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CN101896606B - 在重组酵母中生产二羧酸 - Google Patents

在重组酵母中生产二羧酸 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含下述核苷酸序列的重组酵母，所述核苷酸序列编码催化苹果酸转化成延胡索酸的异源酶。本发明还涉及生产二羧酸的方法，其中使用根据本发明的酵母。

Description

在重组酵母中生产二羧酸
本发明涉及包含下述核苷酸序列的重组酵母，所述核苷酸序列编码催化苹果酸转化为延胡索酸的酶，本发明还涉及用于生产二羧酸的方法。
二羧酸例如延胡索酸和琥珀酸是大量化学品的潜在前体。例如，琥珀酸可以被转化为1，4-丁二醇(BDO)、四氢呋喃和γ-丁酸内酯。衍生自琥珀酸的另一产物是通过连接琥珀酸和BDO制造的聚酯聚合物。
琥珀酸主要通过丁烷氢化的石油化学方法生产。这些方法被认为对环境有害，并且昂贵。琥珀酸的发酵生产可以是生产琥珀酸的一种有吸引力的替代性方法，其中可以使用可再生的原料作为碳源。
已知大量不同的细菌如Escherichia coli和瘤胃细菌Actinobacillus、Anaerobiospirillum、Bacteroides、Mannheimia或Succinimonas sp.能生产琥珀酸。对这些细菌菌株的代谢改造提高了琥珀酸产率和/或生产力，或者减少了副产物形成。
WO2007/061590公开了用于生产苹果酸和/或琥珀酸的丙酮酸脱羧酶阴性酵母，用丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶和苹果酸转运蛋白(MAE)对所述酵母加以转化。
尽管琥珀酸的发酵生产有所改进，但是仍然需要用于发酵生产琥珀酸的改进的微生物。
本发明的一个目的是用于生产二羧酸如延胡索酸和琥珀酸的替代性酵母。
根据本发明用编码下述核苷酸序列的重组酵母实现了这一目的，所述核苷酸序列编码催化苹果酸转化成延胡索酸的异源酶。惊讶地发现，通过根据本发明的重组酵母，生产出的二羧酸如延胡索酸和/或苹果酸的量与野生型酵母相比有所提高。
在本文中使用时，根据本发明的重组酵母被定义为下述细胞，所述细胞含有天然不存在于所述酵母中的核苷酸序列和/或蛋白质，或所述细胞经天然不存在于所述酵母中的核苷酸序列和/或蛋白质转化或遗传修饰，或者其含有内源核酸序列(或蛋白质)的额外一个或多个拷贝。野生型酵母在本文中被定义为重组酵母的亲本酵母。
优选地，编码酶的核苷酸序列表达后，催化苹果酸转化成延胡索酸的酶在胞质溶胶中有活性。
催化苹果酸转化成延胡索酸的酶优选地具有延胡索酸酶活性，优选地所述酶为EC4.2.1.2的延胡索酸酶。
催化苹果酸转化成延胡索酸的酶可以来自于任何合适的起源，例如细菌、酵母、真菌、原生动物或植物。优选地，根据本发明的酶来自于Rhizopus oryzae。
显示：Rhizopus oryzae的异源fumR基因在Aspergillus niger中的表达在氧受限的条件下不导致琥珀酸生产(PhD thesis，2006 W.A.de Jongh，Biocentrum TechnicalUniversity of Denmark)。令人惊讶的是，表达本发明的异源延胡索酸酶的酵母在氧受限的条件下生产与野生型酵母相比更大量的琥珀酸。
用于表示给定(重组)核酸或多肽分子和给定宿主生物或宿主细胞之间相互关系时，术语“同源的”被理解为表示天然情况下所述核酸或多肽分子即由相同物种的宿主细胞或生物生产，优选由相同品种或菌株的宿主细胞或生物生产。
关于核酸(DNA或RNA)或蛋白质使用时，术语“异源的”是指下述核酸或蛋白质，所述核酸或蛋白质不作为其出现的生物、细胞、基因组或DNA或RNA序列的一部分天然存在，或者存在于与其天然存在不同的细胞或基因组或DNA或RNA序列中的一个或多个位置中。异源核酸或蛋白质对引入它的细胞而言不是内源的，而是得自另一细胞或合成生产或重组生产的。
优选地，根据本发明的酵母是包含下述核苷酸序列的酵母，所述核苷酸序列编码催化苹果酸转化成延胡索酸的酶，其中所述酶与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列、优选与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％、75％，优选至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，优选所述酶包含SEQ ID NO：3。
序列同一性在本文中被定义为通过比较序列测定的两条或更多条氨基酸(多肽或蛋白质)序列或两条或更多条核酸(多核苷酸)序列之间的关系。通常，在被比较的序列的整个长度上比较序列。在本领域中，“同一性”也表示氨基酸或核酸序列之间的序列相关度，根据情况通过这类序列串之间的匹配测定。
测定同一性的优选方法被设计为在测试的序列之间给予最大匹配。测定同一性的方法被编码于公众可获得的计算机程序中。测定两条序列之间同一性的优选的计算机程序方法包括BLASTP和BLASTN，公众可从NCBI和其它来源(BLAST Manual，Altschul，S.，等，NCBI NLM NIHBethesda，MD 20894)获得。使用BLASTP的氨基酸序列比较的优选参数为缺口开放11.0，缺口延伸1，Blosum 62矩阵。使用BLASTP的核酸序列比较的优选参数为缺口开放11.0，缺口延伸1，DNA完全矩阵(DNA同一性矩阵)。
根据本发明编码在胞质溶胶中催化苹果酸转化成琥珀酸的酶的核苷酸序列也可以通过它们在中度杂交条件或优选严格杂交条件下与编码SEQID NO：1或SEQ ID NO：3酶的核苷酸序列杂交的能力来定义。严格杂交条件在本文中定义为下述条件：所述条件允许至少约25个、优选约50个核苷酸、75或100个、优选约200或更多个核苷酸的核酸序列，在约65℃的温度下，在包含约1M盐的溶液(优选6xSSC(氯化钠、柠檬酸钠))或具有与之相当的离子强度的任何其它溶液中杂交，以及在65℃下，在包含约0.1M或更少盐、优选0.2x SSC的溶液或具有与之相当的离子强度的任何其它溶液中洗涤。优选地，杂交过夜进行，即至少进行10小时，以及优选地，洗涤进行至少1小时，其中至少将洗涤溶液更换两次。这些条件通常会允许具有约90％或更多序列同一性的序列的特异性杂交。
中度条件在本文中定义为下述条件，所述条件允许至少50个核苷酸、优选约200或更多个核苷酸的核酸序列，在约45℃的温度下，在包含约1M盐的溶液(优选6xSSC)或具有与之相当的离子强度的任何其它溶液中杂交，以及室温下，在包含约1M盐的溶液(优选6xSSC)或具有与之相当的离子强度的任何其它溶液中洗涤。优选地，杂交过夜进行，即至少进行10小时，以及优选地，洗涤进行至少进行1小时，其中至少将洗涤溶液更换两次。这些条件通常会允许具有多达50％序列同一性的序列的特异性杂交。本领域技术人员应当能够调整这些杂交条件，从而特异性地鉴定同一性在50％和90％之间变化的序列。
在本文中使用时，术语“基因”表示含有核酸聚合酶(在真核生物中为RNA聚合酶II)的模板的核酸序列。基因被转录为mRNA，随后被翻译为蛋白质。
在本文中使用时，术语“核酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚体，即多核苷酸，除非另有限制，其包括具有天然核苷酸主要特性的已知类似物，因为它们能够以类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交(例如肽核酸)。多核苷酸可以是天然或异源的结构基因或调节基因的全长或亚序列。除非另有说明，该术语包括特定的序列及其互补序列。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，表示氨基酸残基的多聚体。该术语适用于下述氨基酸多聚体，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物，还适用于天然存在的氨基酸多聚体。天然存在的氨基酸的这类类似物的关键特征是，当掺入蛋白质中时，蛋白质与下述抗体特异反应，所述抗体针对相同但是完全由天然存在的氨基酸组成的蛋白质产生。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”也包括修饰，所述修饰包括但不限于糖基化、脂质结合、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化和ADP-核糖基化。
在本文中使用时，术语“酶”被定义为在细胞例如酵母细胞中催化(生物)化学反应的蛋白质。
为了提高引入的酶在本发明的酵母中以活性形式表达的可能性，可以改变相应的编码核苷酸序列，从而使其密码子选择针对选用的酵母细胞而优化。用于密码子优化的若干方法是本领域已知的。针对酵母优化核苷酸序列密码子选择的一种优选的方法是WO2008/000632中公开的密码子对优化技术。密码子对优化是在宿主细胞中生产多肽的一种方法，其中在其密码子使用方面(特别是使用的密码子对)，对编码多肽的核苷酸序列进行了修饰、，从而获得编码多肽的核苷酸序列提高的表达和/或提高的多肽生产。密码子对被定义为编码序列中两个相继三联体(密码子)的集合。
通常，编码酶(例如催化苹果酸转化成延胡索酸)的核苷酸序列与使得相应核苷酸序列在本发明酵母中充分表达的启动子可操作地连接，从而赋予酵母生产延胡索酸和/或琥珀酸的能力。
在本文中使用时，“可操作地连接”是指处于功能性关系中的多核苷酸元件(或编码序列或核酸序列)的连接。当核酸序列被放置为与另一核酸序列处于功能性关系时，其是“可操作地连接”的。例如，如果启动子或增强子能影响编码序列的转录，则其与编码序列可操作地连接。
在本文中使用时，术语“启动子”是指下述核酸片段，其发挥控制一个或多个基因转录的功能，就转录方向而言位于基因转录起点的上游，并且在结构上通过DNA-依赖型RNA聚合酶结合位点、转录起点和本领域技术人员已知的任何其它DNA序列的存在而被识别。“组成型”启动子是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子。
能够用于实现编码酶(例如催化苹果酸转化成延胡索酸的酶)的核苷酸序列表达的启动子对编码待表达的酶的核苷酸序列而言可以不是天然的，即对与之可操作地连接的核苷酸序列(编码序列)而言异源的启动子。优选地，所述启动子对宿主细胞而言是同源的，即内源的。
本文上下文中合适的启动子既包括组成型又包括诱导型的天然启动子以及经改造的启动子，所述启动子是本领域技术人员公知的。真核宿主细胞中合适的启动子可以是GAL7、GAL10或GAL 1、CYC1、HIS3、ADH1、PGL、PH05、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI和AOX1。其它合适的启动子包括PDC、GPD1、PGK1、TEF1和TDH。
通常，编码酶的核苷酸序列包含终止子。本发明中可以使用在真核细胞中有功能的任何终止子。优选的终止子得自宿主细胞的天然基因。合适的终止子序列是本领域公知的。优选地，这类终止子与下述突变组合，所述突变防止本发明宿主细胞中无义介导的mRNA衰退(见例如Shirley等，2002，Genetics 161：1465-1482)。
在一个优选的实施方案中，过量表达编码催化苹果酸转化成延胡索酸的酶(例如延胡索酸酶)的核苷酸序列，从而通过根据本发明的重组酵母实现提高的延胡索酸和/或琥珀酸生产。
本领域可获得多种手段用于在本发明的酵母细胞中过量表达编码酶的核苷酸序列。具体地，可以通过提高细胞中编码酶的基因的拷贝数，例如通过在细胞的基因组中整合额外的基因拷贝，通过表达来自着丝粒载体、来自附加体多拷贝表达载体的基因，或者通过引入包含多拷贝基因的(附加体)表达载体，来过量表达编码酶的核苷酸序列。优选地，用(强)组成型启动子实现根据本发明的酶的过量表达。
核酸构建体可以是质粒，例如低拷贝质粒或高拷贝质粒。根据本发明的酵母可包含单个、但是优选地包含多个拷贝的编码延胡索酸酶的核苷酸序列，例如通过多拷贝的核苷酸构建体来实现。
核酸构建体可以保持为附加体，并因此包含用于自主复制的序列，例如常染色体复制序列序列。合适的附加体核酸构建体可例如基于酵母2μ或pKD1质粒(Gleer等，1991，Biotechnology 9：968-975)或AMA质粒(Fierro等，1995，Curr Genet.29：482-489)。或者，可以将每种核酸构建体以一个或多个拷贝整合进酵母细胞的基因组中。进入细胞基因组的整合可以通过非同源重组随机发生，但是优选地，可以如本领域所公知的，通过同源重组将核酸构建体整合进细胞的基因组中(见例如WO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635 574和US 6,265,186)。
在一个优选的实施方案中，在编码核苷酸序列表达后，催化苹果酸转化成延胡索酸的酶在胞质溶胶中有活性。就真核细胞对延胡索酸和/或琥珀酸的高生产力而言，酶的胞质溶胶活性是优选的。
编码催化苹果酸转化成琥珀酸的酶的核苷酸序列可包含过氧化物酶体或线粒体靶向信号，例如通过Schlüter等，Nucleic acid Research 2007，Vol25，D815-D822公开的方法所确定的。在酶包含靶向信号的事件中，优选地，根据本发明的酵母包含截短形式的酶，其中所述靶向信号被去除。
根据本发明的酵母优选地属于Saccharomyces、Pichia、Kluyveromyces或Zygosaccharomyces属之一。更优选地，真核细胞是Saccharomycescerevisiae、Saccharomyces uvarum、Saccharomyces bayanus、Pichiastipidis、Kluyveromycesmarxianus、K.lactis、K.thermotolerans或Zygosaccharomyces bailii。
优选地，酵母是Saccharomyces cerevisiae，优选是包含SEQ ID NO：4的Saccharomyces cerevisiae。
除了编码催化苹果酸转化成延胡索酸的本发明酶的核苷酸序列以外，根据本发明的重组酵母可包含其它遗传修饰，例如同源核苷酸序列中的突变、缺失或断裂，和/或用编码同源或异源的下述酶的核苷酸序列转化，所述酶在细胞中催化反应，导致提高的朝向延胡索酸和/或琥珀酸的通量。例如可有利地引入、遗传修饰和/或过量表达下述异源和/或同源核苷酸序列，所述核苷酸序列编码i)催化磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸转化成草酰乙酸的酶；ii)催化从草酰乙酸转化成苹果酸的苹果酸脱氢酶；或iii)催化延胡索酸转化成琥珀酸的延胡索酸还原酶。优选地，i)、ii)和iii)的酶在胞质溶胶中表达。胞质溶胶表达可以如本文之前所述，通过线粒体或过氧化物酶体靶向信号的缺失或修饰来实现。另外，如上文所述的分子DNA技术(例如过量表达和密码子优化)也适用于这些核苷酸序列。
可以用催化C3到C4碳分子反应的任何合适的核苷酸序列转化或遗传修饰酵母，所述反应例如为磷酸烯醇丙酮酸(PEP，C3)到草酰乙酸(OAA，C4)和丙酮酸(C3)到OAA或苹果酸。合适的酶是催化PEP转化成OAA的PEP羧激酶(EC 4.1.1.49，EC 4.1.1.38)和PEP羧化酶(EC 4.1.1.31)；催化丙酮酸反应成为OAA的丙酮酸羧化酶(EC 6.4.1.1.)；或催化丙酮酸反应成为苹果酸的苹果酸酶(EC 1.1.1.38)。
优选地，根据本发明的酵母中的内源延胡索酸酶活性被降低，例如通过缺失，断裂或突变编码酵母内源延胡索酸酶的基因来实现。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的细胞还包含同源或异源的苹果酸脱氢酶(MDH)。优选地，通过本文所述本领域已知的方法通过过量表达来提高苹果酸脱氢酶的活性。优选地，如例如WO2007/061590中所述，在胞质溶胶中表达MDH。
优选地，根据本发明的酵母是其中至少一种编码醇脱氢酶的基因没有功能的酵母。无功能的醇脱氢酶在本文中用于描述下述酵母，其中通过突变、断裂或缺失，例如通过Gueldener等2002，Nucleic Acids Research，Vol.30，No.6，e23所公开的方法，使编码醇脱氢酶的基因失活。优选地，所述酵母是Saccharomyces cerevisiae，其中编码醇脱氢酶的一个或多个adh1和/或adh2基因失活。
优选地，根据本发明的酵母还包含至少一种编码无功能的甘油-3-磷酸脱氢酶的基因。无功能的甘油-3-磷酸脱氢酶在本文中用于描述下述酵母细胞，其中通过突变、断裂或缺失使编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因失活，导致与野生型酵母相比甘油形成降低。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的酵母可以能够在本领域已知的任何合适的碳源上生长，并将其转化为二羧酸，例如延胡索酸和/或琥珀酸。酵母可以能够直接转化植物生物质、纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖和甘油。因此，一种优选的酵母细胞表达将纤维素转化为葡萄糖单体和将半纤维素转化为木糖和阿拉伯糖单体的酶，例如纤维素酶(内切纤维素酶和外切纤维素酶)和半纤维素酶(例如内切和外切木聚糖酶、阿拉伯糖酶)，能够将果胶转化为葡糖醛酸和半乳糖醛酸的果胶酶，或将淀粉转化成葡萄糖单体的淀粉酶。酵母表达这类酶的能力可已通过对酵母的遗传修饰获得。优选地，酵母能够转化选自下组的碳源，所述组由葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖、棉子糖(raffinose)和甘油组成。
在另一方面中，本发明涉及用于制备选自延胡索酸和琥珀酸的二羧酸的方法，包括在存在合适的发酵培养基时发酵根据本发明的酵母。合适的发酵培养基是本领域技术人员已知的。优选地，根据本发明的方法中生产的二羧酸是琥珀酸。
发现：在生产选自延胡索酸和琥珀酸的二羧酸的方法中，使用根据本发明的酵母是有利的，因为与野生型酵母相比能生产更高量的琥珀酸和/或延胡索酸。优选地，根据本发明的酵母与野生型酵母相比，生产至少1.1、优选至少1.2、1.3、1.4、1.5或至少2倍的琥珀酸和/或延胡索酸。
根据本发明的方法可以在需氧和缺氧的条件下进行。优选地，所述方法在缺氧条件下或微需氧或氧受限的条件下进行。缺氧发酵方法在本文中被定义为下述发酵方法，其在无氧时进行，或其中基本无氧(优选地少于5、2.5或1mmol/L/h)被消耗，并且其中有机分子发挥电子供体以及电子受体两种作用。
氧受限的发酵方法是其中氧消耗受从气体到液体的氧转移限制的方法。氧限制程度是通过进入气流的量和组成以及使用的发酵装置的实际混合/质量转移性能决定的。优选地，在氧受限条件下的方法中，氧消耗速率至少约为5.5mmol/L/h，更优选地至少或约为6mmol/L/h，甚至更优选地至少或约为7mmol/L/h。
根据本发明的用于生产二羧酸的方法可以在1和9之间的任何合适的pH下进行。优选地，发酵液中的pH在2和7之间，优选地在3和5之间。发现能够在低pH下进行根据本发明的方法是有利的，因为这能防止细菌污染。另外，因为延胡索酸和/或琥珀酸生产期间的pH降低，将pH保持在期望水平需要更少量的滴定剂。
可以进行根据本发明的方法的合适温度在5℃和60℃之间，优选地在10℃和50℃之间，更优选地在15℃和35℃之间，更优选地在18℃和30℃之间。本领域技术人员已知哪些最适温度适合用于发酵特定的酵母细胞。
优选地，通过本领域已知的合适方法，例如通过结晶或铵沉淀，从发酵液中回收二羧酸例如延胡索酸和琥珀酸。
优选地，在根据本发明的方法中制备的二羧酸被进一步转化成期望的产物，例如药物、化妆品、食物、饲料或化学制品。在生产琥珀酸的情况下，琥珀酸可以被进一步转化成聚合物，例如聚丁二酸丁二醇酯(polybutylene succinate，PBS)或由其衍生的任何合适的聚合物。
遗传修饰
标准的遗传技术例如宿主细胞中酶的过量表达、宿主细胞的遗传修饰或杂交技术是本领域已知的方法，例如如Sambrook和Russel(2001)″Molecular Cloning：ALaboratory Manual(第三版)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press或F.Ausubel等编，″Currentprotocols in molecular biology″，GreenPublishing and Wiley Interscience，NewYork(1987)中所述。用于真菌宿主细胞转化、遗传修饰等等的方法从EP-A-0 635 574、WO 98/46772、WO 99/60102和WO 00/37671、WO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635 574和US 6,265,186中已知。
附图描述
图1：pGBS415SUS-01的质粒图谱，其编码用于在Saccharomycescerevisiae中表达的来自Rhizopus oryzae的延胡索酸酶。CPO表示密码子对经优化。
图2：pGBS416FUM-1的质粒图谱，其编码用于在Saccharomycescerevisiae中表达的来自Rhizopus oryzae的延胡索酸酶。CPO表示密码子对经优化。
以下实施例仅用于阐述的目的，不应被理解为限制本发明。
实施例
实施例1
使用E.coli DH10B作为克隆载剂，在Saccharomyces cerevisiae中克隆来自 Rhizopus oryzae的延胡索酸酶
1.1.表达构建体
使用SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)Bendtsen，J.等(2004)Mol.Biol.，340：783-795和TargetP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)Emanuelsson，O.等(2007)NatureProtocols 2，953-971，针对信号序列的存在，分析来自Rhizopus oryzae的延胡索酸酶[E.C.4.2.1.2]，GenBank查询号469103。
鉴定了蛋白质最初23个氨基酸中推定的线粒体靶向序列。为了避免S.cerevisiae中可能的到线粒体的靶向，从SEQ ID NO：1中去除最初23个氨基酸(SEQ ID NO：2是相应的核苷酸序列)并再引入甲硫氨酸氨基酸，得到SEQ ID NO：3。针对S.cerevisiae，如PCT/EP2007/05594中所公开的，对SEQ ID NO：3进行密码子对方法。将得到的序列SEQ ID NO：4置于组成型TDH 1启动子序列SEQ ID NO：5之后和TDH 1终止子序列SEQ IDNO：6之前，并添加便利的限制性位点。将SEQ ID NO：4中的终止密码子修饰为TAAG。得到的序列在Sloning(Puchheim，德国)合成。用BamHI/NotI限制性消化S.cerevisiae表达载体pRS415(SirkoskiR.S.和Hieter P，Genetics，1989，122(1)：19-27)后，随后在该载体中连接由延胡索酸(来源Rhizopus oryzae)合成基因构建体组成的BamHI/NotI限制性消化片段，创建表达构建体pGBS415SUS-01(图1)。使用连接混合物转化E.coli DH 1OB(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS415SUS-01(图1)。
将构建体pGBS415SUS-01转化进S.cerevisiae菌株CEN.PK113-6B(MATA ura3-52leu2-112 trp1-289)、RWB066(MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289 adh1::lox adh2::Kanlox)和RWB064(MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289adh1::lox adh2::lox gpd1::Kanlox)。将转化混合物涂布于补充有合适氨基酸的酵母氮基础(YNB)w/o AA(Difco)+2％葡萄糖上。将转化体接种进补充有合适氨基酸的包含葡萄糖的Verduyn培养基(Verduyn等，1992，Yeast.Jul；8(7)：501-17)中，并在摇瓶中于需氧、缺氧和氧受限的条件下生长。用于缺氧培养的培养基补充有溶于乙醇中的0.42g/l Tween 80和0.01g/l麦角固醇(Andreasen和Stier，1953，J.cell.Physiol，41，23-36；Andreasen和Stier，1954，J.Cell.Physiol，43：271-281)。所有酵母培养物在30℃下于250-280rpm的摇动培养箱中生长。在不同的孵育时间取出培养物的小份试样，离心并如下文所述通过HPLC分析培养基的草酸、苹果酸、延胡索酸和琥珀酸形成。
1.2HPLC分析
进行HPLC来测定不同种类样品中有机酸和糖的测定。PhenomenexRezex-RHM-单糖柱上的分离原则基于使用反相机制的离子交换、离子排除和尺寸排除。检测通过示差折射系数(differential refractive index)和紫外检测器进行。
实施例2：在Saccharomyces cerevisiae中克隆来自Rhizopus oryzae的延胡索酸 酶。
2..1表达构建体
以与实施例1.1中所公开相似的方式，将来自Rhizopus oryzae的延胡索酸酶(SEQID NO：4)连接进S.cerevisiae表达载体pRS416(Sirkoski R.S.和Hieter P，Genetics，1989，122(1)：19-27)中。使用连接混合物转化E.coliTOP10(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS416FUM-1(图2)。
2.2.转化和微量滴定板(MTP′s)生长实验
将构建体pGBS416FUM-1转化进酿酒酵母菌株CEN.PK1 13-5D(MATA ura3-52)中。作为阴性对照，将空载体pRS416转化进菌株CEN.PK 113-5D中。将转化混合物涂布在酵母氮基(YNB)w/o AA(Difco)+2％葡萄糖上。将以下数量的各转化体一式两份(in duplo)接种于96深孔MTP中250微升包含2％葡萄糖的Verduyn培养基(Verduyn等，1992，Yeast.Jul；8(7)：501-17)中，并在30℃、550rpm和80％的湿度下，在Infors微量培养板摇动培养箱中预培养：12个pGBS416FUM-1(FUMR)和24个pRS416空载体对照转化体。3天后将MTP孔中存在的25微升预培养物转移至含有Verduyn培养基的新的96深孔MTP中，所述Verduyn培养基含有葡萄糖和CaCO3(终浓度：250微升总体积中葡萄糖10％，CaCO3 1％ w/v)。在30℃、550rpm和80％湿度下在Infors微量培养板摇动培养箱中生长3天和7天后，将MTP以2000rpm离心2分钟，使用Multimek 96(Beckman)收获200微升上清液，并如实施例1.2中所述通过HPLC分析上清液中琥珀酸的存在。结果展示于表1中。
表1.在Saccaromyces cerevisae CEN.PK 113-5D中插入来自Rhizopusoryzae的延胡索酸酶(FumR)对培养3天和7天后琥珀酸生产水平的影响。
用载体转化的CEN.PK 113- 3天后的琥珀酸 7天后的琥珀酸
5D： (mg/l) (mg/l)
pRS416 138±18(n＝48) 203±48(n＝48)
pGBS416FUM-1 156±10(n＝24) 317±59(n＝24)
表1中的结果显示，引入并过量表达来自Rhizopus oryzae的延胡索酸酶导致3天的孵育后琥珀酸生产水平显著提高至1.13倍(p＝4.71 E-7，学生t-检验)。孵育7天后，引入并过量表达来自Rhizopus oryzae的延胡索酸酶导致琥珀酸生产水平显著提高至1.56倍(p＝4.49 E-10，学生t-检验)。

Claims (4)

1.包含下述核苷酸序列的重组酵母，所述核苷酸序列编码催化苹果酸转化成延胡索酸的异源延胡索酸酶，其中所述酶与SEQ ID NO:3具有至少99％的同一性，并且在所述核苷酸序列表达后所述酶在胞质溶胶中有活性，其中所述酶来自于Rhizopus oryzae。
2.根据权利要求1的酵母，其属于Saccharomyces、Pichia、Kluyveromyces、Zygosaccharomyces之一的属。
3.根据权利要求1到2中任一项的酵母，其为包含SEQ ID NO:4的Saccharomyces cerevisiae。
4.用于生产琥珀酸的方法，所述方法包括在合适的发酵培养基中发酵根据权利要求1到3中任一项的酵母，其中生产出所述琥珀酸。
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