CN102180951B - 胆固醇修饰的抗hiv多肽药物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了胆固醇修饰的抗HIV多肽药物及其用途。该胆固醇修饰的抗HIV多肽，名称为CHFI，其氨基酸序列如序列表中的序列2所示，其中，序列2的第33位的半胱氨酸残基与胆固醇通过硫醚键连接。本发明通过化学选择性极高的成硫醚反应将溴乙酸胆固醇酯接枝到多肽链半胱氨酸的侧链上，得到CHFI。CHFI具有抗病毒活性强、具有靶向性、半衰期长、水溶性好、易于合成等重要优点。

Description

胆固醇修饰的抗HIV多肽药物及其用途

技术领域

本发明涉及一种高效抑制人免疫缺陷病毒(HIV)的多肽类药物及其设计方法和治疗艾滋病的用途。

背景技术

目前全球HIV感染人数超过6000万，其中约2000万已经死亡。新的感染人数和死亡人数逐年增加。据WHO估计，现在每天就有1.6万新发感染；推测十年后大约有1亿人感染，这无疑将是人类社会的一大灾难。疫苗是预防艾滋病的最好的手段，但二十多年来，还没有一个HIV疫苗的临床方案被证明有效。在今后相当长的一段时期内，有效的HIV疫苗恐难有重大突破。因此，大力研究HIV-1感染机制并据此设计阻断病毒不同复制阶段的药物是目前防控艾滋病的重点策略之一。迄今为止，临床上治疗HIV感染的药物可以分为逆转录酶抑制剂，蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂和HIV进入抑制剂，它们分别针对病毒复制的不同环节。大多数药物属于逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，这两类药物在临床上容易诱导HIV耐药性突变，而且对人体有较大的毒副作用，导致很多患者无法继续接受治疗，极大地限制了艾滋病病人的临床治疗。因此，研究开发新的艾滋病药物，尤其是针对病毒侵入途径的抑制剂是当前的重点内容。

HIV-1 gp41结构与功能研究

HIV-1进入靶细胞的过程主要由包被糖蛋白gp160介导。该蛋白由表面亚基gp120和跨膜亚基gp41通过非共价键连接。在天然状态下，gp160为三聚体，其中三分子的gp120形成一个球状复合物，而三分子gp41则象三个脚，插入病毒包膜内^[1]。在HIV感染靶细胞过程中，gp120主要功能是与受体CD4分子和辅助受体(趋化因子受体CCR5或CXCR4等)结合，而gp41分子主要介导病毒和细胞的膜融合。如同其他的I型跨膜蛋白一样，HIV-1 gp41分子由膜外区，跨膜区和胞内区组成。研究发现，gp41膜外区包含几个重要的功能区：(1)富含甘氨酸的疏水性融合肽(fusion peptide)；(2)N-末端重复序列(NHR或HR1)；(3)C-末端重复序列(CHR或HR2)；(4)色氨酸富含区(TR)。从结构上分析，NHR和CHR含有的疏水氨基酸4-3重复序列[(abcdefg)_n]可能形成卷曲螺旋(coied coil)结构，但确切的边界点难以预测。直到1995年，Lu等^[2]采用有限蛋白酶水解方法鉴定出由NHR多肽N51(aa540-590)和CHR多肽C43(aa624-666)组成的蛋白酶抗性gp41结构。结果发现合成的N51和C43多肽可以结合在一起形成稳定的六聚体螺旋束结构，提示它们分别包含NHR和CHR疏水性4-3重复序列。后来，进一步采用有限蛋白酶水解方法消化重组N51(L6)C43重组蛋白鉴定出更短的NHR序列(N36，aa546-581)和CHR序列(C34，aa628-661)。N36和C34分别位于N51和C43的中间位置，也可以形成稳定的六聚体螺旋束结构，被认为是HIV-1 gp41的功能性核心结构。1997年，麻省理工大学Kim P研究小组用N36和C34多肽在体外反应形成复合物来模拟HIV gp41，率先解出了gp41的核心结构^[3]。另外两个独立的实验室也随后报道了基于gp41合成多肽的六聚体螺旋束的晶体结构^[4-5]，证实了以上的发现。晶体结构显示，HIV gp41核心结构为六股α-螺旋束，其中三个NHR组成的N-螺旋通过在a和d位置的氨基酸相互作用形成位于中心的螺旋三聚体，其e和g位置的氨基酸残基则暴露于中心螺旋体的外围，并与三个CHR组成的C-螺旋的a和d位置相互作用。C-螺旋以反向平行的方式分别结合在三个N-螺旋形成的沟槽中。基于gp41三维结构信息，科学家提出了HIV-1膜融合机制：当HIV包膜蛋白gp120与靶细胞上的受体结合后发生显著的构象变化，gp41的融合多肽(FP)被暴露出来并插入靶细胞膜，三分子gp41上的NHR与CHR分别发生反向结合，形成稳定的六螺旋束核心结构，将病毒包膜与靶细胞膜的距离拉近而发生融合，从而介导HIV进入靶细胞内^[3-5]。令人兴奋的是，晶体结构还揭示NHR含有明显的疏水袋状结构(hydrophobic pocket)，被认为有可能是抗HIV药物的新靶点^[6-7]。

最近的研究发现，HIV-1gp41 CHR可以分为三个功能区(1)位于CHR N末端的NHR疏水袋结合区(PBD：pocket-binding domain，aa628-635)；(2)NHR结合区(NBD：aa628-666)和(3)脂膜结合区(LBD：lipid-binding domain，aa666-673)^[8]。包括定点突变分析在内的大量研究表明NHR和CHR螺旋间的相互作用对gp41核心结构的稳定性以及病毒的感染活性起着决定性的作用^[9-10]。在gp41六螺旋束即核心结构形成过程中，CHR上PBD的三个氨基酸以高亲和力插入NHR疏水袋，对稳定六螺旋束结构至关重要。以前的研究推测，CHR疏水袋结合区上游序列⁶²³QIWNNMT⁶²⁷也可能呈现α-螺旋结构；同时，NHR下游序列⁵⁸¹AVERYLKDQ⁵⁹⁰也有α-螺旋趋势^[3-5]。推测这两个位点之间的相互作用有可能影响NHR和CHR形成稳定的功能性核心结构，从而影响病毒感染的膜融合过程。最近的研究发现，含有⁶²¹QIWNNMT⁶²⁷的多肽(CP621-652)可以和NHR相应多肽(T21)形成极其稳定的六螺旋束结构(Tm＝82℃)，远远高于目前被认为gp41核心结构的N36和C34复合体的稳定性(Tm＝64℃)。这个结果提示，在HIV-1感染过程中，CHR上游的⁶²¹QIWNNMT⁶²⁷位点和NHR下游的⁵⁸¹AVERYLKDQ⁵⁹⁰间可能相互作用并对gp41介导的膜融合过程有重要影响，从而决定病毒的感染活性。

靶向gp41的HIV融合抑制剂研究

理论上，抑制融合过程中的任何一个环节，就能抑制HIV进入靶细胞，从而达到抑制HIV感染和治疗艾滋病的目的。从病毒融合机制的角度，HIV进入抑制剂可分为三大类，一是干扰gp120与CD4受体结合，称为粘附抑制剂；二是拮抗辅助受体，阻止其与gp120-CD4复合物结合，称为辅助受体拮抗剂；第三类是阻止gp41核心结构的形成，称为HIV融合抑制剂^[11]。于2003年获得美国FDA“快通道”批准的抗HIV多肽类药物T-20(Enfuvirtide)即是针对gp41核心结构的形成过程而发挥作用。T-20对耐受前两类药物的病毒依然有效，可用于组成更多的“鸡尾酒”方案，用于艾滋病的治疗。HIV进入抑制剂的药物作用靶点，既可以是病毒包膜蛋白，如gp120和gp41，也可以是靶细胞上与HIV进入有关的蛋白，如CD4或CCR5、CXCR4等受体分子。以CCR5或CXCR4为药物靶点的辅助受体拮抗剂，只能对相应的R5或X4病毒有作用，不能抑制能使用两种辅助受体的R5X4病毒，也无法完全抑制HIV感染者携带的各种准株，可能导致治疗和预防的失败。同时，作用于人体蛋白也可能产生严重的副作用。因此，以HIV包膜蛋白本身作为药物靶点，在药物的安全性方面具有显著的优越性。由于gp41的序列比gp120更为保守，且是病毒特有的蛋白，因而作为药物靶点研究HIV进入抑制剂更具优势。

在过去的十余年中，靶向gp41的抗病毒多肽是HIV药物研究的亮点之一，科学家采用不同的策略设计了许多基于多肽或重组蛋白的高效抗HIV融合抑制剂^[11，13]。早在1992年，wild等从NHR区鉴定了第一个抗HIV多肽T21(DP-107)。随后，更有效的HIV融合抑制多肽从CHR区被鉴定，如SJ-2176和T-20。总的来说，衍生于gp41 CHR的原型多肽比衍生于NHR的原型多肽具有更高的抗HIV活性，其中最著名的就是T-20和C34，它们可以有效地抑制HIV-1介导的细胞融合和感染。基于HIV的融合模型，CHR多肽抑制HIV进入靶细胞的作用机理被认为是与gp41 NHR结合，从而阻止gp41本身的CHR与NHR结合形成功能性六螺旋束结构(dominant negative fashion)。然而，一些学者对T-20的作用机制有不同的看法^[14]，它也有可能同时作用于细胞膜甚或gp120。结构上T-20和C34都包含NHR结合区，可以和NHR序列相互作用。虽然这两个多肽大部分序列重叠，但C34包含疏水袋结合区(PBD)而T-20缺乏这个位点；然而T-20包含C34所没有的脂膜结合区(LBD)，该位点对T-20的抗病毒活性也很重要。研究表明，NHR上⁵⁴⁷GIV⁵⁴⁹位点(GIV motif)与HIV-1对T-20和C34的耐药密切相关^[15]。为克服T-20的耐药问题并提高药物活性，设计了第二代融合抑制剂T-1249。该肽序列包含了HIV-1，HIV-2和SIV的CHR序列，具有较高的抗HIV能力，对T-20耐药株也非常有效。但是，T-1249由于在剂型上存在问题而停止了临床试验。T-20是第一个也是目前唯一一个被批准用于临床治疗的HIV-1膜融合抑制剂，但由于容易引起耐药，限制了它在临床上的应用。C34虽然活性更好，但由于其水溶性问题也很难发展成为药物。基于HIV-1 gp41核心构象的三维结构和C34的序列，设计新型的抗病毒多肽是目前的研究热点之一。另外，基于HIV-1 gp41核心结构理论研发融合抑制剂的研究进展也极大地推动了寻找具有类似融合机理的包膜病毒(如SARS冠状病毒，呼吸道合胞病毒及H5N1禽流感病毒等)抗病毒药物。

参考文献：

1.Zhu P，Liu J，Bess J Jr，Chertova E，Lifson JD，GriséH，Ofek GA，Taylor KA，Roux KH.2006.Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelopespikes.Nature 441(7095)：847-52.

2.Lu，M.，S.C.Blacklow，and P.S.Kim.1995.A trimeric structural domainof the HIV-1 transmembrane glycoprotein.Nat.Struct.Biol.2：1075-1082.

3.Chan，D.C.，D.Fass，J.M.Berger，and P.S.Kim.1997.Core structure ofgp41 from the HIV envelope glycoprotein.Cell 89：263-273.

4.Weissenhorn，W.，A.Dessen，S.C.Harrison，J.J.Skehel，and D.C.Wiley.1997.Atomic structure of the ectodomain from HIV-1 gp41.Nature 387：426-430.

5.Tan K，Liu J，Wang J，Shen S，Lu M.1997.Atomic structure of a thermostablesubdomain of HIV-1 gp41.Proc Natl Acad Sci U S A.94(23)：12303-8.

6.Chan，D.C.，C.T.Chutkowski，and P.S.Kim.1998.Evidence that a prominentcavity in the coiled coil of HIV type 1 gp41 is an attractive drug target.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 95：15613-15617.

7.Chan，D.C.and P.S.Kim.1998.HIV entry and its inhibition.Cell 93：681-684.

8.Liu，S.，W.Jing，B.Cheung，H.Lu，J.Sun，X.Yan，J.Niu，J.Farmar，S.Wu，and S.Jiang.2007.HIV gp41 C-terminal heptad repeat contains multifunctionaldomains.Relation to mechanisms of action of anti-HIV peptides.J.Biol.Chem.282：9612-9620.

9.Liu，J.，S.Wang，J.A.Hoxie，C.C.LaBranche，and M.Lu.2002.Mutationsthat destabilize the gp41 core are determinants for stabilizing the simianimmunodeficiency virus-CPmac envelope glycoprotein complex.J.Biol.Chem.277：12891-12900.

10.Follis，K.E.，S.J.Larson，M.Lu，and J.H.Nunberg.2002.Genetic evidencethat interhelical packing interactions in the gp41 core are critical for transitionof the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein to the fusion-activestate.J.Virol.76：7356-7362.

11.Este，J.A.and A.Telenti.2007.HIV entry inhibitors.Lancet 370：81-88.

12.Brass AL，Dykxhoorn DM，Benita Y，Yan N，Engelman A，Xavier RJ，LiebermanJ，Elledge SJ.2008.Identification of host proteins required for HIV infectionthrough a functional genomic screen.Science 319(5865)：921-6.

13.Liu，S.，S.Wu，and S.Jiang.2007.HIV entry inhibitors targeting gp41：frompolypeptides to small-molecule compounds.Curr.Pharm.Des 13：143-162.

14.Liu，S.，H.Lu，J.Niu，Y.Xu，S.Wu，and S.Jiang.2005.Different from theHIV fusion inhibitor C34，the anti-HIV drug Fuzeon(T-20)inhibits HIV-1 entry bytargeting multiple sites in gp41 and gp120.J.Biol.Chem.280：11259-11273.

15.Chinnadurai，R.，D.Rajan，J.Munch，and F.Kirchhoff.2007.Humanimmunodeficiency virus type 1 variants resistant to first-and second-version fusioninhibitors and cytopathic in ex vivo human lymphoid tissue.J.Virol.81：6563-6572.

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可以高效抑制HIV感染的多肽及其衍生物，该多肽是针对HIV侵入靶细胞的机制而设计，不但具有高活性，而且具有靶向性，可以极大地提高药物的抗病毒效果，降低给药剂量，从而达到提高疗效、降低毒副作用的目的。

本发明所提供的一个多肽，名称为P32，其氨基酸序列如序列表中的序列1所示。

为了提高其稳定性，所述序列1的第1位氨基酸残基连接有氨基端保护基，所述序列1的第32位氨基酸残基连接有羧基端保护基。

本发明所提供的另一个多肽是P32的衍生多肽，其氨基酸序列如序列表中的序列2所示。

为了提高其稳定性，所述序列2的第1位氨基酸残基连接有氨基端保护基，所述序列2的第33位的半胱氨酸残基连接有羧基端保护基。

序列表中的序列1由32个氨基酸残基组成，序列2由33个氨基酸残基组成。序列2与序列1相比，只在序列1的羧基端添加一个半胱氨酸残基，以便于连接胆固醇分子。

本发明所提供的多肽衍生物，是序列2所示衍生多肽的胆固醇修饰物，其氨基酸序列如序列表中的序列2所示，其中，所述胆固醇修饰物是所述序列2的第33位的半胱氨酸残基与胆固醇通过硫醚键连接得到的化合物。

为了提高其稳定性，所述序列2的第1位氨基酸残基连接有氨基端保护基，胆固醇连接有羧基端保护基。该胆固醇修饰物的名称为CHFI(Cholesterol-conjugated HIV fusioninhibitor)。其序列和结构为Ac-WNEMTWEEWEKKIEEYTKKIEEILKKSEEQQKC+Cholesterol-NH₂，在合成多肽的C末端化学偶联胆固醇分子。

其中，各个字母符号所代表的氨基酸残基的定义如下：W为色氨酸、N为天冬酰胺、E为谷氨酸、M为蛋氨酸、T为苏氨酸、K为赖氨酸、I为异亮氨酸、Y为酪氨酸、L为亮氨酸、S为丝氨酸、Q为谷氨酰胺、C为半胱氨酸；Cholesterol代表胆固醇、Ac代表乙酰基、NH₂代表氨基。

上述氨基端保护基可为乙酰基、氨基、马来酰基、琥珀酰基、叔丁氧羰基或苄氧或其他疏水基团或大分子载体基团中的任一基团；所述羧基端保护基可为NH₂、羧基、酰胺基或叔丁氧羰基或其他疏水基团或大分子载体基团中的任一基团。

含有上述多肽的编码基因，或含有所述编码基因的重组载体、重组细胞、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。

序列2所示衍生多肽的胆固醇修饰物的制备方法，包括以下步骤：1)制备氨基酸序列是序列表中序列2的多肽，将序列2的第33位的半胱氨酸残基与胆固醇通过硫醚键连接得到该胆固醇修饰物。

上述多肽、上述衍生多肽、或上述胆固醇修饰物可用于制备如下产品：

a)抗HIV的产品，如抗下述至少一种毒株的产品：HIV gp41自然突变株，包括L33S、L33M、L33V、S35F、Q39R、L54M、Q56K、Q56R、L54M/Q56K、L54M/Q56R和L34M/L54M/Q56R；HIVgp41诱导突变株包括I37Q/V38M、I37Q/V38Q、I37S/V38N和I37V/V38T；HIV gp41野生株；HIV毒株NL4-3；

b)治疗和/或预防艾滋病的产品，如药物或疫苗。

CHFI多肽的设计原理是基于HIV膜融合的原理，首先设计合成可以结合病毒gp41分子NHR  从而反式阻断CHR  与NHR  之间相互作用的多肽序列Ac-WNEMTWEEWEKKIEEYTKKIEEILKKSEEQQKC-NH₂，然后通过化学选择性极高的成硫醚反应对多肽的C末端进行胆固醇分子修饰，目的是使多肽药物可以与细胞脂膜上的脂筏(Lipid raft)相互作用，从而提高多肽的靶向性和生物利用度。CHFI由于末端的胆固醇修饰，使其具有细胞膜靶向性，并可以同时延长多肽的半衰期，以提高多肽药物的抗病毒活性。

CHFI多肽序列根据HIV亚型B标准病毒株NL4-3对应的32个氨基酸序列而设计，对其中18个氨基酸(56.25％)进行了替代，通过“盐桥”作用以增加多肽自身的螺旋稳定性和多肽与NHR结合的能力。同时，在多肽的C末端引入半胱氨酸(C)，以连接胆固醇分子。

本发明的多肽及其衍生物具有抗病毒活性强、具有靶向性、半衰期长、水溶性好、易于合成等重要优点。

附图说明

图1为分析型高效液相色谱图。

图2为CHFI的质谱图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下的优先实施例对本发明作详细说明，但不意味着限制本发明的内容。

实施例1.多肽的合成及修饰

1.1材料

所需化学试剂均来自主要的化学试剂供应商，使用前未经进一步纯化。Rink树脂(取代常数为0.44mmol/g)购自天津和成公司。

1.2多肽合成

所有多肽的合成均采用固相多肽合成法(Fmoc/tBu策略)，由羧基端向氨基端方向手动合成。

采用N-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸、采用Rink树脂(取代常数为0.44mmol/g)作为固相载体，用25％(体积百分含量)哌啶的DMF溶液脱除氨基保护基Fmoc，每次脱除步骤需进行两次，时长分别为8min和10min。接肽反应选用的缩合方法为DIPC/HOBt法和PyBOP法，氨基酸和活化试剂均采用3倍当量，反应时长为1小时，采用茚三酮定性显色(Kaiser法)监测反应进程。若某个氨基酸缩合反应不完全，适当延长反应时间或重复缩合一次，直至得到所需的目标肽段Ac-WNEMTWEEWEKKIEEYTKKIEEILKKSEEQQKC-NH2。

1.3切割及去侧链保护

使用切割试剂(三氟乙酸∶1，2-乙二硫醇∶苯甲硫醚∶苯酚∶H₂O∶三异丙基硅烷＝68.5∶10∶10∶5∶3.5∶1，v/v)将目标多肽从树脂上裂解下来并除去侧链保护基(30℃下切割4小时)。滤液加入到大量冷的无水乙醚中使多肽沉淀析出，离心。用乙醚洗涤数次后干燥，即得到多肽粗品。

1.4胆固醇修饰多肽的合成

溴乙酸胆固醇酯的合成参照Paolo Ingallinella等人公开发表的文献进行(PaoloIngallinella et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2009；106(14)：5801-6)。溴乙酸胆固醇酯通过化学选择性极高的成硫醚反应接枝到多肽链上，从而得到目标分子——胆固醇修饰多肽。具体方法为：205毫克按照步骤1.3中方法得到的粗肽(序列为Ac-WNEMTWEEWEKKIEEYTKKIEEILKKSEEQQKC-NH₂)溶解于7.5毫升DMSO，向其中加入溶于1毫升THF(三氟乙酸)中的68毫克溴乙酸胆固醇酯，随后500微升DIEA(二异丙基乙胺)加入到混合溶液中。反应1小时后反应完成，得到胆固醇化多肽(Ac-WNEMTWEEWEKKIEEYTKKIEEILKKSEEQQKC+Cholesterol-NH2)。

1.5多肽纯化及表征

采用HP1100型(美国安捷伦公司)反相高效液相色谱仪对步骤1.4制备得到的胆固醇化多肽进行成功纯化。色谱柱型号：Cosmosil 5C₄-AR(10×250mm)。色谱操作条件：线性梯度洗脱，洗脱液由流动相A和流动相B组成。流动相A为三氟乙酸和乙腈的水溶液，三氟乙酸的体积百分浓度为0.05％，乙腈的体积百分浓度为2％。流动相B为90％(体积百分浓度)乙腈水溶液。线性梯度洗脱由20％B到40％B，时间20分钟，洗脱流速为每分钟25毫升，紫外检测波长220纳米。冻干溶剂后得到蓬松状态的胆固醇化多肽纯品，其化学结构由MALDI-TOF质谱进行表征，而其纯度则由分析型高效液相色谱仪(流速：每分钟1毫升)给出。其中，分析型高效液相色谱仪的型号：岛津CBM-10A VP PULS，所采用的色谱柱的型号：Agela4.6*250mm C18。色谱操作条件：线性梯度洗脱，洗脱液由流动相A和流动相B组成。流动相A为三氟乙酸和乙腈的水溶液，三氟乙酸的体积百分浓度为0.05％，乙腈的体积百分浓度为2％。流动相B为三氟乙酸和乙腈的水溶液，三氟乙酸的体积百分浓度为0.05％，乙腈的体积百分浓度为90％。线性梯度洗脱由25％B到45％B，时间20分钟。

表1.分析型高效液相色谱的结果

MALDI-T质谱仪的型号：Perseptive Biosystems(制造商)VOYAGER-DE STR(型号)

检测条件：加速电压    20000v

          Grid        95％

          Guide wire  0.05

结果表明得到的胆固醇化多肽经由制备型反相高效液相色谱仪纯化，得13毫克纯品，收率为6.34％。得到的胆固醇化多肽纯品由分析型反相高效液相色谱仪表征得纯度为96.6％(图1和表1)，MALDI-TOF质谱测得其分子量为4743.79Da(理论值为4742.53Da)(图2)。将该纯品以CHFI表示。

下述实施例2-4中的T-20、C34、SFT、T1249、T267227、CP32M、P32均未被胆固醇修饰，均按照上述方法合成，它们的氨基端均连接有乙酰基，它们的羧基端均连接有氨基，它们的纯度均大于95％。

实施例2.CHFI多肽的抗病毒效果评价

2.1多肽对HIV毒株NL4-3的抑制作用：编码HIV-1病毒株NL4-3的分子克隆质粒pNL4-3由美国NIH AIDS Research&Reference Reagent Program提供(目录号：114)。采用QIAGEN公司的质粒提取试剂盒制备pNL4-3质粒，采用Invitrogen公司的Lipofectamine^TM2000转染试剂将pNL4-3质粒转染293T细胞，于37℃5％CO₂细胞培养箱中孵育6小时后换液，然后继续培养48小时。用移液器轻轻收集细胞培养瓶或细胞培养板中的上清，经0.45μm滤器过滤取上清，加入20％胎牛血清(FBS)，然后分装于聚丙烯管中，放置-80℃保存备用或直接进行病毒滴定。病毒滴定的步骤为，将病毒在96孔板中做5倍稀释，设置4个复孔8个梯度，终体积为100μl。将TZM-bl细胞用胰酶消化，细胞计数，用DMEM完全培养基将细胞稀释至10⁵个/ml，每孔加100μl，每孔细胞为10⁴个，加入DEAE-dextran，终浓度为15μg/ml。将96孔板放入细胞培养箱中，37℃，5％CO₂培养48小时。然后从细胞培养箱中取出96孔板，从上样孔中吸弃上清，加入30μl细胞裂解液，放置10min后加入100μl荧光素酶检测试剂。用移液器从每孔中吸出100μl液体，加于对应96孔白板中，于微孔板光度计读取发光值。用Reed-Muench法计算病毒滴度。为测定抗HIV多肽的抗病毒活性，将多肽按倍比(2倍)稀释铺入96孔板中，终体积为50μl，其中用50μl DMEM培养基替代多肽作为阴性对照。加入TZM-bl细胞100μl(10⁵个细胞/ml)含DEAE-dextran终浓度为15μg/ml，加入已获得的病毒50μl，每孔相当于100TCID₅₀。培养48h后，利用荧光素酶检测试剂(Promega)测定每孔的相对荧光单位(RLU)。

2.2检测抗HIV-1药物的数据分析：半数有效剂量是能引起50％最大效应(量反应)的剂量，用半数有效剂量(ED₅₀)表示。病毒检测抗HIV药物实验中得到的数据为相对光单位(RLU)数值，可以定量分析药物半数有效剂量(ED₅₀)，所有药物浓度均转化为log₁₀浓度值，每一浓度样品孔均计算平均RLU值，计算每一浓度样品荧光抑制率，计算公式：

数据分析利用GraphPad Prism Software

2.01软件，采用非线性回归分析中参数S型剂量方程分析每种药物的ED₅₀值及药物

2.3HIV假病毒的制备：

表2中的假病毒按照下述方法制备。

(1)将表达HIV ENV蛋白的质粒pcDNA3.1-ENV(将ENV编码基因插入pcDNA3.1(-)得到的重组表达质粒)和HIV骨架质粒pSG3^ΔENV(表达HIV基因组中除ENV之外的所有蛋白)(由美国国立卫生研究院NIH AIDS Research and Reference Reagent Program提供，Cat No：11051)，按质量比1∶2的比例转染293T细胞，同时设pSG3^ΔENV对照，即只转染相同量的pSG3ΔENV。

(2)于37℃、5％CO₂细胞培养箱中孵育6小时，换液后于细胞培养箱中继续孵育48小时，假病毒分泌至上清中。

(3)用移液器尽量多地吸出细胞培养瓶或细胞培养板中的上清，经0.45μm滤器过滤或1000g离心10min取上清，向其中加入FBS使其终浓度为20％，转移入聚丙烯管中于-80℃保存备用或直接进行病毒滴定。假病毒的滴定方法和多肽抗病毒活性的测定方法同HIV病毒株NL4-3。

2.4抗病毒活性检测结果

首先，采用实验室代表性HIV-1病毒株NL4-3评价了CHFI的抗病毒活性，同时以目前上市的药物T-20和文献中报道的第二代抗病毒多肽(C34、SFT、T1249、T267227、CP32M)作为对照进行平行检测。结果发现(表2)，CHFI抑制NL4-3感染的EC₅₀在0.01nM，即10pM水平，比T-20活性(EC₅₀＝74.71nM)高7471倍；比文献中报道的第二代抗病毒多肽活性高80-336倍。可见，CHFI具有极高度的抗病毒活性。为进一步评价CHFI的抗病毒活性，我们制备了44株HIV假病毒，包括国际代表毒株和中国目前流行的HIV毒株，其中有A亚型2株、B亚型10株、C亚型5株、A和E重组型即A/E亚型8株、B和C重组型即B/C亚型18株、E亚型1株。采用这些HIV假病毒的抗病毒实验表明(表3)，CHFI对测试的各种亚型病毒(包括A、B、C、AE、BC和E亚型)都具有高效的活性，显著高于T-20对照多肽和未经修饰的裸肽P32。因此，CHFI的抗HIV活性不但高效，而且广谱。结果说明，胆固醇修饰可以显著提高多肽的抗HIV活性。

表2.抗HIV多肽的活性比较

表3.CHFI对不同亚型HIV假病毒的抑制作用

实施例3.CHFI多肽对HIV耐药株具有显著的活性

HIV融合蛋白gp41NHR区域的氨基酸变异可以导致病毒对融合抑制剂的耐药。为进一步评价CHFI的抗HIV活性，我们用表4中的一套HIV gp41自然突变株和诱导突变株测试CHFI对病毒感染的抑制作用。自然突变株包括L33S、L33M、L33V、S35F、Q39R、L54M、Q56K、Q56R、L54M/Q56K、L54M/Q56R和L34M/L54M/Q56R，其制备方法见Chinnadurai等人公开发表的文献(Raghavan Chinnadurai，Jan Mu¨nch and Frank Kirchhoff.Effect ofnaturally-occurring gp41 HR1 variations on susceptibility of HIV-1 to fusioninhibitors.AIDS 2005，19：1401-1405)；诱导突变株包括I37Q/V38M、I37Q/V38Q、I37S/V38N和I37V/V38T，其制备方法见Chinnadurai等人公开发表的文献(Raghavan Chinnadurai，DeviRajan，Jan Mu¨nch，and Frank Kirchhoff.Human Immunodeficiency Virus Type 1 VariantsResistant to First-and Second-Version Fusion Inhibitors and Cytopathic in Ex VivoHuman Lymphoid Tissue.Journal of Virology，2007；81(12)：6563-6572)。表4中的实验结果表明，抗HIV多肽CHFI对这些测试的病毒株具有极高的活性，说明上述gp41自然的突变和诱导的突变对CHFI的抗病毒活性影响甚微。作为对照的T-20对上述多数病毒呈现显著的抗药性，其中L33M、L33V、S35F、Q39R、L54M、L34M/L54M/Q56R、I37Q/V38M、I37Q/V38Q、I37S/V38N和I37V/V38T突变株的抗药性尤其明显，说明这些单点突变或双点突变或三点突变可以导致病毒对T-20出现耐药。最近的研究表明，HIV gp41的I37T和N43K点突变或I37T/N43K双突变可以导致HIV对第二代HIV融合抑制剂SFT及T-20的显著耐药，见Liu等人公开发表的文献(Liu Z，Shan M，Li L，Lu L，Meng S，Cheng C，He Y，Jiang S，ZhangL.In Vitro selection and characterization of HIV-1 variants with increasedresistance to Sifuvirtide，a novel HIV-1fusion inhibitor.Journal of BiologicalChemistry，2011；286(5)：3277-87)。为此，我们采用携带I37T、N43K点突变或I37T/N43K双突变的HIV假病毒系统测试了这些突变对CHFI的抗病毒活性影响。从表5的结果可见，I37T和N43K点突变或I37T/N43K双突变对CHFI的活性影响不大，而可以导致对SFT和T-20的显著耐药。综合这些实验结果说明，CHFI对T-20耐药毒株具有高抑制活性，可以用于T-20耐药株感染的治疗。

表4.CHFI对HIV突变株的抑制作用

表5.CHFI对HIV耐药株的抑制作用

实施例4.CHFI多肽通过结合靶细胞膜发挥高效抗病毒作用

为分析CHFI的作用机制，我们以下述实验探讨CHFI是否通过作用靶细胞膜而发挥其高效的抗病毒活性。实验的基本步骤为：(1)用胰酶消化TZM-bl细胞后并计数，用DMEM完全培养基将细胞稀释至10⁵个/ml，按每孔加100μl(每孔细胞为10⁴个)铺在96孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO₂细胞培养箱培养过夜；(2)分别将多肽CHFI和P32从初始终浓度125nM进行3倍稀释，设10个梯度。加入细胞后于37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育30分钟，然后弃培养液并用1×PBS洗涤3次，以去掉未结合细胞膜的多肽，然后加入150μl DMEM完全培养基换液(洗涤组)。同时，设置不经洗涤的细胞孔作为对照(未洗组)；(3)两组(洗涤组和未洗组)分别加入50μl含有终浓度为15μg/ml的DEAE-dextran的假病毒SF162或NL4-3(相当于100 TCID₅₀)。阴性细胞对照孔加入50μl DMEM完全培养基。将96孔板放入细胞培养箱中，37℃，5％CO₂培养48小时；(4)然后，从细胞培养箱中取出96孔板，从上样孔中吸弃上清，加入30μl细胞裂解液，放置10分钟后加入70μl荧光素酶检测试剂(Promega)。用移液器从每孔中吸出70μl液体，加于对应96孔白板中，于Modulus^TMII微孔板多功能光度计中读取每孔的相对荧光单位(RLU)，并按上述公式计算每一浓度样品荧光抑制率及ED₅₀值。表6中的实验结果显示，CHFI加入靶细胞后经充分洗涤仍能保留其高效的抗HIV活性。针对病毒株NL4-3未洗涤组CHFI的活性为0.15±0.03nM，洗涤组为0.27±0.04nM，针对病毒株SF162未洗涤组活性为0.07±0.01nM，洗涤组为1.35±0.06nM。而作为对照的P32多肽，针对NL4-3和SF162在未洗涤组分别为2.34±0.56nM和3.84±0.50nM，但经洗涤后在浓度高达250nM时不能测出多肽的抗病毒活性。这个实验结果说明，胆固醇修饰的CHFI可以稳定地结合细胞膜，PBS充分洗涤不能去除CHFI，所以仍能保留其强大的HIV抑制活性，而未经修饰的对应裸肽P32不能有效结合细胞膜，其抗病毒活性容易被洗涤去除。因此，胆固醇修饰可以靶向多肽于细胞膜表面，更能有效地发挥多肽的抗病毒活性。这也是CHFI高活性的分子机制之一。

表6.CHFI靶向细胞膜发挥抗病毒活性(EC₅₀±SD，nM)

Claims (14)

1.多肽，其氨基酸序列如序列表中的序列1所示。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述序列1的第1位氨基酸残基连接有氨基端保护基，所述序列1的第32位氨基酸残基连接有羧基端保护基。

3.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于：所述氨基端保护基为乙酰基、氨基、马来酰基、琥珀酰基、叔丁氧羰基或苄氧；所述羧基端保护基为NH₂、羧基、酰胺基或叔丁氧羰基。

4.权利要求1所述多肽的衍生多肽的胆固醇修饰物，其氨基酸序列如序列表中的序列2所示，其特征在于：所述胆固醇修饰物是序列表中序列2的第33位的半胱氨酸残基与胆固醇通过硫醚键连接得到的化合物。

5.根据权利要求4所述的胆固醇修饰物，其特征在于：所述序列2的第1位氨基酸残基连接有氨基端保护基，胆固醇连接有羧基端端保护基。

6.根据权利要求5所述的胆固醇修饰物，其特征在于：所述氨基端保护基为乙酰基、氨基、马来酰基、琥珀酰基、叔丁氧羰基或苄氧；所述羧基端保护基为NH₂、羧基、酰胺基或叔丁氧羰基。

7.权利要求1所述多肽的编码基因。

8.表达权利要求7所述编码基因的重组载体。

9.表达权利要求7所述编码基因的重组细胞。

10.表达权利要求7所述编码基因的重组菌。

11.表达权利要求7所述编码基因的重组病毒。

12.权利要求4所述的胆固醇修饰物的制备方法，包括以下步骤：1）制备氨基酸序列是序列表中序列2的多肽，将序列2的第33位的半胱氨酸残基与胆固醇通过硫醚键连接得到权利要求4所述的胆固醇修饰物。

13.权利要求1或2所述的多肽在制备a）或b）中的应用：

a）抗HIV-1的药物，

b）治疗由HIV-1引起的艾滋病的药物。

14.权利要求4或5或6所述的胆固醇修饰物在制备a）或b）中的应用：

a）抗HIV-1的药物，

b）治疗由HIV-1引起的艾滋病的药物。

Images