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CN101687911A - 抗病毒肽的半胱磺酸衍生物 - Google Patents

抗病毒肽的半胱磺酸衍生物 Download PDF

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CN101687911A CN200880022163A CN200880022163A CN101687911A CN 101687911 A CN101687911 A CN 101687911A CN 200880022163 A CN200880022163 A CN 200880022163A CN 200880022163 A CN200880022163 A CN 200880022163A CN 101687911 A CN101687911 A CN 101687911A
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glu
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马丁·罗比塔耶
多米尼克·P·布赖顿
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ConjuChem Biotechnologies Inc
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Abstract

本发明涉及水溶解度改善的C34肽衍生物，它们是病毒感染的抑制剂和/或表现出抗融合性质。具体来说，本发明涉及对人类免疫缺陷病毒(HIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、人类副流感病毒(HPV)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)具有抑制活性的C34衍生物，治疗相应病毒感染的作用持续时间长。

Description

抗病毒肽的半胱磺酸衍生物
与相关申请的交叉参考
本申请要求2007年5月16日提交的美国顺序号No.60/938,380和No.60/938,394的优先权。上述申请的内容在此以其全文引为参考。
发明背景
I型人类免疫缺陷病毒(HIV-I)进入未感染细胞包括三个主要步骤：(i)gp120与CD4受体的结合，(ii)随后与共同受体CXCR4或CCR5结合，以及(iii)HIV-I跨膜糖蛋白gp41的胞外结构域的一系列构象变化，这些变化对于引发膜融合事件、最终允许感染发生是重要的。诸如呼吸道合胞病毒(RSV)、3型人类副流感病毒(HPIV-3)、麻疹病毒和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)这样的病毒与HIV显示出高度的结构和功能相似性，包括gp41样蛋白。
几种小分子药物候选物，包括抑制与CD4或与CCR5共同受体结合的那些，正处于人类临床实验中或者快要上市(Meanwell NA，Kadow JF(2003)Curr Opinion Drug Disc & Develop 6：45 1-46 1；Olson WC，Maddon PJ(2003)Curr Drug Targets-Infectious Disord 3：283-294)。已知有几种合成的肽抑制或破坏与膜融合相关的事件，包括例如抑制反转录病毒向未感染细胞传播。例如，合成肽C34、T1 249、DP-107和T-20(DP-178)源于gp41内分开的结构域，是HIV-I感染和HIV诱导的细胞-细胞融合的有效抑制剂。
T-20(DP-178，恩夫韦地(enfuvirtide)，
Figure A20088002216300101
Trimeris/RocheApplied Sciences)是基于HIV-I gp41的CHR序列的合成肽，被认为靶定gp41的构象重排。已经广泛地认为，T-20抑制是由于它与gp41的NHR区域的疏水沟结合、导致抑制六螺旋束形成的能力(Kliger Y，Shai Y(2000)J Mol Biol 295：163-168)。与这种观点相反，最近的研究提示，T-20能够靶定gp41和gp120中的多个位点(Liu S等，(2005)J Biol Chem280：11259-11273)。例如，T-20在膜的表面上结合并低聚化，由此抑制了gp41在受感染细胞的质膜上的募集和低聚化(Munoz-Barroso I等，(1998)J Cell Biol 140：315-23；Kliger Y等，(2001)J Biol Chem276：1391-1397)。此外，已经显示，紧邻肽序列为666WASLWNWF673的跨膜结构域的区域内的gp41的胞外结构域，构成了与gp41的NHR相比，对T-20具有更高亲和性的位点(Munoz-Barroso I等，(1998)同上，140：315-23；Kliger Y等，(2001)同上)。
另一个C-肽C34，由与T-20重叠但是包含gp41卷曲螺旋腔结合残基628WMEW631的肽序列构成，已知其与gp41的CHR竞争NHR区域的疏水沟(Liu S等，(2005)J Biol Chem 280：11259-11273)。
尽管在本技术领域描述的许多抗病毒或抗融合(anti-fusogenic)肽显示出有效力的抗病毒和/或抗融合活性，但这些肽具有在生理pH下的水性制剂中溶解性差、以及体内细胞质半衰期短的缺点。因此，对于增加现有抗病毒和/或抗融合肽的溶解度和延长其半衰期、从而提供在体内水溶性、作用较长的抗病毒和/或抗融合肽的方法，存在着需求。
发明概述
本发明至少部分涉及修饰的抗病毒和/或抗融合肽，它们与修饰前的肽相比，在生理pH下的水性溶液溶解度增加。在一个实施方案中，对本发明的肽进行修饰，以包含一个或多个极性基团或部分，例如一个或多个半胱磺酸，由此增加它们在水性溶液中的溶解度。修饰的肽可以进一步包含化学反应性部分，使得修饰的肽可以与血液成分或载体蛋白例如白蛋白(例如人血清白蛋白或重组白蛋白)上的可用官能团发生反应，从而增加修饰的肽的体内稳定性。在实施方案中，修饰的肽与血液成分或载体蛋白例如白蛋白(例如人血清白蛋白，重组白蛋白或其它载体蛋白)结合。由此，这些修饰的肽或其结合物，减少了例如对频繁或甚至连续地施用肽的需要。本发明的修饰的肽可以例如预防性和/或治疗性地用于改善多种病毒的感染，包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类呼吸道合胞病毒(RSV)、人类副流感病毒(HPIV)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。参与病毒感染(例如肝炎、EB病毒和其它相关病毒)的其它肽的修饰，也在本发明的范围内。
因此，一方面，本发明的特点是修饰的抗病毒和/或抗融合肽，其与修饰前的肽相比，在大约5到8的pH范围内(例如生理pH下)是在水性或水溶液中溶解度增加。在一个实施方案中，修饰的抗病毒和/或抗融合肽在浓溶液中(例如在水性溶液(例如等渗或高盐水性溶液)中，浓度在大约10到500mg/ml、大约10到400mg/ml、大约10到300mg/ml、大约10到200mg/ml、大约10到180mg/ml、大约40到180mg/ml、大约60到180mg/ml或大约90到100mg/ml的范围内)保持基本上溶解(例如在大约5到8的pH范围内(例如生理pH下)，在水或水性溶液中沉淀少于大约40％、30％、20％、10％)。在实施方案中，修饰的抗病毒和/或抗融合肽显示出溶度极限(即维持澄清溶液的最高浓度)比修饰前的肽高至少大约1.3、1.5、1.8、2、2.3、2.5、2.8、3或3.5倍。在实施方案中，修饰的抗病毒和/或抗融合肽，在pH范围为大约5到8的水性等渗溶液中的溶度极限为至少大约20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml或40mg/ml。本文中使用的“水性溶液”包括但不限于在适合给药于对象(例如人类对象)、例如皮下、静脉内、肺部、肌肉内或腹膜内给药的pH下的水、盐水溶液(例如等渗溶液)、在水中制成的缓冲液(例如磷酸钠缓冲液)、水性凝胶，以及水性制剂；或在适合制造工艺的pH下的制剂。
在实施方案中，修饰的抗病毒和/或抗融合肽包含一个或多个极性部分。在一个实施方案中，修饰的抗病毒和/或抗融合肽包含一个或多个在生理pH下带电或不带电的极性部分。在某些实施方案中，侧链可以是中性的，并可以通过例如形成氢键或其它非共价相互作用，增加修饰的肽在水性溶液中的总体溶解度。例如，在某些情况下，带有氧或氮基团的中性侧链能够与主体溶剂形成氢键，并可用于增加肽的总体溶解度。在某些实施方案中，侧链可以是任何非天然的极性或中性侧链，例如在20种天然存在的氨基酸中没有发现的侧链。
在实施方案中，修饰的抗病毒和/或抗融合肽的极性部分包含下列结构：
Figure A20088002216300131
例如，修饰的抗病毒和/或抗融合肽可以包含一个或多个半胱磺酸。在实施方案中，半胱磺酸具有下列结构：
Figure A20088002216300132
本技术领域的普通专业人员在得益于本公开内容后，将容易选择其它能够增加本文公开的肽的溶解度的合适侧链。
在其它实施方案中，将一个或多个极性部分(例如半胱磺酸)添加到抗病毒和/或抗融合肽的N-末端或C-末端上。在其它实施方案中，一个或多个极性部分被添加到抗病毒和/或抗融合肽的内部序列上。
在一个实施方案中，修饰的抗病毒和/或抗融合肽包含gp41卷曲螺旋腔结合残基的至少一部分。例如，肽可以包含残基628WMEW631(SEQID NO：1)，或在其上具有最多1个氨基酸取代(例如，保守或非保守取代)或添加的氨基酸序列。在其它实施方案中，抗病毒和/或抗融合肽包含来自氨基酸628WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL661(对应于氨基酸C1到C34)的C34的全部或部分天然氨基酸序列，或对其进行多达5、4、3、2或1个氨基酸取代(例如，保守或非保守取代)、缺失或添加。
在其它实施方案中，修饰的抗病毒和/或抗融合肽包含DP107和DP178肽及其类似物的氨基酸序列，包括含有来自其它(非HIV)病毒的氨基酸序列的肽，所述其它病毒的氨基酸序列对应于DP107和DP178来源的HIV的gp41区域，并表现出抗病毒和/或抗融合活性。更具体来说，这些肽可以表现出尤其是针对人类呼吸道合胞病毒(RSV)、人类副流感病毒(HPV)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的抗病毒活性。本发明还涉及了US 05/0070475的SEQ ID NO：1到SEQID NO：86的修饰的肽，在此特别引为参考。
在实施方案中，本发明的修饰的抗病毒和/或抗融合肽还包含一个或多个化学反应性部分或基团，使得修饰的肽可以与血液成分或载体蛋白上的可用官能团发生反应，形成稳定的共价键，由此产生结合的肽形式。在一个实施方案中，修饰的肽包含一个或多个反应性基团，与一种或多种血液成分(例如白蛋白)上的一个或多个氨基、羟基或巯基发生反应，形成稳定的共价键。例如，肽-反应性基团白蛋白结合物的肽与白蛋白的摩尔比例可以是大约1∶1。通常通过反应性基团与白蛋白例如人白蛋白的34位氨基酸(Cys34)之间的共价键发生结合。
在另一个实施方案中，反应性基团可以是含有马来酰亚胺的基团(例如MPA(马来酰亚胺丙酸)或GMBA(γ-马来酰亚胺-丁酰胺))，它与血液蛋白、包括移动的血液蛋白例如白蛋白上的巯基具有反应性。反应性修饰或基团还可以包含一个或多个接头。在实施方案中，接头选自下面的一个或多个：(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)，[2-(2-氨基)乙氧基)]乙氧基乙酸(AEEA)，乙二胺(EDA)；一个或多个烷基链(C1-C10)，例如8-氨基辛酸(AOA)，8-氨基丙酸(APA)或4-氨基苯甲酸(AphA)。带有或不带接头的反应性基团，可以添加到抗病毒和/或抗融合修饰的肽的N-或C-末端上，通常是抗病毒和/或抗融合修饰的肽的C-末端上。在其它实施方案中，反应性基团连接到修饰的肽的内部残基上(例如连接到内部赖氨酸残基的ε-NH2基团上；内部丝氨酸残基(例如C34的13位丝氨酸)的羟基上)。C34修饰的肽的非限制性例子公开在WO 02/096935中，其全部内容在此以其全文引为参考。
典型地，当一个或多个极性部分(例如半胱磺酸)被添加到修饰的抗病毒和/或抗融合肽的一个末端(例如N-末端)时，反应性基团则被添加到相反末端上(例如C-末端)。例如，修饰的肽可以具有下列构型之一：
[极性部分(例如半胱磺酸)-修饰的肽-接头n-反应性基团](VI)；或
[反应性基团-接头n-修饰的肽-极性部分(例如半胱磺酸)](VII)。
其中反应性基团可以是例如含有马来酰亚胺的基团，带有或不带有接头，例如n可以是0、1、2、3、4或更多个接头。当存在一个以上接头时，接头可以是相同的，例如AEEA-AEEA，或是不同的，例如AEEA-EDA或AEA-AEEA。
在某些实施方案中，包含在修饰的抗病毒和/或抗融合肽中的其它基团可以是具有式(I)的化合物。
(VIII)     (R1)m-X-(R2)n
在式(VIII)中，m和n的和至少为1，m和n各为0或更大的整数。例如，当m为0时，n为1以上，当n为0时，m为1以上。X是抗病毒和/或抗融合肽，例如C34、T20、T1249或其类似物或衍生物，包括例如其马来酰亚胺衍生物。当R1存在而R2不存在时，R1存在于X基团的N-末端。当R1不存在而R2存在时，R2存在于X基团的C-末端。
在某些实施例中I，R1和R2可以各自独立地选自具有式(IX)的化合物。
Figure A20088002216300161
式(IX)的核心结构与氨基酸相似，包含氨基、α碳和羧基。根据R1和R2基团在肽衍生物中的准确位置，基团可以通过式(IX)的不同原子与肽结合。例如，当R1是具有式(IX)的化合物时，R1可以通过式(IX)的羧基与肽结合，在R1的羧基与肽的氨基之间提供肽键。当R2是具有式(IX)的化合物时，R2可以通过式(IX)的氨基与肽结合，在R2的氨基与肽的羧基之间提供肽键。
在某些实施方案中，式(IX)的R3基团可以是除了在20种天然存在的氨基酸中通常发现的极性、不带电荷的基团之外的任何极性、不带电荷的基团。例如，R3基团可以是或可以包含磺酰基(HS＝(O)2)、亚砜基(HS＝O)、磺酸基(HO-S＝(O)2)、卤代烷基、仲胺、叔胺、羟基，或其它极性或甚至中性并能够增加肽衍生物在水性溶液中的总体溶解度的侧链基团。例如，具有能够形成氢键的基团的侧链可用于增加肽的总体溶解度。在某些实施例中，侧链优选无反应性，使得与接头或其它物类的不想要的副反应不会发生到任何显著的程度。在某些实施例中，上面提到的用于R3的基团可以与α碳隔开，例如1-3个碳原子。在某些实施例中，可以选择R3以提供具有式(X)-(XV)的化合物。
Figure A20088002216300171
本技术领域的普通专业人员受益于本公开内容，将容易选择可以增加本文公开的肽的溶解度的其它合适侧链。
在某些实施方案中，R1和R2基团基本上不影响肽结合物的总体二级结构，或在某些情况下的三级结构。由于基本上不影响肽结合物的二级结构，肽结合物的总体活性将不会显著低于未衍生的肽。
在其它实施方案中，肽衍生物可以采取在式(XVI)中显示的组合物的形式。
(XVI)         X1-(R1)m-X2-(R2)n
在式(XVI)中，X1和X2表示肽的部分，它们连接在一起时将提供例如C34、T20或T1249，或其变体。在式(XVI)中，R1和R2可以是任何上面有关式(IX)时讨论的那些基团，m与n的和是大于或等于1的整数，m或n有可以为0的可能性。在式(XVI)中，基团被插入到肽链的中间。这样的插入可以使用许多不同方法来进行，包括用酶消化肽，然后将R1或R2基团或二者插入，然后将肽片段连接在一起。
在某些实施方案中，本文公开的化合物，可以连接到肽的N-末端、C-末端的一个或多个附加基团上或通过肽的一个或多个氨基酸的侧链连接。例如，可以产生在式(XVII)-(XX)中示意显示的组合物。
Figure A20088002216300181
在式(XVII)-(XX)中，L是接头，例如(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)、乙二胺(EDA)、2-[2-(2-氨基)乙氧基]乙氧基乙酸(AEAA)、烷基链基序(C1-C10)例如甘氨酸、3-氨基丙酸(APA)、8-氨基辛酸(AOA)、4-氨基苯甲酸(AphA)等，R1和R2可以是本文讨论的任何基团。接头可以通过肽的任何氨基酸连接到肽上，例如通过赖氨酸的氨基基团、肽的一个或多个氨基酸侧链残基中的巯基、羟基；或者连接到肽的N-末端或C-末端上。X、X1和X2基团是肽(X)或肽片段(X1和X2)。在式(XIX)和(XX)中显示的P基团，表示可以通过接头L与衍生的肽结合的蛋白。说明性的蛋白包括血液蛋白或载体蛋白(例如人血清白蛋白，重组白蛋白，免疫球蛋白或其片段，转铁蛋白或其它适合的蛋白)。
蛋白结合物(式(XIX)和(XX))可以离体或体内生产。在进行体内生产时，可以将化合物，例如在式(XVII)和(XVIII)中显示的化合物，导入到对象中，与体内蛋白例如白蛋白反应。
本发明的抗病毒和/或抗融合肽可以具有一个或多个氨基酸取代或添加。例如，肽可以具有一个或多个保守的或非保守的取代。在某些实施方案中，修饰的肽可以进一步包含一个或多个氨基酸残基。例如C34的修饰的肽可以任选在28位的天然赖氨酸(Lys28)被精氨酸取代，和/或添加Lys残基(或在其ε-氮原子上被修饰的赖氨酸残基，直接或间接地共价连接到位于C-末端的本文描述的反应性基团上(例如AEEA-MPA)。应该理解，在基团Lys(ε-AEEA-MPA)中，AEEA-MPA连接到赖氨酸的ε-NH2基团上。
本发明的C34的修饰的抗病毒和/或抗融合修饰的肽的非限制性的例子，包括下列序列：
CA化合物I：(半胱磺酸(CA)与C34直接相连；在本文中也被称为CA-C34(SEQ ID NO：3))。
Figure A20088002216300191
CA化合物II：(半胱磺酸(CA)与28位天然赖氨酸(Lys28)被精氨酸取代的C34直接相连；在本文中也被称为CA-C34(Arg28)(SEQ IDNO：4))
CA化合物III：(半胱磺酸(CA)与在35位具有附加的赖氨酸残基(Lys35)的C34直接相连，其中赖氨酸的ε-NH2基团通过接头(AEEA-MPA)与反应性基团相连；在本文中也被称为CA-C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)(SEQ ID NO：5))。
Figure A20088002216300202
以及
CA化合物IV：(半胱磺酸(CA)与在28位的天然赖氨酸(Lys28)被精氨酸取代、在35位具有附加的赖氨酸残基(Lys35)且其中赖氨酸的ε-NH2基团通过接头(AEEA-MPA)与反应性基团相连的C34直接相连；在本文中也被称为CA-C34(Arg28)-Lys35(ε-AEEA-MPA)(SEQ IDNO：6))。
另一方面，本发明的特点是本文描述的具有一个或多个化学反应性修饰的修饰的抗病毒和/或抗融合肽与一种或多种血液成分上的可用官能团结合的结合物。在本发明的一个实施方案中，修饰的肽含有反应性基团，它们与血液成分上的氨基、羟基或巯基结合，形成了稳定的共价键。马来酰亚胺基团可以与修饰的肽直接结合，或者可以例如通过接头(例如本文描述的接头)间接结合。在本发明的另一个实施方案中，反应性基团可以是马来酰亚胺，它与血液蛋白、包括移动的血液蛋白例如白蛋白上的巯基反应。肽-反应性基团白蛋白结合物可以是大约1∶1的肽与白蛋白的摩尔比例。通常，通过反应性基团与人类白蛋白的34位氨基酸(Cys34)之间的共价键发生结合。
修饰的抗病毒和/或抗融合肽可以包含反应性部分，例如含有马来酰亚胺的基团，所述部分具有与一种或多种血液成分例如血清白蛋白形成共价键、从而形成结合物的能力。结合步骤可以在体内发生，例如在将修饰的肽施用于对象之后。或者，结合步骤可以离体(Ex vivo)或在体外发生，例如通过将含有反应性基团的修饰的肽与血液成分例如白蛋白相接触。结合物C34、DP107、DP178等的制备和使用，公开在WO 02/096935和US 05/0070475中，在此以其全文引为参考。体内或离体形成的结合物可用于在对象、例如人类对象中抑制病毒和/或病毒的融合活性，所述病毒例如HIV、RSV、HPV、MeV或SIV。
另一方面，本发明的特点在于含有本文描述的一种或修饰的抗病毒和/或抗融合肽以及可药用载体的组合物，例如药物组合物。在实施方案中，组合物适合于注射(例如皮下或血管内注射)，以及肺部、肌内和/或腹膜内投送。在其它实施方案中，组合物适用于制造工艺。
在其它实施方案中，组合物在pH范围为大约5到8的水性溶液(例如等渗或高盐水性溶液)中是浓缩的，例如浓度为大约10到500mg/ml、大约10到400mg/ml、大约10到300mg/ml、大约10到200mg/ml、大约10到180mg/ml、大约40到150mg/ml、大约60到125mg/ml或大约90到100mg/ml。
另一方面，本发明的特点在于用于预防和/或治疗病毒感染的方法和组合物，包含本文描述的修饰的抗病毒和/或抗融合肽或其结合物。方法包括对需要治疗的对象(人类对象)施用有效量的、例如预防或治疗量的本文描述的修饰的抗病毒和/或抗融合肽或其结合物，以减轻与病毒感染有关的一种或多种症状。可以治疗或预防的示例性病毒感染包括AIDS、人类呼吸道合胞病毒(RSV)、人类副流感病毒(HPV)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。因此，公开了使用修饰的抗病毒和/或抗融合肽，或其结合物，来减轻或抑制与病毒相关的疾病或病症的一种或多种症状、或预防或延迟其发作的方法。在预防性应用的情况下(例如预防、减轻或延迟疾病或病症的一种或多种症状的发作或复发)，对象可以具有或可以不具有疾病或病症的一种或多种症状。例如，可以在任何可检测到的症状出现之前，或者在检测到至少部分但不是所有症状之后，施用修饰的抗病毒和/或抗融合肽或其结合物。在治疗性应用的情况下，治疗可以在对象中改善、治愈、维持疾病或病症，或减少疾病或病症的持续时间。在治疗性应用中，对象可以具有部分或全部表现出的症状。在典型的情况下，治疗将对象的疾病或病症改善到可以被医生察觉到的程度，或者防止疾病或病症的恶化。
公开了在对象、例如人类对象中抑制HIV、RSV、HPV、MeV或SIV的一种或多种活性的方法和组合物。方法包括给需要治疗的对象施用有效量的、例如预防或治疗量的本文描述的修饰的抗病毒和/或抗融合肽或其结合物。
本发明的修饰的肽也可用于便利纯化和制造工艺，因为修饰的肽的溶解度增加允许了更浓的反应溶液，因此便于大规模制造工艺。因此，本发明的特点还在于增强抗病毒和/或抗融合肽的溶解度的方法。方法包括提供含有一个或多个极性部分(例如一个或多个半胱磺酸)的修饰的抗病毒和/或抗融合肽，例如本文描述的修饰的肽；以及制备修饰的肽的溶液(例如本文描述的药物组合物，或生产制备物)。方法可以任选包括测定修饰的抗病毒和/或抗融合肽在溶液中的溶解度(例如通过获得修饰的抗病毒和/或抗融合肽在溶液中的样品，并评估样品的浊度和/或乳光)。
另一方面，本发明的特点在于改进抗病毒和/或抗融合肽的制备、例如结合(例如大规模结合)的方法。方法包括提供含有一个或多个极性部分(例如一个或多个半胱磺酸)的修饰的抗病毒和/或抗融合肽，例如本文描述的修饰的肽；以及制备具有高浓度修饰的肽(例如本文描述的高浓度)的修饰的肽的溶液。
本文中使用的无数量词的对象是指一个或一个以上的(例如至少一个)语法对象。
本文中使用的术语“或”意味着术语“和/或”，并可以与它互换使用，除非上下文明确表示不是这样。
术语“蛋白”和“多肽”在本文中可以互换使用。
“大约(About)”和“近似(approximately)”一般将意味着测量到的量给出测量值的本质或精确性的可接受的误差程度。示例性的误差程度在给定值或值的范围的20百分率(％)内，通常在10％以内，更通常在5％以内。
在通篇本申请中引用的所有出版物、待审专利申请、公布的专利申请(包括WO 02/096935和US 05/0070475)以及公布的专利的内容，在此以其全文引为参考。
本发明的其它特点、目标和优点从说明书和附图以及从权利要求书中将变得明显。
附图简述
图1是线形图，显示了在存在对照(实心菱形)的情况下，与天然C34(空心方块)相比，在外周血单核细胞(PBMC)中HIV-IIIIB复制的抑制。
图2是线形图，显示了在存在对照(实心菱形)的情况下，与C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)与人血清白蛋白结合(C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)：HSA)(空心方块)相比，在PBMC中HIV-IIIIB复制的抑制。
图3是线形图，显示了在存在对照(实心菱形)的情况下，与在N-末端具有半胱磺酸、在C-末端添加的赖氨酸的ε-NH2上结合有AEEA-MPA的C34(CA-C34-Lys35(ε-AEEA-MPA))与人血清白蛋白的白蛋白结合物(CA-C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)：HSA)(空心方块)相比，在PBMC中HIV-IIIIB复制的抑制。
图4是线形图，显示了在存在对照(实心菱形)的情况下，与白蛋白通过MPA-AEEA接头连接到C34的色氨酸的N-末端α氨基上的结合物(其也被称为PC-1505；MPA-(AEEA)-C34)(空心方块)相比，在PBMC中HIV-IIIIB复制的抑制。
图5A显示了C34肽和化合物VIII(其也被称为PC-1505；MPA-(AEEA)-C34；和AC-CpdVIII)在静脉或皮下给药到Sprague-Dawley大鼠中后的药代动力学曲线。
图5B显示了在静脉或皮下给药到Sprague-Dawley大鼠中之后，化合物VIII与rHA的药代动力学曲线的比较。曲线的重叠，为连接马来酰亚胺基-化合物VIII与人类血清白蛋白的半胱氨酸-34的化学键的稳定性、以及化合物VIII对肾脏清除和肽酶降解的稳定性，提供了决定性的支持依据。
图6是表，汇总了使用HIVIIIB时，几种修饰的抗融合肽在PBMC中的活性的结果。
发明详述
公开了修饰的抗病毒和/或抗融合肽，它们与修饰前的肽相比，在生理pH下的水性溶液中具有增加的溶解度。在一个实施方案中，本发明的肽被修饰，以包含一个或多个极性部分，例如一个或多个半胱磺酸，从而增加了它们在水性溶液中的溶解度。修饰的肽还可以包含化学反应性部分，使得修饰的肽可以与血液成分或载体蛋白例如白蛋白上的可用官能团反应，从而增加修饰的肽的体内稳定性。本发明的修饰的肽可以例如预防性和/或治疗性应用，用于缓解多种病毒的感染，包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类呼吸道合胞病毒(RSV)、人类副流感病毒(HPV)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
本文中的某些术语定义如下：
抗病毒肽：本文使用的“抗病毒肽”应当是指通过例如抑制细胞-细胞融合或游离病毒感染，来抑制细胞的病毒感染的肽。感染的途径可涉及膜融合，如在包膜病毒的情况中发生的，或某些涉及病毒和细胞结构的其它融合事件。抑制特定病毒的病毒感染的肽，可以针对该具体病毒进行指称，特别是例如抗HIV肽、抗RSV肽。
抗融合肽：“抗融合肽”是相对于不存在肽的情况下发生的膜融合水平，被证明具有抑制或降低两个或多个实体、例如病毒-细胞或细胞-细胞之间的膜融合事件水平的能力的肽。
HIV和抗HIV肽：造成获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的人类免疫缺陷病毒(HIV)，是反转录病毒的慢病毒科的成员。有两种主要类型的HIV，HIV-1和HIV-2，已经鉴定到了每种的各种不同毒株。HIV的靶为CD-4+细胞，病毒的进入依赖于HIV蛋白gp41与CD-4+细胞表面受体的结合。抗HIV肽是指表现出针对HIV的抗病毒活性的肽，包括抑制游离病毒对CD-4+细胞的感染，和/或抑制感染与未感染的CD-4+细胞之间HIV诱导的合胞体形成。
SIV和抗SIV肽：猿猴免疫缺陷病毒(SIV)是在易感猴子中引起获得性免疫缺陷综合症(AIDS)样疾病的慢病毒。抗SIV肽是表现出针对SIV的抗病毒活性的肽，包括抑制SIV病毒对细胞的感染，和抑制感染与未感染细胞之间形成合胞体。
RSV和抗RSV肽：呼吸道合胞病毒(RSV)是呼吸病原体，在婴儿和幼儿中特别危险，它在其中可以引起毛细支气管炎(小气道的炎症)和肺炎。RSVs是负义单链RNA病毒，是副粘病毒科病毒的成员。RSV的感染途径典型是通过呼吸道的粘膜，即鼻、咽、气管、支气管和细支气管。抗RSV肽是对RSV表现出抗病毒活性的肽，包括抑制游离RSV病毒对粘膜细胞的感染以及感染与未感染细胞之间的合胞体形成。
HPV和抗HPV肽：人类副流感病毒(HPIV或HPV)，与RSV类似，是呼吸道疾病的另一种主因，并与RSVs类似，是负义单链RNA病毒，是副粘病毒科病毒的成员。HPIV有四种已识别的血清型——HPIV-1、HPIV-2、HPIV-3和HPIV-4。HPIV-1是儿童假膜性喉炎的主因，HPIV-1和HPIV-2都引起上和下呼吸道疾病。HPIV-3更通常与细支气管炎和肺炎相关。抗HPV肽是对HPV表现出抗病毒活性的肽，包括抑制游离HPV病毒的感染和感染与未感染细胞之间的合胞体形成。
MeV和抗Mev肽：麻疹病毒(VM或MeV)是包膜的负义单链RNA病毒，属于副粘病毒科的病毒。与RSV和HPV类似，MeV引起呼吸疾病，并且也产生免疫抑制作用，造成其它的机会感染。在某些情况下，MeV可以建立脑部感染，导致严重的神经并发症。抗MeV肽是对MeV表现出抗病毒活性的肽，包括抑制游离MeV病毒的感染和感染与未感染细胞之间的合胞体形成。
C34和C34类似物：术语“C34”是指gp41卷曲螺旋腔结合残基的一部分。例如，肽可以包含gp41的残基628WMEW631(SEQ ID NO：1)，或gp41的628WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEK NEQELL661(SEQ ID NO：2)。
C34类似物可以包括它的截短物、缺失物、插入物和/或氨基酸取代物(例如保守或非保守取代)。缺失物可以由从C34肽中移除一个或多个氨基酸残基构成，并可以包括移除肽序列的单个连续的部分或多个部分。插入物可以包括单个氨基酸残基或成段残基，并可以在C34肽的羧基或氨基末端或在肽内部的位置上进行。
DP-178和DP178类似物：除非明确或由上下文另行指明，DP-178是指36个氨基酸的DP-178肽，对应于HIV-1分离株LAI(HIVLAI)的gp41糖蛋白的氨基酸残基638-673，具有下面的序列：YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ IDNO：7)。
DP178的类似物包括它的截短物、缺失物、插入物和/或氨基酸取代物(例如保守或非保守取代)。肽的截短物可以包含3-36个氨基酸之间的肽。缺失物可以由从DP178肽中移除一个或多个氨基酸残基组成，并可以包括移除肽序列的单个连续部分或多个部分。插入物可以包括单个氨基酸残基或成段残基，并可以在DP178肽的羧基或氨基末端或在肽内部的位置上进行。
DP178肽类似物是这样的肽，其氨基酸序列包含HIV-1LAI之外的病毒与DP178来源的gp41区域对应的肽区域的氨基酸序列，及其截短物、缺失物或插入物。这些其它的病毒可以包括但不限于其它的HIV分离株例如HIV-2NIHZ，呼吸道合胞病毒(RSV)，人类副流感病毒(HPV)，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和麻疹病毒(MeV)。DP178类似物也指通过在美国专利Nos.6,013,263、6,017,536和6,020,459中描述并且合并在本文中的ALLMOTI5、107X 178X 4和PLZIP搜索基序鉴定并识别的那些肽序列，其与DP178具有结构和/或氨基酸基序相似性。DP178类似物还指描述为“DP178样”的肽，该术语定义在美国专利Nos.6,013,263、6,017,536和6,020,459中。
DP-107和DP107类似物：除非明确地或由上下文另行指明，DP-107是指38个氨基酸的DP-107肽，对应于HIV-1分离株LAI(HIVLAI)的gp41蛋白的氨基酸残基558-595，并具有下列序列：NNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQ(SEQ ID NO：8)。
DP107的类似物可以包括它的截短物、缺失物、插入物和/或氨基酸取代物(例如保守或非保守取代)。肽的截短物可以包含3-38个氨基酸之间的肽。缺失物可以由从DP107肽中移除一个或多个氨基酸残基组成，并可以包括移除肽序列的单个连续部分或多个部分。插入物可以包括单个氨基酸残基或成段残基，并可以在DP107肽的羧基或氨基末端或在肽内部的位置上进行。
DP107肽类似物是这样的肽，其氨基酸序列包含病毒除HIV-1LAI之外的、对应于DP107来源的gp41区域的肽区域的氨基酸序列，及其截短物、缺失物或插入物。这些其它的病毒可以包括但不限于其它的HIV分离株例如HIV-2NIHZ，呼吸道合胞病毒(RSV)，人类副流感病毒(HPV)，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和麻疹病毒(MeV)。DP107类似物也指通过在美国专利Nos.6,013,263、6,017,536和6,020,459中描述的、并且合并在本文中的ALLMOTI5、107X 178X 4和PLZIP搜索基序鉴定并识别肽序列，与DP107具有结构和/或氨基酸基序相似性。DP107类似物还指描述为“DP178样”的肽，该术语的定义在美国专利Nos.6,013,263、6,017,536和6,020,459中。
反应性基团：反应性基团是能够形成共价键的化学基团。这样的反应性基团连接或键合到C34、DP-107、DP-178或T-1249肽或其类似物或其它感兴趣的抗病毒或抗融合肽上。一般来说，反应性基团在水性环境中将是稳定的，并通常是羧基、磷酰基，或作为酯或混合酸酐的方便的酰基，或亚胺酯，由此能够与流动的血液成分上靶位点处的官能团，例如氨基、羟基或巯基形成共价键。大多数情况下，酯包括苯酚化合物，或是巯基酯、烷基酯、磷酸酯等。
官能团：官能团是血液成分上的基团，修饰的抗病毒肽上的反应性基团与它反应以形成共价键。官能团包括与酯的反应性本体成键的羟基；与马来酰亚胺、亚胺酯和硫酯基团成键的巯基；与羧基、磷酰基或酰基成键的氨基，以及与氨基基团成键的羧基。
血液成分或载体蛋白：血液成分可以是固定的或移动的。固定血液成分是不移动的血液成分，包括组织、膜受体、间质蛋白、纤维蛋白、胶原蛋白、血小板、内皮细胞、上皮细胞以及它们的相关膜和膜受体、体细胞、骨骼肌和平滑肌细胞、神经元成分、骨细胞和破骨细胞，以及所有身体组织、特别是与循环和淋巴系统有关的组织。移动的血液成分是不具有任何较长时期的固定位置的血液成分，一般不超过5分钟、更通常不超过1分钟。这些血液成分不是膜结合的，在血液中长时间存在，并且以至少0.1.mu.g/ml的最小浓度存在。移动的血液成分包括载体蛋白。移动的血液成分包括血清白蛋白、转铁蛋白、铁蛋白和免疫球蛋白例如IgM和IgG。移动的血液成分的半衰期为至少大约12小时。血液成分的其它例子包括铁蛋白、类固醇结合蛋白、转铁蛋白、甲状腺素结合蛋白，以及α-2-巨球蛋白。通常，血清白蛋白和IgG是更优选的，血清白蛋白例如人血清白蛋白是最优选的。白蛋白也可以来自于重组或基因组来源，例如酵母、细菌(例如大肠杆菌(E.coli))、哺乳动物细胞(例如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞)、转基因植物、转基因动物。因此，术语“血液成分”包括从对象生物化学纯化的蛋白，以及重组制造的蛋白。
保护性基团：保护性基团是用于保护肽衍生物免于与它们自身反应的化学基团。在本文和美国专利No.5,493,007中公开了各种保护性基团，该专利在此引为参考。这样的保护性基团包括乙酰基、芴甲氧羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)、苯甲基氧基羰基(CBZ)等。具体的被保护的氨基酸显示在表1中。
Figure A20088002216300301
连接基团：连接(间隔)基团是连接或联接反应性本体与抗病毒或抗融合肽的化学部分。连接基团可以包含一个或多个烷基部分、烷氧部分、烯基部分、炔基部分或氨基部分，它们被烷基部分、环烷基部分、多环部分、芳基部分、多芳基部分、取代的芳基部分、杂环部分和取代的杂环基取代。连接基团可以包括(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)、[2-(2-氨基)乙氧基)]乙氧基乙酸(AEEA)、乙二胺(EDA)，一种或多种烷基链(C1-C10)例如8-氨基辛酸(AOA)、8-氨基丙酸(APA)或4-氨基苯甲酸(APhA)。
敏感官能团：敏感官能团是代表了抗病毒和/或抗融合肽上潜在反应位点的原子的基团。如果存在，敏感功能基团可以被选择为接头-反应性基团修饰的连接点。敏感官能团包括但不限于羧基、氨基、巯基和羟基基团。
修饰的肽：修饰的肽是通过连接反应性基团进行了修饰的抗病毒和/或抗融合肽。反应性基团可以通过连接基团、或任选不使用连接基团连接到肽上。还考虑到了一个或多个其它氨基酸可以添加到肽上，以便于反应性本体的连接。修饰的肽可以体内施用，以便在体内发生与血液成分的结合，或者它们可以首先在体外与血液成分或载体蛋白结合(例如使用重组生产的蛋白，例如重组白蛋白、免疫球蛋白或转运蛋白)，并将由此产生的结合肽(在下面定义)施用于体内。
结合肽：结合肽是通过在修饰的肽的反应性基团与血液成分的官能团之间使用或不使用连接基团形成的共价键，与血液成分结合的修饰的肽。在本申请通篇中使用时，术语“结合肽”可以更具体地指称特定的结合肽，例如“结合的C34”或“结合的DP107”。
在实施方案中，本发明的修饰的抗病毒和/或抗融合肽包含含有马来酰亚胺的基团，该基团具有共价键合血液成分、更具体是血清白蛋白以形成结合物的能力。向对象施用抗病毒和/或抗融合肽的马来酰亚胺衍生物，可以导致肽与血液成分例如血清白蛋白的体内结合。通过将修饰的抗病毒和/或抗融合肽与血液成分或载体蛋白、例如血清白蛋白相接触，来制备离体(或体内)结合物，也包括在本发明中。在这种情况下，白蛋白可以从不同的来源提供，例如在血液样品中、纯化的白蛋白、重组的白蛋白(包括白蛋白的修饰形式，例如具有氨基酸取代、插入和/或缺失)等。C34与白蛋白的结合物的制备和使用，已经在WO 02/096935中充分公开，类似的制备和使用也适用于本发明的结合物。在对象体内形成的结合物与离体制备的结合物，在施用于对象时，都可用于表现出相应的融合肽抑制剂的抗融合活性，因此，在对象中抑制HIV、RSV、HPV、MeV或SIV的活性。
考虑到这些定义，本发明利用了现有的抗病毒和抗融合肽的性质。可以被肽抑制的病毒，包括但不限于在例如美国专利Nos.6,013,263、6,017,536和6,020,459中表V-VII和表IX-XIV列出的所有病毒株。这些病毒包括例如人类反转录病毒，包括HIV-1、HIV-2和人类T-淋巴细胞病毒(HTLV-I和HTLV-II)，以及非人类反转录病毒，包括牛白血病病毒、猫肉瘤病毒、猫白血病病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猿猴肉瘤病毒、猿猴白血病和绵羊进行性肺炎病毒。本发明的肽也可以抑制非反转录病毒，包括人类呼吸道合胞病毒(RSV)、犬瘟热病毒、新城疫病毒、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、麻疹病毒(MeV)、EB病毒、乙肝病毒和猿猴Mason-Pfizer病毒。非包膜的病毒也可以被本发明的肽抑制，包括但不限于小核糖核酸病毒例如脊髓灰质炎病毒、甲肝病毒、肠道病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒，乳头多瘤空泡病毒例如乳头状瘤病毒、细小病毒、腺病毒和呼肠弧病毒。
例如，如同在本申请的背景部分中所讨论，已经描述了HIV融合肽的作用机制，肽的抗病毒和抗融合性质也已经很好地建立。对应于羧基末端胞外结构域序列(例如B型HIV-1的LAI毒株的氨基酸残基643-678或来自类似毒株的残基638-673以及残基558-595)的合成肽，已经显示出在低浓度下完全抑制病毒介导的细胞-细胞融合。本发明的肽与天然病毒gp41的亮氨酸拉链区竞争，从而导致了干扰病毒融合/感染到细胞中。
本发明还提供了用于以DACTM(药物活性复合物)技术修饰选定的抗病毒和/或抗融合肽的方法和试剂，通过肽在蛋白载体上的选择性结合，赋予该肽改进的生物利用度、延长的半衰期和更好的分布，而不改变肽的抗病毒性质。被选择(但不限于)用于本发明的载体是白蛋白，通过它的游离巯基被马来酰亚胺部分修饰的抗病毒和/或抗融合肽结合。
抗病毒和/或抗融合抑制剂
在文献中，已经描述了几种肽序列高效防止HIV-1融合/感染。例如，肽C34、DP107和DP178结合到gp41与融合相关的构象上。因此，在本发明的一个实施方案中，修饰了C34-、DP178-和DP178-样的肽。同样地，本发明的其它实施方案包括用于对抗HIV的C34-、DP107和DP107-样的肽的修饰，以及在RSV、HPV、MeV和SIV病毒中发现的与DP107和DP178类似的肽。
修饰的C34肽或类似物
在某些实施方案中，本发明的修饰的C34肽包括包含在肽中的附加基团，它们可以是具有式(I)的化合物。
(VIII)       (R1)m-X-(R2)n
在式(VIII)中，m与n的和至少为1，m和n各为0或大于0的整数。例如，当m为0时，n为1或以上，当n为0时，m为1或以上。X是肽、肽片段或蛋白，例如C34、T20、T1249或其衍生物，包括例如其马来酰亚胺衍生物。当R1存在而R2不存在时，R1存在于X基团的N-末端。当R1不存在而R2存在时，R2存在于X基团的C-末端。
在某些实施例中，R1和R2可以各自独立地选自具有式(IX)的化合物。
Figure A20088002216300341
式(IX)的核心结构与氨基酸相似，包含氨基、α碳和羧基。根据R1和R2基团在肽衍生物中的准确位置，基团可以通过式(IX)的不同原子与肽结合。例如，当R1是具有式(IX)的化合物时，R1可以通过式(IX)的羧基与肽结合，在R1的羧基与肽的氨基之间提供肽键。当R2是具有式(IX)的化合物时，R2可以通过式(IX)的氨基与肽结合，在R2的氨基与肽的羧基之间提供肽键。
在某些实施例中，式(IX)的R3基团可以是除了在20种天然存在的氨基酸中通常发现的极性、不带电荷的基团之外的任何极性、不带电荷的基团。例如，R3基团可以是或可以包含磺酰基(HS＝(O)2)、亚砜基(HS＝O)、磺酸基(HO-S＝(O)2)、卤代烷基、仲胺、叔胺、羟基，或其它极性的或甚至中性的并能够增加肽衍生物在水性溶液中的总体溶解度的侧链基团。例如，具有能够形成氢键的基团的侧链可用于增加肽的总体溶解度。在某些实施例中，侧链优选无反应性，使得与接头或其它物类的不想要的副反应不会以任何显著的程度发生。在某些实施例中，上面提到的用于R3的基团可以与α碳隔开，例如1-3个碳原子。
在某些实施例中，可以选择R3以提供具有式(X)-(XV)的化合物。
Figure A20088002216300351
本技术领域的普通专业人员受益于本公开内容，将容易选择出可以增加本文公开的肽的溶解度的其它合适侧链。
在某些实施方案中，R1和R2基团基本上不影响肽结合物的总体二级结构，或在某些情况下的三级结构。由于基本上不影响肽结合物的二级结构，肽结合物的总体活性将不会显著低于未衍生的肽。
在其它实施方案中，肽衍生物可以采取在式(XVI)中显示的组合物的形式。
(XVI)          X1-(R1)m-X2-(R2)n
在式(XVI)中，X1和X2表示肽的部分，它们连接在一起时将提供例如C34、T20或T1249。在式(XVI)中，R1和R2可以是任何上面就式(IX)讨论的那些基团，m与n的和是大于或等于1的整数，m或n有可以为0的可能性。在式(XVI)中，基团被插入到肽链的中间。这样的插入可以使用许多不同的方法来进行，包括酶法消化肽，然后将R1或R2基团或二者插入，然后将肽片段连接在一起。
本文描述的C34的半胱磺酸衍生物的合成，是使用自动的固相过程，在十二通道(Symphony)肽合成仪上进行的，在肽的产生过程中进行了手工干预(参见本文的实施例1-5)。合成在Fmoc保护的拉每(Ramage)酰胺接头树脂上，使用Fmoc保护的氨基酸来进行。使用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二异丙基乙胺(DIEA)作为活化剂混合物，在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中进行连接。Fmoc保护基团使用20％哌啶/DMF除去。Boc-保护的氨基酸用于N-末端，以便一旦肽从树脂上裂解下来，就产生游离的Nα-末端。在合成过程中使用Sigmacote处理过(Sigmacoted)的玻璃反应容器。
在某些实施方案中，一部分肽可以使用常规的固相合成技术来合成，例如在Merrifield，1986.固相合成(Solid phase synthesis.)Science.232：341-347中描述的。简单来说，将阻断基团加到氨基酸的N-末端，氨基酸的羧基可以通过与二环己基碳二亚胺(DCCD)反应来活化。活化的氨基酸可以与结合在树脂或珠子上的具有游离N-末端和C-末端的氨基酸反应。在形成了氨基阻断的二肽基化合物后，酸处理产生了异丁烯、二氧化碳和结合到树脂或珠子上的二肽。通过重复这些步骤，可以将其它氨基酸添加到二肽珠子上。此外，本文公开的氨基酸衍生物，也可以使用类似的反应添加到肽链上沿着肽链的任何位点。因此，可以将R1或R2基团插入到所需多肽中的任何位点处，以提供具有式(IX)的化合物。
在某些实施方案中，本文公开的化合物可以连接到肽的N-末端、C-末端的一个或多个附加基团上或通过肽的一个或多个氨基酸的侧链连接。例如，可以产生在式(XVII)-(XX)中示意显示的组合物。
Figure A20088002216300371
在式(XVII)-(XX)中，L是接头，例如(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)、乙二胺(EDA)、2-[2-(2-氨基)乙氧基]乙氧基乙酸(AEAA)、烷基链基序(C1-C10)例如甘氨酸、3-氨基丙酸(APA)、8-氨基辛酸(AOA)、4-氨基苯甲酸(AphA)等，R1和R2可以是本文讨论的任何基团。接头可以通过肽的任何氨基酸、例如通过肽的赖氨酸的ε-氨基基团在肽的N-末端或C-末端与肽连接。X、X1和X2基团是肽(X)或肽的片段(X1和X2)。在式(XIX)和(XX)中显示的P基团代表可以通过接头L与衍生的肽结合的蛋白。说明性的蛋白包括血液蛋白、人血清白蛋白、重组白蛋白或其它适合的蛋白。
蛋白结合物(式(XIX)和(XX))可以离体或体内生产。在进行体内生产时，可以将化合物，例如在式(XVII)和(XVIII)中显示的化合物，导入到对象中，与体内蛋白例如白蛋白反应。
本发明的C34的修饰的抗病毒和/或抗融合修饰的肽的非限制性例子，包括下列序列：
CA化合物I：(半胱磺酸(CA)与C34直接相连；在本文中也被称为CA-C34(SEQ ID NO：3))。
Figure A20088002216300381
CA化合物II：(半胱磺酸(CA)与在28位的天然赖氨酸(Lys28)被精氨酸取代的C34直接相连；在本文中也被称为CA-C34(Arg28)(SEQ ID NO：4))
Figure A20088002216300382
CA化合物III：(半胱磺酸(CA)与在35位具有附加的赖氨酸残基(Lys35)的C34直接相连，其中赖氨酸的ε-NH2基团通过接头(AEEA-MPA)与反应性基团相连；在本文中也被称为CA-C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)(SEQ ID NO：5))。
Figure A20088002216300383
CA化合物IV：(半胱磺酸(CA)与在28位的天然赖氨酸(Lys28)被精氨酸取代、在35位具有附加的赖氨酸残基(Lys35)的C34直接相连，其中赖氨酸的ε-NH2基团通过接头(AEEA-MPA)与反应性基团相连；在本文中也被称为CA-C34(Arg28)-Lys35(ε-AEEA-MPA)(SEQ IDNO：6))。
Figure A20088002216300391
可以根据本发明的讲述进行修饰的修饰的C34肽的其它例子也包含下面的氨基酸序列：
N末端-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-C末端(SEQ ID NO：8)；
N末端-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQERNEQELK-C末端(SEQ ID NO：9)；
N末端-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQERNEQEKL-C末端(SEQ ID NO：10)；
N末端-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQERNEQKLL-C末端(SEQ ID NO：11)；
N末端-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQERNEKELL-C末端(SEQ ID NO：12)；
N末端-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQERNKQELL-C末端(SEQ ID NO：13)；
N末端-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQERKEQELL-C末端(SEQ ID NO：14)；
N末端-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQERNEQELLK-C末端(SEQ ID NO：15)；以及
N末端-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLK-C末端(SEQ ID NO：16)。
修饰的C34肽的非限制性的例子是下面显示的式I-VIII的化合物，它们能够与血液成分上的巯基在体内或离体发生反应，形成稳定的共价键。这些化合物的合成描述在WO 02/096935中，其内容在此特别引为参考。
Figure A20088002216300401
DP178和DP107
DP178肽
DP178肽对应于来自HIV-1LAI分离株的跨膜蛋白gp41的氨基酸残基638到673，具有36个氨基酸的序列(从氨基向羧基末端读)：
NH2-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH(SEQ ID NO：7)
除了全长的DP17836-mer之外，本发明的肽还包括DP178肽的截短物，含有3到36个氨基酸残基之间的肽(即肽的大小在三肽到36-mer多肽的范围内)。这些截短的肽显示在表2和3中。
此外，DP178肽的氨基酸取代物也在本发明的范围内。HIV-1和HIV-2包膜蛋白在结构上截然不同，但是在HIV-1和HIV-2的DP178相应区域中存在着显著的氨基酸保守性。氨基酸保守性具有周期性性质，表明一定的结构和/或功能保守。因此，一类可能的氨基酸取代将包括预期稳定本发明的DP178肽的结构的氨基酸改变。利用本文描述的DP178和DP178类似物序列，专业技术人员可以容易地编译出DP178的共有序列，并据此确定能够代表优选的氨基酸取代的保守氨基酸残基。
氨基酸取代可以是保守或非保守的性质。保守的氨基酸取代物由将DP178肽序列的一个或多个氨基酸用电荷，大小和/或疏水性特征相似的氨基酸代替而构成，例如谷氨酸(E)对天冬氨酸(D)的氨基酸取代。非保守取代由将DP178肽序列的一个或多个氨基酸用具有不相似的电荷、大小和/或疏水性特征的氨基酸代替而构成，例如谷氨酸(E)取代缬氨酸(V)。
DP178的氨基酸插入可以由单个氨基酸残基或成段残基组成。插入可以在DP178或DP178的截短肽的羧基或氨基末端进行，以及在肽内部的位置上进行。
这样的插入一般来说长度在2到15个氨基酸的范围内。考虑到在目标肽的羧基或氨基末端进行的插入可以具有较宽的尺寸范围，优选为大约2到大约50个氨基酸。可以在DP178或DP178截短物中导入一个或多个这样的插入，只要这样的插入产生的肽仍然可以被上面描述的107x178x4、ALLMOTI5或PLZIP搜索基序识别即可。
优选的氨基或羧基末端插入是长度为大约2到大约50个氨基酸残基的肽，分别对应于实际的DP178 gp41氨基酸序列的氨基或羧基方向的gp41蛋白区域。因此，优选的氨基末端或羧基末端氨基酸插入将包含在gp41蛋白的紧接DP178区域氨基或羧基方向发现的gp41氨基酸序列。
DP178或DP178截短物的缺失也在本发明的范围内。这样的缺失包括由从DP178或DP178样肽序列中除去一个或多个氨基酸而组成，产生的肽序列的下限长度为4到6个氨基酸。
这样的缺失可以包括肽序列的单个连续的或一个以上不连续的部分。可以在DP178或DP178截短物中导入一个或多个这样的缺失，只要这样的缺失产生的肽仍然可以被上面描述的107x178x4、ALLMOTI5或PLZIP搜索基序识别即可。
DP107肽
DP107是表现出有效抗病毒活性的38个氨基酸的肽，对应于HIV-1LAI分离株的跨膜(TM)gp41糖蛋白的残基558到595，显示如下：
NH2-NNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQ-COOH(SEQ ID NO：17)
除了全长DP10738-mer之外，DP107肽还包括DP107肽的截短物，含有3到38个氨基酸残基之间的肽(即肽的尺寸在三肽到38-mer多肽的范围内)。这些肽显示在US 2005/0070475的表4和5中。
此外，氨基酸取代的DP107肽也在本发明的范围内。至于DP178，在HIV-1和HIV-2的DP107相应区域中也存在着强烈的氨基酸保守性，也具有周期性性质，表明了结构和/或功能的保守性。因此，一类可能的氨基酸取代包括预计稳定本发明的DP107肽结构的氨基酸改变。利用本文描述的DP107和DP107类似物序列，专业技术人员可以容易地编译出DP107的共有序列，并据此确定能够代表优选的氨基酸取代的保守氨基酸残基。
氨基酸取代可以是保守或非保守的性质。保守的氨基酸取代由将DP107肽序列的一个或多个氨基酸用具有相似的电荷、大小和/或疏水性特征的氨基酸代替而构成，例如谷氨酸(E)对天冬氨酸(D)的氨基酸取代。非保守取代由将DP107肽序列的一个或多个氨基酸用具有不相似的电荷、大小和/或疏水性特征的氨基酸代替而构成，例如谷氨酸(E)取代缬氨酸(V)。
氨基酸插入可以由单个氨基酸残基或成段残基构成。插入可以在DP107或DP107的截短肽的羧基或氨基末端进行，以及在肽内部的位置上进行。
这样的插入一般来说长度在2到15个氨基酸之间。考虑到了在目标肽的羧基或氨基末端进行的插入可以具有较宽的尺寸范围，优选为大约2到大约50个氨基酸。可以在DP107或DP107截短物中导入一个或多个这样的插入，只要这样的插入产生的肽仍然可以被上面描述的107x178x4、ALLMOTI5或PLZIP搜索基序识别即可。
优选的氨基或羧基末端插入是长度为大约2到大约50个氨基酸残基的肽，分别对应于实际的DP107 gp41氨基酸序列的氨基或羧基方向的gp41蛋白区域。因此，优选的氨基末端或羧基末端氨基酸插入将包含在gp41蛋白紧接DP107区域的氨基或羧基方向上发现的gp41氨基酸序列。
DP107或DP107截短物的缺失也在本发明的范围内。这样的缺失由从DP107或DP107样肽序列中除去一个或多个氨基酸构成，产生的肽序列的下限长度为4到6个氨基酸。
这样的缺失可以包括肽序列的单个连续的或一个以上不连续的部分。可以在DP107或DP107截短物中导入一个或多个这样的缺失，只要这样的缺失产生的肽仍然可以被上面描述的107x178x4、ALLMOTI5或PLZIP搜索基序识别即可。
DP107和DP107截短物在美国专利No.5,656,480中进行了更全面的描述。
DP107和DP178类似物
对应于上面描述的本发明的DP178、DP178截短物、DP107和DP107截短物序列的类似物的肽，可以在其它病毒中发现，包括例如非HIV-1包膜病毒、非包膜病毒和其它非病毒生物体。
这样的DP178和DP107类似物，可以对应于例如包膜病毒的跨膜(“TM”)蛋白中存在的肽序列，和可以对应于非包膜和非病毒生物体中存在的肽序列。这样的肽可以表现出抗融合活性、抗病毒活性，更具体来说是对在其中发现它们天然序列的病毒具有特异性的抗病毒活性，或可表现出调节涉及卷曲螺旋肽结构的细胞内过程的能力。
DP178类似物
DP178类似物，是其氨基酸序列含有例如对应于DP178来源的gp41肽区域的其它(即HIV-1之外)病毒肽区域氨基酸序列的肽。这样的病毒可以包括但不限于其它HIV分离株和HIV-2分离株。
源于其它(即非HIV-1LAI)HIV-1分离株的相应gp41肽区域的DP178类似物，可以包含例如下面显示的肽序列。
NH2-YTNTIYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH(SEQ ID NO：18)
NH2-YTGIIYNLLEESQNQQEKNEQELLELDKWANLWNWF-COOH(SEQ ID NO：19)
NH2-YTSLIYSLLEKSQIQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH(SEQ ID NO：10)
SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的肽分别源自HIV-1SF2、HIV-1RF和HIV-1MN。其它的DP178类似物包括源于HIV-2的，包括US 2005/0070475的SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的肽，它们分别源于HIV-2ROD和HIV-2NIHZ。其它有用的类似物包括US2005/0070475的SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的肽，它们已被证实显示出抗病毒活性。
在本发明中，优选DP178类似物表示其氨基酸序列对应于gp41蛋白的DP178区域的肽，此外，还考虑到本文公开的肽还可以包含长度为大约2到大约50个氨基酸残基范围的氨基酸序列，其对应于实际的DP178氨基酸序列的氨基或羧基方向的gp41蛋白区域。
US 2005/0070475的表6和表7显示了HIV-2NIHZ DP178类似物的一些可能的截短物，它们可以含有3到36个氨基酸残基之间的肽(即肽的大小从三肽到36-mer多肽)。这些表中的肽序列是从氨基(左)到羧基(右)末端列出的。
其它的DP178类似物和DP107类似物
DP178和DP107类似物是例如通过使用上面描述的107x178x4、ALLMOTI5或PLZIP计算机辅助搜索策略识别或鉴定的。搜索策略鉴定了预计具有类似DP107和/或DP178的结构和/或氨基酸序列特征的其它肽区域。
搜索策略在美国专利Nos.6,013,263、6,017,536和6,020,459的第9节显示的实施例中进行了充分的描述。尽管该搜索策略部分是基于从DP107和DP178推导的一级氨基酸基序，但它不仅仅是基于搜索一级氨基酸序列同源性，因为这样的蛋白序列同源性存在于病毒的主要类别之内，而不是之间。例如，在HIV-1不同毒株的TM蛋白内、或在猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的不同分离株的TM蛋白内，一级氨基酸序列同源性是高的。
在美国专利Nos.6,013,263、6,017,536和6,020,459中公开的计算机搜索策略，成功地鉴定了与DP107和DP178相似的蛋白区域。该搜索策略被设计成用于可商购的序列数据包，优选PC/Gene。
在美国专利Nos.6,013,263、6,017,536和6,020,459中，设计并工程化了一系列搜索基序107x178x4、ALLMOTI5和PLZIP基序，其严紧性范围从严格到宽泛，其中107x178x4是优选的。通过这些基序鉴定到的序列，例如在美国专利Nos.6,013,263、6,017,536和6,020,459的表V-XIV中列出的序列，潜在地表现出抗融合、例如抗病毒的活性，可以另外用于抗融合例如抗病毒的化合物的鉴定。
其它的抗病毒肽
抗RSV肽
抗RSV肽包括从RSV中相应的肽序列中鉴定到的DP178和/或DP107类似物，它们已经被进一步鉴定为抑制RSV引起的病毒感染。这些目标肽包括US 2005/0070475的表16的肽以及SEQ ID NO：10到SEQ ID NO：30的肽。合成这些肽的详细方案公开在US 2005/0070475中，其内容在此特别引为参考。其中特别有利的是下面的肽：
YTSVITIELSNIKENKCNGAKVKLIKQELDKYK(SEQ ID NO：21)
TSVITIELSNIKENKCNGAKVKLIKQELDKYKN(SEQ ID NO：22)
VITIELSNIKENKCNGAKVKLIKQELDKYKNAV(SEQ ID NO：23)
IALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDK(SEQ IDNO：24)
US 2005/0070475的SEQ ID NO：10的肽源自于RSV的F2区域，并在美国专利Nos.6,103,236和6,020,459中使用了所描述的搜索基序鉴定为对应于DP107和DP178肽(即“DP107/178样”)。SEQ ID NO：21到SEQ ID NO：23的肽各具有包含在SEQ ID NO：10中的氨基酸序列，且每个都已被显示表现出抗RSV活性，具体来说，在低于50μg/ml的浓度下抑制RSV感染的与未感染的Hep-2细胞之间的融合和合胞体形成。
US 2005/0070475的SEQ ID NO：11的肽源自于RSV的F1区域，并在美国专利Nos.6,103,236和6,020,459中使用了所描述的搜索基序鉴定为对应于DP107(即“DP107样”)。SEQ ID NO：24的肽所含的氨基酸序列包含在US 2005/0070475的SEQ ID NO：10内，并同样已被显示表现出抗RSV活性，具体来说，在低于50μg/ml的浓度下抑制RSV感染的与未感染的Hep-2细胞之间的融合和合胞体形成。
抗HPIV肽
抗HPIV肽包括从HPIV中相应的肽序列中鉴定到的、已被进一步鉴定为抑制HPIV引起的病毒感染的DP178和/或DP107类似物。这些目标肽包括US 2005/0070475的表17的肽以及SEQ ID NO：31到SEQID NO：62的肽。合成这些肽的详细方案公开在US 2005/0070475中，其内容在此特别引为参考。其中特别感兴趣的是下面的肽：
VEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLI(SEQ IDNO：25)
RSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLIVAIKSV(SEQ IDNO：26)
NSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKL(SEQ IDNO：27)
ALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSI(SEQ IDNO：28)
LDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIG(SEQ IDNO：29)
DPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGN(SEQ IDNO：30)
PIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGNW(SEQ IDNO：31)
IDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGNWH(SEQ IDNO：32)
US 2005/0070475的SEQ ID NO：31的肽源自于HPIV-3的F1区域，并在美国专利Nos.6,103,236和6,020,459中使用了所描述的搜索基序鉴定为对应于DP107(即“DP107样”)。SEQ ID NO：25和SEQID NO：26的肽各具有包含在US 2005/0070475的SEQ ID NO：30的肽内的氨基酸序列，且每个都已被显示表现出抗HPIV-3活性，具体来说，在低于1μg/ml的浓度下抑制HPIV-3感染的Hep2细胞与未感染的CV-1W细胞之间的融合和合胞体形成。
US 2005/0070475的SEQ ID NO：32的肽源自于HPIV-3的F1区域，并在美国专利Nos.6,103,236和6,020,459中使用了所描述的搜索基序鉴定为对应于DP178的(即“DP178样”)。SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28到SEQ ID NO：32的肽各具有包含在US 2005/0070475的SEQ ID NO：32的肽内的氨基酸序列，并每个也已被显示表现出抗HPIV-3活性，具体来说，在低于1μg/ml的浓度下抑制HPIV-3感染的Hep2细胞与未感染的CV-1W细胞之间的融合和合胞体形成。
抗MeV肽
抗MeV肽是从麻疹病毒(MeV)中相应的肽序列中鉴定到的DP178和/或DP107类似物，其已被进一步鉴定为抑制麻疹病毒引起的病毒感染。这些特定的目标肽包括US 2005/0070475的表19的肽以及SEQ IDNO：74到SEQ ID NO：86的肽。合成这些肽的详细方案公开在US2005/0070475中，其内容在此特别引为参考。其中特别感兴趣的是下面列出的肽：
HRIDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEAKELLE(SEQ IDNO：33)
IDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEAKELLESS(SEQ ID NO：34)
LGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEAKELLESSDQ(SEQ IDNO：35)
PISLERLDVGTNLGNAIAKLEAKELLESSDQILR(SEQ ID NO：36)
源自于麻疹病毒的序列，在美国专利Nos.6,103,236和6,020,459中使用所描述的搜索基序鉴定为对应于DP178(即“DP178样”)。SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36的肽各具有如此鉴定的氨基酸序列，且每个都已被显示表现出抗MeV活性，具体来说，在低于1μg/ml的浓度下抑制MeV感染的Hep2细胞与未感染的人用狂犬病纯化疫苗(Vero)细胞之间的融合和合胞体形成。
抗SIV肽
抗SIV肽是从SIV中相应的肽序列中鉴定到的DP178和/或DP107类似物，其已被进一步鉴定为抑制SIV引起的病毒感染。这样的目标肽包括US 2005/0070475的表18的肽以及SEQ ID NO：63到SEQ IDNO：73的肽。合成这些肽的详细方案公开在US 2005/0070475中，其内容在此特别引为参考。其中特别感兴趣的是下面的肽：
WQEWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQK(SEQ IDNO：37)
QEWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKL(SEQ IDNO：38)
EWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLN(SEQ IDNO：39)
WERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNS(SEQ IDNO：40)
ERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSW(SEQ IDNO：41)
RKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWD(SEQ IDNO：42)
KVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDV(SEQ IDNO：43)
VDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDVF(SEQ IDNO：44)
DFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFG(SEQ IDNO：45)
FLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFGN(SEQ IDNO：46)
源自于SIV跨膜融合蛋白的序列，在美国专利Nos.6,103,236和6,020,459中使用了所描述搜索基序鉴定为对应于DP178(即“DP178样”)。SEQ ID NO：37到SEQ ID NO：46的肽各具有这样鉴定的氨基酸序列，且每个作为粗肽都已被显示表现出有效力的抗SIV活性。
其它病毒和融合抑制剂
“病毒抑制剂衍生物”的表述目的是指选自抗融合化合物或进入抑制剂(或非抗融合)化合物的病毒抑制剂的任何修饰或衍生物。
抗融合化合物包括但不限于恩夫韦地，C34，T-1249，TRI-899，TRI-999，5-螺旋，N36Mut(例如)，NCCG-gp41，DP-107，M41-P，N36，M87o，FM-006，ADS-J1，C14林克美(linkmid)，C34卷曲，溶血素A，IQN17，IQN23，SC34EK，SPI-30，014，SPI-70，038，T-1249-HSA，T-649，T-651，TRI-1144，C14，MBP-107，scC34；SJ-2176，T-1249-转铁蛋白，p26，p38，ADS-J2，C52L，克隆3抗体，D5IgG，D5scFc，F240scFv，西夫韦肽(sifuvirtide)，IZN-36，T-1249模拟体，N-36-E，NB-2，NB-64，S-29-I，茶黄素-3，3′-二没食子酸，VIRIP，西霉素(siamycin)I，西霉素(siamycin)II。
进入抑制剂(或非抗融合)化合物包括但不限于AMD-070，SPC-3，KRH-2731，AMD-8664，FC-131，HIV-1Tat类似物，KRH-1120，KRH-1636，POL-2438，T-134，T-140，基质细胞衍生因子1，ALX40-4C，AMD-3100，T-22，TJN-151，AM-1401，EradicAide病毒巨噬细胞炎性蛋白II，AMD-3451，考诺科万(conocurvone)，马拉韦罗(maraviroc)，维克韦罗(vicriviroc)，INCB-9471，INCB-15，050，DAPTA，PRO-140，HGS-004，SCH-C，TAK-652，TAK-220，尼非韦罗(nifeviroc)，AMD-887，抗CD63MAb，AOP-RANTES，CPMD-167，E-913，FLSC R/T-IgG1，HGS-101，NIBR-1282，诺大肯(nonakine)，PSC-RANTES，sCD4-17b，SCH-350，634，MIP-1α，MIP-1β，RANTES，阿普韦罗(aplaviroc)，肽T，TAK-779，pCLXSN载体，UCB-35，625，J-113，863，CLIV，1-309，EGCG，表没食子儿茶素没食子酸酯，HB-19，λ角叉菜胶，PC-515，可得兰胶(curdlan)硫酸酯，OKU-40，OKU-41，VGV-1，净特韦(Zintevir)，AR-177，T-30，177，琥珀酸化白蛋白，NSC0-658，586，ISIS-5320，RP-400c，SA-1042，C31G，沙维(Savvy)，PRO-542，rCD4-IgG2，BMS-488，043，BMS-378，806，DES-6，12p1，阿克汀文(Actinohivin)，BlockAide/VP，CD4M33，CT-319，CT-326，西亚诺韦林(cyanovirin)-N，DCM-205，DES-10，格里夫辛(griffithsin)，HNG-105，NBD-556，NBD-557，PEG-西亚诺韦林(cyanovirin)-N，西托韦林(scytovirin)，sCD4，葡聚糖-2-硫酸酯，F-105，FP-21，399，TNX-355，B4MAb，R-15-K，sCD38(51-75)MBP，PRO-2000，NSC-13，778，SB-673，461M，SB-673，462M，rsCD4，Ac(Ala10，11)RANTES(2-14)，IC-9564，RPR-103，611，阿木迪尔(Immudel)-gp120，苏力高韦(suligovir)，IQP-0410，乙酰三碘甲状腺原氨酸，SP-01A，DEB-025，CSA-54，HGS-H/A 27，SP-10，VIR-5103，BMS-433，771，TMC-353，121，NSC-650，898，麦克拉敏(Michellamine)B，NSC-692，906，TG-102，VIR-576，MEDI-488，CovX体，CNI-H0294。
抗病毒和抗融合肽的修饰
本发明考虑到了对表现出抗病毒和/或抗融合活性的肽进行修饰，包括DP-107和DP-178及其类似物这样的修饰。这样的修饰的肽可以与血液成分上的可用反应性官能团通过共价键发生反应。本发明也涉及了这样的修饰、这样的与血液成分的组合，以及它们的使用方法。这些方法包括与向患者施用未结合的肽相比，延长结合的抗病毒肽衍生物的有效治疗期限。修饰的肽是一类被命名为DACTM(药物亲和复合物)的肽，含有抗病毒肽分子和连接基团，以及能够与移动的血液蛋白的反应性官能团反应的化学反应性基团。通过与血液成分或蛋白反应，修饰的肽或DAC可以经血液投送到适当的位点或受体。
为了与蛋白上的官能团形成共价键，人们可以使用多种多样的活性羧基基团作为反应性基团，特别是酯，其中羟基部分在修饰的肽所需的水平下是生理可接受的。尽管许多不同的羟基可以用在这些反应性基团中，但最方便的是N-羟基琥珀酰亚胺或(NHS)、N-羟基-硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)。在本发明的优选实施方案中，蛋白上的官能团将是巯基，反应性基团将是含有马来酰亚胺的基团，例如γ-马来酰亚胺-丁酰胺(GMBA)或马来酰亚胺基丙酸(MPA)。
伯胺是NHS酯的首要靶。蛋白N-末端上存在的可接近的α-氨基与NHS酯发生反应。但是，蛋白上的α-氨基对于NHS连接来说可能是不想要的或不可用的。尽管有5种氨基酸在其侧链上具有氮，但是只有赖氨酸的ε-氨基与NHS酯发生显著反应。当NHS酯结合反应与伯胺发生反应释放出N-羟基琥珀酰亚胺时，形成了酰胺键，如下面的示意图所示。
Figure A20088002216300531
NHS-酯反应图
在本发明的优选实施方案中，该蛋白上的官能基团将是巯基，化学反应性基团将是含有马来酰亚胺的基团，例如MPA或GMBA(γ-马来酰亚胺-丁酰胺)。当反应混合物的pH保持在6.5到7.4之间时，马来酰亚胺基团对肽上的巯基最具选择性。在pH7.0下，马来酰亚胺基团与巯基的反应速率比与胺快1000倍。在马来酰亚胺基团与巯基之间形成了稳定的硫醚键，其在生理条件下不能被裂解，如下面的示意图所示。
Figure A20088002216300532
马来酰亚胺反应图
特异性标记
优选，本发明的修饰的肽被设计成与移动的血液蛋白上的巯基特异性反应。优选这样的反应通过将用马来酰亚胺连接修饰的肽(例如从GMBA、MPA或其它马来酰亚胺制备)共价键合到移动的血液蛋白例如血清白蛋白或IgG的巯基上来建立。
在某些情况下，使用马来酰亚胺特异性标记提供了优于使用基团例如NHS和N-羟基-硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)对移动蛋白进行非特异性标记的几个优点。巯基在体内不如氨基丰富。因此，本发明的马来酰亚胺基修饰的肽，即马来酰亚胺肽，将与较少的蛋白共价键合。例如，在白蛋白(最丰富的血液蛋白)中，只有一个巯基。因此，肽-马来酰亚胺-白蛋白结合物将倾向于包含大约1∶1摩尔比例的肽与白蛋白。除了白蛋白之外，IgG分子(II类)也具有游离巯基。因为IgG分子与血清白蛋白占血液中可溶性蛋白的绝大部分，因此它们也占血液中可用于与马来酰亚胺修饰的肽共价键合的游离巯基的绝大部分。
此外，即使在含有游离巯基的血液蛋白、包括IgGs中，由于白蛋白本身的独特性质，用马来酰亚胺进行特异性标记也导致优先形成肽-马来酰亚胺-白蛋白结合物。在物种间高度保守的白蛋白的单个游离巯基，位于34位氨基酸残基上(Cys34)。最近已经证明，白蛋白的Cys34相对于其它含有游离巯基的蛋白上的游离巯基来说，具有增加的反应性。这部分是由于白蛋白的Cys34的pK值非常低，仅为5.5。这远低于一般的半胱氨酸残基的典型pK值，其典型为大约8。由于这种低的pK，在正常生理条件下，白蛋白的Cys34主要为离子化形式，这急剧增加了它的反应性。除了Cys34的低pK值之外，增强Cys34的反应性的另一个因素是它的位置，它在接近白蛋白V区的一个环的表面的裂隙中。该位置使Cys34非常可用于所有种类的配体，并在Cys34作为自由基捕集器和游离巯基清除剂的生理角色中是一个重要因素。这些性质使得Cys34与马来酰亚胺-肽具有高度反应性，其反应速率的加速与马来酰亚胺-肽和其它含有游离巯基的蛋白的反应速率相比，可以高达1000倍。
肽-马来酰亚胺-白蛋白结合物的另一个优点是重复性，这和Cys34处肽与白蛋白特异性的1∶1载荷有关。其它技术，例如，游离胺的戊二醛、DCC、EDC和其它化学活化，缺少这种选择性。例如，白蛋白含有52个赖氨酸残基，其中25-30个位于白蛋白的表面上，因此可用于结合。活化这些赖氨酸残基，或可选地对肽进行修饰以通过这些赖氨酸残基连接，将产生结合物的异质群体。即使使用1∶1摩尔比例的肽与白蛋白，结果也将由多种结合产物构成，某些在每个白蛋白上含有0、1、2或以上的肽，并且每个都在25-30个可用赖氨酸位点的任何一个或多个上随机连接有肽。由于大量的可能组合，对每个结合物批次的精确组成和性质的表征变得困难，批与批的可重复性几乎不可能，使得这样的结合物不适合用作治疗药物。此外，尽管似乎通过白蛋白的赖氨酸残基的结合将至少具有每个白蛋白分子投送更多治疗药剂的优点，但研究显示，治疗药剂与白蛋白的1∶1比例是优选的。在Stehle等的文章“装载比率决定了氨甲蝶呤-白蛋白结合物在大鼠中的肿瘤靶定性质”(The Loading Rate Determines Tumor Targeting properties ofMethotrexate-Albumin Conjugates in Rats)，Anti-Cancer Drugs，Vol.8，pp.677-685(1988)中，作者报道了抗癌氨甲喋呤与白蛋白以1∶1的比例通过戊二醛结合，给出了最有希望的结果。这些结合物被肿瘤细胞优先摄取，而带有5∶1到20∶1的氨甲喋呤分子的结合物具有改变的HPLC谱，并在体内被肝脏快速摄取。据推测，在这些较高的比例下，白蛋白的构象变化降低了它作为治疗药物载体的有效性。
通过在体内受控施用马来酰亚胺-肽，人们可以控制体内白蛋白和IgG的特异性标记。在典型的施用中，施用的马来酰亚胺-肽的80-90％将标记白蛋白，少于5％将标记IgG。游离巯基例如谷胱甘肽的痕量标记也将发生。这样的特异性标记对于体内应用来说是优选的，因为它允许精确地计算所施用的药剂的估计半衰期。
除了提供受控的特异性体内标记之外，马来酰亚胺-肽还可以提供血清白蛋白和IgG的离体特异性标记。这样的离体标记包括向血液、血清或含有血清白蛋白和/或IgG的盐溶液中加入马来酰亚胺-肽。一旦与马来酰亚胺-肽发生离体结合之后，血液、血清或盐溶液可以重新施用于患者的血液中，用于体内治疗。
与NHS-肽相反，马来酰亚胺-肽在存在水性溶液和存在游离胺的情况下一般相当稳定。因为马来酰亚胺-肽只与游离巯基发生反应，因此一般不需要保护性基团来防止马来酰亚胺-肽与它本身反应。此外，修饰的肽的稳定性增加，允许使用进一步的纯化步骤例如HPLC来制备适合于体内应用的高纯度产物。最后，增加的化学稳定性提供了具有更长的储存期限的产品。
非特异性标记
本发明的抗病毒肽也可以被修饰，用于非特异性标记血液成分。也可以使用与氨基基团成键，特别是形成酰胺键来进行非特异性标记。为了形成这样的键，人们可以使用多种多样的活性羧基基团作为化学反应性基团，特别是酯，其中羟基部分在所需的水平下是生理可接受的。尽管这些连接剂可以使用许多不同的羟基，但最方便的是N-羟基琥珀酰亚胺或(NHS)和N-羟基-硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)。
其它可以使用的连接剂描述在美国专利5,612,034中。
修饰的肽的化学反应性基团可以在体内与之反应的各种位点包括细胞，特别是血红细胞(红细胞)，和血小板以及蛋白，例如免疫球蛋白包括IgG和IgM，血清白蛋白，铁蛋白，类固醇结合蛋白，转铁蛋白，甲状腺素结合蛋白，α-2-巨球蛋白等。修饰的肽与之反应的那些受体不是长期存活的，一般在大约3天内从人类宿主中消除。上面指出的蛋白(包括细胞的蛋白)，根据在血液中的浓度，特别是针对半衰期来说，将保持至少3天，并可能保持5天以上(通常不超过60天，更通常不超过30天)。
反应绝大部分将与血液中的移动成分发生，特别是血液蛋白和细胞，更特别是血液蛋白和红细胞。“移动的”是指成分不具有任何较长时期的固定位置，一般不超过5分钟，更通常为1分钟，尽管某些血液成分可以相对静止较长的时期。一开始，存在着功能化蛋白和细胞的相对异质群体。但是，绝大部分群体在几天内将与最初的群体相比有显著变化，这取决于功能化蛋白在血流中的半衰期。因此，通常在大约3天或更多天内，IgG将变成血流中的主要功能化蛋白。
通常，到给药后5天，IgG、血清白蛋白和红细胞将为血液中结合成分的至少大约60摩尔％，通常为至少大约75摩尔％，其中IgG、IgM(程度明显降低)和血清白蛋白为非细胞结合成分的至少大约50摩尔％，通常至少大约75摩尔％，更通常至少大约80摩尔％。
非特异性修饰的肽与血液成分的所需结合物，可以通过将修饰的肽给患者施用而在体内制备，患者可以是人类或其它哺乳动物。施用可以快速推注的形式进行，或者使用计量流量通过滴注随时间缓慢导入，等等。
如果需要，也可以通过将血液与本发明的修饰的肽混合，使修饰的肽与血液成分上的反应性官能团共价键合，然后将结合的血液返回或施用于宿主，来离体制备目标结合物。此外，以上也可以通过首先纯化个体的血液成分或有限数量的成分例如血红细胞、免疫球蛋白、血清白蛋白等，并将成分与化学反应性修饰的肽离体混合来实现。然后可以将功能化的血液或血液成分返回到宿主，在体内提供目标治疗有效性结合物。也可以对血液进行处理，以防止在离体操作期间发生凝结。
修饰的抗病毒和抗融合肽的合成
A.肽合成
本发明的抗病毒和/或抗融合肽可以通过本技术领域的普通专业人员已知的固相肽化学标准方法来合成。例如，可以按照Steward和Young描述的程序(Steward，J.M.和Young，J.D.，《固相肽合成》(第二版)，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd Ed.，Pierce Chemical Company，Rockford，111.，(1984))，使用Applied Biosystem的合成仪，通过固相化学技术来合成肽。类似地，可以合成多个肽片段，然后连接在一起形成较大的肽。这些合成的肽也可以在特定位置进行氨基酸取代。
对于固相肽合成来说，许多技术的汇总可以在J.M.Stewart和J.D.Young的《固相肽合成》(Solid Phase Peptide Synthesis，W.H.FreemanCo.(San Francisco)，1963)和J.Meienhofer的《激素蛋白和肽》(第二卷)(Hormonal Proteins and Peptides，vol.2，p.46，Academic Press(NewYork)，1973)中找到。对于经典的溶液合成，参见G.Schroder和K.Lupke的《肽》(第一卷)(The Peptides，Vol.1，Acacemic Press(New York))。一般来说，这些方法包括向增长的肽链连续添加一个或多个氨基酸或适合的受保护的氨基酸。通常，第一个氨基酸的氨基或羧基基团被适当的保护基团所保护。然后通过加入具有受到适当保护的互补(氨基或羧基)基团的序列中的下一个氨基酸，并在适合于形成酰胺键的条件下，将被保护的或衍生的氨基酸连接到惰性固相支持物上，或用在溶液中。然后从该新添加的氨基酸残基上除去保护基团，并加入下一个氨基酸(被适当保护的)，依此类推。
在所有所需的氨基酸已经连接到适合的序列中后，相继或同时地移除任何剩余的保护基团(以及任何固相支持物)，以获得最终的多肽。通过对该通用程序进行简单的修改，有可能可以向增长的链一次添加一个以上的氨基酸，例如，通过将受保护的三肽与适当保护的二肽连接(在不使手性中心消旋的条件下)，在去保护后，形成了五肽。
制备本发明化合物的特别优选的方法，包括固相肽合成，其中氨基酸的α-N-末端被酸或碱敏感性基团所保护。这样的保护基团应该具有在肽键形成条件下稳定的性质，同时容易被移除而不破坏增长的肽链或使其中包含的任何手性中心消旋。适合的保护基团是9-芴甲氧羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)、苯甲基氧基羰基(Cbz)、二苯基异丙氧基羰基、叔戊氧基羰基、异冰片基氧基羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基苯甲氧基羰基、邻硝基苯基氧硫基、2-氰基-叔丁氧基羰基等。9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护基团对于合成本发明的肽来说是特别优选的。其它优选的侧链保护基团是用于例如赖氨酸和精氨酸的侧链氨基基团的2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-璜酰基(pmc)、硝基、对甲苯璜酰基、4-甲氧基苯璜酰基、Cbz、Boc和金刚烷氧基羰基；用于酪氨酸的苯甲基、邻溴苯甲氧基羰基、2，6-二氯苯甲基、异丙基、叔丁基(t-Bu)、环己基、环戊基和乙酰基(Ac)；用于丝氨酸的叔丁基、苯甲基和四氢吡喃基；用于组氨酸的三苯甲基、苯甲基、Cbz、对甲苯璜酰基和2，4-二硝基苯基；用于色氨酸的甲酰基；用于天冬氨酸和谷氨酸的苯甲基和叔丁基，以及用于半胱氨酸的三苯基甲基(三苯甲基)。
在固相肽合成方法中，α-C-末端氨基酸连接到适合的固相支持物或树脂上。可用于上述合成的适合的固相支持物，是对于逐级缩合-去保护反应的试剂和反应条件惰性，并在使用的介质中不溶的材料。用于α-C-末端羧基肽合成的优选固相支持物是4-羟甲基苯氧基甲基-共聚(苯乙烯-1％二乙烯基苯)。用于α-C-末端酰胺肽的优选固相支持物是可以从Applied Biosystems(Foster City，Calif)获得的4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基乙酰氨基乙基树脂。α-C-末端氨基酸如下连接到树脂上：在溶剂例如二氯甲烷或DMF中，在10℃到50℃之间的温度下，通过N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)或O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲-六氟磷酸酯(HBTU)，使用或不使用4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸酯(BOP)或双(2-氧-3-恶唑烷基)氯化膦(BOPCl)，介导连接大约1到大约24小时。
当固相支持物是4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基-乙酰氨基乙基树脂时，在与上述的α-C-末端氨基酸连接之前，Fmoc基团使用仲胺裂解，优选为哌啶。用于与去保护的4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基-乙酰氨基乙基树脂连接的优选方法，是DMF中的O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲-六氟磷酸酯(HBTU，1当量)和1-羟基苯并三唑(HOBT，1当量)。随后的受保护氨基酸的连接可以在自动多肽合成仪中按照本技术领域熟知的方法进行。在优选实施方案中，增长的肽链的α-N-末端氨基酸用Fmoc保护。从增长的肽的α-N-末端一侧除去Fmoc保护基团，是通过用仲胺、优选哌啶进行处理来完成。然后以大约3倍摩尔过量导入每种受保护的氨基酸，连接优选在DMF中进行。连接剂通常为O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲-六氟磷酸酯(HBTU，1当量)和1-羟基苯并三唑(HOBT，1当量)。
在固相合成结束时，将多肽从树脂上移除并去保护，这可以相继进行或在单独的操作中进行。在单独操作中，多肽的移除和去保护可以通过用含有茴香硫醚、水、乙二硫醇和三氟乙酸的裂解试剂处理树脂结合的多肽来完成。在多肽的α-C-末端是烷基酰胺的情况下，树脂通过用烷基胺进行氨解来裂解。或者，肽可以通过例如与甲醇的转酯反应、然后进行氨解，或直接转酰胺来移除。受保护的肽可以在这时进行纯化，或直接带入下一个步骤。使用上面描述的裂解混合物来完成侧链保护基团的移除。完全去保护的肽通过一系列层析步骤来纯化，使用了任何或所有下列的类型：在弱碱性树脂(乙酸型)上的离子交换；在未衍生的聚苯乙烯-二乙烯苯(例如Amberlite XAD)上的疏水吸附层析；硅胶吸附层析；在羧甲基纤维素上的离子交换层析；分配层析，例如在Sephadex G-25、LH-20上或逆流分配；高效液相色谱(HPLC)，特别是在辛基-或十八烷基甲硅烷基-二氧化硅键合相柱填料上的反向HPLC。这些ITPs的分子量使用快速原子轰击(FAB)质谱法来测定。
N-末端保护基团
正如上面讨论的，术语“N-保护基团”是指打算用于保护氨基酸或肽的α-N-末端，或保护氨基酸或肽的氨基基团免于合成过程中的不需要的反应的基团。常用的N-保护基团公开在Greene的《有机合成中的保护基团》(Protective Groups In Organic Synthesis，John Wiley &Sons，New York(1981))中，在此引为参考。此外，保护基团可用作前体药物，可以在体内容易地被例如酶法水解切开，释放出生物活性母体。α-N-保护基团包括低级烷酰基，例如甲酰基、乙酰基(“Ac”)、丙酰基、三甲基乙酰基、叔丁基乙酰基等；其它酰基基团包括2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、邻苯二甲酰基、邻硝基苯氧乙酰基、-氯丁酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基等；磺酰基例如苯磺酰基、对甲苯磺酰基等；氨基甲酸酯形成基团例如苯甲氧基羰基、对氯苯甲氧基羰基、对甲氧基苯甲氧基羰基、对硝基苯甲氧基羰基、2-硝基苯甲氧基羰基、对溴苯甲氧基羰基、3，4-二甲氧基苯甲氧基羰基、3，5-二甲氧基苯甲氧基羰基、2，4-二甲氧基苯甲氧基羰基、4-乙氧基苯甲氧基羰基、2-硝基-4，5-二甲氧基苯甲氧基羰基、3，4，5-三甲氧基苯甲氧基羰基、1-(对联二苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基苯甲氧基羰基、二苯甲氧基羰基、叔丁氧基羰基(Boc)、二异丙基甲氧基羰基、异丙氧基羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、2，2，2，-三氯乙氧基羰基、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴基-9-甲氧基羰基、环戊基氧基羰基、金刚烷氧基羰基、环己基氧基羰基、苯基硫代羰基等；芳烷基例如苯甲基、三苯基甲基、苯甲氧基甲基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)等，以及甲硅烷基例如三甲基甲硅烷基等。
羧基保护基团
正如上面讨论的，术语“羧基保护基团”是指当进行涉及化合物的其它功能性位点的反应时，用于阻断或保护羧酸官能团的羧酸保护性酯或酰胺基团。羧基保护基团公开在Greene的《有机合成中的保护基团》(“Protective Groups In Organic Synthesis”pp.152-186(1981))中，在此引为参考。此外，羧基保护基团可以用作前体药物，藉此羧基保护基团在体内容易通过例如酶法水解切开，释放出生物活性母体。这样的羧基保护基团对于本技术领域的专业人员来说是熟知的，已经广泛用于在青霉素和头孢菌素领域中保护羧基基团，如美国专利Nos.3,840,556和3,719,667中所述，其公开内容在此引为参考。代表性的羧基保护基团是C1-C8低级烷基(例如甲基、乙基或叔丁基等)；芳烷基例如苯乙基或苯甲基或其取代的衍生物例如烷氧基苯甲基或硝基苯甲基等；芳烷烯基例如苯乙烯基等；芳基及其取代的衍生物例如5-茚满基等；二烷基氨基烷基例如二甲基氨基乙基等；烷酰基氧基烷基例如乙酰氧基甲基、丁酰氧基甲基、戊酰氧基甲基、异丁酰氧基甲基、异戊酰氧基甲基、1-(丙酰氧基)-1-乙基、1-(三甲基乙酰氧基)-1-乙基、1-甲基-1-(丙酰氧基)-1-乙基、三甲基乙酰氧基甲基、丙酰氧基甲基等；环烷酰基氧基烷基基团例如环丙羰基氧基甲基、环丁羰基氧基甲基、环戊羰基氧基甲基、环己羰基氧基甲基等；芳酰基氧基烷基例如苯甲酰基氧基甲基、苯甲酰基氧基乙基等；芳烷基羰基氧基烷基例如苯甲基羰基氧基甲基、2-苯甲基羰基氧基乙基等；烷氧基羰基烷基或环烷氧基羰基烷基例如甲氧基羰基甲基、环己基氧基羰基甲基、1-甲氧基羰基-1-乙基等；烷氧基羰基氧基烷基或环烷氧基羰基氧基烷基例如甲氧基羰基氧基甲基、叔丁氧基羰基氧基甲基、1-乙氧基羰基氧基-1-乙基、1-环己氧基羰基氧基-1-乙基等；芳氧基羰基氧基烷基例如2-(苯氧基羰基氧基)乙基、2-(5-茚满基氧基羰基氧基)乙基等；烷氧基烷基羰基氧基烷基例如2-(1-甲氧基-2-甲基丙-2-酰氧基)乙基等；芳烷氧基羰基氧基烷基例如2-(苯甲氧基羰基氧基)乙基等；芳基烯氧基羰基氧基烷基例如2-(3-苯基丙烯-2-基氧基羰基氧基)乙基等；烷氧基羰基氨基烷基例如叔丁氧基羰基氨基甲基等；烷基氨基羰基氨基烷基例如甲基氨基羰基氨基甲基等；烷酰基氨基烷基例如乙酰基氨基甲基等；杂环羰基氧基烷基例如4-甲基哌嗪基羰基氧基甲基等；二烷基氨基羰基烷基例如二甲基氨基羰基甲基、二乙基氨基羰基甲基等；(5-(低级烷基)-2-氧-1，3-二氧戊-烯-4-基)烷基例如(5-叔丁基-2-氧-1，3-二氧戊烯-4-基)甲基等；以及(5-苯基-2-氧-1，3-二氧戊烯-4-基)烷基例如(5-苯基-2-氧-1，3-二氧戊烯-4-基)甲基等。
代表性的酰胺羧基保护基团是氨基羰基和低级烷基氨基羰基基团。
本发明优选的羧基被保护的化合物，是这样的化合物，其中被保护的羧基基团是低级烷基、环烷基或芳烷基酯，例如甲酯、乙酯、丙酯、异丙酯、丁酯、仲丁酯、异丁酯、戊酯、异戊酯、辛酯、环己酯、苯乙酯等，或烷酰基氧基烷基、环烷酰基氧基烷基、芳酰基氧基烷基或芳烷基羰基氧基烷基酯。优选的酰胺羧基保护基团是低级烷基氨基羰基基团。例如，天冬氨酸可以在α-C-末端被酸不稳定基团(例如叔丁基)保护，在β-C-末端被氢化不稳定基团(例如苯甲基)保护，然后在合成过程中选择性去保护。
肽修饰
依赖于包含肽的各种元件的性质，产生本发明的修饰的肽的方式也将广泛变化。选择合成程序是要简单、提供高的产量、以及允许获得高纯度的稳定产物。一般来说，化学反应性基团在合成的最后阶段产生，例如对于羧基来说，酯化以形成活性酯。用于生产本发明的修饰的肽的具体方法描述在下面。
具体来说，对所选的肽首先进行抗病毒活性分析，然后只用连接基团在肽的N-末端、C-末端或内部进行修饰。然后分析该修饰的肽-连接基团的抗病毒活性。如果抗病毒活性没有急剧降低(即降低少于10倍)，那么通过其体内寿命测量修饰的肽-连接基团的稳定性。如果稳定性没有增加到所需水平，那么在另一个位点对肽进行修饰，并重复该过程，直到获得所需的抗病毒和稳定性水平。
更具体来说，被选择用接头和反应性本体基团进行修饰的每个肽，将按照下面的标准进行修饰：如果肽上的末端羧基可用并且对于保持抗病毒活性不是关键的，并且在肽上没有其它敏感官能基团，那么被选择羧酸作为接头-反应性基团修饰的连接点。如果末端羧基参与抗病毒活性，或者如果没有羧酸可用，那么将选择任何其它对于保留抗病毒活性不关键的敏感官能基团，作为接头-反应性基团修饰的连接点。如果在肽上有几个敏感官能基团可用，那么将使用保护基团的组合，使得在添加接头/反应性本体并将所有被保护的敏感官能基团去保护后，仍然获得抗病毒活性的保留。如果在肽上没有敏感官能基团可用，或者如果需要更简单的修饰途径，合成工作将可以是修饰原始的肽，使得维持保留抗病毒性。在这种情况下，修饰将发生在肽的相反末端。
NHS衍生物可以在肽中不存在其它敏感官能基团的情况下，从羧酸合成。具体来说，这样的肽在无水CH2Cl2和EDC中与N-羟基琥珀酰亚胺反应，将产物通过层析纯化或从适合的溶剂系统重结晶，以给出NHS衍生物。
或者，NHS衍生物可以从含有氨基和/或巯基和羧酸的肽合成。当分子中存在游离氨基或巯基基团时，优选在进行NHS衍生物的添加之前保护这些敏感官能基团。例如，如果分子含有游离氨基，在进行上面描述的化学之前，将胺转化成Fmoc或优选转化成tBoc保护的胺是必要的。在制备了NHS衍生物之后，胺官能团将不被去保护。因此，这种方法只适用于不需要其胺基游离来诱导所需的抗病毒效应的化合物。如果需要氨基游离来保持分子的原始性质，那么将不得不进行下面描述的另一种类型的化学。
此外，NHS衍生物可以从含有氨基或巯基但没有羧基的肽合成。当所选的分子不含羧酸时，可以使用一批双官能接头将分子转变成反应性NHS衍生物。例如，将乙二醇-双(琥珀酰亚胺基琥珀酸)(EGS)和三乙胺溶解在DMF中并加入到含有游离氨基的分子中(10∶1的比例，有利于EGS)，将产生单NHS衍生物。为了从巯基衍生分子产生NHS衍生物，人们可以使用DMF中的N-[-马来酰亚胺丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS)和三乙胺。马来酰亚胺基团将与游离巯基反应，并通过在硅土上层析或通过HPLC，从反应混合物中纯化NHS衍生物。
NHS衍生物也可以从含有多个敏感官能基团的肽合成。必须对每种情况进行分析并通过不同的方式解决。但是，受惠于可商购的大量保护基团和双官能接头，本发明可应用于任何肽，优选只有一个化学步骤来修饰肽(如上所述)，或两个步骤(如上所述包括敏感基团的预先保护)或三个步骤(保护，活化和去保护)。只有在例外的情况下，才需要多步骤(超过三个步骤)的合成，将肽转化成活性的NHS或马来酰亚胺衍生物。
马来酰亚胺衍生物也可以从含有游离氨基和游离羧酸的肽合成。为了从氨基衍生分子生产马来酰亚胺衍生物，人们可以使用DMF中的N-[γ-马来酰亚胺丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS)和三乙胺。琥珀酰亚胺酯基团将与游离氨基反应，并通过结晶或通过在硅土上层析或通过HPLC，从反应混合物中纯化马来酰亚胺衍生物。
最后，马来酰亚胺衍生物可以从含有多个其它敏感官能基团并不含游离羧酸的肽合成。当所选的分子不含羧酸时，可以使用一批双官能交联试剂将分子转变成反应性NHS衍生物。例如，使用在DMF中的HBTU/HOBt/DIEA活化，通过游离胺与MPA的羧基反应，马来酰亚胺丙酸(MPA)可以与游离胺连接，产生马来酰亚胺衍生物。
当需要时，可以备选使用许多其它可商购的异双官能交联试剂。有大量的双官能化合物可用于连接本体。说明性的试剂包括：叠氮基苯甲酰酰肼、N-[4-(对叠氮基水杨酸基氨基)丁基]-3′-[2′-吡啶基二硫代丙酰胺)、双-磺基琥珀酰亚胺基辛二酸酯、己二亚胺二甲基酯、酒石酸二琥珀酰亚胺基酯、N-γ-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯、N-琥珀酰亚胺基[4-叠氮基苯基]-1，3′-二-硫代丙酸酯、N-琥珀酰亚胺基[4-碘代乙酰基]氨基苯甲酸酯、戊二醛以及琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸。
修饰的抗病毒肽的应用
本发明的修饰的抗病毒肽，可以在患有病毒感染的患者的治疗中用作治疗剂，并可以按照下面描述的方法以及本技术领域已知的其它方法给患者施用。修饰的肽的有效治疗剂量可以通过本技术领域的专业人员熟知的程序、并考虑到对肽的潜在毒性的任何顾虑来确定。
修饰的肽也可以预防性施用于以前未感染的个体。在个体遭受暴露于病毒的高度风险的情况下，如当个体已经与存在病毒传播的高风险的感染个体接触时是可发生的，这将是有利的。当已知在对病毒、例如HIV病毒进行治疗时，这可能是格外有利的。例如，在保健工作人员暴露于来自HIV感染个体的血液的情况下，或者在个体参加了使该个体潜在暴露于HIV病毒的高危活动的其它情况下，预防性施用修饰的抗HIV肽将是有利的。
修饰的抗病毒和抗融合肽的施用
一般来说，修饰的肽将在生理可接受的介质中施用，例如去离子水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、盐水、乙醇或其它醇的水溶液、血浆、蛋白溶液、甘露糖醇、葡萄糖水溶液、醇类、植物油等。其它可以包含的添加剂包括缓冲剂，其中介质通常被缓冲到大约5到10的pH范围内，其中缓冲液的浓度一般为大约50到250mM的范围内，盐，其中盐浓度一般在大约5到500mM的范围内，生理可接受的稳定剂等。组合物可以被冷冻干燥以便于储存和运输。
本修饰的肽绝大部分将通过肠胃外施用，例如静脉内(IV)、动脉内(IA)、肌内(IM)、皮下(SC)等。在适合的情况下，可以通过输注施用。在某些情况下，当官能基团的反应相对较慢时，施用可以是经口、经鼻、经直肠、透皮或气溶胶，其中结合物的性质允许它转移到血管系统。通常使用单次注射，虽然如果需要的话，也可以使用一次以上的注射。修饰的肽可以通过任何方便的手段施用，包括注射器、套管针、导管等。
在某些实施方案中，修饰的肽将通过本技术领域已知的方法通过肺部方式施用。用于深部肺投送气溶胶干粉形式的肽或蛋白的技术由Patton等(1997)Chemtech 27(12)：34-38公开。其它公开了肽的肺部施用的参考文献包括Senior，K.等(2000)PSTT Vol 3：281-282，Gumbleton，M.(2006)Advanced Drug Delivery Reviews 58：993-995；Newhouse，M.T.(2006)《制药技术百科全书》(Encyclopedia of PharmaceuticalTechnology)，题为“药物投送：肺部投送”(″Drug Delivery：PulmonaryDelivery″)，以及Labiris，N.R.(2003)J.Clin.Pharmacology 56：600-612。所有这些参考文献的内容在此引为参考。
施用的具体方式将根据施用的量、是单次快速推注还是连续施用等而变化。优选，施用将是血管内的，其中导入位点对于本发明并不重要，优选在血液流动快的位点，例如静脉内，外周或中央静脉。当施用与缓释技术或保护性基质结合时，可以发现其它途径的用处。目的是使修饰的肽有效地分布在血液中，以便能够与血液成分反应。结合物的浓度将广泛变化，一般在大约1pg/ml到50mg/ml的范围内。血管内施用的总量一般在大约0.1mg/ml到大约50mg/ml的范围内、大约5mg/ml到40mg/ml、大约10到30mg/ml、大约10到20mg/ml、或大约5到15mg/ml、大约1mg/ml到大约10mg/ml、或大约1到5mg/ml。
通过与血液的长寿命成分例如免疫球蛋白、血清白蛋白、红细胞和血小板键合，带来了许多优点。肽的活性延长了数天到数周。在该时间期间只需要进行施用一次。可以获得更高的特异性，因为活性的化合物将主要结合于大分子，这样它不太可能被摄入到细胞内，干扰其它生理过程。
监测修饰的肽的存在
可以对哺乳动物宿主血液中修饰的肽化合物的存在进行一次或多次监测。通过获取宿主血液的一部分或样品，人们可以确定肽是否已经以足够具有治疗活性的量与长寿命的血液成分结合，并在随后确定血液中肽化合物的水平。如果需要，人们也可以确定肽与何种血液成分结合。当使用非特异性修饰的肽时，这是特别重要的。对于特异性的马来酰亚胺修饰的肽来说，计算血清白蛋白和IgG的半衰期要简单得多。
免疫分析
本发明的另一方面涉及使用肽、肽类似物或它们的衍生物和结合物的特异性抗体，测定抗病毒肽和/或类似物、或它们的衍生物和结合物在生物学样品(例如血液)中的浓度的方法，以及使用这样的抗体作为与所述肽、类似物和/或它们的衍生物或结合物潜在相关的毒性的治疗。这是有利的，因为肽在患者体内的稳定性和寿命增加可能导致治疗过程中的新问题，包括毒性增加的可能性。
对特定肽、肽类似物或其衍生物具有特异性的单克隆或多克隆抗治疗剂抗体可能有助于调解任何这样的问题。抗体可以从用特定肽、其类似物或衍生物、或用药剂的免疫原性片段或对应于药剂的抗原性决定簇的合成免疫原免疫的宿主中产生或得到。优选的抗体将对肽、肽类似物或衍生物的天然的、修饰的和结合的形式具有高的特异性和亲和性。这样的抗体也可以用酶、荧光染料或放射性标记物标记。
修饰的肽的特异性抗体可以通过使用纯化的肽诱导肽特异性抗体来产生。抗体的诱导，不仅意指通过注射到动物中刺激免疫应答，也指在生产合成的抗体或其它特异性结合分子中的类似步骤，例如重组免疫球蛋白文库的筛选。单克隆和多克隆抗体都可以通过本技术领域熟知的过程来生产。
抗肽抗体可用于治疗由施用修饰的肽、其类似物或衍生物所引起的毒性，并可以离体或体内使用。离体方法包括使用固定于固体支持物的抗治疗剂抗体对毒性进行免疫透析治疗。体内方法包括以有效诱导抗体-药剂复合物清除的量施用抗治疗剂抗体。
通过将血液与抗体在无菌条件下进行接触，可以使用抗体从患者的血液中离体移除修饰的肽、其类似物或衍生物、及其结合物。例如，抗体可以固定或固定化在柱基质上，患者的血液可以从患者取出并通过基质。修饰的肽、肽类似物、衍生物或结合物将与抗体结合，然后可以将含有低浓度的肽、类似物、衍生物或结合物的血液返回到患者的循环系统中。移除的肽化合物的量可以通过调节压力和流速来控制。
从患者血液的血浆成分中选择性去除肽、类似物、衍生物和结合物，可以例如通过使用半透膜来实现，或者通过本技术领域已知的方法首先将血浆成分与细胞成分分开，然后将血浆成分通过含有抗治疗剂抗体的基质来实现。或者，选择性去除结合了肽的血细胞、包括血红细胞，可以通过收集和浓缩患者血液中的血细胞，并将这些细胞与固定的抗治疗剂抗体接触以排除患者血液的血清成分来实现。
抗治疗剂抗体可以肠胃外体内施用于已经接受了肽、类似物、衍生物或结合物进行治疗的患者。抗体将与肽化合物和结合物结合。一旦结合，肽的活性将被阻碍，即便不是完全阻断的话，从而降低了肽化合物在患者血流中的生物学有效浓度，并将有害副作用减到最小。此外，结合的抗体-肽复合物将便于从患者血流中清除肽化合物和结合物。
参考下面的非限制性实施例，可以对已经充分描述的本发明有进一步的认识和理解。
实施例
实施例1-5：C34半胱磺酸衍生物的合成和纯化
使用自动化固相方法，在十二通道(Symphony)肽合成仪上进行C34的半胱磺酸衍生物的合成，在肽的产生过程中进行手动干预。合成在Fmoc保护的拉每(Ramage)酰胺接头树脂上，使用Fmoc保护的氨基酸进行。连接使用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二异丙基乙胺(DIEA)作为活化剂混合物在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中进行。Fmoc保护基团使用20％哌啶/DMF除去。Boc-保护的氨基酸用于N-末端，以便当肽从树脂上裂解下来后产生游离的Nα-末端。在合成过程中使用Sigmacote处理过的玻璃反应容器。
实施例2：CA-C34的合成
CA-C34具有下列氨基酸序列：
半胱磺酸-Trp-Met-Glu-Trp-Asp-Arg-Glu-Ile-Asn-Asn-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-CONH2(SEQ ID NO：2)。CA-C34修饰的肽按照下述合成：
步骤1：使用手动和自动固相合成，十二通道(Symphony)肽合成仪和拉每(Ramage)树脂，以100μm规模进行CA-C34的固相肽合成。将下面的被保护氨基酸相继加到树脂上：Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Asp(tBu)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Boc-半胱磺酸-OH。将它们溶解在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并按照顺序使用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二异丙基乙胺(DIEA)进行活化。使用含20％(V/V)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液20分钟，来完成除去Fmoc保护基团(步骤1)。
步骤2：使用85％TFA/5％TIS/5％茴香硫醚和5％苯酚，将肽从树脂上切下，然后用干冰冷却的(0-4℃)Et2O沉淀和收集。
实施例3：CA-C34(Arg 28 )的合成
CA-C34(Arg28)具有下面的氨基酸序列：
半胱磺酸-Trp-Met-Glu-Trp-Asp-Arg-Glu-Ile-Asn-Asn-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Arg-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-CONH2(SEQ ID NO：3)。
步骤1：使用手动和自动固相合成、十二通道(Symphony)肽合成仪和拉每(Ramage)树脂，以100μm规模进行CA-C34(Arg28)的固相肽合成。将下面的被保护氨基酸相继加到树脂上：Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Asp(tBu)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Boc-半胱磺酸-OH。将它们溶解在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并按照顺序使用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二异丙基乙胺(DIEA)进行活化。使用含20％(V/V)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液20分钟，来完成除去Fmoc保护基团(步骤1)。
步骤2：使用85％TFA/5％TIS/5％茴香硫醚和5％苯酚将肽从树脂上切下，然后用干冰冷却的(0-4℃)Et2O沉淀和收集。
实施例4：CA-C34-Lys 35 (ε-AEEA-MPA)的合成
CA-C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)具有下面的氨基酸序列：
半胱磺酸-Trp-Met-Glu-Trp-Asp-Arg-Glu-Ile-Asn-Asn-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-ILe-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-LyS(AEEA-MPA)-CONH2(SEQ ID NO：4)。
步骤1：使用手动和自动固相合成、十二通道(Symphony)肽合成仪和拉每(Ramage)树脂，以100μm规模进行CA-C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)的固相肽合成。将下面的受保护氨基酸相继加到树脂上：Fmoc-Lys(Aloc)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OHFmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Asp(tBu)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Boc-半胱磺酸-OH。将它们溶解在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并按照顺序，使用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二异丙基乙胺(DIEA)进行活化。使用含20％(V/V)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液20分钟，来完成除去Fmoc保护基团(步骤1)。
步骤2：Lys(Aloe)基团的选择性去保护手动进行，并通过用3当量Pd(PPh3)4溶解在5mL C6H6∶CHCl3(1∶1)∶2.5％NMM(v∶v)∶5％AcOH(v∶v)中的溶液处理树脂2小时来完成(步骤2)。然后将树脂用CHCl3(6×5mL)、含20％AcOH的DCM(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)进行洗涤。
步骤3：然后重新自动进行合成，以添加Fmoc-AEEA-OH和3-马来酰亚胺丙酸(步骤3)。AEEA上的保护基团(Fmoc)按照以前的描述在每次结合之间移除，将树脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤3次和用异丙醇洗涤3次。
步骤4：使用85％TFA/5％TIS/5％茴香硫醚和5％苯酚将肽从树脂上切下，然后用干冰冷却的(0-4℃)Et2O沉淀(步骤4)和收集。
实施例5：CA-C34(Arg28)-Lys 35 (ε-AEEA-MPA)
CA-C34(Arg28)-Lys35(ε-AEEA-MPA)具有下面的序列：
半胱磺酸-Trp-Met-Glu-Trp-Asp-Arg-Glu-Ile-Asn-Asn-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Arg-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-LyS(AEEA-MPA)-CONH2(SEQ ID NO：5)。
步骤1：使用手动和自动固相合成、十二通道(Symphony)肽合成仪和拉每(Ramage)树脂来进行，以100μm规模进行CA-C34(Arg28)-Lys35(ε-AEEA-MPA)的固相肽合成。将下面的受保护氨基酸相继加到树脂上：Fmoc-Lys(Aloc)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Asp(tBu)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Boc-半胱磺酸-OH。将它们溶解在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并按照顺序使用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二异丙基乙胺(DIEA)进行活化。使用含20％(V/V)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液20分钟，来完成除去Fmoc保护基团(步骤1)。
步骤2：Lys(Aloc)基团的选择性去保护手动进行，并通过用3当量Pd(PPh3)4溶解在5mL C6H6∶CHCl3(1∶1)∶2.5％NMM(v∶v)∶5％AcOH(v∶v)的溶液处理2小时来完成(步骤2)。然后将树脂用CHCl3(6×5mL)、含20％AcOH的DCM(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)进行洗涤。
步骤3：然后重新自动进行合成，以添加Fmoc-AEEA-OH和3-马来酰亚胺丙酸(步骤3)。AEEA上的保护基团(Fmoc)按照以前的描述在每次结合之间移除，将树脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤3次和用异丙醇洗涤3次。
步骤4：使用85％TFA/5％TIS/5％茴香硫醚和5％苯酚将肽从树脂上切下，然后用干冰冷却的(0-4℃)Et2O沉淀(步骤4)和收集。
纯化步骤
每种C34修饰的肽使用Varian(Dynamax)制备型二元HPLC系统，通过制备型反相HPLC进行纯化。
示例性的衍生物的纯化使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，50mm×250mm柱(粒度10μ)进行，柱用水/TFA混合物(0.1％TFA在H2O中；溶剂A)和乙腈/TFA(0.1％TFA在CH3CN中；溶剂B)平衡。洗脱通过以50mL/min经180分钟运行28-38％B的梯度进行。含有肽的级份通过在214和254nm处的UV吸光度(Varian Dynamax UVDII)来检测。
将级份收集为25mL的等份试样。含有目标产物的级份通过直接注射到LC/MS上之后，以质量检测来鉴定。然后将选出的级份通过分析型HPLC(经20分钟20-60％B；Phenomenex Luna 5μ苯基-己基10mm×250mm柱，0.5mL/min)进行分析，以鉴定纯度≥90％的级份用于合并。将合并物使用液氮冷冻干燥，随后冻干至少2天，以获得白色粉末。
IV-流程图：
对于所有衍生物使用同样的合成路线。在下面的流程图中示例了CA-C34和CA-C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)的路线。当然，对于CA-C34来说，省略了Aloe移除步骤以及添加AEEA和MPA的步骤。
Figure A20088002216300751
实施例6：C34的半胱磺酸衍生物的溶解度分析
a.溶解度分析在100mM磷酸钠水溶液(起始pH8)中进行。已经发现，缓冲液浓度高可用于中和在HPLC纯化后仍然与C34衍生物在一起的过量的三氟乙酸(TFA)。
最终pH5.8-7.0适合维持各种C-34衍生物的溶解度。因此，将起始缓冲液制备成pH8.0；C34衍生物的溶解导致最终pH为大约6.3。表2显示了在N-末端带有或不带有半胱磺酸(CA)和在C-末端带有或不带有Lys35(ε-AEEA-MPA)的C34的溶度极限。此外，表1中显示的最终重量克分子渗透压浓度显示出这些最终溶液是等渗的。
表2
  C34和C34衍生物   溶度极限1(mg/ml)   最终pH   重量克分子渗透压浓度(mOsm)   最终结果
  C34   15.75   在几分钟内形成凝胶
  C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)   N/A2   形成凝胶
  CA-C34   29.3   6.32   301   透明溶液
  CA-C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)   338   6.27   302   透明的发黄3溶液
1指示的溶度极限是维持透明溶液的最高浓度。浓度被校正成表示不含TFA的C34衍生物的重量。
2“N/A”表示发现化合物不可溶。
3观察到的发黄的颜色可能是由于(AEEA-MPA)的浓度较高或由于杂质所致。
天然C34被发现在15.75mg/ml下可溶，得到的溶液在一分钟内形成凝胶。C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)一放入溶液中就形成凝胶，继续添加缓冲液也不能成功地使化合物溶解。从可以表1注意到，在这两种化合物的N-末端添加半胱磺酸，赋予了C34显著增加的溶解度，即分别为29.3和33.8mg/ml。
b.连接有N-末端修饰的AEEA-MPA的C34(W1(AEEA-MPA)-C34)，和N-末端半胱磺酸修饰、在35位添加有赖氨酸并通过AEEK接头与MPA连接的C34(CAK35(AEEA-MPA-C34))，在500mM pH8.0的磷酸钠缓冲液中，在30-35mg/ml内的溶解度
1M磷酸钠，pH8.0缓冲液
A-2M无水磷酸氢二钠，UQAM，OM-27，S1835
1M＝141.96g/IL，2M＝13.3568g/40ml纳滤纯(nanopure)H2O。
B-2M一水磷酸二氢钠，UQAM，OM-27，S1820
1M＝137.99g/lL，2M＝11.0392g/40ml纳滤纯H2O。
C-混合30ml纳滤纯H2O+大约28ml磷酸氢二钠+1.5ml磷酸二氢钠。证实pH是否为8.0。用磷酸氢二钠调整体积。
D-调整到最终pH8(实际值为7.98)。
500mM磷酸钠，pH8.0缓冲液
将1M磷酸钠pH8.0的缓冲液与等体积的纳滤纯H2O混合(不过滤)。最终pH为8.0。
c.W1(AEEA-MPA)-C34和(CA K35(AEEA-MPA-C34))在500mMpH8.0的磷酸钠缓冲液中，在100mg/ml下的溶解度
化合物
W1(AEEA-MPA)-C34批次B，批号JC-205-12，存货号1139
1M，含盐＝4769.1＝称重12.64mg
1M，不含盐＝4541.1＝12.0357mg
纯度＝90.8％＝10.928mg在109.3μl 500mM磷酸钠pH8.0缓冲液中，得到100mg/ml。
注释：将缓冲液加入到玻璃小瓶中的粉末上。在涡旋(中速)1分钟后溶解。剩余3个颗粒。最终pH6.82(使用Chemical Department的pH计测量，500mM NaP pH8缓冲液为8.1)。
(CA K35(AEEA-MPA-C34))批次B，批号PB-262-01，存货号1352。
1M，含盐＝5165.2＝称重12.11mg
1M，不含盐＝4820.2＝11.30mg
纯度＝92.8％＝10.487mg在104.9μl 500mM磷酸钠pH8.0缓冲液中，得到100mg/ml。
注释：将缓冲液加入到玻璃小瓶中的粉末上。在涡旋(中速)1分30秒后大部分溶解。在玻璃小瓶的底部有2个小团粒。3分钟后，这两个小团粒溶解。最终pH6.75(使用Chemical Department的pH计测量，500mM NaP pH8缓冲液为8.1)。
W1(AEEA-MPA)-C34和(CA K35(AEEA-MPA-C34))在溶解后是黄色的。W1(AEEA-MPA)-C34颜色更深。
结论：
W1(AEEA-MPA)-C34和(CA K35(AEEA-MPA-C34))化合物在500mM磷酸钠pH8.0缓冲液中，在100mg/ml下是可溶的。它们的最终pH超出可接受的限度，即6.8。这些化合物的可接受的pH限度是6.2。
d.W1(AEEA-MPA)-C34和(CA K35(AEEA-MPA-C34))在500mMpH8.0的磷酸钠缓冲液中，在150mg/ml下的溶解度
W1(AEEA-MPA)-C34批次B，批号JC-205-12，存货号1139。
1M，含盐＝4769.1＝称重11.97mg，
1M，不含盐＝4541.1＝11.398mg
纯度＝90.8＝10.35mg在69μl 500mM磷酸钠pH8.0缓冲液中，得到150mg/ml。
注释：将缓冲液加入到玻璃小瓶中的粉末上。涡旋(中-快速)1分钟后溶解。最终pH6.60(使用Chemical Department的pH计测量，500mM NaP pH8缓冲液为8.23)。
(CA K35(AEEA-MPA-C34))批次B，批号PB-262-01，存货号1352。
1M，含盐＝5165.2＝称重12.48mg
1M，不含盐＝4820.2＝11.64mg
纯度＝92.8％＝10.808mg在72.05μl 500mM磷酸钠pH8.0缓冲液中，得到150mg/ml。
注释：将缓冲液加入到玻璃小瓶中的粉末上。在涡旋(中-快速)1分钟后大部分溶解。在玻璃小瓶的底部有1个小团粒。10分钟后，这个小团粒溶解。最终pH6.57(使用Chemical Department的pH计测量，500mM NaP pH8缓冲液为8.23)。
W1(AEEA-MPA)-C34和(CA K35(AEEA-MPA-C34))在溶解后是黄色的。W1(AEEA-MPA)-C34颜色更深。
结论：W1(AEEA-MPA)-C34和(CA K35(AEEA-MPA-C34))在500mM磷酸钠pH8.0缓冲液中，在150mg/ml下是可溶的。
实施例7：C34的半胱磺酸衍生物的活性分析
第一种活性分析：抗HIV-1诱导的细胞-细胞融合分析
使用由纽约血液中心(New York Blood Center，310 East 67th Street，New York，NY 10021)的Shibo Jiang博士及同事设计的HIV-1诱导的细胞-细胞融合分析，评估了各种抗融合化合物和相应进行的白蛋白结合物的功效。C34衍生物对HIV诱导的细胞-细胞融合的抑制活性，按照以前的描述进行检测(Jiang，S.L.等，(2000)A Convenient Cell FusionAssay for Rapid Scrccning for HIV Entry Inhibitors，(用于快速筛选HIV进入抑制剂的便捷细胞融合分析)，Proc.SPIE 3926：212-219)。
简单来说，首先将化合物在磷酸-柠檬酸缓冲液(pH7.0)中稀释到100μM作为储液，然后在培养基中进一步稀释到1000、500、250、100、50、25、5、1nM。将50微升化合物溶液与50μl HIV-1IIIB感染的H9细胞(H9/HIV-1IIIB)混合成2×105个细胞/ml，细胞用钙荧光素-AM(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)标记。在37℃共培养2小时后，在倒置荧光显微镜(Zeiss，Germany)下分别使用485nm和535nm的滤光片激发波长，采用目镜测微盘(10×10mm2)和20x物镜，对与MT-2细胞融合或未融合的钙荧光素标记的H9/HIV-1IIIB细胞进行计数。融合的细胞比未融合的细胞大得多(至少2倍)，因此由于钙荧光素从一个细胞扩散到两个或多个细胞，融合的细胞中的荧光强度比未融合细胞弱。每个孔检测4个视野，通过下面的公式计算细胞融合百分率：融合的细胞/(融合的+未融合的细胞)×100％。
阳性对照孔加入50μl钙荧光素标记的HIV感染的细胞。阴性对照孔加入培养基和钙荧光素标记的未感染的H9细胞。细胞融合的抑制百分率使用下面的公式计算：[1-(E-N)/(P-N)]×100％，其中“E”表示实验组中的细胞融合％，“P”表示没有加入测试化合物的阳性对照组中的融合％，“N”表示其中钙荧光素标记的HIV-1IIIB细胞被钙荧光素标记的H9细胞所代替的阴性对照组中的融合％。抗病毒化合物对细胞融合的50％抑制浓度(IC50)，使用由T.C.Chou博士友好提供的计算机程序来计算(Chou，T.C.和Hayball，M.P.，CalcuSyn：Windows softwarefor dose effect analysis(CalcuSyn：用于量效分析的Windows软件)，(1991)Ferguson，MO 63135，USA，BIOSOFT)。
表3显示了在N-末端带有或不带有半胱磺酸、以及有或没有通过基团Lys(ε-AEEA-MPA)结合人类血清白蛋白(HSA)的C34的抗融合活性。
表3
  C34，C34衍生物及其白蛋白结合物   IC50(nM)
  C34   3.6-4.6
  C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)：HSA   16.17
  CA-C34   7.3
  CA-C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)：HSA   6.1-9.4
如表3中所示，在C34和CA-C34的抗融合活性之间没有观察到显著差异。因此，在C34的N-末端添加半胱磺酸对C34的抗融合活性没有负面影响。
表2也显示了将Lys(ε-AEEA-MPA)结合到C34和CA-C34的C-末端，然后将它们与HAS结合，对它们的抗融合活性没有明显的负面影响。
实施例8：第二种活性分析：HIV IIIB 在人类PBMCS中复制的抑制
在基于PBMC的分析中使用HIV-1株IIIB进行急性感染后，评估了化合物的抗HIV功效和细胞的细胞毒性。这些实验在南方研究所的传染病研究部(Southern Research Institute，Infectious Disease ResearchDepartment)，431 Aviation Way，Frederick，MD进行，按照下述的方案进行。
a.PBMCs的HIV-1感染
HIV和HBV血清阴性的新鲜人类PBMCs，从筛选的供体分离，并由Biological Specialty Corporation Colmar，PA商业提供。通过低速离心和重悬浮在PBS中，将细胞沉淀/清洗2-3次，以除去污染性血小板。然后将携带白细胞的(leukophoresed)血液用Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS)稀释，在50mL离心管中在淋巴细胞分离培养基(LSM；
Figure A20088002216300811
Mediatech，Inc.；密度为1.078+/-0.002g/ml；目录号85-072-CL)上分层，然后离心。将淡黄色的覆盖层从产生的界面上轻轻吸出，然后通过低速离心用PBS洗涤。第三次洗涤后，将细胞重新悬浮在补充有胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素和植物血凝素(PHA-P；Sigma，St-Louis，MO)的RPMI 1640中。将细胞在37℃温育。温育两天后，将PBMCs离心，重新悬浮在含有FBS、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素和重组人类IL-2(R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN)的RPMI 1640中。在培养基中包含IL-2是为了维持由PHA促有丝分裂刺激引发的细胞分裂。将细胞在培养物中维持最多两周，单核细胞由于粘附于组织培养瓶而从培养物中被除去。
对于标准PBMC分析来说，将来自至少两个正常供体的PHA-P刺激的细胞合并，在新鲜培养基中稀释，铺在由南方研究所的传染病研究部开发的标准格式的96孔圆底微孔板的内部孔中。来自一个以上供体的合并PBMCs用于最小化在各个供体之间观察到的变异性，这种变异性来自于HIV感染的定量和定性差异，以及初级淋巴细胞群体对PHA和IL-2的总体应答。每个板含有病毒/细胞对照孔(细胞+病毒)、试验孔(化合物+细胞+病毒)和化合物对照孔(化合物+培养基，没有细胞，为细胞毒性的MTS监测所需)。在微量滴定管中制备测试化合物稀释液，使用标准格式将每种浓度放置在适合的孔中。在向PBMCs加入化合物稀释液后，然后将病毒储存溶液的预定稀释液放置在每个测试孔中(最终的
Figure A20088002216300812
)。病毒储存溶液从传代次数低的临床分离株HIV-1IIIB制备，该分离株从NIAID AIDS研究和参比反应试剂项目(NIAID AIDS Research and Reference Reagent Program)获得。马上要使用前，将储存在-80℃的预先滴定过的HIV-1IIIB等份小样在生物安全柜中快速融化到室温。因为HIV-1对PBMCs没有细胞病变效应，因此同样的分析板可用于抗病毒功效和细胞毒性测定。感染后，将PBMC培养物在37℃、5％CO2下维持7天。
b.反转录酶活性分析
利用基于微量滴定板的反转录酶(RT)反应(Buckheit等，AIDSResearch and Human Retroviruses 7：295-302，1991)。将氚化的胸苷三磷酸(3H-TTP，80Ci/mmol，NEN)以1mCi/ml的量加入到1∶1的dH2O∶乙醇中。通过将150μl poly rA(20mg/ml)与0.5ml oligo dT(20单位/ml)和5.35ml无菌dH2O进行混合，然后分成等份(1.0ml)并储存在-20℃，将Poly rA：oligo dT模板：引物(Pharmacia)制备成储液。RT反应缓冲液以天为基础新鲜制备，由125μl 1.0M EGTA、125μl dH2O、125μl 20％Triton X100、50μl 1.0M Tris(pH7.4)、50μl 1.0M DTT和40μl 1.0M MgCl2组成。最终的反应混合物通过混合1份3H-TTP、4份dH2O、2.5份poly rA：oligo dT储液和2.5份反应缓冲液来制备。将10微升该反应混合物放置在圆底微量滴定板中，加入15μl含有病毒的上清液并混合。将板在37℃温育60分钟。温育后，将反应体积点在DE81滤纸垫上(Wallac)，清洗5次，每次在5％磷酸钠缓冲液或2X SSC(Life Technologies)中5分钟，再清洗2次，每次在蒸馏水中1分钟，再清洗2次，每次在70％乙醇中1分钟，然后干燥。掺入的放射活性(每分钟的计数，CPM)使用标准液体闪烁技术定量。
c.用于PBMC存活性的MTS染色，以测量细胞毒性
在分析结束时，将分析板用可溶的基于四唑鎓的染料MTS(CellTiter Reagent，Promega)进行染色，以确定细胞存活性并对化合物的细胞毒性进行定量。MTS被代谢活性细胞的线粒体酶代谢，产生可溶性的甲臜(formazan)产物，可以快速定量分析细胞的存活性和化合物的细胞毒性。MTS是稳定的溶液，不需要在使用前制备。在分析结束时，向每个孔加入20μl MTS试剂。对于HIV PBMC分析来说，孔在37℃温育4小时。温育间期根据凭经验确定的每种细胞类型中最适的染料还原时间来选择。使用粘性的板密封剂代替盖子，将密封的板颠倒几次以混合可溶的甲臜产物，使用Molecular Devices Vmax读板器在490/650nm处通过分光光度法读板。
d.数据分析
使用内部自己设计的计算机程序，计算了IC50(病毒复制的50％抑制)、IC90(病毒复制的90％抑制)、TC50(50％细胞毒性)、TC90(90％细胞毒性)和治疗指数(TI＝TC50/IC50)。抗病毒活性和细胞毒性的原始数据以及数据的图示提供在汇总了每种化合物活性的打印输出中。AZT作为抗HIV分析中的相关阳性对照化合物，进行了平行评估。
e.结果
图1显示了天然C34对PBMC中HIV-1IIIB复制的抑制(参见曲线◆)。正如下面显示的(参见曲线□)，该化合物对PBMCs没有显示出任何显著的细胞毒性效应。
图2显示了在添加在C-末端的赖氨酸的ε-NH2上具有AEEA-MPA的C34的白蛋白结合物，即C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)：HSA，对PBMC中HIV-1IIIB复制的抑制(参见曲线◆)。正如下面所示(参见曲线□)，该化合物对PBMCs没有显示出任何细胞毒性效应。
图3显示了在N-末端具有半胱磺酸、并在添加在C-末端的赖氨酸的ε-NH2上具有AEEA-MPA的C34的白蛋白结合物，即CA-C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)：HSA，对PBMC中HIV-1IIIB复制的抑制(参见曲线◆)。正如下面所示(参见曲线□)，该化合物对PBMCs没有显示出任何细胞毒性效应。
根据图1、2和3中显示的数据，这两种白蛋白结合物的IC50值给出在表4中，并与天然C34进行了比较。
表4
  C34和白蛋白结合物   IC50(nM)
  C34   0.6-1.7
  C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)：HSA   11.2-18.9
  CA-C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)：HSA   1.7-2.2
表4显示了天然C34、C34的白蛋白结合物和CA-C34的白蛋白结合物的抗HIV活性相似。总之，在N-末端添加半胱磺酸以及它随后与白蛋白通过Lys35的结合(ε-AEEA-MPA)，在本分析中对C34的活性没有负面影响。
实施例8：其它的抗融合肽衍生物
实验程序
下面的步骤在所有实行的实验中使用，以获得下面详细讨论的结果。
CHR肽类似物的合成使用自动化固相程序在十二通道(Symphony)肽合成仪上进行，在肽的产生过程中进行了手动干预。合成使用Fmoc保护的氨基酸，在Fmoc保护的拉每(Ramage)酰胺接头树脂上进行。连接使用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二异丙基乙胺(DIEA)作为活化剂混合物在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中达成。Fmoc保护基团使用20％哌啶/DMF来除去。Boc-保护的氨基酸用在N-末端，以便当肽从树脂上切下来后产生游离的α-N-末端。在合成过程中使用Sigmacote处理过的玻璃反应容器。
当马来酰亚胺基位于分子的C-末端部分时(表5，白蛋白结合的化合物VII和乙酰化结合的化合物X)，肽的固相合成通过加入Fmoc-Lys(Aloc)来起始。Aloc是对酸性介质稳定的特异性正交保护基团。然后通过顺序加入其侧链由对酸性介质不稳定的基团所保护的氨基酸，将肽链在固体支持物上延伸。当肽链完成时，使用四三苯基膦钯将C-末端赖氨酸上的Aloc保护基团选择性移除。然后将Fmoc-氨基乙氧基乙氧基乙酸(AEEA)接头化学连接到未保护的赖氨酸上。在经典的Fmoc去保护规程后，将马来酰亚胺丙酸(MPA)化学连接到AEEA间隔基上。最后，将酸不稳定的保护基团从肽上移除，然后使用强酸性混合物将肽从固体支持物上切下。当马来酰亚胺位于分子的N-末端部分时(表5，马来酰亚胺基化合物VIII，白蛋白结合的化合物VIII)，以及白蛋白结合的MPA-AEEA-化合物VIII，肽的固相合成通过融合肽抑制剂的天然氨基酸序列来起始。
表5
 HSAa   人类血清白蛋白
 C34   (628)WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL(661)-CONH2 b
 马来酰亚胺基化合物VIII MPAc-AEEAd-(628)WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL(661)-CONH2 b
 白蛋白结合的化合物VIII   [HSAa-Cys34e]-MPAc-AEEAd-(628)WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL(661)-CONH2 b
 白蛋白结合的化合物VII   [HSAa-Cys34e]-MPA-(628)WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL(661)-CONH2 b
 白蛋白结合的化合物VI   (628)WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL(661)K(εN)-AEEAd-MPAc-[Cys34e-HSAa]
 T-20   Acf-(638)YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(673)-CONH2 b
 白蛋白结合的化合物IX   [HSAa-Cys34e]-MPAc-AEEAd-(638)YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(673)-CONH2 b
 白蛋白结合的化合物X   Acf-(638)YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(673)K(εN)-AEEAd-MPAc-[Cys34e-HSAa]
aHSA，人类血清白蛋白
bCONH2，羧酰胺
cMPA，马来酰亚胺丙酸
dAEEA，氨基乙基乙氧基乙酸
eCys34，白蛋白的半胱氨酸-34
fAc，乙酰基
肽的纯化
每种产物使用Varian(Dynamax)制备型二元HPLC系统，通过制备型反相HPLC纯化。所有DAC肽的纯化使用Phenomenex Luna苯基-己基(10微米，50mm×250mm)柱进行，柱用水/TFA混合物(0.1％TFA在H2O中；溶剂A)和乙腈/TFA(0.1％TFA在CH3CN中；溶剂B)平衡。洗脱通过以50mL/min用180分钟运行各种溶剂B的梯度来进行。含有肽的级份通过在214和254nm处的UV吸光度(VarianDynamax UVD II)来检测。
将级份收集为25mL的等份试样。含有目标产物的级份在直接注射到LC/MS上之后通过质量来鉴定。然后将选出的级份通过分析型HPLC(用20分钟20-60％B；Phenomenex Luna 5微米苯基-己基，10nmx 250mm柱，0.5mL/min)进行分析，以鉴定具有≥90％纯度的级份用于合并。然后将合并物使用液氮冷冻干燥，随后冻干至少2天，以获得白色粉末。
白蛋白结合物的制备
使用疏水相互作用层析法进行马来酰亚胺基-C34和马来酰亚胺基-T-20衍生物与HAS的半胱氨酸-34结合以及随后纯化，最近成为一种有效的方法。结合步骤包括将每种马来酰亚胺基-肽与HSA的25％溶液(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)混合，并在37℃温育30分钟。使用AKTA纯化仪(GE Healthcare)，将得到的混合物以2.5ml/min的流速直接上样到装填有丁基琼脂糖凝胶4FF(butyl sepharose 4fastflow)树脂(GE Healthcare)的50ml柱子中，柱子用含有5mM辛酸钠和750mM(NH4)2SO4的20mM磷酸钠缓冲液(pH 7)平衡。在这些条件下，C34-HSA结合物吸附在疏水树脂上，而基本上所有未结合的HSA洗脱在柱子的空隙体积中。通过施加超过4倍柱体积的(NH4)2SO4浓度逐渐减少(750-0mM)的线性梯度，将每种结合物从任何游离的(未反应的)马来酰亚胺基-C34衍生物进一步纯化出来。然后使用10kDa超离心过滤装置(Amicon；Millipore，Bedford，MA)，将每种纯化的结合物在水中脱盐并浓缩。最后，将每种结合物溶液重新配制在pH
7的等渗缓冲溶液中。每种纯化样品的质谱证实了最丰富的蛋白产物对应于HSA与每种马来酰亚胺基衍生物的1∶1共价复合物，每种纯化样品的反相HPLC分析证实移除了基本上所有未结合的(游离的)马来酰亚胺基衍生物。每种白蛋白结合物使用无菌的0.9％NaCl进行配制，T-20(从旧金山总医院药房(San Francisco General Hospital pharmacy)获得)溶解在无菌注射用水中，并用HCl调整到pH7。
在新鲜的人类PBMCs中的抗HIV功效评估
HIV-1IIIB通过NIH的NIAID的AIDS分部的AIDS研究和参比试剂项同(AIDS Research and Reference Reagent Program，Division ofAIDS，NIAID，NIH)获得，由Robert C.Gallo博士好意提供(Popovic ME，Read-Connole E，Gallo RC(1984)T4positive human neoplastic cell linessusceptible to and permissive for HTLV-III.(对HTLV-III易感和可感染的T4阳性人类肿瘤细胞系)，Lancet ii：1472-1473；Popovic M，Sarngadharan MG，Read E，Gallo RC(1984)Detection，isolation，andcontinuous production of cytopathic retroviruses (HTLV-III)from patientswith AIDS and pre-AIDS.(从患有AIDS和AIDS前期的患者检测、分离和连续生产细胞病变性反转录病毒(HTLV-III))，Science224：497-500；Ratner L等，(1985)Complete nucleotide sequence of theAIDS virus，HTLV-III.(AIDS病毒HTLV-III的完整核苷酸序列)，Nature 313：277-283)。对HIV和HBV血清阴性的新鲜的人类外周血单核细胞(PBMCs)，从筛选的供体的血液中(Biological SpecialtyCorporation；Colmar，PA)，使用淋巴细胞分离培养基(LSM；
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Mediatech，Inc.；密度为1.078+/-0.002g/ml)，按照制造商的说明书进行分离。细胞通过在4μg/mL植物血凝素(PHA；Sigma)中温育48-72小时，进行刺激。通过向培养基加入20U/mL重组人类IL-2(R&DSystems，Inc)来维持促有丝分裂刺激。将来自至少两个供体的PHA刺激的PBMCs合并，在新鲜培养基中稀释，以5×104个细胞/孔加到96孔板中。在存在9种不同浓度的测试化合物(三个重复孔/浓度)下，对细胞进行感染(最终的
Figure A20088002216300881
)，并温育7天。为了确定病毒抑制的水平，收集无细胞上清液样品，用于反转录酶活性分析(BuckheitRW，Swanstrom R(1991)Characterization of an HIV-1isolate displayingan apparent absence of virion-associated reverse transcriptase activity.(显示出明显不存在病毒粒子相关的反转录酶活性的HIV-1分离株的表征)，AIDS Res Hum Retrovir 7：295-302)。在移除上清液样品后，通过加入3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓(MTS；CellTiter 96Reagent，Promega)，按照制造商的说明书来测量化合物的细胞毒性。使用内部自己设计的计算机程序，确定了IC50(病毒复制的50％抑制)、IC90(病毒复制的90％抑制)、TC50(细胞存活性减少50％)和选择性指数(IC50/TC50)。AZT(核苷反转录酶抑制剂)被用作分析的对照化合物。
病毒
下面的试剂通过通过NIH的NIAID的AIDS分部的AIDS研究和参比试剂项目(AIDS Research and Reference Reagent Program，Divisionof AIDS，NIAID，NIH)获得：pNL4-3来自Malcolm Martin。(Adachi A等，(1986)Production of acquired immunodeficiency syndrome-associatedretrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectiousmolecular clone.(在用感染性分子克隆转染的人类和非人类细胞中生产获得型免疫缺陷综合症相关的反转录病毒)，J Virol 59：284-291.)。
来自AIDS试剂项目的NL4-3在gp41中含有未预料到的变异体DIV(G36D)突变，在体外赋予了对T-20的8倍的抗性。通过定点突变将T-20敏感性NL4-3(NL4-3G)改变成与gp41的36位氨基酸处的共有序列匹配(天冬氨酸用甘氨酸代替)。NL4-3G和NL4-3D(原始克隆)的储液通过转染293T细胞并在第3天收集上清液来制备。病毒储液通过在PHA活化的PBMCs中进行50％终点分析来滴定，并通过ELISA进行p24检测。
结果
使用基于PBMC分析的体外抗病毒活性
使用针对HIV-1IIIB的基于PBMC的分析(Popovic ME，Read-Connole E，Gallo RC(1984)T4 positive human neoplastic cell linessusceptible to and permissive for HTLV-III.(对HTLV-III易感和可感染的T4阳性人类肿瘤细胞株)，Lancet ii：1472-1473；Popovic M，Sarngadharan MG，Read E，Gallo RC(1984)Detection，isolation，andcontinuous production of cytopathic retroviruses(HTLV-III)from patientswith AIDS and pre-AIDS.(从患有AIDS和AIDS前期的患者检测、分离和连续生产细胞病变性反转录病毒(HTLV-III))，Science224：497-500；Ratner L等，(1985)Complete nucleotide sequence of theAIDS virus，HTLV-III.(AIDS病毒HTLV-III的完整核苷酸序列)，Nature 313：277-283；Buckheit RW，Swanstrom R(1991)Characterizationof an HIV-1 isolate displaying an apparent absence of virion-associatedreverse transcriptase activity.(显示出明显不存在病毒粒子相关的反转录酶活性的HIV-1分离株的表征)，AIDS Res Hum Retrovir 7：295-302)，比较了每种白蛋白结合物与原始的肽抑制剂的体外抗病毒活性。有趣的是，PC-1505(白蛋白结合的化合物VIII)、化合物C(白蛋白结合的化合物VII)和化合物D(白蛋白结合的化合物VI)的抗病毒活性，都被发现在体外与C34肽和T-20基本上等效。也就是说，将反应性马来酰亚胺基团放置在C34肽的N-末端(PC-1505(白蛋白结合的化合物VIII)和化合物C(白蛋白结合的化合物VII))或C-末端(化合物D(白蛋白结合的化合物VI))，然后进行白蛋白结合，不改变融合抑制剂的抗病毒活性(表7)。在白蛋白与T-20结合后，当反应性肽被设计成在肽的N-末端发生结合时(化合物E，白蛋白结合的化合物III)，极好地保留了抗病毒活性，但是当对白蛋白的结合发生在肽的C-末端时(化合物F，化合物X——cpdF与Erikson中(化合物I-VIII)等价)，观察到了该肽的抗病毒活性的显著降低。
表6
  化合物   IC50(nM)   IC90(nM)   选择性指数
  HSA   NA   NA   NA
  C34   0.6   2.8   ＞255
  A(马来酰亚胺基-1505)马来酰亚胺基-化合物VIII NP NP NP
  B预先形成的结合物-化合物VIII(PC-1505) 1.8 13.5 ＞81.5
  C预先形成的结合物-化合物VII 11.2 302 ＞22.4
  T20   2.2   9.5   ＞109
  E预先形成的结合物-化合物IX 10.7 31.7 ＞23.4
  F预先形成的结合物-化合物X 87.0 ＞2,000 ＞23.0
  AZT   2.9   26.9   ＞346
NA＝没有获得IC50
NP＝未进行
C34肽、化合物VIII和rHA在大鼠中的药代动力学特性
为了确保在本研究中观察到的抗病毒活性是由于白蛋白结合物的的作用，而不是由于游离肽或是马来酰亚胺和半胱氨酸-C34之间共价键的可逆性，在测试前对所有白蛋白结合物进行了纯化，以除去任何未结合的肽，并在大鼠中对化合物VIII的药代动力学特性与C34肽(图5A)和rHA(图5B)进行了比较。显然，在白蛋白结合后，急剧增加了C34肽的暴露，并且预先形成的结合物-化合物VIII的药代动力学特性与rHA相重叠，这个事实证实了C34肽采取了与白蛋白接近的半衰期。使用Balb/c小鼠，在静脉内或皮下施用预先形成的结合物-化合物VIII后，也观察到了测量C34肽和HSA的药代动力学曲线重叠了至少30个小时(数据未显示，白蛋白的T1/2在小鼠中比在大鼠中短)。相反，C34肽从结合物的缓慢持续释放将导致这两个药代动力学特性不再重叠，因为预先形成的结合物-化合物VIII的总体暴露将比rHA低下。此外，从结合物释放的C34肽在体内将经历非常短的半衰期，与长期持续的预先形成的结合物-化合物VIII相比，抗病毒功效有限。因此，连接马来酰亚胺与半胱氨酸-34的键在体内高度稳定，C34肽被赋予了对快速肾脏清除和肽酶降解的更高稳定性。合在一起，可以得出结论。所有白蛋白结合物在体内和体外的抗病毒活性仅仅是由于化学稳定的结合物的作用，而不是由于马来酰亚胺-半胱氨酸-34键的可逆性。
讨论
基于HIV gp41的N-末端螺旋区域(NHR)和C-末端螺旋区域(CHR)序列的合成肽，已经被显示出通过在多步融合过程中竞争暴露的gp41结合位点，而抑制HIV的进入(Chan DC，Fass D，Berger JM，Kim PS(1997)Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein.(来自HIV包膜糖蛋白的gp41的核心结构)，Cell 89：263-273；ChanDC，Chutkowski CT，Kim PS(1998)Evidence that a prominent cavity inthe coiled coil of HIV type 1 gp41 is an attractive drug target.(1型HIVgp41的卷曲螺旋中的显著的腔是有吸引力的药物靶的证据)，Proc NatlAcad Sci USA 95：15613-15617.)。在临床上，这些肽中最成功的是T-20(来自Trimeris/Roche Applied Sciences的
Figure A20088002216300911
)，源自于gp41的CHR。当与小分子进行比较时，肽的商业化应用通常受限于它们的成本高，以及它们在体内的半衰期短和分布差。我们寻求通过工程化CHR肽(C34和T-20)，使它们与人类白蛋白的半胱氨酸-34共价结合，来应对这些缺点，这对于其它类型的肽已经进行了(Holmes DL等，(2000)Site specific 1:1 opioid：albumin conjugate with in vitro activity and longin vivo duration.(具有体外活性和体内持续时间长的位点特异性的1:1的阿片样物质：白蛋白结合物)，Bioconj Chem 11：439-444；Leger R等，(2003)Synthesis and in vitro analysis of atrial natriuretic peptide-albuminconjugates.(动脉钠尿肽-白蛋白结合物的合成和体外分析)，Bioorg &Med Chem Lett 13：3571-3575；Leger R等，(2004)Kringle 5peptide-albumin conjugates with anti-migratory activity.(具有抗迁移活性的Kringle 5肽-白蛋白结合物)Bioorg & Med Chem Lett 14：841-845；Leger R等，(2004)Identification of CJC-1131-albumin bioconjugate as astable and bioactive GLP-1(7-36)analog.(CJC-1131-白蛋白生物结合物被鉴定为稳定的有生物活性的GLP-1(7-36)类似物)，Bioorg & MedChem Lett 14：4395-4398；Jette L等，(2005)Human growthhormone-releasing factor(hGRF)1-29 albumin bioconjugates activate theGRF receptor on the anterior pituitary in rats：Identification of CJC-1295as a long-lasting GRF analog.(人类生长激素释放因子(hGRF)1-29白蛋白生物结合物激活大鼠中垂体前叶上的GRF受体：鉴定CJC-1295为长期持续的GRF类似物)，Endocrinology 146：3052-3058；fhibaudeauK等，(2005)Synthesis and evaluation of insulin-human serum albuminconjugates.(胰岛素-人血清白蛋白结合物的合成和评估)，Bioconj Chem16：1000-1008.)。也就是说，我们推断CHR-肽-HSA结合物在身体中将经历与白蛋白接近的半衰期，与此相反，原始融合抑制剂的半衰期短得多。
本文显示的结果表明，gp41的NHR比最初所认为的更容易接近。例如，为了允许这种竞争性抑制发生，正如使用预先形成的结合物-化合物VIII所显示的，gp41可能参与了在不存在靶细胞的情况下(即在无细胞病毒或感染细胞的情况下)暴露NHR区域的构象平衡，或者在“进入爪(entry claw)”中形成的前发夹中间体(Sougrat R等，(2007)Electron tomography of the contact between T cells and SIV/HIV-1：Implications for viral entry.(T细胞与SIV-HIV-1之间接触的电子断层成像：喻示病毒进入)，PLoS Pathogens 3：0571-0581.)在形成六螺旋束和随后的脂类混合和膜刺穿步骤之前，是充分溶剂暴露的。就是说，使用Mw为～71kDa的预先形成的结合物-化合物VIII，我们的结果表明，用于接近gp41的NHR-三体的分子量截止值远大于以前报道的，即＜25kDa(11)。其次，c34肽的N-末端片段628WMEW631，代表了gp41的卷曲螺旋腔结合残基，据推断其对于C34肽抑制HIV-1进入的能力是基本的(18，19)。因此，在预先形成的结合物-化合物VIII(含有AEEA接头)或化合物C预先形成的结合物-化合物VII(没有AEEA接头)的情况下，有多大可能c34肽的628WMEW631片段到达gp41的NHR，并同时永久性键合并定位在紧邻白蛋白的表面？保留预先形成的结合物-化合物VIII和化合物C预先形成的结合物-化合物VII的抗病毒活性的一个可能的解释，是事实上，血清白蛋白是高度柔性的蛋白，能够被诱导采取几种构象状态(Peters T，Jr(1996)All aboutalbumin-biochemistry，genetics，and medical applications，《关于白蛋白生物化学、遗传学和医学应用的所有情况》，Copyright by AcademicPress，Inc.)。例如，因为C34肽永久连接到白蛋白的半胱氨酸-34，因此有可能白蛋白不受约束的N-末端结构域(即没有二硫桥)中局部的构象重排导致了部分解旋，从而便于将融合抑制剂正确插入到gp41的NHR区域上。因此，尚不知道，C34肽在白蛋白分子中半胱氨酸-34之外的其它位置定位是否会导致该融合抑制剂同样保留抗病毒活性(例如赖氨酸残基，N-末端或C-末端)，或者在C34肽与其它较高分子量的丰富的血清蛋白例如转铁蛋白或IgG结合后，是否将观察到同样保留的抗病毒活性。因此，也有可能白蛋白分子扮演了主动的参与角色而不仅仅是作为蛋白货物。例如，马来酰化、乌头酰化和琥珀酰化的白蛋白在体外起到有效力的HIV-1进入抑制剂的作用(35-38)。
此外，既然在C34肽中发现的34个氨基酸残基中有24个与T-20中发现的重叠，那么怎么可能T-20在C-末端修饰后成为白蛋白结合的不好的候选物，而当T-20在其N-末端修饰时观察到了抗病毒活性的保留改善？该发现的一种可能的解释是最近的证据，表明由T-20引起的HIV-1的抑制机理与C34肽引起的不同(Liu S等，(2005)J Biol Chem280：11259-11273；Munoz-Barroso I等，(199S)J Cell Biol 140：315-23；Kliger Y等，(2001)J Biol Chem 276：1391-1397.)。例如，已经显示T-20抑制gp41在质膜上的召集以及它随后在脂类混合步骤后的低聚化，而C34肽被发现在形成六螺旋束之后不能执行其抑制效应(Liu S等，(2005)J Biol Chem 280：11259-11273.)。也就是说，已经提出，T-20在它插入到质膜中以后发挥这样的抑制功能，并且T-20的疏水性C-末端区段666WASLWNWF673，被认为对于实现这些疏水相互作用来说是关键的(Munoz-Barroso I等，(1998)J Cell Biol 140：315-23；Kliger Y等，(2001)J Biol Chem 276：1391-1397.)。更具体来说，T-20通过与位于紧邻质膜的gp41中的相应序列结合，抑制了gp41的召集和低聚化(Munoz-Barroso I，Durell S，Sakaguchi K，Appella E，Blumenthal R(1998)Dilation of the human immunodeficiency virus-1 envelopeglycoprotein fusion pore revealed by the inhibitory action of a syntheticpeptide from gp41.(通过来自gp41的合成肽的抑制作用显示人类免疫缺陷病毒-1包膜糖蛋白融合核心的扩张)，J Cell Biol 140：315-23；Kliger Y等，(2001)J Biol Chem 276：1391-1397.)。因此，对于其中666WASLWNWF673序列位于紧邻自蛋白分子的化合物F化合物X所观察到的抗病毒活性的急剧丧失，可以归因于该肽在脂类混合步骤后不能象未结合的(游离的)T-20肽一样有效地发挥功能。相反，在化合物E(化合物IX)的设计中，666WASLWNWF673序列的构象约束较低。概括地说，我们的结果为表明T-20和C34肽不在HIV-1融合的同样步骤中发挥作用的报告，提供了确定性的支持证据。
本文中显示的结果，为该新的一类用于抑制HIV或采用了相似的膜融合和病毒进入机理的其它病毒的白蛋白-肽结合物，建立了原理证明。与未结合的(游离的)肽抑制剂相比，白蛋白结合物可以造成对淋巴系统的暴露显著改善，淋巴系统代表了大约98％的总HIV感染细胞的解剖学栖息地(Stebbing J，Gazzard B，Douek DC(2004)Where doesHIV live？(HIV生活在哪里？)，N Engl J Med 350：1872-1880.)。可以预期这种改善，主要是由于观察到血清白蛋白显著稳态的淋巴与血浆浓度比率(Bent-Hansen L(1991)Whole body capillary exchange ofalbumin.(白蛋白的全身毛细血管交换)，Acta Physiol Scand Suppl 603：5-10(综述)；Porter CJH，Charman SA(2000)Lymphatic transport ofproteins after subcutaneous administration.(蛋白皮下施用后的淋巴运输)，J Pharm Sci 89：297-310.)，以及皮下注射大于16-20kDa蛋白所观察到的有效的淋巴摄入、运输和通透性(Porter CJH，Charman SA(2000)Lymphatic transport of proteins after subcutaneous administration.(蛋白皮下施用后的淋巴运输)，J Pharm Sci 89：297-310.)。
最后，由于在C34肽和许多其它抗融合肽中发现的疏水性残基的高含量，白蛋白结合物也可以帮助改善这类肽当放置在适用于皮下投送的简单水性制剂中时，通常观察到的低溶度极限。例如，C34肽的溶度极限，在水性缓冲液中被发现不超过1mg/ml，而PC-1505的溶度极限被发现与白蛋白的相似，相当于大约16mg/ml的C34肽(即25％(w/v)溶液＝250mg/ml PC-1505≈16mg/ml C34肽)。
概括来说，抗融合肽通过白蛋白的半胱氨酸-34的结合，克服了通常伴随着gp41的NHR三体的空间阻碍，因此，为发现新的较高分子量的、表现出强有力和广泛的中和活性的分子，提供了希望。白蛋白结合的C34肽HIV-1融合抑制剂的一个例子，PC-1505，可能比T-20需要的给药频度低，并可能是在人类中针对T-20抗性HIV-1的有效药剂。
实施例9：其它的抗融合肽衍生物
图6描述的表，显示了所描述的抗融合肽的几种结合物(显示为PC，预先形成的复合物)的体外抗HIV活性。按照本文实施例中的描述进行分析。
尽管已经对本发明的某些实施方案进行了描述和示例，但本技术领域的普通专业人员将会理解，本发明不打算受限于任何这些实施方案的细节，而是由随附的权利要求书限定。
序列表
<110>康久化学生物技术公司
(CONJUCHEM BIOTECHNOLOGIES INC.)
<120>抗病毒肽的半胱磺酸衍生物
     (CYSTEIC ACID DERIVATIVES OF ANTI-VIRAL PEPTIDES)
<130>SCT094204-70
<140>PCT/US08/064010
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Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys Glu Asn Lys Cys
1               5                   10                  15
Asn Gly Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn
<210>23
<211>33
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<400>23
Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly
1               5                   10                  15
Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala
            20                  25                  30
Val
<210>24
<211>33
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     peptide″
<400>24
Ile Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly
1               5                   10                  15
Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp
            20                  25                  30
Lys
<210>25
<211>35
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     peptide″
<400>25
Val Glu Ala Lys Gln Ala Arg Ser Asp Ile Glu Lys Leu Lys Glu Ala
1               5                   10                  15
Ile Arg Asp Thr Asn Lys Ala Val Gln Ser Val Gln Ser Ser Ile Gly
            20                  25                  30
Asn Leu Ile
        35
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<211>35
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<400>26
Arg Ser Asp Ile Glu Lys Leu Lys Glu Ala Ile Arg Asp Thr Asn Lys
1               5                   10                  15
Ala Val Gln Ser Val Gln Ser Ser Ile Gly Asn Leu Ile Val Ala Ile
            20                  25                  30
Lys Ser Val
        35
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<211>35
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<400>27
Asn Ser Val Ala Leu Asp Pro Ile Asp Ile Ser Ile Glu Leu Asn Lys
1               5                   10                  15
Ala Lys Ser Asp Leu Glu Glu Ser Lys Glu Trp Ile Arg Arg Ser Asn
            20                  25                  30
Gln Lys Leu
        35
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<211>35
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<400>28
Ala Leu Asp Pro Ile Asp Ile Ser Ile Glu Leu Asn Lys Ala Lys Ser
1               5                   10                  15
Asp Leu Glu Glu Ser Lys Glu Trp Ile Arg Arg Ser Asn Gln Lys Leu
            20                  25                  30
Asp Ser Ile
        35
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<211>35
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<400>29
Leu Asp Pro Ile Asp Ile Ser Ile Glu Leu Asn Lys Ala Lys Ser Asp
1               5                   10                  15
Leu Glu Glu Ser Lys Glu Trp Ile Arg Arg Ser Asn Gln Lys Leu Asp
            20                  25                  30
Ser Ile Gly
        35
<210>30
<211>35
<212>PRT
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<400>30
Asp Pro Ile Asp Ile Ser Ile Glu Leu Asn Lys Ala Lys Ser Asp Leu
1               5                   10                  15
Glu Glu Ser Lys Glu Trp Ile Arg Arg Ser Asn Gln Lys Leu Asp Ser
            20                  25                  30
Ile Gly Asn
        35
<210>31
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<400>31
Pro Ile Asp Ile Ser Ile Glu Leu Asn Lys Ala Lys Ser Asp Leu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Glu Trp Ile Arg Arg Ser Asn Gln Lys Leu Asp Ser Ile
            20                  25                  30
Gly Asn Trp
        35
<210>32
<211>35
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<400>32
Ile Asp Ile Ser Ile Glu Leu Asn Lys Ala Lys Ser Asp Leu Glu Glu
1               5                   10                  15
Ser Lys Glu Trp Ile Arg Arg Ser Asn Gln Lys Leu Asp Ser Ile Gly
            20                  25                  30
Asn Trp His
        35
<210>33
<211>34
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<400>33
His Arg Ile Asp Leu Gly Pro Pro Ile Ser Leu Glu Arg Leu Asp Val
1               5                   10                  15
Gly Thr Asn Leu Gly Asn Ala Ile Ala Lys Leu Glu Ala Lys Glu Leu
            20                  25                  30
Leu Glu
<210>34
<211>34
<212>PRT
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<400>34
Ile Asp Leu Gly Pro Pro Ile Ser Leu Glu Arg Leu Asp Val Gly Thr
1               5                   10                  15
Asn Leu Gly Asn Ala Ile Ala Lys Leu Gl u Ala Lys Glu Leu Leu Glu
            20                  25                   30
Ser Ser
<210>35
<211>34
<212>PRT
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<400>35
Leu Gly Pro Pro Ile Ser Leu Glu Arg Leu Asp Val Gly Thr Asn Leu
1               5                   10                  15
Gly Asn Ala Ile Ala Lys Leu Glu Ala Lys Glu Leu Leu Glu Ser Ser
            20                  25                  30
Asp Gln
<210>36
<211>34
<212>PRT
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<400>36
Pro Ile Ser Leu Glu Arg Leu Asp Val Gly Thr Asn Leu Gly Asn Ala
1               5                   10                  15
Ile Ala Lys Leu Glu Ala Lys Glu Leu Leu Glu Ser Ser Asp Gln Ile
            20                  25                  30
Leu Arg
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<211>35
<212>PRT
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     peptide″
<400>37
Trp Gln Glu Trp Glu Arg Lys Val Asp Phe Leu Glu Glu Asn Ile Thr
1               5                   10                  15
Ala Leu Leu Glu Glu Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu
            20                  25                  30
Leu Gln Lys
        35
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<211>35
<212>PRT
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     peptide″
<400>38
Gln Glu Trp Glu Arg Lys Val Asp Phe Leu Glu Glu Asn Ile Thr Ala
1               5                   10                  15
Leu Leu Glu Glu Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu Leu
            20                  25                  30
Gln Lys Leu
        35
<210>39
<211>35
<212>PRT
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<400>39
Glu Trp Glu Arg Lys Val Asp Phe Leu Glu Glu Asn Ile Thr Ala Leu
1               5                   10                  15
Leu Glu Glu Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu Leu Gln
            20                  25                  30
Lys Leu Asn
        35
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<211>35
<212>PRT
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<400>40
Trp Glu Arg Lys Val Asp Phe Leu Glu Glu Asn Ile Thr Ala Leu Leu
1               5                  10                  15
Glu Glu Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu Leu Gln Lys
            20                  25                  30
Leu Asn Ser
        35
<210>41
<211>35
<212>PRT
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<400>41
Glu Arg Lys Val Asp Phe Leu Glu Glu Asn Ile Thr Ala Leu Leu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu Leu Gln Lys Leu
            20                  25                  30
Asn Ser Trp
        35
<210>42
<211>35
<212>PRT
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     peptide″
<400>42
Arg Lys Val Asp Phe Leu Glu Glu Asn Ile Thr Ala Leu Leu Glu Glu
1               5                   10                  15
Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asn
            20                  25                  30
Ser Trp Asp
        35
<210>43
<211>35
<212>PRT
<213>Artificial sequence
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     peptide″
<400>43
Lys Val Asp Phe Leu Glu Glu Asn Ile Thr Ala Leu Leu Glu Glu Ala
1               5                   10                  15
Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asn Ser
            20                  25                  30
Trp Asp Val
        35
<210>44
<211>35
<212>PRT
<213>Artificial sequence
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     peptide″
<400>44
Val Asp Phe Leu Glu Glu Asn Ile Thr Ala Leu Leu Glu Glu Ala Gln
1               5                   10                  15
Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asn Ser Trp
            20                  25                  30
Asp Val Phe
        35
<210>45
<211>35
<212>PRT
<213>Artificial sequence
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     peptide″
<400>45
Asp Phe Leu Glu Glu Asn Ile Thr Ala Leu Leu Glu Glu Ala Gln Ile
1                   5               10                  15
Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asn Ser Trp Asp
            20                  25                  30
Val Phe Gly
        35
<210>46
<211>35
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
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     peptide″
<400>46
Phe Leu Glu Glu Asn Ile Thr Ala Leu Leu Glu Glu Ala Gln Ile Gln
1               5                   10                  15
Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asn Ser Trp Asp Val
            20                  25                  30
Phe Gly Asn
        35
<210>47
<211>8
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
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<400>47
Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe
1               5
<210>48
<211>34
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
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     peptide″
<400>48
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Lys Leu Ile His
1               5                   10                  15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu
            20                  25                  30
Leu Leu
<210>49
<211>34
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
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     peptide″
<400>49
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Lys Tyr Thr Ser Leu Ile His
1               5                   10                  15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu
            20                  25                  30
Leu Leu
<210>50
<211>34
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
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     peptide″
<400>50
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Lys Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His
1               5                   10                  15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu
            20                  25                  30
Leu Leu
<210>51
<211>37
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
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     peptide″
<400>51
Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln
1               5                   10                  15
Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Trp Asn Trp Phe Lys
        35

Claims (41)

1.一种修饰的抗融合肽或其结合物，其中所述肽被修饰，使其与修饰前的肽相比，在pH范围大约5到8的水性溶液中具有增加的溶解度，其中所述修饰的肽具有下列性质：
a)在水性溶液中大约10到180mg/ml的浓度范围下，显示出低于大约10％的沉淀；
b)与修饰前的肽相比，具有高至少大约2.5倍的溶度极限；以及
c)在水性溶液中具有至少大约20mg/ml的溶度极限。
2.权利要求1的修饰的抗融合肽或其结合物，其中所述修饰的肽含有一个或多个在生理pH下带电或不带电的极性部分。
3.权利要求2的修饰的抗融合肽或其结合物，其中所述修饰的肽的一个或多个极性部分含有一个或多个在20种天然存在的氨基酸中没有发现的极性或中性侧链。
4.权利要求3的修饰的抗融合肽或其结合物，其中所述修饰的肽的一个或多个极性部分含有一个或多个半胱磺酸。
5.权利要求1或4的修饰的抗融合肽或其结合物，所述修饰的肽的一个或多个半胱磺酸被加到修饰的抗融合肽的N-末端或C-末端。
6.权利要求3的修饰的抗融合肽或其结合物，其中所述修饰的肽的一个或多个极性部分基本上不影响肽的二级或三级结构。
7.权利要求1或4的修饰的抗融合肽或其结合物，其中所述修饰的肽含有gp41的卷曲螺旋腔结合残基的至少一部分。
8.权利要求7的修饰的抗融合肽或其结合物，其中所述修饰的肽含有来自氨基酸628WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL661(SEQ ID NO：2)的C34的氨基酸序列，或对其最多两个氨基酸取代、插入或缺失。
9.权利要求7的修饰的抗融合肽或其结合物，其中所述修饰的肽含有DP107和DP178的氨基酸序列，或对其最多两个氨基酸取代、插入或缺失。
10.权利要求7的修饰的抗融合肽或其结合物，还含有一个或多个化学反应性部分，使得所述修饰的肽能够与血液成分或载体蛋白上的可用官能团反应，形成结合物的稳定共价键。
11.权利要求10的修饰的抗融合肽或其结合物，其中反应性部分是含有马来酰亚胺的基团。
12.权利要求10的修饰的抗融合肽或其结合物，还含有一个或多个接头，选自：(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)，[2-(2-氨基)乙氧基)]乙氧基乙酸(AEEA)，乙二胺(EDA)；一个或多个烷基链(C1-C10)，例如8-氨基辛酸(AOA)，8-氨基丙酸(APA)和4-氨基苯甲酸(AphA)。
13.权利要求10的修饰的抗融合肽或其结合物，其中带有或不带接头的反应性部分添加到所述修饰的肽的C-末端，和一个或多个极性部分添加到所述修饰的抗融合肽的N-末端。
14.权利要求10的修饰的抗融合肽或其结合物，其中带有或不带接头的反应性部分添加到所述修饰的肽的N-末端，和一个或多个极性部分添加到所述修饰的抗融合肽的C-末端。
15.权利要求10的修饰的抗融合肽或其结合物，其中血液成分或载体蛋白是白蛋白。
16.权利要求15的修饰的抗融合肽或其结合物，其中白蛋白是重组的。
17.权利要求16的修饰的抗融合肽或其结合物，其中白蛋白是共价连接的。
18.一种修饰的抗融合肽或其结合物，具有下列构型：
[(半胱磺酸)-修饰的肽-接头n-反应性基团]；或
[反应性基团-接头n-修饰的肽-(半胱磺酸)]，
其中反应性基团是使用或不使用接头，与人血清白蛋白共价连接的含有马来酰亚胺的基团；
n可以是0、1、2、3、4或更多个接头，选自(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)，[2-(2-氨基)乙氧基)]乙氧基乙酸(AEEA)，乙二胺(EDA)；一个或多个烷基链(C1-C10)，例如8-氨基辛酸(AOA)，8-氨基丙酸(APA)和4-氨基苯甲酸(AphA)；并且
所述修饰的肽含有来自氨基酸628WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL661(SEQ ID NO：2)的C34的氨基酸序列，或对其最多两个氨基酸取代或添加。
19.一种修饰的抗融合肽或其结合物，由下式表示：
(I)(R1)m-X-(R2)n
其中在式(I)中，m与n的和至少为1，且m和n各为0或大于0的整数；
X含有C34、DP107、DP178的氨基酸序列，或其类似物；
R1存在而R2不存在时，R1存在于X基团的N-末端；和
当R1不存在而R2存在时，R2存在于X基团的C-末端。
20.权利要求19的修饰的抗融合肽或其结合物，其中R1和R2各自独立地选自下式(II)表示的化合物：
Figure A2008800221630005C1
其中式(II)的核心结构与氨基酸相似，并包含氨基、α碳和羧基；并且
其中式(II)的R3基团包括磺酰基(HS＝(O)2)、亚砜基(HS＝O)、磺酸基(HO-S＝(O)2)、卤代烷基、仲胺、叔胺、羟基，或其它极性或甚至中性并能够增加肽衍生物在水性溶液中的总体溶解度的侧链基团。
21.权利要求20的修饰的抗融合肽或其结合物，其中R1和R2基团基本上不影响肽的总体二级或三级结构。由于基本上不影响所述肽结合物的二级结构，肽结合物的总体活性将不会显著低于未衍生的肽。
22.修饰的抗融合肽，具有选自下列的结构：
CA化合物I：(半胱磺酸(CA)与C34直接相连；在本文中也被称为CA-C34(SEQ ID NO：3))，
Figure A2008800221630005C2
CA化合物II：(半胱磺酸(CA)与在28位的天然赖氨酸(Lys28)被精氨酸取代的C34直接相连；在本文中也被称为CA-C34(Arg28)(SEQ ID NO：4))，
Figure A2008800221630006C1
CA化合物III：(半胱磺酸(CA)与在35位具有附加的赖氨酸残基(Lys35)的C34直接相连，其中赖氨酸的ε-NH2基团通过接头(AEEA-MPA)与反应性基团相连；在本文中也被称为CA-C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)(SEQ ID NO：5))，
Figure A2008800221630006C2
以及
CA化合物IV：(半胱磺酸(CA)与在28位的天然赖氨酸(Lys28)被精氨酸取代；在35位具有附加的赖氨酸残基(Lys35)，其中赖氨酸的εNH2基团通过接头(AEEA-MPA)与反应性基团相连的C34直接相连；在本文中也被称为CA-C34(Arg28)-Lys35(ε-AEEA-MPA)(SEQ IDNO：6))，
23.一种结合物，其含有权利要求1、4、18、19或22任一项的修饰的抗融合肽。
24.一种结合物，其含有权利要求8的修饰的抗融合肽，所述修饰的抗融合肽，使用或不使用接头，与白蛋白上的一个或多个氨基、羟基或巯基结合，形成稳定的共价键。
25.一种结合物，其含有权利要求10的修饰的抗融合肽，所述修饰的抗融合肽，使用或不使用接头，与白蛋白上的一个或多个氨基、羟基或巯基结合，形成稳定的共价键。
26.一种结合物，其含有权利要求11的修饰的抗融合肽，所述修饰的抗融合肽，使用或不使用接头，与白蛋白上的一个或多个氨基、羟基或巯基结合，形成稳定的共价键。
27.一种结合物，其含有权利要求12的修饰的抗融合肽，所述修饰的抗融合肽，使用或不使用接头，与白蛋白上的一个或多个氨基、羟基或巯基结合，形成稳定的共价键。
28.一种结合物，其含有权利要求13的修饰的抗融合肽，所述修饰的抗融合肽，使用或不使用接头，与白蛋白上的一个或多个氨基、羟基或巯基结合，形成稳定的共价键。
29.一种结合物，其含有权利要求15的修饰的抗融合肽，所述修饰的抗融合肽，使用或不使用接头，与白蛋白上的一个或多个氨基、羟基或巯基结合，形成稳定的共价键。
30.一种结合物，其含有权利要求22的修饰的抗融合肽，所述修饰的抗融合肽，使用或不使用接头，与白蛋白上的一个或多个氨基、羟基或巯基结合，形成稳定的共价键。
31.一种药物组合物，其含有权利要求8的修饰的抗融合肽或其结合物以及适合于皮下、静脉内或肺部给药的可药用载体。
32.一种药物组合物，其含有权利要求22的修饰的抗融合肽或其结合物以及适合于皮下、静脉内或肺部给药的可药用载体。
33.一种药物组合物，其含有权利要求23的结合物以及适合于皮下、静脉内或肺部给药的可药用载体。
34.一种药物组合物，其含有权利要求24的结合物以及适合于皮下、静脉内或肺部给药的可药用载体。
35.用于在对象中治疗或预防病毒的方法，所述病毒选自人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、呼吸道合胞病毒(RSV)、3型人类副流感病毒(HPIV-3)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，包括
向带病毒、或处于带病毒风险的对象施用权利要求8的修饰的抗融合肽或其结合物，从而治疗或预防感染。
36.用于在对象中治疗或预防病毒的方法，所述病毒选自人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、呼吸道合胞病毒(RSV)、3型人类副流感病毒(HPIV-3)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，包括
向带病毒、或处于带病毒风险的对象施用权利要求22的修饰的抗融合肽或其结合物，从而治疗或预防感染。
37.用于在对象中治疗或预防病毒的方法，所述病毒选自人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、呼吸道合胞病毒(RSV)、3型人类副流感病毒(HPIV-3)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，包括
向带病毒、或处于带病毒风险的对象施用权利要求23的结合物，从而治疗或预防感染。
38.用于在对象中治疗或预防病毒的方法，所述病毒选自人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、呼吸道合胞病毒(RSV)、3型人类副流感病毒(HPIV-3)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，包括
向带病毒、或处于带病毒风险的对象施用权利要求24的结合物，从而治疗或预防感染。
39.在对象中抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、呼吸道合胞病毒(RSV)、3型人类副流感病毒(HPIV-3)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的一种或多种活性的方法，包括给需要治疗的对象施用有效量的权利要求8的修饰的抗融合肽或其结合物。
40.在对象中抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、呼吸道合胞病毒(RSV)、3型人类副流感病毒(HPIV-3)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的一种或多种活性的方法，包括给需要治疗的对象施用有效量的权利要求22的修饰的抗融合肽或其结合物。
41.用于提高抗融合肽的大规模制备的方法，包括：
提供权利要求8的修饰的抗融合肽；以及
制备修饰的肽的浓度为至少100mg/ml的修饰的肽溶液。
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