，但是白念珠菌caesa1/caesa1缺失株对H₂O₂敏感。说明Esa1蛋白在氧化损伤应激中保护白念珠菌不可或缺。

白念珠菌作为人类致病真菌，已经发展出一套较为完善的规避系统，来抵抗人类宿主的氧化杀伤。上述结果表明野生型菌株具备修复功能，能够生存，但是白念珠菌caesa1/caesa1缺失株细胞存在DNA损伤修复缺陷，对DNA损伤敏感。

实施例7CaESA1基因的敲除对白念珠菌毒性的影响

1.实验方法

酵母-菌丝形态之间的转换能力与白念珠菌的致病能力密切相关，不能形成菌丝的菌株会丧失毒性。由于构建的caesa1/caesa1缺失株不能形成菌丝，因此可以通过小鼠系统感染试验来检测缺失株的感染能力或者毒性。

通过尾静脉对每只小鼠注射5×10⁶个白念珠菌细胞，然后观察小鼠的存活率来判断菌株的致病能力。采用分别注射了野生型菌株SC5314和CaESA1基因单拷贝缺失株（ESA1/esa1）细胞的小鼠作为对照，注射了esa1/esa1缺失株细胞的小鼠作为实验样，每种菌株注射6只小鼠。

2.实验结果及分析

结果显示，注射SC5314的小鼠到第7天时全部死亡，注射ESA1/esa1单拷贝缺失株的小鼠在第12天时全部死亡，而注射了esa1/esa1缺失株的小鼠并没有出现任何不适症状包括体重下降，活动减少，精神委靡等现象，在我们的实验记录时间内(30天)都没有观察到死亡现象，并且小鼠的生长很正常（图8）。因此我们认为CaESA1基因是白念珠菌的致病能力所必需的，而对应的CaEsa1蛋白是白念珠菌的毒性因子。

利用同源重组原理，我们在白念珠菌中构建了caesa1/caesa1基因缺失株。CaESA1基因的缺失使得细胞内组蛋白H4K5和H4K12的乙酰化水平大大下降，证明CaEsa1具有组蛋白乙酰转移酶（HAT，histone acetyltransferases）催化活性。caesa1/caesa1基因缺失株细胞的生长速度呈现温度依赖现象，高于室温（22°C）生长速度比野生型菌株慢，低于室温生长速度则比野生型菌株快，缺失株中热休克蛋白的表达量大大下调。caesa1/caesa1缺失株对DNA损伤和氧化损伤高度敏感，而且不能形成菌丝，菌丝特异基因的表达也大大下降。在系统感染实验中，缺失株没有毒性，说明CaEsa1是白念珠菌中一个重要的毒性因子。

Claims (5)

1.一种白念珠菌减毒株，为白念珠菌esa1/esa1缺失株，所述减毒株中CaESA1基因不表达；所述白念珠菌esa1/esa1缺失株中，CaESA1基因通过同源重组的方法敲除；与野生型白念珠菌相比，所述减毒株中菌丝生长相关基因表达下降，所述菌丝生长相关基因选自HWP1基因或ECE1基因。

2.如权利要求1所述的白念珠菌减毒株，其特征在于，与野生型白念珠菌相比，所述减毒株中组蛋白H4的乙酰化水平降低。

3.如权利要求1所述的白念珠菌减毒株，其特征在于，与野生型白念珠菌相比，所述减毒株中热休克基因的表达下降，所述热休克基因选自HSP70基因、HSP90基因或HSP104基因。

4.权利要求1-3任一权利要求所述白念珠菌减毒株的构建方法，其步骤如下：

1)PCR敲除法：通过PCR的方法扩增含有CaESA1基因侧翼片段的HIS1基因，然后将扩增获得的HIS1基因转化白念珠菌，通过同源重组的方法敲除白念珠菌染色体上的一个CaESA1拷贝，获得单拷贝缺失株；

2)URA-BLAST敲除法：体外构建敲除质粒，所述敲除质粒中含有与CaESA1开放阅读框同源的重组片段，并且该重组片段中含有HisG-URA3-HisG筛选片段；利用敲除质粒通过同源重组的方法敲除所述单拷贝缺失株的染色体中另一个CaESA1拷贝，筛选获得的重组子即为双拷贝缺失株esa1/esa1。

5.权利要求1-3任一权利要求所述白念珠菌减毒株在研究白念珠菌发育及毒性功能中的应用，或者在制备或筛选白念珠菌治疗药物中的应用。