CN101643750B - 靶向性溶肿瘤腺病毒载体Ad-TD-gene的构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene的构建方法及应用，该病毒载体为C亚类的5型腺病毒Ad5，删除腺病毒的E1A-CR2、E1B19K和E3gp-19K三个内在基因，保留E3B基因，保留E3gp-19K启动子表达外源治疗基因，该载体可以插入任意一种有助于治疗肿瘤或用于感染性疾病疫苗的抗原基因。本发明的Ad-TD-gene具有特异性、安全性和高效性，可以携带各种治疗肿瘤的抗原基因，可用于各种实体瘤的治疗。本发明的Ad-TD-hCCL21，利用人趋化因子CCL21基因作为治疗基因，具有肿瘤靶向性和抗肿瘤效果，为肿瘤靶向性基因工程药物推向临床应用打下了基础，将为肿瘤病人提供一种有效的治疗方法。

Description

靶向性溶肿瘤腺病毒载体Ad-TD-gene的构建方法及应用

一、技术领域：

本发明涉及生物技术和基因治疗领域，特别是涉及一种肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene的构建方法及应用。

二、背景技术：

恶性肿瘤是目前威胁人类健康的严重疾病，尤其是中晚期恶性肿瘤。化疗和放疗是目前临床上治疗中晚期肿瘤的常用方法。尽管标准的化疗和放疗已在临床上应用了几十年，然而大多数临床中晚期病人的整体生存率仍无明显改善。因此，在理论上和临床实践上不仅需要创新性的肿瘤治疗方法，而且要对肿瘤细胞有更好的选择性和更明确的作用机制，同时又不会与现在常用的治疗药物产生拮抗。

病毒可以通过多种机制感染人类细胞，并在细胞中复制，最终杀伤被感染的细胞。一个世纪以前，当病毒被发现时，临床医生就试图用野生型病毒治疗肿瘤，但是由于病毒治疗的毒性副作用和当时化疗药物的兴起就一度被禁用。随着DNA重组技术的发现和对肿瘤发生分子机制的深入了解，用基因工程方法来改造病毒，使其安全地靶向杀伤肿瘤细胞已成为现实。复制选择性溶肿瘤病毒是一种新的肿瘤治疗方法。所谓复制选择性溶肿瘤病毒，是根据分子病毒学、肿瘤分子生物学和分子生物学等知识，用基因工程方法改造野生型病毒或发现先天性嗜肿瘤的病毒株，这些病毒能选择性的在肿瘤细胞中复制，可杀伤肿瘤细胞并释放新的病毒感染邻近肿瘤细胞；而在正常细胞中不复制或复制很低。复制选择性溶肿瘤病毒不仅本身可以杀伤肿瘤细胞，而且还可以携带治疗基因，使治疗基因通过复制达到高水平、长时间的表达，并且还能广泛地感染大量肿瘤细胞，克服非复制型载体的不足；同时可以使肿瘤细胞对常规化疗及放疗效果增强，并通过多种途经来产生抗肿瘤效果，如调节免疫反应、抑制新生血管生成等。因此，复制选择性溶肿瘤病毒目前已成为肿瘤治疗中的热点。

自从二十多年前Martuza等首次用改造的复制选择性溶肿瘤病毒(HSV)治疗肿瘤以来，用病毒治疗肿瘤又获得新生。目前已有多种微生物被发现或修饰用于肿瘤治疗，如疱疹病毒、腺病毒、痘苗病毒、呼肠孤病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、水泡性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒等。

鉴于腺病毒毒性低，基因结构清楚，能以非整合方式感染分裂和非分裂细胞，理化性质稳定，又适合符合GMP标准的高滴度生产与纯化，故复制选择性溶肿瘤腺病毒(Replication-selective oncolytic Adenovirus，RSOA)目前已成为肿瘤病毒治疗中研究最为广泛的病毒。第一代RSOA-Onyx-015(或dl1520)，在中国称H101，已被国家医药管理局正式批准为用于头颈部的肿瘤治疗药物。临床试验表明，这种病毒虽然显示了好的肿瘤选择性和安全性，但单纯应用时，对肿瘤的治疗效果甚微。

第一代具有复制能力的溶肿瘤腺病毒H101，是E1B-55K和大部分E3区基因删除的腺病毒。E1B-55K蛋白抑制肿瘤抑制蛋白p53，阻止p53介导的感染细胞的凋亡。P53功能的缺失是大多数肿瘤的共同特征，因此，E1B-55K基因的删除能够阻止病毒在表达有功能的p53的正常细胞内复制，但是允许在缺乏有功能的p53的肿瘤细胞内复制。这种病毒是第一次被改造的复制选择性腺病毒，并进入了头颈部和胰腺等癌症的临床研究。但是E1B-55K蛋白是病毒mRNA从细胞核输出必需的蛋白，因此E1B-55K缺失的腺病毒H101杀伤肿瘤细胞的能力就相对减弱。基于对腺病毒生命周期中基因产物作用的更加彻底的了解，第二代溶肿瘤腺病毒，即腺病毒E1A蛋白与肿瘤抑制蛋白Rb相结合的CR2基因被删除的RSOA-dl922/47，显示出更好的抗肿瘤能力，在相同体内外模型中比dl1520(H101)的效果更好。但该病毒在具有增值能力的正常细胞中仍有一定的复制能力。为了进一步提高该病毒的选择性，我们对腺病毒E1B19K基因对RSOA的影响进行了研究，结果发现删除E1B19K可增强腺病毒对肿瘤细胞的杀伤能力和选择性，并能加快腺病毒粒子的释放。此外，H101和dl922/47都缺乏大部分腺病毒的E3区基因。先前认为腺病毒E3区域基因对腺病毒在体外的复制没有影响，删除该区域能增加装载外源基因的能力，但是最近我们发现，腺病毒E3B区域严重影响溶肿瘤腺病毒的抗肿瘤效果，删除该区域基因明显加快机体对腺病毒的清除，但是删除E3区的E3gp-19K导致病毒的抗肿瘤效果增强。

为了增强腺病毒对肿瘤细胞的特异性和高效性，降低对正常细胞的毒性，必须根据最新的研究成果对腺病毒进行改造。

CCL21是主要的免疫趋化因子之一。CCL21在脾脏和淋巴结的二级淋巴组织的T细胞区表达，负责抗原激活的(成熟的)树突细胞(DC)、非成熟的DC和幼稚T细胞的招募。此外，CCL21能够增强促炎症反应细胞因子的产生，例如IL-12、干扰素(IFN)-γ、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMM-CSF)，它们能够促进细胞介导的免疫反应，连同血管抑制分子，例如能够阻止肿瘤内血管生成的IFN-γ诱导蛋白10(IP10)和IFN-γ诱导的单核因子(MIG)的表达。很多关于小鼠肿瘤的直接肿瘤内注射CCL21实验已经显示肿瘤病灶中DC和T细胞渗透的增加，伴随着肿瘤消退。高水平表达CCL21这种有效抗肿瘤免疫调节分子，能在肿瘤病灶区聚集免疫细胞，激活对肿瘤抗原的免疫记忆。这个作用应当能够使免疫系统直接识别和破坏原发肿瘤、在淋巴系统中转移的细胞和在其他部位的继发性肿瘤。

三、发明内容：

本发明要解决的技术问题是：提供一种肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene的构建方法，该载体能够构建携带有治疗基因的肿瘤靶向性腺病毒载体，该病毒载体具有靶向性、安全、高效的特点；

本发明还提供一种的肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-hCCL21，利用人趋化因子CCL21基因作为治疗基因，该载体能选择地杀死肿瘤细胞，具有肿瘤靶向性和抗肿瘤效果。

本发明的技术方案：

为了解决上述问题，本发明提供一种肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene的构建方法，其特征是：该病毒载体为C亚类的5型腺病毒Ad5，删除该腺病毒的E1A-CR2、E1B19K和E3gp-19K三个内在基因(triple deletion，TD)，保留了有助于病毒基因的表达和增强病毒在体内持续时间的E3B基因，同时，保留E3gp-19K启动子表达外源治疗基因，所述载体可插入任意一种有助于治疗肿瘤或用于感染性疾病疫苗的抗原基因。

所述肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene的构建方法，包括以下步骤，

(1)首先用PCR方法得到要改造序列E1A-CR2两侧的基因片段，上游序列称为左臂，下游序列称为右臂，用基因工程方法把左臂和右臂按病毒基因一致的顺序连接到质粒载体pSuperShuttle上，建成E1A-CR2穿梭载体；

将所述腺病毒载体Ad5和E1A-CR2穿梭载体按1∶2～10的比例转化到BJ5183细菌中，进行同源重组；用PCR方法鉴定阳性重组菌，提取重组质粒，转染到293细胞中，得到E1A-CR2缺失的Ad5R-CR2病毒载体；

(2)用与所述构建E1A-CR2穿梭载体相同的方法构建E1B19K穿梭载体，然后与Ad5R-CR2病毒载体同源重组，得到CR2和E1B19K双缺失的Ad5R-CR2R-E1B19K病毒载体；

(3)用PCR方法扩增E3gp-19K基因蛋白编码区两侧序列，左臂范围从-1087bp到0bp，其中包含E3gp-19K基因的启动子，右臂起始于E3gp-19K基因的终止密码向后1146bp，两臂用酶切位点相连，构建穿梭载体，然后与Ad5R-CR2R-E1B19K病毒载体同源重组，得到E1A-CR2、E1B19K和E3gp-19K三个编码基因均缺失的腺病毒载体pZZU001，将pZZU001转染到293细胞中，生产所述肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene。

所述肿瘤为各种实体瘤；所述感染性疾病为艾滋病、幽门螺旋杆菌、血吸虫、霍乱或肝炎。

所述方法构建的肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-hCCL21，其特征是：所述肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene携带人的免疫趋化因子CCL21基因。

所述肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-hCCL21的构建方法，包括如下步骤：

(1)用NcoI和NheI双酶切pORF5-hExodus-2质粒，然后用T4DNA聚合酶将切出的hCCL21基因片段补平，备用；

(2)酶切腺病毒载体pZZU001，然后将所述的hCCL21基因平端插入到病毒载体的酶切位点上，用PCR方法鉴定筛选插入方向正确的重组载体，然后转染到293细胞中，生产所述病毒载体Ad-TD-hCCL21。

所述的肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-hCCL21在用于制备治疗肿瘤的药物中的应用。

本发明的腺病毒载体也可以携带治疗感染性疾病疫苗的抗原基因(如艾滋病、幽门螺旋杆菌、血吸虫、霍乱和肝炎等)，可用于该类感染性疾病的治疗(Demberg T.et al.J Virol，2007)。

本发明的积极有益效果：

(1)本发明提供的肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene，利用病毒内在基因的启动子，删除了E1A-CR2、E1B19K和E3gp-19K三个腺病毒内在基因，保留了E3区的部分基因，增加了特异性、安全性和高效性，可以携带各种治疗肿瘤的治疗基因，具有靶向性，可用于各种实体瘤(如胰腺癌、大肠癌、肺癌和肝癌等)的治疗。因此，Ad-TD-gene可作为一种治疗肿瘤的有效的、安全的基因治疗载体系统。

(2)本发明的肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-hCCL21，利用人趋化因子CCL21基因作为治疗基因，在Ad-TD-gene的携带下，具有高表达作用，由此能在肿瘤病灶区聚集免疫细胞，激活对肿瘤抗原的免疫记忆，使免疫系统直接识别和破坏原发肿瘤、在淋巴系统中转移的细胞以及在其他部位的继发性肿瘤。经细胞实验和动物试验表明，该载体能选择地杀死肿瘤细胞，清除部分免疫缺陷和免疫完全鼠类的荷瘤，比第一代和第二代腺病毒载体相比，其疗效和安全性都较好。

(3)本发明的肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-hCCL21，具有肿瘤靶向性和抗肿瘤效果，为作为一种肿瘤靶向性基因工程药物推向临床应用打下基础，将为肿瘤病人提供一种有效的治疗方法，将会产生较好的社会效益和经济效益。

四、附图说明：

图1：dl1520及肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene、Ad-TD-h/mCCL21和对照病毒Ad-TD-RFP的结构图。

图2：对照病毒Ad-TD-RFP在293t细胞中的表达。图中可以看到大量明显的红色荧光蛋白发出的红色荧光。

图3：肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD、Ad-TD-hCCL21及其对照病毒对常见人肿瘤细胞的杀伤能力检测示意图。

图中1、2、3、4依次为dl1520、Ad-TD、Ad-TD-hCCL21、Ad-TD-mCCL21。

图4：肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD和H101对荷瘤金黄地鼠的治疗效果——肿瘤生长曲线的比较图。

图5：肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD和H101对荷瘤金黄地鼠的治疗效果——肿瘤清除率的比较图。

五、具体实施方式：

以下实施例只是对本发明的技术方案的进一步说明，并不限定本发明的保护范围。

实施例1、肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene、Ad-TD-hCCL21及其对照病毒载体Ad-TD-RFP的构建。

1、肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene的构建

(1)首先用PCR方法得到要改造序列E1A-CR2两侧的基因片段，上游序列称为左臂，下游序列称为右臂，用基因工程方法把左臂和右臂按病毒基因一致的顺序连接到质粒载体pSuperShuttle上，建成E1A-CR2穿梭载体；

(2)将Ad5腺病毒载体和穿梭载体按1∶2～10的比例转化到BJ5183细菌中，进行同源重组；用PCR方法鉴定阳性重组菌，提取重组质粒，转染到293细胞中，得到E1A-CR2缺失的Ad5R-CR2病毒载体；

(3)用和步骤(1)相同的方法构建E1B19K穿梭载体，然后与Ad5R-CR2病毒载体同源重组，得到CR2和E1B19K双缺失的Ad5R-CR2R-E1B19K病毒载体；

(4)用PCR方法扩增E3gp-19K蛋白编码区两侧序列。左臂(引物：actcccgggcgtccttcattcacgcctc和actcccgggcttgggtggcgacccc)范围从-1087bp到0bp，包含E3gp-19K基因的启动子，右臂(引物：actcccgggtttactaagttacaaagctaatg和actcccgggcttgttgcagtggaagcatag)起始于E3gp-19K基因的终止密码向后1146bp。两条臂用SwaI酶切位点相连，构建穿梭载体，然后与Ad5R-CR2R-E1B19K病毒载体同源重组，得到E1A-CR2、E1B19K和E3gp-19K三个编码基因均缺失的腺病毒载体pZZU001，将该载体转染到293细胞中，生产病毒载体Ad-TD-gene(ZZU001)。该病毒载体未插入外源基因应用时，可简写为Ad-TD(ZZU001)。

2、肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-hCCL21的构建

(1)用NcoI和NheI双酶切pORF5-hExodus-2(购自Invitrogen)质粒，然后用T4DNA聚合酶将切出的hCCL21基因片段补平，备用；

(2)用SwaI酶切腺病毒载体pZZU001，然后将hCCL21基因平端插入到病毒载体的酶切位点上，用PCR方法鉴定筛选插入方向正确的重组载体，命名为pZZU002，转染到293细胞中，生产病毒载体Ad-TD-hCCL21(ZZU002)。hCCL21基因在E3gp-19K启动子的启动下表达高水平的蛋白产物。

由于E3gp-19K的启动子是腺病毒自身的启动子，能够使外源基因的表达限制在病毒感染的肿瘤细胞内，所以Ad-TD-gene能够介导外源治疗基因在肿瘤细胞中高表达，而在正常细胞中不表达，从而杀伤肿瘤细胞。

用同样方法构建对照病毒载体Ad-TD-RFP(RFP，红色荧光蛋白)。

肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene、Ad-TD-hCCL21及其对照病毒载体Ad-TD-RFP(RFP，红色荧光蛋白)，都删除E1A-CR2、E1B19K和E3gp-19K三个腺病毒内在基因，保留了有助于病毒基因的表达和增强在体内持续时间的E3B基因，结果如附图1所示。

实施例2、肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene的内源性启动子表达报告基因RFP在细胞内的特异性表达

293细胞接种六孔板，当细胞长至75％时，Ad-TD-RFP以1×10⁵pt/细胞的剂量感染293细胞，培养48小时后，在荧光显微镜下观察红色荧光蛋白的表达，结果如附图2所示。

实施例3、肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene和Ad-TD-hCCL21对常见人肿瘤细胞的杀伤能力检测

收集处于对数生长期的HCT116(大肠癌)细胞、PT45(胰腺癌)细胞、H460(肺癌)细胞、A549(肺癌)细胞、SUIT2(胰腺癌)细胞，计数，分别按2000细胞/孔接种于96孔板中。12小时后，细胞贴壁，稀释病毒dl1520、Ad-TD、Ad-TD-hCCL21和Ad-TD-mCCL21(mCCL21，小鼠CCL21基因)。按最高浓度1×10⁴pt/细胞加入96孔板中，每列递减10倍，第10列为空白对照。六天后，MTS法检测(Buttke TM，J Immunol Methods，1993，157(1-2)：233-40)，换算成EC50(即每种病毒杀伤50％肿瘤细胞所需的病毒量，EC50越低，表明该病毒杀伤能力更强)。由附图3可知，Ad-TD、Ad-TD-hCCL21和Ad-TD-mCCL21与dl1520相比，对肿瘤细胞有更强的杀伤能力。

实施例4、肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD和dl1520(H101)对荷瘤金黄地鼠的治疗效果将5-6周龄的雌性金黄地鼠右侧背部皮下接种胰腺癌细胞株HPD1NR(金黄地鼠胰腺癌细胞系)，每只金黄地鼠为1×10⁶个细胞，10天后肿瘤达到100～150mm³时进行分组，治疗组1×10⁹pfu/只的Ad-TD进行治疗，对照组为磷酸盐缓冲液(PBS)和dl1520(H101)，实验结果如图4、图5所示。

由图4可知，Ad-TD比dl1520(H101)的治疗时间明显缩短，治疗效果更好。

由图5可知，Ad-TD比dl1520(H101)更能显著抑制肿瘤生长，单独使用ZZU001腺病毒载体治疗，可使金黄地鼠71.4％的肿瘤完全消除，而dl1520只能引起金黄地鼠14.2％的肿瘤消除。

Claims (6)

1.一种肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene的构建方法，其特征是：该病毒载体为C亚类的5型腺病毒Ad5，删除该腺病毒的E1A-CR2、E1B19K和E3gp-19K三个内在基因，保留E3B基因，同时，保留E3gp-19K启动子表达外源治疗基因，所述载体可插入任意一种有助于治疗肿瘤或用于感染性疾病疫苗的抗原基因。

2.根据权利要求1所述肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene的构建方法，其特征是：该方法包括以下步骤，

(1)首先用PCR方法得到要改造序列E1A-CR2两侧的基因片段，上游序列称为左臂，下游序列称为右臂，用基因工程方法把左臂和右臂按病毒基因一致的顺序连接到质粒载体pSuperShuttle上，建成E1A-CR2穿梭载体；

将所述腺病毒载体Ad5和E1A-CR2穿梭载体按1∶2～10的比例转化到BJ5183细菌中，进行同源重组；用PCR方法鉴定阳性重组菌，提取重组质粒，转染到293细胞中，得到E1A-CR2缺失的Ad5R-CR2病毒载体；

(2)用与所述构建E1A-CR2穿梭载体相同的方法构建E1B19K穿梭载体，然后与Ad5R-CR2病毒载体同源重组，得到CR2和E1B19K双缺失的Ad5R-CR2R-E1B19K病毒载体；

(3)用PCR方法扩增E3gp-19K基因蛋白编码区两侧序列，左臂范围从-1087bp到0bp，其中包含E3gp-19K基因的启动子，右臂起始于E3gp-19K基因的终止密码向后1146bp，两臂用酶切位点相连，构建穿梭载体，然后与Ad5R-CR2R-E1B19K病毒载体同源重组，得到E1A-CR2、E1B19K和E3gp-19K三个编码基因均缺失的腺病毒载体pZZU001，将pZZU001转染到293细胞中，生产所述肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene。

3.根据权利要求1或2所述肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene的构建方法，其特征是：所述肿瘤为各种实体瘤；所述感染性疾病为艾滋病、幽门螺旋杆菌、血吸虫、霍乱或肝炎。

4.一种按照权利要求1或2所述方法构建的肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-hCCL21，其特征是：所述肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene携带人的免疫趋化因子CCL21基因。

5.根据权利要求4所述肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-hCCL21的构建方法，其特征是：该方法包括如下步骤：

(1)用NcoI和NheI双酶切pORF5-hExodus-2质粒，然后用T4DNA聚合酶将切出的hCCL21基因片段补平，备用；

(2)酶切腺病毒载体pZZU001，然后将所述的hCCL21基因平端插入到病毒载体的酶切位点上，用PCR方法鉴定筛选插入方向正确的重组载体，然后转染到293细胞中，生产所述病毒载体Ad-TD-hCCL21。

6.权利要求4所述的肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-hCCL21在用于制备治疗肿瘤的药物中的应用。

Images