CN101481715B - 一种生物发酵提纯他克莫司的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用生物发酵提纯他克莫司的方法，利用自主筛选鉴定的链霉菌Streptomyces sp.NJYH2618，通过微生物发酵培养出含他克莫司的发酵液，采用菌丝体抽提、发酵液萃取、大孔树脂吸附、硅胶柱层析及冷却结晶技术得到他克莫司纯品，纯度＞98％。本发明操作方便、工艺简单、成本低廉，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及生物发酵，生物制药，发酵产物的提取、分离和纯化方法，特别涉及一种生物发酵提纯他克莫司的方法。
背景技术
他克莫司(tacrolimus，FK506)是由日本藤泽药品工业公司探索研究所于1984年自日本筑波山土壤中分离的筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)No.9993的发酵液中提取得到的一种新型二十三元大环内酯聚酮免疫抑制剂。临床研究表明，其免疫抑制活性是环孢菌素A的10～100倍。目前已广泛应用于肝脏、骨髓移植、对其他药物耐药肾移植的排斥防治、白塞氏病、变应性皮炎、银屑病、鱼鳞病、斑秃、类风湿性关节炎、牛皮癣、多发性硬化病、糖尿病等多种自身免疫疾病的治疗。自在中国上市的短短时间内，市场份额迅速上升，已成为肝脏及肾脏移植后排斥反应的临床一线药物。
他克莫司的合成方法主要有：①生物发酵法。主要由筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)、吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)生物发酵得到。Kino T.等1984年首次从筑波链霉菌中分离出他克莫司。②有机合成法。Todd K.Jones等1990年在欧洲专利EP378,318中首次公布了他克莫司的有机合成方法。由于他克莫司是二十三元大环内酯，有机合成过程中工艺步骤繁多，反应条件苛刻，合成成本昂贵。因此主要用生物发酵法制备他克莫司。
国内在他克莫司提纯方面的研究起步较晚。从90年代中后期华北制药和华东制药对他克莫司产生菌进行了初步诱变选育，上海农药所公开了一株新的他克莫司产生菌及生产方法，发酵产物他克莫司的平均浓度为150μg/mL，但对于如何分离提取产物并未具体说明。国外分离提纯他克莫司主要有两种方法：①分别加工菌丝体和发酵液，如Kino T.et al.J.Antibiot.1987，40，1249-1255中所述。②利用疏水性溶剂直接萃取发酵液，如专利WO03/68980中所述。由于发酵液中存在多种他克莫司类似物，生物效价不高，并且存在于菌丝体和发酵液之中，有效的分离提纯他克莫司很有难度，使得国内在发酵液中提纯他克莫司的主要技术研究方面尚属空白。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术中存在的缺陷或不足，提供一种采用生物发酵提纯他克莫司的方法。
本发明的技术方案为：利用自主筛选鉴定的链霉菌Streptomyces sp.NJYH2618，通过微生物发酵培养出含他克莫司的发酵液，他克莫司发酵液经种子的培养、接种前准备及接种、多阶段溶氧控制、分批补料发酵阶段得到，具体培养方法见本发明人申请的专利(申请号为200810234807.6)；并采用菌丝体抽提、发酵液萃取、大孔树脂吸附、硅胶柱层析及冷却结晶技术得到他克莫司纯品。本发明操作方便、工艺简单、成本低廉，适合工业化生产。
本发明的具体技术方案：一种生物发酵提纯他克莫司的方法，其特征在于利用自主筛选鉴定的链霉菌Streptomyces sp.NJYH2618，通过微生物发酵培养出含他克莫司的发酵液，采用菌丝体抽提、发酵液萃取、大孔树脂吸附、硅胶柱层析及冷却结晶技术得到他克莫司纯品。
具体步骤如下：
1)用发酵过滤后的菌丝体5～10倍体积的有机溶剂抽提2～3次链霉菌Streptomycessp.NJYH2618发酵过滤后的菌丝体，得菌丝体抽提液并分离残留物；
2)用发酵上清液1～2倍体积的疏水性溶剂萃取链霉菌Streptomyces sp.NJYH2618发酵上清液，控制溶液温度和pH值，得疏水性萃取液；
3)合并菌丝体抽提液和疏水性萃取液得合并液，合并液经超滤膜过滤后，进入装有大孔树脂的床层进行吸附，其中大孔树脂体积与合并液体积比为1∶5～1∶20，用1～4倍大孔树脂体积的有机溶剂进行冲洗，并用1/3～1倍大孔树脂体积的有机溶剂进行解吸，控制溶液温度和pH值，得解吸液；
4)真空浓缩解吸液，并用1～4倍解吸液体积的乙酸乙酯或丙酮提取解吸液，无水硫酸钠或无水硫酸镁脱水，再次真空浓缩；将真空浓缩后的浓缩液经与浓缩液体积比为1∶10～1∶20的甲醇-水混合溶液溶解，在反相硅胶柱中用和浓缩液体积比为1∶2～1∶7的硅胶进行层析分离，用2～3倍硅胶体积的洗脱剂进行洗脱，收集含他克莫司的活性组分；
5)真空浓缩含他克莫司的活性组分，并将活性组分溶于2～5倍体积的结晶溶剂中冷却结晶得到他克莫司。
上述的步骤1)中有机溶剂为丙酮、乙酸乙酯或甲醇。上述的步骤2)中疏水性溶剂为丙酮、乙酸乙酯或甲苯。步骤3)中冲洗的有机溶剂为体积浓度45～55％丙酮或甲醇；解吸的有机溶剂为体积浓度70～80％丙酮或甲醇；步骤4)中洗脱剂为体积浓度50～75％甲醇或乙醇；上述的步骤5)中结晶溶剂为乙腈、甲醇或乙醇。
上述步骤2)中萃取过程中控制溶液温度为15～35℃，pH 6-12；步骤3)中冲洗和解吸过程中控制溶液温度为15～35℃，pH 6-12；步骤4)中用乙酸乙酯或丙酮提取解吸液的次数为2-3次；混合溶液中甲醇和水的体积比为1∶1～1∶1.5；步骤5)中结晶温度为5～25℃，结晶时间为15～60小时。
所述的链霉菌为本实验室自主筛选，其分类命名为链霉菌，菌种的拉丁学名是Streptomyces sp.，分类株：NJYH2618，并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCC No.2519，保藏时间是2008年5月26日(见本发明人申请的专利，申请号为200810234807.6)。
有益效果：
采用本发明的生物发酵提纯他克莫司的方法，利用自主筛选鉴定的链霉菌Streptomyces sp.NJYH2618，通过微生物发酵培养出含他克莫司的发酵液，采用菌丝体抽提、发酵液萃取、大孔树脂吸附、硅胶柱层析及冷却结晶技术得到他克莫司纯品，纯度＞98％，收率83％～93％。本发明操作方便、工艺简单、成本低廉，适合工业化生产。
具体实施方式
本发明提供一种生物发酵提纯他克莫司的方法，下面列举实施例予以进一步说明。本发明实施例所用的发酵液见本发明人申请的专利(申请号为200810234807.6)实施例3所发酵得到的发酵液，并将发酵液进行过滤，得发酵过滤后的菌丝体和发酵上清液；
实例1：
1)用5倍体积的丙酮抽提2次链霉菌Streptomyces sp.NJYH2618发酵过滤后的菌丝体，得菌丝体抽提液并分离残留物；
2)用等体积的乙酸乙酯萃取链霉菌Streptomyces sp.NJYH2618发酵上清液，温度为25℃，pH 7.5，得疏水性萃取液；
3)合并菌丝体抽提液和疏水性萃取液得合并液，合并液经截留分子量为1000的聚醚砜超滤膜，去除蛋白质和多糖等大分子物质，再进入装有D101大孔树脂的床层进行吸附，其中大孔树脂体积与合并液体积比为1∶5，用2倍大孔树脂体积的体积浓度45％丙酮冲洗，并用1/3倍大孔树脂体积的体积浓度70％丙酮解吸，温度为25℃，pH 7.5，得解吸液；
4)真空浓缩解吸液并用2倍体积的乙酸乙酯提取2次解吸液，无水硫酸钠脱水，再次真空浓缩；将浓缩后的浓缩液经与浓缩体积比为1∶10的甲醇-水(1∶1，V/V)溶解，用硅胶-提取液(1∶2，V/V)的反相硅胶柱层析分离，2倍硅胶体积的体积浓度50％甲醇作为洗脱剂，结合高效液相检测收集含他克莫司的活性组分；
5)真空浓缩高效液相检测的活性组分，将活性组分溶于2倍体积的乙腈中，冷却于10℃下保持约24小时，纯度＞98％，收率85％。
实例2：
1)用8倍体积的丙酮抽提2次链霉菌Streptomyces sp.NJYH2618发酵过滤后的菌丝体，得菌丝体抽提液并分离残留物；
2)用1.5倍体积的丙酮萃取链霉菌Streptomyces sp.NJYH2618发酵上清液，温度为25℃，pH 8.0，得疏水性萃取液；
3)合并菌丝体抽提液和疏水性萃取液得合并液，合并液经截留分子量为1000的聚醚砜超滤膜，去除蛋白质和多糖等大分子物质，再进入装有SP207大孔树脂的床层进行吸附，其中大孔树脂体积与合并液体积比为1∶10，同2倍大孔树脂体积的体积浓度50％甲醇冲洗，并用1/2倍大孔树脂体积的体积浓度75％甲醇解吸，温度为25℃，pH 8.0，得解吸液；
4)真空浓缩解吸液并用3倍体积的乙酸乙酯提取解吸液2次，无水硫酸镁脱水，再次真空浓缩；将浓缩后的浓缩液经与浓缩体积比为1∶15的甲醇-水(1∶1，V/V)溶解，用硅胶-提取液(1∶5，V/V)的反相硅胶柱层析分离，2.5倍硅胶体积的体积浓度60％甲醇作为洗脱剂，结合高效液相检测收集含他克莫司的活性组分。
5)真空浓缩高效液相检测的活性组分，将活性组分溶于3倍体积的甲醇中，冷却于5℃温度下保持约20小时，纯度＞98％，收率92％。
实例3：
1)用10倍体积的乙酸乙酯抽提2次链霉菌Streptomyces sp.NJYH2618发酵过滤后的菌丝体，得菌丝体抽提液并分离残留物；
2)用2倍体积的丙酮萃取链霉菌Streptomyces sp.NJYH2618发酵上清液，温度为25℃，pH 7.0，得疏水性萃取液；
3)合并菌丝体抽提液和疏水性萃取液得合并液，合并液经截留分子量为1000的聚醚砜超滤膜，去除蛋白质和多糖等大分子物质，再进入装有D315大孔树脂的床层进行吸附，其中大孔树脂体积与合并液体积比为1∶20，用4倍大孔树脂体积的体积浓度55％丙酮冲洗，并用与大孔树脂体积的相同体积浓度80％丙酮解吸，温度为25℃，pH 7.0，得解吸液；
4)真空浓缩解吸液并用4倍体积的丙酮提取3次解吸液，无水硫酸钠脱水，再次真空浓缩；将浓缩后的浓缩液经与浓缩液体积比为1∶20的甲醇-水(1∶1.5，V/V)溶解，用硅胶-提取液(1∶7，V/V)的反相硅胶柱层析分离，3倍硅胶体积的体积浓度75％乙醇作为洗脱剂，结合高效液相检测收集含他克莫司的活性组分；
5)真空浓缩高效液相检测的活性组分，将活性组分溶于5倍体积的乙醇中，冷却于15℃温度下保持约48小时，纯度＞98％，收率88％。
Claims (4)
1.一种生物发酵提纯他克莫司的方法，其特征在于利用自主筛选鉴定的链霉菌Streptomyces sp.NJYH2618，通过微生物发酵培养出含他克莫司的发酵液，采用菌丝体抽提、发酵液萃取、大孔树脂吸附、硅胶柱层析及冷却结晶技术得到他克莫司纯品；具体步骤如下：
1)用发酵过滤后的菌丝体5～10倍体积的有机溶剂抽提2～3次链霉菌Streptomyces sp.NJYH2618发酵过滤后的菌丝体，得菌丝体抽提液并分离残留物；其中有机溶剂为丙酮、乙酸乙酯或甲醇；
2)用发酵上清液1～2倍体积的疏水性溶剂萃取链霉菌Streptomyces sp.NJYH2618发酵上清液，控制溶液温度为15～35℃和pH值为6-12，得疏水性萃取液；
3)合并菌丝体抽提液和疏水性萃取液得合并液，合并液经超滤膜过滤后，进入装有大孔树脂的床层进行吸附，其中大孔树脂体积与合并液体积比为1∶5～1∶20，用1～4倍大孔树脂体积的有机溶剂进行冲洗，并用1/3～1倍大孔树脂体积的有机溶剂进行解吸，控制溶液温度为15～35℃和pH值为6-12，得解吸液；其中冲洗的有机溶剂为体积浓度45～55％丙酮或甲醇；解吸的有机溶剂为体积浓度70～80％丙酮或甲醇；
4)真空浓缩解吸液，并用1～4倍解吸液体积的乙酸乙酯或丙酮提取解吸液，无水硫酸钠或无水硫酸镁脱水，再次真空浓缩；将真空浓缩后的浓缩液经与浓缩液体积比为1∶10～1∶20的甲醇-水混合溶液溶解，其中甲醇和水混合溶液中甲醇和水的体积比为1∶1～1∶1.5；在反相硅胶柱中用和浓缩液体积比为1∶2～1∶7的硅胶进行层析分离，用2～3倍硅胶体积的洗脱剂进行洗脱，收集含他克莫司的活性组分；其中洗脱剂为体积浓度50～75％甲醇或乙醇；
5)真空浓缩含他克莫司的活性组分，并将活性组分溶于2～5倍体积的结晶溶剂中冷却结晶得到他克莫司。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤2)中疏水性溶剂为丙酮、乙酸乙酯或甲苯。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤5)中结晶溶剂为乙腈、甲醇或乙醇。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4)中用乙酸乙酯或丙酮提取解吸液的次数为2-3次；步骤5)中结晶温度为5～25℃，结晶时间为15～60小时。
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