CN102154238A - 一种有效降低人体胆固醇、血脂水平的脂肪酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明申请提供一种能够有效降低人体胆固醇、血脂水平的脂肪酶及其在制备抗高胆固醇血症和高脂血症的药物中的应用，通过高脂乳液灌胃大鼠，造成大鼠非酒精单纯性脂肪肝模型，考查该脂肪酶对大鼠非酒精单纯性脂肪肝的防治作用，结果表明，脂肪酶剂量组和模型对照组比较，可显著降低ALT活性及肝组织甘油三酯含量，同时也可减轻肝脂肪变性的程度，具有推广应用的价值。

Description

一种有效降低人体胆固醇、血脂水平的脂肪酶及其应用

技术领域

本发明申请涉及一种能够有效降低人体胆固醇、血脂水平的脂肪酶及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

脂肪酶，又称甘油三酯水解酶，是一类能催化长链脂肪酸甘油酯水解的酶，也可以催化该反应的逆反应，许多微生物分泌的脂肪酶还可以催化酯化反应、酯交换反应、醇解反应、酸解反应以及氨解反应等。

脂肪肝(Fatty Liver)作为一种病理学概念，系指肝内脂肪含量超过肝湿重的5％，或肝活检1/3以上肝细胞有脂肪变性且弥漫分布于全肝。其对应的临床概念是脂肪性肝病(Fatty Liver Disease，FLD)系指病变主体在肝小叶，以弥漫性肝细胞脂肪变(多为大泡性脂肪变)为病理特征的临床综合征。目前，按相关专业委员会的疾病诊断标准及有关共识可以明确的是：1、脂肪性肝病在临床上根据患者有无过量饮酒史，分酒精性脂肪性肝病(酒精性脂肪肝)和非酒精性脂肪性肝病；2、酒精性肝病临床诊断通常分为轻症酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化；3、非酒精性脂肪性肝病一般在病理上分为单纯性脂肪肝以及由其演变的脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化三种类型。

高胆固醇血症和高脂血症是目前广泛存在于现代人的一种综合病征，并且有逐渐年轻化的趋势，它也是高血压、冠心病和糖尿病的重要的危险因素。目前，在临床上缺乏针对高胆固醇血症和高脂血症的有效的治疗手段和药物，常用的药物的治疗效果也不理想。

发明内容

本发明申请即是针对上述不足之处，提供一种能够应用于临床，并且能够有效降低人体胆固醇和血脂水平的脂肪酶。

本发明申请的另一个目的是提供该种脂肪酶在制备降低人体胆固醇、血脂水平的药物中的应用。

具体来说，本发明申请所述的一种有效降低人体胆固醇、血脂水平的脂肪酶，其特征在于：所述的脂肪酶由以下的方法获得：

1、获得潮霉素抗性表达盒并克隆至目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；

2、分别扩增青霉的脂肪酶基因(PEL)、构巢曲霉的强启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PgpdA)和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子(TtrpC)，得到有强启动子驱动的PEL基因表达盒；

3、将该PEL基因表达盒插入到潮霉素抗性的重组质粒中，获得了含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体；

4、将含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体转化工程农杆菌，利用农杆菌介导转化法将PEL基因表达盒转化到青霉菌株中，获得高表达脂肪酶的青霉基因工程菌；

5、将所述的青霉基因工程菌以菌丝体或孢子悬液接入种子培养基，在25-35℃、200-300rpm条件下培养24小时后，以5％-20％接种量转入发酵培养基，在25-35℃、150-300rpm条件下发酵2天后，经分离纯化得到所述的脂肪酶。

其中，获得潮霉素抗性表达盒的方法包括PCR技术或限制性酶切技术。

获得青霉的脂肪酶基因(PEL)、构巢曲霉的强启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PgpdA)和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子(TtrpC)的方法包括PCR扩增或限制酶克隆或化学合成技术克隆。

其中所述的青霉菌为扩展青霉。

所述的目标质粒为下列之一：

pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3300或pHB。

其中，所以培养基的成分如下：

1、种子培养基(％)：黄豆饼粉4，玉米淀粉0.8，Na NO₃ 0.3，Na₂HPO₄ 0.2，K₂SO₄ 0.25，MgSO₄ 0.03，FeSO₄ 0.003；

2、发酵培养基(％)：黄豆饼粉6，玉米淀粉1，NaNO₃ 0.4，Na₂HPO₄ 0.2，K₂SO₄ 0.3，MgSO₄ 0.035，FeSO₄ 0.02，CaCO₃ 0.5，Na₂CO₃ 0.02。

本发明申请所述的脂肪酶在制备降低人体胆固醇、血脂水平的药物中的应用。

附图说明

图1为PV2+载体的结构示意图；

图2为pCAMBIA2300载体的结构示意图；

图3为pCAMBIA2302载体的结构示意图；

图4为PMD18-T::gpdA-Lip-TtrpC载体的结构示意图；

图5为pCHAMBIA2302::PgpdA-Lip-TtrpC最终载体的结构示意图；

图6为超表达载体pCHAMBIA2302::PgpdA-PEL-TtrpC的构建路线图；

图7为构建的超表达载体pCHAMBIA2302::PgpdA-PEL-TtrpC的PCR鉴定图谱；

其中，1-6：独立的农杆菌转化子、+：阳性对照、-：阴性对照、M：DL-2000Marker；

图8为青霉转基因菌株的PCR鉴定图谱；

其中，1-5：独立的农杆菌转化子、+：阳性对照、-：阴性对照、M：DL-2000Marker。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明申请所述的本发明申请所述的一种有效降低人体胆固醇、血脂水平的脂肪酶进行进一步描述，目的是为了公众更好的理解本发明的技术内容，而不是对所述技术内容的限制，事实上，在本发明精神实质内，对本发明申请所述方法的改进，目标质粒和限制性内切酶的替换都是本领域一般技术人员无需创造性的劳动即可获得的，因此都在本发明申请所要求保护的技术方案之内。

实施例一、超表达载体的构建

采用如下的步骤：

(1)利用限制性内切酶Sac I，Kpn I将潮霉素抗性表达盒从质粒PV2⁺上酶切出来(如图1所示)，片段经凝胶回收，克隆到pCAMBIA2300质粒(如图2所示)的相应酶切位点上，获得具有潮霉素抗性的重组质粒pCHAMBIA2302(如图3所示)；潮霉素表达盒也可来自其它含该序列的任何DNA或者直接合成，用于构建PEL基因超表达载体的质粒除pCAMBIA2300外，还可用能在丝状真菌中表达的质粒如pCAMBIA1300、pCAMBIA3300等pCAMBIA系列载体和pHB载体；

(2)根据扩展青霉菌P.expansium的脂肪酶基因PEL(AF330635)的序列设计引物(正向引物：TGACTAGT ATGTTGTTCAACTACCAATCTTT下划线的序列为限制性酶Spe I切点；反向引物：TGGATCCGCGGCCGCTTATCAGCTCAGATAGC下划线的序列为限制性酶Not I切点)，利用PCR技术扩增全基因序列，PCR反应条件为：95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 90s，35个循环；72℃ 10min；

(3)根据质粒pPAN7-1(Punt et al.1987 Gene 56：117-124)的序列设计引物(正向引物：GCTATCTGAGCTGATAAGCGGCCGCGGATCCACTTAACGTTA，下划线的序列为限制性酶Not I切点；反向引物：GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC，下划线的序列为限制性酶PmeI切点)，利用PCR技术扩增出色氨酸合成酶终止子TtrpC，PCR反应条件为：95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 60s，35个循环；72℃ 10min；

(4)取(2)和(3)的反应液各1μL作为模板，以(TGACTAGTATGTTGTTCAACTACCAATCTTT)作为正向引物；以(GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC)作为反向引物，进行PCR扩增，PCR的反应条件为：95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃150s，35个循环；72℃ 10min。反应结束后，将PCR扩增产物进行凝胶柱回收，并克隆到PMD-18-T：载体，获得中间载体PMD-18-T::PEL-TtrpC；

(5)根据质粒pPAN7-1(Punt et al.1987 Gene 56：117-124的序列设计引物(正向引物：GAGTCGAC GAATTCCCTTGTATCTCTACACAC下划线的序列为限制性酶Not I切点；反向引物：GAACTAGTCTGCTCAAGCGGGGTAGCTGTTAGT下划线的序列为限制性酶PmeI切点)利用PCR技术扩增强启动子PgpdA。PCR反应条件为：95℃5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 150s，35个循环；72℃ 10min。利用限制性内切酶Sal I和Spe I将PgpdA克隆到载体PMD-18-T::PEL-TtrpC的相应位点，获得中间载体PMD-18-T::PgpdA-PEL-TtrpC(如图4所示)；

(6)利用限制内切酶Sal I和Pme I对载体PMD-18-T::PgpdA-PEL-TtrpC进行消化，回收表达盒PgpdA-PEL-TtrpC，然后克隆至pCHAMBIA2302相应位点，获得最终载体pCHAMBIA2302::PgpdA-PEL-TtrpC(如图5所示)，整个的构建过程如图6所示；

(7)对含有最终载体pCHAMBIA2302::PgpdA-PEL-TtrpC的菌进行扩大培养，并抽提质粒，利用冻融法转化工程农杆菌EHA105，随机挑选6株转化子，以(TGACTAGT ATGTTGTTCAACTACCAATCTTT)作为正向引物；以(TGGATCCGCGGCCGCTTATCAGCTCAGATAGC)作为反向引物，以载体PMD-18-T::PEL-TtrpC为阳性对照，空EHA105为阴性对照，对这6株菌进行PCR鉴定，结果显示这6株菌均为阳性，见图7。

实施例二、青霉基因工程菌的获得

所述青霉基因工程菌的活动包括如下的步骤：

(1)挑取分离纯化后的野生型青霉接种于PDA平板上，于28℃培养20天左右，用无菌水洗下成熟孢子；

(2)将实例一中含终载体pCHAMBIA2302::PgpdA-PEL-TtrpC的工程农杆菌EHA105接种于含有链霉素、卡那霉素(均为100μg/ml)的LB液体培养基中28℃，200rpm过夜培养，用含有链霉素和卡那霉素(均为100μg/ml)的MM培养基重新活化，28℃，220rpm培养48小时。吸取适量的培养物5000rpm离心去上清，并用IM液体培养基洗涤，最后用IM液体培养基稀释至OD600＝0.15，然后在28℃，220rpm的条件下培养6-8小时，至OD600＝0.5-0.6；

(3)将第(1)步得到的新鲜孢子配制成1×10⁷个/mL浓度的悬浮液，随后取上述孢子悬液与步骤(2)中的工程农杆菌等体积混合，取200μL均匀涂布到铺有玻璃纸的IM固体培养基(含AS 200μg/mL)之上，28℃共培养60h，然后将玻璃纸反铺到含有潮霉素(100μg/mL转化选择抗生素)、头孢菌素(500μg/mL，抑制农杆菌生长抗生素)的PDA培养基上28℃培养2天，揭下玻璃纸，在28℃条件下培养1-3天，将抗潮霉素的转化子挑出接种到二筛培养基上，如稳定传代，即是所述的青霉基因工程菌，如此获得了30株青霉基因工程菌。随机挑选5株转化子进行扩大培养，并分别抽提基因组DNA，以(TGACTAGTATGTTGTTCAACTACCAATCTTT)作为正向引物；以(GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC)作为反向引物，以载体PMD-18-T::PEL-TtrpC为阳性对照，野生型青霉基因组DNA为阴性对照，对这5株菌进行PCR鉴定，结果显示这5株菌均为阳性，见图8。

MM培养基的成分如下所述：

1M K₂HPO₄-KH₂PO₄(PH7.0)10mL，M-N(MgSO₄·7H₂O 30g/L，NaCl 15g/L)20mL，1％CaCl₂·2H₂O 1mL，20％葡萄糖10mL，0.01％FeSO₄ 10mL，Spore element(ZnSO₄·7H₂O 100mg/L，CuSO₄·5H₂O 100mg/L，H₃BO₃ 100mg/L，MnSO₄·H₂O 100mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 100mg/L)5mL，20％NH₄NO₃ 2.5mL，无菌水941.5mL。

IM培养基的成分如下所述：

1M K-buffer(PH4.9)10mL，M-N(MgSO₄·7H₂O 30g/L，NaCl 15g/L)20mL，1％CaCl₂·2H₂O 1mL，20％葡萄糖10mL，0.01％FeSO₄ 10mL，Spore element(ZnSO₄·7H₂O 100mg/L，CuSO₄·5H₂O 100mg/L，H₃BO₃ 100mg/L，MnSO₄·H₂O 100mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 100mg/L)5mL，20％NH₄NO₃ 2.5mL，50％甘油10mL，1M MES(PH5.5)40mL，100mM AS(乙酰丁香酮)2mL，无菌水898.7mL

CM培养基：加一半IM培养基的葡萄糖量，外加1.5％琼脂，其它成份同IM培养基。

PDA培养基(g/L)：马铃薯，200；蔗糖，20；琼脂，15；PH自然。

实施例三、产脂肪酶能力对比实验

随机挑选实例2所得的青霉基因工程菌接种到PDA培养基上，培养10天后分别接入种子培养基50mL中，在28℃，210rpm摇床培养24h，然后以10％的接种量分别转入发酵培养基(250mL三角瓶装30mL发酵培养基)，在28℃，210rpm条件下发酵48h；然后将发酵液离心，取上清液进行脂肪酶活力检测。

利用酸碱滴定法对脂肪酶活力进行检测。

步骤：

取100mL三角瓶20只，分别加入4.0mL pH9.4的Gly-NaOH缓冲液和5.0mL橄榄油乳化液；放入震荡恒温水浴锅36℃水浴锅预热5分钟.酶液过滤后，用0.05mol/L pH9.4的Gly-NaOH缓冲液稀释使酶活为4-5u/mL后测定。往其中两个各加入1mL稀释好的酶液，缓慢振荡(60次/min)10分钟(精确计时).另外两瓶做空白对照.立即加入95％酒精20mL(空白对照加入1mL稀释好的酶液)，摇匀，加入10mL30％的氯化钠溶液，摇匀；用0.01mol/LNaOH溶液滴定样品使其与空白对照的pH相同，记下0.01mol/LNaOH用量。

计算

X＝A×B×1/T×n

式中：

X——样品的酶活力(u/g或u/mL)；

A——滴定样品时消耗标准0.01mol/LNaOH的体积(mL)；

B——滴定用NaOH的浓度(μmol/mL)

T——酶促反应时间(min)，

n——稀释倍数；

同时做两份平行，结果取平均值，所得结果表示至整数。平行试验相对误差不得超过5.0％。

PDA培养基(g/L)：马铃薯，200；蔗糖，20；琼脂，15；PH自然

种子培养基(％)：黄豆饼粉4，玉米淀粉0.8，Na NO₃ 0.3，Na₂HPO₄ 0.2，K₂SO₄ 0.25，MgSO₄ 0.03，FeSO₄ 0.003

发酵培养基(％)：黄豆饼粉6，玉米淀粉1，NaNO₃ 0.4，Na₂HPO₄ 0.2，K₂SO₄ 0.3，MgSO₄ 0.035，FeSO₄ 0.02，CaCO₃ 0.5，Na₂CO₃ 0.02

橄榄油乳化液的制取：4％PVA溶液和橄榄油为2∶1(v/v)，放到小三角瓶里(外包冰块)，调整为转速为10000转/分，一次乳化3分钟，间隔3分钟，共乳化3次。

转基因青霉和非转基因青霉的酶活力测定结果见下表

其中，WT为青霉野生型菌株，T1，T2，T3，T4，T5：为独立的青霉转化子，由图可知，转基因青霉的酶活力显著高于非转基因青霉的酶活力。

实施例四、所述脂肪酶防治大鼠非酒精性脂肪肝实验研究

一、试验材料

1.受试药物及试剂

脂肪酶(ZFM)受试药，0.4g/粒，每瓶40粒，每人每次3～4粒，一日3次，由中国医药工业科研开发促进会提供，批号：081223。成人(以60Kg体重计算)日用药量为4800mg，即人每日每千克体重用量为80mg/kg。实验时先用适量吐温研磨，再用0.5％的羧甲基纤维素钠(CMC)按设计浓度配制。

阳性药：易善复(多烯磷脂酰胆碱胶囊)，228mg/粒，2粒/次，3次/d，24粒/盒。塞诺菲安万特(北京)制药有限公司，批号：D8139，国药准字：H20059010。实验时先用适量吐温研磨，再用0.5％的羧甲基纤维素钠(CMC)按设计浓度配制。

胆固醇(分析纯级)，成都科龙化工试剂厂，批号：20071229；吐温-80(化学纯)，成都科龙化工试剂厂，批号：20050402；胆酸钠(Sodium Taurochlate)，上海Solarbio，批号：20060826；丙硫氧嘧啶片，50mg/片X 100片/瓶，上海复星朝晖药业有限公司，批号：071105，国药准字H31021082，1，2丙二醇(分析纯)，天津市大茂化学试剂厂，批号：20051128；羧甲基纤维素钠，上海三浦化工有限公司，批号：20010911。

2.实验分组及剂量设计

剂量分组见表1

表1大鼠脂肪肝试验剂量与分组

注：因提供的ZFM试验药按照给药周期不免设置三个剂量组，仅能设置一个剂量。

3.实验动物及场地

SD大鼠，雌雄各半，体质量230-250g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提拱；

实验场地：成都地奥制药集团有限公司新药部药理实验室。

4.主要仪器

LD2-5医用离心机，北京医用离心机厂；SHA-C恒温振荡器，常州国化电器有限公司；TMS-1024i全自动生化分析仪，日本国东京医疗公司；BP221型电子天平，SARTORIOU。

5.统计方法

用SPSS11.5统计软件进行统计分析。以(x±s)表示结果的数据用单因数方差分析进行组间比较，肝病理组间差异的显著性检验运用非参数检验分析方法。

二、实验方法及结果

1.实验方法

取SD大鼠，体重230～250g，64只，雌雄各半，随机分为4组，每组动物16只。将大鼠适应性饲养3天后，每天上午各组大鼠分别按表1设计剂量给药，空白组给予相应的CMC混悬液；下午除空白组外，其余各组大鼠分别灌胃给予高脂乳液(20％猪油、8％胆固醇、1.2％胆酸钠和0.6％丙硫氧嘧啶)1ml/100g。于第4周后末次给药后禁食16小时(不禁水)，眼眶取血，离心并分离血清，动态测定给药4周后的血清生化指标。

于第6周后末次给药后禁食16小时(不禁水)，称取大鼠体重，股动脉取血，离心并分离血清，-30℃低温保存，待测血清中的生化指标；另摘取肝脏并称重，观察大体外观后，每只大鼠在相同部位切下2g肝组织置于预冷的生理盐水中制成10％肝匀浆，4℃静置48h后，10000r/min，离心20min，取上清液，用全自动生化仪测定肝组织内甘油三酯的含量；另取肝左叶1块放于10％中性福尔马林溶液，待作肝组织病理学检查(固定后，石蜡包埋，切片作HE染色)。

2.实验结果

2.1常规观察

实验期间空白组动物活动、饮食正常、皮毛光亮整洁、体重持续增长，其余各组在灌胃给予高脂乳液两周后逐渐出现不同程度的精神萎靡、活动减少、体重增加缓慢、无力、蜷缩、饮食减少、皮毛凌乱、萎黄等。

2.2体重及肝脏器系数测定

结果提示，灌胃给予高脂乳液一定周期后，模型对照组体重增加缓慢，和空白对照组比较有显著性差异(**P＜0.01)，ZFM剂量组和易善复组在给药前4周均有抵抗大鼠体重增加缓慢的作用趋势，但无统计学意义。

另脂肪肝模型大鼠的肝脏指数较空白组明显升高(**P＜0.01)；ZFM剂量组和易善复组均有降低脂肪肝模型大鼠的肝脏器系数的作用趋势，但无意义。结果见表2

表2脂肪酶对大鼠脂肪肝体重及肝脏器系数的影响(X±S)

注：和模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01.

2.3血清中ALT、AST的含量动态测定   结果见表3

表3脂肪酶对大鼠脂肪肝血清中ALT、AST的含量的影响(X±S)

注：和模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01.

ALT主要存在于肝细胞浆内，肝内该酶的活性比血清高100倍，是最敏感的肝功能检测指标之一。AST在心肌中含量最高，肝脏为第二位，AST主要分布肝细胞的线粒体中，在发生肝损伤时，其漏出量较ALT低。

当急性肝炎和慢性肝炎和轻型，虽有肝细胞的损伤，肝细胞的线粒体仍保持完整，故释放入血的只有存在于肝细胞浆内的ALT，故ALT升高明显；重型肝炎和慢性肝炎的中型和重型，肝细胞的线粒体也遭到了严重的破坏，AST从线粒体和胞浆内释出，SAT也明显升高。

结果提示，在给予高脂乳液4周，6周后，脂肪肝模型大鼠血清中ALT的活性明显较空白组明显升高(**P＜0.01)；与模型对照组相比，ZFM剂量组及易善复组均能明显降低模型大鼠ALT活性(*P＜0.05)，表明ZFM具有一定的降酶作用。

但脂肪肝模型大鼠血清中AST未明显升高，原因可能为我们通过高脂乳液造成的非酒精性脂肪肝模型，该模型程度较轻，肝细胞的线粒体末遭到严重的破坏。

2.4肝脏肉眼大体外观变化情况

空白组肝脏肉眼观察呈鲜红色，边缘锐利，表面光滑。脂肪肝模型对照组肉眼见肝脏体积增大，边缘变钝，颜色呈奶黄色，切面油腻状，有明显脂肪颗粒，提示病变基础是肝细胞脂肪积聚；ZFM给药组织和易善复组肝脏肉眼观察有部分肝脏呈鲜红色。

2.5肝组织内甘油三酯的含量    结果见表4

表4脂肪酶对脂肪肝大鼠肝组织内TG的影响(X±S)

注：和模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01.

脂肪肝主是甘油三酯大量堆积于肝脏所致的一种病理改变，因此测定肝组织中甘油三酯的含量尤为重要，结果表示，非酒精性脂肪肝大鼠肝细胞内甘油三酯含量明显升高，与空白组比较，差异有高度显著性(**P＜0.01)，ZFM剂量组及易善复组，均能显著降低大鼠肝组织内甘油三酯的含量(*P＜0.05)，表明ZFM有一定的降低大鼠肝脂肪变性的作用。

2.6肝组织病理学分析(HE染色，100×)

表5肝组织病理损伤判断标准

表6肝病理分级结果(表中数为例数)

表7脂肪酶对脂肪肝大鼠肝脏病理的影响

注：与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

由表6表7可知，模型组与空白对照组比较，出现了肝细胞的脂肪变性，经非参数检验，具有极显著性差异(**P＜0.01)，表明造模成功；与模型组比较，脂肪酶剂量组及易善复组均可显著降低肝脂肪变性程度(*P＜0.05)，表明脂肪酶具有一定的降低脂肪肝大鼠脂肪变性的作用。

本次实验研究旨在通过高脂乳液灌胃大鼠，造成大鼠非酒精单纯性脂肪肝模型，考查该试验药对大鼠非酒精单纯性脂肪肝的防治作用，实验结果表明，模型对照组与空白对照组比较，肝脏器系数、ALT活性、肝组织甘油三酯含量均显著升高，同时肝病理也显示出现了一定的脂肪变性，按照专业委员会的诊断标准，该模型属于非酒精单纯性脂肪肝模型；脂肪酶剂量组和模型对照组比较，可显著降低ALT活性及肝组织甘油三酯含量，同时也可减轻肝脂肪变性的程度。

Claims (4)

1.一种有效降低人体胆固醇、血脂水平的脂肪酶，其特征在于：所述的脂肪酶由以下的方法获得：

(1)获得潮霉素抗性表达盒并克隆至目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；

(2)分别扩增青霉的脂肪酶基因(PEL)、构巢曲霉的强启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PgpdA)和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子(TtrpC)，得到有强启动子驱动的PEL基因表达盒；

(3)将该PEL基因表达盒插入到潮霉素抗性的重组质粒中，获得了含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体；

(4)将含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体转化工程农杆菌，利用农杆菌介导转化法将PEL基因表达盒转化到青霉菌株中，获得高表达脂肪酶的青霉基因工程菌；

(5)将所述的青霉基因工程菌以菌丝体或孢子悬液接入种子培养基，在25-35℃、200-300rpm条件下培养24小时后，以5％-20％接种量转入发酵培养基，在25-35℃、150-300rpm条件下发酵2天后，经分离纯化得到所述的脂肪酶。

2.根据权利要求1所述的一种有效降低人体胆固醇、血脂水平的脂肪酶，其特征在于：其中所述的青霉菌为扩展青霉菌。

3.根据权利要求1所述的一种有效降低人体胆固醇、血脂水平的脂肪酶，其特征在于：所述的目标质粒包括pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3300或pHB。

4.权利要求1所述的脂肪酶在制备降低人体胆固醇、血脂水平的药物中的应用。

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