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CN101389214A - 具有基因修饰免疫系统的有蹄类动物 - Google Patents

具有基因修饰免疫系统的有蹄类动物 Download PDF

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CN101389214A CNA2005800441766A CN200580044176A CN101389214A CN 101389214 A CN101389214 A CN 101389214A CN A2005800441766 A CNA2005800441766 A CN A2005800441766A CN 200580044176 A CN200580044176 A CN 200580044176A CN 101389214 A CN101389214 A CN 101389214A
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Abstract

本发明提供了缺少功能内源免疫球蛋白基因座表达的有蹄类动物、组织和器官以及来自此类动物、组织和器官的细胞和细胞系。本发明还提供了表达异种的(如人)免疫球蛋白基因座的有蹄类动物、组织和器官以及来自此类动物、组织和器官的细胞和细胞系。本发明还提供了有蹄类动物，如猪的重链和轻链免疫球蛋白的基因组DNA序列。此类动物、组织、器官和细胞可以用于研究和医疗目的。此外，提供了制备此类动物、器官、组织和细胞的方法。

Description

具有基因修饰免疫系统的有蹄类动物
本申请要求2004年10月22日提交的美国临时申请号60/621,433的优先权，将所述临时申请完整引入本文作为参考。
发明领域
本发明提供了缺少功能内源免疫球蛋白基因座表达的有蹄类动物、组织和器官以及来自此类动物、组织和器官的细胞和细胞系。本发明还提供了表达异种的(如人)免疫球蛋白基因座的有蹄类动物、组织和器官以及来自此类动物、组织和器官的细胞和细胞系。本发明还提供了有蹄类动物，如猪的重链和轻链免疫球蛋白的猪基因组DNA序列。此类动物、组织、器官和细胞可以用于研究和医学治疗。此外，提供了制备此类动物、器官、组织和细胞的方法。
发明背景
抗原是被身体识别为“外来的”试剂或者物质。通常它是作为抗原的更大的外来物质的仅仅一个相对较小的化学组，如细菌的细胞壁的组分。多数抗原是蛋白质，尽管糖类可以作为弱抗原。细菌、病毒和其他微生物通常含有许多抗原，花粉、尘螨、霉菌、食物和其他物质也一样。身体通过产生抗体对抗原产生反应。抗体(也称作免疫球蛋白(Ig))是免疫系统的细胞产生的蛋白质，其结合抗原或者外来蛋白质。抗体在血液的血清中循环以检测外来抗原并构成了血液蛋白质的γ球蛋白部分。这些抗体与抗原以高度特异的方式发生化学相互作用，像拼图玩具的两片一样，从而形成抗原/抗体复合体，或者免疫复合体。该结合中和抗原或者引起抗原的破坏。
当脊椎动物首次遇到抗原时，它显示出初次体液免疫应答。如果动物在几天后遇到相同的抗原，那么免疫应答更快速并且具有更大的量级。最初的相遇导致特异免疫细胞(B细胞)克隆增殖和分化。子代淋巴细胞不仅包括效应细胞(产生抗体的细胞)，而且包括记忆细胞克隆，所述记忆细胞在最初抗原的随后刺激后保留产生效应细胞和记忆细胞的能力。效应细胞仅存活几天。记忆细胞终生活着并且可以通过用相同的抗原再次刺激而再活化。从而，当再次遇到抗原时，它的记忆细胞快速产生效应细胞，所述效应细胞快速产生大量抗体。
通过利用抗体与抗原以高度特异性方式相互作用的独特能力，已经开发抗体作为可以生产并用于诊断和治疗应用的分子。因为它们结合抗原性表位的独特能力，多克隆和单克隆抗体可以用于鉴定携带该表位的分子或者可以自身或者与另一部分结合导向特定部位用于诊断或治疗。可以对实际上任何病原体或者生物学靶产生多克隆和单克隆抗体。术语多克隆抗体指通常含有各种同种型和特异性的病原体特异性抗体的免疫血清。相反，单克隆抗体由单一免疫球蛋白类型组成，代表具有一种特异性的一种同种型。
在1890年，Shibasaburo Kitazato和Emil Behring进行了一个基础实验，其证明通过将来自免疫动物的血清转移到非免疫动物，可以将免疫性从一个动物转移到另一个动物。该划时代的实验奠定了将被动免疫引入临床实践的基础。然而，在二十世纪40年代，因为与施用异源血清有关的毒性和有效的抗微生物化学疗法的引入，大规模的血清疗法在很大程度上被抛弃。当前，此类多克隆抗体疗法适于治疗相对少的情况下的传染病，如免疫球蛋白缺陷患者中的替代疗法、针对几种病毒(如狂犬病、麻疹、甲型和乙型肝炎、水痘)的暴露后预防，和毒素中和(白喉、破伤风和肉毒中毒)。尽管血清疗法的用途有限，但是在美国，每年需要超过16公吨的人抗体用于静脉内抗体治疗。在大多数高度工业化国家的经济中需要相当水平的使用，并且预期在发展中国家中，该需要快速增长。当前，用于被动免疫的人抗体从供体的合并血清得到。从而，用于治疗性和预防性治疗的人抗体的量存在固有的限制。
抗体用于针对生物战争试剂的被动免疫代表了非常有希望的防御策略。对这种生物战争试剂的最终防线是所暴露的个体的免疫系统。当前对生物武器的防御策略包括这样的措施，如增强流行病学监护、接种、和使用抗微生物剂。因为生物战争和生物恐怖主义(bioterrotism)的潜在威胁与靶定群体中免疫人数成反比，所以生物制剂是仅对具有很大比例的易感人员的潜在武器。
接种可以减小群体对特定威胁的易感性，前提是存在可以诱导保护性应答的安全疫苗。不幸的是，通过接种产生保护性应答需要的时间比暴露于疾病和疾病发作之间的时间更长。此外，许多疫苗需要多剂来实现保护性免疫应答，其将限制它们在紧急情况下对于在受攻击后提供快速预防的有用性。此外，并不是所有的疫苗受体都产生保护性应答，即使在接受推荐的免疫方案之后。
当暴露于某些试剂后施用时，药物可以提供保护，但是对于生物战争的许多潜在试剂还没有药物。当前，没有可以用于在暴露于预先形成的毒素后预防该疾病的小分子药物。可以提供即刻免疫状态的唯一的当前可利用的干预是用保护性抗体进行被动免疫(ArturoCasadevall“Passive Antibody Administration(Immediate Immunity)as a Specific Defense Against Biological Weapons”from EmergingInfectious Diseases，Posted 09/12/2002)。
除了提供保护性免疫外，现代的基于抗体的疗法组成了对新出现的病原性细菌、真菌、病毒和寄生物的潜在有用的选择(A.Casadevall和M.D.Scharff，Clinical Infectious Diseases 1995；150)。恶性肿瘤和癌症患者的治疗(C.Botti等人，Leukemia 1997；Suppl 2：S55-59；B.Bodey，S.E.Siegel，和H.E.Kaiser，Anticancer Res 1996；16(2)：661)、移植器官的类固醇抗性排斥以及自身免疫病的治疗也可以通过使用单克隆或者多克隆抗体制剂实现(N.Bonnefoy-Berard和J.P.Revillard，J Heart Lung Transplant 1996；15(5)：435-442；C.Colby，等人Ann Pharmacother 1996；30(10)：1164-1174；MJ.Dugan，等人，Ann Hematol 1997；75(1-2)：41 2；W.Cendrowski，Boll Ist SieroterMilan 1997；58(4)：339-343；L.K.Kastrukoff，等人Can J Neurol Sci1978；5(2)：175178；J.E.Walker等人J Neurol Sci 1976；29(2-4)：303309)。
在抗体生产技术中的最近的进展提供了产生人抗体试剂同时避免与人血清疗法有关的毒性的方法。基于抗体的疗法的优点包括多方适应性、低毒性、病原体特异性、免疫功能的增强和有利的药物代谢动力学。
最近才出现了单克隆抗体治疗剂的临床应用。现在单克隆抗体已被批准作为移植、癌症、传染病、心血管疾病和炎症的治疗。更多单克隆抗体处于治疗多种疾病适应症的最后阶段的临床试验中。结果，单克隆抗体代表当前开发的最大类别的药物之一。
尽管当前流行使用单克隆抗体作为治疗剂，但是它们的使用存在一些障碍。例如，单克隆抗体的许多治疗应用需要重复施用，特别对于慢性疾病如自身免疫或癌症。因为小鼠方便用于免疫并且识别大多数人抗原作为外来的，所以针对人靶的具有治疗潜力的单克隆抗体通常是鼠来源的。然而，鼠单克隆抗体作为人治疗剂具有内在的缺点。例如，它们需要更频繁的给药以维持单克隆抗体的治疗水平，因为它们在人中比人抗体具有更短的循环半衰期。更关键的是，反复施用鼠免疫球蛋白产生了人免疫系统将识别鼠蛋白质为外来的，从而产生人抗小鼠抗体应答的可能性，其可以导致严重的变态反应。这种减小的功效和安全性的可能性导致开发许多技术用于减小鼠单克隆抗体的免疫原性。
多克隆抗体对多种抗原性靶非常有效。它们具有靶定并杀死与复杂疾病关联的多种“进化中的靶(evolving target)”的独特能力。同样，在所有药物类别中，多克隆抗体对于在抗原突变事件中保持活性的可能性最高。此外，尽管单克隆抗体对传染物具有有限的治疗活性，但是多克隆抗体可以中和毒素和引导免疫应答以消除病原体，以及生物战争试剂。
开发多克隆和单克隆抗体生产平台以满足将来对生产能力的需求代表了有希望的领域，其是当前多数研究的主题。一个特别有希望的策略是向小鼠或者大的家畜中引入人免疫球蛋白基因。该技术的延伸将包括灭活它们的内源免疫球蛋白基因。大型动物，如羊、猪和牛当前都用于生产血清来源的产品，如超免疫血清和凝血因子用于人用途。这将支持因安全性和伦理学而使用来自此类物种的人多克隆抗体。这些物种的每一种在血清和乳中都天然产生相当大量的抗体。
编码免疫球蛋白的基因的排列
抗体分子从可变基因元件的组合装配而来，且组合种系中许多可变基因元件引起的可能性使得宿主能够合成针对巨大数目抗原的抗体。每个抗体分子由两类多肽链组成：轻(L)链(可以是κL-链或者λL-链)和重(H)链。重链和轻链结合在一起以限定表位的结合区。单个抗体分子具有L链的两个相同拷贝和两个H链。每条链都包含可变区(V)和恒定区(C)。可变区构成分子的抗原结合部位。为了实现多样的抗原识别，编码可变区的DNA经历基因重排。恒定区氨基酸序列对于抗体的特定同种型以及对于产生抗体的宿主是特异的，并且从而不经历重排。
DNA重排机制对于重链和轻链基因座的可变区是相似的，尽管仅仅需要一个结合事件来产生轻链基因，而需要两个结合事件来产生完整重链基因。最常见的重排模式涉及两个基因区段之间DNA的环出和缺失。这在两个基因区段的编码序列在DNA中处于相同方向时发生。在具有相反的转录方向的两个基因区段之间可以发生第二种重组模式。该重组模式较不常见，尽管这种重排可以占据高达所有Vκ与Jκ连接的半数；半数人Vκ基因区段的转录方向与Jκ基因区段的转录方向相反。
通过分离的基因区段的体细胞重组产生编码完整V区的DNA序列。免疫球蛋白重链或者轻链的V区或者V结构域由超过一个基因区段编码。对于轻链，V结构域由两个单独的DNA区段编码。第一个区段编码轻链的前95-101个氨基酸并且称作V基因区段，因为它编码V结构域的大部分。第二个区段编码V结构域的剩余部分(最多达13个氨基酸)并且称作连接或者J基因区段。V和J基因区段的连接产生了编码整个轻链V区的连续外显子。为了产生完整的免疫球蛋白轻链信使RNA，V区外显子在转录后通过RNA剪接连接到C区序列。
重链V区在三个基因区段中编码。除了V和J基因区段(称作VH和JH以将它们与轻链VL和JL区别开来)，还存在第三个基因区段，称作多样性或者DH基因区段，其位于VH和JH基因区段之间。产生完整重链V区的重组过程在两个单独的阶段发生。在第一个阶段，DH基因区段连接到JH基因区段；然后VH基因区段重排到DJH以产生完整的VH-区外显子。如对于轻链基因那样，RNA剪接将装配的V区序列连接到邻近的C区基因。
抗体谱的多样化在两个阶段发生：主要通过存在于骨髓中的前体B细胞中的Ig V、D和J基因区段的重排(“V(D)J重组”)，然后通过体细胞突变和这些重排的Ig基因的类别转换重组，此时成熟的B细胞被激活。免疫球蛋白体细胞突变和类别转换对于免疫应答的成熟和产生“记忆”应答是重要的。
抗体的基因组基因座非常大并且它们位于不同的染色体上。免疫球蛋白基因区段组织成三簇或者遗传基因座：κ、λ和重链基因座。每个组织稍有不同。例如，在人中，免疫球蛋白基因如下组织。λ轻链基因座位于22号染色体上并且一簇Vλ基因区段之后是四组Jλ基因区段，其每个都连接到单个Cλ基因。κ轻链基因座在2号染色体上并且Vκ基因区段簇之后是一簇Jκ基因区段，然后是单个Cκ基因。14号染色体上重链基因座的组织与κ基因座的相似，具有单独簇的VH、DH和JH基因区段和单独簇的CH基因。重链基因座在一个重要的方面不同：它不是含有单个C区，而是含有轮流排列的一系列C区，每个C区对应于一个不同的同种型。有5种免疫球蛋白重链同种型：IgM、IgG、IgA、IgE和IgD。通常，细胞一次仅表达一种同种型，以IgM开始。其他同种型如IgG的表达可以通过同种型转换发生。
各种V、D和J基因的连接是完全随机的事件，其对于VDJ(H)产生约50,000个不同的可能的组合，对于VJ(L)产生约1,000个组合。H和L链的随后的随机配对使抗体特异性总数达到约107种可能性。通过不同遗传区段的不精确连接进一步增加了多样性。重排在两个DNA链上发生，但是仅一条链被转录(由于等位基因排斥)。由于DNA中的不可逆缺失，在B细胞的生命中仅发生一次重排。因此，每个成熟B细胞维持一种免疫特异性并且在后代或者克隆中维持。这组成了克隆选择的分子基础；即每个抗原决定簇触发带有特异性受体分子的B淋巴细胞的原始克隆的应答。V(D)J重组确立的初级B细胞谱主要受到两个紧密连锁的基因：重组激活基因(RAG)-1和RAG-2的控制。
在过去10年里，已经揭示了脊椎动物在Ig基因多样性和抗体谱发育中的相当大的多样性。啮齿类动物和人具有5个重链类别：IgM、IgD、IgG、IgE和IgA，且每种具有IgG的四个亚类和IgA的一个或两个亚类，而兔具有一个IgG重链基因但是对于不同的IgA亚类有13种基因(Burnett，R.C等人EMBO J 8：4047；Honjo，In Honjo，T，Alt.F.W.T.H.eds，Immunoglobulin Genes p.123 Academic Press，New York)。猪具有至少6个IgG亚类(Kacskovics，I等人1994 JImmunol 153：3565)，但是没有IgD(Butler等人1996 Inter.Immunol8：1897-1904)。编码IgD的基因仅已在啮齿类动物和灵长类动物中描述。通过将啮齿类和灵长类动物中看到的模式与对鸡、兔、猪和驯养的牛科(Bovidae)报导的模式比较例证了谱发育机理中的多样性。虽然前面的组具有属于7到10个家族的大量的VH基因(Rathbun，G.InHongo，T.Alt.F.W.和Rabbitts，T.H.，eds，Immunoglobulin Genes，p.63，Academic press New York)，但后面组的每个成员的VH基因属于单个VH基因家族(Sun，J.等人1994 J.Immunol 1553：56118；Dufour，V等人1996，J Immunol.156：2163)。除了兔之外，该家族由小于25种基因组成。虽然啮齿类和灵长类动物可以利用4到6种JH区段，但鸡中仅一种JH可以用于谱发育(Reynaud等人1989 Adv.Immunol.57：353)。类似地，Butler等人(1996 Inter.Immunol 8：1897-1904)假定猪可能像鸡一样具有仅一个JH基因。这些物种通常具有较少的V、D和J基因；在猪和奶牛中，存在单个VH基因家族，其由小于20种基因区段组成(Butler等人，Advances in Swine in BiomedicalResearch，编著：Tumbleson和Schook，1996；Sinclair等人，J.Immunol.159：3883，1997)。与J和D基因区段的较低数目一起，这导致通过基因重排产生明显较低的多样性。然而，在这些物种中似乎有更大数目的轻链基因。类似于人和小鼠，这些物种表达单个κ轻链但是多个λ轻链基因。然而，这些似乎不影响通过重排实现的有限的多样性。
因为超过100种VH、20-30种DH和4到6种JH基因区段的组合连接是人中产生抗体谱的主要机制，所以具有较少的VH、DH或者JH区段的物种必须产生较小的谱或者使用谱发育的备选机制。反刍动物、猪、兔和鸡利用几种机制来产生抗体多样性。在这些物种中，似乎存在一个重要的次级谱发育，其在高度特化的淋巴组织如回肠的淋巴集结中发生(Binns和Licence，Adv.Exp.Med.Biol.186：661，1985)。次级谱发育在这些物种中通过体细胞突变过程发生，该过程是随机的并且是没有完全了解的过程。该谱多样化的机制似乎是模板化突变，或者基因转变(Sun等人，J.Immunol.153：5618，1994)或者体细胞高变。
基因转变对于一些高等脊椎动物如鸡、兔和奶牛中的抗体多样化是重要的。然而，在小鼠中，转变事件在内源抗体基因中似乎不频繁。基因转变是一种不同的多样化机制，其特征是来自供体抗体V基因区段的同源序列转移到受体V基因区段。如果供体和受体区段具有许多序列差别，那么基因转变可以通过单个事件将一组序列改变导入V区中。取决于物种，基因转变事件可以在B细胞分化期间抗原暴露之前和/或之后发生(Tsai等人International Immunology，Vol.14，No.1，55-64，2002年1月)。
体细胞高变实现所有高等脊椎动物物种中的抗体基因多样化。它的特征是向抗体V(D)J区段中导入单个点突变。通常，高变似乎通过抗原刺激在B细胞中激活。
产生具有人源化免疫系统的动物
为了减小在小鼠中产生的用于人治疗的抗体的免疫原性，已经做了各种努力来在现在称作人源化的方法中用人蛋白质序列替换鼠蛋白质序列。已经构建了转基因小鼠，其自身的免疫球蛋白基因已经被人免疫球蛋白基因功能地替换，从而它们在免疫后产生人抗体。通过使用基因寻靶技术缺失参与小鼠Ig基因重排和表达的过程中的关键的顺式作用序列，灭活胚胎干(ES)细胞中的小鼠Ig基因，消除了小鼠抗体的产生。通过引入含有人种系构型H链和κL链小基因座(minilocus)转基因的兆碱基大小的YAC，可以恢复这些突变小鼠中的B细胞发育。这些转基因小鼠中完全人抗体的表达是占优势的，处于几百μg/l血液的水平上。该水平的表达为在表达人Ig基因的野生型小鼠中检测到的水平的几百倍，从而表明灭活内源小鼠Ig基因以增强小鼠的人抗体产生的重要性。
首次人源化尝试利用分子生物学技术来构建重组抗体。例如，将来自对半抗原特异的小鼠抗体的互补性决定区(CDR)嫁接到人抗体构架上，从而实现CDR置换。该新抗体保留CDR序列赋予的结合特异性(P.T.Jones等人Nature 321：522-525(1986))。人源化的下一个水平涉及组合完整小鼠VH区与人恒定区如γ1(S.L.Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，81，pp.6851-6855(1984))。然而，这些嵌合抗体仍然含有大于30％的异种序列，有时相对于完全异种抗体的免疫原性的降低仅仅是微小的(M.Bruggemann等人，J.Exp.Med.，170，pp.2153-2157(1989))。
随后，试图向小鼠中引入人免疫球蛋白基因，从而产生能够用具有人序列的抗体应答抗原的转基因小鼠(Bruggemann等人Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 86：6709-6713(1989))。由于人免疫球蛋白基因组基因座的大尺寸，认为这些尝试受到DNA的量的限制，所述DNA可以通过可利用的克隆载体稳定维持。结果，许多研究人员将注意力集中在产生小基因座上，该小基因座含有有限数目的V区基因并且与天然或者种系构型相比在基因之间具有改变的空间距离(见，例如，美国专利号5,569,825)。这些研究表明在小鼠中产生人序列抗体是可能的，但是在从这些转基因动物得到结合特异性和效应子功能(同种型)的足够多样性以满足对抗体治疗剂的不断增长的需求方面仍然存在巨大障碍。
为了提供额外的多样性，已经开展了将人Ig基因座的大种系片段加入转基因哺乳动物中的工作。例如，使用酵母人工染色体(YAC)克隆载体向小鼠中导入在人基因组的未重排种系中发现的以相同间隔排列的多数人V、D和J区基因和人Cμ和Cδ恒定区(见例如，WO 94/02602)。将包含编码人γ-2恒定区的序列和类别转换重组所需的上游序列的22kb DNA片段后来附加到前面的转基因中。此外，使用YAC向小鼠中导入包含Vκ、Jκ和Cκ区基因的人κ基因座的部分，所述Vκ、Jκ和Cκ区基因也在人基因组的未重排的种系中被发现以基本上相同的间隔排列。用基因寻靶灭活鼠IgH和κ轻链免疫球蛋白基因座并且将这种敲除品种与上面的转基因品种育种以产生小鼠品系，其具有人V、D、J、Cμ、Cδ和Cγ2恒定区以及人Vκ、Jκ和Cκ区基因，它们都处于灭活的鼠免疫球蛋白背景下(见，例如，Kucherlapati等人的PCT专利申请WO94/02602；也见Mendez等人，Nature Genetics15：146-156(1997))。
酵母人工染色体作为克隆载体与内源基因座的基因寻靶和转基因小鼠品种的育种组合提供了抗体多样性问题的一个解决方案。通过该方法得到了几个优点。一个优点是YAC可以用于向宿主细胞转移数百kb DNA。因此，使用YAC克隆载体允许向转基因小鼠中包含相当大部分的完整人Ig重链和轻链区，从而接近在人中可得到的潜在多样性水平。该方法的另一优点是已经表明许多V基因在鼠免疫球蛋白生产缺陷的小鼠中恢复完全的B细胞发育。这确保为这些重构的小鼠提供必要的细胞以对任何给定免疫原产生强烈的人抗体应答(见例如，WO 94/02602.；L.Green和A.Jakobovits，J.Exp.Med.188：483-495(1998))。另一优点是通过利用酵母中的高频率同源重组在YAC中缺失或插入序列。这提供了YAC转基因的容易的工程改造。
此外，Green等人Nature Genetics 7：13-21(1994)描述了产生分别含有人重链基因座和κ轻链基因座的245kb和190kb大小的种系构型片段的YAC，其含有核心可变和恒定区序列。Green等人的工作最近延伸到导入大于约80％的人抗体谱来产生XenoMouseTM小鼠，所述导入通过引入分别为人重链基因座和κ轻链基因座的兆碱基大小的种系构型YAC片段来实现。见例如，Mendez等人NatureGenetics 15：146-156(1997)，Green和Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)，欧洲专利号EP 0 463 151 B1，PCT公开号WO94/02602，WO 96/34096和WO 98/24893。
存在几种策略用于产生生产人抗体的哺乳动物。具体地，有“小基因座”方法，其以GenPharm International，Inc.和MedicalResearch Council的工作为代表；YAC导入Ig基因座的大的和相当大的种系片段，其以Abgenix，Inc(以前Cell Genesys)的工作为代表。通过使用微细胞融合导入整个或者基本上整个基因座，以Kirin BeerKabushiki Kaisha的工作为代表。
在小基因座方法中，通过包括Ig基因座的片段(个体基因)模拟外源Ig基因座。从而，一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、μ恒定区和第二个恒定区(如γ恒定区)形成用于插入动物中的构建体。见例如，美国专利号5,545,807，5,545,806,5,625,825，5,625,126，5,633,425，5,661,016，5,770,429，5,789,650,5,814,318，5,591,669，5,612,205，5,721,367，5,789,215，5,643,763；欧洲专利号0 546 073；PCT公开号WO 92/03918，WO 92/22645，WO92/22647，WO 92/22670，WO 93/12227，WO 94/00569，WO 94/25585,WO 96/14436，WO 97/13852和WO 98/24884；Taylor等人NucleicAcids Research 20：6287-6295(1992)，Chen等人InternationalImmunology 5：647-656(1993)，Tuaillon等人J.Immunol.154：6453-6465(1995)，Choi等人Nature Genetics 4：117-123(1993)，Lonberg等人Nature 368：856-859(1994)，Taylor等人InternationalImmunology 6：579-591(1994)，Tuaillon等人J.Immunol.154：6453-6465(1995)，和Fishwild等人Nature Biotech.14：845-851(1996)。
在微细胞融合方法中，可以向小鼠中导入部分或者完整人染色体(见，例如，欧洲专利申请号EP 0 843 961 A1)。使用该方法产生并且含有人Ig重链基因座的小鼠将通常具有超过一个，并且可能所有的人恒定区基因。因此，此类小鼠将产生结合特定抗原的具有许多不同恒定区的抗体。
尽管小鼠仍然是关于在人中表达人免疫球蛋白研究最深入的动物，但是最近的技术发展已经允许开始在其他动物如奶牛中应用这些技术。小鼠中的一般方法是基因修饰小鼠的胚胎干细胞以敲除鼠免疫球蛋白，然后向ES细胞中插入含有人免疫球蛋白的YAC。然而，不能从奶牛和其他大的动物如羊和猪中得到ES细胞。从而，在甚至可能产生具有免疫球蛋白基因被敲除并且表达人抗体的大型动物之前，必须发生几个根本的发展。用ES细胞操作来产生基因修饰动物的备选方案是使用已经基因修饰的体细胞进行克隆。使用用于核转移的基因修饰体细胞进行克隆仅仅在最近才实现。
自从1997年宣布多莉(Dolly)(克隆的羊)从成年体细胞出生(Wilmut，L，等人(1997)Nature 385：810-813)以来，已经克隆了有蹄类动物，包括牛(Cibelli，J等人，1998 Science 280：1266-1258；Kubota，C.等人2000 Proc.Nat’l.Acad.Sci 97：990-995)、山羊(Baguisi，A.等人，(1999)Nat.Biotechnology 17：456-461)和猪(Polejaeva，I.A.，等人2000 Nature 407：86-90；Betthauser，J.等人2000 Nat.Biotechnology18：1055-1059)。
下一个技术进展是技术发展到在核转移前基因修饰细胞以产生基因修饰动物。关于PPL治疗的PCT公开号WO 00/51424描述了用于核转移的体细胞的定向基因修饰。
这些基础发展之后，已经报导了基因的单个和双等位基因敲除和具有这些修饰的活动物的出生。在2002到2004年之间，三个独立的小组：Immerge Biotherapeutics，Inc.与University of Missouri合作(Lai等人(Science(2002)295：1089-1092)& Kolber-Simonds等人(PNAS.(2004)101(19)：7335-40))，Alexion Pharmaceuticals(Ramsoondar等人(Biol Reprod(2003)69：437-445)和Revivicor，Inc.(Dai等人(Nature Biotechnology(2002)20：251-255)和Phelps等人(Science(2003)Jan 17；299(5605)：411-4))通过用定向遗传缺失从体细胞进行核转移，产生了缺少α-1，3-GT基因的一个等位基因或者两个等位基因的猪。在2003年，Sedai等人(Transplantation(2003)76：900-902)报导牛中α-1，3-GT基因的一个等位基因的定向破坏，接着成功地核转移基因修饰细胞的核并产生转基因胎儿。
从而，现在正刚开始研究在大型动物中敲除免疫球蛋白基因并向它们的细胞中插入人免疫球蛋白基因座的可行性。然而，由于免疫球蛋白基因的复杂性和物种差异，Igκ、λ和重链的基因组序列和重排在大多数物种中仍然知之甚少。例如，在猪中，仅仅对重链恒定α、重链恒定μ和重链恒定δ描述了部分基因组序列和组织(Brown和Butler Mol Immunol.1994 Jun；31(8)：633-42，Butler等人VetImmunol Immunopathol.1994 Oct；43(l-3)：5-12，和Zhao等人JImmunol.2003 Aug 1；171(3)：1312-8)。
在奶牛中，已经对免疫球蛋白重链基因座作图(Zhao等人2003 J.Biol.Chem.278：35024-32)并且牛κ基因的cDNA序列是已知的(见，例如，美国专利公开号2003/0037347)。此外，已经对约4.6kb的牛μ重链基因座测序并且通过破坏牛μ重链的一个或两个等位基因，已经产生了重链免疫球蛋白表达降低的转基因小牛。此外，用牛胎儿成纤维细胞的微细胞介导的染色体转移和核转移技术，已经向奶牛(TC奶牛)中导入了含有人Ig H链和κL链的完全未排列的序列的哺乳动物人工染色体(MAC)载体(见例如，Kuroiwa等人2002 NatureBiotechnology 20：889，Kuroiwa等人2004 Nat Genet.Jun 6 Epub，美国专利公开号2003/0037347、2003/0056237、2004/0068760和PCT公开号WO 02/07648)。
尽管在产生表达人免疫球蛋白的牛的方面已经取得了重大进步，但是在其他大型动物，如羊、山羊和猪中收效甚微。尽管可以容易地从Genbank获得羊、山羊和猪的免疫球蛋白基因的cDNA序列信息，但是免疫球蛋白基因座(其经历大量重排)的独特性质使得需要表征已知的存在于mRNA(或者cDNA)的序列之外的序列。因为免疫球蛋白基因座是模块式的并且编码区域是冗余的，所以缺失已知的编码区不能确保改变基因座的功能。例如，如果人们缺失重链可变区的编码区，那么基因座的功能将不被显著改变，因为在该基因座中仍有数百其他功能可变基因。因此，人们必须首先表征基因座以鉴定潜在的“唯一弱点”。
尽管在牛中表达人抗体取得了一定进展，但是对于灭活内源牛Ig基因、增加人抗体的表达水平和在其他大型动物，如猪中产生人抗体表达方面仍然存在更大的挑战，所述其他大型动物的免疫球蛋白基因的序列和排列在很大程度上还未知。
因此，本发明的一个目的是提供有蹄类动物免疫球蛋白种系基因序列的排列。
本发明的另一个目的是提供新颖的有蹄类动物免疫球蛋白基因组序列。
本发明的另一个目的是提供缺少重链和/或轻链免疫球蛋白基因的至少一个等位基因的细胞、组织和动物。
本发明的另一个目的是提供表达人免疫球蛋白的有蹄类动物。
本发明的另一个目的是提供产生缺少新的有蹄类动物免疫球蛋白基因序列的至少一个等位基因的细胞、组织和动物和/或表达人免疫球蛋白的方法。
发明概述
本发明首次提供了有蹄类动物免疫球蛋白种系基因序列排列以及其新的基因组序列。此外，提供了缺少重链或轻链免疫球蛋白基因的至少一个等位基因的新的有蹄类动物细胞、组织和动物。基于该发现，可以产生完全缺少重链和/或轻链免疫球蛋白基因的至少一个等位基因的有蹄类动物。此外，可以进一步修饰这些有蹄类动物以表达异种的(例如人)免疫球蛋白基因座或者其片段。
在本发明的一方面，提供了缺少功能性内源免疫球蛋白的任何表达的转基因有蹄类动物。在一个实施方案中，该有蹄类动物可以缺少内源重链和/或轻链免疫球蛋白的任何表达。轻链免疫球蛋白可以是κ和/或λ免疫球蛋白。在额外实施方案中，提供了缺少内源免疫球蛋白的至少一个等位基因的表达的转基因有蹄类动物，其中该免疫球蛋白选自重链、κ轻链和λ轻链或者其任意组合。在一个实施方案中，通过内源免疫球蛋白基因座的遗传寻靶以防止内源免疫球蛋白的表达，可以实现功能性内源免疫球蛋白的表达。在一个实施方案中，通过同源重组可以完成遗传寻靶。在另一实施方案中，通过核转移可以产生转基因有蹄类动物。
在其他实施方案中，缺少功能性内源免疫球蛋白的任何表达的转基因有蹄类动物可以进一步基因修饰以表达异种免疫球蛋白基因座。在备选实施方案中，提供了含有异种免疫球蛋白基因座的猪动物。在一个实施方案中，异种免疫球蛋白基因座可以是重链和/或轻链免疫球蛋白或其片段。在另一实施方案中，异种免疫球蛋白基因座可以是κ链基因座或者其片段和/或λ链基因座或者其片段。在其他实施方案中，人工染色体(AC)可以含有异种免疫球蛋白。在一个实施方案中，AC可以是酵母AC或者哺乳动物AC。在另一实施方案中，异种基因座可以是人免疫球蛋白基因座或者其片段。在一个实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以是人14号染色体、人2号染色体和人22号染色体或者其片段。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括人免疫球蛋白的任意片段，该片段可以经历重排。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括人免疫球蛋白重链和人免疫球蛋白轻链的任意片段，其可以经历重排。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括任意人免疫球蛋白基因座或者其片段，其在暴露于抗原后可以产生抗体。在具体实施方案中，应答对一种或多种抗原的暴露，所述外源人免疫球蛋白可以在B细胞中表达以产生异种免疫球蛋白。
在本发明的另一方面，提供了表达异种免疫球蛋白基因座或者其片段的转基因有蹄类动物，其中该免疫球蛋白可以从整合在内源有蹄类动物染色体内的免疫球蛋白基因座表达。在一个实施方案中，提供了来自转基因动物的有蹄类动物细胞。在一个实施方案中，异种免疫球蛋白基因座可以被后代遗传。在另一实施方案中，异种免疫球蛋白基因座可以通过雄性种系由后代遗传。在其他实施方案中，人工染色体(AC)可以含有异种免疫球蛋白。在一个实施方案中，AC可以是酵母AC或者哺乳动物AC。在另一实施方案中，异种基因座可以是人免疫球蛋白基因座或者其片段。在一个实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以是人14号染色体、人2号染色体和人22号染色体或者其片段。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括人免疫球蛋白的任意片段，该片段可以经历重排。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括人免疫球蛋白重链和人免疫球蛋白轻链的任意片段，其可以经历重排。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括任意人免疫球蛋白基因座或者其片段，其在暴露于抗原后可以产生抗体。在具体实施方案中，应答对一种或多种抗原的暴露，所述外源人免疫球蛋白可以在B细胞中表达以产生异种免疫球蛋白。
在本发明的另一方面，提供了编码有蹄类动物免疫球蛋白的重链基因座的新的基因组序列。在一个实施方案中，提供了编码猪重链的分离的核苷酸序列，其包括至少一个可变区、两个多样性区、至少四个连接区和至少一个恒定区，如μ恒定区，例如，如Seq ID No.29中表示。在另一实施方案中，提供了分离的核苷酸序列，其包括猪重链基因组序列的至少四个连接区和至少一个恒定区，如μ恒定区，如Seq ID No.4中表示。在另一实施方案中，提供了核苷酸序列，其包括猪重链基因组序列的第一个连接区的5’侧翼序列，如Seq ID No.1中表示。此外，提供了核苷酸序列，其包括猪重链基因组序列的第一个连接区的3’侧翼序列，如Seq ID No.4的3’区中表示。在进一步实施方案中，提供了如Seq ID No.1、4或29所述的分离的核苷酸序列。还提供了与Seq ID No.1、4或29至少80、85、90、95、98或99％同源的核酸序列。此外，提供了含有Seq ID No.1、4或29的至少10、15、17、20、25或30个连续核苷酸的核苷酸序列。在一个实施方案中，该核苷酸序列含有Seq ID No 4的至少17、20、25或30个连续核苷酸或者Seq ID No.29的残基1-9,070。在另一实施方案中，该核苷酸序列含有Seq ID No.29的残基9,070-11039。还提供了任选在严格条件下与Seq ID No.1、4或29杂交的核苷酸序列以及其同源核苷酸。
在另一实施方案中，提供了编码有蹄类动物免疫球蛋白的κ轻链基因座的新的基因组序列。本发明提供了有蹄类动物κ轻链区的首次报导的基因组序列。在一个实施方案中，提供了编码猪κ轻链基因座的核酸序列。在另一实施方案中，该核酸序列可以含有κ轻链的至少一个连接区、一个恒定区和/或一个增强子区。在另一实施方案中，该核苷酸序列可以包括至少五个连接区、一个恒定区和一个增强子区，例如，如Seq ID No.30中表示。在另一实施方案中，提供了分离的核苷酸序列，其含有猪基因组κ轻链的至少一个、至少两个、至少三个、至少四或者五个连接区和连接区的3’侧翼序列，例如，如Seq ID No 12中表示。在另一实施方案中，提供了猪基因组κ轻链的分离的核苷酸序列，其含有第一个连接区的5’侧翼序列，如Seq ID No25中表示。在另一实施方案中，提供了分离的核苷酸序列，其含有猪基因组κ轻链的恒定区的3’侧翼序列和任选地，增强子区的5’部分，如Seq ID Nos.15、16和/或19中表示。
在另一实施方案中，提供了如Seq ID Nos 30、12、25、15、16或19中所述的分离的核苷酸序列。还提供了与Seq ID Nos 30、12、25、15、16或19至少80、85、90、95、98或99％同源的核酸序列。此外，提供了含有Seq ID Nos 30、12、25、15、16或19的至少10、15、17、20、25或30个连续核苷酸的核苷酸序列。还提供了任选在严格条件下与Seq ID Nos 30、12、25、15、16或19杂交的核苷酸序列，以及其同源核苷酸。
在另一实施方案中，提供了编码有蹄类动物免疫球蛋白的λ轻链基因座的新的基因组序列。本发明提供了有蹄类动物λ轻链区的首次报导的基因组序列。在一个实施方案中，猪λ轻链核苷酸包括J到C单位的多联体。在具体实施方案中，提供了如Seq ID No.28中描绘的分离的猪λ核苷酸序列。在一个实施方案中，提供了包括猪λ轻链基因组序列的第一个λJ/C区的5’侧翼序列的核苷酸序列，如Seq IDNo 32表示。此外，提供了包括猪λ轻链基因组序列的J/C簇区的3’侧翼序列，如λJ/C下游约200个碱基对的核苷酸序列，如Seq ID No33表示。备选地，提供了包括猪λ轻链基因组序列的J/C簇区的3’侧翼序列的核苷酸序列，如Seq ID No 34、35、36、37、38和/或39表示。在另一实施方案中，提供了编码牛λ轻链基因座的核酸序列，其可以包括至少一个连接区-恒定区对和/或至少一个可变区，如SeqID No.31表示。在进一步的实施方案中，提供了如Seq ID Nos 28、31、32、33、34、35、36、37、38或39中所述的分离的核苷酸序列。还提供了与Seq ID Nos 28、31、32、33、34、35、36、37、38或39至少80、85、90、95、98或99％同源的核酸序列。此外，提供了含有Seq ID Nos 28、31、32、33、34、35、36、37、38或39的至少10、15、17、20、25或30个连续核苷酸的核苷酸序列。还提供了任选在严格条件下与Seq ID Nos 28、31、32、33、34、35、36、37、38或39杂交的核苷酸序列，以及其同源核苷酸。
在另一实施方案中，还提供了核酸寻靶载体构建体。该寻靶载体可以设计成在细胞中完成同源重组。可以将这些寻靶载体转化到哺乳动物细胞中以通过同源重组靶定有蹄类动物重链、κ轻链或者λ轻链基因。在一个实施方案中，寻靶载体可以含有3’重组臂和5’重组臂(即侧翼序列)，其与有蹄类动物重链、κ轻链或者λ轻链基因组序列，例如，如上述的Seq ID Nos.1、4、29、30、12、25、15、16、19、28或31表示的序列同源。同源DNA序列可以包括与基因组序列同源的序列的至少15bp、20bp、25bp、50bp、100bp、500bp、1kbp、2kbp、4kbp、5kbp、10kbp、15kbp、20kbp或50kbp。可以设计3’和5’重组臂，从而使得它们在基因组序列的至少一个功能可变区、连接区、多样性区和/或恒定区的3’和5’末端的侧翼。功能性区域的寻靶使得它失活，其导致细胞不能产生功能性免疫球蛋白分子。在另一实施方案中，同源DNA序列可以包括一个或多个内含子和/或外显子序列。除了核酸序列外，表达载体可以含有选择标记序列，如增强的绿色荧光蛋白(eGFP)基因序列、起始和/或增强子序列、聚腺苷酸化尾序列，和/或提供构建体在原核和/或真核宿主细胞中表达的核酸序列。选择标记可以位于5’和3’重组臂序列之间。
在一个具体实施方案中，寻靶载体可以含有5’和3’重组臂，该重组臂含有与猪免疫球蛋白重链基因座的J6区的3’和5’侧翼序列同源的序列。因为J6区是猪免疫球蛋白重链基因座的唯一的功能连接区，所以这将阻止功能性猪重链免疫球蛋白的表达。在特定实施方案中，寻靶载体可以含有5’重组臂和3’重组臂，所述5’重组臂含有与J6区5’的基因组序列，包括J1-4同源的序列，所述3’重组臂含有与J6区3’的基因组序列，包括μ恒定区同源的序列(“J6寻靶构建体”)，见例如图1。此外，该J6寻靶构建体还可以含有位于5’和3’重组臂之间的选择标记基因，见例如，Seq ID No 5和图1。在其他实施方案中，寻靶载体可以含有5’重组臂和3’重组臂，所述5’重组臂含有与猪重链基因座的多样性区5’的基因组序列同源的序列，所述3’重组臂含有与猪重链基因座的多样性区3’的基因组序列同源的序列。在另一实施方案中，寻靶载体可以含有5’重组臂和3’重组臂，所述5’重组臂含有与猪重链基因座的μ恒定区5’的基因组序列同源的序列，所述3’重组臂含有与猪重链基因座的μ恒定区3’的基因组序列同源的序列。
在另一具体实施方案中，寻靶载体可以含有5’重组臂和3’重组臂，它们含有猪免疫球蛋白重链基因座的恒定区的3’和5’侧翼序列同源的序列。因为本发明发现了猪免疫球蛋白κ轻链基因座仅有一个恒定区，这将阻止功能性猪κ轻链免疫球蛋白的表达。在具体实施方案中，寻靶载体可以含有5’重组臂和3’重组臂，所述5’重组臂含有与恒定区5’的基因组序列(任选包括连接区)同源的序列，所述3’重组臂含有与恒定区3’的基因组序列(任选包括增强子区的至少部分)同源的序列(“κ恒定寻靶构建体”)，见例如图2。此外，该κ恒定寻靶构建体还可以含有位于5’和3’重组臂之间的选择标记基因，见例如Seq ID No 20和图2。在其他实施方案中，寻靶载体可以含有5’重组臂和3’重组臂，所述5’重组臂含有与猪κ轻链基因座的连接区5’的基因组序列同源的序列，所述3’重组臂含有与猪κ轻链基因座的连接区3’的基因组序列同源的序列。
在另一实施方案中，提供了用于产生寻靶载体的3’和5’序列的引物。寡核苷酸引物能够与猪免疫球蛋白基因组序列，如上述Seq IDNos.1、4、29、30、12、25、15、16、19、28或31杂交。在具体实施方案中，引物在严格条件下与如上述的Seq ID Nos.1、4、29、30、12、25、15、16、19、28或31杂交。另一实施方案提供了能够与猪重链、κ轻链或λ轻链核酸序列，如上述Seq ID Nos.1、4、29、30、12、25、15、16、19、28或31杂交的寡核苷酸探针。多核苷酸引物或者探针可以具有与本发明的多核苷酸杂交的至少14个碱基、20个碱基、30个碱基或者50个碱基。探针或引物可以长为至少14个核苷酸，且在具体实施方案中，长为至少15、20、25、28或30个核苷酸。
在一个实施方案中，提供了扩增猪Ig重链的包括功能连接区(J6区)的片段的引物。在一个非限制性实施方案中，所扩增的重链片段由Seq ID No 4表示并且用于扩增该片段的引物可以与J区的部分，如但不限于Seq ID No 2互补，以产生5’重组臂，并且与Ig重链μ恒定区的部分，如但不限于Seq ID No 3互补，以产生3’重组臂。在另一实施方案中，可以将猪Ig重链的区域(如但不限于Seq ID No 4)亚克隆并装配到寻靶载体中。
在其他实施方案中，提供了扩增猪Igκ轻链的包括恒定区的片段的引物。在另一实施方案中，提供了扩增猪Igκ轻链的包括J区的片段的引物。在一个非限制性实施方案中，用于扩增该片段的引物可以与J区的部分，如但不限于Seq ID No 21或10互补，以产生5’重组臂，并且与恒定区3’的基因组序列，如但不限于Seq ID No 14、24或18互补，以产生3’重组臂。在另一实施方案中，可以将猪Ig重链的区域(如但不限于Seq ID No 20)亚克隆并装配到寻靶载体中。
在本发明的另一方面，提供了根据本文描述的方法、序列和/或构建体产生的有蹄类动物细胞，其缺少有蹄类动物重链、κ轻链和/或λ轻链基因座的功能区的至少一个等位基因。这些细胞可以由于同源重组得到。具体地，通过灭活有蹄类动物重链、κ轻链或λ轻链基因的至少一个等位基因，可以产生表达有蹄类动物抗体的能力降低的细胞。在其他实施方案中，可以根据本文描述的方法、序列和/或构建体产生缺少有蹄类动物重链、κ轻链和/或λ轻链基因的两个等位基因的哺乳动物细胞。在进一步的实施方案中，提供了猪动物，其中通过根据本文描述的方法、序列和/或构建体产生的遗传寻靶事件灭活了有蹄类动物重链、κ轻链和/或λ轻链基因的至少一个等位基因。在本发明的另一方面，提供了猪动物，其中通过遗传寻靶事件灭活了有蹄类动物重链、κ轻链和/或λ轻链基因的两个等位基因。基因可以通过同源重组被靶定。
在其他实施方案中，可以破坏基因，即，可以改变遗传密码的部分，从而影响基因的该区段的转录和/或翻译。例如，可以通过替代、缺失(“敲除”)或者插入(“敲入”(knock-in))技术发生基因的破坏。可以插入所需蛋白质的额外基因或者调节现有序列转录的调节序列。为了实现有蹄类动物免疫球蛋白基因的多个基因修饰，在一个实施方案中，可以顺序修饰细胞以含有多个基因修饰。在其他实施方案中，可以将动物一起育种以产生含有免疫球蛋白基因的多个基因修饰的动物。作为阐明性实例，缺少表达有蹄类动物重链基因的至少一个等位基因的动物可以进一步基因修饰或者与缺少κ轻链基因的至少一个等位基因的动物育种。
在本发明的实施方案中，根据本文描述的方法、序列和/或构建体使得有蹄类动物重链、κ轻链或者λ轻链基因的等位基因失活，从而不再产生功能性有蹄类动物免疫球蛋白。在一个实施方案中，可以将靶定的免疫球蛋白基因转录成RNA，但是不翻译成蛋白质。在另一实施方案中，可以将靶定的免疫球蛋白基因以失活的截短形式转录。这种截短的RNA可以不被翻译或者可以翻译成无功能的蛋白质。在备选实施方案中，可以将靶定的免疫球蛋白基因以不发生基因的转录的方式灭活。在另一实施方案中，可以转录靶定的免疫球蛋白基因，然后翻译成无功能的蛋白质。
在本发明的另一方面，缺少有蹄类动物重链、κ轻链和/或λ轻链基因的一个等位基因、任选两个等位基因的有蹄类动物，如猪或者牛的细胞可以用作供体细胞以向受体细胞进行核转移，以产生克隆的转基因动物。备选地，可以在胚胎干细胞中产生有蹄类动物重链、κ轻链和/或λ轻链基因敲除，其然后用于产生后代。根据本文描述的方法、序列和/或构建体产生的缺少功能性有蹄类动物重链、κ轻链和/或λ轻链基因的一个等位基因的后代可以育种以进一步通过孟德尔型遗传产生在两个等位基因中都缺少功能性的后代。
在本发明的一方面，提供了破坏有蹄类动物免疫球蛋白基因的表达的方法，其通过(i)分析有蹄类动物重链、κ轻链或λ轻链基因组基因座的种系构型；(ii)确定该基因座的至少一个功能区域的5’末端和3’末端侧翼的核苷酸序列位置；和(iii)将含有侧翼序列的寻靶构建体转染到细胞中实现，其中，在成功地同源重组后，破坏了免疫球蛋白基因座的至少一个功能区，从而减小或者防止该免疫球蛋白基因的表达。在一个实施方案中，提供了猪重链基因座的种系构型。猪重链基因座含有至少四个可变区、两个多样性区、六个连接区和五个恒定区，例如，如图1图解的。在具体实施方案中，六个连接区的仅一个：J6是功能性的。在另一实施方案中，提供了猪κ轻链基因座的种系构型。猪κ轻链基因座含有至少六个可变区、六个连接区、一个恒定区和一个增强子区，例如，如图2图解的。在另一实施方案中，提供了猪λ轻链基因座的种系构型。
在本发明的其他方面，提供了根据本文描述的方法、序列和/或构建体产生的有蹄类动物和有蹄类动物细胞，它们缺少有蹄类动物重链、κ轻链和/或λ轻链基因座的功能区的至少一个等位基因，所述有蹄类动物和有蹄类动物细胞进一步修饰以表达人抗体(即，免疫球蛋白(Ig))基因座的至少部分。在额外实施方案中，提供了表达异种免疫球蛋白的猪动物。该人基因座可以经历重排并在有蹄类动物中表达人抗体分子的不同群体。这些克隆的转基因有蹄类动物提供了人抗体(如多克隆抗体)的可补充的、理论上无限的供应，所述抗体可以用于治疗、诊断、纯化和其他临床上相关的目的。在一个具体实施方案中，人工染色体(AC)，如酵母或者哺乳动物人工染色体(YAC或者MAC)可以用于允许人免疫球蛋白基因在有蹄类动物细胞和动物中表达。可以将所有或者部分的人免疫球蛋白基因，如Ig重链基因(人414号染色体)、Igκ轻链基因(人2号染色体)和/或Igλ轻链基因(22号染色体)插入到人工染色体，其然后可插入到有蹄类动物细胞中。在进一步的实施方案中，提供了有蹄类动物和有蹄类动物细胞，其含有至少一种人抗体基因座的部分或者全部，该基因座经历重排并且表达不同群体的人抗体分子。
在额外实施方案中，提供了产生异种抗体的方法，其中该方法可以包括：(a)对有蹄类动物施用一种或多种目的抗原，所述有蹄类动物的细胞包含一个或多个人工染色体并且缺少功能性内源免疫球蛋白的任何表达，每个人工染色体包含一个或多个经历重排的异种免疫球蛋白基因座，从而导致产生针对所述一种或多种抗原的异种抗体；和/或(b)从有蹄类动物回收所述异种抗体。在一个实施方案中，免疫球蛋白基因座可以在B细胞中经历重排。
在本发明的一方面，通过根据本发明的任意方面的方法可以制备有蹄类动物，如猪或者奶牛。这些克隆的转基因有蹄类动物(例如，猪和牛动物)提供人多克隆抗体的可补充的、理论上无限的供应，所述抗体可以用作治疗、诊断和纯化目的。例如，根据本文描述的方法、序列和/或构建体产生的在血流中产生多克隆人抗体的转基因动物可以用于产生对所需抗原特异的一组不同的人抗体。大量多克隆抗体的可用性也可以用于治疗和预防传染病、对生物战争试剂接种、调节免疫系统、除去不希望的人细胞(如癌细胞)和调节特定人分子。
在其他实施方案中，根据本文描述的方法、序列和/或构建体产生的缺少功能性免疫球蛋白表达的动物或细胞可以含有额外的基因修饰以消除异种抗原的表达。可以修饰此类动物以消除α-1，3-半乳糖基转移酶基因、CMP-Neu5Ac羟化酶基因(见例如，USSN10/863,116)、iGb3合酶基因(见，例如，美国专利申请60/517,524)和/或福斯曼(Forssman)合酶基因(见例如，美国专利申请60/568,922)的至少一个等位基因的表达。在额外实施方案中，本文公开的动物还可以含有基因修饰以表达岩藻糖基转移酶和/或唾液酸转移酶。为了实现这些额外的基因修饰，在一个实施方案中，可以修饰细胞以含有多个基因修饰。在其他实施方案中，动物可以一起育种以实现多个基因修饰。在一个具体实施方案中，根据本文描述的方法、序列和/或构建体产生的缺少功能性免疫球蛋白表达的动物，如猪可以与缺少α-1，3-半乳糖基转移酶表达的动物如猪育种(如WO 04/028243中所述)。
附图简述
图1图解了寻靶载体的设计，该寻靶载体破坏猪重链免疫球蛋白基因的连接区的表达。
图2图解了寻靶载体的设计，该寻靶载体破坏猪κ轻链免疫球蛋白基因的恒定区的表达。
图3图解了猪λ免疫球蛋白基因座的基因组组织，该基因座包括J-C序列的多联体以及包括JC区5’的可变区的侧翼区域。细菌人工染色体(BAC1和BAC2)代表可以从BAC文库得到的猪免疫球蛋白基因组的片段。
图4代表寻靶载体的设计，该寻靶载体破坏猪λ轻链免疫球蛋白基因的JC簇区域的表达。“SM”代表选择标记基因，其可以用于寻靶载体中。
图5图解了向猪λ免疫球蛋白基因座的JC簇区域5’的区插入位点特异性重组酶靶或者识别位点的寻靶策略。“SM”代表选择标记基因，其可以用于寻靶载体中。“SSRRS”代表特异性重组酶靶或者识别位点。
图6图解了向猪λ免疫球蛋白基因座的JC簇区域3’的区插入位点特异性重组酶靶或者识别位点的寻靶策略。“SM”代表选择标记基因，其可以用于寻靶载体中。“SSRRS”代表特异性重组酶靶或者识别位点。
图7图解了YAC向宿主基因组的位点特异性重组酶介导的转移。“SSRRS”代表特异性重组酶靶或者识别位点。
详述
本发明首次提供了有蹄类动物免疫球蛋白种系基因序列排列以及其新的基因组序列。此外，提供了缺少重链或轻链免疫球蛋白基因的至少一个等位基因的新的有蹄类动物细胞、组织和动物。基于该发现，可以产生完全缺少重链和/或轻链免疫球蛋白基因的至少一个等位基因的有蹄类动物。此外，可以进一步修饰这些有蹄类动物以表达异种的(例如人)免疫球蛋白基因座或者其片段。
在本发明的一方面，提供了缺少功能性内源免疫球蛋白的任何表达的转基因有蹄类动物。在一个实施方案中，该有蹄类动物可以缺少内源重链和/或轻链免疫球蛋白的任何表达。轻链免疫球蛋白可以是κ和/或λ免疫球蛋白。在额外实施方案中，提供了缺少内源免疫球蛋白的至少一个等位基因的表达的转基因有蹄类动物，其中该免疫球蛋白选自重链、κ轻链和λ轻链或者其任意组合。在一个实施方案中，通过内源免疫球蛋白基因座的遗传寻靶以防止内源免疫球蛋白的表达，可以实现功能性内源免疫球蛋白的表达。在一个实施方案中，通过同源重组可以完成遗传寻靶。在另一实施方案中，通过核转移可以产生转基因有蹄类动物。
在其他实施方案中，缺少功能性内源免疫球蛋白任何表达的转基因有蹄类动物可以进一步基因修饰以表达异种免疫球蛋白基因座。在备选实施方案中，提供了含有异种免疫球蛋白基因座的猪动物。在一个实施方案中，异种免疫球蛋白基因座可以是重链和/或轻链免疫球蛋白或者其片段。在另一个实施方案中，异种免疫球蛋白基因座可以是κ链基因座或者其片段和/或λ链基因座或者其片段。在其他实施方案中，人工染色体(AC)可以含有异种免疫球蛋白。在一个实施方案中，AC可以是酵母AC或者哺乳动物AC。在另一实施方案中，异种基因座可以是人免疫球蛋白基因座或者其片段。在一个实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以是人14号染色体、人2号染色体和人22号染色体或者其片段。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括人免疫球蛋白的任意片段，该片段可以经历重排。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括人免疫球蛋白重链和人免疫球蛋白轻链的任意片段，其可以经历重排。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括任意人免疫球蛋白基因座或者其片段，其在暴露于抗原后可以产生抗体。在具体实施方案中，应答对一种或多种抗原的暴露，所述外源人免疫球蛋白可以在B细胞中表达以产生异种免疫球蛋白。
在本发明的另一方面，提供了表达异种免疫球蛋白基因座或者其片段的转基因有蹄类动物，其中该免疫球蛋白可以从整合在内源有蹄类动物染色体内的免疫球蛋白基因座表达。在一个实施方案中，提供了来自转基因动物的有蹄类动物细胞。在一个实施方案中，异种免疫球蛋白基因座可以被后代遗传。在另一实施方案中，异种免疫球蛋白基因座可以通过雄性种系由后代遗传。在其他实施方案中，人工染色体(AC)可以含有异种免疫球蛋白。在一个实施方案中，AC可以是酵母AC或者哺乳动物AC。在另一实施方案中，异种基因座可以是人免疫球蛋白基因座或者其片段。在一个实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以是人14号染色体、人2号染色体和人22号染色体或者其片段。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括人免疫球蛋白的任意片段，该片段可以经历重排。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括人免疫球蛋白重链和人免疫球蛋白轻链的任意片段，其可以经历重排。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括任意人免疫球蛋白基因座或者其片段，其在暴露于抗原后可以产生抗体。在具体实施方案中，应答对一种或多种抗原的暴露，所述外源人免疫球蛋白可以在B细胞中表达以产生异种免疫球蛋白。
定义
术语“重组DNA技术”、“DNA克隆”、“分子克隆”或者“基因克隆”指将DNA序列转移到细胞或者生物中的方法。DNA片段可以从一种生物转移到自身复制的遗传元件(例如，细菌质粒)，其允许DNA(或者RNA)序列的任何特定部分的拷贝在许多其他序列中选择并以无限的量产生。质粒和其他类型的克隆载体如人工染色体可以用于拷贝基因和染色体的其他片段以产生足够的相同材料用于进一步研究。除了细菌质粒(其可以携带最高达20kb外源DNA)外，其他克隆载体包括病毒、粘粒、和人工染色体(例如，细菌人工染色体(BAC)或者酵母人工染色体(YAC))。当染色体DNA的片段最终与它的克隆载体在实验室中连接时，将它称作“重组DNA分子”。将重组质粒导入合适的宿主细胞后不久，新插入的区段将随着宿主细胞DNA一起繁殖。
“粘粒”是人工构建的克隆载体，其携带最高达45kb的外来DNA。它们可以在λ噬菌体颗粒中包装以用于转染到大肠杆菌(E.coli)细胞中。
如本文使用的术语“哺乳动物”(如在“基因修饰的(或者改变的)哺乳动物”中)意在包括任何非人哺乳动物，包括但不限于，猪、羊、山羊、牛、鹿、骡、马、猴、狗、猫、大鼠、小鼠、鸟、鸡、爬行动物、鱼和昆虫。在本发明的一个实施方案中，提供了基因改变的猪和其生产方法。
术语“有蹄类动物”指有蹄的哺乳动物。偶蹄类动物是偶数趾(分趾蹄的)有蹄类动物，包括羚羊、骆驼、奶牛、鹿、山羊、猪和羊。奇蹄类动物是奇数趾的有蹄类动物，其包括马、斑马、犀牛和貘。本文使用的术语有蹄类动物指成年、胚胎或者胎儿有蹄类动物。
本文使用的术语“猪(porcine)”、“猪动物”、“猪(pig)”和“猪(swine)”是一般术语，指相同类型的动物，而不关心性别、大小或者品种。
“同源DNA序列或者同源DNA”是与参考DNA序列至少约80％，85％、90％、95％、98％或99％相同的DNA序列。同源序列在严格条件下与靶序列杂交，严格杂交条件包括如果两个序列之间有至少85、至少95％或者98％同一性，那么将允许它们杂交的杂交条件。
“等基因或者基本上等基因DNA序列”是与参考DNA序列相同或者几乎相同的DNA序列。术语“基本上等基因”指与参考DNA序列至少约97-99％相同，或者与参考DNA序列至少约99.5-99.9％相同，并且在一些用途中与参考DNA序列100％相同的DNA。
“同源重组”指基于序列同源性的DNA重组过程。
“基因寻靶”指两个DNA序列之间的同源重组，所述序列之一位于染色体上并且另一个不在染色体上。
“非同源的或者随机整合”指DNA借以整合到基因组但是不涉及同源重组的任意过程。
“选择标记基因”是一种基因，其表达允许鉴定含有该基因的细胞。选择标记可以是允许细胞在防止或者延缓没有该基因的细胞生长的培养基上增殖的选择标记。实例包括抗生素抗性基因和允许生物在选择的代谢物上生长的基因。备选地，该基因可以通过赋予细胞容易鉴定的表型来促进转化体的视觉筛选。这种可鉴定的表型可以例如，是发光的产生或者有色化合物的产生，或者细胞周围培养基中可检测的改变的产生。
术语“连续的”在本文中以它的标准意思使用，即没有中断或者未中断的。
“严格条件”指这样的条件：(1)利用低离子强度和高温度进行洗涤，例如，0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％ SDS于50℃，或者(2)在杂交过程中利用变性剂，如甲酰胺。本领域技术人员可以确定并适当改变严格条件以得到清楚和可检测的杂交信号。例如，在杂交和洗涤期间通过升高存在的盐含量、降低温度或者它们的组合一般可以降低严格性。见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press，ColdSpring Harbour，New York，(1989)。
I.免疫球蛋白基因
在本发明的一方面，提供了缺少功能性内源免疫球蛋白的任何表达的转基因有蹄类动物。在一个实施方案中，该有蹄类动物可以缺少内源重链和/或轻链免疫球蛋白的任何表达。轻链免疫球蛋白可以是κ和/或λ免疫球蛋白。在额外实施方案中，提供了缺少内源免疫球蛋白的至少一个等位基因的表达的转基因有蹄类动物，其中该免疫球蛋白选自重链、κ轻链和λ轻链或者其任意组合。在一个实施方案中，通过内源免疫球蛋白基因座的遗传寻靶以防止内源免疫球蛋白的表达，可以实现功能性内源免疫球蛋白的表达。在一个实施方案中，通过同源重组可以完成遗传寻靶。在另一实施方案中，通过核转移可以产生转基因有蹄类动物。
在本发明的另一方面，提供了破坏有蹄类动物免疫球蛋白基因表达的方法，其包括(i)分析有蹄类动物重链、κ轻链或λ轻链基因组基因座的种系构型；(ii)确定该基因座的至少一个功能区域的5’末端和3’末端侧翼的核苷酸序列位置；和(iii)将含有侧翼序列的寻靶构建体转染到细胞中，其中，在成功地同源重组后，破坏该免疫球蛋白基因座的至少一个功能区，从而减小或者防止该免疫球蛋白基因的表达。
在一个实施方案中，提供了猪重链基因座的种系构型。猪重链基因座含有至少四个可变区、两个多样性区、六个连接区和五个恒定区，例如，如图1图解。在特定实施方案中，六个连接区的仅一个：J6是功能性的。
在另一实施方案中，提供了猪κ轻链基因座的种系构型。猪κ轻链基因座含有至少六个可变区、六个连接区、一个恒定区和一个增强子区，例如，如图2图解。
在另一实施方案中，提供了猪λ轻链基因座的种系构型。
提供了如Seq ID Nos 1-39中所述的分离的核苷酸序列。还提供了与Seq ID Nos 1-39的任一个至少80、85、90、95、98或99％同源的核酸序列。此外，提供了含有Seq ID Nos 1-39任一个的至少10、15、17、20、25或30个连续核苷酸的核苷酸序列。还提供了任选在严格条件下与Seq ID Nos 1-39杂交的核苷酸序列，以及其同源核苷酸。
在核苷酸或者氨基酸序列水平上的同源性或者同一性可以通过BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析，使用程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx(见例如，Altschul，S.F.等人，(1997)Nucleic Acids Res 25：3389-3402和Karlin等人，(1900)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，2264-2268)(它们被定制以用于序列相似性搜索)所用的算法来确定。BLAST程序使用的方法是首先考虑查询序列和数据库序列之间的相似性区段(有和没有缺口)，然后评估所鉴定的所有匹配的统计学显著性，并最后仅仅总结满足预先选择的显著性阈值的那些匹配。见例如，Altschul等人，(1994)(Nature Genetics 6，119-129)。直方图、描述、比对、期望(即，对数据库序列报告匹配的统计学显著性阈值)、截止值(cutoff)、矩阵和滤器(低复杂性)的搜索参数处于默认设置。blastp、blastx、tblastn和tblastx的默认评分矩阵是BLOSUM62矩阵(Henikoff等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，10915-10919)，推荐其用于长度超过85(核苷酸碱基或者氨基酸)的查询序列。
猪重链
在本发明的另一方面，提供了编码有蹄类动物免疫球蛋白的重链基因座的新的基因组序列。在一个实施方案中，提供了编码猪重链的分离的核苷酸序列，其包括至少一个可变区、两个多样性区、至少四个连接区和至少一个恒定区，如μ恒定区，例如，如Seq ID No.29中表示。在另一实施方案中，提供了分离的核苷酸序列，其包括猪重链基因组序列的至少四个连接区和至少一个恒定区，如μ恒定区，如Seq ID No.4中表示。在另一实施方案中，提供了核苷酸序列，其包括猪重链基因组序列的第一个连接区的5’侧翼序列，如Seq ID No.1中表示。此外，提供了核苷酸序列，其包括猪重链基因组序列的第一个连接区的3’侧翼序列，如Seq ID No.4的3’区中表示。在进一步实施方案中，提供了如Seq ID No.1、4或29所述的分离的核苷酸序列。还提供了与Seq ID No.1、4或29至少80、85、90、95、98或99％同源的核酸序列。还提供了任选在严格条件下与Seq ID No.1、4或29杂交的核苷酸序列以及其同源核苷酸。
此外，提供了含有Seq ID No.1、4或29的至少10、15、17、20、25或30个连续核苷酸的核苷酸序列。在一个实施方案中，该核苷酸序列含有Seq ID No 4的至少17、20、25或30个连续核苷酸或者SeqID No.29的残基1-9,070。在其他实施方案中，提供了含有Seq ID No.29的至少50、100、1,000、2,500、4,000、4,500、5,000、7,000、8,000、8,500、9,000、10,000或15,000个连续核苷酸的核苷酸序列。在另一实施方案中，该核苷酸序列含有Seq ID No.29的残基9,070-11039。
在进一步实施方案中，提供了如Seq ID No.1、4或29所述的分离的核苷酸序列。还提供了与Seq ID No.1、4或29至少80、85、90、95、98或99％同源的核酸序列。此外，提供了含有Seq ID No.1、4或29的至少10、15、17、20、25或30个连续核苷酸的核苷酸序列。还提供了任选在严格条件下与Seq ID No.1、4或29杂交的核苷酸序列以及其同源核苷酸。
在一个实施方案中，提供了编码猪重链的分离的核苷酸序列，其包括至少一个可变区、两个多样性区、至少四个连接区和至少一个恒定区，如μ恒定区，例如，如Seq ID No.29中表示。在Seq ID No.29中，重链的多样性区例如通过残基1089-1099(D(pseudo))表示，重链的连接区例如通过残基1887-3352(例如：J(psuedo)：1887-1931，J(psuedo)：2364-2411，J(psuedo)：2756-2804，J(功能性J)：3296-3352)表示，重组信号例如通过残基3001-3261(九碱基顺序)，3292-3298(七碱基序列)表示，恒定区通过下面的残基表示：3353-9070(J到Cμ内含子)、5522-8700(转换区)、9071-9388(μ外显子1)、9389-9469(μ内含子A)、9470-9802(μ外显子2)、9830-10069(μ内含子B)、10070-10387(μ外显子3)、10388-10517(μ内含子C)、10815-11052(μ外显子4)、11034-11039(聚腺苷酸信号)。
 
Seq ID No.29 tctagaagacgctggagagaggccagacttcctcggaacagctcaaagagctctgtcaaagccagatcccatcacacgtgggcaccaataggccatgccagcctccaagggccgaactgggttctccacggcgcacatgaagcctgcagcctggcttatcctcttccgtggtgaagaggcaggcccgggactggacgaggggctagcagggtgtggtaggcaccttgcgccccccaccccggcaggaaccagagaccctggggctgagagtgagcctccaaacaggatgccccacccttcaggccacctttctatccagctacactccacctgccattctcctctgggcacagggcccagcccctggatcttggccttggctcgacttgcacccacgcgcacacacacacttcctaacgtgctgtccgctcacccctccccagcgtggtccatgggcagcacggcagtgcgcgtccggcggtagtgagtgcagaggtccctttgcctctgccaggagcccctggggtgtgtgcagatctgggggctcctgtcccttacaccttcatgcccctcccctcatacccaccctccaggcgggaggcagcgagacctttgcccagggactcagccaacgggcacacgggaggccagccctcagcagctggctcccaaagaggaggtgggaggtaggtccacagctgccacagagagaaaccctgacggaccccacaggggccacgccagccggaaccagctccctcgtgggtgagcaatggccagggccccgccggccaccacggctggccttgcgccagctgagaactcacgtccagtgcagggagactcaagacagcctgtgcacacagcctcggatctgctcccatttcaagcagaaaaaggaaaccgtgcaggcagccctcagcatttcaaggattgtagcagcggccaactattcgtcggcagtggccgattagaatgaccgtggagaagggcggaagggtctctcgtgggctctgcggccaacaggccctggctccacctgcccgctgccagcccgaggggcttgggccgagccaggaaccacagtgctcaccgggaccacagtgactgaccaaactcccggccagagcagccccaggccagccgggctctcgccctggaggactcaccatcagatgcacaagggggcgagtgtggaagagacgtgtcgcccgggccatttgggaaggcgaagggaccttccaggtggacaggaggtgggacgcactccaggcaagggactgggtccccaaggcctggg
 
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Seq ID No.1 TCTAgAAGACGCTGGAGAGAGGCCagACTTCCTCGGAACAGCTCAAAGAGCTCTGTCAAAGCCAGATCCCATCACACGTGGGCACCAATAGGCCATGCCAGCCTCCAAGGGCCGAACTGGGTTCTCCACGGCGCACATGAAGCCTGCAGCCTGGCTTATCCTCTTCCGTGGTGAAGAGGCAGGCCCGGGACTGGACGAGGGGCTAGCAGGGTGTGGTAGGCACCTTGCGCCCCCCACCCCGGCAGGAACCAGAGACCCTGGGGCTGAGAGTGAGCCTCCAAACAGGATGCCCCACCCTTCAGGCCACCTTTCAATCCAGCTACACTCCACCTGCCATTCTCCTCTGGGCACAGGGCCCAGCCCCTGGATCTTGGCCTTGGCTCGACTTGCACCCACGCGCACACACACACTTCCTAACGTGCTGTCCGCTCACCCCTCCCCAGCGTGGTCCATGGGCAGCACGGCAGTGCGCGTCCGGCGGTAGTGAGTGCAGAGGTCCCTTCCCCTCCCCCAGGAGCCCCAGGGGTGTGTGCAGATCTGGGGGCTCCTGTCCCTTACACCTTCATGCCCCTCCCCTCATACCCACCCTCCAGGCGGGAGGCAGCGAGACCTTTGCCCAGGGACTCAGCCAACGGGCACACGGGAGGCCA GCCCTCAGCAGCTGGG                                 
Seq ID No.4 GGCCAGACTTCCTCGGAACAGCTCAAAGAGCTCTGTCAAAGCCAGATCCCATCACACGTGGGCACCAATAGGCCATGCCAGCCTCCAAGGGCCGAACTGGGTTCTCCACGGCGCACATGAAGCCTGCAGCCTGGCTTATCCTCTTCCGTGGTGAAGAGGCAGGCCCGGGACTGGACGAGGGGCTAGCAGGGTGTGGTAGGCACCTTGCGCCCCCCACCCCGGCAGGAACCAGAGACCCTGGGGCTGAGAG                                                 
 
TGAGCCTCCAAACAGGATGCCCCACCCTTCAGGCCACCTTTCAATCCAGCTACACTCCACCTGCCATTCTCCTCTGGGCACAGGGCCCAGCCCCTGGATCTTGGCCTTGGCTCGACTTGCACCCACGCGCACACACACACTTCCTAACGTGCTGTCCGCTCACCCCTCCCCAGCGTGGTCCATGGGCAGCACGGCAGTGCGCGTCCGGCGGTAGTGAGTGCAGAGGTCCCTTCCCCTCCCCCAGGAGCCCCAGGGGTGTGTGCAGATCTGGGGGCTCCTGTCCCTTACACCTTCATGCCCCTCCCCTCATACCCACCCTCCAGGCGGGAGGCAGCGAGACCTTTGCCCAGGGACTCAGCCAACGGGCACACGGGAGGCCAGCCCTCAGCAGCTGGCTCCCAAAGAGGAGGTGGGAGGTAGGTCCACAGCTGCCACAGAGAGAAACCCTGACGGACCCCACAGGGGCCACGCCAGCCGGAACCAGCTCCCTCGTGGGTGAGCAATGGCCAGGGCCCCGCCGGCCACCACGGCTGGCCTTGCGCCAGCTGAGAACTCACGTCCAGTGCAGGGAGACTCAAGACAGCCTGTGCACACAGCCTCGGATCTGCTCCCATTTCAAGCAGAAAAAGGAAACCGTGCAGGCAGCCCTCAGCATTTCAAGGATTGTAGCAGCGGCCAACTATTCGTCGGCAGTGGCCGATTAGAATGACCGTGGAGAAGGGCGGAAGGGTCTCTCGTGGGCTCTGCGGCCAACAGGCCCTGGCTCCACCTGCCCGCTGCCAGCCCGAGGGGCTTGGGCCGAGCCAGGAACCACAGTGCTCACCGGGACCACAGTGACTGACCAAACTCCCGGCCAGAGCAGCCCCAGGCCAGCCGGGCTCTCGCCCTGGAGGACTCACCATCAGATGCACAAGGGGGCGAGTGTGGAAGAGACGTGTCGCCCGGGCCATTTGGGAAGGCGAAGGGACCTTCCAGGTGGACAGGAGGTGGGACGCACTCCAGGCAAGGGACTGGGTCCCCAAGGCCTGGGGAAGGGGTACTGGCTTGGGGGTTAGCCTGGCCAGGGAACGGGGAGCGGGGCGGGGGGCTGAGCAGGGAGGACCTGACCTCGTGGGAGCGAGGCAAGTCAGGCTTCAGGCAGCAGCCGCACATCCCAGACCAGGAGGCTGAGGCAGGAGGGGCTTGCAGCGGGGCGGGGGCCTGCCTGGCTCCGGGGGCTCCTGGGGGACGCTGGCTCTTGTTTCCGTGTCCCGCAGCACAGGGCCAGCTCGCTGGGCCTATGCTTACCTTGATGTCTGGGGCCGGGGCGTCAGGGTCGTCGTCTCCTCAGGGGAGAGTCCCCTGAGGCTACGCTGGGG*GGGGACTATGGCAGCTCCACCAGGGGCCTGGGGACCAGGGGCCTGGACCAGGCTGCAGCCCGGAGGACGGGCAGGGCTCTGGCTCTCCAGCATCTGGCCCTCGGAAATGGCAGAACCCCTGGCGGGTGAGCGAGCTGAGAGCGGGTCAGACAGACAGGGGCCGGCCGGAAAGGAGAAGTTGGGGGCAGAGCCCGCCAGGGGCCAGGCCCAAGGTTCTGTGTGCCAGGGCCTGGGTGGGCACATTGGTGTGGCCATGGCTACTTAGATTCGTGGGGCCAGGGCATCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGAGCCTGGTGTCTGATGTCCAGCTAGGCGCTGGTGGGCCGCGGGTGGGCCTGTCTCAGGCTAGGGCAGGGGCTGGGATGTGTATTTGTCAAGGAGGGGCAACAGGGTGCAGACTGTGCCCCTGGAAACTTGACCACTGGGGCAGGGGCGTCCTGGTCACGTCTCCTCAGGTAAGACGGCCCTGTGCCCCTCTCTCGCGGGACTGGAAAAGGAATTTTCCAAGtATTCCTTGGTCTGTGTGGGGCCCTCTGGGGCCCCCGGGGGTGGCTCCCCTCCTGCCCAGATGGGGCCTCGGCCTGTGGAGCACGGGCTGGGCACACAGCTCGAGTCTAGGGCCACAGAGGCCCGGGCTCAGGGCTCTGTGTGGCCCGGCGACTGGCAGGGGGCTCGGGTTTTTGGACACCCCCTAATGGGGGCCACAGCACTGTGACCATCTTCACAGCTGGGGCCGAGGAGTCGAGGTCACCGTCTCCTCAGGTGAGTCCTCGTCAGCCCTCTCTCACTCTCTGGGGGGTTTTGCTGCATTTTGTGGGGGAAAGAGGATGCCTGGGTCTCAGGTCTAAAGGTCTAGGGCCAGCGCCGGGGCCCAGGAAGGGGCCGAGGGGCCAGGCTCGGCTCGGCCAGGAGCAGAGCTTC  
 
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CTGGGTTGATCTGGCAGGGCTGGTTTGCGCTGGGTCAAGCTCCCGGGAGATGGCCTGGGATGAGCTGGGCTGGTTTGGGCTGAGCTGAGCTGAGCTGAGCTAGGCTGCATTGAGCAGGCTGAGCTGGGCTGAGCTGGCCTGGGGTGAGCTGGGCTGGGTGGAGCTGAGCTGGGCTGAACTGGGCTAAGCTGGCTGAGCTGGATCGAGCTGAGCTGGGCTGAGCTGGCCTGGGGTTAGCTGGGCTGAGCTGAGCTGAGCTAGGCTGGGTTGAGCTGGCTGGGCTGGTTTGCGCTGGGTCAAGCTGGGCCGAGCTGGCCTGGGTTGAGCTGGGCTGGGCTGAGCTGAGCTAGGCTGGGTTGAGCTGGGCTGGGCTGAGCTGAGCTAGGCTGCATTGAGCTGGCTGGGATGGATTGAGCTGGCTGAGCTGGCTGAGCTGGCTGAGCTGGGCTGAGCTGGCCTGGGTTGAGCTGGGCTGGGTTGAGCTGAGCTGGGCTGAGCTGGGCTCAGCAGAGCTGGGTTGAGCTGAGCTGGGTTGAGCTGGGGTGAGCTGGGCTGAGCAGAGCTGGGTTGAGCTGAGCTGGGTTGAGCTGGGCTCGAGCAGAGCTGGGTTGAGCTGAGCTGGGTTGAGCTGGGCTCAGCAGAGCTGGGTTGAGCTGAGCTGGGTTGAGCTGGGCTGAGCTAGCTGGGCTCAGCTAGGCTGGGTTGAGCTGAGCTGGGCTGAACTGGGCTGAGCTGGGCTGAACTGGGCTGAGCTGGGCTGAGCTGGGCTGAGCAGAGCTGGGCTGAGCAGAGCTGGGTTGGTCTGAGCTGGGTTGAGCTGGGCTGAGCTGGGCTGAGCAGAGTTGGGTTGAGCTGAGCTGGGTTCAGCTGGGCTGAGCTAGGCTGGGTTGAGCTGGGTTGAGTTGGGCTGAGCTGGGCTGGGTTGAGCGGAGCTGGGCTGAACTGGGCTGAGCTGGGCTGAGCGGAACTGGGTTGATCTGAATTGAGCTGGGCTGAGCCGGGCTGAGCCGGGCTGAGCTGGGCTAGGTTGAGCTTGGGTGAGCTTGCCTCAGCTGGTCTGAGCTAGGTTGGGTGGAGCTAGGCTGGATTGAGCTGGGCTGAGCTGAGCTGATCTGGCCTCAGCTGGGCTGAGGTAGGCTGAACTGGGCTGTGCTGGGCTGAGCTGAGCTGAGCCAGTTTGAGCTGGGTTGAGCTGGGCTGAGCTGGGCTGTGTTGATCTTTCCTGAACTGGGCTGAGCTGGGCTGAGCTGGCCTAGCTGGATTGAACGGGGGTAAGCTGGGCCAGGCTGGACTGGGCTGAGCTGAGCTAGGCTGAGCTGAGTTGAATTGGGTTAAGCTGGGCTGAGATGGGCTGAGCTGGGCTGAGCTGGGTTGAGCCAGGTCGGACTGGGTTACCCTGGGCCACACTGGGCTGAGCTGGGCGGAGCTCGATTAACCTGGTCAGGCTGAGTCGGGTCCAGCAGACATGCGCTGGCCAGGCTGGCTTGACCTGGACACGTTCGATGAGCTGCCTTGGGATGGTTCACCTCAGCTGAGCCAGGTGGCTCCAGCTGGGCTGAGCTGGTGACCCTGGGTGACCTCGGTGACCAGGTTGTCCTGAGTCCGGGCCAAGCCGAGGCTGCATCAGACTCGCCAGACCCAAGGCCTGGGCCCCGGCTGGCAAGCCAGGGGCGGTGAAGGCTGGGCTGGCAGGACTGTCCCGGAAGGAGGTGCACGTGGAGCCGCCCGGACCCCGACCGGCAGGACCTGGAAAGACGCCTCTCACTCCCCTTTCTCTTCTGTCCCCTCTCGGGTCCTCAGAGAGCCAGTCTGCCCCGAATCTCTACCCCCTCGTCTCCTGCGTCAGCCCCCCGTCCGATGAGAGCCTGGTGGCCCTGGGCTGCCTGGCCCGGGACTTCCTGCCCAGCTCCGTCACCTTCTCCTGGAA                        
猪κ轻链
在另一实施方案中，提供了编码有蹄类动物免疫球蛋白的κ轻链基因座的新的基因组序列。本发明提供了有蹄类动物κ轻链区的首次报导的基因组序列。在一个实施方案中，提供了编码猪κ轻链基因座的核酸序列。在另一实施方案中，该核酸序列可以含有κ轻链的至少一个连接区、一个恒定区和/或一个增强子区。在另一实施方案中，该核苷酸序列可以包括至少五个连接区、一个恒定区和一个增强子区，例如，如Seq ID No.30中表示。在另一实施方案中，提供了分离的核苷酸序列，其含有猪基因组κ轻链的至少一个、至少两个、至少三个、至少四或者五个连接区和连接区的3’侧翼序列，例如，如Seq ID No 12中表示。在另一实施方案中，提供了猪基因组κ轻链的分离的核苷酸序列，其含有第一个连接区的5’侧翼序列，如Seq ID No25中表示。在另一实施方案中，提供了分离的核苷酸序列，其含有猪基因组κ轻链的恒定区的3’侧翼序列和任选地，增强子区的5’部分，如Seq ID Nos.15、16和/或19中表示。
在其他实施方案中，提供了如Seq ID Nos 30、12、25、15、16或19中所述的分离的核苷酸序列。还提供了与Seq ID Nos 30、12、25、15、16或19至少80、85、90、95、98或99％同源的核酸序列。此外，提供了含有Seq ID Nos 30、12、25、15、16或19的至少10、15、17、20、25或30个连续核苷酸的核苷酸序列。此外，提供了含有Seq ID No.1、4或29的至少10、15、17、20、25或30个连续核苷酸的核苷酸序列。在其他实施方案中，提供了含有Seq ID No.30的至少50、100、1,000、2,500、5,000、7,000、8,000、8,500、9,000、10,000或15,000个连续核苷酸的核苷酸序列。还提供了任选在严格条件下与Seq ID Nos 30、12、25、15、16或19杂交的核苷酸序列，以及其同源核苷酸。
在一个实施方案中，提供了编码κ轻链的分离的核苷酸序列，其包括至少五个连接区、一个恒定区和一个增强子区，例如，如Seq IDNo.30中表示。在Seq ID No.30中，κ轻链的编码区例如通过残基1-549和10026-10549表示，而内含子序列例如通过残基550-10025表示，κ轻链的连接区例如通过残基5822-7207(例如，J1：5822-5859，J2：6180-6218，J3：6486-6523，J4：6826-6863，J5：7170-7207)表示，恒定区通过下面的残基表示：10026-10549(C外显子)和10026-10354(C编码)，10524-10529(聚腺苷酸信号)和11160-11264(SINE元件)。
 
Seq ID No 30 GCGTCCGAAGTCAAAAATATCTGCAGCCTTCATGTATTCATAGAAACAAGGAATGTCTACATTTTCCAAAGTGGGACCAGAATCTTGGGTCATGTCTAAGGCATGTGCATTTGCACATGGTAGGCAAAGGACTTTGCTTCTCCCAGCACATCTTTCTGCAGAGATCCATGGAAACAAGACTCAACTCCAAAGCAGCAAAGAAGCAGCAAGTTCTCAAGTGATCTCCTCTGACTCCCTCCTCCCAGGCTAATGAAGCCATGTTGCCCCTGGGGGATTAAGGGCAGGTGTCCATTGTGGCACCCAGCCCGAAGACAAGCAATTTGATCAGGTTCTGAGCACTCCTGAATGTGGACTCTGGAATTTTCTCCTCACCTTGTGGCATATCAGCTTAAGTCAAGTACAAGTGACAAACAACATAATCCTAAGAAGAGAGGAATCAAGCTGAAGTCAAAGGATCACTGCCTTGGATTCTACTGTGAATGATGACCTGGAAAATATCCTGAACAACAGCTTCAGGGTGATCATCAGAGACAAAAGTTCCAGAGCCAGgtagggaaaccctcaagccttgcaaagagcaaaatcatgccattgggttcttaacctgctgagtgatttactatatgttactgtgggaggcaaagcgctcaaatagcctgggtaagtatgtcaaataaaaagcaaaagtggtgtttcttgaaatgttagacctgaggaaggaatattgataacttaccaataattttcagaatgatttatagatgtgcacttagtcagtgtctctccaccccgcacctgacaagcagtttagaatttattctaagaatctaggtttgctgggggctacatgggaatcagcttcagtgaagagtttgttggaatgattcactaaattttctatttccagcataaatccaagaacctctcagactagtttattgacactgcttttcctccataatccatctcatctccgtccatcatggacactttgtagaatgacaggtcctggcagagactcacagatgcttctgaaacatcctttgccttcaaagaatgaacagcacacatactaaggatctcagtgatccacaaattagtttttgccacaatggttcttatgataaaagtctttcattaacagcaaattgttttataatagttgttctgctttataataattgcatgcttcactttcttttcttttctttttttttctttttttgctttttagtgccgcaggtgcagcatatgaaatttcccaggctaggggtcaaatcagaactacacctactggcctacgccacagccacagcaactcaggatctaagccatgtcggtgacctacactacagctcatggcaatgccagatccttaacccaatgagcgaggccagggatcgaacccatgtcctcatggatactagtcaggctcattatccgctgagccataacaggaactcccgagtttgctttttatcaaaattggtacagccttattgtttctgaaaaccacaaaatgaatgtattcacataattttaaaaggttaaataatttatgatatacaagacaatagaaagagaaaacgtcattgcctctttcttccacgacaacacgcctccttaattgatttgaagaaataactactgagcatggtttagttgacttctttcagcaattagcctgtattcatagccatacatattcaattaaaatgagatcatgatatcacacaatacataccatacagcctatagggatttttacaatcatcttccacatgactacataaaaacctacctaaaaaaaaaaaaaaccctacttcatcctcctattggctgctttgtgctccattaaaaagctctatcataattaggttatgatgaggatttccattttctacctttcaagcaacatttcaatgcacagtcttatatacacatttgagcctacttttctttttctttctttttttggttttttttttttttttttttttggtctttttgtcttttcttaggctgcatatggaggttcccaggctagctgtctaatcagaactatagctgctggcctacgccacatccacagcaatacaagatctgagccatgtctgcaacttacaccacagctcacagcaacggtggatccttaaaccactgagcaaggccagggatcaaacccataacttcatggctcctagttggatttgttaaccactgagccatgatggcaactcctgagcctacttttctaatcatttccaaccctaggacacttttttaagtttcatttttctccccccaccccctgttttctgaagtgtgtttgcttccactgggtgacttcactcccaggatctcatctgcaggatactgcagctaagtgtatgagctctgaatttgaatcccaactctgccactcaaagggataggagtttccgatgtggcccaatgggatcagtggcatctctgcagtgccaggacgcaggttccatccctggcccagcacagtgggttaagaatctggcattgctgcagctgaggcatagatttcaattgtgcctcagatctgatccttggcccaaggactgcatatgcctcagggcaaccaaaaaagagaaaaggggggtgatagcattagtttctagatttgggggataattaaataaagtgatccatgtacaatgtatggcattttgtaaatgctcaacaaatttcaactattatggagttcccatcatggctca
 
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Seq ID No.25 GCACATGGTAGGCAAAGGACTTTGCTTCTCCCAGCACATCTTTCTGCAGAGATCCATGGAAACAAGACTCAACTCCAAAGCAGCAAAGAAGCAGCAAGTTCTCAAGTGATCTCCTCTGACTCCCTCCTCCCAGGCTAATGAAGCCATGTTGCCCCTGGGGGATTAAGGGCAGGTGTCCATTGTGGCACCCAGCCCGAAGACAAGCAATTTGATCAGGTTCTGAGCACTCCTGAATGTGGACTCTGGAATTTTCTCCTCACCTTGTGGCATATCAGCTTAAGTCAAGTACAAGTGACAAACAACATAATCCTAAGAAGAGAGGAATCAAGCTGAAGTCAAAGGATCACTGCCTTGGATTCTACTGTGAATGATGACCTGGAAAATATCCTGAACAACAGCTTCAGGGTGATCATCAGAGACAAAAGTTCCAGAGCCAGGTAGGGAAACCCTCAAGCCTTGCAAAGAGCAAAATCATGCCATTGGGTTCTTAACCTGCTGAGTGATTTACTATATGTTACTGTGGGAGGCAAAGCGCTCAAATAGCCTGGGTAAGTATGTCAAATAAAAAGCAAAAGTGGTGTTTCTTGAAATGTTAGACCTGAGGAAGGAATATTGATAACTTACCAATAATTTTCAGAATGATTTATAGATGTGCACTTAGTCAGTGTCTCTCCACCCCGCACCTGACAAGCAGTTTAGAATTTATTCTAAGAATCTAGGTTTGCTGGGGGCTACATGGGAATCAGCTTCAGTGAAGAGTTTGTTGGAATGATTCACTAAATTTTCTATTTCCAGCATAAATCCAAGAACCTCTCAGACTAGTTTATTGACACTGCTTTTCCTCCATAATCCATCTCATCTCCGTCCATCATGGACACTTTGTAGAATGACAGGTCCTGGCAgAGACTCaCAGATGCTTCTGAAACATCCTTTGCCTTCAAAGAATGAACAGCACACATACTAAGGATCTCAGTGATCCACAAATTAGTTTTTGCCACAATGGTTCTTATGATAAAAGTCTTTCATTAACAGCAAATTGTTTTATAATAGTTGTTCTGCTTTATAATAATTGCATGCTTCACTTTCTTTTCTTTTCTTTTTTTTTCTTTTTTTGCTTTTTAGTGCCGCAGGTgcagcatatgaaatttcccaggctaggggtcaaatcagaactacacctactggcctacgccacagccacagcaactcaggatctaagccatgtcggtgacctacactacagctcatgg
 
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猪λ轻链
在另一实施方案中，提供了编码有蹄类动物免疫球蛋白的λ轻链基因座的新的基因组序列。本发明提供了有蹄类动物λ轻链区的首次报导的基因组序列。在一个实施方案中，猪λ轻链核苷酸包括J到C单位的多联体。在特定实施方案中，提供了如Seq ID No.28中描绘的分离的猪λ核苷酸序列。
在一个实施方案中，提供了包括猪λ轻链基因组序列的第一个λJ/C区的5’侧翼序列的核苷酸序列，如Seq ID No 32表示。此外，提供了包括猪λ轻链基因组序列的J/C簇区的3’侧翼序列，如λJ/C下游约200个碱基对的核苷酸序列，如Seq ID No 33表示。备选地，提供了包括猪λ轻链基因组序列的J/C簇区的3’侧翼序列的核苷酸序列，如J/C簇下游约11.8kb，接近增强子(如Seq JD No.34表示)，λ的下游约12Kb，包括增强子区(如Seq ID No.35表示)，λ的下游约17.6Kb(如Seq ID No.36表示，λ的下游约19.1Kb(如Seq ID No.37表示)，λ的下游约21.3Kb(如Seq ID No.38表示)，和/或λ的下游约27Kb(如Seq ID No.39表示)。
在进一步的实施方案中，提供了如Seq ED Nos 28、31、32、33、34、35、36、37、38或39中所述的分离的核苷酸序列。还提供了与Seq ID Nos 28、31、32、33、34、35、36、37、38或39至少80、85、90、95、98或99％同源的核酸序列。此外，提供了含有Seq ID Nos 28、31、32、33、34、35、36、37、38或39的至少10、15、17、20、25、30、40、50、75、100、150、200、250、500或1,000个连续核苷酸的核苷酸序列。还提供了任选在严格条件下与Seq ID Nos 28、31、32、33、34、35、36、37、38或39杂交的核苷酸序列，以及其同源核苷酸。
 
Seq ID No.28 CCTTCCTCCTGCACCTGTCAACTCCCAATAAACCGTCCTCCTTGTCATTCAGAAATCATGCTCTCCGCTCACTTGTGTCTACCCATTTTCGGGCTTGCATGGGGTCATCCTCGAAGGTGGAGAGAGTCCCCCTTGGCCTTGGGGAAGTCGAGGGGGGCGGGGGGAGGCCTGAGGCATGTGCCAGCGAGGGGGGTCACCTCCACGCCCCTGAGGACCTTCTAGAACCAGGGGCGTGGGGCCACCGCCTGAGTGGAAGGCTGTCCACTTTTCCCCCGGGCCCCCAGGCTCCCTCCTCCGTGTGGACCTTGTCCACCTCTGACTGGCCCAGCCACTCATGCATTGTTTCCCCGAAACCCCAGGACGATAGCTCAGCACGCGACAGTGTCCCCCTCTGAGGGCCTCTGTCCATTTCAGGACGACCCGCATGTACAGCGTGACCACTCTGCTCACGCCCACTCACCACGTCCTAGAGCCCCACCCCCAGCCCCATCCTTAGGGGCACAGCCAGcTCCGACCGCCCCGGGGACACCACCCTCTGCCCCTTcCCCAGGCCCTCCCTGTCACACGCACCACAGGGCCCTCCGTCCCGAGACCCTGCTCCCTCATCCCTCGGTCCCCTCAGGTAGCCTTCCACCCGCGTGTGTCCCGAGGTCCCAGATGCAGCAAGGCCCCTGGGACAACGCCAGATCTCTGCTCTcCCCGACCCCTCAGAAGCCAGCCCACGCCTGGCCCCACCACCACTGCCTAACgTCCAAGTGTCCATAGGCCTCGGGACCTCCAAGTCCAGGTTCTGCCTCTGGGATTCCGCCATGGGTCTGCCTGGGAAATGATGCACTTGGAGGAGCTCAGCATGGGATGCGGGACCTTGTCTCTAGGCGCTcCCTCAGGATCCCACAGCTGCCCTGTGAGACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAAACACGCATGCACGCACGCCGGCACACACGCTATTGCAGAGATGGCCACGGTAGCTGTGCCTCGAGGCCGAGTGGAGTGTCTAGAACTCTCGGGGGTCCCCTCTGCAGACGACACTGCTCCATCCCCCCCGTGCCCTGAAGGGCTCCTCACTCTCCCATCAGGATCTCTCCAAGCTGCTGACCTGGAGAGGAAGGGGCCTGGGACAGGCGGGGACACTCAGACCTCCCTGCTGCCCCTCCTCTGCCTGGGCTTGGACGGCTCCCCCCTTCCCACGGGTGAAGGTGCAGGTGGGGAGAGGGCACCCCCCTCAGCCTCCCAGACCCAGACCAGCCCCCGTGGCAGGGGCAGCCTGTGAGCCTCCAGCCAGATGCAGGTGGCCTGGGGTGGGGGGTGGAGGGGGCGGGAGGTTTATGTTTGAGGCTGTATCACTGTGTAATATTTTCGGCGGTGGGACCCATCTGACCGTCCTCGGTGAGTCTCCCCTTTTCTCTCCTCCTTGGGGATCCGAGTGAAATCTGGGTCGATCTTCTCTCCGTTCTCCTCCGACTGGGGCTGAGGTCTGAACCTCGGTGGGGTCCGAAGAGGAGGCCCCTAGGCCAGGCTCCTCAGCCCCTCCAGCCCGACcgGCCCTCTTGACACAGGGTCCAGCTAAGGGCAGACATGGAGGCTGCTAGTCCAGGGCCAGGCTCTGAGACCCAAGGGCGCTGCCCAAGGAACCCTTGCCCCAGGGACCCTGGGAGCAAAGCTCCTCACTCAGAGCCTGCAGCCCTGGGGTCTGAGGACAAGGAGGGACTGAGGACTGGGCGTGGGGAGTTCAGGCGGGGACACCAGGTCCAGGGAGGTGACAAAGGCGCTGGGAGGGGGCGGACGGTGCCGGGGACTCCTCCTGGGCCCTGTGGGCTCGGGGTCCTTGTGAGGACCCTGAGGGACTGAGGGGCCCCTGGGCCTAGGGACTTGCAgTgAGGGAGGCAGGGAGTGTCCCTTGAGAACGTGGCCTCCGCGGGCTGGGTCCCCCTCGTGCTCCCAGCC*GGGAGGACACCCCAGAGCAAGCGCCCCAGGTGGGCGGGGAGGGTCTCCTCACAGGGGCAGCTGACAGATAGAGGCCCCCGCCAGGCAGATGCTTGATCCTGGCAgTTATACTGGGTTC**GCACAACTTTCCCTGAACAAGGGGCCCTCCGAACAGACACAGACGCAACCCAGTCGACCcaggCTCAGCACAgAAAATGCACTGACACCCAAAACCCTCATCTggggGCCTGGCCGGcAtCCCGCCCCAGGACCCAAGGCCCCTGCCCCCTGGCAGCCCTGGACACGGTCCTCTGTGGGCGGTGGGGTCgGGGCTGTGGTGACGGTGGCATCGGGGAGCCTGTGCCCCCTCCCTGAAAGGGCGGAGAGGCTCAAGAGGGGACAGAAATGTCCTCCCCTAGGAAGACCTCGGACGGGGGCGGGGGGGTGGTCTCCGACAGACAGATGCCCGGGACCGACAGACCTGCCGAGGGAAGAGGGCACCTCGGTCGGGTTAGGCTCCAGGCAGCACGAGGGAGCGAGGCTGGGAGGGTGAGGACATGGGAGCCTGAGGAGGAGCTGGAGACTTCAGCAGGCCCCCAGCTCCGGGCTTCGGGCTCTGAGATGCTCGGACGCAAGGTGAGTGACCCCACCTGTGGCTGACCTGACCTCAgGGgGACAAGGC
 
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AGGCTCAAGAGGGGACAGAAATGTCCTCCCCTAGGAAGACCTCGGACGGGGGCGGGGGGGTGGTCTCCGACAGACAGATGCCCGGGACCGACAGACCTGCCGAGGGAAGAGGGCACCTCGGTCGGGTTAGGCTCCAGGCAGCACGAGGGAGCGAGGCTGGGAGGGTGAGGACATGGGAGCCTGAGGAGGAGCTGGAGACTTCAGCAGGCCCCCAGCTCCGGGCTTCGGGCTCTGAGATGCTCGGACGCAAGGTGAGTGACCCCACCTGTGGCTGACCTGACCTGACCtCAGGGGGACAAGGGTGAGTGACCCCACCTGTGGCTGACCTGACCTGACCtCAGGGGGACAAGGCTCAGCCTGGGACTCTgTGTCCCCATCGCCTGCACAGGGGATTCCCCTGCCAAGGCCACTCCCACGGTCAACCTCTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTCGGCACCAACAAGGCCACCCTGGTGTGTCTA                        
 
 Secl ID No．32                                                                       
GCCACGCCCACTCCATCATGCGGGGAGGGGATGGGCAGACCCTCCAGAAAGAAGCTCCCTGGGGTGCAGGTTAACAGCTTTCCCAGACACAGCCAGTACTAGAGTGAGGTGAATAAGACATCCTCCTTGCTTGTGAAATTTAGGAAGTGCCCCCAAACATCAGTCATTAAGATAAATAATATTGAATGCACTTTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTTTGCTTTTTAGGGCCTAATCTGCAGCatatggaagttcccaggctacaagtcgaaccagagctgcagctgccagcctacatcacagccacagcaacaccagatccgagccacatctgtgactaacactgcagttcacagcaacgccagatccttaacccattgagtgaggccagggatcaaacccacatcctcatggatactagtctggttcgtaaaccactgagccaCAAGGGGAACTCCTGAATGCAATATTTTTGAAAATTGAAATTAAATCTGTCACTCTTTCACTTAAGAGTCCCCTTAGATTGGGGAAAATTTAAATATCTGTCATCTTAGTGCATCTTTGCTCATATGATGTGAATAAAATCCCAAAATCCATATGAATGAAGCATCAAAATGTACATGAAGTCAGCCTGACCCTGCACTGCCCTCACTTGCCTCATGTACCCCCCACCTCAAAGGAAGATGCAGAAAGGAGTCCAGCCCCTACACCGCCACCTGCCCCCACCACTGGAGCCCCTCAGGTCTCCCACCTCCTTTTCTGAGCTTCAGTCTTCCTGTGGCATTGCCTACCTCTACAGCTGCCCCCTACTAGGCCCTCCCCCTGGGGCTGAGCTCCAGGCACTGGACTGGGAAAGTTAGAGGTTAAAGCATGGAAAATTCCCAAAGCCACCAGTTCCAGGCTGCCCCCCACCCCACCGCCACGTCCAAAAAGGGGCATCTTCCCAGATCTCTGGCTGGTATTGGTAGGACCCAGGACATAGTCTTTATACCAATTCTGCTGTGTGTCTTAGGAAAGAaactctccctctctgtgcttcagtttcctcatcaataaaAGGAGCAGGCCAGGTTGGAGGGTCTGTGACGTCTGCTGAAGCAGCAGGATTCTCTCTCCTTTTGCTGGAGGAGAACTGATCCTTCACCCCCAGGATCAACAGAGAAGCCAAGGTCTTCAGCCTTCCTGGGGACCCCTCAGAGGGAACTCAGGGCCACAGAGCCAGACCCTGATGCCAGAACCTTTGTCATATGCCCAGACGGAGACTTCATCCCCCTCCTCCTCAGACCCTCCAGGCCCCAACAGTGAGATGCTGAAGATATTAAGAGAAGGGCAAGTCAGcTTAAGTTTGGGGGTAGAGGGGAACAGGGAGTGAGGAGATCTGGCCTGAGAGATAGGAGCCCTGGTGGCCACAGGAGGACTCTTTGGGTCCTGTCGGATGGACACAGGGCGGCCCGGGGGCATGTTGGAGCCCGGCTGGTTCTTACCAGAGGCAGGGGGCACCCTCTGACACGGGAGCAGGGCATGTTCCATACATGACACACCCCTCTGCTCCAGGGCAGGTGGGTGGCGGCACAGAGGAGCCAGGGACTCTGAGCAAGGGGTCCACCAGTGGGGCAGTTGGATCCAGACTTCTCTGGGCCAGCGAGAGTCTAGCCCTCAGCCGTTCTCTGTCCAGGAGGGGGGTGGGGCAGGCCTGGGCGGCCAGAGCTCATCCCTCAAGGGTTCCCAGGGTCCTGCCAGACCCAGATTTCCGACCGCAGCCACCACAAGAGGATGTGGTCTGCTGTGGCAGCTGCCAAGACCTTGCAGCAGGTGCAGGGTGGGGGGGTGGGGGCACCTGGGGGCAGCTGGGGTCACTGAGTTCAGGGAAAACCCCTTTTTTCCCCTAAACCTGGGGCCATCCCTAGGGGAAACCACAACTTCTGAGCCCTGGGCAGTGGCTGCTGGGAGGGAAGAGCTTCATCCTGGACCCTGGGGGGGAACCCAGCTCCAAAGGTGCAAGGGGCCCAGGTCCAAGGCTAGAGTGGGCCAAGCACCGCAATGGCCAGGGAGTGGGGGAGGTGGAGCTGGACTGGATCAGGGCCTCCTTGGGACTCCCTACAC          
 
CCTGTGTGACATGTTAGGGTACCCACACCCCATCACCAGTCAGGGCCTGGCCCATCTCCAGGGCCAGGGATGTGCATGTAAGTGTGTGTGAGTGTGTGTGTGTGGTGTAGTACACCCCTTGGCATCCGGTTCCGAGGCCTTGGGTTCCTCCAAAGTTGCTCTCTGAATTAGGTCAAACTGTGAGGTCCTGATCGCCATCATCAACTTCGTTCTCCCCACCTCCCATCATTATCAAGAGCTGGGGAGGGTCTGGGATTTCTTCCCACCCACAAGCCAAAAGATAAGCCTGCTGGTGATGGCAGAAGACACAGGATCCTGGGTCAGAGACAAAGGCCAGTGTGTCACAGCGAGAGAGGCAGCCGGACTATCAGCTGTCACAGAGAGGCCTTAGTCCGCTGAACTCAGGCCCCAGTGACTCCTGTTCCACTGGGCACTGGCCCCCCTCCACAGCGCCCCCAGGCCCCAGGGAGAGGCGTCACAGCTTAGAGATGGCCCTGCTGAACAGGGAACAAGAACAGGTGTGCCCCATCCAGCGCCCCAGGGGTGGGACAGGTGGGCTGGATTTGGTGTGAAGCCCTTGAGCCCTGgAACCCAAcCACAGCAgGGCAGTTGGTAGATGCCATTTGGGGAGAGGCCCCAGGAGTAAGGGCCATGGGCCCTTGAGGGGGCCAGGAGCTGAGGACAGGGACAGAGACGGCCCAGGCAGAGGACAGGGCCATGAGGGGTGCACTGAGATGGCCACTGCCAGCAGGGGCAGCTGCCAACCCGTCCAGGGAACTTATTCAGCAGTCAGCTGGAGGTGCCATTGACCCTGAGGGCAGATGAAGCCCAGGCCAGGCTAGGTGGGCTGTGAAGACCCCAGGGGACAGAGCTCTGTCCCTGGGCAGCACTGGCCTCTCATTCTGCAGGGCTTGACGGGATCCCAAGGCCTGCTGCCCCTGATGGTAGTGGCAGTACCGCCCAGAGCAGGACCCCAGCATGGAAACCCCAACGGGACGCAGCCTGCGGAGCCCACAAAACCAGTAAGGAGCCGAAGCAGTCATGGCACGGGGAGTGTGGACTTCCCTTTGATGGGGCCCAGGCATGAAGGACAGAATGGGACAGCGGCCATGAGCAGAAAATCAGCCGGAGGGGATGGGCCTAGGCAGACGCTGGCTTTATTTGAAGTGTTGGCATTTTGTCTGGTGTGTATTGTTGGTATTGATTTTATTTTAGTATGTCAGTGACATACTGACATATTATGTAACGACATATTATTATGTGTTTTAAGAAGCACTCCAAGGGAACAGGCTGTCTGTAATGTGTCCAGAGAAGAGAGCAAGAGCTTGGCTCAGTCTCCCCCAAGGAGGTCAGTTCCTCAACAGGGGTCCTAAATGTTTCCTGGAGCCAGGCCTGAATCAAGGGGgTCATATCTACACGTGGGGCAGACCCATGGACCATTTTCGGAGCAATAAGATGGCAGGGAGGATACCAAGCTGGTCTTACAGATCCAGGGCTTTGACCTGTGACGCGGGCGCTCCTCCAGGCAAAGGGAGAAGCCAGCAGGAAGCTTTCAGAACTGGGGAGAACAGGGTGCAGACCTCCAGGGTCTTGTACAACGCACCCTTTATCCTGGGGTCCAGGAGGGGTCACTGAGGGATTTAAGTGGGGGACCATCAGAACCAGGTTTGTGTTTTGGAAAAATGGCTCCAAAGCAGAGACCAGTGTGAGGCCAGATTAGATGATGAAGAAGAGGCAGTGGAAAGTCGATGGGTGGCCAGGTAGCAAGAGGGCCTATGGAGTTGGCAAGTGAATTTAAAGTGGTGGCACCAGAGGGCAGATGGGGAGGAGCAGGCACTGTCATGGACTGTCTATAGAAATCTAAAATGTATACCCTTTTTAGCAATATGCAGTGAGTCATAAAAGAACACATATATATTTAAATTGTGTAATTCCACTTCTAAGGATTCATCCCAAGGGGGGAAAATAATCAAAGATGTAACCAAAGGTTTACAAACAAGAACTCATCATTAATCTTCCTTGTTGTTATTTCAACGATATTATTATTATTACTATTATTATTATTATTATTttgtctttttgcattttctagggccactcccacggcatagagaggttcccaggctaggggtcaaatcggagctacagctgccggcctacgccagagccacagcaacgcaggatctgagccacagcaatgcaggatctacaccacagctcatggtaacgctggatccttaacccaatgagtgaggccagggatcgaacctgtaacttcatggttcctagtcggattcattaaccactgagccacgacaggaactccAACATTATTAATGATGGGAGAAAACTGGAAGTAACCTAAATATCCAGCAGAAAGGGTGTGGCCAAATACAGCATGGAGTAGCCATCATAAGGAATCTTACACAAGCCTCCAAAATTGTGTTTCTGAAATTGGGTTTAAAGTACGTTTGCATTTTAAAAAGCCTGCCAGAAAATACAGAAAAATGTCTGTGATATGTCTCTGGCTGATAGGATTTTGCTTAGTTTTAATTTTGGCTTTATAATTTTCTATAGTTATGAAAATGTTCACAAGAAGATATATTTCATTTTAGCTTCTAAAATAATTATAACACAGAAGTAATTTGTGCTTTAAAAAAATATTCAACACAGAAGTATATAAAGTAAAAATTGaggagttcccatcgtggctcagtgattaacaaacccaactagtatccatgaggatatggatttgatccctggccttgctcagtgggttgaggatccagtgttgctg 
 
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Seq ID No.33 agatctttaaaccaccgagcaaggccagggatcgaacccgcatcctcatgaatcctagttgggttcgttaaccgctgaaccacaatgggaactcctGTCTTTCACATTTAATTCACAACCTCTCCAGGATTCTGGGGGTGGGTGGGGAATCCTAGGTACCCACTGGGAAAGTAATCCAAGGGGAGAGGCTCACGGACTcTAGGGATCGGCGGAGGAGGGAAGGTATCTCCCAGGAAACTGGCCAGGACACATTGGTCCTCCGCCCTCCCCTTCCTCCCACTCCTCCTCCAGACAGGACTG
 
TGCCCACCCCCTGCCACCTTTCTGGCCAGAACTGTCCATGGCAGGTGACCTTCACATGAGCCCTTCCTCCCTGCCTGCCCTAGTGGGACCCTCCATACCTCCCCCTGGACCCCGTTGTCCTTTCTTTCCAGTGTGGCCCTGAGCATAACTGATGCCATCATGGGCTGCTGACCCACCCGGGACTGTGTTGTGCAGTGAGTCACTTCTCTGTCATCAGGGCTTTGTAATTGATAGATAGTGTTTCATCATCATTAGGACCGGGTGGCCTCTATGCTCTGTTAGTCTCCAAACACTGATGAAAACCTTCGTTGGCATAGTCCCAGCTTCCTGTTGCCCATCCATAAATCTTGACTTAGGGATGCACATCCTGTCTCCAAGCAACCACCCCTCCCCTAGGCTAACTATAAAACTGTCCCAATGGCCCTTGTGTGGTGCAGAGTTCATGCTTCCAGATCATTTCTCTGCTAGATCCATATCTCACCTTGTAAGTCATCCTATAATAAACTGATCCATTGATTATTTGCTTCTGTTTTTTCCATCTCAAAACAGCTTCTCAGTTCAGTTCGAATTTTTTATTCCCTCCATCCACCCATACTTTCCTCAGCCTGGGGAACCCTTGCCCCCAGTCCCATGCCCTTCCTCCCTCTCTGCCCAGCTCAGCACCTGCCCACCCTCACCCTTCCTGTCACTCCCTAGGACTGGACCATCCACTGGGGCCAGGACACTCCAGCAGCCTTGGCTTCATGGGCTCTGAAATCCATGGCCCATCTCTATTCCTCACTGGATGGCAGGTTCAGAGATGTGAAAGGTCTAGGAGGAAGCCAGGAAGGAAACTGTTGCATGAAAGGCCGGCCTGATGGTTCAGTACTTAAATAATATGAGCTCTGAGCTCCCCAGGAACCAAAGCATGGAGGGAGTATGTGCCTCAGAATCTCTCTGAGATTCAGCAAAGCCTTTGCTAGAGGGAAAATAGTGGCTCAACCTTGAGGGCCAGCATCTTGCACCACAGTTAAAAGTGGGTATTTGTTTTACCTGAGGCCTCAGCATTATGGGAACCGGGCTCTGACACAAACACAGGTGCAGCCCGGCAGCCTCAGAACACAGCAACGACCACAAGCTGGGACAGCTGCCCCTGAACGGGGAGTCCACCATGCTTCTGTCTCGGGTACCACCAGGTCACCATCCCTGGGGGAGGTAGTTCCATAGCAGTAGTCCCCTGATTTCGCCCCTCGGGCGTGTAGCCAGGCAAGCTCCTGCCTCTGGACCCAGGGTGGACCCTTGCTCCCCACTACCCTGCACATGCCAGACAGTCAAGACCACTCCCACCTCTGTCTGAGGCCCCCTTGGGTGTCCCAGGGCCCCCGAGCTGTCCTCTACTCATGGTTCTTCCACCTGGGTACAAAAGAGGCGAGGGACACTTTTCTCAGGTTTGCGGCTCAGAAAGGTACCTTCCTAGGGTTTGTCCACTGGGAGTCACCTCCCTTGCATCTCAATGTCAGTGGGGAAAACTGGGTCCCATGGGGGGATTAGTGCCACTGTGAGGCCCCTGAAGTCTGGGGCCTCTAGACACTATGATGATGAGGGATGTGGTGAAAAACCCCACCCCAGCCCTTCTTGCCGGGACCCTGGGCTGTGGCTCCCCCATTGCACTTGGGGTCAGAGGGGTGGATGGTGGCTATGGTCAGGCATGTTTCCCATGAGCTGGGGGCACCCTGGGTGACTTTCTCCTGTGAATCCTGAATTAGCAGCTATAACAAATTGCCCAAACTCTTAGGCTTAAAACAACACACATTTATTCCTCTGGGTCCCAGGGTCAGAAGTCCAAAATGAGTCCTATAGGCTAAATTTGAGGTGTCTCTGGGTTGAGCTCCTCCTGGAAGCCTTTTCCAGCCTCTAGAGTCCCAAGTCCTTGGCTCTGGGCCCCTCCCTCAAGCTTCAAAGCCACAGAAGCTTCTAATCTCTCTCCCTTCCCCTCTGACCTCTGCTCCCATCCTCATACCCTGTCCCCTCACTCTGACCCTCCTGCCTCCCTCTTTCCCTTATAAAGACCCTGCATGGGGCCACGGAGATAATCCAGGGTAATCGCCCCTCTTCCAGCCCTTAACTCCATCCCATCTGCAAAATCCCTGTCACCCCATAATGGACCTACTGATGGTCTGGGGGTTAGGACGTGGACAACTTGGGGCCTTATTCATCTGATCACAACTCCAGTTCCCAGACCCCCAGACCCCCGGGCATTAGGGAAACTTCTCCCAGTTCCTCTCCCTCTGTGTCCTGCCCAGTCTCCAGGATGGGCCACTCCCGAGGGCCCTTCAGCTCAGGCTCCCCCTCCTTTCTCCCTGGCCTCTTGTGGCCCCATCTCCTCCTCCGCTCACAGGGAGAGAACTTTGATTTCAGCTTTGGCTCTGGGGCTTTGCTTCCTTCTGGCCATTGGCTGAAGGGCGGGTTTCTCCAGGTCTTACCTGTCAGTCATCAAACCGCCCTTGGAGGAAGACCCTAATATGATCCTTACCCTACAGATGGAGACTCGAGGCCCAGAGATCCTGAGTGACCTGCTCACATTCACAGCAGGGACTGAACCCCAGTCACCTACCCAACTCCAGGGCTCAGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTgccttttcgagggccgctcccgcaacatatggagatttccaggctaggggtctaattggagcagtcgacactggcctaagccaaagccacagcaacaagggcaagccgcttctgcagcctataccacagctcacggcaatgccggatccttaacccactgagcaa 
 
agccagggattgaacctgcaacctcatgtttcctagtcaaatttgttaaccactgacccatgacgggaactcccAGGGCTCAGCTCTTGACTCCAGGTTCGCAGCTGCCCTCAAAGCAATGCAACCCTGGCTGGCCCCGCCTCATGCATCCGGCCTCCTCCCCAAAGAGCTCTGAGCCCACCTGGGCCTAGGTCCTCCTCCCTGGGACTCATGGCCTAAGGGTACAGAGTTACTGGGGCTGATGAAGGGACCAATGGGGACAGGGGCCTCAAATCAAAGTGGCTGTCTCTCTCATGTCCCTTCCTCTCCTCAGGGTCCAAAATCAGGGTCAGGGCCCCAGGGCAGGGGCTGAGAGGGCCTCTTTCTGAAGGCCCTGTCTCAGTGCAGGTTATGGGGGTCTGGGGGAGGGTCAATGCAGGGCTCACCCTTCAGTGCCCCAAAGCCTAGAGAGTGAGTGCCTGCCAGTGGCTTCCCAGGCCCAATCCCTTGACTGCCTGGGAATGCTCAAATGCAGGAACTGTCACAACACCTTCAGTCAGGGGCTGCTCTGGGAGGAAAAACACTCAGAATTGGGGGTTCAGGGAAGGCCCAGTGCCAAGCATAGCAGGAGCTCAGGTGGCTGCAGATGGTGTGAACCCCAGGAGCAGGATGGCCGGCACTCCCCCCAGACCCTCCAGAGCCCCAGGTTGGCTGCCCTCTTCACTGCCGACACCCCTGGGTCCACTTCTGCCCTTTCCCACCTAAAACCTTTAGGGCTCCCACTTTCTCCCAAATGTGAGACATCACCACGGCTCCCAGGGAGTGTCCAGAAGGGCATCTGGCTGAGAGGTCCTGACATCTGGGAGCCTCAGGCCCCACAATGGACAGACGCCCTGCCAGGATGCTGCTGCAGGGCTGTTAGCTAGGCGGGGTGGAGATGGGGTACTTTGCCTCTCAGAGGCCCCGGCCCCACCATGAAACCTCAGTGACACCCCATTTCCCTGAGTTCACATACCTGTATCCTACTCCAGTCACCTTCCCCACGAACCCCTGGGAGCCCAGGATGATGCTGGGGCTGGAGCCACGACCAGCCCACGAGTGATCCAGCTCTGCCAATCAGCAGTCATTTCCCAAGTGTTCCAGCCCTGCCAGGTCCCACTACAGCAGTAATGGAGGCCCCAGACACCAGTCCAGCAGTTAGAGGGCTGGACTAGCACCAGCTTTCAAGCCTCAGCATCTCAAGGTGAATGGCCAGTGCCCCTCCCCGTGGCCATCACAGGATCGCAGATATGACCCTAGGGGAAGAAATATCCTGGGAGTAAGGAAGTGCCCATACTCAAGGATGGCCCCTCTGTGACCTAACCTGTCCCTGAGGATTGTACTTCCAGGCGTTAAAACAGTAGAACGCCTGCCTGTGAACCCCCGCCAAGGGACTGCTTGGGGAGGCCCCCTAAACCAGAACACAGGCACTCCAGCAGGACCTCTGAACTCTGACCACCCTCAGCAAGTGGCACCCCCCGCAGCTTCCAAGGCAC                                    
 
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CCCTCCAGTGGCTGGACACTGAGGCCACACTGGGGCACCCTGTGGAGATCt                                                 
 
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GGTCTTTGAGGCTGGGCCCCACCCTCTCAGCTTTCACAGGAGAAACAGAGGCCCACAGGGGGCAAAGGACTTGCCAGACTCACAATGAGCCCAGCAGCTGGACTCAAGGCCCAGTGTTCGGCCCCACAACAGCACTCACGTGCCCTTGATCGTGAGGGGCCCCCTCTCAGCCAGGCATTCAGACCTGTGACCTGCATCTAAGATTCAGCATCAGCCATTCTGAGCTGAAGAGCCCTCAGGGTCTGCAGTCAAGGCCACAGGGCCAGACCTCCAACGGCCAGACATCCCAGCCAGATTCCTTTCTGGTCAATGGGCCCCAGTCTGGCTTGGCTCCTGCAGGCCCAGTGCCGCCTTCTTCCCCTGGGCCTGTGGAGTCCAGCCTTTCAGTTTCCCACCCACATCCTCAGCCACAATCCAGGCTCAGAGGCAATGTCCGTGGGCAGCCCCTGTGTGACCCCTCTGTGGGTGATCCTCAGTCCTACCCTTAGCAGACAGCGCATGAGGGGCCCTCTTGAACCTGAGGGATACTCCATGTCGGAGGGGAGAAGCTGGCCTTCCCCACCCCCACTTCCAGGCCTTGGGGAGCAGAGAAAGACCCCAGACCTGGGTCCCTTCTAACAGGCCAGGCCCCAGCCCAGCTCTCCACCAGCCCCAGGGGCCTCGGGTCCACGCCTGGGGACTGGAGGGTGGGCCTGTCAGGCGCTGACCCAGAGGCAGGACAGCCAAGTTCAGGATCCCAGCCAGGTGGTCCCCGTGCACCATGCAGGGGTGTCACCCACACAGGGGTGTTGCCACCCTCACCTGACTGTCCTCATGGGCCACATGGAGGTATCCTGGGTTCATTACTGGTCAACATACCCGTGTCCCTGCAGTGCCCCCTCTGGcgcacgcgtgcacgcgcacacgcacacactcatacaGAGGCTCCAGCCAACAGTGCCCTCTAGTAGGCACTGCTGTCACTTCTCTAAAAGGTCGCAATCATACTTGTAAAGACCCAAGATTGTTCAGAAATCCCAGATGGAGAAGTCTGGAAAGATCtTTTTCTCCTTTCACGGGCTGGGGAAATGTGACCTGGCCAAGGTCACACAGCAAGTGGTGGAACCCTGGCCCCTGATTCCAGCTCATTCCAGTTCCCAAGGCCCTGCCAGAGCCCAGAGGCTGGGCCCTCTGGGGCAGAGGAGCTGGGGTCCTCCCCCCTACACAGAGCACACAGCCCCGCAAGAGAGAAGAGACACCTTGGGGAGAGGAATCTCCAGACCAGAGATCCCAGTATGGGTCTCCTCTATGCTGACGGGATGGGATGTCAAGAGGGGAGGGGGCTGGGCTTTAGGGAAACACACAAAAATCGCTGAGAACACTGACAGGTGCGACACACCCACCCCTAATGCTAACCTGTGGCCCATTACTCAgatct                                 
 
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GCCCCTCCCAGACCCCGCTCTGGGCAGAACCTGGGAAGGGATGTGGCCATCGGGGGATCCCTCCAGGCCATCTCCTCAGATGGGGGCTGGTCGACTAGCTTCTGAGTCCTCCAAGGAACCGGGTCCTTCTAGTCATGACTCTGCCCAGATGAAGAAGGAGAGCACTTCTCTCCATCAGGAGGATCTGAGCTTCTCTTAATTAGAATCAGCTCCTTGGCTTCTACCCCTTAAAAAAAGGTACAGAAACTTTGCACCTTGATCCAGTATCAGGGGAATTTATCAATCAATGTGGGAGAAATTGGCATCTTTACCACACTGAATCTTTCAATCCATGAATATCCTCTCTCTCTTCCATGCATAGGTTTTAATAATTCTCAATGGAGTTTAATGTAAGTTTTCCTCATAGACAATTGCCTTTGGACATCTCTTTAGACTCATCTCTAGTAAACTGATATTCTTAATGCAATTATAAAATGTATCCTGCTTAATGTTATTTTCTATTCATTTGCTGTTATATAGAGATACAATGAGTTTCCACATTTGAAACTGGATCTGGTAAATTGGCTACCCTTTTTTTATAGATTCTATTAATTTTTATACATTCTGTGGGACTTGCTACATACTTAATCATGTCACCTGTGAAGAATGACAATTTGGTTGCTACCCTCCCAATTCTTATATGTCTCATTTCTTTCCCTCTGCTGGTACTCTGGCAGCAGCAGGGAAGATAATGGGCCTCCTTATCTTGTCACAAAAGGATGTTTTTAAAGATTTCGTTATAAAACATAACGCTTTCTGGTTTTCTTTAAAGATTCTCTCACCAGCTTAAGAAAATTTTCTTATACTCTGTATGATAAATGGGTTTTTGACAATCATTTGTTGCATTTTACCTAGTGTTTTCTCTGCATCTTTATATGCTTTTTCTCCTTTAATCCTGAAAATTGTTTCGATTTTTCTAACATTGAACCAATCTTACATTCCTGGAATGGATGGACCAGACTAGTCCACATGTTTATTCTGCCCAATGGCTAGATTTTGTGTTCaatattttgttcagaatgtttgcatctatattcttGAGTGAGACAGAGCTGCCCTTGTTAGGTTTCACAACCGAGGTTGTGTTAGCTTCATAAAAATGAGACGTTTATCTCTAAAAGAATTGTTTCGCTTCTCTGGATGAATTTGTGTAAGGTTAGAATTGCTTACCAGTGAagatctCGGGgCCAGTTCTTCTTTAGGGGAAGATTTTCAACAATTAAGCTCAATGCCTTTAGAAGAACTGAGAGTTTCTATTATTTCTTGAGTTAAATATATGTATTTAATTAGACTTTCTAGGAATAGTCTCATTTCATCTCAAATAATTGACATATGCTATTAAAGCAGATTCTCATGAACCATTGTAGGTATTCCAGGTCTAGAAAAATGTTCCCCTTTGCATCCCTAATGTGTTTAATTTTCACCTTCTTTCTTTTGTTCTTGAGAAATTCACCAAATCATTTTCAATTTCAGTCATATCCCAAAGCAACCAACTCTCTACCTTCTTCTTTTATCATCCCTGCTGGATTTTTGTTATCTACTTCTTCAGTATTTGTTCTTCCCTTTCTTCTATTCCTCATTCCATTTTTCCCTTGTTTTCTAACTTTCTGAGATATATGCTTAGTTCCTTCATTTGAAGCCTTTTTATTTTCTTTTTTTTTTTTTGGTCTTTTTGTCTTTTGTTGTTGTTGTTGTGCTATTtCTTGGGCCGCTCCCGCGGCATATGGAGGTTCCCAGGCTAGGAGTCGAATCGGAGCTGTAGCCACCGGCCTACGCCAGAGCCACAGCAATGCGGGATCCGAGCCGCGTCTGCAACCTACACCACAGCTCATGGCAACGCCGGATCGTTAACCCACTGAGCAAGGGCAGGAACCGAACCCGCAACCTCATGGTTCCTAGTCGGATTCGTAACCACTGTGCCACAACAGGAACTCCGCCTTTTTATTTTCTATAAAAATTTCTATGTACATTTTAAGGTTATAGGTTTCCTTCTATGTACCCCATTGGCTGTATCCTCAGGGTTCTGTGGAGTGATTTCATTATTGTTCAAGTTCAATATGTCTTCTGATTTTCCAATTTGAATACCTCTCTAAATCAGTAGGTGAATATTTCTTTTTCTTTTTCTTTTCTTTTCTTCTTTTTTTTTTTCTTTCAGCCAGGTCCATGGCATGCAGAAATTCCCAGGCCAGGAATCAAACTCTCACCATGGCAGTGACAATGTCGGATCCTTTACCCACTAGGCCACCAGGGAACTCTGGGAGCATATGTTTTTATTTCCCCACATCTGAGGATGCCTAGTATGTCTTCATTATTGATTTCTAGTTTGCCACTGATTTCTAGTATTTTGCTCATAGAGTGTATGCTCAATGGTTTTGGTCATTTGAAATGTATTTAGRCCTGCTTTATGACCCAGTATGTGGTCAGTTTTGTCAATGTTCCTTTTCTGCTTGAAGAGAACCTACATGCTGTAACTCTGGGTGCATGTTCTGTATATAAGTCTATAGGCTGAGCCGGGGGAGCCTTCTAATCTGCCGTTATCTTCTTCGAGTTATTCTAGGTACTATTTCTTAGCCATAAACCTTTAAATTCTGATATCAATATAATGACCCCAGCCCGCTTAGGGTCGGCACTTCATGTTATCTTTTTCCATCCATTTAATCCCTCCCCACTGTTTTGGCCACACCCGTGGGATATGGGAGTTCCTGGGCCAAGGATCaGATCTGAGCCGCAGCTGCCACCTATGCCACAGCAgcagcaatga 
 
tggatctttaacccactgcaccacactggggattgaacccaagcctcagcagcaacccaagctactgcagagacaacaccagatccttaacctgctgtgccatagcgggaaTTTCCATCCATTTACTTTCAAGCCAGCTGAATAACCTAGCCCACCATGCCTGGACATGGGTGCTCTGCTTCAAATGATTTTGTTCAGTCAGCATCCATCTCTGAAATGTGTGCCAAGCATTTATATGCATGCAAGAGTCATGTTGGCACTTCTATCATTTCCAACAGTTCAGTAGCCTTTGTATCATGACATTTCTTGGCCTTTTCTCTACAATATTTGAGGCTGAGCAGACTGGCCGTGCCCCTGTCCATGCTTCCAGAGCCTGTGTGCAGACTTCTGCTCTAGACAGAGACAGCTAACCATCCTGCAGTGCCCAGAAAACCCAACTCAAAGACCCTCAAGTAAGGAAGGATTTATTGGCTCACGTAATCTGGAATCCAGGCATGGGGTATTCAGGGCCACCTGAACCAGAGGCCCTGGCCCTGTTCTCTAAGCTTCTTCCTGCCCTGCCCTCGTTCTGGAAGTGACCCTGAAGGACAGCAATGAAGGGCAGCTCCCCCAGGGACAGATGACTGAGAGGTCCATTTCAAGTCCAACTTGGCCTAGATTGAGAGGCAGCAAGAAATATGGACCTACAGTGAGTCACAGGATTTACCAGTGGTTTGGCTGGGTTGTCAGTGTTACAGGCTAAACATTTGGGTCCCTCCAAAATTAACATGTTGCCACTCTAACCACCAAAATCatggtatttgggggtggggcccttggaggtaattaggtttagaaAGAATGAAGAGGGGGCCCTTGTGATGGGACTAGTGCCTTTATAGAGAGAGAAGAGAGAGGG  
 
Seq ID No.39 CACCTCATCCCCAACCACCTGGATGGTGGCAAGTGGCAGGCTGAGAGGCTGCATATGAGCTCATCAAGAGGGTCCCCACCCCACAGAGGCTGACCCAGCTGCCACTGCCACCTAGTGGCTGATCGGCCAAGAGCAGGAGCCCCAGGGGCAGCTCCATTCCCTGGGGCGGCCAGGGAACCACCTGGTGGTAGGACAATTCCATTGCACCTCATCCATCAGGAAAAGGTTTGCCTTCCCTGGCAGTAATGCATCTTCCCATAACATGGTCCCTGGCCTCTTGGAATGGCTTGGCCACCGTCATGGCCTCACCCACAAAGCCTTGTGTCTCAGCAAGGAACTTATTCCACAGCAAAGGACTTGCAGCCTGGAATGAACTGGTCTGACTACATACCCCATTGCCCAGAAGTAGGTGGTCTATTGCAAAGTGGAGTGGCTTACCCAAGACTCAGTTGTGCCCAAGTTGAGAGATAGCATCCTAAAATATGGGCTTATGTCTCACTGGCTGAGGTTTATTCTTTGAATCAAAGACAATTATATGGTGTGGTCCCCCCAGAGATAGAATACATGAGTCTGGGAATCAAGGGATAGAAGTAAGAAGAGATTTTGTCACCATTAATCCCAATAACTCGCCCAAAGAATATTTGCTTTCTGTCCTGGCAGCTCTGCTGCTTTGGCAATAACTTCCTAGAATATAATGTCTCCACCAGGGGACTCCACAACGGTTCCATTGATTTGAAGCCAATGGGCAGAGGAGGGGCTGCCTTACTGGTCGGACTGGTCAGCCCTGATTACTAAGGAGAAATCAGGCAACTTCAACAAAACTAAGGCAGGGGGGACTTTGTCTAGAACCCAAAGCACTAAGCATCTTAGTACTTTTTAGTTCTCAGAGCCTCCAAGAACAAAGATTTAGCCCCTCAGCACCACCAGGTAAAGAACAGGTAAATCCAGCTGAGGACAAGAGAAATATTGAATGGATAGAGGAAGAAAGAAATTATAGATATCAACTATGGCCTCATGACTAGAGTCTCCAGATTAAGCGGAATAAAAATACAGATGATTaGATCTGAACATCAGGCCAAACAACGAACAACAGTTTAAGTGCGACCTAGGCAATATTTGGGACATACTTATACTAAAATTTTTTCGCTATTTGAGCATCCTGTATTTTATCTGGCAACTTTATTCATCCCTAGCGAAAAAGGAACTGTGGTAACTTAGTGTATTTTTACTTTGCTCATTATTGTGTATATACCTACTTGTATTTATCAATCATATTTACTCTGTTCTCAGTATTACTTTATATAGCAGTTGGTGGTGATGGTTAGCAACATATTCAGTGGAACTGTGACTGAATTTGAGGAGAAATTAACAGAGTTGGCTGTGGCTACAATAACCCTTCGGGACATGTGTCCCCTCATTTTGGGGAGATGGTTagatctCTGGGTAAATGTTAGGGCATCTGAGCCAGAAACCAAGATTTTGCCAGCTGGTGCAATGTCAGATTTTACCAGCAGAGGGTGCCAGAGGAATGCGGCAAAACCCGAGTGCCAGAAAGCACCTCCCTGTTTTCCAGCTTTTCTTCCTTTTTATTTATTTTATTTACGGCCCAGGAGTCCGTAATAGCGCTGAGGATGGCCCAGGCTCTTCTCAGCAGCCCTGACTGACTAGTTCAGCAATGCGCTCAGGCCCCATCTGGCCACCGGGCAGCCTCTTCTGTGGTAGCTCCAGCCTCAGCCAGTGCAAAAGGCTA
 
CCCTACACTGGCGCCACTTCTACAATCAGCACTGGCCACACCCTCCACGCCATCCGGCACGGAGCCAGGTGATCTGCCGGCCAGATTGCAGTTCGTGCTGCCTGAGTCCAGGTGATTACACTGGCTGCATCTTTTCTTTCTGGACCAtTCattccattttttt                                     
牛λ轻链
在另一实施方案中，提供了编码牛λ轻链基因座的核酸序列，其可以包括至少一个连接区-恒定区对和/或至少一个可变区，如SeqID No.31表示。在Seq ID No.31中，牛λC可以在残基993-1333处找到，J-C对可以在残基33848-35628的互补序列处找到，其中C是33848-34328的互补序列，而J是35599-35628的互补序列，V区可以在残基10676-10728、11092-11446、15088-15381、25239-25528、29784-30228和51718-52357(或者其互补序列)处找到。Seq ID No.31可以见Genbank编号AC117274。还提供了载体和/或寻靶构建体，其含有Seq ID No.31的全部或者部分，如Seq ID No.31的至少100、250、500、1000、2000、5000、10000、20000、500000、75000或100000个连续核苷酸，以及含有被破坏的牛λ基因的ceels和动物。
 
Seq ID No31 1    tgggttctat gccacccagc ttggtctctg atggtcactt gaggccccca tctcatggca61   aagagggaac tggattgcag atgagggacc gtgggcagac atcagaggga cacagaaccc121  tcaaggctgg ggaccagagt cagagggcca ggaagggctg gggaccttgg gtctagggat181  ccgggtcagg gactcggcaa aggtggaggg ctccccaagg cctccatggg gcggacctgc241  agatcctggg ccggccaggg acccagggaa agtgcaaggg gaagacgggg gaggagaagg301  tgctgaactc agaactgggg aaagagatag gaggtcagga tgcaggggac acggactcct361  gagtctgcag gacacactcc tcagaagcag gagtccctga agaagcagag agacaggtac421  cagggcagga aacctccaga cccaagaaga ctcagagagg aacctgagct cagatctgcg481  gatgggggga ccgaggacag gcagacaggc tccccctcga ccagcacaga ggctccaagg541  gacacagact tggagaccaa cggacgcctt cgggcaaagg ctcgaacaca catgtcagct601  caaaatatac ctggactgac tcacaggagg ccagggaggc cacatcatcc actcagggga661  cagactgcca gccccaggca gaccccatca accgtcagac gggcaggcaa ggagagtgag721  ggtcagatgt ctgtgtggga aaccaagaac cagggagtct caggacagcg ctggcagggg781  tccaggctca ggctttccca ggaagatggg gaggtgcctg agaaaacccc acccaccttc841  cctggcacag gccctctggc tcacagtggt gcctggactc ggggtcctgc tgggctctca901  aaggatcctg tgtccccctg tgacacagac tcaggggctc ccatgacggg caccagacct961  ctgattgtgg tcttcttccc ctcgcccact ttgcaggtca gcccaagtcc acaccctcgg1021 tcaccctgtt cccgccctcc aaggaggagc tcagcaccaa caaggccacc ctggtgtgtc1081 tcatcagcga cttctacccg ggtagcgtga ccgtggtcta gaaggcagac ggcagcacca1141 tcacccgcaa cgtggagacc acccgggcct ccaaacagag caacagcaag tacgcggcca1201 gcagctacct gagcctgatg ggcagcgact ggaaatcgaa aggcagttac agctgcgagg1261 tcacgcacga ggggagcacc gtgacgaaga cagtgaagcc tcagagtgtt cttagggccc1321 tgggccccca ccccggaaag ttctaccctc ccaccctggt tccccctagc ccttcctcct
 
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引物
在另一实施方案中，提供了用于产生寻靶载体的3’和5’序列的引物。寡核苷酸引物能够与猪免疫球蛋白基因组序列，如上述Seq IDNos.1、4、29、30、12、25、15、16、19、28或31杂交。在具体实施方案中，引物在严格条件下与如上述的Seq ID Nos.1、4、29、30、12、25、15、16、19、28或31杂交。另一实施方案提供了能够与猪重链、κ轻链或λ轻链核酸序列，如上述Seq ID Nos.1、4、29、30、12、25、15、16、19、28或31杂交的寡核苷酸探针。多核苷酸引物或者探针可以具有与本发明的多核苷酸杂交的至少14个碱基、20个碱基、30个碱基或者50个碱基。探针或引物可以长为至少14个核苷酸，且在具体实施方案中，长为至少15、20、25、28或30个核苷酸。
在一个实施方案中，提供了扩增猪Ig重链的包括功能连接区(J6区)的片段的引物。在一个非限制性实施方案中，所扩增的重链片段可由Seq ID No 4表示并且用于扩增该片段的引物可以与J区的部分，如但不限于Seq ID No 2互补，以产生5’重组臂，并且与Ig重链μ恒定区的部分，如但不限于Seq ID No 3互补，以产生3’重组臂。在另一实施方案中，可以将猪Ig重链的区域(如但不限于Seq ID No4)亚克隆并装配到寻靶载体中。
在其他实施方案中，提供了扩增猪Igκ轻链的包括恒定区的片段的引物。在另一实施方案中，提供了扩增猪Igκ轻链的包括J区的片段的引物。在一个非限制性实施方案中，用于扩增该片段的引物可以与J区的部分，如但不限于Seq ID No 21或10互补，以产生5’重组臂，并且与恒定区3’的基因组序列，如但不限于Seq ID No 14、24或18互补，以产生3’重组臂。在另一实施方案中，可以将猪Ig重链的区域(如但不限于Seq ID No 20)亚克隆并装配到寻靶载体中。
II.免疫球蛋白基因的遗传寻靶
本发明提供了被基因修饰而灭活免疫球蛋白基因，如上述免疫球蛋白基因的细胞。可以被基因修饰的动物细胞可以从多种不同器官和组织得到，所述器官和组织如但不限于，皮肤、间充质、肺、胰、心脏、肠、胃、膀胱、血管、肾、尿道、生殖器官，和胚胎、胎儿或成年动物的完整或者部分的解聚制剂。在本发明的一个实施方案中，细胞可以选自，但不限于，上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B和T)、巨噬细胞、单核细胞、单核的细胞、心肌细胞、其他肌细胞、卵泡细胞、卵丘细胞、表皮细胞、内皮细胞、胰岛细胞、血细胞、血前体细胞、骨细胞、骨前体细胞、神经元干细胞、原始干细胞、肝细胞、角质形成细胞、脐静脉内皮细胞、主动脉内皮细胞、微血管内皮细胞、成纤维细胞、肝星状细胞、主动脉平滑肌细胞、心肌细胞、神经元、Kupffer细胞、平滑肌细胞、施旺细胞、和上皮细胞、红细胞、血小板、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、脂肪细胞、软骨细胞、胰岛细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、腮腺细胞、肿瘤细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞、红细胞、白细胞、巨噬细胞、上皮细胞、体细胞、垂体细胞、肾上腺细胞、毛细胞、膀胱状细胞、肾细胞、视网膜细胞、杆细胞、视锥细胞、心细胞、起博细胞、脾细胞、抗原呈递细胞、记忆细胞、T细胞、B细胞、浆细胞、肌细胞、卵巢细胞、子宫细胞、前列腺细胞、阴道上皮细胞、精细胞、睾丸细胞、生殖细胞、卵细胞、间质细胞、管周细胞、支持细胞、黄体细胞、颈细胞、子宫内膜细胞、乳房细胞、滤泡细胞、粘液细胞、纤毛细胞、非角化上皮细胞、角化上皮细胞、肺细胞、杯形细胞、柱状上皮细胞、鳞状上皮细胞、骨细胞、成骨细胞和破骨细胞。在一个备选实施方案中，可以使用胚胎干细胞。可以使用胚胎干细胞系或者可以从宿主如牛动物新鲜得到胚胎干细胞。细胞可以在合适的成纤维细胞-饲养层上生长或者在白血病抑制因子(LIF)存在下生长。
在具体实施方案中，细胞可以是成纤维细胞；在一个具体实施方案中，细胞可以是胎儿成纤维细胞。成纤维细胞是合适的体细胞类型，因为它们可以从发育中的胎儿和成年动物大量得到。这些细胞可以在体外容易地增殖，具有快的倍增时间，并且可以克隆繁殖以用于基因寻靶程序中。
寻靶构建体
同源重组
在一个实施方案中，免疫球蛋白基因可以通过同源重组遗传靶定在细胞中。同源重组允许内源基因的位点特异性修饰，且从而可以向基因组中工程改造新的改变。在同源重组中，引入的DNA与基因组中含有基本同源的DNA序列的位点相互作用并整合到该位点中。在非同源(“随机”或者“不法”)整合中，引入的DNA在基因组中的同源序列中没有发现但是整合到别处的许多可能的位置之一。通常，用高等真核生物细胞进行的研究已经揭示同源重组的频率远小于随机整合的频率。这些频率的比率对于“基因寻靶”具有直接的含义，所述基因寻靶取决于通过同源重组(即，外源“寻靶DNA”与基因组中对应的“靶DNA”之间的重组)的整合。
许多文献描述了同源重组在哺乳动物细胞中的用途。这些文献示例为Kucherlapati等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3153-3157，1984；Kucherlapati等人，Mol.Cell.Bio.5：714-720，1985；Smithies等人，Nature 317：230-234，1985；Wake等人，Mol.Cell.Bio.8：2080-2089，1985；Ayares等人，Genetics 111：375-388，1985；Ayares等人，Mol.Cell.Bio.7：1656-1662，1986；Song等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：6820-6824，1987；Thomas等人，Cell 44：419-428，1986；Thomas和Capecchi，Cell 51：503-512，1987；Nandi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：3845-3849，1988；和Mansour等人，Nature336：348-352，1988.Evans和Kaufman，Nature 294：146-154，1981；Doetschman等人，Nature 330：576-578，1987；Thoma和Capecchi，Cell 51：503-512，4987；Thompson等人，Cell 56：316-321，1989。
本发明可以使用同源重组以灭活细胞、如上述细胞中的免疫球蛋白基因。DNA可以包含特定基因座上基因的至少部分，其中在天然基因的至少一个拷贝、任选两个拷贝中引入改变，从而防止功能性免疫球蛋白的表达。所述改变可以是插入、缺失、替换或者其组合。当向被灭活的基因的仅一个拷贝中引入改变时，将具有靶基因的单个未突变的拷贝的细胞扩增并进行第二次寻靶步骤，其中该改变可以与第一次改变相同或不同，通常不同，并且当涉及缺失或者替换时，第二次改变可以与最初引入的改变的至少部分重叠。在该第二次寻靶步骤中，可以使用具有相同的同源性臂但是含有不同的哺乳动物选择标记的寻靶载体。对所得转化体筛选功能性靶抗原的不存在并且可以进一步筛选细胞的DNA以确保不存在野生型靶基因。备选地，通过将对突变杂合的宿主育种实现表型的纯合性。
寻靶载体
在另一实施方案中，还提供了核酸寻靶载体构建体。可以设计寻靶载体来完成细胞中的同源重组。可以将这些寻靶载体转化到哺乳动物细胞中以通过同源重组靶定有蹄类动物重链、κ轻链或者λ轻链基因。在一个实施方案中，寻靶载体可以含有3’重组臂和5’重组臂(即，侧翼序列)，其与有蹄类动物重链、κ轻链或者λ轻链基因组序列，例如，如上述的Seq ID Nos.1、4、29、30、12、25、15、16、19、28或31表示的序列同源。同源DNA序列可以包括与基因组序列同源的序列、尤其是连续序列的至少15bp、20bp、25bp、50bp、100bp、500bp、1kbp、2kbp、4kbp、5kbp、10kbp、15kbp、20kbp或50kbp。可以设计3’和5’重组臂从而使得它们在基因组序列的至少一个功能性可变区、连接区、多样性区和/或恒定区的3’和5’末端的侧翼。功能区的寻靶使得它失活，其导致细胞不能产生功能性免疫球蛋白分子。在另一实施方案中，同源DNA序列可以包括一个或多个内含子和/或外显子序列。除了核酸序列外，表达载体可以含有选择标记序列，如增强的绿色荧光蛋白(eGFP)基因序列，起始和/或增强子序列，聚腺苷酸尾序列，和/或提供构建体在原核和/或真核宿主细胞中表达的核酸序列。选择标记可以位于5’和3’重组臂序列之间。
通过向细胞中导入DNA可以产生细胞的靶定基因座的修饰，其中所述DNA与靶基因座具有同源性并且包括标记基因，从而允许选择包含整合的构建体的细胞。靶载体中的同源DNA将与染色体DNA在靶基因座重组。标记基因的两边侧翼可以是同源DNA序列、3’重组臂和5’重组臂。构建寻靶载体的方法已经在本领域中描述，参见例如，Dai等人，Nature Biotechnology 20：251-255，2002；WO00/51424。
可以制备各种构建体用于在靶基因座发生同源重组。构建体可以包括与靶基因座同源的序列的至少50bp、100bp、500bp、1kbp、2kbp、4kbp、5kbp、10kbp、15kbp、20kbp或50kbp。该序列可以包括免疫球蛋白基因的任何连续序列。
各种考虑可以涉及确定靶DNA序列的同源性程度，如靶基因座的大小、序列的可用性、在靶基因座上双交换事件的相对效率和靶序列与其他序列的相似性。
寻靶DNA可以包括这样的序列，其中基本上等基因的DNA将所需序列修饰置于基因组中将修饰的对应的靶序列两侧。基本上等基因的序列与对应的靶序列可具有至少约95％、97-98％、99.0-99.5％、99.6-99.9％或100％同一性(除了所需序列修饰外)。在具体实施方案中，寻靶DNA和靶DNA可以共有一段100％相同的至少约75、150或者500个碱基对的DNA序列。因此，寻靶DNA可以来自与将靶定的细胞系密切相关的细胞；或者寻靶DNA可以来自与被靶定的细胞相同的细胞系或者动物的细胞。
猪重链寻靶
在本发明的具体实施方案中，提供了用来靶定猪重链基因座的寻靶载体。在一个具体实施方案中，寻靶载体可以含有5’和3’重组臂，该重组臂含有与猪免疫球蛋白重链基因座的J6区的3’和5’侧翼序列同源的序列。因为J6区是猪免疫球蛋白重链基因座的唯一的功能性连接区，所以这将阻止功能性猪重链免疫球蛋白的表达。在特定实施方案中，寻靶载体可以含有5’重组臂和3’重组臂，所述5’重组臂含有与J6区5’的基因组序列，任选包括J1-4同源的序列，所述3’重组臂含有与J6区3’的基因组序列，包括μ恒定区同源的序列(“J6寻靶构建体”)，见例如图1。此外，该J6寻靶载体还可以含有位于5’和3’重组臂之间的选择标记基因，见例如，Seq ID No 5和图1。在其他实施方案中，5’寻靶臂可以含有J1 5’的序列，如Seq ID No.1和/或Seq ID No 4中描绘。在另一实施方案中，5’寻靶臂可以含有J1、J2和/或J3 5’的序列，如Seq ID No 4的约残基1-300、1-500、1-750、1-1000和/或1-1500所示。在进一步的实施方案中，5’寻靶臂可以含有恒定区5’的序列，如Seq ID No 4的约残基1-300、1-500、1-750、1-1000、1-1500和/或1-2000或Seq ID No 4的任一片段和/或Seq ID No4的任何连续序列或者其片段所示。在另一实施方案中，3’寻靶臂可以含有恒定区3’的序列和/或包括恒定区的序列，如Seq ID No 4的残基7000-8000和/或8000-9000或其片段。在其他实施方案中，寻靶载体可以含有Seq ID No 4的任何连续序列或者其片段。在其他实施方案中，寻靶载体可以含有5’重组臂和3’重组臂，所述5’重组臂含有与猪重链基因座多样性区5’的基因组序列同源的序列，所述3’重组臂含有与猪重链基因座多样性区3’的基因组序列同源的序列。在进一步的实施方案中，寻靶载体可以含有5’重组臂和3’重组臂，所述5’重组臂含有与猪重链基因座μ恒定区5’的基因组序列同源的序列，所述3’重组臂含有与猪重链基因座μ恒定区3’的基因组序列同源的序列。
在进一步的实施方案中，寻靶载体可以包括，但不限于下面序列的任一种：重链的多样性区如通过Seq ID No 29的残基1089-1099(D(pseudo))表示的，重链的连接区例如通过Seq ID No 29的残基1887-3352(例如：J(psuedo)：Seq ID No 29的1887-1931，J(psuedo)：Seq ID No 29的2364-2411，J(psuedo)：Seq ID No 29的2756-2804，J(功能性J)：Seq ID No 29的3296-3352)表示，重组信号例如通过SeqID No 29的残基3001-3261(九碱基顺序)，Seq ID No 29的3292-3298(七碱基序列)表示，恒定区通过下面的残基表示：Seq ID No 29的3353-9070(J到Cμ内含子)、Seq ID No 29的5522-8700(转换区)、Seq ID No 29的9071-9388(μ外显子1)、Seq ID No 29的9389-9469(μ内含子A)、Seq ID No 29的9470-9802(μ外显子2)、Seq ID No 29的9830-10069(μ内含子B)、Seq ID No 29的10070-10387(μ外显子3)、Seq ID No 29的10388-10517(μ内含子C)、Seq ID No 29的10815-11052(μ外显子4)、Seq ID No 29的11034-11039(聚腺苷酸信号)，或者其任意片段或者组合。此外，Seq ID No 29的至少约17、20、30、40、50、100、150、200或300个核苷酸的任意连续序列或者其片段和/或组合可以用作重链寻靶载体的寻靶序列。可以理解通常当设计寻靶构建体时，一个寻靶臂将在另一个寻靶臂的5’。
在其他实施方案中，设计用来破坏猪重链基因的表达的寻靶载体可以含有重组臂，如3’或者5’重组臂，其靶定重链的恒定区。在一个实施方案中，重组臂可以靶定μ恒定区，如上述或者Sun & ButlerImmunogenetics(1997)46：452-460中描述的Cμ序列。在另一实施方案中，重组臂可以靶定δ恒定区，如Zhao等人(2003)J Imunol 171：1312-1318中公开的序列，或者靶定α恒定区，如Brown & Butler(1994)Molec Immunol 31：633-642中公开的序列。
 
Seq ID No.5 GGCCAGACTTCCTCGGAACAGCTCAAAGAGCTCTGTCAAAGCCAGATCCCATCACACGTGGGCACCAATAGGCCATGCCAGCCTCCAAGGGCCGAACTGGGTTCTCCACGGCGCACATGAAGCCTGCAGCCTGGCTTATCCTCTTCCGTGGTGAAGAGGCAGGCCCGGGACTGGACGAGGGGCTAGCAGGGTGTGGTAGGCACCTTGCGCCCCCCACCCCGGCAGGAACCAGAGACCCTGGGGCTGAGAGTGAGCCTCCAAACAGGATGCCCCACCCTTCAGGCCACCTTTCAATCCAGCTACACTCCACCTGCCATTCTCCTCTGGGCACAGGGCCCAGCCCCTGGATCTTGGCCTTGGCTCGACTTGCACCCACGCGCACACACACACTTCCTAACGTGCTGTCCGCTCACCCCTCCCCAGCGTGGTCCATGGGCAGCACGGCAGTGCGCGTCCGGCGGTAGTGAGTGCAGAGGTCCCTTCCCCTCCCCCAGGAGCCCCAGGGGTGTGTGCAGATCTGGGGGCTCCTGTCCCTTACACCTTCATGCCCCTCCCCTCATACCCACCCTCCAGGCGGGAGGCAGCGAGACCTTTGCCCAGGGACTCAGCCAACGGGCACACGGGAGGCCAGCCCTCAGCAGCTGGCTCCCAAAGAGGAGGTGGGAGGTAGGTCCACAGCTGCCACAGAGAGAAACCCTGACGGACCCCACAGGGGCCACGCCAGCCGGAACCAGCTCCCTCGTGGGTGAGCAATGGCCAGGGCCCCGCCGGCCACCACGGCTGGCCTTGCGCCAGCTGAGAACTCACGTCCAGTGCAGGGAGACTCAAGACAGCCTGTGCACACAGCCTCGGATCTGCTCCCATTTCAAGCAGAAAAAGGAAACCGTGCAGGCAGCCCTCAGCATTTCAAGGATTGTAGCAGCGGCCAACTATTCGTCGGCAGTGGCCGATTAGAATGACCGTGGAGAAGGGCGGAAGGGTCTCTCGTGGGCTCTGCGGCCAACAGGCCCTGGCTCCACCTGCCCGCTGCCAGCCCGAGGGGCTTGGGCCGAGCCAGGAACCACAGTGCTCACCGGGACCACAGTGACTGACCAAACTCCCGGCCAGAGCAGCCCCAGGCCAGCCGGGCTCTCGCCCTGGAGGACTCACCATCAGATGCACAAGGGGGCGAGTGTGGAAGAGACGTGTCGCCCGGGCCATTTGGGAAGGCGAAGGGACCTTCCAGGTGGACAGGAGGTGGGACGCACTCCAGGCAAGGGACTGGGTCCCCAAGGCCTGGGGAAGGGGTACTGGCTTGGGGGTTAGCCTGGCCAGGGAACGGGGAGCGGGGCGGGGGGCTGAGCAGGGAGGACCTGACCTCGTGGGAGCGAGGCAAGTCAGGCTTCAGGCAGCAGCCGCACATCCCAGACCAGGAGGCTGAGGCAGGAGGGGCTTGCAGCGGGGCGGGGGCCTGCCTGGCTCCGGGGGCTCCTGGGGGACGCTGGCTCTTGTTTCCGTGTCCCGCAGCACAGGGCCAGCTCGCTGGGCCTATGCTTACCTTGATGTCTGGGGCCGGGGCGTCAGGGTCGTCGTCTCCTCAGGGGAGAGTCCCCTGAGGCTACGCTGGGG*GGGGACTATGGCAGCTCCACCAGGGGCCTGGGGACCAGGGGCCTGGACCAGGCTGCAGCCCGGAGGACGGGCAGGGCTCTGGCTCTCCAGCATCTGGCCCTCGGAAATGGCAGAACCCCTGGCGGGTGAGCGAGCTGAGAGCGGGTCAGACAGACAGGGGCCGGCCGGAAAGGAGAAGTTGGGGGCAGAGCCCGCCAGGGGCCAGGCCCAAGGTTCTGTGTGCCAGGGCCTGGGTGGGCACATTGGTGTGGCCATGGCTACTTAGACGCGTGATCAAGGGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTggatcccggcgcgccctaccgggtaggggaggcgcttttcccaaggcagtctggagcatgcgctttagcagccccgctgggcacttggcgctacacaagtggcctctggcctcgcacacattccacatccaccggtaggcgccaaccggctccgttctttggtggccccttcgcgccaccttctactcctcccctagtcaggaagttcccccccgccccgcagctcgcgtcgtgcaggacgtgacaaatggaagtagcacgtctcgctagtctcgtgcagatggacagcaccgctgagcaatggaagcgggtaggcctttggggcagcggccaatagcagctttggctccttcgctttctgggctcagaggctgggaaggggtgggtccgggggcgggctcaggggcgggctcaggggcggggcgggcgcccgaaggtcctccggaagcccggcattctgcacgcttcaaaagcgcacgtctgccgcgctgttctcctcttcctcatctccgggcctttcgacctgcagccaatatgggatcggccattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcaatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcc 
 
cgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggatcgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgaggggatcaattcTCTAGATGCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCGCCCTtCCAGGCGTTGAAGTCGTCGTGTCCTCAGGTAAGAACGGCCCTCCAGGGCCTTTAATTTCTGCTCTCGTCTGTGGGCTTTTCTGACTCTGATCCTCGGGAGGCGTCTGTGCCCCCCCCGGGGATGAGGCCGGCTTGCCAGGAGGGGTCAGGGACCAGGAGCCTGTGGGAAGTTCTGACGGGGGCTGCAGGCGGGAAGGGCCCCACCGGGGGGCGAGCCCCAGGCCGCTGGGCGGCAGGAGACCCGTGAGAGTGCGCCTTGAGGAGGGTGTCTGCGGAACCACGAACGCCCGCCGGGAAGGGCTTGCTGCAATGCGGTCTTCAGACGGGAGGCGTCTTCTGCCCTCACCGTCTTTCAAGCCCTTGTGGGTCTGAAAGAGCCATGTCGGAGAGAGAAGGGACAGGCCTGTCCCGACCTGGCCGAGAGCGGGCAGCCCCGGGGGAGAGCGGGGCGATCGGCCTGGGCTCTGTGAGGCCAGGTCCAAGGGAGGACGTGTGGTCCTCGTGACAGGTGCACTTGCGAAACCTTAGAAGACGGGGTATGTTGGAAGCGGCTCCTGATGTTTAAGAAAAGGGAGACTGTAAAGTGAGCAGAGTCCTCAAGTGTGTTAAGGTTTTAAAGGTCAAAGTGTTTTAAACCTTTGTGACTGCAGTTAGCAAGCGTGCGGGGAGTGAATGGGGTGCCAGGGTGGCCGAGAGGCAGTACGAGGGCCGTGCCGTCCTCTAATTCAGGGCTTAGTTTTGCAGAATAAAGTCGGCCTGTTTTCTAAAAGCATTGGTGGTGCTGAGCTGGTGGAGGAGGCCGCGGGCAGCCCTGGCCACCTGCAGCAGGTGGCAGGAAGCAGGTCGGCCAAGAGGCTATTTTAGGAAGCCAGAAAACACGGTCGATGAATTTATAGCTTCTGGTTTCCAGGAGGTGGTTGGGCATGGCTTTGCGCAGCGCCACAGAACCGAAAGTGCCCACTGAGAAAAAACAACTCCTGCTTAATTTGCATTTTTCTAAAAGAAGAAACAGAGGCTGACGGAAACTGGAAAGTTCCTGTTTTAACTACTCGAATTGAGTTTTCGGTCTTAGCTTATCAACTGCTCACTTAGATTCATTTTCAAAGTAAACGTTTAAGAGCCGAGGCATTCCTATCCTCTTCTAAGGCGTTATTCCTGGAGGCTCATTCACCGCCAGCACCTCCGCTGCCTGCAGGCATTGCTGTCACCGTCACCGTGACGGCGCGCACGATTTTCAGTTGGCCCGCTTCCCCTCGTGATTAGGACAGACGCGGGCACTCTGGCCCAGCCGTCTTGGCTCAGTATCTGCAGGCGTCCGTCTCGGGACGGAGCTCAGGGGAAGAGCGTGACTCCAGTTGAACGTGATAGTCGGTGCGTTGAGAGGAGACCCAGTCGGGTGTCGAGTCAGAAGGGGCCCGGGGCCCGAGGCCCTGGGCAGGACGGCCCGTGCCCTGCATCACGGGCCCAGCGTCCTAGAGGCAGGACTCTGGTGGAGAGTGTGAGGGTGCCTGGGGCCCCTCCGGAGCTGGGGCCGTGCGGTGCAGGTTGGGCTCTCGGCGCGGTGTTGGCTGTTTCTGCGGGATTTGGAGGAATTCTTCCAGTGATGGGAGTCGCCAGTGACCGGGCACCAGGCTGGTAAGAGGGAGGCCGCCGTCGTGGCCAGAGCAGCTGGGAGGGTTCGGTAAAAGGCTCGCCCGTTTCCTTTAATGAGGACTTTTCCTGGAGGGCATTTAGTCTAGTCGGGACCGTTTTCGACTCGGGAAGAGGGATGCGGAGGAGGGCATGTGCCCAGGAGCCGAAGGCGCCGCGGGGAGAAGCCCAGGGCTCTCCTGTCCCCACAGAGGCGACGCCACTGCCGCAGACAGACAGGGCCTTTCCCTCTGATGACGGCAAAGGCGCCTCGGCTCTTGCGGGGTGCTGGGGGGGAGTCGCCCCGAAGCCGCTCACCCAGAGGCCTGAGGGGTGAGACTGACCGATGCCTCTTGGCCGGGCCTGGGGCCGGACCGAGGGGGACTCCGTGGAGGCAGGGCGATGGTGGCTGCGGGAGGGAACCGACCCTGGGCCGAGCCCGGCTTGGCGATTCCCGGGCGAGGGCCCTCAGCCGAGGCGAGTGGGTCCGGCGGAACCACCCTTTCTGGCCAGCGCCACAGGGCTCTCGGGACTGTCCGGGGCGACGCTGGGCTGCCCGTGGCAGGCCTGGGCTGACCTGGACTTCACCAGACAGAACAGGGCTTTCAGGGCTGAGCTGAGCCAGGTTTAGCGAGGCCAAGTGGGGCTGAACCAGGCTCAACTGGCCTGAGCTGGGTTGAGCTGGGCTGACCTGGGCTGAGCTGAGCTGGGCTGGGCTGGGCTGGGCTGGGCTGGGCTGGGCTGGACTGGCTGAGCTGAGCTGGGTTGAGCTGAGCTGAGCTGGCCTGGGTTGAGCTGGGCTGGGTTGAGCTGAGCTGGGTTGAGCTGGGTTGAGCTGGGTTG
 
ATCTGAGCTGAGCTGGGCTGAGCTGAGCTAGGCTGGGGTGAGCTGGGCTGAGCTGGTTTGAGTTGGGTTGAGCTGAGCTGAGCTGGGCTGTGCTGGCTGAGCTAGGCTGAGCTAGGCTAGGTTGAGCTGGGCTGGGCTGAGCTGAGCyAGGCTGGGCTGATTTGGGCTGAGCTGAGCTGAGCTAGGCTGCGTTGAGCTGGCTGGGCTGGATTGAGCTGGCTGAGCTGGCTGAGCTGGGCTGAGCTGGCCTGGGTTGAGCTGAGCTGGACTGGTTTGAGCTGGGTCGATCTGGGTTGAGCTGTCCTGGGTTGAGCTGGGCTGGGTTGAGCTGAGCTGGGTTGAGCTGGGCTCAGCAGAGCTGGGTTGGGCTGAGCTGGGTTGAGCTGAGCTGGGCTGAGCTGGCCTGGGTTGAGCTGGGCTGAGCTGAGCTGGGCTGAGCTGGCCTGTGTTGAGCTGGGCTGGGTTGAGCTGGGCTGAGCTGGATTGAGCTGGGTTGAGCTGAGCTGGGCTGGGCTGTGCTGACTGAGCTGGGCTGAGCTAGGCTGGGGTGAGCTGGGCTGAGCTGATCCGAGCTAGGCTGGGCTGGTTTGGGCTGAGCTGAGCTGAGCTAGGCTGGATTGATCTGGCTGAGCTGGGTTGAGCTGAGCTGGGCTGAGCTGGTCTGAGCTGGCCTGGGTCGAGCTGAGCTGGACTGGTTTGAGCTGGGTCGATCTGGGCTGAGCTGGCCTGGGTTGAGCTGGGCTGGGTTGAGCTGAGCTGGGTTGAGCTGGGCTGAGCTGAGGGCTGGGGTGAGCTGGGCTGAACTAGCCTAGCTAGGTTGGGCTGAGCTGGGCTGGTTTGGGCTGAGCTGAGCTGAGCTAGGCTGCATTGAGCAGGCTGAGCTGGGCTGAGCAGGCCTGGGGTGAGCTGGGCTAGGTGGAGCTGAGCTGGGTCGAGCTGAGTTGGGCTGAGCTGGCCTGGGTTGAGGTAGGCTGAGCTGAGCTGAGCTAGGCTGGGTTGAGCTGGCTGGGCTGGTTTGCGCTGGGTCAAGCTGGGCCGAGCTGGCCTGGGTTGAGCTGGGCTCGGTTGAGCTGGGCTGAGCTGAGCCGACCTAGGCTGGGATGAGCTGGGCTGATTTGGGCTGAGCTGAGCTGAGCTAGGCTGCATTGAGCAGGCTGAGCTGGGCCTGGAGCCTGGCCTGGGGTGAGCTGGGCTGAGCTGCGCTGAGCTAGGCTGGGTTGAGCTGGCTGGGCTGGTTTGCGCTGGGTCAAGCTGGGCCGAGCTGGCCTGGGATGAGCTGGGCCGGTTTGGGCTGAGCTGAGCTGAGCTAGGCTGCATTGAGCAGGCTGAGCTGGGCTGAGCTGGCCTGGGGTGAGCTGGGCTGAGCTAAGCTGAGCTGGGCTGGTTTGGGCTGAGCTGGCTGAGCTGGGTCCTGCTGAGCTGGGCTGAGCTGACCAGGGGTGAGCTGGGCTGAGTTAGGCTGGGCTCAGCTAGGCTGGGTTGATCTGGCAGGGCTGGTTTGCGCTGGGTCAAGCTCCCGGGAGATGGCCTGGGATGAGCTGGGCTGGTTTGGGCTGAGCTGAGCTGAGCTGAGCTAGGCTGCATTGAGCAGGCTGAGCTGGGCTGAGCTGGCCTGGGGTGAGCTGGGCTGGGTGGAGCTGAGCTGGGCTGAACTGGGCTAAGCTGGCTGAGCTGGATCGAGCTGAGCTGGGCTGAGCTGGCCTGGGGTTAGCTGGGCTGAGCTGAGCTGAGCTAGGCTGGGTTGAGCTGGCTGGGCTGGTTTGCGCTGGGTCAAGCTGGGCCGAGCTGGCCTGGGTTGAGCTGGGCTGGGCTGAGCTGAGCTAGGCTGGGTTGAGCTGGGCTGGGCTGAGCTGAGCTAGGCTGCATTGAGCTGGCTGGGATGGATTGAGCTGGCTGAGCTGGCTGAGCTGGCTGAGCTGGGCTGAGCTGGCCTGGGTTGAGCTGGGCTGGGTTGAGCTGAGCTGGGCTGAGCTGGGCTCAGCAGAGCTGGGTTGAGCTGAGCTGGGTTGAGCTGGGGTGAGCTGGGCTGAGCAGAGCTGGGTTGAGCTGAGCTGGGTTGAGCTGGGCTCGAGCAGAGCTGGGTTGAGCTGAGCTGGGTTGAGCTGGGCTCAGCAGAGCTGGGTTGAGCTGAGCTGGGTTGAGCTGGGCTGAGCTAGCTGGGCTCAGCTAGGCTGGGTTGAGCTGAGCTGGGCTGAACTGGGCTGAGCTGGGCTGAACTGGGCTGAGCTGGGCTGAGCTGGGCTGAGCAGAGCTGGGCTGAGCAGAGCTGGGTTGGTCTGAGCTGGGTTGAGCTGGGCTGAGCTGGGCTGAGCAGAGTTGGGTTGAGCTGAGCTGGGTTCAGCTGGGCTGAGCTAGGCTGGGTTGAGCTGGGTTGAGTTGGGCTGAGCTGGGCTGGGTTGAGCGGAGCTGGGCTGAACTGGGCTGAGCTGGGCTGAGCGGAACTGGGTTGATCTGAATTGAGCTGGGCTGAGCCGGGCTGAGCCGGGCTGAGCTGGGCTAGGTTGAGCTTGGGTGAGCTTGCCTCAGCTGGTCTGAGCTAGGTTGGGTGGAGCTAGGCTGGATTGAGCTGGGCTGAGCTGAGCTGATCTGGCCTCAGCTGGGCTGAGGTAGGCTGAACTGGGCTGTGCTGGGCTGAGCTGAGCTGAGCCAGTTTGAGCTGGGTTGAGCTGGGCTGAGCTGGGCTGTGTTGATCTTTCCTGAACTGGGCTGAGCTGGGCTGAGCTGGCCTAGCTGGATTGAACGGGGGTAAGCTGGGCCAGGCTGGACTGGGCTGAGCTGAGCTAGGCTGAGCTGAGTTGAA   
 
TTGGGTTAAGCTGGGCTGAGATGGGCTGAGCTGGGCTGAGCTGGGTTGAGCCAGGTCGGACTGGGTTACCCTGGGCCACACTGGGCTGAGCTGGGCGGAGCTCGATTAACCTGGTCAGGCTGAGTCGGGTCCAGCAGACATGCGCTGGCCAGGCTGGCTTGACCTGGACACGTTCGATGAGCTGCCTTGGGATGGTTCACCTCAGCTGAGCCAGGTGGCTCCAGCTGGGCTGAGCTGGTGACCCTGGGTGACCTCGGTGACCAGGTTGTCCTGAGTCCGGGCCAAGCCGAGGCTGCATCAGACTCGCCAGACCCAAGGCCTGGGCCCCGGCTGGCAAGCCAGGGGCGGTGAAGGCTGGGCTGGCAGGACTGTCCCGGAAGGAGGTGCACGTGGAGCCGCCCGGACCCCGACCGGCAGGACCTGGAAAGACGCCTCTCACTCCCCTTTCTCTTCTGTCCCCTCTCGGGTCCTCAGAGAGCCAGTCTGCCCCGAATCTCTACCCCCTCGTCTCCTGCGTCAGCCCCCCGTCCGATGAGAGCCTGGTGGCCCTGGGCTGCCTGGCCCGGGACTTCCTGCCCAGCTCCGTCACCTTCTCCTGGAA
猪κ链寻靶
在本发明的具体实施方案中，提供了靶定猪κ链基因座的寻靶载体。在一个具体实施方案中，寻靶载体可以含有5’重组臂和3’重组臂，它们含有猪免疫球蛋白κ链基因座的恒定区的3’和5’侧翼序列的同源序列。因为本发明发现猪免疫球蛋白κ轻链基因座仅有一个恒定区，所以这将阻止功能性猪κ轻链免疫球蛋白的表达。在具体实施方案中，寻靶载体可以含有5’重组臂和3’重组臂，所述5’重组臂含有与恒定区5’的基因组序列，任选包括连接区同源的序列，所述3’重组臂含有与恒定区3’的基因组序列，任选包括增强子区的至少部分同源的序列(“κ恒定寻靶构建体”)，见例如图2。此外，该κ恒定寻靶构建体还可以含有位于5’和3’重组臂之间的选择标记基因，见例如Seq ID No 20和图2。在其他实施方案中，寻靶载体可以含有5’重组臂和3’重组臂，所述5’重组臂含有与猪κ轻链基因座的连接区5’的基因组序列同源的序列，所述3’重组臂含有与猪κ轻链基因座的连接区3’的基因组序列同源的序列。在其他实施方案中，寻靶载体的5’臂可以包括Seq ID No 12和/或Seq ID No 25或者其任何连续序列或者片段。在另一实施方案中，寻靶载体的3’臂可以包括Seq ID No 15、16和/或19或者其任何连续序列或者片段。
在进一步的实施方案中，寻靶载体可以包括，但不限于下面序列的任一种：κ轻链的编码区例如通过Seq ID No 30的残基1-549和SeqID No 30的10026-10549表示，而内含子序列由例如Seq ID No 30的残基550-10025表示，κ轻链的连接区例如由Seq ID No 30的残基5822-7207(例如，J1：Seq ID No 30的5822-5859，J2：Seq ID No 30的6180-6218，J3：Seq ID No 30的6486-6523，J4：Seq ID No 30的6826-6863，J5：Seq ID No 30的7170-7207)表示，恒定区由下面的残基表示：Seq ID No 30的10026-10549(C外显子)和Seq ID No 30的10026-10354(C编码)，Seq ID No 30的10524-10529(聚腺苷酸信号)和Seq ID No 30的11160-11264(SINE元件)或者其任意片段或者组合。此外，Seq ID No 30的至少约17、20、30、40、50、100、150、200或300个核苷酸的任何连续序列或者其片段和/或组合可以用作重链寻靶载体的寻靶序列。可以理解通常当设计寻靶构建体时，一个寻靶臂将在另一个寻靶臂的5’。
 
Seq ID No.20 ctcaaacgtaagtggctttttccgactgattctttgctgtttctaattgttggttggctttttgtccatttttcagtgttttcatcgaattagttgtcagggaccaaacaaattgccttcccagattaggtaccagggaggggacattgctgcatgggagaccagagggtggctaatttttaacgtttccaagccaaaataactggggaagggggcttgctgtcctgtgagggtaggtttttatagaagtggaagttaaggggaaatcgctatggttcacttttggctcggggaccaaagtggagcccaaaattgagtacattttccatcaattatttgtgagatttttgtcctgttgtgtcatttgtgcaagtttttgacattttggttgaatgagccattcccagggacccaaaaggatgagaccgaaaagtagaaaagagccaacttttaagctgagcagacagaccgaattgttgagtttgtgaggagagtagggtttgtagggagaaaggggaacagatcgctggctttttctctgaattagcctttctcatgggactggcttcagagggggtttttgatgagggaagtgttctagagccttaactgtgggttgtgttcggtagcgggaccaagctggaaatcaaacgtaagtgcacttttctactcctttttctttcttatacgggtgtgaaattggggacttttcatgtttggagtatgagttgaggtcagttctgaagagagtgggactcatccaaaaatctgaggagtaagggtcagaacagagttgtctcatggaagaacaaagacctagttagttgatgaggcagctaaatgagtcagttgacttgggatccaaatggccagacttcgtctgtaaccaacaatctaatgagatgtagcagcaaaaagagatttccattgaggggaaagtaaaattgttaatattgtggatcacctttggtgaagggacatccgtggagattgaacgtaagtattttttctctactaccttctgaaatttgtctaaatgccagtgttgacttttagaggcttaagtgtcagttttgtgaaaaatgggtaaacaagagcatttcatatttattatcagtttcaaaagttaaactcagctccaaaaatgaatttgtagacaaaaagattaatttaagccaaattgaatgattcaaaggaaaaaataattagtgtagatgaaaaaggaattcttacagctccaaagagcaaaagcgaattaattttctttgaactttgccaaatcttgtaaatgatttttgttctttacaatttaaaaaggttagagaaatgtatttcttagtctgttttctctcttctgtctgataaattattatatgagataaaaatgaaaattaataggatgtgctaaaaaatcagtaagaagttagaaaaatatatgtttatgttaaag 
 
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猪λ链寻靶
在本发明的具体实施方案中，提供了靶定猪重链基因座的寻靶载体。在一个实施方案中，通过设计寻靶构建体可以靶定λ，该构建体含有位于第一个JC簇5’的序列的5’臂和含有最后一个JC簇3’的序列的3’臂，从而防止λ基因座的功能性表达(见图3-4)。在一个实施方案中，寻靶载体可以含有Seq ID No 28的任意连续序列(如约17、20、30、40、50、75、100、200、300或5000个核苷酸的连续序列)或者其片段。在一个实施方案中，5’寻靶臂可以含有Seq ID No32，其包括猪λ轻链基因组序列的第一个λJ/C区的5’侧翼序列或者其任何连续序列(如约17、20、30、40、50、75、100、200、300或5000个核苷酸的连续序列)或者其片段(也见例如图5)。在另一实施方案中，3’寻靶臂可以含有但不限于一个或多个下面的：Seq ID No.33，其包括猪λ轻链基因组序列的J/C簇区的3’侧翼序列，从λJ/C下游约200个碱基对起；Seq ID No.34，其包括猪λ轻链基因组序列的J/C簇区的3’侧翼序列，J/C簇下游约11.8Kb，接近增强子；SeqID No.35，其包括λ下游约12Kb，包括增强子区；Seq ID No 36，其包括λ下游约17.6Kb；Seq ID No 37，其包括λ下游约19.1Kb；Seq IDNo 38，其包括λ下游约21.3Kb；和Seq ID No 39，其包括λ下游约27Kb，或者Seq ID Nos 32-39的任意连续序列(如约17、20、30、40、50、75、100、200、300或5000个核苷酸的连续序列)或者其片段(也见例如图6)。可以理解通常当设计寻靶构建体时，一个寻靶臂将在另一个寻靶臂的5’。
在额外实施方案中，λ基因座的寻靶构建体可以含有位点特异性重组酶位点，如lox。在一个实施方案中，寻靶臂可以将位点特异性重组酶位点插入到靶定的区域中。然后，位点特异性重组酶可以被激活和/或应用于细胞，从而两个位点特异性重组酶位点之间的间插核苷酸序列可以被切除(见，例如，图6)。
选择标记基因
可以设计DNA构建体来修饰内源的靶免疫球蛋白基因。用于靶定构建体的同源序列可以具有一个或多个缺失、插入、替代或其组合。改变可以是插入与靶基因的上游序列在阅读框融合的选择标记基因。
合适的选择标记基因包括，但不限于：赋予在某些培养基底物上生长的能力的基因，如tk基因(胸苷激酶)或者hprt基因(次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶)，其赋予在HAT培养基(次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)上生长的能力；细菌gpt基因(鸟嘌呤/黄嘌呤磷酸核糖基转移酶)，其允许在MAX培养基(霉酚酸、腺嘌呤和黄嘌呤)上生长。见，例如，Song，K-Y.，等人Proc.Nattl Acad.Sci.U.S.A.84：6820-6824(1987)；Sambrook，J.，等人，Molecular Cloning-ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989)，第16章。选择标记的其他实例包括：赋予对化合物如抗生素的抗性的基因，赋予在所选的底物上生长能力的基因，编码产生可检测信号如发光的蛋白质(如绿色荧光蛋白、增强的绿色荧光蛋白(eGFP))的基因。多种此类标记是已知的和可得到的，包括例如，抗生素抗性基因，如新霉素抗性基因(neo)(Southern，P.，和P.Berg，J.Mol.Appl.Genet.1：327-341(1982))；和潮霉素抗性基因(hyg)(Nucleic Acids Research 11：6895-6911(1983)，和Te Riele，H.，等人，Nature 348：649-651(1990))。其他选择标记基因包括：乙酰羟酸合酶(AHAS)、碱性磷酸酶(AP)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、辣根过氧化物氧化酶(HRP)、萤光素酶(Luc)、胭脂碱合酶(NOS)、章鱼碱合酶(OCS)、和其衍生物。可以得到多种选择标记，它们赋予对氨苄青霉素、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、氨甲蝶呤、膦丝菌素、嘌呤霉素和四环素的抗性。
掺入抗生素抗性基因和阴性选择因子的方法是本领域技术人员熟悉的(见，例如，WO 99/15650；美国专利号6,080,576；美国专利号6,136,566；Niwa等人，J.Biochem.113：343-349(1993)；和Yoshida等人，Transgenic Research 4：277-287(1995))。
还可以使用选择标记的组合。例如，为了靶定免疫球蛋白基因，可以将neo基因(有或者没有其自身启动子，如上文讨论)克隆到与该免疫球蛋白基因同源的DNA序列中。为了使用标记的组合，可以克隆HSV-tk基因从而使得它在寻靶DNA的外面(如果需要，可以在相反侧翼放置另一种选择标记)。向将要靶定的细胞导入DNA构建体后，可以在合适的抗生素上选择细胞。在该具体实例中，通过同源重组最可能产生抗G418和更昔洛韦的那些细胞，在同源重组中，neo基因已经重组到免疫球蛋白基因中，但是tk基因已经失去，因为它位于双交换区的外面。
缺失可以为约50bp，更通常至少约100bp，且通常不超过约20kbp，其中缺失可以通常包括编码区的至少部分，包括一个或多个外显子的部分、一个或多个内含子的部分，并且可以包括或不包括侧翼非编码区、尤其5’非编码区(转录调节区)的部分。从而，同源区可以延伸到编码区外进入5’非编码区或者备选地进入3’非编码区。插入可以通常不超过10kbp，通常不超过5kbp，通常至少50bp，更通常至少200bp。
同源区可以包括突变，其中突变可以还灭活靶基因，以提供移码，或者改变关键氨基酸，或者突变可以校正功能异常的等位基因等等。突变可以是轻微改变，不超过同源侧翼序列的约5％。当需要基因的突变时，可以向内含子或外显子中插入标记基因。
可以根据本领域已知的方法制备构建体，可以将各个片段聚集在一起，导入合适的载体，克隆，分析然后进一步操作，直到已得到了所希望的构建体。可以对序列进行各种修饰，以允许限制酶切分析、切除、探针的鉴定，等等。如需要，可以导入沉默突变。在各个阶段，可以使用限制酶切分析、测序、用聚合酶链反应扩增、引物修复、体外诱变等等。
构建体可以用细菌载体制备，所述细菌载体包括原核生物复制系统，例如，大肠杆菌可识别的起点，可以在每个阶段克隆并分析构建体。可以使用标记，其与将用于插入的标记相同或不同，并且可以在导入靶细胞前除去。一旦含有该构建体的载体已经完成，它就可以被进一步操作，如通过缺失细菌序列、线性化、在同源序列中引入短缺失。最后操作后，可以将构建体导入细胞。
本发明还包括含有免疫球蛋白基因的序列的重组构建体。构建体包含载体，如质粒或者病毒载体，已经向其中以正向或者反向插入了本发明的序列。构建体还可以包括调节序列，包括例如，与该序列可操作地连接的启动子。许多合适的载体和启动子是本领域技术人员已知的，并且可以商购得到。提供下面的载体作为实例。细菌的：pBs、pQE-9(Qiagen)、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核生物的：pWLneo、pSv2cat、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPv、pMSG、pSVL(Pharmiacia)，病毒来源的载体(M13载体、噬菌体1载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体)、高、低和可调节拷贝数载体、对于组合用于单个宿主中具有相容复制子的载体(pACYC184和pBR322)和真核附加型复制载体(pCDM8)。其他载体包括原核表达载体，如pcDNA II、pSL301、pSE280、pSE380、pSE420、pTrcHisA、B和C、pRSET A、B和C(Invitrogen，Corp.)、pGEMEX-1、和pGEMEX-2(Promega，Inc.)、pET载体(Novagen，Inc.)、pTrc99A、pKK223-3、pGEX载体、pEZZ18、pRIT2T、和pMC1871(Pharmacia，Inc.)、pKK233-2和pKK388-1(Clontech，Inc.)、和pProEx-HT(Invitrogen、Corp.)和其变体和衍生物。其他载体包括真核生物表达载体，如pFastBac、pFastBacHT、pFastBacDUAL、pSFV、和pTet-Splice(Invitrogen)、pEUK-Cl、pPUR、pMAM、pMAMneo、pBI101、pBI121、pDR2、pCMVEBNA、和pYACneo(Clontech)、pSVK3、pSVL、pMSG、pCH110、和pKK232-8(Pharmacia，Inc.)、p3′SS、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMC1neo、和pOG44(Stratagene、Inc.)、和pYES2、pAC360、pBlueBacHis A、B、和C、pVL1392、pBlueBacIII、pCDM8、pcDNA1、pZeoSV、pcDNA3pREP4、pCEP4、和pEBVHis(Invitrogen，Corp.)和其变体和衍生物。可以使用的额外的载体包括：pUC18、pUC19、pBlueScript、pSPORT、粘粒、噬菌粒、YAC’s(酵母人工染色体)、BAC’s(细菌人工染色体)、P1(大肠杆菌噬菌体)、pQE70、pQE60、pQE9(quagan)、pBS载体、PhageScript载体、BlueScript载体、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、pcDNA3(Invitrogen)、pGEX、pTrsfus、pTrc99A、pET-5、pET-9、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)、pSPORT1、pSPORT2、pCMVSPORT2.0和pSV-SPORT1(Invitrogen)、pTrxFus、pThioHis、pLEX、pTrcHis、pTrcHis2、pRSET、pBlueBacHis2、pcDNA3.1/His、pcDNA3.1(-)/Myc-His、pSecTag、pEBVHis、pPIC9K、pPIC3.5K、pAO815、pPICZ、pPICZ
Figure A200580044176D0129171927QIETU
、pGAPZ、pGAPZ
Figure A200580044176D0129171850QIETU
、pBlueBac4.5、pBlueBacHis2、pMelBac、pSinRep5、pSinHis、pIND、pIND(SP1)、pVgRXR、pcDNA2.1、pYES2、pZErO1.1、pZErO-2.1、pCR-Blunt、pSE280、pSE380、pSE420、pVL1392、pVL1393、pCDM8、pcDNA1.1、pcDNA1.1/Amp、pcDNA3.1、pcDNA3.1/Zeo、pSe、SV2、pRc/CMV2、pRc/RSV、pREP4、pREP7、pREP8、pREP9、pREP10、pCEP4、pEBVHis、pCR3.1、pCR2.1、pCR3.1-Uni、和pCRBac(来自 Invitrogen)；ExCell、
Figure A200580044176D0129171907QIETU
gt11、pTrc99A、pKK223-3、pGEX-1
Figure A200580044176D0129171859QIETU
T、pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-4T-3、pGEX-3X、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2、pGEX-5X-3、pEZZ18、pRIT2T、pMC1871、pSVK3、pSVL、pMSG、pCH110、pKK232-8、pSL1180、pNEO、和pUC4K(Pharmacia)；pSCREEN-1b(+)、pT7Blue(R)、pT7Blue-2、pCITE-4abc(+)、pOCUS-2、pTAg、pET-32LIC、pET-30LIC、pBAC-2cp LIC、pBACgus-2cp LIC、pT7Blue-2 LIC、pT7Blue-2、SCREEN-1、
Figure A200580044176D0130172111QIETU
BlueSTAR、pET-3abcd、pET-7abc、pET9abcd、pET11abcd、pET12abc、pET-14b、pET-15b、pET-16b、pET-17b-pET-17xb、pET-19b、pET-20b(+)、pET-21abcd(+)、pET-22b(+)、pET-23abcd(+)、pET-24abcd(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28abc(+)、pET-29abc(+)、pET-30abc(+)、pET-31b(+)、pET-32abc(+)、pET-33b(+)、pBAC-1、pBACgus-1、pBAC4x-1、pBACgus4x-1、pBAC-3cp、pBACgus-2cp、pBACsurf-1、plg、Signalplg、pYX、Selecta Vecta-Neo、Selecta Vecta-Hyg、和SelectaVecta-Gpt(来自Novagen)；pLexA、pB42AD、pGBT9、pAS2-l、pGAD424、pACT2、pGAD GL、pGAD GH、pGAD10、pGilda、pEZM3、pEGFP、pEGFP-1、pEGFP-N、pEGFP-C、pEBFP、pGFPuv、pGFP、p6xHis-GFP、pSEAP2-Basic、pSEAP2-Contral、pSEAP2-启动子、pSEAP2-增强子、pgal-基本、p
Figure A200580044176D0130172121QIETU
gal-对照、pgal-启动子、p
Figure A200580044176D0130172129QIETU
gal-增强子、pCMV
Figure A200580044176D0130172132QIETU
、pTet-Off、pTet-On、pTK-Hyg、pRetro-Off、pRetro-On、pIRES1neo、pIRES1hyg、pLXSN、pLNCX、pLAPSN、pMAMneo、pMAMneo-CAT、pMAMneo-LUC、pPUR、pSV2neo、pYEX4T-l/2/3、pYEX-S1、pBacPAK-His、pBacPAK8/9、pAcUW31、BacPAK6、pTriplEx、
Figure A200580044176D0130172136QIETU
gt10、
Figure A200580044176D0130172141QIETU
gt11、pWE15、和
Figure A200580044176D0130172147QIETU
TriplEx(来自Clontech)；Lambda ZAP II、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescript II KS+/-、pBluescript II SK+/-、pAD-GAL4、pBD-GAL4Cam、pSurfscript、Lambda FIX II、Lambda DASH、LambdaEMBL3、Lambda EMBL4、SuperCos、pCR-Scrigt Amp、pCR-ScriptCam、pCR-Script Direct、pBS +/-、pBC KS +/-、pBC SK +/-、Phagescript、pCAL-n-EK、pCAL-n、pCAL-c、pCAL-kc、pET-3abcd、pET-11abcd、pSPUTK、pESP-1、pCMVLacI、pOPRSVI/MCS、pOPI3CAT、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMC1neo、pMC1neo Poly A、pOG44、pOG45、pFRT
Figure A200580044176D0130172152QIETU
GAL、pNEO
Figure A200580044176D0130172156QIETU
GAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415、和pRS416来自(Stratagene)和其变体或衍生物。还可以使用双杂交和反向双杂交载体，例如，pPC86、pDBLeu、pDBTrp、pPC97、p2.5、pGAD1-3、pGAD10、pACt、pACT2、pGADGL、pGADGH、pAS2-1、pGAD424、pGBT8、pGBT9、pGAD-GAL4、pLexA、pBD-GAL4、pHISi、pHISi-1、placZi、pB42AD、pDG202、pJK202、pJG4-5、pNLexA、pYESTrp和其变体或衍生物。可以使用任何其他质粒和载体，只要它们在宿主中可复制和存活。
可以用于允许DNA构建体进入宿主细胞的技术包括，例如，磷酸钙/DNA共沉淀、DNA向细胞核中的显微注射、电穿孔、细菌与完整细胞的原生质体融合、转染或者本领域技术人员已知的任意其他技术。DNA可以是单链或者双链的、线性或环状的、松弛或者超螺旋DNA。对于用于转染哺乳动物细胞的各种技术，见例如，Keown等人，Methods in Enzymology Vol.185，pp.527-537(1990)。
在一个具体实施方案中，通过用含有从等基因DNA分离的免疫球蛋白基因序列的敲除载体转染原代胎儿成纤维细胞，可以产生杂合或纯合的敲除细胞。在另一实施方案中，载体可以结合启动子捕获策略，其中使用例如IRES(内部核糖体进入位点)来启动Neor基因的翻译。
位点特异性重组酶
在额外实施方案中，寻靶构建体可以含有位点特异性重组酶位点，如lox。在一个实施方案中，寻靶臂可以将位点特异性重组酶靶位点插入到靶定的区域中，从而使得一个位点特异性重组酶靶位点位于第二个位点特异性重组酶靶位点的5’。然后，该位点特异性重组酶被激活和/或应用于细胞，从而使得切除两个位点特异性重组酶位点之间的间插核苷酸序列。
位点特异性重组酶包括识别并结合短核苷酸位点或者序列特异性重组酶靶位点，即，重组酶识别位点，并催化与这些位点有关的核酸重组的酶或者重组酶。这些酶包括重组酶、转座酶和整合酶。序列特异性重组酶靶位点的实例包括，但不限于，lox位点、att位点、dif位点和frt位点。位点特异性重组酶的非限制性实例包括，但不限于，噬菌体P1 Cre重组酶、酵母FLP重组酶、Inti整合酶、λ噬菌体、phi 80、P22、P2、186和P4重组酶、Tn3解离酶、Hin重组酶和Cin重组酶、大肠杆菌xerC和xerD重组酶、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)重组酶、TpnI和β-内酰胺酶转座子，和免疫球蛋白重组酶。
在一个实施方案中，重组位点可以是噬菌体P1的Cre重组酶识别的lox位点。Lox位点指噬菌体P1的cre基因产物Cre重组酶可以催化位点特异性重组事件所处的核苷酸序列。多种lox位点是本领域已知的，包括天然存在的loxP、loxB、loxL和loxR，以及许多突变体或者变体lox位点，如loxP511、loxP514、lox.DELTA.86、lox.DELTA.117、loxC2、loxP2、loxP3和lox P23。Lox位点的额外实例包括，但不限于loxB、loxL、loxR、loxP、loxP3、loxP23、loxΔ86、loxΔ117、loxP511和loxC2。
在另一实施方案中，重组位点是非Cre的重组酶识别的重组位点。在一个实施方案中，重组酶位点可以是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的2pi质粒的FLP重组酶识别的FRT位点。FRT位点指酵母2μ质粒的FLP基因产物FLP重组酶催化位点特异性重组所处的核苷酸序列。非-Cre重组酶的额外实例包括，但不限于位点特异性重组酶，包括：λ噬菌体的Int重组酶识别的att位点(例如，att1、att2、att3、attP、attB、attL和attR)、解离酶家族识别的重组位点和苏云金芽孢杆菌的转座酶识别的重组位点。
在本发明的具体实施方案中，寻靶构建体可以含有：与本文描述的猪免疫球蛋白基因同源的序列、选择标记基因和/或位点特异性重组酶靶位点。
同源重组的细胞的选择
然后可以在合适选择的培养基上培养细胞以鉴定提供合适的整合的细胞。插入免疫球蛋白基因的选择标记基因的存在确立了靶构建体向宿主基因组中的整合。这些显示出所需表型的细胞可以通过限制酶切分析、电泳、DNA印迹分析、聚合酶链反应等等进一步分析DNA，以确定发生了同源还是非同源重组。这可以通过下述方法确定：使用插入片段的探针，然后对插入片段侧翼的5’和3’区测序以确定延伸到构建体的侧翼区之外的免疫球蛋白基因的存在或者当导入缺失时，鉴定该缺失的存在。还可以使用与构建体内的序列互补和与构建体外面的序列互补和在靶基因座的引物。这样，如果已经发生了同源重组，那么人们仅可以得到在互补链中存在两个引物的DNA双链体。通过阐明引物序列或者预期大小的序列的存在，来支持同源重组的发生。
用于筛选同源重组事件的聚合酶链反应是本领域已知的，见例如，Kim和Smithies，Nucleic Acids Res.16：8887-8903，1988；和Joyner等人，Nature 338：153-156，1989。Thomas和Capecchi，同上，1987；Nicholas和Berg(1983)在Teratocarcinoma Stem Cell，eds.Siver，Martin和Strikland(Cold Spring Harbor Lab.，Cold SpringHarbor，N.Y.(pp.469-497)；和Linney和Donerly，Cell 35：693-699，1983已经显示，驱动新霉素基因的突变的多瘤增强子和胸苷激酶启动子的特定组合在胚胎干细胞和EC细胞中是有效的。
从第一轮寻靶得到的细胞系对于靶定的等位基因可能是杂合的。可以以多种方式实现纯合性，其中两个等位基因都被修饰。一种方法是生长许多其中一个拷贝已经被修饰的细胞，然后将这些细胞使用不同选择标记进行另一轮的寻靶。备选地，根据传统孟德尔遗传学，通过将对修饰的等位基因杂合的动物育种得到纯合子。在一些情况下，需要具有两个不同修饰的等位基因。这可以通过连续轮的基因寻靶或者通过育种杂合子(每个杂合子携带一个所需的经修饰等位基因)来实现。
已经经历同源重组的细胞的鉴定
在一个实施方案中，选择方法可以直接检测免疫球蛋白基因的缺失，该缺失是由于通过同源重组对该免疫球蛋白基因的定向敲除，或者基因中的导致无功能或者不表达的免疫球蛋白的突变。通过抗生素抗性选择已经最常用于筛选(见上文)。该方法可以检测寻靶载体上抗性基因的存在，但是不直接指出整合是定向的重组事件还是随机整合。某些技术，如聚腺苷酸和启动子捕获技术，增加了定向事件的概率，但是仍然不给出所需表型的直接证据，已经得到了免疫球蛋白基因表达缺陷的细胞。此外，负选择形式可以用于选择定向整合；在这些情况中，细胞致死因子的基因以这样的方式插入，从而使得仅定向事件允许细胞避免死亡。通过这些方法选择的细胞然后可以测定其基因破坏、载体整合和最终测定免疫球蛋白基因缺失。在这些情况中，因为选择是基于检测寻靶载体整合并且不是基于改变的表型，所以仅仅可以检测定向敲除，而检测不到点突变、基因重排或者截短或者其他此类修饰。
可以进一步表征被认为缺少功能性免疫球蛋白基因表达的动物细胞。此类表征可以通过下面的技术实现，包括，但不限于：PCR分析、DNA印迹分析、RNA印迹分析、特异凝集素结合测定法，和/或测序分析。
如技术中描述的PCR分析可以用于确定寻靶载体的整合。在一个实施方案中，扩增引物可以在抗生素抗性基因中产生并且延伸到载体序列外的区域中。可以用DNA印迹分析表征基因座中的总体修饰，如寻靶载体向免疫球蛋白基因座中的整合。然而，RNA印迹分析可以用于表征从每个等位基因产生的转录物。
此外，从RNA转录物产生的cDNA的测序分析地可以用于确定免疫球蛋白等位基因中任何突变的精确位置。
在本发明的另一方面，提供了根据本文描述的方法、序列和/或构建体产生的缺少有蹄类动物重链、κ轻链和/或λ轻链基因座的功能区的至少一个等位基因的有蹄类动物细胞。这些细胞可以由于同源重组得到。具体地，通过灭活有蹄类动物重链、κ轻链或λ轻链基因的至少一个等位基因，可以产生表达猪抗体的能力降低的细胞。在其他实施方案中，可以根据本文描述的方法、序列和/或构建体产生缺少有蹄类动物重链、κ轻链和/或λ轻链基因的两个等位基因的哺乳动物细胞。在进一步的实施方案中，提供了猪动物，其中通过根据本文描述的方法、序列和/或构建体产生的遗传寻靶事件灭活有蹄类动物重链、κ轻链和/或λ轻链基因的至少一个等位基因。在本发明的另一方面，提供了猪动物，其中通过遗传寻靶事件灭活了有蹄类动物重链、κ轻链和/或λ轻链基因的两个等位基因。基因可以通过同源重组靶定。在其他实施方案中，可以破坏基因，即，可以改变遗传密码的部分，从而影响基因的该区段的转录和/或翻译。例如，可以通过替代、缺失(“敲除”)或者插入(“敲入”)技术发生基因的破坏。可以插入所需蛋白质的额外基因或者调节现有序列转录的调节序列。
在本发明的实施方案中，根据本文描述的方法、序列和/或构建体使得有蹄类动物重链、κ轻链或者λ轻链基因的等位基因失活，从而不再能产生功能性有蹄类动物免疫球蛋白。在一个实施方案中，可以将靶定的免疫球蛋白基因转录成RNA，但是不翻译成蛋白质。在另一实施方案中，可以将靶定的免疫球蛋白基因以失活的截短形式转录。这种截短的RNA可以不被翻译或者可以翻译成无功能的蛋白质。在备选实施方案中，可以将靶定的免疫球蛋白基因以这样的方式灭活，从而使得不发生基因的转录。在另一实施方案中，可以转录靶定的免疫球蛋白基因，然后翻译成无功能的蛋白质。
III.含有人免疫球蛋白基因的人工染色体的插入
人工染色体
本发明的一方面提供了根据本文描述的方法、序列和/或构建体产生的有蹄类动物和有蹄类动物细胞，它们缺少有蹄类动物重链、κ轻链和/或λ轻链基因座的功能区的至少一个等位基因，所述有蹄类动物和有蹄类动物细胞进一步修饰以表达人抗体(即，免疫球蛋白(Ig))基因座的至少部分。该人基因座可以经历重排并在有蹄类动物中表达人抗体分子的不同群体。这些克隆的转基因有蹄类动物提供了人抗体(如多克隆抗体)的可补充的、理论上无限的供应，所述抗体可以用于治疗、诊断、纯化和其他临床上相关的目的。
在一个具体实施方案中，人工染色体(AC)可以用于实现向有蹄类动物细胞和动物中转移人免疫球蛋白基因。AC允许含有单个或多个基因的兆碱基大小的DNA片段的定向整合。因此，AC可以将同源DNA导入所选细胞中以用于产生通过异源DNA编码的基因产物。在一个实施方案中，具有整合的人免疫球蛋白DNA的一个或多个AC可以用作将人Ig基因导入有蹄类动物(如猪)的载体。
AC首先在1983年在酵母中构建，是人造的线性DNA分子，其从负责天然染色体的正确复制和分配的基本顺式作用DNA序列元件构建(Murray等人(1983)，Nature 301：189-193)。染色体需要至少三个元件来发挥功能。具体地，人工染色体的元件包括至少：(1)自主复制序列(ARS)(具有复制起点的性质，其是用于启动DNA复制的位点)，(2)着丝粒(动粒装配的位点，其负责有丝分裂和减数分裂时复制的染色体的正确分配)，和(3)端粒(在线性染色体末端的特化结构，其功能为稳定末端并且促进DNA分子的最末端的完全复制)。
在一个实施方案中，人Ig可以维持为与有蹄类动物染色体DNA分离的独立的单位(附加体)。例如，附加体载体含有细胞内DNA复制和载体维持所需的必需DNA序列元件。附加体载体可以通过商业途径获得(见，例如，Maniatis，T.等人，Molecular Cloning，ALaboratory Manual(1982)pp.368-369)。AC可以稳定复制并且与内源染色体一起分离。在备选实施方案中，人IgG DNA序列可以整合到有蹄类动物细胞的染色体中，从而允许新信息复制和分配到细胞的子代作为天然染色体的部分(见，例如，Wigler等人(1977)，Cell11：223)。可以将AC易位或者插入到有蹄类细胞的内源染色体中。两个或更多个AC可以同时或者顺序地导入宿主细胞中。
此外，AC可以提供基因组外基因座，用于含有单个或多个基因，包括可操作地连接一个启动子的单个基因的多个拷贝或者连接到单独的启动子的每个拷贝或者几个拷贝的兆碱基大小的DNA片段的定向整合。AC可以允许含有单个或多个人免疫球蛋白基因的兆碱基大小的DNA片段的定向整合。通过在本领域技术人员已知的条件下培养具有双着丝粒染色体(即，具有两个着丝粒的染色体)的细胞，从而染色体分裂形成微型染色体和以前的双着丝粒染色体，可以产生AC。
AC可以从人(人人工染色体：“HAC”)、酵母(酵母人工染色体：“YAC”)、细菌(细菌人工染色体：“BAC”)、噬菌体P1衍生的人工染色体：“PAC”)和其他哺乳动物(哺乳动物人工染色体：“MAC”)构建。AC基于着丝粒的来源命名(例如，YAC、BAC、PAC、MAC、HAC)。例如，YAC可以从啤酒糖酵母得到着丝粒。另一方面，MAC包括活性哺乳动物着丝粒，而HAC指包括人着丝粒的染色体。此外，还可以构建植物人工染色体(“PLAC”)和昆虫人工染色体。AC可以包括来自染色体的负责复制和维持的元件。因此，AC能够稳定维持大的基因组DNA片段，如人Ig DNA。
在一个实施方案中，提供了含有YAC的有蹄类动物。YAC是基因工程改造的环形染色体，其含有来自酵母如啤酒糖酵母染色体的元件，和外来DNA的区段，该区段比常规克隆载体(例如，质粒、粘粒)接受的区段大得多。YAC允许外源DNA的极大区段(Schlessinger，D.(1990)，Trends in Genetics 6：248-253)在哺乳动物细胞和动物中增殖(Choi等人(1993)，Nature Gen 4：117-123)。YAC转基因方法非常有效并且通过有效操作克隆的DNA的能力得到极大的增强。酵母的主要技术优点是通过DNA介导的转化和同源重组可以进行的特定基因组修饰的容易性(Ramsay，M.(1994)，Mol Biotech 1：181-201)。在一个实施方案中，具有整合的人Ig DNA的一个或多个YAC可以用作将人Ig基因导入有蹄类动物(如猪)的载体。
YAC载体含有用于在酵母中复制的特定结构元件，包括：着丝粒、端粒、自主复制序列(ARS)、酵母选择标记(例如，TRP1、URA3和SUP4)，和用于插入外源DNA的大于50kb的大区段的克隆位点。标记基因可以允许选择携带YAC的细胞并作为特定限制性内切核酸酶合成的位点。例如，TRP1和URA3基因可以用作双重选择标记来确保仅维持完整的人工染色体。可以在着丝粒的两边携带酵母选择标记，并且协助体内端粒形成的两个序列是分离的。然而，酵母细胞的总DNA的仅1％的部分是复制所必需的，包括染色体的中心(着丝粒，其作为姐妹染色单体之间的附着位点和有丝分裂期间纺锤丝附着的位点)、染色体的末端(端粒，其作为维持真核生物染色体末端必需的序列)，和DNA的另一个短序列，其称作ARS，作为DNA区段，其中双螺旋可以解旋并且开始自己复制。
在一个实施方案中，YAC可以用于克隆最高达约1、2或者3Mb免疫球蛋白DNA。在另一实施方案中，至少25、30、40、50、60、70、75、80、85、90或95kb。
酵母整合质粒、复制载体(其是YAC的片段)也可以用于表达人Ig。酵母整合质粒可以含有提供复制起点和用于在细菌(例如，大肠杆菌)中生长的药物抗性基因的细菌质粒序列、用于选择酵母中的转化体的酵母标记基因，和用于插入Ig序列的限制位点。宿主细胞可以通过将该质粒直接整合在染色体中而稳定获得该质粒。酵母复制载体也可以用于表达人Ig作为酵母中的游离质粒环。通过加入着丝粒序列可以稳定酵母或者含有ARS的载体。YAC具有着丝粒和端粒区，并且可以用于克隆DNA的非常大的片段，因为重组体基本上作为酵母染色体维持。
YAC如在美国专利号6,692,954、6,495,318、6,391,642、6,287,853、6,221,588、6,166,288、6,096,878、6,015,708、5,981,175、5,939,255、5,843,671、5,783,385、5,776,745、5,578,461和4,889,806；欧洲专利号1356062和0648265；PCT公开号WO 03/025222、WO02/057437、WO 02/101044、WO 02/057437、WO 98/36082、WO98/12335、WO 98/01573、WO 96/01276、WO 95/14769、WO 95/05847、WO 94/23049和WO 94/00569中公开的提供。
在另一实施方案中，提供了含有BAC的有蹄类动物。BAC是在细菌如大肠杆菌中发现的基于F的质粒，其可以向宿主细胞中转移约300kb的外来DNA。一旦Ig DNA已经克隆到宿主细胞中，新插入的区段就可以随着质粒的剩余部分一起复制。结果，可以在非常短的时间内产生外来DNA的数十亿拷贝。在具体实施方案中，具有整合的人Ig DNA的一个或多个BAC用作向有蹄类动物(例如猪)中导入人Ig基因的载体。
BAC克隆系统基于大肠杆菌F因子，其复制受到严格控制并且从而确保大构建体的稳定维持(Willets，N.，和R.Skurray(1987)，Structure and function of the F-factor and mechanism of conj ugation.In Escherichia coli and Salmonella Typhimurium：Cellular andMolecular Biology(F.C.Neidhardt，Ed)Vol.2 pp 1110-1133，Am.Soc.Microbiol.，Washington，D.C.)。BAC已经广泛用于从各种真核生物物种克隆DNA(Cai等人(1995)，Genomics 29：413-425；Kim等人(1996)，Genomics 34：213-218；Misumi等人(1997)，Genomics40：147-150；Woo等人(1994)，Nucleic Acids Res 22：4922-4931；Zimmer，R.和Gibbins，A.M.V.(1997)，Genomics 42：217-226)。F质粒的低发生率可以减小DNA片段之间的重组潜力并且可以避免克隆的细菌基因的致命超表达。BAC可以将单个拷贝载体中的人免疫球蛋白基因稳定维持在宿主细胞中，甚至在连续生长100或更多世代之后。
BAC(或者pBAC)载体可以容纳约30到300kb对范围的插入片段。一种特定类型的BAC载体pBeloBac11使用lacZ基因的互补，通过颜色区分含有插入片段的重组分子与携带BAC载体的菌落。当将DNA片段克隆到pBeloBac11的lacZ基因中时，插入激活导致转化后在X-Gal/IPTG板上形成白色菌落(Kim等人(1996)，Genomics34：213-218)以容易鉴定阳性克隆。
例如，BAC可以如美国专利号6,713,281、6,703,198、6,649,347、6,638,722、6,586,184、6,573,090、6,548,256、6,534,262、6,492,577、6,492,506、6,485,912、6,472,177、6,455,254、6,383,756、6,277,621、6,183,957、6,156,574、6,127,171、5,874,259、5,707,811和5,597,694；欧洲专利号0 805 851；PCT公开号WO 03/087330、WO 02/00916、WO 01/39797、WO 01/04302、WO 00/79001、WO 99/54487、WO99/27118和WO 96/21725中公开的提供。
在另一实施方案中，提供了含有噬菌体PAC的有蹄类动物。在具体实施方案中，具有整合的人Ig DNA的一种或多种噬菌体PAC用作向有蹄类动物(例如猪)中导入人Ig基因的载体。例如，PAC可以如美国专利号6,743,906、6,730,500、6,689,606、6,673,909、6,642,207、6,632,934、6,573,090、6,544,768、6,489,458、6,485,912、6,469,144、6,462,176、6,413,776、6,399,312、6,340,595、6,287,854、6,284,882、6,277,621、6,271,008、6,187,533、6,156,574、6,153,740、6,143,949、6,017,755和5,973,133；欧洲专利号0 814 156；PCT公开号WO 03/091426、WO 03/076573、WO 03/020898、WO 02/101022、WO 02/070696、WO 02/061073、WO 02/31202、WO 01/44486、WO01/07478、WO 01/05962和WO 99/63103中公开的提供。
在另一实施方案中，提供了含有MAC的有蹄类动物。MAC具有高有丝分裂稳定性、一致和受调节的基因表达、高克隆能力和非免疫原性。哺乳动物染色体可以包含约50到250Mb大小的DNA的连续线性链。DNA构建体可以还含有DNA构建体在酵母细胞中增殖必需的一种或多种序列。DNA构建体还含有编码选择标记基因的序列。DNA构建体可以能够在用该DNA构建体转化的细胞中作为染色体进行维持。MAC提供基因组外特异整合位点用于导入编码目的蛋白质的基因和允许兆碱基大小的DNA整合，从而例如，编码整个代谢途径的基因、非常大的基因[例如，囊性纤维化(CF)基因(～600kb)]或者几种基因[例如，用于制备多价疫苗的一系列抗原]可以稳定导入细胞中。
提供了哺乳动物人工染色体[MAC]。还提供了其他高等真核生物物种，如昆虫和鱼的人工染色体，它们使用本文提供的MACS产生。用于产生和分离此类染色体的方法。还提供了使用MAC从其他物种如昆虫和鱼物种构建人工染色体的方法。人工染色体是完全功能性的稳定染色体。提供了两种类型的人工染色体。一种类型在本文中称作SATAC[随体人工染色体]是稳定的异染色质染色体，且另一类型是基于常染色质的扩增的微型染色体。如本文使用的，前面的双着丝粒染色体是当双着丝粒染色体断裂并且获得新的端粒时产生的染色体，从而产生两个染色体，每个染色体具有一个着丝粒。每个片段都可以是可复制的染色体。
还提供了其他高等真核生物物种，如昆虫和鱼的人工染色体，它们使用本文提供的MACS产生。在一个实施方案中，提供了SATAC[随体人工染色体]。SATAC是稳定的异染色质染色体。在另一实施方案中，提供了微型染色体，其中微型染色体基于常染色质的扩增。
在一个实施方案中，通过将细胞与双着丝粒染色体在染色体断裂以形成微型染色体和以前的双着丝粒染色体的条件下培养，产生了人工染色体。在一个实施方案中，SATAC可以从微型染色体片段产生，见例如，美国专利号5,288,625。在另一实施方案中，SATAC可以从以前的双着丝粒染色体的片段产生。SATAC可以由短卫星DNA的重复单位组成并且可是完全异染色质的。在一个实施方案中，不存在异源或者外来DNA的插入，SATAC不含有遗传信息。在其他实施方案中，提供了各种大小的SATAC，它们通过在选择条件下反复培养并亚克隆含有从以前的双着丝粒染色体产生的染色体的细胞来提供。这些染色体可以基于大小为7.5到10Mb的重复单位，或者兆复制子(megareplicon)。这些兆复制子可以是卫星DNA的串联块，其侧翼为异源的非卫星DNA。扩增可以产生相同的染色体区段(每个称作扩增子)的串联排列，所述区段含有边界为异源[“外来”]DNA的两个倒置的兆复制子。反复细胞融合，在选择培养基上生长和/或BrdU[5-溴脱氧尿苷]处理，或者其他基因组去稳定剂或者试剂，如电离辐射，包括X射线处理，以及亚克隆导致得到这样的细胞系，其携带稳定的异染色质或者部分异染色质的染色体，包括150-200Mb“腊肠(sausage)”染色体、500-1000Mb千兆染色体(gigachromosome)、稳定的250-400Mb兆染色体(megachromosome)和多种从其得到的较小的稳定染色体。这些染色体基于这些重复单位并且可以包括所表达的人免疫球蛋白DNA(也见美国专利号6,743,967)。
在其他实施方案中，MAC可以如美国专利号6,743,967、6,682,729、6,569,643、6,558,902、6,548,287、6,410,722、6,348,353、6,297,029、6,265,211、6,207,648、6,150,170、6,150,160、6,133,503、6,077,697、6,025,155、5,997,881、5,985,846、5,981,225、5,877,159、5,851,760和5,721,118；PCT公开号WO 04/066945、WO 04/044129、WO 04/035729、WO 04/033668、WO 04/027075、WO 04/016791、WO 04/009788、WO 04/007750、WO 03/083054、WO 03/068910、WO 03/068909、WO 03/064613、WO 03/052050、WO 03/027315、WO 03/023029、WO 03/012126、WO 03/006610、WO 03/000921、WO 02/103032、WO 02/097059、WO 02/096923、WO 02/095003、WO 02/092615、WO 02/081710、WO 02/059330、WO 02/059296、WO 00/18941、WO 97/16533和WO 96/40965中公开的提供。
在本发明的另一方面，提供了含有HAC的有蹄类动物和有蹄类动物细胞。在具体实施方案中，具有整合的人Ig DNA的一种或多种HAC用作向有蹄类动物(如猪)中导入人Ig基因的载体。在具体实施方案中，具有整合的人Ig DNA的一种或多种HAC用于通过核转移产生有蹄类动物(如猪)，其应答免疫而表达人Ig并且经历亲和力成熟。
各种方法可以用于产生表达人抗体(“人Ig”)的有蹄类动物。这些方法包括例如，在其胚胎阶段或者在其出生后向有蹄类动物中插入含有重链和轻链Ig基因的HAC或者向有蹄类动物插入人B细胞或者B细胞前体(例如，免疫缺陷的或者免疫抑制的有蹄类动物)(见，例如，2000年11月17日提交的WO 01/35735，2002年3月20日提交的US 02/08645)。在任一情况下，在有蹄类动物中可以同时存在产生人抗体的细胞和产生有蹄类动物抗体的B细胞。在含有HAC的有蹄类动物中，单个B细胞可以产生含有有蹄类动物和人重链和轻链蛋白质的组合的抗体。在其他实施方案中，HAC的总大小为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10Mb。
例如，HAC可以如美国专利号6,642,207、6,590,089、6,566,066、6,524,799、6,500,642、6,485,910、6,475,752、6,458,561、6,455,026、6,448,041、6,410,722、6,358,523、6,277,621、6,265,211、6,146,827、6,143,566、6,077,697、6,025,155、6,020,142和5,972,649；美国专利申请号2003/0037347；PCT公开号WO 04/050704、WO 04/044156、WO 04/031385、WO 04/016791、WO 03/101396、WO 03/097812、WO 03/093469、WO 03/091426、WO 03/057923、WO 03/057849、WO 03/027638、WO 03/020898、WO 02/092812、和WO 98/27200中公开的提供。
可以插入人免疫球蛋白序列以用于本发明的AC的额外实例包括例如，BACs(例如，pBeloBAC11或pBAC108L；见，例如，Shizuya等人(1992)，Proc Natl Acad Sci USA 89(18)：8794-8797；Wang等人(1997)，Biotechniques 23(6)：992-994)、噬菌体PACs、YACs(见，例如，Burke(1990)，Genet Anal Tech Appl 7(5)：94-99)，和MACs(见，例如，Vos(1997)，Nat.Biotechnol.15(12)：1257-1259；Ascenzioni等人(1997)，Cancer Lett 118(2)：135-142)，如HACs，也见，美国专利号6,743,967、6,716,608、6,692,954、6,670,154、6,642,207、6,638,722、6,573,090、6,492,506、6,348,353、6,287,853、6,277,621、6,183,957、6,156,953、6,133,503、6,090,584、6,077,697、6,025,155、6,015,708、5,981,175、5,874,259、5,721,118和5,270,201；欧洲专利号1 437 400、1 234 024、1 356 062、0 959 134、1 056 878、0 986 648、0 648 265和0 338 266；PCT公开号WO 04/013299、WO 01/07478、WO00/06715、WO 99/43842、WO 99/27118、WO 98/55637、WO 94/00569和WO 89/09219。额外的实例包括例如在PCT公开号WO02/076508、WO 03/093469、WO 02/097059；WO 02/096923；US公开号US 2003/0113917和US 2003/003435；和美国专利号6,025,155中提供的那些AC。
在本发明的其他实施方案中，AC通过在每世代中的雄性配子发生传递。AC可以是整合的或非整合的。在一个实施方案中，AC可以通过基本上所有分裂的细胞中的有丝分裂传递。在另一实施方案中，AC可以提供人免疫球蛋白核酸序列的不依赖于位置的表达。在具体实施方案中，AC可以通过每个雄性和雌性配子发生而具有至少10％的传递效率。在一个具体实施方案中，AC可以是环状的。在另一具体实施方案中，非整合AC可以是2000年3月27日以保藏号LMBP 5473 CB保藏在比利时微生物协调保藏中心——BCCM的非整合AC。在额外实施方案中，提供了产生AC的方法，其中鉴定含有通过雄性配子发生传递的外源核酸的有丝分裂稳定的单位；并且有丝分裂稳定的单位中的进入位点允许人免疫球蛋白基因整合到该单位中。
在其他实施方案中，提供了AC，其包括：功能性着丝粒、选择标记和/或独特克隆位点。在其他实施方案中，AC可以显示出一种或多种下面的性质：它可以作为独立的染色体稳定分离，免疫球蛋白序列可以以受控的方式插入并且可以从AC表达，它可以通过雄性和雌性种系有效传递和/或转基因动物可以在大于约30、40、50、60、70、80或90％的它的细胞中具有该染色体。
在具体的实施方案中，AC可以从成纤维细胞(如任何哺乳动物或者人成纤维细胞)分离，其中它是有丝分裂稳定的。将AC转移到仓鼠细胞中后，可以插入lox(如loxP)位点和选择标记位点。在其他实施方案中，AC可以维持有丝分裂稳定性，例如，不存在选择时，每次有丝分裂的损失小于约百分之5、2、1、0.5或0.25。也见US2003/0064509和WO 01/77357。
异种免疫球蛋白基因
在本发明的另一方面，提供了表达异种免疫球蛋白基因座或者其片段的转基因有蹄类动物，其中该免疫球蛋白可以从整合在内源有蹄类动物染色体的免疫球蛋白基因座表达。在一个实施方案中，提供了从转基因动物得到的有蹄类动物细胞。在一个实施方案中，该异种免疫球蛋白基因座被后代遗传。在另一实施方案中，该异种免疫球蛋白基因座可以通过雄性种系由后代遗传。在其他实施方案中，人工染色体(AC)可以含有异种免疫球蛋白。在一个实施方案中，AC可以是酵母AC或者哺乳动物AC。在进一步的实施方案中，异种基因座可以是人免疫球蛋白基因座或者其片段。在一个实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以是人14号染色体、人2号染色体和人22号染色体或其片段。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括人免疫球蛋白的任意片段，该片段可以经历重排。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括人免疫球蛋白重链和人免疫球蛋白轻链的任意片段，其可以经历重排。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括任意人免疫球蛋白基因座或者其片段，其在暴露于抗原后可以产生抗体。在具体实施方案中，应答对一种或多种抗原的暴露，所述外源人免疫球蛋白可以在B细胞中表达以产生异种免疫球蛋白。
在其他实施方案中，缺少功能性内源免疫球蛋白的任何表达的转基因有蹄类动物可以进一步基因修饰以表达异种免疫球蛋白基因座。在备选实施方案中，提供了含有异种免疫球蛋白基因座的猪动物。在一个实施方案中，异种免疫球蛋白基因座可以是重链和/或轻链免疫球蛋白或者其片段。在另一个实施方案中，异种免疫球蛋白基因座可以是κ链基因座或者其片段和/或λ链基因座或者其片段。在其他实施方案中，人工染色体(AC)可以含有异种免疫球蛋白。在一个实施方案中，AC可以是酵母AC或者哺乳动物AC。在另一实施方案中，异种基因座可以是人免疫球蛋白基因座或者其片段。在一个实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以是人14号染色体、人2号染色体和人22号染色体或者其片段。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括人免疫球蛋白的任意片段，该片段可以经历重排。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括人免疫球蛋白重链和人免疫球蛋白轻链的任意片段，其可以经历重排。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括任意人免疫球蛋白基因座或者其片段，其在暴露于抗原后可以产生抗体。在具体实施方案中，应答对一种或多种抗原的暴露，所述外源人免疫球蛋白可以在B细胞中表达以产生异种免疫球蛋白。
在其他实施方案中，缺少功能性内源免疫球蛋白的任何表达的转基因有蹄类动物可以进一步基因修饰以表达异种免疫球蛋白基因座。在备选实施方案中，提供了含有异种免疫球蛋白基因座的猪动物。在一个实施方案中，异种免疫球蛋白基因座可以是重链和/或轻链免疫球蛋白或者其片段。在另一个实施方案中，异种免疫球蛋白基因座可以是κ链基因座或者其片段和/或λ链基因座或者其片段。在其他实施方案中，人工染色体(AC)可以含有异种免疫球蛋白。在一个实施方案中，AC可以是酵母AC或者哺乳动物AC。在另一实施方案中，异种基因座可以是人免疫球蛋白基因座或者其片段。在一个实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以是人14号染色体、人2号染色体和人22号染色体或者其片段。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括人免疫球蛋白的任意片段，该片段可以经历重排。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括人免疫球蛋白重链和人免疫球蛋白轻链的任意片段，其可以经历重排。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括任意人免疫球蛋白基因座或者其片段，其在暴露于抗原后可以产生抗体。在具体实施方案中，应答对一种或多种抗原的暴露，所述外源人免疫球蛋白可以在B细胞中表达以产生异种免疫球蛋白。
在另一实施方案中，提供了含有异种免疫球蛋白基因座的猪动物。在一个实施方案中，异种免疫球蛋白基因座可以是重链和/或轻链免疫球蛋白或者其片段。在另一个实施方案中，异种免疫球蛋白基因座可以是κ链基因座或者其片段和/或λ链基因座或者其片段。在其他实施方案中，人工染色体(AC)可以含有异种免疫球蛋白。在一个实施方案中，AC可以是酵母AC或者哺乳动物AC。在另一实施方案中，异种基因座可以是人免疫球蛋白基因座或者其片段。在一个实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以是人14号染色体、人2号染色体和人22号染色体或者其片段。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括人免疫球蛋白的任意片段，该片段可以经历重排。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括人免疫球蛋白重链和人免疫球蛋白轻链的任意片段，其可以经历重排。在另一实施方案中，人免疫球蛋白基因座可以包括任意人免疫球蛋白基因座或者其片段，其在暴露于抗原后可以产生抗体。在具体实施方案中，应答对一种或多种抗原的暴露，所述外源人免疫球蛋白可以在B细胞中表达以产生异种免疫球蛋白。
可以将人免疫球蛋白基因，如Ig重链基因(人414号染色体)、Igκ链基因(人2号染色体)和/或Igλ链基因(22号染色体)插入到Ac中，如上述。在具体实施方案中，人重链、κ和/或λIg基因的任意部分可以插入到AC中。在一个实施方案中，核酸可以与来自人的天然存在的核酸的对应区域至少70、80、90、95或99％相同。在其他实施方案中，有蹄类动物产生超过一类的人抗体。在各种实施方案中，有蹄类动物产生超过一种不同的人Ig或者抗体。在一个实施方案中，可以导入含有人Ig重链基因和Ig轻链基因两者的AC，如自主人人工染色体(“AHAC”，在体内通过内源表达的限制性内切核酸酶转化成线性人染色体的环状重组核酸分子)。在一个实施方案中，人重链基因座和轻链基因座在不同的染色体臂(即，在着丝粒的不同侧)上。在一个实施方案中，重链可以包括μ重链，且轻链可以是λ或κ轻链。Ig基因可以在一个或超过一个的AC中同时或顺序导入。
在具体实施方案中，有蹄类动物或者有蹄类动物细胞表达编码人Ig基因的全部或者部分的一种或多种核酸，所述人Ig基因经历重排并且表达超过一种的人Ig分子，如人抗体蛋白质。从而，编码人Ig链或者抗体的核酸为其未重排的形式(即，该核酸没有经历V(D)J重组)。在具体实施方案中，编码抗体轻链的V基因区段的所有核酸区段可以与编码J基因区段的所有核酸区段通过一个或多个核苷酸隔开。在具体实施方案中，编码抗体重链的V基因区段的所有核酸区段可以与编码D基因区段的所有核酸区段通过一个或多个核苷酸隔开，和/或编码抗体重链的D基因区段的所有核酸区段可以与编码J基因区段的所有核酸区段通过一个或多个核苷酸隔开。向含有未重排的人Ig基因的转基因有蹄类动物施用抗原后，接着在人Ig基因座中核酸区段重排并产生与抗原反应的人抗体。
在一个实施方案中，AC可以表达人染色体的部分或者片段，其含有免疫球蛋白基因。在一个实施方案中，AC可以表达人轻链基因座的至少300或者1300kb，如Davies等人1993 Biotechnology 11：911-914中所述。
在另一实施方案中，AC可以表达人22号染色体的部分，其含有至少λ轻链基因座，包括Vλ基因区段、Jλ基因区段和单个Cλ基因。在另一实施方案中，AC可以表达至少一个Vλ基因区段、至少一个Jλ基因区段和Cλ基因。在其他实施方案中，AC可以含有λ基因座的部分，如Popov等人J Exp Med.1999 May 17；189(10)：1611-20中描述。
在另一实施方案中，AC可以表达人2号染色体的部分，其含有至少κ轻链基因座，包括Vκ基因区段、Jκ基因区段和单个Cκ基因。在另一实施方案中，AC可以表达至少一个Vκ基因区段、至少一个Jκ基因区段和Cκ基因。在其他实施方案中，含有κ轻链基因座的部分的AC可以是例如Li等人2000 J Immunol 164：812-824和Li SProc Natl Acad Sci U S A.1987 Jun；84(12)：4229-33中描述的那些。在另一实施方案中，提供了含有约1.3Mb人κ基因座的AC，如Zou等人FASEB J.1996 Aug；10(10)：1227-32中所述。
在其他实施方案中，AC可以表达人14号染色体的部分，其含有至少人重链基因座，包括VH、DH、JH和CH基因区段。在另一实施方案中，AC可以表达至少一个VH基因区段、至少一个DH基因区段、至少一个JH基因区段和至少一个CH基因区段。在其他实施方案中，AC可以表达人重链基因座的至少85kb，如Choi等人1993 Nat Gen4：117-123和/或Zou等人1996 PNAS 96：14100-14105中所述。
在其他实施方案中，AC可以表达重链和轻链基因座的部分，如至少220、170、800或1020kb，如Green等人1994 Nat Gen 7：13-22；Mendez等人，1995 Genomics 26：294-307；Mendez等人1997Nat Gen 15：146-156；Green等人1998 J Exp Med 188：483-495和/或Fishwild等人1996 Nat Biotech 14：845-851中公开的。在另一实施方案中，AC可以表达兆碱基量的人免疫球蛋白，如Nicholson JImmunol.1999 Dec 15；163(12)：6898-906和Popov Gene.1996 Oct24；177(l-2)：195-201中所述。此外，在一个具体实施方案中，来自人14号染色体(包含Ig重链基因)、人2号染色体(包含Igκ链基因)和人22号染色体(包含Igλ链基因)的MAC可以同时或者连续导入，如Robl等人的美国专利公开号2004/0068760中所述。在另一实施方案中，MAC的总大小小于或者等于约10、9、8或者7兆碱基。
在具体实施方案中，可以将种系构型的人免疫球蛋白的人Vh、人Dh、人Jh区段和人μ区段插入AC，如YAC，从而使得Vh、Dh、Jh和μDNA区段形成免疫球蛋白谱，其含有对应于人DNA区段的部分，例如，如Babraham Insttitute的美国专利号5,545,807所述。此类AC在插入有蹄类动物细胞和产生有蹄类动物后可以产生重链免疫球蛋白。在一个实施方案中，这些免疫球蛋白可以形成功能性重链-轻链免疫球蛋白。在另一实施方案中，这些免疫球蛋白可以以允许从有蹄类动物的合适的细胞或者体液回收的量表达。此类免疫球蛋白可以插入酵母人工染色体载体，如Burke，D T，Carle，G F和Olson，MV(1987)＂Cloning of large segments of exogenous DNA into yeast bymeans of artificial chromosome vectors＂Science，236，806-812所述，或者通过导入染色体片段(如Richer，J和Lo，C W(1989)＂Introduction of human DNA into mouse eggs by injection ofdissected human chromosome fragments＂Science 245，175-177所述)。
关于含有人免疫球蛋白基因的特定AC的额外信息可以见例如Giraldo & Montoliu(2001)Transgenic Research 10：83-103和Peterson(2003)Expert Reviews in Molecular Medicine 5：1-25的最近综述。
AC转移方法
可以首先将人免疫球蛋白基因插入AC中然后可以将含有人免疫球蛋白的AC插入有蹄类动物细胞中。备选地，可以将AC转移到中间哺乳动物细胞，如CHO细胞，之后插入到有蹄类动物细胞中。在一个实施方案中，中间哺乳动物细胞也含有AC并且第一种AC可以插入到哺乳动物细胞的该AC中。具体地，可以将酵母细胞中含有人免疫球蛋白基因或者其片段的YAC转移到含有MAC的哺乳动物细胞。YAC可以插入到MAC中。然后MAC转移到有蹄类动物细胞。可以通过同源重组将人Ig基因插入AC中。所得的含有人Ig基因的AC可以接着导入有蹄类动物细胞中。可以通过本文描述的或者本领域已知的技术选择一种或多种有蹄类动物细胞，其含有包含人Ig的AC。
本文提供了用于导入AC的合适宿主，其包括但不限于任何动物或植物、其细胞或组织，包括但不限于：哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖类、昆虫、鱼、蜘蛛、烟草、番茄、小麦、单子叶植物、双子叶植物和藻类。在一个实施方案中，可以通过本领域已知的任意试剂浓缩AC(Marschall等人，Gene Ther.1999 Sep；6(9)：1634-7)，所述试剂包括但不限于，精胺、亚精胺、聚氮丙啶，和/或聚赖氨酸，之后导入细胞中。通过细胞融合或者微细胞融合或者分离后通过本领域技术人员已知的任意方法可以导入AC，所述方法包括但不限于：直接DNA转移、电穿孔、核转移、微细胞融合、细胞融合、原生质球融合、脂质介导的转移、脂转染、脂质体、微粒轰击、显微注射、磷酸钙沉淀和/或任意其他合适的方法。用于将DNA导入细胞的其他方法包括核显微注射、电穿孔、细菌与完整细胞的原生质体融合。也可以使用聚阳离子，如1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物和聚鸟氨酸。关于用于转化哺乳动物细胞的各种技术，见例如，Keown等人Methods in Enzymology(1990)Vol.185，pp.527-537；和Mansour等人(1988)Nature 336：348-352。
通过直接DNA转化、在细胞或者胚胎中显微注射、植物的原生质体再生、电穿孔、微粒枪和本领域技术人员已知的其他此类方法可以导入AC(见例如，Weissbach等人(1988)Methods for PlantMolecular Biology，Academic Press，N.Y.，Section VIII，pp.421-463；Grierson等人(1988)Plant Molecular Biology，2d Ed.，Blackie，London，Ch.7-9；还见例如，美国专利号5,491,075；5,482,928；和5,424,409；还见例如，美国专利号5,470,708，)。
在具体实施方案中，可以使用含有人Ig基因的一种或多种分离的YAC。可以通过本领域已知的任意试剂浓缩分离的YAC(Marschall等人，Gene Ther.1999 Sep；6(9)：1634-7)，所述试剂包括但不限于，精胺、亚精胺、聚氮丙啶，和/或聚赖氨酸。然后通过本领域中已知的任意方法(例如，显微注射、电穿孔、脂质介导的转染等等)将浓缩的YAC转移到猪细胞。备选地，可以通过精子介导的基因转移或者胞质内精子注射技术(ICSI)介导的基因转移将浓缩的YAC转移到卵母细胞。在一个实施方案中，可以用原生质球融合将含有人Ig基因的YAC转移到猪细胞。
在本发明的其他实施方案中，含有人Ig的AC可以插入到成年、胎儿或者胚胎有蹄类动物细胞中。有蹄类动物细胞的额外实例包括未分化的细胞，如胚胎细胞(如胚胎干细胞)、分化的或者体细胞，如上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞、肌细胞、来自雌性生殖系统的细胞，如乳腺、卵丘、卵泡或者输卵管细胞、生殖细胞、胎盘细胞，或者来自任何器官，如膀胱、脑、食管、输卵管、心脏、肠、胆囊、肾、肝、肺、卵巢、胰、前列腺、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、输尿管、尿道、和子宫的细胞或者本文中描述的任何其他细胞类型。
位点特异性重组酶介导的转移
在本发明的具体实施方案中，含有人免疫球蛋白基因的AC向猪细胞，如本文描述的或者本领域已知的那些细胞的转移可以通过位点特异性重组酶介导的转移来完成。在一个具体实施方案中，可以将AC转移到猪成纤维细胞。在另一具体实施方案中，AC可以是YAC。
在本发明的其他实施方案中，含有位点特异性重组酶靶位点的环化DNA，如AC可以转移到在其基因组中具有位点特异性重组酶靶位点的细胞系中。在一个实施方案中，细胞的位点特异性重组酶靶位点可以位于外源染色体内。外源染色体可以是不整合在宿主的内源基因组中的人工染色体。在一个实施方案中，AC可以通过种系传递转移到后代。在一个具体实施方案中，含有人免疫球蛋白基因或者其片段的YAC可以通过位点特异性重组酶环化，且然后转移到含有MAC的宿主细胞中，其中MAC含有位点特异性重组酶位点。然后现在含有人免疫球蛋白基因座或者其片段的该MAC可以与猪细胞，如但不限于，成纤维细胞融合。然后该猪细胞可以用于核转移。
在本发明的一些实施方案中，在插入有蹄类动物细胞中前，含有人免疫球蛋白基因或者其片段的AC可以转移到哺乳动物细胞，如CHO细胞。在一个实施方案中，中间哺乳动物细胞也含有AC并且第一种AC可以插入到哺乳动物细胞的该AC中。具体地，可以将酵母细胞中含有人免疫球蛋白基因或者其片段的YAC转移到含有MAC的哺乳动物细胞。YAC可以插入到MAC。然后MAC可转移到有蹄类动物细胞。在具体实施方案中，含有人Ig基因或者其片段的YAC可以含有位点特异性重组酶靶基因。YAC可以首先通过应用合适的位点特异性重组酶环化，然后插入到含有其自身的位点特异性重组酶靶位点的哺乳动物细胞中。然后，可以应用位点特异性重组酶以将YAC整合到中间哺乳动物细胞中的MAC中。位点特异性重组酶可以顺式或者反式应用。具体地，位点特异性重组酶可以反式应用。在一个实施方案中，位点特异性重组酶可以通过位点特异性重组酶表达质粒，如Cre表达质粒的转染来表达。此外，YAC的一个端粒区也可以用选择标记，如本文描述的或者本领域已知的选择标记改进(retrofit)。然后可以将中间哺乳动物细胞的MAC内的人Ig基因或者其片段转移到有蹄类动物细胞，如成纤维细胞中。
备选地，含有人Ig基因或者其片段的AC，如YAC可以含有任选位于每个端粒附近的位点特异性重组酶靶位点。YAC可以首先通过应用合适的位点特异性重组酶环化，然后插入到在其基因组内含有其自身位点特异性重组酶靶位点的有蹄类动物细胞中。备选地，有蹄类动物细胞可以含有其自身的MAC，该MAC含有位点特异性重组酶靶位点。在该实施方案中，YAC可以直接插入有蹄类动物细胞的内源基因组中。在具体实施方案中，有蹄类动物细胞可以是成纤维细胞或者可以用于核转移的任何其他合适的细胞。见例如，图7；Call等人，Hum Mol Genet.2000 JuI 22；9(12)：1745-51。
在其他实施方案中，提供了环化至少100kb DNA的方法，其中DNA然后通过位点特异性重组酶整合到宿主基因组中。在一个实施方案中，可以环化至少100、200、300、400、500、1000、2000、5000、10,000kb的DNA。在另一实施方案中，可以环化至少1000、2000、5000、10,000或20,000兆碱基的DNA。在一个实施方案中，通过将位点特异性重组酶靶位点附着在DNA序列的每个末端，然后应用位点特异性重组酶以导致DNA的环化可以完成DNA的环化。在一个实施方案中，位点特异性重组酶靶位点可以是lox。在另一实施方案中，位点特异性重组酶靶位点可以是Flt。在一些实施方案中，DNA可以是人工染色体，如YAC或者本文描述的或者本领域已知的任何AC。在另一实施方案中，AC可以含有人免疫球蛋白基因座或者其片段。
在另一优选的实施方案中，YAC可以转化成或者整合在人工哺乳动物染色体内。哺乳动物人工染色体可以转移到或者包含在猪细胞内。可以通过本领域已知的任意方法将人工染色体导入猪基因组内，所述方法包括但不限于直接注射中期染色体、脂质介导的基因转移或者微细胞融合。
位点特异性重组酶包括识别并结合短核酸位点或者序列特异性重组酶靶位点，即，重组酶识别位点，并催化与这些位点有关的核酸重组的酶或者重组酶。这些酶包括重组酶、转座酶和整合酶。序列特异性重组酶靶位点的实例包括，但不限于，lox位点、att位点、dif位点和frt位点。位点特异性重组酶的非限制性实例包括，但不限于，噬菌体P1 Cre重组酶、酵母FLP重组酶、Inti整合酶、λ噬菌体、phi 80、P22、P2、186和P4重组酶、Tn3解离酶、Hin重组酶和Cin重组酶、大肠杆菌xerC和xerD重组酶、苏云金芽孢杆菌重组酶、TpnI和β-内酰胺酶转座子，和免疫球蛋白重组酶。
在一个实施方案中，重组位点可以是噬菌体P1的Cre重组酶识别的lox位点。Lox位点指噬菌体P1的cre基因产物Cre重组酶可以催化位点特异性重组事件所处的核苷酸序列。多种lox位点是本领域已知的，包括天然存在的loxP、loxB、loxL和loxR，以及许多突变体或者变体lox位点，如loxP511、loxP514、lox.DELTA.86、lox.DELTA.117、loxC2、loxP2、loxP3和lox P23。Lox位点的额外实例包括，但不限于loxB、loxL、loxR、loxP、loxP3、loxP23、loxΔ86、loxΔ117、loxP511和loxC2。
在另一实施方案中，重组位点是非Cre的重组酶识别的重组位点。在一个实施方案中，重组酶位点可以是啤酒糖酵母的2pi质粒的FLP重组酶识别的FRT位点。FRT位点指酵母2μ质粒的FLP基因产物FLP重组酶催化位点特异性重组所处的核苷酸序列。非-Cre重组酶的额外实例包括，但不限于位点特异性重组酶，包括：λ噬菌体的Int重组酶识别的att位点(例如，att1、att2、att3、attP、attB、attL和attR)、解离酶家族识别的重组位点和苏云金芽孢杆菌的转座酶识别的重组位点。
IV.产生基因修饰动物
在本发明的额外方面，通过本领域技术人员已知的任意方法可以产生含有本文描述的基因修饰的有蹄类动物。此类方法包括，但不限于：核转移、胞质内精子注射技术、合子直接修饰和精子介导的基因转移。
在另一实施方案中，克隆此类动物如猪的方法包括：将卵母细胞去核、将卵母细胞与来自细胞的供体核融合，所述细胞中至少一种免疫球蛋白基因的至少一个等位基因已经被灭活，和将核转移得到的胚胎植入替代母亲中。
备选地，通过灭活胚胎干细胞中免疫球蛋白基因的两个等位基因，提供了产生缺少功能性免疫球蛋白的任何表达的活动物的方法，所述细胞然后可以用于产生后代。
在另一方面，本发明还提供了产生活动物，如猪的方法，其中已经使得免疫球蛋白基因的两个等位基因都失活。在一个实施方案中，通过使用来自细胞的供体细胞核克隆产生了动物，所述细胞中免疫球蛋白基因的两个等位基因都被灭活。在一个实施方案中，通过遗传寻靶事件灭活免疫球蛋白基因的两个等位基因。
通过直接修饰合子可以产生基因改造动物。对于哺乳动物，可以将经修饰的合子导入能够怀有该动物至足月的假孕雌性的子宫中。例如，如果需要缺少免疫球蛋白基因的完整动物，那么来自该动物的胚胎干细胞可以被寻靶并且以后导入胚泡中以使修饰的细胞生长成嵌合动物。对于胚胎干细胞，可以使用胚胎干细胞系或者新鲜得到的干细胞。
在本发明的合适的实施方案中，全能细胞是胚胎干(ES)细胞。从胚泡分离ES细胞、确立ES细胞系和它们的随后培养可通过常规方法进行，如Doetchmann等人，J.Embryol.Exp.Morph.87：27-45(1985)；Li等人，Cell 69：915-926 (1992)；Robertson，E.J.＂Tetracarcinomas and Embryonic Stem Cells：A PracticalApproach，＂ed.E.J.Robertson，IRL Press，Oxford，England(1987)；Wurst和Joyner，＂Gene Targeting：A Practical Approach，＂ed.A.L.Joyner，IRLPress，Oxford，England(1993)；Hogen等人，＂Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual，＂eds.Hogan，Beddington，Costantini and Lacy，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(1994)；and Wang等人，Nature336：741-744(1992)所述。在本发明的另一合适的实施方案中，全能细胞是胚胎生殖干(EG)细胞。胚胎生殖干细胞是与ES细胞在功能上等价的未分化的细胞，即，它们可以在体外培养和转染，然后有助于嵌合体的体细胞和生殖细胞谱系(Stewart等人，Dev.Biol.161：626-628(1994))。通过培养原生殖细胞——配子的祖先与生长因子：白血病抑制因子、青灰因子和碱性成纤维细胞生长因子的组合得到EG细胞(Matsui等人，Cell 70：841-847(1992)；Resnick等人，Nature359：550-551(1992))。可以使用Donovan等人，＂Transgenic Animals，Generation and Use，＂Ed.L.M.Houdebine，Harwood AcademicPublishers(1997)和其中引用的原始文献中描述的方法进行EG细胞的培养。
用于本发明的四倍体胚泡可以通过天然合子产生和发育得到，或者通过已知的二细胞胚胎的电融合和随后的培养得到，如James等人，Genet.Res.Camb.60：185-194(1992)；Nagy和Rossant，＂GeneTargeting：A Practical Approach，＂ed.A.L.Joyner，IRL Press，Oxford，England(1993)；或Kubiak和Tarkowski，Exp.Cell Res.157：561-566(1985)所述。
可以通过本领域已知的任意方法进行ES细胞或者EG细胞向胚泡中的导入。用于本发明目的的合适的方法是如Wang等人，EMBOJ.10：2437-2450(1991)所述的显微注射方法。
备选地，通过修饰的胚胎干细胞可以产生转基因动物。可以根据常规技术将基因修饰胚胎干细胞注射到胚泡然后在雌性宿主哺乳动物中使其足月。然后可以使用诸如PCR或者DNA印迹的技术，对杂合后代筛选靶基因座位点上所述改变的存在。与相同物种的野生型宿主交配后，可以将所得嵌合子代杂交以得到纯合宿主。
用寻靶载体转化胚胎干细胞以改变免疫球蛋白基因后，可以将细胞铺平板在合适的培养基，如胎牛血清增强的DMEM中的饲养层上。使用选择培养基可以检测含有构建体的细胞，并且菌落生长足够的时间后，可以挑取菌落并分析同源重组的发生。可以使用聚合酶链反应，引物在构建体序列内和外，但是在靶基因座上。然后显示出同源重组的那些菌落可以用于胚胎操作和胚泡注射。可以从超排卵的雌性得到胚泡。然后可以将胚胎干细胞胰蛋白酶消化并将经修饰的细胞加入含有胚泡的小滴。可以将至少一个经修饰的胚胎干细胞注射到胚泡的囊胚腔中。注射后，至少一个胚泡可以返回到假孕雌性的每个子宫角。然后允许雌性足月并对所得的胎仔(litter)筛选具有所述构建体的突变细胞。从转化的ES细胞选择胚泡的不同家系。通过提供不同表型的胚泡和ES细胞，可以容易地检测嵌合后代，且然后进行基因型分型以探测经修饰的免疫球蛋白基因的存在。
在其他实施方案中，精子介导的基因转移可以用于产生本文描述的基因修饰有蹄类动物。本文描述的用于消除内源免疫球蛋白的表达或者插入异种免疫球蛋白基因的方法和组合物可以用于通过本文描述或者本领域已知的任意技术基因修饰精细胞。基因修饰精子然后可以通过人工受精、胞质内精子注射技术或者任何其他已知的技术用于使雌性受体怀孕。在一个实施方案中，精子和/或精子头可以与外源核酸温育足够的时间段。足够的时间段包括例如，约30秒到约5分钟，通常约45秒到约3分钟，更一般约1分钟到约2分钟。在具体实施方案中，异种的，如人免疫球蛋白基因在如本文描述的有蹄类动物中的表达可以通过胞质内精子注射技术完成。
精细胞作为基因转移的载体的潜在用途首次由Brackett等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 68：353-357(1971)提出。接着报导了卵母细胞与已经通过裸DNA温育的精子的体外受精后产生转基因小鼠和猪(见，例如，Lavitrano等人，Cell 57：717-723(1989)和Gandolfi等人Journal of Reproduction and Fertility Abstract Series 4，10(1989))，尽管其他实验室不能重复这些实验(见例如，Brinster等人Cell 59：239-241(1989)和Gavora等人，Canadian Journal of AnimalScience 71：287-291(1991))。从这以后，几个报导描绘了鸡(见，例如，Nakanishi和Iritani，Mol.Reprod.Dev.36：258-261(1993))；小鼠(见，例如，Maione，Mol.Reprod.Dev.59：406(1998))；和猪(见，例如，Lavitrano等人Transplant.Proc.29：3508-3509(1997)；Lavitrano等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：14230-5(2002)；Lavitrano等人，Mol.Reprod.Dev.64-284-91(2003))的成功的精子介导的基因转移。类似的技术也在2002年4月23日授权的美国专利号6,376,743、2001年11月22日公开的美国专利公开号20010044937和2002年8月8日公开的20020108132中描述。
在其他实施方案中，胞质内精子注射可以用于产生本文描述的基因修饰有蹄类动物。这可以如下完成：将外源核酸和精子共同插入(coinserting)未受精的卵母细胞的细胞质中以形成转基因的受精的卵母细胞，并允许转基因的受精的卵母细胞发育成转基因胚胎，且如果需要，发育成活的后代。精子可以是膜破坏的精子头或者去膜(demembraned)的精子头。共同插入步骤可以包括将精子与外源核酸预温育足够的时间段的子步骤，如约30秒到约5分钟，通常约45秒到约3分钟，更通常约1分钟到约2分钟。通过显微注射可以将精子和外源核酸共同插入卵母细胞中。与精子混合的外源核酸可以含有超过一种的转基因，以产生对本文描述的超过一种的转基因为转基因的胚胎。胞质内精子注射可以通过本领域已知的任一种技术完成，见，例如，美国专利号6,376,743。在具体实施方案中，异种的，如人免疫球蛋白基因在如本文描述的有蹄类动物中的表达可以通过胞质内精子注射完成。
本领域已知的任何额外的技术都可以用于向动物中导入转基因。此类技术包括，但不限于前核显微注射(见，例如，Hoppe，P.C.和Wagner，T.E.，1989，美国专利号4,873,191)；向种系的逆转录病毒介导的基因转移(见，例如，Van der Putten等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 82：6148-6152)；胚胎干细胞中的基因寻靶(见，例如，Thompson等人，1989，Cell 56：313-321；Wheeler，M.B.，1994，WO 94/26884)；胚胎的电穿孔(见，例如，Lo，1983，Mol Cell.Biol.3：1803-1814)；细胞枪(cell gum)；转染；转导；逆转录病毒感染；腺病毒感染；腺伴随病毒感染；脂质体介导的基因转移；裸DNA转移；和精子介导的基因转移(见，例如，Lavitrano等人，1989，Cell57：717-723)等等。关于这种技术的综述，见例如，Gordon，1989，Transgenic Animals，Intl.Rev.Cytol.115：171-229。在具体实施方案中，通过这些技术可以完成异种的如人免疫球蛋白基因在如本文描述的有蹄类动物中的表达。
体细胞核转移以产生克隆的转基因后代
在本发明的另一方面，缺少有蹄类动物重链、κ轻链和/或λ轻链基因的一个等位基因、任选地两个等位基因的有蹄类动物，如猪或者牛细胞可以用作供体细胞以核转移到受体细胞中而产生克隆的转基因动物。备选地，可以在胚胎干细胞中产生有蹄类动物重链、κ轻链和/或λ轻链基因敲除体，其然后用于产生后代。根据本文描述的方法、序列和/或构建体产生的缺少功能性有蹄类动物重链、κ轻链和/或λ轻链基因的单个等位基因的后代可以育种以进一步通过孟德尔型遗传产生在两个等位基因中缺少功能性的后代。
在另一实施方案中，本发明提供了产生缺少功能性α-1，3-GT的任何表达的活猪的方法，其通过将对α-1，3-GT基因杂合的公猪与对α-1，3-GT基因杂合的母猪育种实现。在一个实施方案中，由于α-1，3-GT基因的一个等位基因的基因修饰以防止该等位基因表达，所以猪是杂合的。在另一实施方案中，由于α-1，3-GT基因的一个等位基因中存在点突变，所以猪是杂合的。在另一实施方案中，点突变可以是在α-1，3-GT基因的外显子9的第二个碱基处T到G的点突变。在一个具体实施方案中，提供了产生缺少功能性α-1，3-GT的任何表达的猪动物的方法，其中将在α-1，3-GT基因的外显子9的第二个碱基处含有T到G的点突变的公猪与在α-1，3-GT基因的外显子9的第二个碱基处含有T到G的点突变的母猪育种，或反过来也一样。
本发明提供了通过体细胞核转移克隆缺少功能性免疫球蛋白基因的动物如猪的方法。通常，通过核转移方法可以产生动物，所述方法包括下面的步骤：得到将用作供体核来源的所需的分化细胞；从动物得到卵母细胞；将所述卵母细胞去核；将所需的分化细胞或者细胞核转移到去核的卵母细胞中，例如，通过融合或者注射，以形成NT单位；激活所得的NT单位；并将所述培养的NT单位转移到宿主动物，从而NT单位发育成胎儿。
核转移技术或者核移植技术是本领域已知的(Dai等人NatureBiotechnology 20：251-255；Polejaeva等人，Nature 407：86-90(2000)；Campbell等人，Theriogenology，43：181(1995)；Collas等人，Mol.Report Dev.，38：264-267(1994)；Keefer等人，Biol.Reprod.，50：935-939(1994)；Sims等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，90：6143-6147(1993)；WO 94/26884；WO 94/24274，和WO 90/03432，美国专利号4,944,384和5,057,420)。
将已经修饰以改变免疫球蛋白基因的供体细胞核转移到受体卵母细胞。该方法的用途不限于具体供体细胞类型。供体细胞可以如本文描述，也见例如，Wilmut等人，Nature 385 810(1997)；Campbell等人，Nature 380 64-66(1996)；Dai等人，Nature Biotechnology20：251-255，2002或Cibelli等人，Science 280 1256-1258(1998)。可以使用可成功地用于核转移的正常核型的所有细胞，包括胚胎、胎儿和成年体细胞。胎儿成纤维细胞是尤其有用的一类供体细胞。通常，用于核转移的合适的方法在Campbell等人，Theriogenology 43 181(1995)，Dai等人Nature Biotechnology 20：251-255，Polejaeva等人，Nature 407：86-90(2000)，Collas等人，Mol.Reprod.Dev.38264-267(1994)，Keefer等人，Biol.Reprod.50 935-939(1994)，Sims等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 90 6143-6147(1993)，WO-A-9426884、WO-A-9424274、WO-A-9807841、WO-A-9003432、美国专利号4,994,384和美国专利号5,057,420中描述。还可以使用分化或者至少部分分化的供体细胞。供体细胞还可以但不必须是培养的并且可以是休眠的。休眠的核供体细胞是可以被诱导以进入休眠或者在体内以休眠状态存在的细胞。现有技术方法也已经在克隆程序中使用胚胎细胞类型(Campbell等人，(Nature，380：64-68，1996)和Stice等人，(Biol.Reprod.，20 54：100-110，1996)。
可以从多种不同的器官和组织得到体细胞核供体细胞，所述器官和组织如，但不限于，皮肤、间充质、肺、胰、心脏、肠、胃、膀胱、血管、肾、尿道、生殖器官，和胚胎、胎儿或成年动物的完整或者部分的解聚制剂。在本发明的合适的实施方案中，核供体细胞选自上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B和T)、巨噬细胞、单核细胞、单核的细胞、心肌细胞、其他肌细胞、xtended
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细胞、卵丘细胞、表皮细胞或内皮细胞。在另一实施方案中，核供体细胞是胚胎干细胞。在具体实施方案中，成纤维细胞可以用作供体细胞。
在本发明的另一实施方案中，本发明的核供体细胞是动物的生殖细胞。动物物种的处于胚胎、胎儿或者成年阶段的任何生殖细胞都可以用作核供体细胞。在合适的实施方案中，核供体细胞是胚胎生殖细胞。
核供体细胞可以停滞在细胞周期的任意阶段(G0、G1、G2、S、M)以便确保与受体细胞协调。本领域已知的任意方法都可以用于操作细胞周期阶段。控制细胞周期阶段的方法包括，但不限于通过培养的细胞的接触抑制诱导的G0休眠、通过除去血清或者其他必需营养物诱导的G0休眠、通过衰老诱导的G0休眠、通过加入特定生长因子诱导的G0休眠；通过物理或者化学手段如热激、高压或者用化学制剂、激素、生长因子或者其他物质处理诱导的G0或者G1休眠；通过用干扰复制过程的任意点的化学试剂处理进行S期控制；通过用荧光激活细胞分选、有丝分裂抖落、用微管破坏剂或破坏有丝分裂进展的任何化学制剂处理进行M期控制(也见Freshney，R.I，.＂Cultureof Animal Cells：A Manual of Basic Technique，＂Alan R.Liss，Inc，New York(1983)。
分离卵母细胞的方法是本领域公知的。基本上，这可以包括从动物的卵巢或者生殖道分离卵母细胞。卵母细胞的容易获得的来源是屠宰场材料。对于如基因工程、核转移和克隆的技术的组合，卵母细胞必须通常在体内成熟，之后这些细胞才可以用作核转移的受体细胞，并且之后它们通过由精细胞受精以发育成胚胎。该方法通常需要从哺乳动物卵巢，如在屠宰场得到的牛卵巢收集不成熟(前期I)卵母细胞，并在受精或者去核前在成熟培养基中成熟，直到卵母细胞达到中期II阶段，其对于牛卵母细胞通常在抽吸后约18-24小时发生。该时间段称作“成熟时间段”。在一些实施方案中，从育肥小母猪(gilt)得到卵母细胞。“育肥小母猪”是从未有过后代的母猪。在其他实施方案中，从母猪得到卵母细胞。“母猪”是以前产生后代的母猪。
中期II阶段卵母细胞可以是受体卵母细胞，在该阶段认为卵母细胞可以被或者被足够“激活”以与处理受精精子一样处理导入的细胞核。已经在体内成熟的中期II阶段卵母细胞已经成功地用于核转移技术。基本上，可以在动情期开始后或者人绒毛膜促性腺激素(hCG)或者类似的激素注射后35到48、或者39到41小时从非超排卵的或者超排卵的动物通过外科手术收集成熟的中期II卵母细胞。可以将卵母细胞置于合适的培养基，如透明质酸酶(hyalurodase)溶液中。
固定时间的成熟时间段(其为约10到40小时，约16-18小时，约40-42小时或约39-41小时)后，可以对卵母细胞去核。在去核前，可以取出卵母细胞并将其放置在合适的培养基，如含有1mg/ml透明质酸酶的HECM中，之后取出卵丘细胞。可以对带状卵母细胞筛选极体，并且然后将如通过极体的存在选择的中期II卵母细胞用于核转移。如下所述去核。
通过已知的方法，如美国专利号4,994,384中所述的进行去核。例如，可以将中期II卵母细胞置于HECM中，任选含有7.5微克/微升松胞菌素B，用于立即去核，或者可以置于合适的培养基，如胚胎培养基如CR1aa加10％动情期奶牛血清中，且然后去核，如不超过24小时后，或者不超过16-18小时后。
可以通过显微外科手术完成去核，其中使用微量移液管以取出极体和相邻的细胞质。然后可以筛选卵母细胞以鉴定已经成功去核的细胞。一种筛选卵母细胞的方法是用溶于HECM中的1微克/毫升33342Hoechst染料对卵母细胞染色，并然后在紫外线照射下观察卵母细胞小于10秒。然后可以将成功去核的卵母细胞置于合适的培养基，如CR1aa加10％血清中。
然后可以将与去核的卵母细胞相同物种的单个哺乳动物细胞转移到用于产生NT单位的去核卵母细胞的卵周隙。哺乳动物细胞和去核的卵母细胞可以用于根据本领域已知的方法产生NT单位。例如，可以通过电融合融合细胞。通过提供足够导致质膜的瞬时破裂的电脉冲完成电融合。该质膜的破裂非常短，因为膜快速重新形成。从而，如果诱导两个相邻的膜破裂并且在重新形成后，脂质双层混合，那么两个细胞之间可以打开小的通道。由于这种小开口的热力学不稳定性，它变大，直到两个细胞变成一个。见例如，Prather等人的美国专利号4,997,384。可以使用多种电融合介质，包括例如，蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇和磷酸缓冲溶液。使用仙台病毒作为融合剂也可以完成融合(Graham，Wister Inot.Symp.Monogr.，9，19，1969)。同样，不使用电穿孔融合，可以将细胞核直接注射到卵母细胞中。见，例如，Collas和Barnes，Mol.Reprod.Dev.，38：264-267(1994)。融合后，将所得融合的NT单位置于合适的培养基中直到活化，例如，CR1aa培养基。通常融合之后很短时间内，如融合后小于24小时后，或者约4-9小时后，或者最佳地融合后1-2小时实现活化。在具体实施方案中，在融合后至少1小时和成熟后40-41小时发生活化。
通过已知方法可以活化NT单位。此类方法包括例如，在亚生理学(sub-physiological)温度，大体上通过对NT单位应用冷，或者实际上凉的温度休克来培养NT单位。这可以最方便地通过在室温下培养NT来进行，所述室温相对于胚胎通常暴露的生理学温度条件是冷的。备选地，通过应用已知的活化剂可以实现活化。例如，已经表明在受精期间通过精子穿透卵母细胞可以活化预融合卵母细胞以在核转移后产生更大数目的活的妊娠和多个遗传上相同的小牛。同样，处理如电和化学休克可以用于在融合后活化NT胚胎。见例如，Susko-Parrish等人的美国专利号5,496,720。通过使用ECM2001Electrocell Manipulator(BTX Inc.，San Diego，CA)应用5V的AC脉冲5秒接着1.5kV/cm的两次每次60微秒的DC脉冲，可以诱导融合和活化。此外，通过升高卵母细胞中二价阳离子的水平，并减小卵母细胞中细胞蛋白质的磷酸化，可以同时或者顺序实现活化。这可以通常通过将二价阳离子导入卵母细胞细胞质来实现，所述二价阳离子为例如镁、锶、钡或者钙，例如，以离子载体的形式。提高二价阳离子水平的其他方法包括使用电休克、用乙醇处理和用笼状(caged)螯合剂处理。通过已知方法可以减小磷酸化，例如，通过加入激酶抑制剂，如丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，如6-甲基-氨基嘌呤、星形孢菌素、2-氨基嘌呤和鞘氨醇。备选地，通过向卵母细胞中导入磷酸酶，如磷酸酶2A和磷酸酶2B可以抑制细胞蛋白质的磷酸化。
活化的NT单位，或者“融合的胚胎”然后可以在合适的体外培养基中培养直到产生细胞集落。适于胚胎的培养和成熟的培养基是本领域公知的。可以用于胚胎培养和维持的已知培养基的实例包括Ham′s F-10+10％胎牛血清(FCS)、组织培养基-199(TCM-199)+10％胎牛血清、Tyrodes-清蛋白-乳酸-丙酮酸(TALP)、Dulbecco氏磷酸缓冲盐水(PBS)、Eagle氏和Whitten氏培养基，和在一个具体实例中，活化的NT单位可以在NCSU-23培养基中于约38.6℃在5％CO2的湿润气氛中培养约1-4小时。
之后，可以洗涤培养的一个或多个NT单位，然后将其置于有孔板中所含的合适的培养基中，所述有孔板可以含有合适的汇合饲养层。合适的饲养层包括例如成纤维细胞和上皮细胞。将NT单位在饲养层上培养直到NT单位达到适于转移到受体雌性，或者适于得到可以用于产生细胞集落的细胞的大小。可以培养这些NT单位直到至少约2到400个细胞、约4到128个细胞或者至少约50个细胞。
然后可以将活化的NT单位转移(胚胎转移)到母猪的输卵管中。在一个实施方案中，母猪可以是动情期同步化的受体育肥小母猪。可以使用杂种育肥小母猪(大白/Duroc/Landrace)(280-400lbs)。通过经口施用混合到饲料中的18-20mg Regu-Mate(Altrenogest，Hoechst，Warren，NJ)可以将育肥小母猪同步化为受体动物。Regu-Mate可以喂饲14个连续日。最后的Regu-Mate处理后约105小时，可以肌内(i.m.)施用1000单位的人绒毛膜促性腺激素(hCG，Intervet America，Millsboro，DE)。hCG注射后约22-26小时可以进行胚胎转移。在一个实施方案中，可以使妊娠达到足月，并导致生出活的后代。在另一实施方案中，妊娠可以早期结束并且收获胚胎细胞。
育种得到所需纯合敲除动物
在另一方面，本发明提供了产生缺少功能免疫球蛋白基因的任何表达的活的动物的方法，其通过将对该免疫球蛋白基因杂合的雄性与对该免疫球蛋白基因杂合的雌性育种而实现。在一个实施方案中，由于免疫球蛋白基因的一个等位基因的基因修饰以防止该等位基因的表达，所以动物是杂合的。在另一实施方案中，由于在α-免疫球蛋白基因的一个等位基因中的点突变的存在，所以动物是杂合的。在其他实施方案中，此类杂合敲除体可以与表达异种免疫球蛋白如人免疫球蛋白的有蹄类动物育种。在一个实施方案中，通过将缺少内源免疫球蛋白的至少一个等位基因的表达的转基因有蹄类动物与表达异种免疫球蛋白的有蹄类动物育种可以得到动物，其中该内源免疫球蛋白选自重链、κ轻链和λ轻链或者其任意组合。在另一实施方案中，通过将缺少重链、κ轻链和λ轻链的一个等位基因的表达的转基因有蹄类动物与表达异种如人免疫球蛋白的有蹄类动物育种可以得到动物。在进一步的实施方案中，通过将缺少重链、κ轻链和λ轻链的一个等位基因的表达并且表达异种如人免疫球蛋白的转基因有蹄类动物与缺少重链、κ轻链和λ轻链的一个等位基因的表达并表达异种如人免疫球蛋白的另一个转基因有蹄类动物育种，以产生缺少重链、κ轻链和λ轻链的两个等位基因的表达并表达异种如人免疫球蛋白的纯合的转基因有蹄类动物，可得到动物。还提供了产生此类动物的方法。
在一个实施方案中，从携带免疫球蛋白基因双敲除的供体细胞的核转移产生的性成熟的动物可以育种并且测试它们后代的纯合敲除。然后这些纯合敲除动物可以育种以产生更多动物。
在另一个实施方案中，来自性成熟的双敲除动物的卵母细胞可以使用来自两个遗传上不同的猪品系的野生型精子在体外受精，并将胚胎植入合适的替代动物中。可以对来自这些交配的后代测试敲除的存在，例如，通过cDNA测序，和/或PCR可以测试它们。然后，在性成熟时，来自这些胎仔每一只的动物可以交配。在根据本发明的该方面的一些方法中，妊娠可以早期结束从而可以分离胎儿成纤维细胞并进一步在表型和/或基因型上表征。缺少免疫球蛋白基因的表达的成纤维细胞可以用于根据本文描述的方法进行核转移以产生携带所需双敲除的多个妊娠和后代。
额外的基因修饰
在其他实施方案中，根据本文描述的方法、序列和/或构建体产生的缺少功能性免疫球蛋白的表达的动物或细胞可以含有额外的基因修饰以消除异种抗原的表达。通过进一步基因修饰从本文描述的转基因细胞和动物得到的细胞或者通过将本文描述的动物与已经进一步基因修饰的动物育种，可以进行额外的基因修饰。可以修饰此类动物以消除α-1，3-半乳糖基转移酶基因、CMP-Neu5Ac羟化酶基因(见例如，USSN 10/863,116)、iGb3合酶基因(见，例如，美国专利申请60/517,524)，和/或福斯曼合酶基因(见例如，美国专利申请60/568,922)的至少一个等位基因的表达。在额外实施方案中，本文公开的动物还可以含有基因修饰以表达岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶和/或葡糖基转移酶家族的任意成员。为了实现这些额外的基因修饰，在一个实施方案中，可以修饰细胞以含有多个基因修饰。在其他实施方案中，动物可以一起育种以实现多个基因修饰。在一个具体实施方案中，根据本文描述的方法、序列和/或构建体产生的缺少功能性免疫球蛋白表达的动物，如猪可以与缺少α-1，3-半乳糖基转移酶表达的动物如猪育种(如WO 04/028243中所述)。
在另一个实施方案中，可以消除或者减少负责异种移植物排斥的额外基因的表达。此类基因包括，但不限于CMP-NEUAc羟化酶基因、异红细胞糖苷脂(isoGloboside)3合酶基因，和福斯曼合酶基因。此外，负责补体介导的裂解的抑制的编码补体相关蛋白质的基因或者cDNA还可以在本发明的动物和组织中表达。此类基因包括，但不限于CD59、DAF、MCP和CD46(见，例如WO 99/53042；Chen等人Xenotransplantation，Volume 6 Issue 3 Page 194-August 1999，其描述了表达CD59/DAF转基因的猪；Costa C等人，Xenotransplantation.2002 Jan；9(1)：45-57，其描述了表达人CD59和H转移酶的转基因猪；Zhao等人；Diamond LE等人Transplantation.2001 Jan 15；71(1)：132-42，其描述人CD46转基因猪。
额外的修饰可以包括表达组织因子途径抑制剂(TFPI)、肝素、抗凝血酶、蛭素、TFPI、壁虱抗凝肽，或者蛇毒液因子，如WO 98/42850和美国专利号6,423,316，标题＂Anticoagulant fusion proteinanchored to cell membrane＂中所述；或者下调细胞的细胞粘着分子表达的化合物，如抗体，如WO 00/31126，标题为“Suppression ofxenograft rejection by down regulation of a celladhesion molecules”所述，和其中阻止信号2的共刺激的化合物，如通过对器官受体使用来自异种供体生物的CTLA-4的可溶形式的，如WO 99/57266，标题＂Immunosuppression by blocking T cell co-stimulation signal 2(B7/CD28 interaction)＂所述。
在下面的非限制性实施例中更详细地描述本发明的一些方面。
实施例
实施例1：猪重链寻靶和缺少重链表达的猪动物的产生
从3X冗余猪BAC文库分离猪Ig重链基因座的部分。通常，通过断裂猪总基因组DNA，其然后可以用于得到代表完整动物的基因组的至少三倍的BAC文库，可以产生BAC文库。然后通过对本文描述的猪重链免疫球蛋白有选择性的探针杂交，选择含有猪重链免疫球蛋白的BAC。
来自克隆的序列(Seq ID 1)用于产生与J区的部分互补的引物(该引物由Seq ID No.2表示)。单独地，设计与Ig重链μ恒定区的部分互补的引物(该引物由Seq ID No.3表示)。这些引物用于扩增猪Ig重链的片段(由Seq ID No.4表示)，其使功能性连接区(J区)和足够的侧翼区用以设计和构建寻靶载体。为了维持该片段和该片段的亚克隆处于天然状态，将含有这些片段的大肠杆菌(Stable 2，Invitrogen cat #1026-019)维持在30℃。亚克隆Seq ID No.4的区域并将其用于装配如Seq ID No.5所示的寻靶载体。将该载体转染到猪胎儿成纤维细胞中，随后将其用G418选择。通过PCR筛选所得集落以检测可能的寻靶事件(Seq ID No.6和Seq ID No.7，5′筛选引物；Seq ID No.8和Seq ID No.9，3′筛选引物)。关于寻靶的示例性图解见图1。通过DNA印迹验证寻靶。使用靶定的胎儿成纤维细胞作为核供体通过核转移产生小猪。
核转移
将靶定的胎儿成纤维细胞用作核供体细胞。通过本领域公知的方法进行核转移(见，例如，Dai等人，Nature Biotechnology 20：251-255，2002；和Polejaeva等人，Nature 407：86-90，2000)。
hCG注射后46-54小时用含有牛血清清蛋白(BSA；4gl-1)的预热的Dulbecco氏磷酸缓冲盐水(PBS)通过输卵管的反向冲洗收集卵母细胞(如Polejaeva，I.A.，等人(Nature 407，86-90(2000)中所述)。如Polejaeva，I.A.，等人(Nature 407，86-90(2000))所述，在成熟后40到42小时开始体外成熟的卵母细胞(BioMed，Madison，WI)的去核。将回收的卵母细胞在含有4gl1 BSA的PBS中于38℃洗涤，并转移到38℃的无钙的磷酸缓冲的NCSU-23培养基中用于转运到实验室。为了去核，我们将卵母细胞在含有5μg ml-1松胞菌素B(Sigma)和7.5μgml-1 Hoechst 33342(Sigma)的无钙的磷酸缓冲的NCSU-23培养基中在38℃温育20分钟。然后使用18μM玻璃移液管(Humagen，Charlottesville，Virginia)直接在第一个极体下抽吸少量的细胞质。我们将抽吸的核体暴露于紫外线以证实存在赤道板。
为了核转移，将单个成纤维细胞置于透明带下与每个去核的卵母细胞接触。使用ECM2001 Electrocell Manipulator(BTX Inc.，SanDiego，CA)，通过应用5V的AC脉冲5秒，接着1.5kV/cm的两次每次60微秒的DC脉冲诱导融合和活化。融合的胚胎在NCSU-23培养基中于38.6℃在5％CO2的湿润气氛中培养1-4小时，然后转移到动情期同步化的受体育肥小母猪的输卵管中。通过经口施用混合到其饲料中的18-20mg Regu-Mate(Altrenogest，Hoechst，Warren，NJ)将杂种育肥小母猪(大白/Duroc/landrace)(280-400lbs)同步化为受体。Regu-Mate喂饲14个连续日。最后的Regu-Mate处理后105小时，肌内施用人绒毛膜促性腺激素(hCG，1000单位；Intervet America，Millsboro，DE)。hCG注射后22-26小时进行胚胎转移。
核转移从四胎仔产下18个健康小猪。这些动物具有一个功能性野生型Ig重链基因座和一个破坏的Ig重链基因座。
 
Seq ID 2：来自Butler亚克隆用 ggccagacttcctcggaacagctca
 
于扩增J到C重链的引物(637Xba5’)         
Seq ID 3：用于扩增J到C重链的C的引物(JM1L)          ttccaggagaaggtgacggagct
Seq ID 6：用于5’筛选的重链5’引物(HCKOXba5’2)             tctagaagacgctggagagaggccag
Seq ID 7：用于5’筛选的重链3’引物(5’arm5’)        taaagcgcatgctccagactgcctt
Seq ID 8：用于3’筛选的重链5’引物(NEO4425)           catcgccttctatcgccttctt
Seq ID 9：用于3’筛选的重链3’引物(650+CA)           Aagtacttgccgcctctcagga
细胞和猪组织样品的DNA印迹分析。将细胞或者组织样品在裂解缓冲液(10mM Tris，pH 7.5，10mM EDTA，10mM NaCl，0.5％(w/v)十二烷基肌氨酸钠，1mg/ml蛋白酶K)中于60℃过夜裂解并用乙醇沉淀DNA。然后将DNA用NcoI或XbaI消化，这取决于所用的探针，并在1％琼脂糖凝胶上分离。电泳后，将DNA转移到尼龙膜上并用洋地黄毒苷标记的探针(SEQ ID No 41用于NcoI消化，SEQ ID No 40用于XbaI消化)探测。使用化学发光底物系统(Roche MolecularBiochemicals)检测条带。
用于重链DNA印迹的探针：
HC J探针(用于XbaI消化)：
CTCTGCACTCACTACCGCCGGACGCGCACTGCCGTGCTGCCCATGGACCA
CGCTGGGGAGGGGTGAGCGGACAGCACGTTAGGAAGTGTGTGTGTGCGCG
TGGGTGCAAGTCGAGCCAAGGCCAAGATCCAGGGGCTGGGCCCTGTGCCC
AGAGGAGAATGGCAGGTGGAGTGTAGCTGGATTGAAAGGTGGCCTGAAGG
GTGGGGCATCCTGTTTGGAGGCTCACTCTCAGCCCCAGGGTCTCTGGTTC
CTGCCGGGGTGGGGGGCGCAAGGTGCCTACCACACCCTGCTAGCCCCTCG
TCCAGTCCCGGGCCTGCCTCTTCACCACGGAAGAGGATAAGCCAGGCTGC
AGGCTTCATGTGCGCCGTGGAGAACCCAGTTCGGCCCTTGGAGG(Scq ID No 40)
HCμ探针(用于NcoI消化)：
GGCTGAAGTCTGAGGCCTGGCAGATGAGCTTGGACGTGCGCTGGGGAGTA
CTGGAGAAGGACTCCCGGGTGGGGACGAAGATGTTCAAGACGGGGGGCTG
CTCCTCTACGACTGCAGGCAGGAACGGGGCGTCACTGTGCCGGCGGCACC
CGGCCCCGCCCCCGCCACAGCCACAGGGGGAGCCCAGCTCACCTGGCCCA
GAGATGGACACGGACTTGGTGCCACTGGGGTGCTGGACCTCGCACACCAG
GAAGGCCTCTGGGTCCTGGGGGATGCTCACAGAGGGTAGGAGCACCCGGG
AGGAGGCCAAGTACTTGCCGCCTCTCAGGACGG(Seq ID No 41)
实施例2：猪κ轻链寻靶和产生缺少κ轻链表达的猪
从3X冗余的猪BAC文库分离猪Igκ链基因座的部分。通常，通过断裂猪总基因组DNA，其然后可以用于得到代表完整动物的基因组的至少三倍的BAC文库，可以产生BAC文库。然后通过对如本文描述的猪κ轻链免疫球蛋白选择性的探针杂交，可以选择含有猪κ轻链免疫球蛋白的BAC。
使用与J区的部分互补的引物(该引物通过Seq ID No.10表示)和与κC区的部分互补的引物(该引物通过Seq ID No.11表示)扩增猪Ig轻链κ的片段。将所得的扩增引物克隆到质粒载体中并在Stable2细胞中于30℃维持(Seq ID No.12)。示意性说明见图2。
单独地，使用与C区的部分互补的引物(Seq ID No.13)和与κ增强子区的区域互补的引物(Seq ID No.14)扩增猪Ig轻链κ的片段。将所得的扩增引物通过限制酶断裂并将产生的DNA片段克隆，在Stable2细胞中于30℃维持并测序。作为测序的结果，装配了两个非重叠的重叠群(Seq ID No.15，扩增引物的5’部分；和Seq ID No.16，扩增引物的3’部分)。来自下游重叠群的序列(Seq ID No.16)用于设计一组引物(Seq ID No.17和Seq ID No.18)，它们用于扩增增强子附近的连续片段(Seq ID No.19)。Seq ID No.12和Seq ID No.19中每一个的亚克隆用于构建寻靶载体(Seq ID No.20)。将该载体转染到猪胎儿成纤维细胞中，其随后用G418进行选择。通过PCR筛选所得集落以检测潜在的寻靶事件(Seq ID No.21和Seq ID No.22，5’筛选引物；和Seq ID No.23和Seq Id No 43，3′筛选引物，和Seq ID No.24和Seq Id No 24，内源筛选引物)。通过DNA印迹证实寻靶。通过克隆额外的κ序列促进DNA印迹策略设计，所述序列对应于种系κ转录物的模板(Seq ID No.25)。通过核转移产生胎儿猪。
核转移
将靶定的胎儿成纤维细胞用作核供体细胞。通过本领域公知的方法进行核转移(见例如，Dai等人，Nature Biotechnology 20：251-255，2002；和Polejaeva等人，Nature 407：86-90，2000)。
hCG注射后46-54小时用含有牛血清清蛋白(BSA；4gl-1)的预热的Dulbecco氏磷酸缓冲盐水(PBS)通过输卵管的反向冲洗收集卵母细胞(如Polejaeva，I.A.，等人(Nature 407，86-90(2000)中所述)。如Polejaeva，I.A.，等人(Nature 407，86-90(2000))所述，在成熟后40到42小时开始体外成熟的卵母细胞(BioMed，Madison，WI)的去核。将回收的卵母细胞在含有4gl-1 BSA的PBS中于38℃洗涤，并转移到38℃的无钙的磷酸缓冲的NCSU-23培养基中用于转运到实验室。为了去核，我们将卵母细胞在含有5μg ml-1松胞菌素B(Sigma)和7.5μgml-1 Hoechst 33342(Sigma)的无钙的磷酸缓冲的NCSU-23培养基中在38℃温育20分钟。然后使用18μM玻璃移液管(Humagen，Charlottesville，Virginia)直接在第一个极体下抽吸少量的细胞质。我们将抽吸的核体暴露于紫外线以证实存在赤道板。
为了核转移，将单个成纤维细胞置于透明带下与每个去核的卵母细胞接触。使用ECM2001 Electrocell Manipulator(BTX Inc.，SanDiego，CA)，通过应用5V的AC脉冲5秒，接着1.5kV/cm的两次每次60微秒的DC脉冲诱导融合和活化。融合的胚胎在NCSU-23培养基中于38.6℃在5％CO2的湿润气氛中培养1-4小时，然后转移到动情期同步化的受体育肥小母猪的输卵管中。通过经口施用混合到其饲料中的18-20mg Regu-Mate(Altrenogest，Hoechst，Warren，NJ)将杂种育肥小母猪(大白/Duroc/landrace)(280-400lbs)同步化为受体。Regu-Mate喂饲14个连续日。最后的Regu-Mate处理后105小时，肌内施用人绒毛膜促性腺激素(hCG，1000单位；Intervet America，Millsboro，DE)。hCG注射后22-26小时进行胚胎转移。
使用κ靶定的核转移从5胎仔产下33个健康猪。这些猪具有一个功能性野生型猪Ig轻链κ等位基因和一个破坏的Ig轻链κ等位基因。
 
Seq ID 10：κ J到C 5’引物(kjc5’1)              caaggaqaccaagctggaactc
Seq ID 11：κ J到C 3’引物 tgatcaagcacaccacagagacag
 
(kjc3’2)
Seq ID 13：κ C到E 5’引物(porKCS1)                 gatgccaagccatccgtcttcatc
Seq ID 14：κ C到E 3’引物(porKCA1)                 tgaccaaagcagtgtgacggttgc
Seq ID 17：用于扩增增强子区的κ 5’引物(K3’arm1S)        ggatcaaacacgcatcctcatggac
Seq ID 18：用于扩增增强子区的κ 3’引物(K3’arm1A)        ggtgattggggcatggttgagg
Seq ID 21：κ筛选，5’引物，5’(kappa5armS)                    cgaacccctgtgtatatagtt
Seq ID 22：κ筛选，3’引物，5’(kappaNeoA)                     gagatgaggaagaggagaaca
Seq ID 23：κ筛选，5’引物，3’(kappaNeoS)                     gcattgtctgagtaggtgtcatt
Seq ID 24：κ筛选，3’引物，5’(kappa5armProbe3’)             cgcttcttgcagggaacacgat
Seq ID 43：κ筛选，3’引物(kappa3armA2)              GTCTTTGGTTTTTGCTGAGGGTT
细胞和猪组织样品的DNA印迹分析。将细胞或者组织样品在裂解缓冲液(10mM Tris，pH 7.5，10mM EDTA，10mM NaCl，0.5％(w/v)十二烷基肌氨酸钠，1mg/ml蛋白酶K)中于60℃过夜裂解并用乙醇沉淀DNA。然后将DNA用SacI消化，并在1％琼脂糖凝胶上分离。电泳后，将DNA转移到尼龙膜上并用洋地黄毒苷标记的探针(SEQ IDNo 42)探测。使用化学发光底物系统(Roche Molecular Biochemicals)检测条带。
用于κDNA印迹的探针：
Kappa5ArmProbe 5’/3’
gaagtgaagccagccagttcctcctgggcaggtggccaaaattacagttg
acccctcctggtctggctgaaccttgccccatatggtgacagccatctgg
ccagggcccaggtctccctctgaagcctttgggaggagagggagagtggc
tggcccgatcacagatgcggaaggggctgactcctcaaccggggtgcaga
ctctgcagggtgggtctgggcccaacacacccaaagcacgcccaggaagg
aaaggcagcttggtatcactgcccagagctaggagaggcaccgggaaaat
gatctgtccaagacccgttcttgcttctaaactccgagggggtcagatga
agtggttttgtttcttggcctgaagcatcgtgttccctgcaagaagcgg(SEQ ID No 42)
实施例3猪λ基因座的表征
为了破坏或者使猪λ丧失功能，已经设计了寻靶策略，其允许除去或者破坏λ基因座的区域，包括J到C表达盒的多联体。可以产生含有猪基因组的部分的BAC克隆。从3X冗余的猪BAC文库分离猪Igλ链基因座的部分。通常，通过断裂猪的总基因组DNA，其然后用于得到代表完整动物的基因组的至少三倍的BAC文库，可以产生BAC文库。然后通过对如本文描述的猪λ链免疫球蛋白选择性的探针杂交，可以选择含有猪λ链免疫球蛋白的BAC。
含有λJ-C侧翼区的BAC克隆(见图3)可以独立地断裂并亚克隆到质粒载体中。通过PCR已经筛选了个体亚克隆中J到C内含子的部分的存在。我们已通过从一个C区到下一个C区扩增克隆了这些表达盒的几个。通过使用方向允许在任何一个C区内背驰延伸的引物(Seq ID 26和Seq ID 27)完成了该扩增。为了得到成功的扩增，延伸的产物与来自相邻C区(与相同的C区相对)的延伸产物会聚。该策略主要产生了从一个C延伸到相邻C的扩增引物。然而，一些扩增引物是越过相邻C到位置远离该相邻C的下一个C扩增的结果。这些多基因扩增引物含有部分C、下一个J-C单位的J和C区、第三个J-C单位的J区，和第三个J-C单位的C区的部分。SeqID28是一个这样的扩增引物并且代表必须除去或者破坏的序列。
已经克隆的其他猪λ序列包括：Seq ID No.32，其包括猪λ轻链基因组序列的第一个λJ/C区的5’侧翼序列；Seq ID No.33，其包括猪λ轻链基因组序列的J/C簇区的3’侧翼序列，从λJ/C下游约200个碱基对开始；Seq ID No.34，其包括猪λ轻链基因组序列的J/C簇区的3’侧翼序列，J/C簇下游约11.8Kb，接近增强子；Seq ID No.35，其包括λ下游约12Kb，包括增强子区；Seq ID No 36，其包括λ下游约17.6Kb；Seq ID No 37，其包括λ下游约19.1Kb；Seq ID No 38，其包括λ下游约21.3Kb；和Seq ID No 39，其包括λ下游约27Kb。
 
Seq ID 26：λC到C扩增引物的5’引物(lam C5’)                         ccttcctcctgcacctgtcaac
Seq ID 26：λC到C扩增引物的3’引物(lam C3’)                         tagacacaccagggtggccttg
实施例4产生λ基因的寻靶载体
在一个实施方案中，已经设计并构建了一种载体，其中一个寻靶臂与J1的上游区同源，而另一个臂与最后一个C下游的区域同源(见图4)。一个寻靶载体设计成靶定J1的上游。该寻靶载体利用选择标记，可以选择所述选择标记的存在或不存在。可以使用本文描述的和本领域已知的阳性和阴性选择标记的任何组合。使用由单纯疱疹胸苷激酶(TK)的编码区和Tn5氨基糖苷磷酸转移酶(Neo抗性)基因组成的融合基因。该融合基因侧翼是本文描述的或者本领域已知的任何位点特异性重组酶(SSRRS)的识别位点，如lox位点。在通过使用G418选择分离靶定的细胞后，以反式提供Cre以缺失标记基因(见图5)。通过加入本领域已知的可以被TK代谢成毒性产物的任何药物，如更昔洛韦来选择已缺失所述标记基因的细胞。然后将所得基因型用第二种载体靶定。第二种寻靶载体(图6)设计成靶定最后一个C的下游并且使用阳性/阴性选择系统，其仅一侧是特异性重组位点(lox)。该重组位点与第一个寻靶事件距离很远。在分离靶定的基因型后，Cre再次以反式提供以介导从第一个寻靶事件中提供的重组位点到第二个寻靶事件中递送的重组位点的缺失。将除去整个J到C簇。通过施用更昔洛韦再次选择合适的基因型。
在另一实例中，用插入寻靶载体独立地破坏每个C区。将设计并装配插入寻靶载体以破坏单独的C区基因。在J-C簇中有至少3个J到C区。我们将通过设计靶定第一个和最后一个C区的载体开始该过程并且将在寻靶载体中包括位点特异性重组位点。一旦产生了两个插入，就将用位点特异性重组酶缺失间插区。
实施例5：重链单敲除猪与κ单敲除体猪的杂交
为了产生具有一个破坏的Ig重链基因座与一个破坏的Ig轻链κ等位基因两者的猪，将单敲除动物杂交。第一次妊娠产生了四个胎儿，其中两个通过PCR和DNA印迹对重链和κ寻靶事件筛选都是阳性的(引物见实施例1和2)。将胎儿成纤维细胞分离、增殖并冷冻。κ单敲除体与重链单敲除体交配导致的第二次妊娠产生了四头健康的小猪。
含有重链单敲除和κ链单敲除的胎儿成纤维细胞将用于进一步寻靶。此类细胞将用于通过本文描述的方法和组合物来靶定λ基因座。所得后代将对于重链、κ链和λ链将是杂合的敲除体。这些动物将与含有如本文描述的人Ig基因的动物进一步杂交，且然后与其他单Ig敲除动物杂交，以产生具有人Ig置换基因的猪Ig双敲除动物。
本发明已经参考其优选实施方案进行了描述。根据前面本发明的详细描述，本发明的变形和修饰将对本领域技术人员是显而易见的。

Claims (115)

1.转基因有蹄类动物，其缺少功能性内源免疫球蛋白的任何表达。
2.权利要求1的转基因有蹄类动物，其中该有蹄类动物缺少内源重链免疫球蛋白的任何表达。
3.权利要求1的转基因有蹄类动物，其中该有蹄类动物缺少内源轻链免疫球蛋白的任何表达。
4.权利要求3的转基因有蹄类动物，其中该有蹄类动物缺少内源κ链免疫球蛋白的任何表达。
5.权利要求3的转基因有蹄类动物，其中该有蹄类动物缺少内源λ链免疫球蛋白的任何表达。
6.权利要求1的转基因有蹄类动物，其中该有蹄类动物选自猪、牛、绵羊和山羊。
7.权利要求6的转基因有蹄类动物，其中该有蹄类动物是猪。
8.权利要求1的转基因有蹄类动物，其中通过核转移产生该有蹄类动物。
9.权利要求1的转基因有蹄类动物，其中该有蹄类动物表达外源免疫球蛋白基因座。
10.权利要求9的转基因有蹄类动物，其中所述外源免疫球蛋白基因座是重链免疫球蛋白或其片段。
11.权利要求9的转基因有蹄类动物，其中所述外源免疫球蛋白基因座是轻链免疫球蛋白或其片段。
12.权利要求11的转基因有蹄类动物，其中所述轻链基因座是κ链基因座或者其片段。
13.权利要求11的转基因有蹄类动物，其中所述轻链基因座是λ链基因座或者其片段。
14.权利要求9的转基因有蹄类动物，其中所述异种基因座是人免疫球蛋白基因座或者其片段。
15.权利要求9的转基因有蹄类动物，其中人工染色体含有所述异种免疫球蛋白。
15.权利要求15的转基因有蹄类动物，其中人工染色体包含哺乳动物人工染色体。
16.权利要求15的转基因有蹄类动物，其中所述哺乳动物人工染色体包含人14号染色体、人2号染色体和人22号染色体的一个或多个或者其片段。
17.转基因哺乳动物，其缺少内源λ链免疫球蛋白的任何表达。
18.表达异种免疫球蛋白基因座或者其片段的转基因有蹄类动物，其中从整合在内源有蹄类动物染色体中的免疫球蛋白基因座表达该免疫球蛋白。
19.权利要求18的转基因有蹄类动物，其中所述异种免疫球蛋白是人免疫球蛋白或者其片段。
20.权利要求18的转基因有蹄类动物，其中所述异种免疫球蛋白基因座被后代遗传。
21.权利要求18的转基因有蹄类动物，其中所述异种免疫球蛋白基因座通过雄性种系被后代遗传。
22.权利要求18的转基因有蹄类动物，其中所述有蹄类动物是猪、绵羊、山羊或者奶牛。
23.权利要求22的转基因有蹄类动物，其中所述有蹄类动物是猪。
24.权利要求18的转基因有蹄类动物，其中通过核转移产生所述有蹄类动物。
25.权利要求18的转基因有蹄类动物，其中应答对一种或多种抗原的暴露，所述免疫球蛋白基因座在B细胞中表达以产生异种免疫球蛋白。
26.权利要求18的转基因有蹄类动物，其中人工染色体包含所述异种免疫球蛋白。
27.权利要求18的转基因有蹄类动物，其中人工染色体包含哺乳动物人工染色体。
28.权利要求27的转基因有蹄类动物，其中所述人工染色体包含酵母人工染色体。
29.权利要求26的转基因有蹄类动物，其中所述人工染色体包含人14号染色体、人2号染色体和人22号染色体的一个或多个或者其片段。
30.来自权利要求1的转基因有蹄类动物的转基因有蹄类动物细胞、组织或者器官。
31.来自权利要求18的转基因有蹄类动物的转基因有蹄类动物细胞、组织或者器官。
32.权利要求30或者31的细胞，其中该细胞是体细胞、繁殖细胞或生殖细胞。
33.权利要求32的细胞，其中所述细胞是B细胞。
34.权利要求33的细胞，其中所述细胞是成纤维细胞。
35.包含异种免疫球蛋白基因座的猪动物。
36.权利要求35的猪，其中人工染色体含有所述异种基因座。
37.权利要求36的猪，其中所述人工染色体包含一个或多个异种免疫球蛋白基因座，其经历重排并且应答对一种或多种抗原的暴露可以产生异种免疫球蛋白。
38.衍生自权利要求35的动物的猪细胞。
39.权利要求36的猪细胞，其中该细胞是体细胞、B细胞或者成纤维细胞。
40.权利要求35的猪，其中所述异种免疫球蛋白是人免疫球蛋白。
41.权利要求36的猪，其中所述一个或多个人工染色体包含哺乳动物人工染色体。
42.权利要求41的猪，其中所述哺乳动物人工染色体包含人14号染色体、人2号染色体和人22号染色体的一个或多个或者其片段。
43.产生异种抗体的方法，该方法包括步骤:(a)对有蹄类动物施用一种或多种目的抗原，所述有蹄类动物的细胞包含一个或多个人工染色体并且缺少功能性内源免疫球蛋白的任何表达，每个人工染色体包含经历重排的一个或多个异种免疫球蛋白基因座，从而导致产生针对所述一种或多种抗原的异种抗体；和(b)从该有蹄类动物回收所述异种抗体。
44.权利要求43的方法，其中所述免疫球蛋白基因座在B细胞中经历重排。
45.权利要求43的方法，其中所述异种免疫球蛋白基因座是重链免疫球蛋白或者其片段。
46.权利要求43的方法，其中所述异种免疫球蛋白基因座是轻链免疫球蛋白或者其片段。
47.权利要求43的方法，其中所述异种基因座是人免疫球蛋白基因座或者其片段。
48.权利要求43的方法，其中人工染色体含有所述异种免疫球蛋白。
49.权利要求48的方法，其中所述人工染色体包含哺乳动物人工染色体。
50.权利要求49的方法，其中所述哺乳动物人工染色体包含人14号染色体、人2号染色体和人22号染色体的一个或多个或者其片段。
51.分离的核苷酸序列，其包含猪重链免疫球蛋白或者其片段，其中该重链免疫球蛋白包括至少一个连接区和至少一个恒定免疫球蛋白区。
52.权利要求51的核苷酸序列，其中所述重链免疫球蛋白包含至少一个可变区、至少两个多样性区、至少四个连接区和至少一个恒定区。
53.权利要求52的核苷酸序列，其中所述重链免疫球蛋白包含Seq ID No.29。
54.权利要求51的核苷酸序列，其中所述重链免疫球蛋白包含Seq ID No.4。
55.权利要求53或54的核苷酸序列，其中所述序列与Seq IDNos4或29至少80、85、90、95、98或99％同源。
56.权利要求53或54的核苷酸序列，其中所述序列含有Seq IDNo.4的至少17、20、25或者30个连续核苷酸或者Seq ID No.29的残基1-9,070。
57.权利要求53或54的核苷酸序列，其中所述序列包含Seq IDNo.29的残基9,070-11039。
58.分离的核苷酸序列，其与Seq ID No.4或29杂交。
59.寻靶载体，其包含:
(a)第一个核苷酸序列，其包含与SEQ ID No29同源的至少17个连续核酸；
(b)选择标记基因；和
(c)第二个核苷酸序列，其包含与SEQ ID No 29同源的至少17个连续核酸，其不与第一个核苷酸序列重叠。
60.权利要求59的寻靶载体，其中所述选择标记包含抗生素抗性基因。
61.权利要求59的寻靶载体，其中所述第一个核苷酸序列代表5’重组臂。
62.权利要求59的寻靶载体，其中所述第二个核苷酸序列代表3’重组臂。
63.用权利要求59的寻靶载体转染的细胞。
64.权利要求63的细胞，其中使得猪重链免疫球蛋白基因座的至少一个等位基因失活。
65.包含权利要求64的细胞的猪动物。
66.分离的核苷酸序列，其包含有蹄类动物κ轻链免疫球蛋白基因座或者其片段。
67.权利要求66的核苷酸序列，其中所述有蹄类动物是猪。
68.权利要求66的核苷酸序列，其中所述有蹄类动物κ轻链免疫球蛋白基因座包含至少一个连接区、一个恒定区和/或一个增强子区。
69.权利要求66的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含至少五个连接区、一个恒定区和一个增强子区。
70.权利要求69的核苷酸序列，其包含Seq ID No.30。
71.权利要求69的核苷酸序列，其包含Seq ID No.12。
72.权利要求70或71的核苷酸序列，其中所述序列含有Seq IDNo 12或30的至少17、20、25或者30个连续核苷酸。
73.分离的核苷酸序列，其与Seq ID No 12或30杂交。
74.寻靶载体，其包含:
(a)第一个核苷酸序列，其包含与SEQ ID No 30同源的至少17个连续核酸；
(b)选择标记基因；和
(c)第二个核苷酸序列，其包含与SEQ ID No 30同源的至少17个连续核酸，其不与第一个核苷酸序列重叠。
75.权利要求74的寻靶载体，其中所述选择标记包含抗生素抗性基因。
76.权利要求74的寻靶载体，其中所述第一个核苷酸序列代表5’重组臂。
77.权利要求74的寻靶载体，其中所述第二个核苷酸序列代表3’重组臂。
78.用权利要求74的寻靶载体转染的细胞。
79.权利要求78的细胞，其中使得κ链免疫球蛋白基因座的至少一个等位基因失活。
80.包含权利要求79的细胞的猪动物。
81.分离的核苷酸序列，其包含有蹄类动物λ轻链免疫球蛋白基因座。
82.权利要求81的核苷酸序列，其中所述有蹄类动物是猪。
83.权利要求81的核苷酸序列，其中所述有蹄类动物是牛。
84.权利要求81的核苷酸序列，其中所述有蹄类动物λ轻链免疫球蛋白基因座包含J到C单位的多联体。
85.权利要求81的核苷酸序列，其中所述有蹄类动物λ轻链免疫球蛋白基因座包含至少一个连接区-恒定区对和/或至少一个可变区，如通过Seq ID No.31表示的。
86.权利要求82的核苷酸序列，其包含Seq ID No.28。
87.权利要求83的核苷酸序列，其包含Seq ID No.31。
88.权利要求86或87的核苷酸序列，其中所述序列含有Seq IDNo 28或31的至少17、20、25或者30个连续核苷酸。
89.分离的核苷酸序列，其与Seq ID No28或31杂交。
90.寻靶载体，其包含:
(a)第一个核苷酸序列，其包含与SEQ ID No 28或31同源的至少17个连续核酸；
(b)选择标记基因；和
(c)第二个核苷酸序列，其包含与SEQ ID No 28或31同源的至少17个连续核酸，其不与第一个核苷酸序列重叠。
91.权利要求90的寻靶载体，其中所述选择标记包含抗生素抗性基因。
92.权利要求90的寻靶载体，其中所述第一个核苷酸序列代表5’重组臂。
93.权利要求90的寻靶载体，其中所述第二个核苷酸序列代表3’重组臂。
94.用权利要求90的寻靶载体转染的细胞。
95.权利要求94的细胞，其中使得λ链免疫球蛋白基因座的至少一个等位基因失活。
96.包含权利要求95的细胞的猪动物。
97.环化至少100kb DNA的方法，其中该DNA然后通过位点特异性重组酶整合到宿主基因组中。
98.权利要求97的方法，其中可以环化至少100、200、300、400、500、1000、2000、5000、10,000kb的DNA。
99.权利要求97的方法，其中通过在DNA序列的每个末端附着位点特异性重组酶靶位点然后对该DNA序列应用位点特异性重组酶，可以实现DNA的环化。
100.权利要求97的方法，其中所述位点特异性重组酶靶位点是Lox。
权利要求97的方法，其中人工染色体含有所述DNA序列。
权利要求101的方法，其中所述人工染色体是酵母菌人工染色体或者哺乳动物人工染色体。
权利要求101的方法，其中所述人工染色体包含编码人免疫球蛋白基因座或者其片段的DNA序列。
权利要求103的方法，其中所述人免疫球蛋白基因座或者其片段包含人14号染色体、人2号染色体、和/或人22号染色体。
缺少内源免疫球蛋白的至少一个等位基因的表达的转基因有蹄类动物，其中该免疫球蛋白选自重链、κ轻链和λ轻链或者其任意组合。
权利要求105的转基因有蹄类动物，其中表达异种免疫球蛋白。
产生权利要求106的转基因有蹄类动物的方法，其中将所述缺少内源免疫球蛋白的至少一个等位基因的表达的转基因有蹄类动物与表达异种免疫球蛋白的有蹄类动物育种，其中所述内源免疫球蛋白选自重链、κ轻链和λ轻链或者其任意组合。
权利要求105-107任一项的转基因有蹄类动物，其中该有蹄类动物是猪。
权利要求106或107的转基因有蹄类动物，其中所述异种免疫球蛋白是人免疫球蛋白基因座或者其片段。
110.权利要求109的转基因有蹄类动物，其中人工染色体含有所述人免疫球蛋白基因座或者其片段。
111.来自权利要求105的有蹄类动物的细胞。
112.权利要求1、18、105或106的转基因有蹄类动物，其还包含额外的基因修饰以消除异种抗原的表达。
113.权利要求112的转基因有蹄类动物，其中该有蹄类动物缺少α-1，3-半乳糖基转移酶基因的至少一个等位基因的表达。
114.权利要求112的转基因有蹄类动物，其中该有蹄类动物是猪。
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