CN101218257A - Gitr结合分子及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了特异结合T细胞和树突状细胞上的GITR，例如人GITR(hGITR)的结合分子。本发明的结合分子特点在于以高亲和性结合hGITR；在有刺激剂，例如CD3存在的情况下，它是拮抗性的，能够抵消Treg细胞对Teff细胞的抑制作用。本发明的多个方面涉及结合分子、其药物组合物，以及用于制备所述结合分子的核酸、重组表达载体和宿主细胞。体外或体内利用本发明结合分子来探测人GITR或者调节人GITR活性的方法也包括在本发明内。

Description

GITR结合分子及其用途

相关申请

本申请享有2005年3月25日提交的名为“GITR结合分子及其用途”的美国临时专利申请60/665322、和2005年6月3日提交的名为“GITR结合分子及其用途”的美国临时专利申请60/687265的优先权，这两份申请案的全部内容通过引用并入本文。

背景技术

肿瘤坏死因子和TNF受体(TNFR)超家族的成员能够调节多种生物功能，包括细胞增殖、分化和存活。利用差异显示来鉴定被合成糖皮质激素地塞米松所诱导的T细胞mRNA，Nocentini et al.((1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：6216-6221997)鉴定到一个编码TNFR家族新成员的小鼠cDNA。其对应的基因被命名为GITR，代表糖皮质激素-诱导的TNFR家族-相关基因(又称为TNFRSF18)。与其它TNFR一样，该预计的CITR蛋白质的胞外结构域含有高半胱氨酸重复片段。此外，GITR的胞内结构域与小鼠和人TNFR、4-1BB以及CD27的胞内结构域同源性很高。Nocentini et al.((1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：6216-6221997)证实GITR基因在T细胞中被地塞米松和其它细胞激活性刺激诱导。GITR表达能够保护T细胞免于由抗CD3抗体处理所诱发的细胞凋亡，但不能保护由其它细胞凋亡剂引起的细胞凋亡。

Shimizu et al.((2002)Nat Immunol 3：135-42)发现GITR主要是在CD4+CD25+调节性T细胞上表达。但是，GITR在常规CD4+和CD8+T细胞上也有表达，并且其表达在激活后迅速增强。体外研究表明，GITR在由这些细胞介导的外周免疫耐受中发挥重要作用，能够消除CD4+CD25+调节性T细胞的抑制功能(Shimizu et al.(2002)Nat Immunol 3：135-42；McHughet al.(2002)Immunity16：311-23)。

开发可以用于调节经由GITR进行的信号传导的试剂将是非常有益的。

发明概述

本发明提供了这样的结合分子，这些分子能够特异结合细胞(比如T细胞和树突状细胞)上的GITR，例如人GITR(hGITR)。本发明结合分子的特征在于能以高亲和性结合hGITR；在有刺激剂(例如CD3)存在的情况下有对抗作用，能消除调节性T(Treg)细胞对效应性T(Teff)细胞的抑制。

本发明的一个方面提供了包含SEQ ID NO：1之氨基酸序列的结合分子，任选还包含引导序列。

另一个方面，本发明提供了包含SEQ ID NO：66之氨基酸序列的结合分子，任选还包含引导序列。

另一个方面，本发明提供了包含SEQ ID NO：2之氨基酸序列的结合分子，任选还包含引导序列。

另一个方面，本发明提供了包含SEQ ID NO：58之氨基酸序列的结合分子，任选还包含引导序列。

本发明的一个方面提供了包含SEQ ID NO：59之氨基酸序列的结合分子，任选还包含引导序列。

另一个方面，本发明提供了包含SEQ ID NO：60之氨基酸序列的结合分子，任选还包含引导序列。

本发明的一个方面提供了包含SEQ ID NO：61之氨基酸序列的结合分子，任选还包含引导序列。

另一方面，发明提供了包含SEQ ID NO：62之氨基酸序列的结合分子，任选还包含引导序列。

本发明的一个方面提供了包含SEQ ID NO：63之氨基酸序列的结合分子，任选还包含引导序列。

本发明的再一方面提供了这样的结合分子，所述分子包含至少一个选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO：19和SEQ ID NO.5的互补决定区(CDR)氨基酸序列。在一实施方案中，所述结合分子包含至少两个选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO：19和SEQ ID NO.5的互补决定区(CDR)氨基酸序列。在另一实施方案中，所述结合分子包含至少三个选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO：19和SEQ ID NO.5的互补决定区(CDR)氨基酸序列。

本发明另一方面提供了这样的结合分子，所述分子包含至少一个选自SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的互补决定区(CDR)氨基酸序列。在一实施方案中，所述结合分子包含至少两个选自SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的互补决定区(CDR)氨基酸序列。在另一实施方案中，所述结合分子包含至少三个选自SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的互补决定区(CDR)氨基酸序列。

本发明另一方面提供了包含SEQ ID NO：3、4、5、6、7和8所示CDR的结合分子。发明的另一方面提供了包含SEQ ID NO：3、19、5、6、7和8所示CDR的结合分子。

本发明的一个方面提供了这样的结合分子，该分子包含含有SEQ IDNO：1之氨基酸序列的重链可变区，还包含含有SEQ ID NO：2之氨基酸序列的轻链可变区。发明的另一方面提供了这样的结合分子，该分子包含含有SEQ ID NO：66之氨基酸序列的重链可变区，并还包含含有SEQ ID NO：2之氨基酸序列的轻链可变区。在一个以上的实施方案中，所述结合分子包含人或基本上是人的重链和轻链框架区。在另一实施方案中，一或多个人框架区氨基酸残基被突变成相应的小鼠氨基酸残基。在另一实施方案中，恒定区包含IgG2b重链恒定区。在另一实施方案中，恒定区包含人，例如人IgG1重链恒定区。在另一实施方案中，所述结合分子被改变了以便减少效应子功能和/或糖基化。在一实施方案中，结合分子结合人GITR。在一实施方案中，结合分子不会诱发细胞凋亡。在另一实施方案中，结合分子不能阻断初级混合淋巴细胞反应。在再一实施方案中，结合分子能够抵消调节性T细胞对效应T细胞的抑制。在一实施方案中，结合分子能调节效应T细胞的增殖。在一实施方案中，结合分子来自小鼠。在另一实施方案中，结合分子包含鼠IgG2b重链。在一实施方案中，结合分子是人源化抗体。再一实施方案中，结合分子是嵌合抗体。还有一实施方案中，结合分子能调整人GITR的活性。在另一实施方案中，结合分子减弱I-κB在T细胞中的降解。

本发明另一方面提供了能结合人T细胞和人树突状细胞上的GITR、且结合常数(Kd)为1×10^-9或更低的结合分子。在一实施方案中，该结合分子能抵消调节性T细胞对效应T细胞的抑制。在另一实施方案中，所述结合分子是人源化抗体。

本发明再一方面提供了包含本发明结合分子和可药用载体的组合物。在一实施方案中，所述组合物还包含至少一种用于处置受试者所患癌症的其它治疗剂。在一实施方案中，组合物还包含至少一种用于处置受试者所患病毒感染的其它治疗剂。在另一实施方案中，组合物还包含至少一种用于处置受试者所患癌症的肿瘤抗原。再一实施方案中，所述组合物还包含至少一种来自病原体的抗原。

本发明的一个方面提供了一种消除调节性T细胞对效应T细胞的抑制的方法，该方法包括将人免疫细胞与本发明结合分子进行接触，从而使得调节性T细胞对效应T细胞的抑制被抵消。

本发明另一方面提供了一种调节效应T细胞中T细胞受体所诱导的信号传导的方法，该方法包括将所述细胞与本发明的结合分子进行接触，从而使效应T细胞中T细胞诱导的受体信号传导得到调节。在一实施方案中，该方法调节了I-κB的降解。在一实施方案中，所述T细胞是Th1细胞。在另一实施方案中，所述T细胞是CD4+细胞。再一实施方案中，所述T细胞是CD8+细胞。

本发明再一方面提供了一种提高受试者的免疫应答的方法，该方法包括将细胞与本发明结合分子进行接触，从而使得受试者的免疫应答被增强。

本发明另一方面提供了一种处置受试者所患癌症的方法，该方法包括将细胞与本发明结合分子进行接触，从而使得受试者的癌症得到治疗。在一实施方案中，癌症的类型选自：胰腺癌(pancreatic cancer)、黑素瘤(melanomas)、乳腺癌(breast cancer)、肺癌(lung cancer)、支气管癌(bronchialcancer)、结直肠癌(colorectal cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、胃癌(stomachcancer)、卵巢癌(ovarian cancer)、尿道膀胱癌(urinary bladder cancer)、脑或中枢神经系统癌(brain or central nervous system cancer)、外周神经系统癌(peripheral nervous system cancer)、食管癌(esophageal cancer)、宫颈癌(cervicalcancer)、子宫或子宫内膜癌(uterine or endometrial cancer)、口腔癌或咽癌(cancer of the oral cavity or pharynx)、肝癌(liver cancer)、肾癌(kidney cancer)、睾丸癌(testicular cancer)、胆管癌(biliary tract cancer)、小肠或附件癌(smallbowel or appendix cancer)、唾液腺癌(salivary gland cancer)、甲状腺癌(thyroidgland cancer)、肾上腺癌(adrenal gland cancer)、骨肉瘤(osteosarcoma)、软骨肉瘤(chondrosarcoma)以及造血组织的癌症(cancer of hematological tissues)。

本发明另一方面提供了一种治疗由病原体在受试者体内引起的感染的方法，该方法包括将细胞与权利要求1的结合分子进行接触，从而使受试者体内由病原体引起的感染得到治疗。在一实施方案中，所述病原体是病毒，例如选自：甲肝病毒(hepatitis type A)，乙肝病毒(hepatitis type B)，丙肝病毒(hepatitis type C)，流感病毒(influenza)、水痘病毒(varicella)、腺病毒(adenovirus)、I型单纯疱疹病毒(herpes simplex type I，HSV I)、II型单纯疱疹病毒(HSV II)、牛瘟病毒(rinderpest)、鼻病毒(rhinovirus)、艾可病毒(echovirus)、轮状病毒(rotavirus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)、乳头瘤病毒(papilloma virus)、乳多空病毒(papova virus)、巨细胞病毒(cytomegalovirus)、echinovirus、虫媒病毒(arbovirus)、汉坦病毒(hantavirus)、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、腮腺炎病毒(mumps virus)、麻疹病毒(measlesvirus)、风疹病毒(rubella virus)、脊髓灰质炎病毒(polio virus)、I型人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus type I，HIV I)和II型人免疫缺陷病毒(HIV II)、任何小RNA病毒(picornaviridae)、肠道病毒(enteroviruses)、杯状病毒(caliciviridae)、诺瓦克病毒群(Norwalk group of viruses)的任一种、披膜病毒(togaviruses)(比如甲病毒(alphaviruses))、黄病毒(flaviviruses)、冠状病毒(coronaviruses)、狂犬病病毒(rabies virus)、马尔堡病毒(Marburg viruses)、埃博拉病毒(ebola viruses)、副流感病毒(parainfluenza virus)、正粘病毒(orthomyxoviruses)、布尼亚病毒(bunya viruses)、砂粒病毒(arenaviruses)、呼肠病毒(reoviruses)、轮状病毒、环状病毒(orbiviruses)、I型人T细胞白血病病毒(human T cell leukemia virus)、II型人T细胞白血病病毒、猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus)、慢病毒(lentiviruses)、多瘤病毒(polyomaviruses)、细小病毒(parvoviruses)、EB病毒(Epstein Barr virus)、人疱疹病毒6型(human herpesvirus 6)、猕猴疱疹病毒1型(cercopithecine hernesvirus 1，B病毒)和痘病毒(poxviruses)。在一实施方案中，所述方法被用于处置慢性病毒感染。

在另一实施方案中，病原体是细菌，例如选自：奈瑟氏球菌物种(Neisseria spp)、链球菌物种(Streptococcus spp)、变异链球菌S.mutans)、嗜血菌物种(Haemophilus spp.)、莫拉氏菌物种(Moraxella spp)、博德特氏菌物种(Bordetella spp)、分枝杆菌物种(Mycobacterium spp)、军团菌物种(Legionella spp)、埃希氏菌物种(Escherichia spp)、弧菌物种(Vibrio spp)、耶尔森氏菌物种(Yersinia spp)、弯曲菌物种(Campylobacter spp)、沙门氏菌物种(Salmonella spp)、李斯特氏菌物种(Listeria spp.)、螺杆菌物种(Helicobacterspp)、假单胞菌物种(Pseudomonas spp)、葡萄球菌物种(Staphylococcus spp.)、肠球菌物种(Enterococcus spp)、梭菌物种(Clostridium spp.)、芽孢杆菌物种(Bacillus spp)、棒杆菌物种(Corynebacterium spp.)、疏螺旋体物种(Borreliaspp.)、埃里希氏体物种(Ehrlichia spp)、立克次氏体物种(Rickettsia spp)、衣原体物种(Chlamydia spp.)、钩端螺旋体物种(Leptospira spp.)、密螺旋体物种(Treponema spp.)。

本发明另一方面提供了一种调节GITR功能的方法，包括在有免疫激活剂时，使人GITR与本发明结合分子接触，从而调整GITR功能。

本发明的一个方面体现在这样的结合分子，其包含至少一个选自SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的CDR氨基酸序列。在一实施方案中，所述组合物还包含至少一种处置受试者所患癌症的治疗剂。在另一实施方案中，所述结合分子包含至少一个衍生自6C8结合分子的CDR。在另一实施方案中，结合分子包含至少两个衍生自6C8结合分子的CDR。在另一实施方案中，结合分子包含至少三个衍生自6C8结合分子的CDR。在另一实施方案中，结合分子包含至少四个衍生自6C8结合分子的CDR。在另一实施方案中，结合分子包含至少五个衍生自6C8结合分子的CDR。在另一实施方案中，结合分子包含至少六个衍生自6C8结合分子的CDR。

本发明另一方面体现在包含SEQ ID NOs.3、4或19、5、6、7和8所示之六个CDR的结合分子。

本发明的再一方面体现在这样的结合分子，其包含含有SEQ ID NO：1之氨基酸序列的重链可变区，并还包含含有SEQ ID NO：2之氨基酸序列的轻链可变区。在一实施方案中，该结合分子包含人或基本是人的重链和轻链框架区。在另一实施方案中，本发明的结合分子包含的人框架区，其中一或多个人框架区氨基酸残基被回复突变成相应的小鼠氨基酸残基，或者被突变成另外的氨基酸残基。在另一实施方案中，本发明的结合分子包含免疫球蛋白分子的恒定区，例如IgG2b重链恒定区。还有一实施方案中，结合分子能够结合人GITR(hGITR)。在一实施方案中，结合分子不会诱发细胞凋亡。在另一实施方案中，结合分子不会阻断初级混合淋巴细胞反应。还有一实施方案中，结合分子抵消了调节性T细胞对效应T细胞的抑制。在一实施方案中，结合分子增强了效应T细胞的增殖。在另一实施方案中，结合分子中和了人GITR的活性。还有一实施方案中，结合分子减弱了I-κB在T细胞中的降解。

一个方面，本发明体现在这样的结合分子，其结合人T细胞和人树突状细胞上的GITR，并且结合常数(Kd)为1×10^-9或更低。在一实施方案中，所述结合分子抵消了调节性T细胞的抑制作用。在另一实施方案中，结合分子来源于鼠或包含鼠CDR。再一实施方案中，结合分子包含IgG2b重链。在一实施方案中，结合分子是人源化抗体。在进一步的实施方案中，结合分子是嵌合抗体。

本发明另一方面提供了包含本发明结合分子和可药用载体的组合物。在一实施方案中，所述组合物还包含至少一种其它的治疗受试者所患癌症的治疗剂。

本发明的一个方面提供了一种消除调节性T细胞对T效应细胞的抑制作用的方法，该方法包括将人免疫细胞与本发明结合分子进行接触，从而消除调节性T细胞的抑制作用。

本发明另一方面提供了一种调节T细胞受体诱导的信号在效应T细胞中传导的方法，该方法包括将细胞与本发明结合分子进行接触，从而使效应T细胞中T细胞受体诱导的信号传导得到调节。在一实施方案中，所述方法调节了I-κB的降解。在一实施方案中，T细胞是Th1细胞。

本发明再一方面提供了一种增强受试者的免疫反应的方法，该方法包括将细胞与本发明结合分子接触，从而提高受试对象的免疫反应。

本发明另一方面提供了一种处置受试者所患癌症的方法，该方法包括将细胞与本发明结合分子进行接触，从而使癌症得到治疗。在一实施方案中，癌症种类选自：胰腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结肠癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、尿道膀胱癌、脑或中枢神经系统癌、外周神经系统癌、食管癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆管癌、小肠或附件癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤以及造血组织的癌症。

本发明另一方面提供了一种抑制GITR功能的方法，该方法包括使人GITR与本发明结合分子在有刺激剂的情况下进行接触，从而使得GITR功能被抑制。

本发明一个方面提供了分离的核酸分子，该核酸分子包含编码重链可变区的含有核苷酸序列SEQ ID NO：9的核苷酸序列，任选还包含引导序列。本发明另一方面提供了分离的核酸分子，该核酸分子包含编码重链可变区的含有核苷酸序列SEQ ID NO：67的核苷酸序列，任选还包含引导序列。

本发明另一方面提供了分离的核酸分子，该核酸分子包含编码轻链可变区的含有核苷酸序列SEQ ID NO：10的核苷酸序列，任选还包含引导序列。

本发明再一方面提供了分离的核酸分子，该核酸分子包含至少一个选自SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO：65和SEQ ID NO.13的编码CDR的核苷酸序列。在一实施方案中，所述分离的核酸分子包含的核苷酸序列编码至少两个衍生自6C8结合分子的CDR。在另一实施方案中，所述分离的核酸分子包含的核苷酸序列编码至少三个衍生自6C8结合分子的CDR。

本发明另一方面提供了分离的核酸分子，该核酸分子包含至少一个选自SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的编码CDR的核苷酸序列。在一实施方案中，所述分离的核酸分子包含的核苷酸序列编码至少两个衍生自6C8结合分子的CDR。在另一实施方案中，所述分离的核酸分子所包含的核苷酸序列编码至少三个衍生自6C8结合分子的CDR。

本发明的一个方面提供了分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO：11-16以及SEQ ID NO：65所示之核苷酸序列。

本发明一个方面提供了包含发明所述核酸分子的重组表达载体。在一实施方案中，所提供的重组表达载体包含具有编码本发明结合分子之核苷酸序列的核酸分子。在另一实施方案中，本发明提供了导入了发明所述重组表达载体的宿主细胞。本发明另一方面提供了制备能够结合人GITR的结合分子的方法，方法包括在培养基中培养发明所述宿主细胞直至该细胞产生能够结合人GITR的结合分子。

附图简述

图1显示纯化的小鼠和人GITR结合分子的SDS-PAGE印迹。每个孔中加入了12微克蛋白质。

图2显示纯化的人GITR结合分子的大小排阻层析(SE-HPLC)结果。50微克蛋白质以0.6ml/min的流速注射到SE-HPLC柱子中。经SE-HPLC纯化的结合分子产生结合分子群体，其中99.8％为单体形式，0.2％为聚集体。

图3显示转染了GITR基因的L-M细胞(小鼠成纤维细胞)用50μl表达GITR的杂交瘤细胞的上清液进行染色的FACS分析结果。GITR结合分子使被GITR-转染的细胞染色，而未转染的L-M细胞没有染色。

图4显示FACS分析，其表明GITR主要在活化的淋巴细胞上表达。6C8结合分子使CD4+、CD8+、CD25+淋巴细胞染色，CD103+细胞弱染色。

图5显示6C8结合分子的结合饱和曲线，是用生物素标记的6C8在CD3活化的淋巴细胞上滴定而评估出的。

图6显示6C8结合分子对T淋巴细胞具有协同刺激活性，所述T淋巴细胞是经亚优化(sub-optimal)OKT3(抗CD3；0.01μg/ml)刺激、并与抗CD28或抗GITR一起保温的细胞。还使用了同种型对照(IgG2b)。

图7A和7B显示6C8结合分子不诱发细胞凋亡。淋巴细胞用PHA活化3天，再加入10μg/ml YTH655(一种已知在活化淋巴细胞上诱导细胞凋亡的抗CD2抗体；Friend，P.et al.(1987)Transplant.Proc.19：4317)、6C8、或同种型对照(IgG2b)。细胞凋亡通过细胞存活率(A)、膜联蛋白V染色(B)、流式细胞术来测定。

图8表明6C8结合分子未阻断初级混合淋巴细胞反应(MLR)。在有不同浓度TRX1(抗人CD4)、6C8或MOPC(TRX1的同种型对照)的情况下，将来自同种异体供体的淋巴细胞混合。细胞保温3天，用³H-胸苷脉冲18小时，然后收获并计数。

图9显示6C8结合分子阻断调节性T细胞(Treg)诱发的对T效应细胞的抑制作用。将CD4+/CD25+细胞以各种比率加入CD4+/CD25-细胞中。细胞用结合在微孔板上的抗CD3和抗CD28进行刺激。比率为1∶1时，CD4+/CD25-细胞的增殖被抑制。加入两种不同稀释度的6C8能够阻断CD4+/CD25+调节性T细胞诱发的对CD4+T效应细胞的抑制作用。

图10显示6C8结合分子具有协同刺激活性，即使在没有抗CD28的情况下用抗CD3刺激T细胞时也是如此。CD4+/CD25+细胞与CD4+/CD25-细胞以不同细胞比率一同保温。细胞仅用结合在微孔板上的抗CD3进行刺激。将6C8加入细胞中，在所述情况下显示协同刺激活性。

图11显示抗GITR对经CD3活化的T细胞中I-κB的降解的影响。

图12显示抗GITR对经CD3活化的T细胞中I-κB的磷酸化的影响。

图13示抗GITR对经CD3+CD28活化的T细胞中I-κB的降解的影响。

图14显示抗GITR对经CD3+CD28活化的T细胞中I-κB的磷酸化的影响。

图15显示，6C8和R&D Systems(Minneapolis，MN)的抗体识别独特的表位。在经过OKT3和伴刀豆球蛋白(Con A)活化的淋巴细胞上进行竞争实验。1μg/ml 6C8与不同量的竞争性R&D Systems抗体(GITT/TNFRSF18单克隆抗体)一起使用。在抗体的最高浓度观察到一些竞争，但这非常可能是由空间位阻引起的。

图16示6C8抗GITR抗体相对R&D Systems GITR抗体的动力学分析。

图17显示，注射了丝裂霉素C处理过的B1 6细胞的小鼠在用抗GITR抗体(2F8大鼠抗小鼠GITR结合分子)处置后的存活率。

图18A-18D显示6C8结合分子的可变重链(VHD)(分别是A和B)和可变轻链(VKA)(分别是C和D)的核酸序列和氨基酸序列。引导序列用粗体显示；框架序列加有下划线；CDR序列为斜体。

图19A和19B显示，2F8和2F8 F(ab’)₂片段增强了对HA的体液应答。

图20A和20B显示，2F8和2F8 F(ab’)₂片段增强了对Ova的体液应答。

发明详述

本发明提供了能够特异结合T细胞和树突状细胞上的GITR，例如人GITR(hGITR)的结合分子。本发明的结合分子特点在于能以高亲和性结合hGITR，并且在有刺激剂(例如CD3)的情况下，它们具有对抗作用，能够抵消Treg细胞对T效应(Teff)细胞的抑制作用。本发明的各个方面涉及结合分子、其药物组合物，以及编码所述结合分子的核酸、用于制备该结合分子的重组表达载体和宿主细胞。利用本发明的结合分子体外或体内检测人GITR或者调节人GITR活性的方法也涵盖在本发明范围内。

为了方便对本发明的理解，首先对一些术语进行定义。

I.定义

术语“糖皮质激素诱导的TNF受体”(文中缩写为“GITR”)，又称为TNF受体超家族18(TNFRSF18)，用于本文，是指肿瘤坏死因子/神经生长因子受体家族的成员。它是一个有241个氨基酸的I型跨膜蛋白，特点在于胞外结构域中有三个半胱氨酸假重复子，特异保护细胞免于T细胞受体诱导的细胞凋亡，虽然它不能保护细胞免于其它细胞凋亡信号，包括Fas诱发、地塞米松处置或UV放射(Nocentini，G，et al.(1 997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：6216-622)。人GITR(hGITR)的核酸序列如SEQ ID NO：17所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。

术语″结合分子″用于本文包括含有至少一个能够特异结合GITR的抗原结合位点的分子。“特异结合”表示所述结合分子对非GITR分子基本只显示出背景结合。但是，特异结合GITR的分离的结合分子对来自其它物种的GITR分子可能有交叉反应性。

本发明的结合分子可以包含免疫球蛋白分子的任何同种型(例如，IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)、类型(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚型的免疫球蛋白重链。结合分子可以既有重链也有轻链。用于本文，术语结合分子还包括抗体(包括全长抗体)；单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)；多克隆抗体；多特异性抗体(例如，双特异性抗体)；人、人源化或嵌合抗体抗体；以及抗体片段，例如Fab片段、F(ab′)片段、Fab表达文库产生的片段、以上所有的表位结合片段，和抗体的工程化形式，例如scFv分子，只要它们表现出所需的活性，例如能够结合GITR。

“抗原”是结合分子所特异结合的实体(例如，蛋白性实体或肽)。

术语“表位”或“抗原决定簇”是指结合分子特异结合到的抗原上的位点。表位可以由连续氨基酸构成，也可以是不连续的氨基酸通过蛋白质的四级折叠而排列在一起的。由连续氨基酸构成的表位在接触变性溶剂时通常能够维持，而通过四级折叠构成的表位通常用变性溶剂处理时会丧失。表位通常包括至少有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的独特立体构象。确定表位的立体构象的方法包括，例如X-射线结晶学和2-维核磁共振。参见例如，Epitope Mapping Protocols in Methods inMolecular Biology，Vol.66，G.E.Morris，Ed.(1996)。

可以通过简单的免疫检测，显示一种抗体能够阻断另一种抗体与靶抗原的结合，即竞争结合法来鉴定识别相同表位的结合分子。竞争结合是通过这样的检测来确定，其中待测结合分子能够阻止参照结合分子与共有抗原(比如GITR)的特异结合。已知的竞争结合检测有许多类型，例如固相直接或间接放射免疫检定(RIA)；固相直接或间接酶免疫检定法(EIA)夹心竞争检定法(见Stahli et al.Methods in Enzymology 9：242(1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Kirkland et al.J. Immunol.137：3614(1986))；固相直接标记检定法、固相直接标记夹心检定法(参见Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press(1988))；用I-125标记进行的固相直接标记RIA(参见Morel et al.Mol.Immunol.25(1)：7(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung et al.Virology 176：546(1990))；以及直接标记RIA(Moldenhauer et al.Scand.J.Immunol.32：77(1990))。通常，这类检测会涉及到使用结合在固体表面或细胞上的纯化抗原，带有未标记待测结合分子和标记的参照结合分子。通过确定在有待测结合分子的情况下，结合到固体表面和细胞上的标记的量来衡量竞争抑制。一般来说，待测结合分子是过量的。通常，当竞争结合分子是过量的，它会抑制参照结合分子与共有抗原的特异结合的至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或以上。

表位还可以被免疫细胞，例如B细胞和/或T细胞所识别。表位的细胞识别可以通过测量抗原依赖性增殖的体外检定法来确定，象通过³H-胸苷掺入、细胞因子分泌、抗体分泌或抗原依赖性杀伤(细胞毒性T淋巴细胞检定法)来确定。

术语″单克隆结合分子″用于本文是指从基本上均质的结合分子群体中获得的结合分子。单克隆结合分子是高度特异的，定向针对单个的抗原位点。此外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同结合分子的多克隆结合分子制备物不同，每种单克隆结合分子是针对抗原上的单一的决定簇的。修饰词″单克隆″表明这类结合分子的特征在于得自基本均质的结合分子群体，而不应解释为需要任何具体方法来制备该结合分子。例如，与本发明一致的单克隆结合分子可以是通过由Kohler等(Nature 256：495(1975))首次描述的杂交瘤方法制备的，或者可以通过重组DNA方法(参见，例如美国专利4,816,567)。″单克隆结合分子″还可以利用例如Clackson，et al.Nature352：624-628(1991)和Marks et al.J.Mol Biol.222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体文库中分离。

术语“嵌合结合分子”是指包含来源于不同物种的氨基酸序列的结合分子。嵌合结合分子可以例如由不同物种的结合分子基因片段通过基因工程来构建。

文中的单克隆结合分子特别包括″嵌合″结合分子，其重链和/或轻链的一部分与来源于具体物种，或者属于具体抗体型或亚型的结合分子中的相应序列是相同或同源的，而链的其它部分与来源于另一物种或属于另一抗体型或亚型的结合分子，以及这样的结合分子的片段中的相应序列是相同或同源的，只要它们表现出所需的生物活性(美国专利4,816,567；和Morrison，et al.Proc.Natl.Acad. Sci.USA 81：6851-6855(1984))，比如与人GITR(hGITR)结合。

轻链和重链均被按照结构和功能同源性分成不同区域。术语“恒定”和“可变”是用于描述功能性的。就这方面而言，应当明白轻链部分的可变结构域(VL)和重链部分的可变结构域(VH)决定了抗原识别和特异性。相反，轻链的恒定结构域(CL)和重链的恒定结构域(CH1、CH2或CH3)赋予重要的生物特性，比如分泌性、穿过胎盘、Fc受体结合、补体结合等等。传统上，恒定区结构域随着离抗原结合位点或抗体氨基末端越远其编号越大。N末端是可变区，C末端是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。

″可变区″在用于描述结合分子时是指结合分子的氨基末端部分，这一部分促使抗原结合到所述结合分子上，并且不是恒定区。该术语包括维持整个可变区的一些或全部结合功能的功能性片段。

术语″超变区″用于本文是指结合分子可变结构域中这样的区域，其在序列上超可变并且/或者形成结构上局限在一起的环形。超变区包含来自″互补决定区″或″CDR″的氨基酸残基。

用于本文，术语″CDR″或″互补决定区″意味着在重链和轻链多肽的可变区中可以发现的非连续抗原结合位点。Kabat，et al.J.Biol.Chem.252，6609-6616(1977)和Kabat，et al.Sequences of protein of immunologicalinterest.(1991)，以及Chothia，et al.J.Mol.Biol.196：901-917(1987)和MacCallum，et al.J.Mol.Biol.262：732-745(1996)描述过这些具体区域，其中的定义包括在相互进行比较时氨基酸残基的重叠或亚组。总之，用这些定义中的任何一个来指结合分子或移植结合分子或者其变体的CDR都在文中界定和使用的术语的范围内。

用于本文，术语″框架区″或“FR”意味着框架中被CDR分隔开的每个结构域。因此，可变区框架长约100-120个氨基酸，但仅指CDR之外的那些氨基酸。

非人(例如鼠)结合分子的″人源化″形式是含有最少的来自非人结合分子序列的嵌合抗体。多数情况，人源化结合分子是这样的人结合分子(受体/接受结合分子)，其中来自超变区的残基被来自非人物种(供体结合分子)，比如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类超变区具备所需特异性、亲和性和能力的残基所取代。在一些例子中，人结合分子的Fv框架区(FR)残基被改变，例如替换、取代或回复突变成相应的非人残基。此外，人源化结合分子可能包含受体结合分子或供体结合分子中都没有的残基。这类修饰一般是为了进一步优化结合分子的性能。通常，人源化结合分子会包含基本上全部的至少一个，一般是两个可变区，其中全部或基本上全部超变环对应着非人结合分子的超变环，并且全部或基本全部FR区是人结合分子序列的FR。人源化结合分子任选还包含通常是人结合分子的结合分子恒定区(Fc)的至少一部分。更详细内容，参见Jones，et al.Nature 321：522-525(1986)；Riechmann，et al.Nature 332：323-329(1988)；Presta，Curr.Op. Struct.Biol.2：593-596(1992)。

优选的，本发明的人源化结合分子包含至少一个选自SEQ ID NO.3(GFSLSTSGMGVG(HC CDR1))、SEQ ID NO.4(HIWWDDDKYYNPSLKS(HC CDR2N))、SEQ ID NO.5(TRRYFPFAY(HC CDR3))、SEQ ID NO.6(KASQNVGTNVA(LC CDR1))、SEQ ID NO.7(SASYRYS(LC CDR2))、SEQID NO.8(QQYNTDPLT (LC CDR3))和SEQ ID NO：19(HIWWDDDKYYQPSLKS(HC CDR2Q))的CDR。

术语″工程化的”或“重组”结合分子用于本文包括通过重组手段制备、表达、创造或分离的结合分子，比如利用转染到宿主细胞的重组表达载体表达的结合分子，从重组、组合结合分子文库中分离的结合分子，从人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)中分离的结合分子(参见例如，Taylor，L.D.et al.(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)，或者通过其它涉及将人结合分子基因序列剪接到其它DNA序列上的手段来制备、表达、创造或分离的结合分子。但是在一些实施方案中，这类重组人结合分子经受了体外突变(或者，当使用人Ig序列的转基因动物时，是体内体细胞突变)，因此重组结合分子的VH和VL区的氨基酸序列虽然来源于并且与人种系VH和VL序列相关，可能不是天然存在于人结合分子体内种系中的。

″分离的结合分子″用于本文是指这样的结合分子，这种结合分子基本上不含具有不同抗原特异性的其它结合分子(例如，特异结合GITR的分离的结合分子基本上不含有特异结合GITR之外的抗原的结合分子)。此外，分离的结合分子可能基本上不含有其它细胞物质和/或化学物质。″分离的″结合分子是已经从其天然环境中的成分中鉴定并且分离和/或回收的结合分子。天然环境的杂质成分包括，例如会干扰结合分子的诊断或治疗用途的物质，可包括酶，激素，及其它蛋白性或非蛋白性溶质。在优选的实施方案中，结合分子经过纯化可以达到以下程度：(1)按Lowry法测定，达到该化合物重量的95％以上，最优选重量的99％以上，(2)足以经转杯式测序仪(spinning cup sequenator)测出N-末端氨基酸序列或内部氨基酸序列的至少15个残基，或者(3)经过还原或非-还原条件下的SDS-PAGE和考马斯蓝或优选银染色测出为均质。分离的结合分子包括重组细胞中的原位结合分子，因为缺少该结合分子的天然环境至少一个成分。但是通常，分离的结合分子是通过至少一个纯化步骤制备的。

用于本文，术语″结合常数”“(kd)”(又称为“亲和常数”)用于衡量两种分子之间可逆结合的程度，包括实际结合亲和性和表观结合亲和性。实际结合亲和性是通过计算M^-1S^-1的结合常数与S^-1的解离常数的比率确定的，单位为“M^-1”。因此，赋予或者优化结合亲和性包括对这两个成分中的一个进行改变，或者两者都做改变来达到所需水平的结合亲和性。表观亲和性可以包括，例如反应的亲和力。例如，两价异数可变区结合片段可能因为其价态，表现出变化的或被优化的结合亲和性。结合亲和性可以通过例如利用BIAcore系统测量表面等离子共振来确定。

术语″核酸分子″用于本文，包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。

术语″分离的核酸分子″在本文中用于描述编码能结合GITR的结合分子的核酸时，是指该核酸分子中编码所述结合分子的核苷酸序列不含有在人基因组DNA中天然侧接该核酸的其它核苷酸序列。这类序列任选包括对调节或蛋白质稳定性重要的5’或3’核苷酸序列。

术语″载体″用于本文是指能够转移连在它上面的另一个核酸的核酸分子。载体的一类是″质粒″，指的是可以在其中连接上其它DNA片段的圆形双链DNA环。另一类载体是病毒载体，其中其它的DNA片段可以连接到病毒基因组中。一些载体能够在所导入的宿主细胞中自动复制(例如，带有细菌复制起点的细菌载体，和游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在导入宿主细胞后能够整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，还有一些载体能够指导与它们可操纵性连接的基因的表达。这类载体在本文中称为″重组表达载体″(或简称为″表达载体″)。一般来说，在重组DNA技术中使用的表达载体通常是质粒。在本说明书中，″质粒″和″载体″可以互换使用，因为最常用的载体形式就是质粒。但是，本发明包括其它形式的表达载体，比如病毒载体(例如，复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，它们可以起到相同的功能。

术语″重组宿主细胞″(或者简称″宿主细胞″)用于本文，是指导入了重组表达载体的细胞。应当明白的是，这类术语不仅指具体的所述细胞，还包括该细胞的后代。因为在后续世代中可能因为突变或环境影响而发生修饰，这些后代可能实际上是不同于亲本细胞的，但仍然包括在文中所用术语“宿主细胞”的范围内。

用于本文，术语″T细胞″(即T淋巴细胞)包括来自哺乳动物(例如人)的T细胞系中的所有细胞，包括胸腺细胞、未成熟T细胞、成熟T细胞等等。优选，所述T细胞是表达CD4或者CD8，但不是两者都表达，以及T细胞受体的成熟T细胞。文中描述的各种T细胞群体可以根据它们的细胞因子特点和功能进行界定，对本领域技术人员是已知的。

用于本文，术语″树突状细胞”是指能够活化原初(naive)T细胞、刺激B细胞生长和分化的专职抗原递呈细胞(APCs)。

用于本文，术语“原初(naive)T细胞”包括还没有接触关联抗原，因此是未被活化的或者有记忆的T细胞。原初T细胞不循环，人原初T细胞是CD45RA+。如果原初T细胞识别抗原并且接受了其它信号，这些信号可以是基于但不限于抗原的量、给予途径和给予时机，原初T细胞可能增殖并分化成各种T细胞亚型，例如效应T细胞。

用于本文，术语“效应T细胞”或者“Teff细胞”包括功能在于(例如，通过产生能调节其它细胞的活化的细胞因子或者通过细胞毒活性)清除抗原的T细胞。术语“效应T细胞”包括辅助性T细胞(例如，Th1和Th2细胞)以及细胞毒性T细胞。Th1细胞介导延迟型超敏反应和巨细胞活化，而Th2细胞能够协助B细胞，在过敏反应中非常关键(Mosmann and Coffman，1989，Annu.Rev.Immunol.7，145-173；Paul and Seder，1994，Cell 76，241-251；Arthurand Mason，1986，J.Exp.Med.163，774-786；Paliard，et al.1988，J.Immunol.141，849-855；Finkelman，et al.1988，J.Immunol.141，2335-2341)。

用于本文，术语“1型辅助性T细胞反应”(Th1反应)是指这样的反应，其特征在于产生一或多种选自IFN-γ、IL-2、TNF和淋巴毒素(LT)的细胞因子，以及其它优先或专门由Th1细胞而非Th2细胞产生的细胞因子。用于本文，“2型辅助性T细胞反应”(Th2反应)是指CD4+T细胞的反应，其特征在于产生一或多种选自IL-4、IL-5、IL-6和IL-10的细胞因子，并且与有效的Th2细胞提供的B细胞“协助”有关(例如，IgG1和/或IgE的产生增加)。

用于本文，术语“调节性T细胞”或“Treg细胞”包括产生低水平IL-2、IL-4、IL-5和IL-12的T细胞。调节性T细胞产生TNFα、TGFβ、IFN-γ和IL-10，但低于效应T细胞产生的水平。虽然TGFβ是调节性T细胞产生的主要细胞因子，它所产生的细胞因子的水平要低于或等同于Th1或Th2细胞产生的，例如比Th1或Th2细胞中的低一个数量级。调节性T细胞可见于CD4+CD25+细胞群(参见，例如Waldmann and Cobbold.2001.Immunity.14：399)。调节性T细胞能积极主动地抑制Th1、Th2或者原初T细胞的增殖和产生细胞因子，其中这些原初T细胞已经在培养中用激活信号(例如，抗原和抗原递呈细胞，或者用模拟MHC中的抗原(例如，抗CD3抗体，加上抗CD28抗体))刺激过。

用于本文，术语“耐受性”包括对活化受体介导的刺激的不应性。这种不应性通常是抗原特异性的，在与耐受化抗原的接触中止后仍然存在。例如，耐受性的特点表现为缺乏产生细胞因子(例如IL-2)，或者可以利用混合淋巴细胞培养来评价。耐受性可以对自身抗原或外来抗原发生。

“混合淋巴细胞培养”(“MLC”)是一种淋巴细胞增殖检测，将来自两个个体的淋巴细胞一起培养，通过³H-标记的胸苷的摄取来测量增殖反应(“混合淋巴细胞反应”)。

用于本文，术语“细胞凋亡”又称为程序化细胞死亡(PCD)，是这样的细胞死亡，其特征包括，但不限于核异染色质的凝聚、细胞收缩、细胞质凝聚，以及在细胞凋亡后期，内切核酸酶介导的细胞DNA被切割成具体片段。在对已发生细胞凋亡的细胞DNA进行电泳分析时，可能形成明显的特征性DNA片段″梯度″。

″处置″既包括治疗性处置，也包括预防或防止性措施。需要某种处置的包括已经患有某种紊乱的，也包括还未表现紊乱的。

″紊乱″是任何可能受益于用本发明结合分子进行处置的状况。它包括慢性和急性紊乱或疾病或者与过高或过低免疫应答相关的病理状态。

以下部分进一步详细描述了本发明的各个方面。

II.GITR结合分子

本发明提供了分离的GITR结合分子。示范性的本发明结合分子包括6C8抗体和2F8抗体。6C8抗体是一种抗GITR抗体，能够与T细胞和树突状细胞，比如人T细胞和树突状细胞上的GITR高亲和性结合。优选的，这样的结合分子抵消Treg细胞对Teff细胞的抑制，在有刺激剂(例如CD3)存在的情况下体外对部分活化的T细胞是拮抗性的。

在一实施方案中，本发明结合分子的VH结构域包含SEQ ID NO：1所示之氨基酸序列(6C8 VH结构域“N”，包括引导序列)。应当明白的是，虽然本文描述的结合分子的一些序列包括引导序列，本发明结合分子也可以不包含引导序列，这一点是任选的。例如，在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：1所示成熟蛋白质的氨基酸序列，例如SEQ ID NO：1中的氨基酸20-138。

在一实施方案中，本发明结合分子的VH结构域包含SEQ ID NO：66所示之氨基酸序列(6C8 VH结构域“Q”，包括引导序列)。

在一实施方案中，本发明结合分子的VL结构域包含SEQ ID NO：2所示之氨基酸序列(6C8 VL结构域，包括引导序列)。

在一实施方案中，本发明结合分子的VH结构域包含SEQ ID NO：1中的氨基酸残基20-138(6C8 VH结构域“N”，不含引导序列)。

在一实施方案中，本发明结合分子的VH结构域包含SEQ ID NO：66中的氨基酸残基20-138(6C8 VH结构域“Q”，不含引导序列)。

在一实施方案中，本发明结合分子的VL结构域包含SEQ ID NO：2中的氨基酸残基21-127(6C8 VL结构域，不含引导序列)。

在本发明的一实施方案中，VL链包含引导和/或信号序列，即SEQ IDNO：2中的氨基酸残基1-20(SEQ ID NO：59)。在一实施方案中，VH链包含引导和/或信号序列，即SEQ ID NO：1中的氨基酸残基1-19(SEQ IDNO：64)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含的VH结构域含有SEQ ID NO：3所示之CDR(6C8 VH CDR1)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含的VH结构域含有SEQ ID NO：4所示之CDR(6C8 VH CDR2-“N”)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含的VH结构域含有SEQ ID NO：5所示之CDR(6C8 VH CDR3)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含的VH结构域含有SEQ ID NO：19所示之CDR(6C8 VH CDR2-alternate“Q”)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含的VL结构域含有SEQ ID NO：6所示之CDR(6C8 VL CDR1)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含的VL结构域含有SEQ ID NO：7所示之CDR(6C8 VL CDR2)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含的VL结构域含有SEQ ID NO：8所示之CDR(6C8 VL CDR3)。

本发明还涉及编码上述氨基酸序列的核酸分子。

在一实施方案中，本发明结合分子的VH结构域包含SEQ ID NO：9所示之核苷酸序列(6C8 VH结构域，“N”，包括引导序列)。

在一实施方案中，本发明结合分子的VH结构域包含SEQ ID NO：65所示之核苷酸序列(6C8 VH结构域，“Q”，包括引导序列)。

在一实施方案中，本发明结合分子的VH结构域包含SEQ ID NO：9中的核苷酸58-414(6C8 VH结构域，“N”，不含引导序列)。

在一实施方案中，本发明结合分子的VH结构域包含SEQ ID NO：65中的核苷酸58-414(6C8 VH结构域，“Q”，不含引导序列)。

在一实施方案中，本发明结合分子的VL结构域包含SEQ ID NO：10所示之核苷酸序列(6C8 VL结构域，包括引导序列)。

在一实施方案中，本发明结合分子的VL结构域包含SEQ ID NO：10中的核苷酸61-381(6C8 VL结构域，不含引导序列)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含的VH结构域含有其核酸序列如SEQ ID NO：11所示的CDR(6C8 VH CDR1)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含的VH结构域含有其核酸序列如SEQ ID NO：12所示的CDR(6C8 VH CDR2-“AAT”)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含的VH结构域含有其核酸序列如SEQ ID NO：13所示的CDR(6C8 VH CDR3)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含的VH结构域含有其核酸序列如SEQ ID NO：65所示的CDR(6C8 VH CDR2-alternate“CAA”)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含的VL结构域含有其核酸序列如SEQ ID NO：14所示的CDR(6C8 VL CDR1)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含的VL结构域含有其核酸序列如SEQ ID NO：15所示的CDR(6C8 VL CDR2)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含的VL结构域含有其核酸序列如SEQ ID NO：16所示的CDR(6C8 VL CDR3)。

在一实施方案中，本发明结合分子的CL结构域包含SEQ ID NO：20所示之氨基酸序列(鼠IgG2a轻链恒定区)。

在一实施方案中，本发明结合分子的CH结构域包含SEQ ID NO：21所示之氨基酸序列(鼠IgG2a重链恒定区)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含SEQ ID NO：22所示之氨基酸序列(嵌合-6C8VL/人CL IgG1)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含SEQ ID NO：23所示之氨基酸序列(嵌合Gly-6C8 VH/人CH IgG1)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含SEQ ID NO：24所示之氨基酸序列(嵌合Agly-6C8 VH/人CH IgG1)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含SEQ ID NO：44所示之氨基酸序列(人源化6C8 VL)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含SEQ ID NO：53所示之氨基酸序列(人源化6C8 VH“N”)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含SEQ ID NO：54所示之氨基酸序列(人源化6C8 VH“Q”)。

在一实施方案中，本发明结合分子的CL结构域包含如SEQ ID NO：55所示之氨基酸序列(人IgG1 Gly重链恒定区)。

在一实施方案中，本发明结合分子的CH结构域包含SEQ ID NO：56所示之氨基酸序列(人IgG1 Agly重链恒定区)。

在一实施方案中，本发明结合分子的CL结构域包含SEQ ID NO：57所示之氨基酸序列(人IgG1轻链恒定区)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含SEQ ID NO：58所示之氨基酸序列(完全人源化6C8轻链)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含SEQ ID NO：60所示之氨基酸序列(完全人源化6C8重链-HuN6C8-Gly)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含SEQ ID NO：61所示之氨基酸序列(完全人源化6C8重链-HuN6C8-Agly)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含SEQ ID NO：62所示之氨基酸序列(完全人源化6C8重链-HuQ6C8-Gly)。

在一实施方案中，本发明结合分子包含SEQ ID NO：63所示之氨基酸序列(完全人源化6C8重链-HuQ6C8-Agly)。

在一实施方案中，本发明的结合分子具有如图18A-18D所示的VL和VH序列；SEQ ID NO：1也显示了6C8 VH区的氨基酸序列；6C8 VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。在另一实施方案中，本发明的结合分子具有SEQ ID NO：20和21所示之LC和HC序列；ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNE(SEQ ID NO：20)；AKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK(SEQ ID NO：21)。

在本发明的一实施方案中，VL链包含引导和/或信号序列，例如SEQ IDNO：2的氨基酸残基1-20。在一实施方案中，VH链包含引导和/或信号序列，例如SEQ ID NO：1中的氨基酸残基1-19。在另一实施方案中，本发明的结合分子不含有引导和/或信号序列。

在一个方面，本发明涉及6C8结合分子和其它与6C8特性相当的结合分子，所述特性比如高亲和性结合GITR，以及抵消Treg细胞对Teff细胞的抑制作用。此外，本发明的结合分子不会诱发细胞凋亡，也不会抑制混合淋巴细胞反应。相应的，本发明的等同的结合分子是GITR拮抗剂，即它们能诱发经由GITR进行的信号转导。GITR是TNFR超家族的成员。因为TNFR家族的成员通过经由NF-κB进行的信号转导参与细胞存活和细胞凋亡，在一实施方案中，本发明的结合分子能减弱I-κB的降解。

在一实施方案中，本发明提供了分离的hGITR结合分子，其轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：2之氨基酸序列，以及任选的引导序列；重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：1之氨基酸序列，以及任选的引导序列。在一些实施方案中，所述结合分子包含重链恒定区，比如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，IgE，IgM或IgD恒定区。此外，所述结合分子可以包含轻链恒定区，即κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。所述结合分子优选包含κ轻链恒定区。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：20所示之轻链恒定区。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：21所示之重链恒定区。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：55所示之重链恒定区。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：56所示之重链恒定区。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：57所示之重链恒定区。

在另一实施方案中，本发明提供了具有6C8相关VL CDR结构域的结合分子，例如带有这样的轻链可变区(VL)的结合分子，该轻链可变区有至少一个CDR结构域，后者包含的氨基酸序列选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8。在另一实施方案中，轻链可变区(VL)有至少两个CDR结构域，结构域的氨基酸序列选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8。还有一实施方案中，轻链可变区(VL)的CDR结构域包含的氨基酸序列选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8。

还有一些实施方案中，本发明提供了具有6C8-相关的VH CDR结构域的结合分子，例如结合分子的轻链可变区(VH)的CDR结构域包含选自SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：19的氨基酸序列。在另一实施方案中，重链可变区(VH)有至少两个CDR结构域，其包含的氨基酸序列选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：19。还有一实施方案中，重链可变区(VH)具有的CDR结构域包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：19的氨基酸序列。

在另一实施方案中，本发明的结合分子包含至少一个来源于小鼠抗人GITR结合分子，例如6C8结合分子的CDR。用于本文，术语“来源于”一个指定的蛋白质表示多肽的来源。在一实施方案中，来源于具体起始多肽的多肽或氨基酸序列是CDR序列或其相关序列。在另一实施方案中，来源于具体起始多肽的多肽或氨基酸序列是FR序列或其相关序列。在一实施方案中，来源于具体起始多肽的氨基酸序列不是连续的。

例如，在一实施方案中，有1、2、3、4、5、或6个CDR来源于小鼠6C8抗体。在一实施方案中，本发明的结合分子包含小鼠6C8抗体的至少一个重链或轻链CDR。在另一实施方案中，本发明的结合分子包含至少两个来自小鼠6C8抗体的CDR。在另一实施方案中，本发明的结合分子包含至少三个来自小鼠6C8抗体的CDR。在另一实施方案中，本发明的结合分子包含至少四个来自小鼠6C8抗体的CDR。在另一实施方案中，本发明的结合分子包含至少五个来自小鼠6C8抗体的CDR。本发明的结合分子包含至少六个来自小鼠6C8抗体的CDR。

本领域技术人员明白，本发明结合分子可以被修饰成与它们所来源的6C8分子在氨基酸序列上不同。例如，可以进行导致保守性取代的核苷酸或氨基酸取代，或对非必需氨基酸残基(例如，在CDR和/或框架中的残基)进行改变，且保持其结合GITR(例如人GITR)的能力。

在一实施方案中，至少一个CDR(或者结合分子中一个以上6C8 CDR中的至少一个)被修饰成与天然6C8结合分子的序列不同，但保持了结合6C8的能力。例如，在一实施方案中，6C8抗体中的一或多个CDR被修饰以便除去潜在的糖基化位点。例如，因为氨基酸序列Asn-X-(Ser/Thr)预计是糖基化位点的共有序列，可能影响到结合分子的产生，而6C8重链的CDR2具有序列Asn-Pro-Ser，故该重链的第二个版本被制备成SEQ IDNO：53中氨基酸残基62的天冬酰胺(Asn)被保守取代成谷氨酰胺(Gln)。

在一实施方案中，本发明的结合分子包含这样的多肽或氨基酸序列，其与6C8抗体或者该抗体的一部分基本相同，所述部分由至少3-5个氨基酸、至少5-10个氨基酸、至少10-20个氨基酸、至少20-30个氨基酸或者至少30-50个氨基酸组成，或者本领域技术人员可以看出其来源于起始序列。

在另一实施方案中，来源于具体起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列具有约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列相同性，或者本领域技术人员可以看出其来源于所述起始序列。

编码多肽之非天然变体的分离核酸分子可以通过向结合分子的核苷酸序列中引入一或多个核苷酸取代、添加或缺失，从而在所编码的蛋白质中引入一或多个氨基酸取代、添加或缺失来产生。可以通过常规技术，比如定点突变和PCR介导的突变来引入突变。在一实施方案中，在一或多个非关键氨基酸残基处做了保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是将氨基酸残基用有类似侧链的另一个氨基酸残基代替。有类似侧链的氨基酸残基家族在本领域已有明确界定，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，结合分子多肽中的一个非关键氨基酸残基可以替换成来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基。在另一实施方案中，一列氨基酸可以替换成结构类似，但顺序和/或侧链家族组成不同的氨基酸串。

替代的，在另一实施方案中，可以沿着结合分子编码序列的全部或部分来引入突变。

优选的本发明结合分子包含来源于人氨基酸序列的框架和恒定区氨基酸序列。但是，所述结合分子可以包含来源于另一个哺乳动物物种的框架和/或恒定区序列。例如，所述结合分子中可以包括灵长类的框架区(例如，非人灵长类)、重链部分，和/或铰链部分。在一实施方案中，结合多肽的框架区可以含有一或多个鼠氨基酸，例如人或非人灵长类框架氨基酸序列可以包含一或多个氨基酸取代和/或回复突变，其中有对应的鼠氨基酸残基。优选的本发明结合分子的免疫原性比起始的6C8鼠抗体的低。

本发明还提供了GITR的特异性嵌合和/或人源化结合分子(即，嵌合和/或人源化免疫球蛋白)。嵌合和/或人源化结合分子与提供作为构建该嵌合或人源化结合分子的起始原料的小鼠或其它非人结合分子有相同或类似的结合特异性和亲和性。

嵌合结合分子一般是通过基因工程，由属于不同物种的免疫球蛋白基因片段构建成它的轻链和重链基因。例如，可以将小鼠单克隆结合分子基因的可变(V)片段与人的恒定(C)片段(比如，IgG1或IgG4，优选人同种型IgG1)连在一起。因此，一个示范性的嵌合结合分子是由来自小鼠结合分子的V或抗原结合结构域以及来自人结合分子的C或效应子结构域构成的杂交蛋白质。

在一实施方案中，本发明涉及到人源化6C8结合分子的可变区以及包含这样的人源化可变区的多肽。在一实施方案中，本发明的结合分子包含至少一个人源化6C8结合分子可变区，例如轻链或重链可变区。

术语“人源化结合分子”是指这样的结合分子，其包含至少一个含有来源于人结合分子链(称为受体免疫球蛋白或结合分子)的可变区框架残基的链，和至少一个来源于小鼠结合分子(称为供体免疫球蛋白或结合分子)的互补决定区。人源化结合分子可以采用下面讨论的重组DNA技术来制备。参见例如，Hwang，W.Y.K.et al.(2005)Methods 36：35；Queen et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1989)，86：10029-10033；Jones et al.Nature，(1986)，321：522-25；Riechmann et al.Nature，(1988)，332：323-27；Verhoeyen et al.Science，(1988)，239：1534-36；Orlandi et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1989)，86：3833-37；美国专利5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；6,180,370，Selick et al.WO 90/07861以及Winter，US 5,225,539(以参考文献的方式全部并入本文)。恒定区，如果有的话，优选也来源于人免疫球蛋白。

当选定了优选非人供体结合分子进行人源化时，可以从例如表达的人抗体基因序列数据库、种系Ig序列或多个人结合分子的共有序列来获得合适的人受体结合分子。

在一实施方案中，基于CDR同源性的方法被用于进行人源化(参见，例如Hwang，W.Y.K.et al.(2005)Methods 36：35，该文内容以引用的方式全部并入本文)。这种方法通常涉及到根据类似结构的小鼠和人CDR，而不是类似结构的小鼠和人框架来将小鼠CDR取代到人可变结构域框架中。确定小鼠和人CDR的类似性一般是通过鉴定相同类型的链(轻链或重链)的人基因，所述链与小鼠结合分子有相同的规范CDR结构组合，从而保持CDR肽骨架的三维构象。第二，对每个具有匹配的规范结构的候选可变基因，在小鼠和候选人CDR之间评价残基和残基的同源性。最后，为了产生人源化结合分子，将选中的人候选CDR中和小鼠CDR不同的CDR残基改变成小鼠的序列。在一实施方案中，人源化结合分子中没有引入人框架的突变。

在一实施方案中，评价了人种系序列与GITR结合分子CDR的CDR同源性。例如，对小鼠6C8抗体，将IMGT数据库中具有2-1-1规范结构的所有种系轻链κ链V基因与6C8抗体序列进行了比较。对重链同样将所有3-1种系重链V基因与6C8氨基酸序列进行了比较。相应的，在一实施方案中，本发明的结合分子包含具有2-1-1规范结构的人κ链V区框架。在另一实施方案中，本发明的结合分子包含具有3-1规范结构的人重链V区框架。

我们鉴定到以下潜在的人轻链种系序列，可以引入到本发明的结合分子中：

IGKV3-15基因的IMGT登录号是M23090。氨基酸序列是：

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWP(SEQ ID NO：25)。

IGKV3D-11基因的IMGT登录号是X17264。氨基酸序列是：

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQGVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGPGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWH(SEQID NO：26)。

IGKV3-11基因有两个等位基因。IGKV3-11基因的等位基因^*01的IMGT登录号是X01668。氨基酸序列是：

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP(SEQID NO：27)。

等位基因^*02的IMGT登录号是X02768。氨基酸序列是：

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGRDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP(SEQID NO：28)。

IGKV1D-43基因的IMGT登录号是X72817。氨基酸序列是：

AIRMTQSPFSLSASVGDRVTITCWASQGISSYLAWYQQKPAKAPKLFIYYASSLQSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTP(SEQID NO：29)。

IGKV1-39基因有两个等位基因。IGKV1-39基因的等位基因^*01的IMGT登录号是X59315。氨基酸序列是：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP(SEQID NO：30)。

IGKV1-39基因的等位基因^*02的IMGT登录号是X59318。氨基酸序列是：

DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQCGYSTP(SEQID NO：31)。

IGKV1-33基因的IMGT登录号是M64856。氨基酸序列是：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLP(SEQID NO：32)。

IGKV1-27基因的IMGT登录号是X63398。氨基酸序列是：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAP(SEQ ID NO：33)。

IGKV1-17基因有两个等位基因。IGKV1-17基因的等位基因^*01的IMGT登录号是X72808。氨基酸序列是：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYP(SEQID NO：34)。

IGKV1-17基因的等位基因^*02的IMGT登录号是D88255。氨基酸序列是：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISNLQPEDFATYYCLQHNSYP(SEQID NO：35)。

IGKV1D-16基因有两个等位基因。IGKV1D-16基因的等位基因^*01的IMGT登录号是K01323。氨基酸序列是：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYP(SEQID NO：36).

IGKV1D-16基因的等位基因^*02的IMGT登录号是J00244。氨基酸序列是：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRARQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYP(SEQID NO：37)。

IGKV1-16基因的IMGT登录号是J00248。氨基酸序列是：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYP(SEQID NO：38)。

IGKV1-12基因有两个等位基因。IGKV1-12基因的等位基因^*01的IMGT登录号是V01577。氨基酸序列是：

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFP(SEQID NO：39)。

IGKV1-12基因的等位基因^*02的IMGT登录号是V01576。氨基酸序列是：

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFP(SEQID NO：40)。

IGKV1-9基因的IMGT登录号是Z00013。氨基酸序列是：

DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYP(SEQID NO：41)。

IGKV1-6基因的IMGT登录号是M64858。氨基酸序列是：

AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYNYP(SEQID NO：42)。

IGKV1-5基因有三个等位基因。IGKV1-5基因的等位基因^*01的IMGT登录号是Z00001。氨基酸序列是：

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYS(SEQID NO：43)。

我们鉴定到以下潜在的人重链种系序列，可以引入到本发明的结合分子中：

IGHV2-5基因有十个等位基因。IGHV2-5基因的等位基因^*01的IMGT登录号是X62111。氨基酸序列是：

QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWLALIYWNDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYY(SEQ ID NO：45)。

IGHV2-26基因的IMGT登录号是M99648。氨基酸序列是：QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSNARMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARI(SEQ ID NO：46)。

IGHV2-70基因有十三个等位基因。IGHV2-70基因的等位基因^*01的IMGT登录号是L21969。氨基酸序列是：

QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMCVSWIRQPPGKALEWLALIDWDDDKYYSTSLKTRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARI(SEQ ID NO：47)。

IGHV4-30-2基因有4个等位基因。IGHV4-30-2基因的等位基因^*01的IMGT登录号是L10089。氨基酸序列是：

QLQLQESGSGLVKPSQTLSLTCAVSGGSISSGGYSWSWIRQPPGKGLEWIGYIYHSGSTYYNPSLKSRVTISVDRSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO：48)。

IGHV4-30-4基因有六个等位基因。IGHV4-30-4基因的等位基因^*01的IMGT登录号是Z14238。氨基酸序列是：

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO：49)。

IGHV4-31基因有十个等位基因。IGHV4-31基因的等位基因^*01的IMGT登录号是L10098。氨基酸序列是：

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTYYNPSLKSLVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO：50)。

IGHV4-39基因有六个等位基因。IGHV4-39基因的等位基因^*01的IMGT登录号是L10094。氨基酸序列是：

QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO：51)。

IGHV4-61基因有八个等位基因。IGHV4-61基因的等位基因^*01的IMGT登录号是M29811。氨基酸序列是：

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO：52)。

这些种系序列每一个都可以用于提供框架区和一或多个6C8 CDR一起使用。

用于本文，“规范结构”是由不同CDR形成的保守的超变环构象，结合分子借助这些构象与抗原产生接触。利用公共领域的软件可以将新的结合分子划分规范结构类型。

在另一实施方案中，将小鼠CDR取代到人可变结构域框架中是在能够维持小鼠可变结构域框架的正确立体取向的基础上进行的，这是通过鉴定到这样的人可变结构域框架，这些人可变结构域框架能维持在和CDR所来源的小鼠可变结构域框架相同的构象。在一实施方案中，这一点的实现是通过获取人结合分子中那些其框架序列与CDR所来源的小鼠可变框架结构域表现出高度序列相同性的人可变结构域。参见Kettleborough et al.ProteinEngineering 4：773(1991)；Kolbinger et al.Protein Engineering 6：971(1993)和Carter et al.WO 92/22653。

优选人受体结合分子保留供体结合分子的规范和界面残基。此外，所述人受体结合分子优选在CDR环长度方面有相当的类似性。参见，Kettleborough et al.Protein Engineering 4：773(1991)；Kolbinger et al.ProteinEngineering 6：971(1993)和Carter et al.WO 92/22653。

在另一实施方案中，可以在与6C8结合分子的框架区的同源性的基础上选择合适的人受体序列。例如，可以将6C8结合分子的氨基酸序列与其它已知结合分子的氨基酸序列进行比较，例如通过将6C8氨基酸序列的FR区或可变区与已知结合分子的公众数据库进行比较，挑选那些可变区或FR区氨基酸相同百分比最高的序列，即达到80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％相同的。在一实施方案中，可以使用SEQ ID NO：67列出的框架系列(QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITSVDTRDTATYYCARTRRYFPFAYWGEGTSVTVTS(SEQ ID NO：67；框架残基以粗体表示))。在另一实施方案中，可以使用SEQ ID NO：68列出的框架序列(QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKYNP SLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARTRRYFPFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：68；框架残基以粗体表示))。

鉴定出鼠供体免疫球蛋白的互补决定区和合适的人受体免疫球蛋白后，下一步是决定如果需要这些成分中的哪些残基应当被取代以便使所得人源化结合分子的特性得到优化。通常，应当尽量减少用鼠取代人的氨基酸残基，因为导入鼠残基会提高结合分子在人体内引发人抗小鼠抗体(HAMA)反应的危险。可以应用本领域认可的确定免疫反应的方法来监视具体患者或者临床试验过程中的HAMA反应。可以对被给予人源化结合分子的患者在进行该项疗法的开始和过程中进行免疫原性评价。例如利用本领域技术人员已知的方法，包括表面等离子共振技术(BIACORE)和/或固相ELISA分析法，通过检测患者血清样品中针对该人源化治疗剂的抗体来衡量HAMA反应。

如果必要，可以将人框架区中的一或多个残基改变或取代成鼠抗体中相应位点的残基，从而保留人源化抗体对抗原的结合亲和性。这种改变有时被称为“回复突变”。基于它们对CDR构象和/或结合抗原的可能影响，挑选人可变区框架残基中的一些氨基酸来做回复突变。用人可变框架区代替鼠CDR区可能造成构象限制，如果不通过取代一些氨基酸残基来进行纠正，会导致结合亲和性的丢失。

在一实施方案中，进行回复突变的氨基酸残基可以部分地利用本领域认可的技术通过计算机模型构建来选择。通常，是以免疫球蛋白链或其结构域已经解决的结构为起点产生分子模型。比较待建模的链与已知三维结构的链或结构域的氨基酸序列类似性，挑选表现出最高序列类似性的链或结构域作为分子建模的起点。选择具有至少50％序列相同性，优选有至少60％、70％、80％、90％或更高序列相同性的链或结构域进行建模。将已知的起始结构进行改动，允许待模拟免疫球蛋白链或结构域中的实际氨基酸和起始结构中的氨基酸之间的差别。然后将改动过的结构组装成组合免疫球蛋白。最后，对模型进行精调，包括通过能量最小化，以及确认所有原子处在合适的距离内，键长和键角在化学上可接受的范围内。

选择进行取代的氨基酸残基也可以部分通过检验具体位置上的氨基酸的特点，或者借助经验观察具体氨基酸取代或突变可能造成的影响。例如，当小鼠可变区框架残基和选定的人可变区框架残基的氨基酸不同时，如果可以合理地预期该氨基酸(1)非共价地直接结合抗原，(2)与CDR区接近，(3)或者与CDR区有相互作用(例如，通过计算机建模确定其与CDR区在约3-6

内)，或者(4)参与VL-VH界面，可以将人框架氨基酸用小鼠结合分子中的等同框架氨基酸来取代。

“非共价地直接结合抗原”的残基包括框架区位点上的氨基酸，它们有很大的可能与抗原上的氨基酸根据已建立的化学力(例如氢键、范德华力、疏水相互作用等)直接相互作用。

“接近CDR区”的残基包括人源化免疫球蛋白链一级序列中紧挨着一或多个CDR的位点上的氨基酸残基，例如处于紧挨着Kabat所定义的CDR，或者Chothia定义的CDR(参见，例如Chothia and Lesk JMB 196：901(1987))的位点上。这些氨基酸特别可能与CDR中的氨基酸发生相互作用，如果从受体中选择，可能会使供体CDR变形，降低亲和性。此外，相邻氨基酸可能与抗原直接相互作用(Amit et al.Science，233：747(1986)，该文以参考文献方式并入本文)，就可能希望选择供体中的这些氨基酸，以便保持原有结合分子中提供亲和性的所有抗原接触。

“或者与CDR区相互作用”的残基包括那些被二级结构分析确定为处于足够影响CDR区的立体取向的残基。在一实施方案中，“或者与CDR区相互作用”的残基是通过分析供体免疫球蛋白的三维模型(例如计算机产生的模型)鉴定到的。三维模型，通常是原有的供体结合分子的三维模型，显示CDR外的一些氨基酸接近CDR，有很大的可能通过氢键、范德华力、疏水相互作用等与CDR中的氨基酸相互作用。在这些氨基酸位点上，可以选择供体免疫球蛋白氨基酸而不是受体免疫球蛋白氨基酸。符合这一标准的氨基酸通常有侧链原子与CDR中的一些原子处于约3

以内，并且必须含有原子能够与CDR原子根据已建立的化学力，比如上面列举的那些化学力相互作用。

对于可能形成氢键的原子，3

是其核间距的测量值，但是对于不成键的原子，3

是其范德华表面之间的距离的测量值。因此，在后一种情况中，原子核必须在约6

以内(3加上范德华半径的和)，原子才被认为能够相互作用。许多情况中，原子核是相距4或5到6

在确定氨基酸是否与CDR有相互作用时，优选不把重链CDR的最后8个氨基酸认为是CDR的一部分，因为从结构上看，这8个氨基酸更象是框架区的一部分。

能够与CDR中的氨基酸相互作用的氨基酸还可以通过另一种方法来鉴定。以两种方式计算每个框架氨基酸的溶剂可接近表面积：(1)在完整结合分子中，和(2)在去除了CDR的结合分子构成的假象分子中。这两个数字之间有约10平方埃或更大的差别表明框架氨基酸与溶剂的接触至少部分地被CDR所阻断，因此该氨基酸与CDR有接触。一个氨基酸的溶剂可接近表面积可以在结合分子的三维模型的基础上，利用本领域已知的算法进行计算(例如，Connolly，J.Appl.Cryst.16：548(1983)和Lee and Richards，J.Mol.Biol.55：379(1971)，这两篇文章均以参考文献的方式并入本文)。框架氨基酸通过影响另一个与CDR有接触的框架氨基酸的构象偶尔也可能与CDR间接相互作用。

框架中几个位点上的氨基酸已知在许多结合分子中能够与CDR相互作用(Chothia and Lesk，同前，Chothia et al.同前和Tramontano et al.J.Mol.Biol.215：175(1990)，这些文章均以参考文献的方式并入本文)。具体来说，轻链中位点2、48、64和71上的氨基酸，重链位点26-30、71和94的氨基酸(编号按照Kabat的)是已知在许多结合分子中能与CDR相互作用的。轻链位点35以及重链位点93和103的氨基酸也可能与CDR相互作用。在所有这些编号位点，优选在人源化免疫球蛋白中选择供体氨基酸而不是受体氨基酸(当它们不同时)。另一方面，一些残基能与CDR区相互作用，比如轻链的开始5个氨基酸，有时可以从受体免疫球蛋白中选择，而不会丢失人源化结合分子的亲和性。

“参与VL-VH界面”的残基或“堆积残基”包括那些位于例如Novotny和Haber(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：4592-66(1985))或Chothia等(同前)定义的VL和VH之间的界面的残基。一般来说，应当在人源化结合分子中保留不常见堆积残基，如果它们与人框架中的不同。

通常，一或多个满足上述标准的氨基酸被取代。在一些实施方案中，全部或大部分满足以上标准的氨基酸被取代。偶尔的，难以判断一个具体氨基酸是否满足上述标准，会产生替代的变体结合分子，其中一个带有该具体取代，另一个没有。可以在文中描述的任一分析法中测试这样产生的替代的变体结合分子的活性，从而选择优选的那个结合分子。

一般来说，人源化结合分子的CDR区与供体结合分子中的相应CDR区基本上相同，或者更经常的就是相同。虽然通常不需要，有时可以对CDR残基做一或多个保守氨基酸取代，而基本不影响所得人源化结合分子的结合亲和性。保守取代表示的是Gly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；和Phe，Tyr这些组合。

其它候选进行取代的是那些对于该人免疫球蛋白位点来说是不常见或“罕见(rare)”的受体人框架氨基酸。这些氨基酸可以用小鼠供体结合分子中等同位点的氨基酸，或者更普通的人免疫球蛋白等同位点上的氨基酸进行取代。例如，当受体免疫球蛋白中人框架区的氨基酸对于该位点来说是罕见的，而供体免疫球蛋白中的相应氨基酸对人免疫球蛋白序列的该位点来说是常见的时；或者当受体免疫球蛋白中的氨基酸对该位点来说是罕见的，供体免疫球蛋白中的相应氨基酸相对其它天序列的该位点来说也是罕见的时，就可能希望进行取代。这些标准保证了人框架中的非典型氨基酸不会破坏结合分子的结构。而且，用来自供体结合分子中恰巧对于人结合分子是典型的氨基酸来代替不常见的人受体氨基酸，得到的人源化结合分子可能免疫原性更低。

术语“罕见”用于本文表明，氨基酸在少于约20％、但通常少于约10％的代表性序列样品中在该位点出现，术语“常见”用于本文，表示氨基酸在超过约25％、但通常超过约50％的代表性样品中出现。例如，所有人轻链和重链可变区序列都被分别划分到相互之间特别有同源性，并且在一些关键位点上氨基酸相同的序列″亚组″中(Kabat等，同前)。在决定人受体序列中的氨基酸对于人序列来说是″罕见″还是″常见″时，经常优选只将相同亚组中的人序列认为是受体序列。

其它候选进行取代的是按照Chothia等(同前)提议的定义会被认定为CDR区的一部分的受体人框架氨基酸。另外的候选进行取代的是按照AbM和/或接触定义会被认定为CDR区的一部分的受体人框架氨基酸。特别是可变重链中的CDR1被界定为包括残基26-32。

其它可供选择进行取代的是与罕见或不常见供体框架残基对应的受体框架残基。罕见或不常见供体框架残基是对于小鼠结合分子该位点来说罕见或不常见(如文中定义)的残基。对于小鼠结合分子，可以根据Kabat以及被认定与共有残基不同的残基位点来划分亚组。这些供体特有的差异可能表明小鼠序列中那些使得活性得到提高的体细胞突变。预计会影响结合的不常见残基被保留，而预计对结合不重要的残基可以被取代。

其它可供选择进行取代的是出现在受体框架区中的非种系残基。例如，将受体结合分子链(即与供体结合分子链有明显序列相同性的人结合分子链)与种系结合分子链(同样与供体链有明显序列同一性)进行序列比对时，受体链框架和种系链框架之间不匹配的残基可以用相应的种系序列中的残基进行取代。

除了上面讨论的特异氨基酸取代，人源化结合分子框架区通常基本上，或者就是与它所来源的人结合分子的框架区相同。当然，框架区中的许多氨基酸对结合分子的特异性或亲和性有很少或者没有直接的贡献。因此，可以容忍许多框架残基的单个保守性取代，而不明显改变所得人源化结合分子的特异性或亲和性。所以，在一实施方案中，人源化结合分子的可变框架区与人可变框架区序列或这些序列的共有序列有至少85％的序列相同性。在另一实施方案中，人源化结合分子的可变框架区与人可变框架区序列或这些序列的共有序列有至少90％，优选95％，更优选96％，97％，98％或99％的序列相同性。但是，总起来说，是不希望进行这类取代的。

在一实施方案中，本发明的结合分子还包含至少一个从人氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的回复突变，所述残基是界面堆积残基。“界面堆积残基(interface packing residue)”包括位于VL和VH之间的界面的残基，例如Novotny and Haber，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：4592-66(1985)中定义的。

在一实施方案中，本发明的结合分子还包含至少一个人氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的回复突变，其中所述氨基酸残基是一个规范残基。“规范残基(canonical residue)”是保守的框架残基，它们属于已知对CDR构象非常重要的规范或结构类型(Tramontano et al.J.Mol.Biol.215：175(1990)，该文全文以参考文献方式并入本文)。规范残基包括轻链中的残基2、25、27B、28、29、30、33、48、51、52、64、71、90、94和95，以及重链的残基24、26、27、29、34、54、55、71和94。其它的残基(例如，CDR结构决定性残基)可以根据Martin and Thorton(1996)J.Mol.Biol.263：800的方法进行鉴定。

在一实施方案中，本发明的结合分子还包含至少一个人氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的回复突变，其中所述氨基酸残基位于能够与CDR相互作用的位点。特别的，轻链位点2、48、64和71以及重链位点26-30，71和94的氨基酸(遵循Kabat的编号)是已知在许多抗体中能与CDR相互作用的。轻链位点35以及重链位点93和1 03的氨基酸也可能与CDR相互作用。

基于CLUSTAL W分析，鉴定到人框架中的多个氨基酸残基可能用例如6C8轻链中的相应氨基酸残基进行取代。这些包括位点1、8、9、10、11、13、15、17、19、20、21、22、43、45、46、58、60、63、70、76、77、78、79、83、85、87、100和104上的残基。

在一实施方案中，本发明结合分子的可变轻链框架还包含至少一个人氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的取代，所述残基选自：E1D(即，包含小鼠CDR和人FR区的CDR移植抗体中位点1的E被突变成D，后者是6C8抗体中的对应氨基酸残基)，P8Q，A9K，T10F，L11M，V13T，P15V，E17D，A19V，T20S，L21V，S22T，A43S，R45K，L46A，I58V，A60D，S63T，E70D，S76N，S77N，L78V，Q79H，F83L，V85E，Y87F，G100A和V104L。

基于CLUSTAL W分析，我们鉴定了人框架中可能以例如6C8重链的相应氨基酸残基来取代的几个氨基酸残基。它们包括位点5，10，11，12，15，19，23，43，46，68，77，81，83，84，86，87，89，90和92。

在一实施方案中，本发明结合分子的可变重链框架还包含至少一个人氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的取代，所述残基选自：R5K(即，包含小鼠CDR和人FR区的CDR移植抗体中位点5的R被突变成K，后者是6C8抗体中的对应氨基酸残基)，A10G，L11I，V12L，T15S，T19S，T23S，P43S，A46G，R68Q，K77R，V81F，T83K，M84I，N86S，M87V，P89T，V90A和T92A。

优选所述人源化结合分子对抗原的特异结合亲和性至少为10⁷、10⁸、10⁹或10¹⁰M^-1。通常，人源化结合分子对抗原的结合亲和性的上限在供体免疫球蛋白结合亲和性上限的3、4或5倍以内。结合亲和性的下限也在供体免疫球蛋白结合亲和性下限的3、4或5倍以内。替代的，结合亲和性可以与没有取代的人源化结合分子(例如，具有供体CDR和受体FR，但没有FR取代的结合分子)的结合亲和性相比。在这种情况中，经过优化的结合分子的结合优选比未取代结合分子至少高2到3倍，或3到4倍。为了做比较，各种结合分子的活性可以通过例如BIACORE(即用未标记试剂进行表面等离子共振)或竞争结合检验法来确定。

从理论上选定了人源化结合分子的CDR和框架成分后，有许多方法可供制备这样的结合分子。由于密码的简并性，每个结合分子氨基酸序列会有多种核酸序列编码。所需核酸序列可以通过重新固相DNA合成或对先前制备的所需多核苷酸的变体进行PCR诱变来生产。

寡核苷酸-介导的突变是制备靶多肽DNA的取代、缺失和插入变体的优选方法。参见Adelman et al.(DNA 2：183(1983))。简而言之，靶多肽DNA通过将编码所需突变的寡核苷酸与单链DNA模板进行杂交被改变。杂交后，用DNA聚合酶合成模板的全长第二互补链，所述模板引入了寡核苷酸引物，编码靶多肽DNA的选定改变。

如上所述制备的结合分子可变片段(例如，嵌合、人源化或人结合分子的重链和轻链可变区)通常会连接上至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般是人免疫球蛋白的恒定区。人恒定区DNA序列可以按照众所周知的方法从多种人细胞中分离，但优选从永生化的B细胞中分离(参见Kabat et al.同前和Liu et al.WO87/02671)(两文均以引用方式全部并入本文)。一般来说，结合分子既含有轻链也含有重链恒定区。重链恒定区一般包括CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。本文描述的结合分子包括有所有类型恒定区的抗体，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE；所有同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。恒定区的选择部分上取决于是否需要结合分子依赖性的补体以及/或者细胞介导的毒性。例如，同种型IgG1和IgG3具有补体活性，而同种型IgG2和IgG4没有。当希望结合分子(例如，人源化结合分子)表现出细胞毒活性时，恒定结构域通常是补体固定恒定结构域，类型一般是IgG1。当不需要这种细胞毒活性时，恒定结构域可以是例如IgG2型。同种型的选择还可能影响抗体进入脑部。优选人同种型IgG1。轻链恒定区可以是λ或κ。人源化结合分子可以包含来自一个以上类型或同种型的序列。可以将结合分子表达为含有两个轻链和两个重链的四聚体、分开的重链、轻链、Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv，或者表达为其重链和轻链可变结构域通过间隔臂连在一起的单链结合分子。

III.制备结合分子

本发明提供了对GITR，例如人GITR有特异性的结合分子。这类结合分子可以用于配制发明所述的各种医疗组合物，或者优选的提供制备人源化或嵌合结合分子的补体决定区(下文有详细描述)。制备非人(例如小鼠、豚鼠、灵长类、兔或大鼠)单克隆结合分子可以通过例如用GITR或编码GITR的核酸分子给动物接种来实现。例如，可以通过将编码人GITR的基因置入表达载体，并给动物接种来制备6C8结合分子。也可以使用包含GITR或GITR的免疫原性片段或GITR的抗独特型结合分子的较长多肽。(参见，例如Harlow&Lane，同前，以引用方式并入本文)。这类免疫原可以得自天然来源、经过肽合成或重组表达。任选的，如下文所述免疫原可以与载体蛋白融合或者以其它方式复合在一起来给予。任选的，所述免疫原可以与佐剂一起给予。术语″佐剂″是指这样一种化合物，当与抗原联合给予时，它能增强对该抗原的免疫反应，但在单独给予时不会引起对该抗原的免疫反应。佐剂可以通过几种机制增强免疫反应，包括召集淋巴细胞、刺激B和/或T细胞，以及刺激巨噬细胞。正如下文所述，有几种类型的佐剂可以使用。完全弗氏佐剂随后用不完全弗氏佐剂是免疫实验动物的优选方法。

通常用兔子或豚鼠来制备多克隆结合分子。示范性的制备用于例如被动保护的多克隆结合分子可以如下操作。将动物用100μg GITR，加上佐剂接种，4-5个月时处以安乐死。收集血液，从其它血液成分中分离IgG。免疫原的特异结合分子可以通过亲和层析做部分纯化。每只动物平均可获得约0.5-1.0mg的免疫原特异性结合分子，总共可达60-120mg。

通常使用小鼠来制备单克隆结合分子。针对某片段的单克隆的制备可以通过将GITR的片段或较长形式注射到小鼠中，制备杂交瘤并筛选杂交瘤寻找特异结合GITR的结合分子。任选的，所筛选的结合分子能够结合GITR的具体区域或目标片段，而不结合GITR的其它非重叠片段。后一项筛选可以通过确定结合分子与GITR肽的一系列缺失突变体的结合情况，并确定哪个突变体能够与结合分子发生结合来实现。评价结合可以通过例如Western印迹或ELISA进行。显示出对结合分子的特异结合的最小片段界定了结合分子的表位。替代的，可以通过竞争检定法，即待测和参照结合分子竞争结合GITR来确定表位特异性。如果待测和参照结合分子发生竞争，则它们结合相同的表位(或结合的表位足够近)，因此与一个结合分子的结合干扰了与另一个的结合。这类结合分子的优选同种型是小鼠同种型IgG2a或其它物种中的对等同种型。小鼠同种型IgG2a是人同种型IgG1的等同物。

在另一实施方案中，编码结合分子的DNA可以采用常规方法(例如，通过使用能与编码鼠结合分子重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)容易地分离并测序。分离并亚克隆的杂交瘤细胞是优选的这类DNA的来源。一经分离，可以将所述DNA放入表达载体，然后将表达载体转染到那些本来不会产生免疫球蛋白的原核或真核宿主细胞中，比如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞。更具体地说，分离DNA(可以象本文描述的是合成DNA)可以象Newman等1995年1月25日提交的美国专利5,658,570(该专利以参考文献的方式并入本文)中描述的，用于克隆恒定和可变区序列以便制备结合分子。基本上，该专利阐述了从所选细胞中提取RNA，转化成cDNA，利用Ig特异性引物经PCR进行扩增。适用于这一目的的引物在美国专利5,658,570中也有描述。可以相对大量地产生能表达所需抗体的转化细胞以便保证结合分子的临床和商业供应。

本领域技术人员会明白，编码结合分子或其片段(即抗原结合位点)的DNA还可以利用例如pd噬菌体或Fd噬粒技术来源于抗体噬菌体文库。在例如EP 368 684 B1；美国专利5,969,108，Hoogenboom，H.R.and Chames.2000.Immunol.Today 21：371；Nagy et al.2002.Nat.Med.8：801；Huie etal.2001.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：2682；Lui et al.2002.J.Mol.Biol.315：1063(这些文章均以参考文献的方式并入本文)中举出了示范性的方法。多份出版物(例如，Marks et al.Bio/Technology10：779-783(1992))描述了通过链改组、组合感染和体内重组作为构建大的噬菌体文库的策略来产生高亲和性人结合分子。在另一实施方案中，可以用核糖体展示来代替噬菌体作为展示平台(参见，例如Hanes et al.2000.Nat.Biotechnol.18：1287；Wilson etal.2001.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：3750；或者Irving et al.2001 J.Immunol.Methods 248：31)。还有一实施方案中，可以在细胞表面文库中筛选结合分子(Boder et al.2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：10701；Daugherty et al.2000 J.Immunol.Methods 243：211)。这些程序提供了分离和克隆单克隆结合分子的传统的杂交瘤技术的替代方法。

本发明的其它实施方案还包含了在那些不能产生内源免疫球蛋白的转基因动物(例如，小鼠)中生产人或基本上是人的结合分子(参见，例如美国专利6,075,181，5,939,598，5,591,669和5,589,369，每份专利都以参考文献的方式并入本文)。例如，已有人描述过在嵌合和种系突变小鼠中同型缺失抗体重链连接区导致内源抗体产生被完全抑制。将人免疫球蛋白基因阵列转移到这样的种系突变小鼠中会导致在用抗原进行攻击时产生人结合分子。另外一种优选的利用SCID小鼠产生人结合分子的手段在美国专利5,811,524中被公开，该专利以参考文献的方式并入本文。应当明白的是，与这些人结合分子相关联的基因材料也可以象本文描述的那样进行分离和操作。

产生重组结合分子的再一个高效方法在Newman，Biotechnology，10：1455-1460(1992)中有公开。具体来说，这项技术导致产生了含有猴可变结构域和人恒定序列的灵长源化结合分子。这篇参考文献通过引用全文并入本文。此外，这项技术在美国专利5,658,570、5,693,780和5,756,096中也有描述，这些专利均通过引用并入本文。

在另一实施方案中，可以通过显微操作来挑选淋巴细胞，并分离可变基因。例如，可以从接种过的哺乳动物中分离外周血单核细胞，体外培养约7天。筛选培养物以得到满足筛选标准的特异性IgG。可以分离阳性小孔中的细胞。单个产生Ig的B细胞可以通过FACS来分离，或者通过在补体介导的溶血斑试验中鉴定。产生Ig的B细胞可以显微操作到试管中，利用例如RT-PCR来扩增VH和VL基因。可以将VH和VL基因克隆到抗体表达载体中，转染细胞(例如，真核或原核细胞)进行表达。

此外，用于产生本发明的多肽的基因序列可以得自多种不同来源。例如，象上文广泛讨论过的，许多人抗体基因可以公众可获取的保藏形式得到。大量抗体和编码抗体的基因的序列已被公开，可以利用本领域认可的技术由这些序列来化学合成合适的抗体基因。与本发明这一方面相容的寡核苷酸合成技术是本领域技术人员所熟知的，可以利用任何商品自动化合成仪来进行。另外，编码文中列出的几类重链和轻链的DNA序列可以由商业的DNA合成服务来获得。然后，利用任何上述方法得到的基因材料可以被改变或合成从而提供本发明的多肽。

替代的，可以采用本领域技术人员熟知的技术来挑选和培养抗体产生细胞系。这类技术在许多实验手册和一级出版物中都有描述。在这方面，适用于本发明的技术在Current Protocols in Immunology，Coligan et al.Eds.GreenPublishing Associates and Wiley-Interscience，John Wiley and Sons，New York(1991)中有描述，该文以参考文献的方式全文(包括补充材料)并入本文。

众所周知的，可以从起始的杂交瘤中或者其它转化细胞中通过常规技术来分离RNA，比如异硫氰酸胍提取和沉淀，随后离心或层析。如果需要，可以通过标准技术，比如在寡dT纤维素上进行层析来从总RNA中分离mRNA。合适的技术是本领域技术人员所熟悉的。

在一实施方案中，可以按照人们熟知的方法，利用逆转录酶和DNA聚合酶同时或分别制备编码结合分子轻链和重链的cDNA。可以在已公开的重链和轻链DNA和氨基酸序列的基础上，利用共有恒定区引物或更特异的引物进行PCR。如上文讨论过的，还可以利用PCR来分离编码结合分子的轻链和重链的DNA克隆。这种情况中，可以通过共有引物或大的同源性探针，比如小鼠恒定区探针来对文库进行筛选。

DNA，通常是质粒DNA可以用本领域已知的技术从细胞中分离，按照前面提及的与重组DNA技术有关的文献中详细描述的标准、众所周知技术做限制酶切图谱并测序。当然，根据本发明在分离或后续的分析过程中的任何时候DNA都可以是合成的。

在一实施方案中，本发明的结合分子包含抗体的抗原结合片段，或者由抗体的抗原结合片段组成。术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体中能够结合抗原，或者与完整抗体(即，与它们所来源的完整抗体)竞争结合抗原(即，特异性结合)的多肽片段。用于本文，术语抗体分子的“片段”包括抗体的抗原结合片段，例如，抗体轻链(VL)、抗体重链(VH)、单链抗体(scFv)、F(ab’)2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段，以及单结构域抗体片段(DAb)。这些片段可以通过例如对完整或全部抗体或抗体链进行化学或酶法处理，或者通过重组手段获得。

在一实施方案中，本发明的结合分子是工程化的或者被修饰的抗体。工程化形式的抗体包括，例如微型抗体(minibodies)、双功能抗体、融合了CH3分子的双功能抗体、四价抗体、胞内双功能抗体(intradiabodies)(例如，Jendreyko et al.2003.J.Biol.Chem.278：47813)、双特异性抗体、融合蛋白(例如，抗体细胞因子融合蛋白)、或者双特异性抗体。其它免疫球蛋白(Ig)和它们的一些变体在例如美国专利4,745,055；EP 256,654；Faulkner et al.Nature 298：286(1982)；EP 120,694；EP 125,023；Morrison，J.Immun.123：793(1979)；Kohler et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：2197(1980)；Raso et al.Cancer Res.41：2073(1981)；Morrison et al.Ann.Rev.Immunol.2：239(1984)；Morrison，Science 229：1202(1985)；Morrison et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6851(1984)；EP 25 5,694；EP 266,663；和WO 88/03559中有描述。重新组合的免疫球蛋白链也是已知的。参见，例如美国专利4,444,878；WO 88/03565；和EP 68,763以及它们引用的参考文献。

在一实施方案中，本发明的修饰抗体是微型抗体。微型抗体是由两个多肽链构成的二聚体分子，这两个多肽链各自包含一个ScFv分子(包含一或多个抗原结合位点的单个多肽，例如VL结构域借助柔性接头连接着VH结构域，后者经连接肽融合CH3结构域。

ScFv分子可以构建成VH-接头-VL取向或者VL-接头-VH取向。

将构成抗原结合位点的VL和VH结构域连接在一起的柔性铰链优选包含约10到50个氨基酸残基。用于该用途的连接肽例子是(Gly4Ser)3(SEQ IDNO：17)(Huston et al.1988.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879)。其它连接肽是本领域已知的。

制备单链抗体的方法是本领域众所周知的，例如Ho et al.1989.Gene77：51；Bird et al.1988 Science 242：423；Pantoliano et al.1991.Biochemistry30：10117；Milenic et al.1991.Cancer Research 51：6363；Takkinen et al.1991.Protein Engineering 4：837。

微型抗体(minibody)可以利用本领域已知方法(参见，例如美国专利5,837,821或WO 94/09817A1)，通过构建ScFv组分并连接肽-CH3组分来制备。这些组分可以作为限制酶切片段从分开的质粒中分离，然后连接并重新克隆到合适的载体中。组装是否正确可以通过限制酶切和DNA序列分析来确认。

双功能抗体与scFv分子类似，但通常有一个短的(少于10个，优选1-5个)氨基酸残基接头将两个V结构域连在一起，因此同一多肽链的VL和VH结构域不能相互作用。相反的，一个多肽链的VL和VH结构域与第二个多肽链的VH和VL结构域(分别)相互作用(WO 02/02781)。在一实施方案中，本发明的结合分子是融合了至少一个重链部分的双功能抗体。在优选实施方案中，本发明的结合分子是融合了CH3结构域的双功能抗体。

其它形式的修饰抗体也包括在本发明范围内(例如，WO 02/02781 A1；5,959,083；6,476,198 B1；US 2002/0103345 A1；WO 00/06605；Byrn et al.1990.Nature.344：667-70；Chamow and Ashkenazi.1996.TrendsBiotechnol.14：52)。

在一实施方案中，本发明的结合分子包含免疫球蛋白恒定区。本领域已知恒定区介导着多种效应子功能。例如，补体的C1组分与结合分子发生结合能够激活补体系统。补体的活化对于细胞病原体的调理作用和裂解是非常重要的。补体的活化还刺激炎症反应，也可能参与自身免疫超敏反应。此外，结合分子借助Fc区与细胞结合，结合分子Fc区的Fc受体位点结合细胞的Fc受体(FcR)。有许多对不同类型结合分子是特异的Fc受体，包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。结合分子结合到细胞表面的Fc受体上能够引发多种重要的不同的生物反应，包括包被结合分子的颗粒的内吞和破坏、免疫复合体的清除、包被结合分子的靶细胞被杀伤细胞裂解(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或者ADCC)、释放炎症介质、胎盘转运和控制免疫球蛋白的产生。

在一实施方案中，利用IgG4结合分子的恒定区，该恒定区被认为不能消除靶细胞，或者通过利用本领域已知的技术(例如，美国专利5,585,097)将Fc区中效应子功能的关键残基突变来制备Fc变体，可以除去或降低效应子功能。例如，恒定区结构域缺失或灭活(通过点突变或其它手段实现)，可以减弱Fc受体与循环的修饰结合分子的结合，从而提高对肿瘤的定位。其它情况中，可以是与本发明一致的恒定区修饰能够调节补体结合，因此降低血清半寿期以及与偶联的细胞毒素的非特异性关联(association)。还可以利用其它恒定区的修饰来修饰二硫键或寡糖部分，从而因为抗原特异性或结合分子柔性提高而使得定位增强。概括来说，本领域技术人员会明白按照本文描述修饰的结合分子可以发挥多种微妙的效果，而这些作用可能很容易或者不容易认识到。但是，这些修饰最后产生的生理变化谱、生物可利用性和其它生化效果，比如肿瘤定位能力、生物分布和血清半寿期可以利用公知的免疫学技术，不需过多实验就容易地测量和定量。

在一实施方案中，本发明的结合分子可以衍生或者连接上另一个功能分子(例如，另一个肽或蛋白质)。相应的，本发明的结合分子包括文中描述的抗GITR结合分子的衍生和其它修饰形式，包括免疫粘附分子。例如，本发明的结合分子可以功能性地连接(通过化学偶联、基因融合、非共价关联或其它方式)上一或多个其它分子实体，比如另一个结合分子(例如，双特异性抗体或双功能抗体)、可检测试剂、细胞毒性剂、药剂，和/或能够介导该结合分子与另一分子的联系的蛋白或肽(比如链霉亲和素核心区或多组氨酸标记)。

一类衍生化结合分子是通过两个或多个结合分子(相同类型或不同类型，例如为了产生双特异性抗体时)的交联产生的。合适的交联物包括异种双功能的，即有两个由适宜的间隔臂分开的不同的反应基团(例如，间-马来酰亚氨苯甲基-N-羟基琥珀酰亚氨酯(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester))；或者是同种双功能的(例如，辛二酸二琥珀酰亚氨酯(disuccinimidyl suberate))。这些偶联剂在Pierce Chemical Company，Rockford，IL有售。

本发明的结合分子可以衍生而具有有用的可检测试剂，包括荧光化合物。示范性的荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸酯荧光素、罗丹明(rhodamine)、丹磺酰氯(5-dimethylamine-1-napthalenesulfonyl chloride)、藻红蛋白(phycoerythrin)等。结合分子还可以衍生有可检测的酶，比如碱性磷脂酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶等。结合分子衍生有可检测酶时，可以通过加入其它该酶与之产生可检测反应产物的试剂来检测。例如，当存在可检测试剂辣根过氧化物酶时，加入过氧化氢和二氨基联苯胺会产生有色的反应产物，就可以检测到了。结合分子还可以衍生有生物素，通过间接测量抗生物素蛋白或者链霉亲和素结合来检测。

IV.表达结合分子

本发明的结合分子可以通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链来制备。为了重组表达结合分子，用一或多个带有编码结合分子之免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，使得轻链和重链在宿主细胞中被表达，并且优选分泌到生长宿主细胞的培养基中，从该培养基中就可以回收结合分子。利用标准重组DNA技术，比如Sambrook，Fritsch and Maniatis(eds)，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，Ausubel，F.M.et al.(eds.)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates，(1989)以及Boss等的美国专利4,816,397中描述的技术来获取抗体重链和轻链基因，将这些基因导入重组表达载体，后者引入宿主细胞。

为了表达本发明的结合分子，可以将编码部分或全长轻链和重链的DNA插入表达载体，使基因与转录和翻译调控序列可操纵地连接在一起。在这里的语境中，术语″可操纵地连接″表示所述结合分子基因被连接到载体中，从而载体中的转录和翻译控制序列能够发挥它们计划中调节结合分子基因的转录和翻译的功能。在一实施方案中，选择的表达载体和表达调控序列与所用表达宿主细胞相容。结合分子轻链基因和结合分子重链基因可以插入分开的载体中，更常见的，是将两个基因插入同一个表达载体中。可以通过标准方法(例如，将结合分子基因片段和载体上的互补限制酶切位点连接起来，或者如果没有限制酶切位点时，进行平末端连接)将结合分子基因插入表达载体。在插入结合分子轻链或重链序列前，表达载体可能已经携带了结合分子的恒定区序列。例如，将VH和VL序列转换成全长结合分子基因的一个策略是将它们插入已经能够分别编码重链和轻链恒定区的表达载体中，使得载体中VH片段与CH片段可操纵地连接，VL片段与CL片段可操纵地连接。此外或者替代的，重组表达载体可以编码能够协助结合分子链从宿主细胞中分泌出来的信号肽。可以将结合分子链基因克隆到载体中，使得信号肽与结合分子链基因的氨基末端符合读框地连在一起。所述信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或者异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。

除了结合分子链基因，本发明的重组表达载体还带有能够控制结合分子链基因在宿主细胞中的表达的调控序列。术语″调控系列″包括启动子、增强子和其它控制结合分子链基因的转录或翻译的表达调控元件(例如，多聚腺苷化信号)。这类调控序列在例如Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中有描述。本领域技术人员明白，设计表达载体，包括选择调控序列可能要取决于这样一些因素，比如可供选择的用于转化的宿主细胞，目的蛋白的表达水平等。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括指导蛋白质在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，比如来源于巨细胞病毒(CMV)的启动子和/或增强子(比如CMV启动子/增强子)、猴病毒40(SV40)(比如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒。关于病毒调控元件及其序列的进一步描述，参见例如Stinski的美国专利5,168,062、Bell等的美国专利4,510,245以及Schaffner等的美国专利4,968,615。

除了结合分子链基因和调控系列，本发明的重组表达载体可以带有其它序列，比如能够调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制原点)和可选择的标记基因。可选择标记基因能够协助挑选出那些载体导入了的宿主细胞(参见例如美国专利4,399,216、4,634,665和5,179,017，都是Axel等的)。例如，通常可选择标记基因使导入了载体的宿主细胞对药物(比如G418、潮霉素或甲氨蝶呤)产生抗性。优选的可选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主细胞，用甲氨蝶呤进行选择/扩增)和neo基因(用G418进行挑选)。

为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码结合分子重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语″转染″的各种形式意在涵盖多种常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。本发明结合分子可以在原核或真核宿主细胞中表达，最优选在真核细胞(最优选是哺乳动物宿主细胞)中表达结合分子，因为这类真核细胞，尤其是哺乳动物细胞，比原核细胞更能组装和分泌出正确折叠的、具有免疫活性的结合分子。

通常，表达载体含有选择标记(例如，氨苄抗性、潮霉素抗性、四环素抗性或新霉素抗性)以便能够检测到转化了所需DNA序列的细胞(参见，例如Itakura等，美国专利4,704,362)。

大肠杆菌是一个尤其有用的克隆发明所述多核苷酸(例如，DNA序列)的原核宿主。其它适用的微生物宿主包括芽孢杆菌(比如枯草芽孢杆菌)，和其它肠杆菌科，比如沙门氏菌、沙雷氏菌和各种假单胞菌。在这些原核宿主中，也可以制备表达载体，它们通常含有与宿主细胞相容的表达调控序列(例如，复制起点)。此外，可以有任何数量的众所周知的启动子，比如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或者来自λ噬菌体的启动子系统。启动子一般会控制表达的进行，任选用操纵子序列进行控制、并具有核糖体结合位点序列等用于启始和结束转录和翻译。

其它微生物，比如酵母菌也可以用于表达。糖酵母(Saccharomyces)是优选的酵母宿主，它具有按照需要携带表达调控序列(例如，启动子)、复制起点、终止序列等的合适载体。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其它糖酵解酶。诱导性酵母启动子包括来自乙醇脱氢酶、异细胞色素C、和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子等。

除了微生物，哺乳动物组织细胞培养物也可以用于表达和产生本发明的多肽(例如，编码结合分子的多肽)。参见Winnacker，From Genes to Clones，VCH Publishers，N.Y.N.Y.(1987)。实际上优选的是真核细胞，因为本领域已建立了大量能够分泌异源蛋白(例如，完整结合分子)的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、或转化的B细胞或杂交瘤。优选的，所述细胞不是人细胞。用于这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列，比如复制起点、启动子和增强子(Queen et al.Inmunol.Rev.89：49(1986))，以及必要的加工信息位点，比如核糖体结合位点、RNA剪切位点、多聚腺苷化位点和转录终止序列。优选的表达调控序列是来源于免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。参见Co et al.J.Immunol.148：1149(1992)。

替代的，编码结合分子的序列可以并入转基因，用于导入转基因动物的基因组，随后表达在转基因动物的奶中(参见，例如Deboer et al.US5,741,957，Rosen，US 5,304,489和Meade et al.US 5,849,992)。合适的转基因包括轻链和/或重链的编码序列与来自哺乳动物腺体特异性基因(比如酪蛋白或β-乳球蛋白)的启动子和增强子可操纵地连在一起。

优选用于表达发明所述重组结合分子的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括Urlaub and Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220所述dhfr-CHO细胞，与DHFR选择标记一起使用，例如R.J.Kaufman and P.A.Shatp(1982)Mol.Biol.159：601-621所述)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当编码结合分子基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足够时间使得宿主细胞表达所述结合分子，或更优选，使结合分子分泌到宿主细胞生长的培养基中，产生结合分子。利用常规蛋白质纯化方法可以从培养基中回收结合分子。

含有目标多核苷酸序列(例如，结合分子重链和轻链编码序列和表达调控序列)的载体可以通过公知方法转移到宿主细胞中，具体方法取决于宿主细胞的类型。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂质体转染、基因枪技术或基于病毒的转染可以用于其它宿主细胞(可以总体参见Sambrook et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Press，2nd ed.1989)(以参考文献方式全部并入本文)。其它用于转化哺乳动物细胞的方法包括polybrene的使用、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射(总体参见Sambrook et al.同前)。为了产生转基因动物，可以将转基因显微注射到受精的卵母细胞中，或者整合到胚胎干细胞基因组中，这些细胞的细胞核转移到去核的卵母细胞中。

当重链和轻链被克隆到分开的表达载体中时，将载体共转染以便表达和组装完整免疫球蛋白。一旦表达后，整个结合分子、其二聚体、单个的轻链和重链或者本发明的其它免疫球蛋白形式可以按本领域标准方法纯化，所述方法包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、HPLC纯化、凝胶电泳等(可总体参见Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag，N.Y.(1982))。用于医药用途时，优选至少约90-95％均质的基本上纯的结合分子，最优选98-99％或以上均质的结合分子。

宿主细胞也可以用于产生完整结合分子的部分，比如Fab片段或scFv分子。应当理解，以上方法的各种变化也在本发明的范围内。例如，可能希望用编码本发明结合分子的轻链或重链(不是两者同时)的DNA转染宿主细胞。还可以利用重组DNA技术除去编码那些对于结合GITR不是必需的轻链或重链或者两者的DNA的部分或全部。由这样截断的DNA分子表达的分子也包含在本发明的结合分子范围内。此外，可以利用常规的化学交联方法，通过将本发明的结合分子与第二个结合分子交联，制得双功能结合分子，使其中的一个重链和一个轻链是本发明结合分子，另一个重链和轻链是特异于除了GITR以外的抗原。

如上述，本发明另一方面涉及可用来重组表达本发明结合分子的核酸、载体和宿主细胞组合物。编码6C8轻链可变区的核苷酸序列见图18和SEQID NO：10。VL的CDR1结构域涵盖SEQ ID NO：10的核苷酸130-162(SEQ IDNO：14)，CDR2结构域涵盖SEQ ID NO：10中的核苷酸208-228(SEQ IDNO：15)，CDR3结构域涵盖SEQ ID NO：10的核苷酸325-351(SEQ IDNO：16)。编码6C8重链可变区的核苷酸序列见图18和SEQ ID NO：9。VH的CDR1结构域涵盖SEQ ID NO：9的核苷酸133-168(SEQ ID NO：11)，CDR2结构域涵盖SEQ ID NO：9中的核苷酸211-258(SEQ ID NO：12)，CDR3结构域涵盖SEQ ID NO：9中的核苷酸355-381(SEQ ID NO：13)。在一实施方案中，编码VH CDR2的核苷酸序列包含SEQ ID NO：12。在另一实施方案中，编码VH CDR2的核苷酸序列包含SEQ ID NO：65(CACATTTGGTGGGATGATGATAAGTACTATCAACCATCCCTGAAGAGC)。本领域技术人员明白，利用遗传密码和常规分子生物学技术可以由编码6C8 VL和VH的核苷酸序列得到编码与6C8相关的结合分子的核苷酸序列。

在一实施方案中，本发明提供了编码多肽序列的分离的核酸分子，所述多肽序列包含6C8 CDR，例如包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

另一实施方案中，本发明提供了编码结合分子轻链可变区的分离的核酸分子，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，但是本领域技术人员明白，因为遗传密码的简并性，其它核酸分子也可以编码SEQ IDNO：2的氨基酸序列。所述核酸分子可以是仅编码VL或者也可以编码与VL可操纵性连接的结合分子轻链恒定区。在一实施方案中，该核酸分子在重组表达载体中。

另一实施方案中，本发明提供了编码结合分子重链可变区的分离的核酸分子，所述重链可变区包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，但是本领域技术人员明白，因为遗传密码的简并性，其它核酸分子也可以编码SEQ IDNO：1的氨基酸序列。在另一实施方案中，本发明提供了编码结合分子重链可变区的分离的核酸分子，所述可变区包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列，但是本领域技术人员明白，因为遗传密码的简并性，其它核酸分子也可以编码SEQ ID NO：66的氨基酸序列。所述核酸分子可以是仅编码VH或者也可以编码与VH可操纵性连接的重链恒定区。在一实施方案中，该核酸分子在重组表达载体中。

本发明还提供了编码结合分子重链和/或结合分子轻链的重组表达载体。例如，在一实施方案中，本发明提供的重组表达载体编码：

a)结合分子轻链，该轻链含有的可变区包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；和

b)结合分子重链，该重链含有的可变区包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在另一实施方案中，本发明提供的重组表达载体编码：

a)结合分子轻链，该轻链含有的可变区包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；和

b)结合分子重链，该重链含有的可变区包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列。

本发明还提供了导入了本发明的一或多个重组表达载体的宿主细胞。优选的，所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。

再进一步，本发明提供了合成发明所述重组结合分子的方法，即将发明所述宿主细胞培养在合适的培养基中直至合成发明所述重组结合分子。该方法还可以还包含从培养基中分离重组结合分子。

V.本发明结合分子的用途

考虑到它们结合GITR的能力，本发明的结合分子可以用于常规免疫检测法，比如酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫检测(RIA)或组织免疫组织化学检测法来探测GITR(例如，在象血清或血浆这样的生物样品中)。本发明提供了检测生物样品中的hGITR的方法，该方法包括将生物样品与本发明结合分子进行接触，通过探测结合了hGITR的结合分子或者未结合的结合分子，从而检测生物样品中的hGITR。所述方法可以体外或体内进行。将结合分子直接或间接标记上可检测物质以协助探测到结合或未结合的结合分子。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光物质和放射性物质。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷脂酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基的例子包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质的例子包括伞形酮(umbelliferone)、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三吖嗪胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯(dansyl chloride)或藻红蛋白；发光物质的一个例子是鲁米诺(luminal)；以及合适的放射性物质的例子包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

作为标记结合分子的替代，可以利用标记了可检测物质的GITR标准和未标记的抗hGITR结合分子，通过竞争免疫分析法来检测生物样液中的hGITR。在这种分析法中，将生物样品、标记的GITR标准和抗hGITR结合分子组合起来，确定结合到未标记结合分子上的标记GITR标准品的量。生物样品中的hGITR的量与结合到抗hGITR结合分子上的标记GITR标准品的量成反比。

本发明的抗GITR结合分子还可以用于检测除人以外的物种的样品中的GITR，特别是灵长类(例如，黑猩猩(chimpanzee)、狒狒(baboon)、指猴(marmoset)、食蟹猴(cynomolgus)和猕猴(rhesus))的GITR。

在另一实施方案中，本发明提供了一种消除调节性T细胞对T效应细胞的抑制作用的方法。消除调节性T细胞对T效应细胞的抑制作用可以通过例如测量在有效应性T细胞的情况下，所述结合分子增强T细胞效应子功能的能力来检测。例如通过测量³H-胸苷掺入或者FACS来分析细胞因子的产生(例如，IL-2产量)或者细胞增殖(例如，辅助T性细胞的增殖)。例如在有调节性T细胞的情况下，T效应细胞的反应或活性低，但是加入GITR结合分子后即使有调节性T细胞，它们也会升高，即GITR结合分子抵消了调节性T细胞对T效应细胞的抑制作用。

本发明的结合分子还可以用于减弱I-κB在细胞中的降解。例如，可以用抗GITR结合分子处理细胞，进行Western印迹，并定量I-κB，从而检测细胞中I-κB降解的减弱情况。

许多疾病或病理状况会受益于T效应细胞活性的增强以及/或者调节性T细胞活性的下调，例如通过抵消调节性T细胞对T效应细胞的抑制作用。例如，免疫效应细胞经常不能有效地与癌症细胞反应。相应的，当需要增强的效应T细胞或抗体反应时，本发明的方法可以用于处置患有这类紊乱的受试者。在一实施方案中，这类方法包含将本发明的结合分子给予受试者，从而使调节性T细胞对T效应细胞的抑制作用被消除，因此增强了免疫反应。优选的，所述受试者是人受试对象。替代的，所述受试对象可以是能表达与本发明的结合分子发生交叉反应的GITR的哺乳动物。更进一步，所述受试者可以是导入了GITR(例如，通过给予GITR或者通过表达GITR转基因)的哺乳动物。可以为了治疗或预防目的，将本发明的结合分子给予人受试对象。例如，所述受试者可能被诊断患有疾病或紊乱，或者易患该病或对该病易感。此外，可以将本发明的结合分子给予表达与所述结合分子交叉反应的GITR分子的非人哺乳动物(例如，灵长类动物)，以实现兽医目的或者作为人疾病的动物模型。就后一个目的而言，这样的动物模型可以用来评价本发明结合分子的治疗和/或预防效果(例如，评估剂量以及/或者给药疗程)。

本发明的结合分子的示范性用途在下面有更详细的讨论：

免疫刺激组合物

正如在下文附上的实施例中描述的，本发明的结合分子可以例如与抗原组合，作为免疫刺激组合物(或疫苗)来提高受试者对靶抗原(例如蛋白质抗原)的免疫反应。这就是说，本发明的结合分子可以作为增强免疫反应的佐剂。例如，为了刺激对靶抗原的抗体或细胞免疫反应(例如，为了接种的目的)，可以将所述抗原与本发明的结合分子一起给药(例如，同时在相同或分开的组合物中给药)从而发生增强的免疫反应。目标抗原和结合分子可以配制成同一个药物组合物，或者分开的组合物。在一实施方案中，目标抗原和结合分子被同时给予受试者。替代的，在一些情况中，可能希望先给予抗原，然后给予结合分子，或者相反(例如，可能先单独给予抗原来引起反应，然后将结合分子单独或与抗原一起给予是有益的)。在优选实施方案中，本发明的GITR结合分子在用抗原进行致敏时，即在第一次给予抗原时给予。例如，第-3、-2、-1、0、+1、+2、+3天。特别优选的给予发明所述GITR结合分子的一天是给予抗原前的一天。

目标抗原是，例如这样的抗原，其能够给受试者提供针对该抗原所来源的传染源的攻击的保护，或者能够以有益于受试者的方式影响肿瘤生长和转移。因此目标抗原的示范性例子包括那些来源于传染源、癌症细胞等的抗原，此时针对该抗原的免疫反应能够预防或治疗由该来源引起的疾病。这类抗原包括，但不限于，病毒、细菌、真菌或寄生虫蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、糖脂等等。目标抗原还包括那些能给有危险染上或者已被诊断患有肿瘤的受试者带来好处的抗原，可能包括例如肿瘤细胞专门表达的或者在肿瘤细胞中表达水平提高的肿瘤相关抗原。所述受试者优选是哺乳动物，最优选是人。

用于本文，术语“病原菌”或“病原体”包括能感染或寄生正常宿主(例如，动物(比如哺乳动物，优选灵长类，例如人))的微生物。用于本文，该术语还包括机会性病原体，例如能够感染或寄生异常宿主的微生物，例如因为治疗方案导致正常菌群被打乱的宿主，或者是免疫缺陷的宿主。用于本文，该术语还包括其复制在受试者中是不受欢迎的微生物，或者这些微生物产生的毒性分子(例如，毒素)。

病毒抗原的非限制性例子，包括但不限于，流感病毒的核蛋白(NP)和HIV的Gag蛋白质。其它异源抗原包括，但不限于HIV Env蛋白或其组成部分：gp120和gp41、HIV Nef蛋白、和HIV Pol蛋白、逆转录酶和蛋白酶。此外，还可以使用其它病毒抗原比如埃博拉病毒(EBOV)抗原，EBOV NP或糖蛋白(GP)(全长或者该分子的粘蛋白区GP缺失(Yang Z-Y，et al.(2000)Nat Med 6：886-9，2000))；天花抗原；甲肝、乙肝或丙肝病毒；人鼻病毒，比如2型和14型；单纯疱疹病毒；2型或3型脊髓灰质炎病毒；口蹄疫病毒(FMDV)；狂犬病病毒；轮状病毒；流感病毒；柯萨奇病毒；人乳头瘤病毒人(HPV)，例如16型乳头瘤病毒、其E7蛋白，以及含有E7蛋白或其表位的片段；以及猴免疫缺陷病毒(SIV)。目标抗原不需要限制为病毒来源的抗原。寄生虫抗原，例如疟原虫抗原也包括在内，以及真菌抗原、细菌抗原和肿瘤抗原也可以用于本文公开的组合物和方法中。细菌抗原的非限制性例子包括：百日咳杆菌(Bordetella pertussis)(例如，P69蛋白和丝状血凝素(FHA)抗原)、霍乱弧菌、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anhracis)和大肠杆菌抗原，比如大肠杆菌不耐热毒素B亚基(LT-B)、大肠杆菌K88抗原和肠毒素性大肠杆菌抗原。其它抗原的例子包括曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)P28谷胱甘肽S-转移酶抗原(P28抗原)和吸虫(f1uke)、支原体(mycoplasma)、线虫(roundworm)、绦虫(tapeworm)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和疟疾寄生虫(malaria parasite)，例如疟原虫属(plasmodium)或焦虫(babesia)的寄生虫，例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的抗原，以及决定上述抗原的免疫源表位的肽。

可以通过给予本发明的疫苗来治疗或预防的感染、疾病或紊乱包括任何会引起宿主免疫反应来防止的感染、疾病或紊乱。可以通过给予本发明的免疫刺激组合物来治疗或预防的疾病、紊乱或感染包括，但不限于，任何由真菌、寄生虫、病毒或细菌引起的或和它们有关的感染、疾病或紊乱，由以下各种病原体引起的或和它们相关的疾病、紊乱或感染，包括用于生物恐怖袭击的、李斯特氏菌病、埃博拉病毒、SARS、天花、甲肝、乙肝、丙肝或戊肝、人鼻病毒、HIV(例如，HIV-1和HIV-2)、以及AIDS、疱疹、脊髓灰质炎、口蹄疫、狂犬病、轮状病毒、流感、柯萨奇病毒、人乳头瘤病毒、SIV、疟原虫、癌症，例如肿瘤、人疱疹病毒、巨细胞病毒(特别是人巨细胞病毒)、EB病毒、水痘-带状疱疹病毒、肝炎病毒(比如乙肝病毒、甲肝病毒、丙肝病毒)、副粘病毒：呼吸道合胞病毒、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒(例如HPV6、11、16、18等等)、黄病毒(例如黄热病病毒(Yellow Fever Virus)、登革病毒(Dengue Virus)、蜱传脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus)、日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus))或者流感病毒，例如甲型流感病毒(例如，血凝素(H)和神经氨酸酶(N)亚型)、乙型流感病毒和丙型流感病毒；以及由细菌生物，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌引起的相关的疾病或紊乱。例子包括，但不限于奈瑟氏球菌，包括淋球菌(N.gonorrhea)和脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)；链球菌，包括肺炎链球菌(S.pneumoniae)、化脓性链球菌(S.pyogenes)、无乳链球菌(S.agalactiae)、变形链球菌(S.mutans)；嗜血菌物种(Haemophilus spp)，包括乙型流感嗜血菌(H.influenzae type B)、非分型流感嗜血菌(non typeable H.influenzae)、杜克雷嗜血菌(H.ducreyi)；莫拉菌属的一些种，包括卡他莫拉菌(M catarrhalis)，又称为粘膜炎布兰汉氏球菌(Branhamella catarrhalis)；博德特氏菌，包括百日咳杆菌、副百日咳杆菌(B.parapertussis)和支气管腐败杆菌(B.bronchiseptica)；分枝杆菌，包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis)、麻风杆菌(M.leprae)、鸟分枝杆菌(M.avium)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)；军团菌属，包括嗜肺军团菌(L.pneumophila)；埃希氏菌，包括肠产毒性大肠杆菌(enterotoxicE.coli)、肠出血性大肠杆菌(enterohemorragic E.coli)、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic E.coli)；弧菌属(Vibrio)细菌，包括霍乱弧菌(V.cholera)；志贺氏菌物种(Shigella spp)，包括宋氏志贺菌(S.sonnei)、痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)、弗氏志贺氏菌(S.flexnerii)；耶尔森菌属，包括小肠结肠炎耶尔森菌(Y.enterocolitica)、鼠疫杆菌(Y. pestis)、假结核耶尔森菌(Y.pseudotuberculosis)；弯曲菌物种(Campylobacter spp)，包括空肠弯曲菌(C.jejuni)和大肠弯曲菌(C.coli)；沙门菌属，包括伤寒沙门菌(S.typhi)、副伤寒沙门菌(S.paratyphi)、猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)、肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)；李斯特菌属，包括单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)；螺杆菌属，包括幽门螺杆菌(H.pylori)；假单胞菌属，包括绿脓杆菌(P.aeruginosa)；葡萄球菌属，包括金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)；肠球菌属，包括粪肠球菌(E.faecalis)、屎肠球菌(E.faecium)；梭菌属，包括破伤风梭菌(C.tetani)、肉毒梭菌(C. botulinum)、艰难梭菌(C.difficile)；芽孢杆菌属，包括炭疽芽孢杆菌；棒状杆菌，包括白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)；疏螺旋体属，包括布氏疏螺旋体(B.burgdorferi)、嘎氏疏螺旋体(B.garinii)、阿氏疏螺旋体(B.afzelii)、B.andersonii，赫氏蜱疏螺旋体(B.hermsii)；埃里希氏体属，包括马埃里希氏体(E.equi)和人埃里希氏体(Human Granulocytic Ehrlichiosis)；立克次氏体属，包括立氏立克次氏体(R.rickettsii)；衣原体属，包括沙眼衣原体(C.trachomatis)、肺炎衣原体(C.pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(C.psittac)；钩端螺旋体属，包括问号钩端螺旋体(L.interrogans)；密螺旋体属，包括苍白密螺旋体(T.pallidum)、齿垢密螺旋体(T.enticola)、猪痢疾密螺旋体(T.hyodysenteriae)。优选的细菌包括，但不限于，李斯特氏菌、分枝杆菌(例如结核分枝杆菌)、炭疽菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌、百日咳杆菌、霍乱弧菌、吸虫、衣原体、线虫、绦虫、沙眼衣原体和疟疾寄生虫。

用于本文，术语“细菌性感染”包括被各种细菌感染。在另一实施方案中，可以从患者中移去T细胞，在体外与抗GITR结合分子接触，任选同时有活化信号(例如，抗原加上APC或者多克隆抗体)并重新导入患者体内。

调节性T细胞通过抑制对自身免疫性疾病和癌症的免疫反应，在维持自我免疫耐受性发明起到重要作用。相应的，在一实施方案中，抵消调节性T细胞对T效应细胞的抑制作用将有利于增强癌症中的免疫反应。因此，本发明的结合分子可以用于处置恶性肿瘤，抑制肿瘤生长或转移。所述结合分子可以系统地或局部地给予到肿瘤位点。

在一实施方案中，调节GITR功能可能用于诱导肿瘤免疫，即用于处置患有瘤形成疾病或癌症的受试者。在一实施方案中，本发明的结合分子减小了肿瘤大小、抑制了肿瘤生长和/或延长了带瘤受试者的存活期。可以将GITR结合分子给予带有肿瘤细胞(例如，肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、神经母细胞瘤、癌(carcinoma))的患者以便克服受试者的肿瘤特异性耐受。

术语″肿瘤相关抗原″用于本文表示宿主生物中影响肿瘤生长或转移的抗原。肿瘤相关抗原可以是肿瘤细胞表达的抗原，或者是非肿瘤细胞表达的抗原，但是后一种情况中，当它表达时会促进肿瘤细胞的生长或转移。肿瘤抗原和肿瘤相关抗原的类型包括任何已知或迄今为止未知的肿瘤抗原，包括但不限于，白血病中的bcr/abl抗原；与宫颈癌相关的致癌病毒的HPVE6和E7抗原；黑素瘤中的或者与黑素瘤相关的MAGE1和MZ2-E抗原；以及乳腺癌中的或与乳腺癌相关的MVC-1和HER-2抗原。

用于本文，术语“瘤形成疾病”的特点在于恶性肿瘤生长或处于以良性增殖和增生细胞为特点的疾病状态。术语“瘤形成”的一般医学含义是指造成对正常生长控制失去反应的“新细胞生长”，例如瘤形成细胞生长。

用于本文，术语“细胞增生的”、“增生的”、“恶性的”和“瘤形成的”可以交换使用，是指处于以快速增殖或瘤形成为特征的异常状态或情形的那些细胞。这些术语意图包括所有类型的增生性生长、增生、癌变生长或致癌过程、转移问题或恶性转化细胞、组织或器官，而不管侵染的组织病理类型或阶段。但是，用于本文，术语瘤形成和增生可以交换使用，象它们的名字提示的，都是泛指经历异常细胞生长速率的细胞。瘤形成和增生包括″肿瘤″，可以是良性的、癌前病变或者恶性的。

术语“瘤形成”、“增生”和“肿瘤”通常都被称为“癌症”，它是100多种以不受控制、反常细胞生长为特征的疾病的总称。癌症的例子包括但不限于：乳腺癌；结肠癌；非小细胞肺癌，头颈癌；大肠癌；肺癌；前列腺癌；卵巢癌；肾癌；黑素瘤；和胃肠道癌(例如，胰腺癌和胃癌)；以及骨肉瘤。

在一实施方案中，所述癌症选自：胰腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结肠癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、尿道膀胱癌、脑或中枢神经系统癌、外周神经系统癌、食管癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆管癌、小肠或附件癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤以及造血组织的癌症。

相应的，本发明还涉及治疗受试者(优选是人或其它动物)中的瘤形成疾病或癌症的方法，该方法是通过将有效量的本发明结合分子给予受试者或动物。本领域技术人员通过常规实验，可以确定用于处置瘤形成疾病或癌症的目的，有效量的多肽是多少。例如，本发明的结合分子的治疗有效量可能根据多种因素而变化，比如疾病阶段(例如，I期相对于IV期)、年龄、性别、医学综合征(例如，免疫抑制状态或疾病)以及受试者的体重，和结合分子在受试者中引发所需反应的能力。可以调节剂量方案来提供最佳的治疗和/或预防反应。例如，可以每天给予几次分开的剂量，或者按照治疗状况的紧急情况相应减少剂量。但一般来说，有效剂量预计在每天每公斤体重约0.05到1 00毫克的范围内，更优选每天每公斤体重约0.5到10毫克。

增强免疫反应的方法

所述结合分子还可以用于提高免疫反应的方法。上调免疫反应可以采取提高已有免疫反应的形式，或者引发初始免疫反应的形式。例如，通过调节GITR来提高免疫反应在病毒感染的情况中可以是有益的。因为抗GITR结合分子能够提高免疫反应，它们在那些需要更快或更彻底地清除病原体(例如细菌和病毒)的情况中有医疗用途。相应的，本发明的抗GITR结合分子可以用于单独或者与抗原或其它免疫刺激剂组合使用来治疗患有疾病或紊乱的受试者，比如前面列举的那些感染性疾病或癌。

抗GITR结合分子还可以用在疫苗中预防各种病原体。可以通过将病毒蛋白和GITR结合分子一起接种来诱导抗病原体(例如病毒)的免疫力(如上所述)。替代的，可以使用编码病原体抗原和GITR结合分子的基因的表达载体来进行接种，例如被工程化用来表达编码病毒蛋白的核酸和编码GITR结合分子的核酸的痘苗病毒表达载体。疫苗可能有用的病原体包括，例如乙肝、丙肝、EB病毒、巨细胞病毒、HIV-1、HIV-2、流感、肺结核、疟原虫和血吸虫病。

本发明进一步涉及到以所述结合分子为基础的疗法，该疗法包括将本发明结合分子给予动物患者，优选是哺乳动物，最优选是人，以便处置、检测和/或预防提及的疾病、紊乱或状况中的一或多种。本发明的治疗组合物包括但不限于，本发明结合分子(包括文中描述的类似物和衍生物)和本文描述的抗独特型结合分子。本发明的结合分子可以用来处置、诊断、抑制或预防与GITR异常活性相关的疾病、紊乱或状况，包括但不限于，文中描述的疾病、紊乱或状况中的一或多种(例如，可以将本发明结合分子提供成本领域已知的或文中描述的可药用组合物)。

本发明的结合分子可以有利地与其它单克隆或嵌合结合分子、或者淋巴因子或造血细胞因子(比如，例如IL-2，IL-3和IL-7)联合使用，例如能提高与结合分子相互作用的效应细胞的数量或活性的那些。

本发明的结合分子可以单独或与其它类型的治疗方法(例如，放疗、化疗、激素疗法、免疫疗法)和抗肿瘤剂、抗生素、针对病原体的疗法(比如能有效对抗病毒病原体或细菌抗原的免疫治疗或化疗剂)以及免疫刺激剂联合使用。还可以将本发明的结合分子与抗原联合给药，所述抗原就是希望提高对它的免疫反应的抗原，例如来自病原体的疫苗或抗原(或减毒形式的病毒或细菌)或者来自上面描述过的肿瘤的抗原。在一实施方案中，将本发明的结合分子以单独或联合疗法给予患有感染的受试者。在另一实施方案中，本发明的结合分子被单独或联合给予有慢性病毒感染的受试者。还有一实施方案中，本发明的结合分子被单独或联合给予患有癌症的受试者。

通常，优选将来源于某物种的结合分子给予相同物种的患者。因此，在优选实施方案中，人结合分子、其衍生物、类似物或核酸被给予人患者用于治疗或预防。

VI.药物组合物

本发明结合分子可以被导入适合给予受试者的药物组合物。通常，所述药物组合物包含本发明的结合分子和可药用载体。用于本文时，说法″可药用载体″包括与药物组合物相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。将这些介质和试剂用于药物活性物质是本领域众所周知的。除非任何常规的介质或试剂与活性化合物是不相容的，否则本发明涉及它们在组合物中的应用。补充性的活性化合物也可以并入组合物中。

本发明的药物组合物被配制成与其预期给药途径相容的剂型。给药途径的例子包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、口腔(例如吸入)、经皮(表面局部)、经粘膜和直肠给药。用于肠胃外、皮内或皮下使用的溶液或悬浮液可以包括以下成分：无菌稀释剂，比如注射用水、盐水溶液、固定油(fixedoil)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂比如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯(methyl parabens)；抗氧化剂比如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂比如乙二胺四乙酸；缓冲液比如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及调节渗透压的试剂比如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱来调节pH，比如盐酸或氢氧化钠。肠胃外用药剂可以封在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

适于注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(当可溶于水时)或悬浮液和用于即时配制无菌注射用液或悬浮液的无菌粉末。适合静脉内给药的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲液(PBS)。所有这些情况中，所述组合物必须是无菌的，其流动性应达到容易进行针管注射的水平。它必需在制造和存储条件下是稳定的，必需在防止微生物(比如细菌和真菌)污染的条件下保存。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，乙二醇、丙二醇和液态聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，以及它们的合适混合物。通过例如使用包衣(比如卵磷脂)、在悬浮液的情况中维持所需颗粒大小、以及使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以利用各种抗细菌剂和抗真菌剂来防止微生物污染，例如对羟基苯甲酸酯(parabens)、氯丁醇(chlorobutanol)、苯酚(phenol)、抗坏血酸、硫柳汞等。许多情况中，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖(sugar)、多元醇(比如甘露醇、山梨醇)和氯化钠。延迟可注射组合物的吸收可以通过在组合物中包含能延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。

无菌注射溶液可以通过在合适溶剂中引入需要量的活性化合物以及上面列举的成分中的一种或多种，经无菌过滤制得。通常，悬浮液是在含有基本分散介质和所需的上述其它成分的无菌载体中引入活性化合物来制备的。在用于配制无菌注射液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从而产生活性成分和任何其它所需成分的粉末，所述其它所需成分来自该成分提前无菌过滤的溶液。

口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用载体。可以将它们密封在明胶胶囊中或压成片剂。为了经口治疗给药，可以将活性化合物与赋形剂一起用于片剂、锭剂(troche)或胶囊的形式。还可以用液体载体来制备口服组合物作为漱口液，其中配制在液态载体中的化合物经口施用，漱口后吐出或咽下。药学相容性粘合剂以及/或者助剂成分可以作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有任何以下成分，或类似特性的化合物：粘合剂，比如微晶纤维素、西黄蓍胶(gum tragacanth)或明胶；赋形剂，比如淀粉或乳糖；崩解剂，比如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，比如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，比如胶体二氧化硅；甜味剂，比如蔗糖或糖精；或者增味剂，比如胡椒薄荷、甲基水杨酸盐或橙味剂(orange flavoring)。

为了通过吸入给药，从加压容器或含有合适的推进剂(例如二氧化碳这样的气体)的分散器，或者喷雾器中以气溶胶喷雾形式来递送所述化合物。

系统给药还可以通过经粘膜或经皮途径。用于经粘膜或经皮给药时，在制剂中使用适合用于待穿透的屏障的渗透剂。这类渗透剂是本领域公知的，在经粘膜给药时，包括例如表面活性剂、胆盐和夫西地酸(fusidic acid)衍生物。经粘膜给药可以通过使用喷鼻剂或栓剂来实现。对于经皮给药，可以将活性化合物配制成本领域熟知的软膏(ointment)、油膏(salve)、凝胶或霜剂。

所述组合物还可以配制成栓剂的形式(例如，用常规栓剂基底比如椰子油和其它甘油酯)或者保留灌肠来经结肠递送。

在一实施方案中，本发明的结合分子用保护化合物不从体内快速清除的载体来制备，所述载体比如控释配制剂，包括植入物和微囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，比如乙烯乙酸乙烯共聚物、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备这些制剂的方法对本领域技术人员是显而易见的。这些材料也可以从Alza Corporation和NovaPharmaceuticals，Inc购买。脂质体悬浮液也可以作为可药用载体。可以按照本领域技术人员已知的方法，象美国专利4,522,811中描述的来制备这些。

尤其有利的是配制成单位剂量形式的口服或肠胃外组合物以方便给药和达到剂量的统一性。单位剂量形式用于本文表示物理上单独的单元，适用于作为待处置受试者的单个剂量；每个单元含有与所需药用载体组合的，预先确定好用量的活性化合物，经过计算能产生所需治疗效果。本发明的剂量单元形式的特性是直接决定于所述活性化合物的独特性质和要达到的具体治疗效果，以及现有技术中组合该活性化合物用于个体处置的局限性。

这些化合物的毒性和治疗效力可以通过标准的药学程序在细胞培养物或实验动物中确定，例如确定LD50(对群体50％致死的剂量)和ED50(对群体的50％有疗效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率是疗效指数，可以表达为比率LD50/ED50。优选表现出较高疗效指数的化合物。虽然可以使用显示毒性副作用的化合物，但要小心设计能够将该化合物定靶到受影响组织的递送系统，以便尽量减少对未受影响细胞的可能破坏，从而减少副作用。

由细胞培养物和动物实验得到的数据可以用于配制人用的剂量。这些化合物的剂量优选处于这样的循环浓度的范围内，即包括ED50而有很少或没有毒性。可以根据采用的剂量形式和所用给药途径在该范围内对剂量做改动。对于任何用于发明所述方法的化合物，治疗有效的剂量可以首先由细胞培养分析来确定。可以在动物模型中确定剂量，以达到循环血浆浓度范围包括由细胞培养确定的IC50(即达到对症状最大抑制的一半的待测化合物的浓度)。可以用这类信息更精确地确定可以用于人的剂量。血浆中的浓度可以通过例如高效液态层析来测量。

所述药物组合物可以与用药说明一起包含在容器、包装或分散器中。

VII.给药本发明结合分子

将本发明的结合分子与来自受试者的细胞在体外或体内以生物可容性形式进行接触。″生物可容性形式″意味着要给予的试剂的形式，其中任何毒性效果都被所述结合分子的治疗效果抵消了。

在一实施方案中，所述组合物被给予受试者。给予药物活性量的本发明药物组合物是指，在一定时间内达到所需结果的有效用量和每次剂量。例如，结合分子的药物活性量可能随着一些因素而变动，比如疾病阶段、年龄、性别和个体体重，以及该结合分子在个体中引发预期反应的能力。可以调节剂量方案来提供最大医疗反应。例如，可以每天给予几次分开的剂量，或者根据治疗情况的紧急与否相应减少剂量。

本发明的药物组合物可以包括″治疗有效量″或″预防有效量″的本发明结合分子。″治疗有效量″是指在所需时间内达到目标治疗结果的有效用量和每次剂量。结合分子的治疗有效量可能随着一些因素而变动，比如疾病阶段、年龄、性别和个体体重，以及该结合分子在个体中引发预期反应的能力。治疗有效量也是其中结合分子的任何毒性或有害效果均被其治疗有益效果所超越的一个用量。″预防有效量″是指在所需时间内达到目标预防结果的有效用量和每次剂量。通常，因为预防剂量是在发病前或疾病的早期用于受试者的，预防有效量会比治疗有效量低。

可以调节剂量方案来实现最佳的预期反应(例如，治疗或预防反应)。例如，可以给予单个大剂量、一段时间内给予几个分开的剂量或者根据治疗情况的紧急与否相应地减少或增加剂量。尤其有利的是配制成单位剂量形式的肠胃外组合物以方便给药和达到剂量的统一性。单位剂量形式用于本文表示物理上单独的单元，适用于作为待处置哺乳动物受试者的单个剂量；每个单元含有与所需药物载体组合的、预定用量的活性化合物，经过计算能产生所需治疗效果。本发明的剂量单元形式的特性直接决定于(a)所述活性化合物的独特性质和要达到的具体治疗效果，以及(b)现有技术中组合该活性化合物用于个体处置的敏感性的局限。

本发明结合分子的治疗或预防有效量的示范性，非限制性范围是例如，约0.1-25mg/kg，约1.0-10mg/kg，约0.5-2.5mg/kg，约5-25mg/kg，约1-400mg/kg。需要说明的是剂量值可能随着欲缓解状况的类型和严重程度而变化。要进一步明白，对于任何具体的受试者，应当根据个体所需和给予或监督给予所述组合物的人的专业判断来随时调整具体剂量方案，这里给出的剂量范围仅是范例，没有限制要求保护的组合物的范围或使用的意图。此外，本发明结合分子的治疗或预防有效量的非限制性范围是约0.0001到100mg/kg，和约0.01到5mg/kg(例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)受试者体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或者在1-10mg/kg的范围内，优选至少1mg/kg。处于上述范围中间的剂量也在本发明的范围内。

可以将这样的剂量每天、隔天、每周或者根据经验决定的其它时间表来给药。示范性的处置需要在一段时间，例如至少六个月内以多个剂量进行给药。其它示范性处置方案规定每两个周或每月一次或每3到6个月一次给药。示范性的剂量方案包括连续每天给予1-10mg/kg或15mg/kg、隔天给予30mg/kg或者每周给予60mg/kg。

本发明的结合分子可以多次给予。单个剂量间的间隔可以是例如，每天、每周、每月或每年。通过测量患者体内结合分子的血液水平，也可以决定间隔是不规律的。

任选将本发明的结合分子与其它对所需处置(例如，预防或治疗)的紊乱或状况有效的试剂联合给药。优选的其它试剂是现有技术认可的，常规给予具体紊乱的那些试剂。

可以以方便的方式来给予结合分子，比如注射(皮下、静脉内等)、口服、吸入、经皮施用或结肠给药。根据给药途径，可以将活性化合物包被在某种材料中以便保护该化合物不受酶、酸和其它可能使化合物被灭活的天然状况的作用。例如，当通过非肠胃外途径给予试剂时，可能会希望将试剂包被，或者和能防止它被灭活的材料一起给药。

本发明的结合分子可以通过本领域已知的多种方法来给药，尽管对于许多治疗性应用来说，优选的给药途径/模式是静脉注射或滴注。本领域技术人员明白，给药途径和/或模式根据预期结果会有变化。在一些实施方案中，可以将活性化合物和能使它免于被快速释放的载体一起制备成比如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂、和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，比如乙烯乙酸乙烯共聚物、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备这类制剂的许多方法是受专利保护的或者本领域技术人员一般都知道的。参见例如，Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.Marcel Dekker，Inc.NewYork，1978。

在一些实施方案中，本发明的结合分子可以是例如与惰性稀释剂或可同化可食用载体一起口服的。化合物(以及其它成分，如果需要的话)还可以密封在硬的或软的明胶胶囊中，挤压成片剂，或者直接掺入受试者的饮食中。用于经口治疗性给药，可以将化合物与赋形剂组合，以可分解的片剂、锭剂、膏药、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、速溶片(wafer)等形式使用。将本发明的化合物以非肠胃外途径给药时，可能有必要将所述化合物包被上某种材料或与某种材料一起给予来防止被灭活。

可以将结合分子和酶抑制剂或者在合适的载体(比如脂质体)中一起给予。可药用稀释剂包括盐水和水缓冲液。可以使用最广义上的佐剂，包括任何免疫刺激化合物比如干扰素。这里预期的佐剂包括雷锁辛(resorcinol)、非离子表面活性剂，比如聚氧乙烯油基醚(polyoxyethylene oleyl ether)和正十六烷基聚乙烯醚(n-hexadecyl polyethylene ether)。酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸(diisopropylfluorophosphate，DEEP)和抑肽酶(trasylol)。脂质体包括水包油包水乳剂以及常规的脂质体(Sterna et al.(1984)J.Neuroimmunol.7：27)。

活性化合物还可以经肠胃外或腹膜内给予。分散体还可以在甘油、脂质聚乙二醇和它们的混合物以及油中制备。在普通保存和使用条件下，这些制品可以含有防腐剂以便防止微生物的生长。

当活性化合物象上文描述的那样有适当的保护，结合分子可以与例如惰性稀释剂或者可同化可食性载体一起经口给予。

补充性活性化合物也可以加入组合物中。在一些实施方案中，本发明的结合分子与一或多种其它治疗剂共同成剂和/或共同给药。例如，本发明的抗GITR结合分子可以与一或多种结合别的靶分子的其它抗体共同成剂和/或共同给药，其中所述抗体是例如能结合其它细胞因子或结合细胞表面分子的抗体。这种联合疗法可以有利地使用低剂量治疗试剂，从而避免和各种单独疗法相关的毒性或综合征。

本发明进一步涵盖偶联了诊断或治疗剂的结合分子。结合分子可以诊断性地用于，例如作为临床测试的一部分，监控肿瘤发展或进展以便确认给定治疗方案的效果。可以通过给抗体偶联上一个可检测物质来协助探测。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、用各种正电子发射X射线断层术放射正电子的金属，以及非放射性顺磁性金属离子。所述可检测物质可以直接或者利用本领域已知技术借助中间物(比如，例如本领域已知的接头)间接地与结合分子偶联或缀合。参见例如，美国专利4,741,900的金属离子可以与结合分子缀合用做诊断剂。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷脂酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基的例子包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三吖嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的一个例子是鲁米诺；生物发光物质的例子包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；合适的放射性物质的例子包括I¹²⁵、I¹³¹、I¹¹¹、In^99Tc。

更进一步，结合分子可以偶联上一个治疗部分，比如细胞毒素，例如细胞生长抑制剂或杀细胞性试剂、治疗剂、放射性金属离子(例如，α放射源，象²¹³Bi)、生物毒素、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂类、生物反应调理剂、药物试剂、免疫活性配体(例如，淋巴因子和其它抗体)。在另一实施方案中，本发明的结合分子可以偶联上能够抑制肿瘤血管形成的分子。在其它实施方案中，本文公开的组合物可以包含偶联了药物或前药的本发明结合分子。本发明的再一些实施方案包含偶联了比如蓖麻毒素、白树毒蛋白(gelonin)、假单胞菌外毒素或白喉毒素这些特异生物毒素或它们的细胞毒性片段的结合分子的用途。选择使用什么样的偶联或未偶联结合分子取决于癌症的类型和阶段、是否使用辅助治疗(例如，化疗或体外放射)以及患者的状况。我们认为本领域技术人员参照本文的教导可以容易地作出选择。

细胞毒素或细胞毒性剂包括任何对细胞有害的试剂。例子包括紫杉醇(paclitaxol)、细胞松弛素(cytochalasin)B、短杆菌肽(gramicidin)D、溴化乙锭、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春花新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光辉霉素(mithramycin)、放线菌素(actinomycin)D、1-去氢睾酮(dehydrotestosterone)、糖皮质激素(glucocorticoids)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)以及它们的类似物或同系物。治疗剂包括但不限于，抗代谢物(例如，氨甲蝶呤(methotrexate)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、达卡巴嗪(dacarbazine))、烷化剂(例如，氮芥(mechlorethamine)、噻替哌(thiotepa)、氯氨布西(chlorambucil)、美法仑(melphalan)、carnustine(BSNU)和洛莫司汀(lomustine，CCNU)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链脲佐菌素(streptozotocin)、丝裂霉素C和顺式二氯二氨合铂(cis-dichlorodiamine platinum)(II)(DDP，顺铂(cisplatin))、蒽环类药(anthracycline)(例如，柔红霉素(以前称为daunomycin)和阿霉素)，抗生素(例如，放线菌素D(dactinomycin，以前称为放线菌素)、博莱霉素(bleomycin)、光辉霉素和氨茴霉素(anthramycin，AMC)，以及抗有丝分裂试剂(例如，长春花新碱和长春花碱)。

本发明进一步通过以下实施例进行阐述，这些实施例不应被理解为对发明的限制。本申请中提及的所有参考文献、专利和已公开的专利申请的全部内容，以及附图均以引用的方式并入本文。

实施例

以下材料和方法用于一些实施例中：

方法

培养T细胞系

用各种方法从得自人脐带血的细胞或者外周血CD4+CD45RA+原初T细胞产生分化的细胞系，所述方法包括流式细胞仪和磁珠分离。起始群体纯度＞95％。然后细胞在RPMI 1640中用CD3和CD28抗体刺激来产生分化的细胞类型，所述培养基含有10％FCS和1％人AB血清，以及细胞因子和抗细胞因子中和抗体的指定混合物。用IL12(62U/ml)和抗IL4(0.2μg/ml)培养，产生Th1细胞；用IL4(145U/ml)和抗IL12(10ug/ml)以及抗IFNγ(10ug/ml)培养，产生Th2细胞；用TGFβ(32U/ml)、IL9(42U/ml)、抗IL4(10ug/ml)和抗IL12(10ug/ml)以及抗IFNγ(10ug/ml)培养，产生调节性T细胞。(注：所有实验中都未使用抗IL12)。所有培养物均补充了IL2(65U/ml)和IL15(4500U/ml)。根据细胞分裂的需要将细胞分到更大的培养板中。

实施例1：分离和纯化6C8

6C8抗体是IgG2b，κ型。该抗体经纯化表明存在两个重链(图1)。这可以是由于取两种糖基化之一或者污染了另一种抗体(Ab)所致。大小排阻层析只显示有一个峰(图2)。

如下纯化6C8抗体：

1.用5个柱体积的dPBS洗20ml蛋白G(Pharmacia HR10/30)

2.上样1L(第1轮)或2L(第2轮)hGITR(6C8)上清液

3.用10个柱体积的dPBS洗涤

4.用100mM柠檬酸盐，pH 2.8直接洗脱到1M Tris(20-25％v；v)中

5.用100mM柠檬酸盐(pH 2.8)、0.3M NaCl剥离(strip)

实施例2：鉴定6C8

6C8抗体与转染了GITR-L-M的细胞(图3)和活化的PBL(图4)结合。活化的淋巴细胞上生物素标记的抗GITR的饱和曲线提示，相对亲和力良好(图5)。

6C8抗体对于利用亚优化的抗CD3激活的T淋巴细胞具有协同刺激活性(图6)。该抗体的协同刺激未达到与CD28一样的水平，但是与抗GITR商品(R&D)是相当的。

6C8抗体未诱导活化的淋巴细胞凋亡(图7)。用PHA活化淋巴细胞，3天后加入抗体。与YTH 655(已知能诱导活化的淋巴细胞凋亡的抗人CD2)相比，6C8未增加活化的T淋巴细胞的细胞凋亡。

6C8抗体未阻断初级混合淋巴细胞反应(MLR)(图8)。用TRX1(抗人CD4)作所述MLR的阳性对照。

实施例3：6C8抗体抵消调节性T细胞对T效应细胞的抑制作用

6C8抗体能够阻断调节性T细胞诱发的抑制作用(图9)。CD4+/CD25+细胞以不同比率加入CD4+/CD25-细胞。所述细胞用结合在微孔板上的抗CD3和抗CD28来刺激。当比率为1∶1时，CD4+/CD25+细胞能够消除CD4+/CD25-细胞的增殖。在培养物中加入6C8能够以剂量依赖方式阻断该抑制作用。

当仅通过抗CD3(并非与抗CD28进行协同刺激)来刺激T细胞时，将CD4+/CD25+细胞加入CD4+/CD25-细胞中，未观察到抑制作用，实际上，所述抗GITR抗体在这些情况中具有微弱的协同刺激效果(图10)。

实施例4：6C8抗体调节经由NF-kB进行的信号传导

T细胞经CD3或者CD3+CD28活化，导致激活I-κB信号传导途径，这可通过I-κB的磷酸化(图1 2和1 4)和随后的降解(图11和13)来评估明。

如图11所示，在部分活化的情况下，抗GITR对I-κB信号传导有明显的影响，I-kB的时间依赖性降解证实了这一点。在有GITR结合分子的情况中，在所分析的所有时间点，降解明显减弱。上述变化与I-κB磷酸化的下降有很好的相关性(图12)。

有趣的是，对TH2和Treg的反应强度(magnitude of response)比对TH1的大。此外，在平行实验中，与TH2和Treg细胞相比，GITR的表达似乎在TH1细胞上更高(经MCF(平均通道荧光)评价得出)。通过交联CD3和CD28而被完全活化的T细胞失去了它们针对抗GITR的反应性，但是完全保持了经由TNF-α进行的I-κb活化。

实施例5：6C8抗体增强免疫反应

B16黑素瘤肿瘤模型是一种有侵占性的(aggressive)黑素瘤模型，其曾被用于研究调节性T细胞在癌症中的作用。对耗尽抗CD25抗体或者抗CTLA-4的小鼠进行的处理在该模型中已显示出很有希望的结果。两种情况中，所述处理均可延迟肿瘤的发生以及肿瘤大小的增长。由于GITR在CD25+细胞上表达，且可能参与抵消调节性T细胞的抑制作用，因而用抗GITR结合分子来处置B16荷瘤小鼠，以便确定是否对肿瘤发生或肿瘤大小有影响。小鼠在注射肿瘤的一天后用抗GITR结合分子进行处置，导致肿瘤发生和大小增长被延迟(图17)。此外，GITR处理组中有一些小鼠在实验的最后仍未出现肿瘤。

第0天，所有动物在右体侧注射104 B16黑素瘤细胞。GITR组在第1天接受了2毫克、1毫克、0.5毫克或0.2毫克抗GITR结合分子。从第16天开始出现可测量到的肿瘤。

实施例6：同时递送抗GITR和抗原导致佐剂效果

进一步研究了抗mGITR抗体在对抗卵清蛋白(Ova)或血凝素(HA)的体液反应中的佐剂效果。小鼠在第-1、0和1天用无抗体、0.4mg/天的YAML(同种型对照)或0.4mg/天的2F8(大鼠-抗mGITR)处置。为了评价Fc受体的参与在所述结合分子的作用机制中的重要性，另外一组动物用6mg/天的2F8 F(ab’)2在第-1、0和1天处置。该剂量是根据F(ab’)2的半寿期比完整抗体短来选择的。第0天，小鼠用Ova(100μg)或HA(10μg)免疫。经Ova处置的小鼠在第14天用100μg Ova攻击，然后在第21和28天取血，获得血清进行ELISA分析。经HA处置的小鼠在第14天用5μg HA攻击，也在第21和28天取血。

监测2F8和2F8 F(ab’)2的血清浓度，来评价结合分子的药代动力学变化。第1天，在经2F8或2F8 F(ab’)2片段处置的小鼠中，结合分子的血清水平相当。在经2F8处置的小鼠中，检测到结合分子的情况持续直至第9天，而经2F8 F(ab’)2片段处置的小鼠检测到结合分子的情况仅持续到第3天，虽然其剂量是2F8的15倍。

这些结果表明，在本研究的HA分支中，第21天和28天，经2F8处置的小鼠与未经抗体处置的小鼠相比，抗HA抗体分别增加4和5倍；与经YAML处置的小鼠相比，抗HA抗体分别增加18和20倍(图19)。在以抗mGITR抗体为佐剂时观察到的抗HA滴度，与将HA和弗氏不完全佐剂(IFA)一起给予时观察到的滴度相当。这提示，用所述抗mGITR抗体观察到的反应与免疫学研究中常用的最强效佐剂之一是相当的。

在本研究的Ova分支中，第21天和28天，经2F8处置的小鼠与未经抗体处置的小鼠相比，抗Ova抗体分别增加13和6倍；与经YAML处置的小鼠相比，抗Ova抗体分别增加17和8倍(图20)。2F8抗体在针对Ova的反应中的影响与在针对HA的反应中观察到的影响相当。第21天和28天，经2F8 F(ab’)2处置的小鼠与未经抗体处置的小鼠相比，抗Ova抗体分别增加4和3倍；与经YAML处置的小鼠相比，抗Ova抗体分别增加6和5倍(图20)。F(ab’)2相比于完整抗体的剂量及不同药代动力学变化，可以解释与经2F8处置的小鼠相比时抗Ova反应的下降。

总之，这些数据显示，2F8抗体在针对抗原的体液反应中的影响主要归功于该抗体的F(ab’)2部分，在所述抗mGITR抗体发挥佐剂效果时可能并非必需有Fc受体参与。

实施例7：制备嵌合抗GITR结合分子

采用常规分子生物学技术将6C8可变轻链区移植到人轻链恒定区上。使用的是IgG1轻链恒定区。完整嵌合轻链GITR结合分子的氨基酸如下所示：

DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTINNVHSEDLAEYFCQQYNTDPLTFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：22)。

采用常规分子生物学技术，还将6C8可变重链移植到人重链恒定区上。使用的是IgG1重链恒定区。完整嵌合重链GITR结合分子的氨基酸序列如下所示(又称为“Gly”)：

QVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSQLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADAATYYCARTRRYFPFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：23)。

因为氨基酸序列NX(S/T)是一个推测的糖基化位点共有序列，该序列可能影响到结合分子的产生，而6C8重链的IgG1恒定区含有序列NST，我们制备了重链恒定区的第二个版本将SEQ ID NO：23中氨基酸残基299的谷氨酰胺保守取代为天冬酰胺(粗体，并加有下划线)。相应的，第二个人恒定区被移植到6C8重链可变区上。完整嵌合重链GITR结合分子的氨基酸序列如下所示(又称为“Agly”)：

QVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSQLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADAATYYCARTRRYFPFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：24)。

实施例8：制备人源化形式的6C8抗GITR结合分子

采用Hwang et al.(2005)Methods(36)35-42中描述的基于CDR同源性的策略来人源化6C8。用公共数据库对重链和轻链氨基酸序列进行检索，结果表明6C8有一个3-1重链规范结构和一个2-1-1轻链规范结构。由此，将IMGT数据库中所有具备2-1-1规范结构的种系K链V基因与6C8抗体序列进行了比较。同样所有3-1种系重链V基因与6C8氨基酸序列进行了比较。只比较了CDR序列，并且根据哪个种系序列在CDR中有最多匹配挑选了框架。(参见以下序列比对)。

对于轻链，3-15^*01序列在CDR中有14个匹配，选择了该序列。因为CDR 3末尾是亮氨酸和苏氨酸，我们使用了Jk4 J基因片段序列。

具备2-1-1规范结构的轻链V基因

IMGT

基因名称    CDR1    CDR2    CDR3    IDs

IGKV1-5     RASQSISSWLA......DASSLES.......QQYNSYS..11

IGKV1-6     RASQGIRNDLG......AASSLSQ.......LQDYNYP..9

IGKV1-9     RASQGISSYLA......AASTLQS.......QQLNSYP..11

IGKV1-12    RASQGISSWLA......AASSLQS.......QQANSFP..11

IGKV1-16    RASQGISSWLA......AASSLQS.......QQYNSYP..12

IGKV1D-16   RARQGISSWLA......AASSLQS.......QQYNSYP..11

IGKV1-17    RASQGIRNDLG......AASSLQS.......LQHNSYP..9

IGKV1-27    RASQGISNYLA......AASTLQS.......QKYNSAP..11

IGKV1-33    QASQDISNYLN......DASNLET.......QQYDNLP..9

IGKV1-39    RASQSISSYLN......AASSLQS.......QQSYSTP..9

IGKV1D-43   WASQGISSYLA......YASSLQS.......QQYYSTP..11

IGKV3-11    RASQSVSSYLA......DASNRAT.......QQRSNWP..11

IGKV3D-11   RASQGVSSYLA......DASNRAT.......QQRSNWH..10

IGKV3-15    RASQSVSSNLA......GASTRAT.......QQYNNWP..14

6C8         KASQNVGTNVA......SASYRYS.......QQYNTDP

将IMGT数据库中所有具备2-1-1规范结构的种系轻链κ链V基因与6C8抗体序列进行了比较。同样将所有3-1种系重链V基因与6C8氨基酸序列进行了比较。

利用该方法制备了轻链的一个版本：

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQNVGTNVAWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNTDPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：44)(CDR用斜体表示)

对重链来说，序列2-05^*01有17个匹配。但是，CDR3周围的序列与6C8不同(YYCAR vs.YYCAHR)。因为已有证明显示CDR 3对于CDR的识别能力是最重要的，应当尽量地使该区域达到完全匹配。序列2-70*01在CDR中有16个匹配，紧挨CDR3前面的序列与6C8的完全匹配，因此我们选择了2-70^*01。

对于重链的J基因片段，JH4有最多的匹配，因此被选中。然后氨基酸序列被反翻译，对应目标核苷酸序列的引物购自IDT(Coralville，IA)。

带有3-1规范结构的重链V基因

IMGT

基因名称     CDR1        CDR2              IDs

IGHV2-5      TSGVGVG.....LIYWNDDKRYSPSLKS  17

IGHV2-26     NARMGVS.....HIFSNDEKSYSTSLKS  12

IGHV2-70     TSGMCVS.....LIDWDDDKYYSTSLKT  16

IGHV4-30-2   SGGYSWS.....YIYHSGSTYYNPSLKS  10

IGHV4-30-4   SGDYYWS.....YIYYSGSTYYNPSLKS  9

IGHV4-31     SGGYYWS.....YIYYSGSTYYNPSLKS  9

IGHV4-39    SSSYYWG.....SIYYSGSTYYNPSLKS  10

IGHV4-61    SGSYYWS.....YIYYSGSTNYNPSLKS  8

6C8         TSGMGVG.....HIWWDDDKYYNPSLKS

利用这种方法，制备了重链的一个版本：

QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARTRRYFPFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：53)(又称为“N”)。

因为氨基酸序列NX(S/T)是一个推测的糖基化位点共有序列，可能影响到结合分子的产生，而6C8重链的CDR2含有序列NPS，我们制备了重链的第二个版本将SEQ ID NO：53中氨基酸残基62的谷氨酰胺保守取代为天冬酰胺(粗体，并加有下划线)。相应的，制备了重链的第二版本：

QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMG VGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKYYQPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARTRRYFPFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：54)(又称为“Q”)。

我们还做了6C8轻链可变区和3-15^*01种系轻链序列的CLUSTAL W(1.82)多重序列比对(利用Blosum评分阵列，空位罚分为10)。结果如下：

6C8         DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPD

3-15^*01     EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPA

            :******   :*.* *:*.:::*:***.*.:*:*********:*: ***.** * :*:*

6C8         RFTGSGSGTDFTLTINNVHSEDLAEYFCQQYNTDPLTFGAGTKLEIK

3-15*01     RFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWP------------

            **:******:*****..::***:*  *:*****.*

基于CLUSTAL W分析，在人框架中鉴定到一些氨基酸残基可能用与人源化6C8轻链的6C8框架残基对应的氨基酸残基进行取代。具体来说，是位点1的E，位点8的P，位点9的A，位点10的T，位点11的L，位点13的V，位点15的P，位点17的E，位点19的A，位点20的T，位点21的L，位点22的S，位点43的A，位点45的R，位点46的L，位点58的I，位点60的A，位点63的S，位点70的E，位点76的S，位点77的S，位点78的L，位点79的Q，位点83的F，位点85的V，位点87的Y，位点100的G，以及位点104的V。

类似的，还对6C8重链可变区和含有2-70^*01氨基酸序列的种系重链蛋白质进行了CLUSTAL W(1.82)多重序列比对(用Blosum评分阵列，空位罚分为10)。结果如下：

6C8        QVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKY

2-70*01    QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMCVSWIRQPPGKALEWLALIDWDDDKY

           ****:****.::**:***:***:*********** *.*****.**.***** * ******

6C8        YNPSLKSQLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADAATYYCARTRRYFPFAYWGQGTLVTVSS

2-70*01    YSTSLKTRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARI-------------------

           *..***::********:***.*.:*.:*..*:*******

基于CLUSTAL W分析，在人框架中鉴定到一些氨基酸残基可能用与人源化6C8重链的6C8框架残基对应的氨基酸残基进行取代。具体来说，是位点5的R，位点10的A，位点11的L，位点12的V，位点15的T，位点19第T，位点23的T，位点43的P，位点46的A，位点68的R，位点77的K，位点81的V，位点83的T，位点84的M，位点86的N，位点87的M，位点89的P，位点90的V，以及/或者在位点92的T。

制备了具有如下人源化重链和轻链组合方式的4种人源化全长6C8结合分子：

全长版本1(HuN6C8-Gly)-人源化(Hu)6C8轻链(L)/人源化重链，CDR2中有N(“N”)、且包含具有N的恒定区(“Gly”)

全长版本2(HuN6C8-Agly)-人源化(Hu)6C8轻链(L)/人源化的重链，CDR2中有N(“N”)、且包含具有A的恒定区(“Agly”)

全长版本3-(HuQ6C8-Gly)-人源化(Hu)6C8轻链(L)/人源化的重链，CDR2中有Q(“Q”)、且包含具有N的恒定区(“Gly”)

全长版本4-(HuQ6C8-Agly)-人源化(Hu)6C8轻链(L)/人源化的重链、CDR2中有Q(“Q”)、且包含具有A的恒定区(“Agly”)

用于产生全长结合分子的糖基化IgG1重链恒定区氨基酸序列如下：ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：55)。

用于产生全长结合分子的去糖基化IgG1重链恒定区氨基酸序列如下：ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：56)。

用于制备全长结合分子的IgG1轻链恒定区氨基酸序列如下：RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：57)。

人源化6C8轻链的完整氨基酸序列如下：EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQNVGTNVAWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNTDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：58).

还可包括引导序列METQSQVFVYMLLWLSGVDG(SEQ ID NO：59)。

人源化6C8重链版本HuN6C8-Agly、HuQ6C8-Gly和HuQ6C8-Agly的完整氨基酸序列如下：

HuN6C8-Gly

QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARTRRYFPFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：60)；

HuN6C8-Agly

QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARTRRYFPFAYWGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS SVVTVPS S SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：61)；

HuQ6C8-Gly

QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKYYQPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARTRRYFPFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：62)；以及

HuQ6C8-Agly

QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKYYQPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARTRRYFPFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：63).

还可包括引导序列MDRLTFSFLLLIVPAYVLS(SEQ ID NO：64)。

等同物

本领域技术人员只需运用常规实验就能认识到，或者确认文中描述的本发明具体实施方案的许多等同物。以下权利要求意在涵盖这些等同物。

序列表

<110>托勒克斯股份有限公司(TolerRx，Inc.)

<120>GITR结合分子及其用途

<130>TLN-029PC

<140>

<141>

<150>60/665,322

<151>2005-03-25

<150>60/687,265

<151>2005-06-03

<160>68

<170>PatentIn Ver.3.3

<210>1

<211>138

<212>PRT

<213>鼠(Mus musculus)

<400>1

Met Asp Arg Leu Thr Phe Ser Phe Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Tyr

  1               5                  10                  15

Val Leu Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys

             20                  25                  30

Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu

         35                  40                  45

Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys

     50                  55                  60

Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr

 65                  70                  75                  80

Asn Pro Ser Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg

                 85                  90                  95

Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Ala Ala

            100                 105                 110

Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Arg Arg Tyr Phe Pro Phe Ala Tyr Trp

        115                 120                 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

    130                 135

<210>2

<211>127

<212>PRT

<213>鼠(Mus musculus)

<400>2

Met Glu Thr Gln Ser Gln Val Phe Val Tyr Met Leu Leu Trp Leu Ser

  1               5                  10                  15

Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser

             20                  25                  30

Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn

         35                  40                  45

Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

     50                  55                  60

Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp

 65                  70                  75                  80

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

                 85                  90                  95

Asn Val His Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn

            100                 105                 110

Thr Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

        115                 120                 125

<210>3

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>3

Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly

  1               5                  10

<210>4

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>4

His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

  1               5                  10                  15

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>5

Thr Arg Arg Tyr Phe Pro Phe Ala Tyr

  1               5

<210>6

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>6

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala

  1               5                  10

<210>7

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>7

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser

  1               5

<210>8

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>8

Gln Gln Tyr Asn Thr Asp Pro Leu Thr

  1               5

<210>9

<211>414

<212>DNA

<213>鼠(Mus musculus)

<400>9

atggacagac ttacattctc attcctgctg ctgattgtcc ctgcatatgt cttgtcccaa 60

gttactctaa aagagtctgg ccctgggata ttgaagccct cacagaccct cagtctgact 120

tgttctttct ctgggttttc actgagcact tctggtatgg gtgtaggctg gattcgtcag 180

ccttcaggga agggtctgga gtggctggcg cacatttggt gggatgatga taagtactat 240

aatccatccc tgaagagcca gctcacaatc tccaaggata cctccagaaa ccaggtattc 300

ctcaagatca ccagtgtgga cactgcagat gctgccactt actactgtgc tcgaactagg 360

aggtacttcc cctttgctta ctggggccaa gggacactag tcacagtctc ctca       414

<210>10

<211>381

<212>DNA

<213>鼠(Mus musculus)

<400>10

atggagacac agtctcaggt ctttgtatac atgttgctgt ggttgtctgg tgttgatgga 60

gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 120

gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt actaatgtag cctggtatca acagaaacca 180

gggcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat 240

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcaacaa tgtgcactct 300

gaagacttgg cagagtattt ctgtcaacaa tataacaccg atccgctcac gttcggagct 360

gggaccaagc tggaaatcaa a                                           381

<210>11

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400>11

gggttttcac tgagcacttc tggtatgggt gtaggc                 36

<210>12

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400>12

cacatttggt gggatgatga taagtactat aatccatccc tgaagagc    48

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400>13

actaggaggt acttcccctt tgcttac                           27

<210>14

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400>14

aaggccagtc agaatgtggg tactaatgta gcc                    33

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400>15

tcggcatcct accggtacag t                  21

<210>16

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400>16

caacaatata acaccgatcc gctcacg            27

<210>17

<211>1214

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>17

gtctacaccc cctcctcaca cgcacttcac ctgggtcggg attctcaggt catgaacggt 60

cccagccacc tccgggcagg gcgggtgagg acggggacgg ggcgtgtcca actggctgtg 120

ggctcttgaa acccgagcat ggcacagcac ggggcgatgg gcgcgtttcg ggccctgtgc 180

ggcctggcgc tgctgtgcgc gctcagcctg ggtcagcgcc ccaccggggg tcccgggtgc 240

ggccctgggc gcctcctgct tgggacggga acggacgcgc gctgctgccg ggttcacacg 300

acgcgctgct gccgcgatta cccgggcgag gagtgctgtt ccgagtggga ctgcatgtgt 360

gtccagcctg aattccactg cggagaccct tgctgcacga cctgccggca ccacccttgt 420

cccccaggcc agggggtaca gtcccagggg aaattcagtt ttggcttcca gtgtatcgac 480

tgtgcctcgg ggaccttctc cgggggccac gaaggccact gcaaaccttg gacagactgc 540

acccagttcg ggtttctcac tgtgttccct gggaacaaga cccacaacgc tgtgtgcgtc 600

ccagggtccc cgccggcaga gccgcttggg tggctgaccg tcgtcctcct ggccgtggcc 660

gcctgcgtcc tcctcctgac ctcggcccag cttggactgc acatctggca gctgaggagt 720

cagtgcatgt ggccccgaga gacccagctg ctgctggagg tgccgccgtc gaccgaagac 780

gccagaagct gccagttccc cgaggaagag cggggcgagc gatcggcaga ggagaagggg 840

cggctgggag acctgtgggt gtgagcctgg ccgtcctccg gggccaccga ccgcagccag 900

cccctcccca ggagctcccc aggccgcagg ggctctgcgt tctgctctgg gccgggccct 960

gctcccctgg cagcagaagt gggtgcagga aggtggcagt gaccagcgcc ctggaccatg 1020

cagttcggcg gccgcggctg ggccctgcag gagggagaga gagacacagt catggccccc 1080

ttcctccctt gctggccctg atggggtggg gtcttaggac gggaggctgt gtccgtgggt 1140

gtgcagtgcc cagcacggga cccggctgca ggggaccttc aataaacact tgtccagtga 1200

aaaaaaaaaa aaaa                                                   1214

<210>18

<211>241

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>18

Met Ala Gln His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu

  1               5                  10                  15

Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro

             20                  25                  30

Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg

         35                  40                  45

Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu

     50                  55                  60

Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gln Pro Glu Phe His

  65                 70                  75                  80

Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro

                 85                  90                  95

Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys

            100                 105                 110

Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His Glu Gly His Cys

        115                 120                 125

Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro

    130                 135                 140

Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala

145                 150                 155                 160

Glu Pro Leu Gly Trp Leu Thr Val Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys

                165                 170                 175

Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu

            180                 185                 190

Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val

        195                 200                 205

Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu

    210                 215                 220

Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp

225                 230                 235                 240

Val

<210>19

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>19

His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Gln Pro Ser Leu Lys Ser

  1               5                  10                  15

<210>20

<211>105

<212>PRT

<213>鼠(Mus musculus)

<400>20

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

  1               5                  10                  15

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

             20                  25                  30

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

         35                  40                  45

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

     50                  55                  60

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

 65                  70                  75                  80

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

                 85                  90                  95

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu

            100                 105

<210>21

<211>334

<212>PRT

<213>鼠(Mus musculus)

<400>21

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly

  1               5                  10                  15

Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

             20                  25                  30

Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

         35                  40                  45

Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met

     50                  55                  60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val

 65                  70                  75                  80

Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys

                 85                  90                  95

Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys

            100                 105                 110

Lys Glu Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val

        115                 120                 125

Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Thr

    130                 135                 140

Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp

145                 150                 155                 160

Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln

                165                 170                 175

Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser

            180                 185                 190

Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys

        195                 200                 205

Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile

    210                 215                 220

Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Gln Val Tyr Ile Leu Pro Pro

225                 230                 235                 240

Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

                245                 250                 255

Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly

            260                 265                 270

His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp

        275                 280                 285

Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp

    290                 295                 300

Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly Leu Lys

305                 310                 315                 320

Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys

                325                 330

<210>22

<211>214

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的小鼠/人轻链构建体

<400>22

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

  1               5                  10                  15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

             20                  25                  30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile

         35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Val His Ser

 65                  70                  75                  80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Asp Pro Leu

                 85                  90                  95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

            100                 105                 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

        115                 120                 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

    130                 135                 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145                 150                 155                 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

                165                 170                 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

            180                 185                 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

        195                 200                 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

    210

<210>23

<211>449

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的小鼠/人重链构建体

<400>23

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln

  1               5                  10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

             20                  25                  30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

         35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser

     50                  55                  60

Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val

 65                  70                  75                  80

Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr

                 85                  90                  95

Cys Ala Arg Thr Arg Arg Tyr Phe Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

        115                 120                 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

    130                 135                 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145                 150                 155                 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

                 165                170                 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

            180                 185                 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

        195                 200                 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

    210                 215                 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225                 230                 235                 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

                245                 250                 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

            260                 265                 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

        275                 280                 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

    290                 295                 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305                 310                 315                 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

                325                 330                 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

            340                 345                 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

        355                 360                 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

    370                 375                 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385                 390                 395                 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

                405                 410                 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

            420                 425                 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

        435                 440                 445

Lys

<210>24

<211>449

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的小鼠/人完整嵌合重链

<400>24

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln

  1               5                  10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

             20                  25                  30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

         35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser

     50                  55                  60

Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val

 65                  70                  75                  80

Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr

                 85                  90                  95

Cys Ala Arg Thr Arg Arg Tyr Phe Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

        115                 120                 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

    130                 135                 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145                 150                 155                 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

                165                 170                 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

            180                 185                 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

        195                 200                 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

    210                 215                 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225                 230                 235                 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

                245                 250                 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

            260                 265                 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

        275                 280                 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val

    290                 295                 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305                 310                 315                 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

                325                 330                 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

            340                 345                 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

        355                 360                 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

    370                 375                 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385                 390                 395                 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

                405                 410                 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

            420                 425                 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

        435                 440                 445

Lys

<210>25

<211>95

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>25

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

  1               5                  10                  15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

             20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

         35                  40                  45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

 65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro

                 85                  90                  95

<210>26

<211>95

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>26

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

  1               5                  10                  15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Tyr

             20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

         35                  40                  45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Pro Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

 65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp His

                 85                  90                  95

<210>27

<211>95

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>27

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

  1               5                  10                  15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

             20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

         35                  40                  45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

 65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro

                 85                  90                  95

<210>28

<211>95

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>28

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

  1               5                  10                  15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

             20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

         35                  40                  45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

 65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro

                 85                  90                  95

<210>29

<211>95

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>29

Ala Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

  1               5                  10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Trp Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr

             20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Lys Ala Pro Lys Leu Phe Ile

         35                  40                  45

Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

 65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro

                 85                  90                  95

<210>30

<211>95

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>30

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

  1               5                  10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

             20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

         35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

 65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro

                 85                  90                  95

<210>31

<211>95

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>31

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

  1               5                  10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

             20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

         35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

 65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Gly Tyr Ser Thr Pro

                 85                  90                  95

<210>32

<211>95

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>32

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

  1               5                  10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

             20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

         35                  40                  45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

 65                  70                  75                  80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro

                 85                  90                  95

<210>33

<211>95

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>33

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

  1               5                  10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr

             20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile

         35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

 65                  70                  75                  80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro

                 85                  90                  95

<210>34

<211>95

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>34

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

  1               5                  10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp

             20                  25                  30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

         35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

 65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro

                 85                  90                  95

<210>35

<211>95

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>35

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

  1               5                  10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp

             20                  25                  30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

         35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro

 65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro

                 85                  90                  95

<210>36

<211>95

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>36

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

  1               5                  10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

             20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

         35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

 65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro

                 85                  90                  95

<210>37

<211>95

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>37

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

  1               5                  10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Arg Gln Gly Ile Ser Ser Trp

             20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

         35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

 65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro

                 85                  90                  95

<210>38

<211>95

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>38

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

  1               5                  10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr

             20                  25                  30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

         35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

 65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro

                 85                  90                  95

<210>39

<211>95

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>39

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

  1               5                  10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

             20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

         35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

 65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro

                 85                  90                  95

<210>40

<211>95

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>40

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

  1               5                  10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

             20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

         35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

 65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro

                 85                  90                  95

<210>41

<211>95

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>41

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

  1               5                  10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr

             20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

         35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

 65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro

                 85                  90                  95

<210>42

<211>95

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>42

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

  1               5                  10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp

             20                  25                  30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

         35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

 65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro

                 85                  90                  95

<210>43

<211>95

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>43

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

  1               5                  10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

             20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

         35                  40                  45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

 65                  70                  75                  80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser

                 85                  90                  95

<210>44

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的蛋白构建体

<400>44

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

  1               5                  10                  15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

             20                  25                  30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

         35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

 65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Asp Pro Leu

                 85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>45

<211>96

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>45

Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln

  1               5                  10                  15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

             20                  25                  30

Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

         35                  40                  45

Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser

     50                  55                  60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

 65                  70                  75                  80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

                 85                  90                  95

<210>46

<211>100

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>46

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu

  1               5                  10                  15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Ala

             20                  25                  30

Arg Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

         35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Asn Asp Glu Lys Ser Tyr Ser Thr Ser

     50                  55                  60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val

 65                  70                  75                  80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

                 85                  90                  95

Cys Ala Arg Ile

            100

<210>47

<211>100

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>47

Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

  1               5                  10                  15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

             20                  25                  30

Gly Met Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

         35                  40                  45

Trp Leu Ala Leu Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser

     50                  55                  60

Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

 65                  70                  75                  80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

                 85                  90                  95

Cys Ala Arg Ile

            100

<210>48

<211>99

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>48

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ser Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

  1               5                  10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly

             20                  25                  30

Gly Tyr Ser Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

         35                  40                  45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

     50                  55                  60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Gln Phe

 65                  70                  75                  80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

                 85                  90                  95

Cys Ala Arg

<210>49

<211>99

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>49

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

  1               5                  10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly

             20                  25                  30

Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

         35                  40                  45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

     50                  55                  60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

 65                  70                  75                  80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

                 85                  90                  95

Cys Ala Arg

<210>50

<211>99

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>50

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

  1               5                  10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly

             20                  25                  30

Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu

         35                  40                  45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

     50                  55                  60

Leu Lys Ser Leu Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

 65                  70                  75                  80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

                 85                  90                  95

Cys Ala Arg

<210>51

<211>99

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>51

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

  1               5                  10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

             20                  25                  30

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

         35                  40                  45

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

     50                  55                  60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

 65                  70                  75                  80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

                 85                  90                  95

Cys Ala Arg

<210>52

<211>99

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>52

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

  1               5                  10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly

             20                  25                  30

Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

         35                  40                  45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

     50                  55                  60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

 65                  70                  75                  80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

                 85                  90                  95

Cys Ala Arg

<210>53

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的蛋白构建体

<400>53

Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

  1               5                  10                  15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

             20                  25                  30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

         35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser

     50                  55                  60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

 65                  70                  75                  80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

                 85                  90                  95

Cys Ala Arg Thr Arg Arg Tyr Phe Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>54

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的蛋白构建体

<400>54

Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

  1               5                  10                  15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

             20                  25                  30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

         35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Gln Pro Ser

     50                  55                  60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

 65                  70                  75                  80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

                 85                  90                  95

Cys Ala Arg Thr Arg Arg Tyr Phe Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>55

<211>330

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的蛋白构建体

<400>55

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

  1               5                  10                  15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

             20                  25                  30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

         35                  40                  45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

     50                  55                  60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

 65                  70                  75                  80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

                 85                  90                  95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

            100                 105                 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

        115                 120                 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

    130                 135                 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145                 150                 155                 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

                165                 170                 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

            180                 185                 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

        195                 200                 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

    210                 215                 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225                 230                 235                 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

                245                 250                 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

            260                 265                 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

        275                 280                 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

    290                 295                 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305                 310                 315                 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                325                 330

<210>56

<211>330

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描达：合成的蛋白构建体

<400>56

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

  1               5                  10                  15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

             20                  25                  30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

         35                  40                  45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

     50                  55                  60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

 65                  70                  75                  80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

                 85                  90                  95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

            100                 105                 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

        115                 120                 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

    130                 135                 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145                 150                 155                 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

                165                 170                 175

Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

            180                 185                 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

        195                 200                 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

    210                 215                 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225                 230                 235                 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

                245                 250                 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

            260                 265                 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

        275                 280                 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

    290                 295                 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305                 310                 315                 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                325                 330

<210>57

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的蛋白构建体

<400>57

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

  1               5                  10                  15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

             20                  25                  30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

         35                  40                  45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

     50                  55                  60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

 65                  70                  75                  80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

                 85                  90                  95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

            100                 105

<210>58

<211>214

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的蛋白构建体

<400>58

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

  1               5                  10                  15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

             20                  25                  30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

         35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

 65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Asp Pro Leu

                 85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

            100                 105                 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

        115                 120                 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

    130                 135                 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145                 150                 155                 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

                165                 170                 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

            180                 185                 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

        195                 200                 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

    210

<210>59

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的氨基酸引导序列

<400>59

Met Glu Thr Gln Ser Gln Val Phe Val Tyr Met Leu Leu Trp Leu Ser

  1               5                  10                  15

Gly Val Asp Gly

             20

<210>60

<211>449

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的蛋白构建体

<400>60

Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

  1               5                  10                  15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

             20                  25                  30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

         35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser

     50                  55                  60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

 65                  70                  75                  80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

                 85                  90                  95

Cys Ala Arg Thr Arg Arg Tyr Phe Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

        115                 120                 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

    130                 135                 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145                 150                 155                 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

                165                 170                 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

            180                 185                 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

        195                 200                 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

    210                 215                 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225                 230                 235                 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

                245                 250                 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

            260                 265                 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

        275                 280                 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

    290                 295                 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305                 310                 315                 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

                325                 330                 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

            340                 345                 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

        355                 360                 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

    370                 375                 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385                 390                 395                 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

                405                 410                 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

            420                 425                 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

        435                 440                 445

Lys

<210>61

<211>449

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的蛋白构建体

<400>61

Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

  1               5                  10                  15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

             20                  25                  30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

         35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser

     50                  55                  60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

 65                  70                  75                  80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

                 85                  90                  95

Cys Ala Arg Thr Arg Arg Tyr Phe Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

        115                 120                 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

    130                 135                 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145                 150                 155                 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

                165                 170                 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

            180                 185                 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

        195                 200                 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

    210                 215                 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225                 230                 235                 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

                245                 250                 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

            260                 265                 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

        275                 280                 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val

    290                 295                 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305                 310                 315                 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

                325                 330                 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

            340                 345                 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

        355                 360                 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

    370                 375                 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385                 390                 395                 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

                405                 410                 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

            420                 425                 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

        435                 440                 445

Lys

<210>62

<211>449

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的蛋白构建体

<400>62

Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

  1               5                  10                  15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

             20                  25                  30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

         35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Gln Pro Ser

     50                  55                  60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

 65                  70                  75                  80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

                 85                  90                  95

Cys Ala Arg Thr Arg Arg Tyr Phe Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

        115                 120                 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

    130                 135                 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145                 150                 155                 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

                165                 170                 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

            180                 185                 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

        195                 200                 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

    210                 215                 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225                 230                 235                 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

                245                 250                 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

            260                 265                 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

        275                 280                 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

    290                 295                 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305                 310                 315                 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

                325                 330                 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

            340                 345                 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

        355                 360                 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

    370                 375                 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385                 390                 395                 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

                405                 410                 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

            420                 425                 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

        435                 440                 445

Lys

<210>63

<211>449

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的蛋白构建体

<400>63

Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

  1               5                  10                  15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

             20                  25                  30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

         35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Gln Pro Ser

     50                  55                  60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

 65                  70                  75                  80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

                 85                  90                  95

Cys Ala Arg Thr Arg Arg Tyr Phe Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

        115                 120                 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

    130                 135                 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145                 150                 155                 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

                165                 170                 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

            180                 185                 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

        195                 200                 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

    210                 215                 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225                 230                 235                 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

                245                 250                 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

            260                 265                 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

        275                 280                 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val

    290                 295                 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305                 310                 315                 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

                325                 330                 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

            340                 345                 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

        355                 360                 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

    370                 375                 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385                 390                 395                 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

                405                 410                 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

            420                 425                 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

        435                 440                 445

Lys

<210>64

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引导序列肽

<400>64

Met Asp Arg Leu Thr Phe Ser Phe Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Tyr

  1               5                  10                  15

Val Leu Ser

<210>65

<211>50

<212>DNA

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>65

cacatttggt gggatgatga taagtactat caaccatccc tgaagagcca    50

<210>66

<211>138

<212>PRT

<213>鼠(Mus musculus)

<400>66

Met Asp Arg Leu Thr Phe Ser Phe Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Tyr

  1               5                  10                  15

Val Leu Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys

             20                  25                  30

Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu

         35                  40                  45

Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys

     50                  55                  60

Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr

 65                  70                  75                  80

Gln Pro Ser Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg

                 85                  90                  95

Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Ala Ala

            100                 105                 110

Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Arg Arg Tyr Phe Pro Phe Ala Tyr Trp

        115                 120                 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

    130                 135

<210>67

<211>118

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的蛋白构建体

<400>67

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

  1               5                  10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

             20                  25                  30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

         35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Asn Pro Ser Leu

     50                  55                  60

Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val Phe

 65                  70                  75                  80

Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Arg Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

                 85                  90                  95

Ala Arg Thr Arg Arg Tyr Phe Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Glu Gly Thr

            100                 105                 110

Ser Val Thr Val Thr Ser

        115

<210>68

<211>118

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的蛋白构建体

<400>68

Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

  1               5                  10                  15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

             20                  25                  30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

         35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Asn Pro Ser Leu

     50                  55                  60

Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val

 65                  70                  75                  80

Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

                 85                  90                  95

Ala Arg Thr Arg Arg Tyr Phe Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

            100                 105                 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

        115

Claims (57)

1.GITR结合分子，其包含SEQ ID NO.1中的氨基酸残基20-138或SEQ ID NO：66中的氨基酸残基20-138。

2.GITR结合分子，其包含SEQ ID NO.2中的氨基酸残基21-127。

3.GITR结合分子，其包含至少一个选自SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4或SEQ ID NO：19，和SEQ ID NO.5的互补决定区(CDR)氨基酸序列。

4.权利要求3的GITR结合分子，其包含至少两个CDR。

5.权利要求3的GITR结合分子，其包含三个CDR。

6.GITR结合分子，其包含至少一个选自SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的CDR氨基酸序列。

7.权利要求6的GITR结合分子，其包含至少两个CDR。

8.权利要求6的GITR结合分子，其包含三个CDR。

9.GITR结合分子，其包含SEQ ID NO：3、4或19、5、6、7或8所示的CDR。

10.GITR结合分子，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有SEQ ID NO.1中的氨基酸残基20-138或者SEQ ID NO：66中的氨基酸残基20-138，所述轻链可变区含有SEQ ID NO：2中的氨基酸残基21-127。

11.权利要求3-10任一项的GITR结合分子，其包含人种系重链和轻链框架区。

12.权利要求11的GITR结合分子，其中的一或多个人框架氨基酸残基被回复突变成相应的鼠氨基酸残基。

13.权利要求9的GITR结合分子，其中恒定区包含IgG2b重链恒定区。

14.权利要求9的GITR结合分子，其中所述结合分子结合人GITR。

15.权利要求9的GITR结合分子，其中所述结合分子不诱发细胞凋亡。

16.权利要求9的GITR结合分子，其中所述结合分子不阻断初级混合淋巴细胞反应。

17.权利要求9的GITR结合分子，其中所述结合分子抵消调节性T细胞对T效应细胞的抑制作用。

18.权利要求9的GITR结合分子，其中所述结合分子促进T效应细胞的增殖。

19.权利要求9的GITR结合分子，其中所述结合分子是来源于鼠的。

20.权利要求19的GITR结合分子，其中所述结合分子包含鼠IgG2a重链。

21.权利要求9的GITR结合分子，其中所述结合分子调节人GITR的活性。

22.权利要求9的GITR结合分子，其中所述结合分子减弱I-κB在T细胞中的降解。

23.权利要求11的GITR结合分子，其中所述结合分子是嵌合抗体。

24.GITR结合分子，该分子结合人T细胞和人树突状细胞上的GITR，并且结合常数(Kd)为1×10^-9或更低。

25.权利要求24的GITR结合分子，其中所述结合分子抵消调节性T细胞对T效应细胞的抑制作用。

26.权利要求24的GITR结合分子，其中所述结合分子是人源化抗体。

27.组合物，其包含权利要求1-10或13-26任一项所述的GITR结合分子和可药用载体。

28.权利要求27的组合物，还包含至少一种另外的用于治疗受试者所患癌症的治疗剂。

29.权利要求27的组合物，还包含至少一种另外的用于治疗受试者的病毒感染的治疗剂。

30.权利要求27的组合物，还包含至少一种治疗受试者所患癌症的肿瘤抗原。

31.权利要求27的组合物，还包含至少一种治疗受试者的病毒感染的病原体抗原。

32.一种消除调节性T细胞对T效应细胞的抑制作用的方法，该方法包括将人免疫细胞与权利要求1-10或13任一项所述GITR结合分子进行接触，从而消除调节性T细胞对T效应细胞的抑制作用。

33.一种调节T效应细胞中经T细胞受体诱导的信号传导的方法，该方法包括将细胞与权利要求1-10或13任一项所述GITR结合分子进行接触，从而使T效应细胞中经T细胞受体诱导的信号传导得到调节。

34.权利要求33的方法，其中所述I-κB的降解是受到调节的。

35.权利要求33的方法，其中所述T细胞是Th1细胞。

36.权利要求35的方法，其中所述T细胞是CD4+细胞。

37.权利要求35的方法，其中所述T细胞是CD8+细胞。

38.一种增强受试者免疫反应的方法，该方法包括将细胞与权利要求1-10或13-26任一项所述GITR结合分子进行接触，从而使受试者的免疫反应增强。

39.一种治疗受试者所患癌症的方法，该方法包括将细胞与权利要求1-10或13-26任一项所述GITR结合分子进行接触，从而使受试者的癌症得到治疗。

40.权利要求39的方法，其中所述癌症的类型选自胰腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结直肠癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、尿道膀胱癌、脑或中枢神经系统癌、外周神经系统癌、食管癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆管癌、小肠或附件癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤以及造血组织的癌症。

41.一种治疗受试者体内由病原体引起的感染或紊乱的方法，该方法包括将细胞与权利要求1所述GITR结合分子进行接触，从而使受试者体内由病原物引起的疾病、紊乱或状况得到治疗。

42.权利要求41的方法，其中所述病原体是选自下列的病毒：HIV、人疱疹病毒、巨细胞病毒、轮状病毒、EB病毒、水痘带状疱疹病毒、肝炎病毒(比如乙肝病毒、甲肝病毒、丙肝病毒和戊肝病毒)、副粘病毒：呼吸道合胞病毒、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒、黄病毒和流感病毒。

43.权利要求41的方法，其中所述病原体是选自下列的细菌：奈瑟氏球菌物种、链球菌物种、变异链球菌、嗜血菌物种、莫拉氏菌物种、博德特氏菌物种、分枝杆菌物种、军团菌物种、埃希氏菌物种、弧菌物种、耶尔森氏菌物种、弯曲菌物种、沙门氏菌物种、李斯特氏菌物种、螺杆菌物种、假单胞菌物种、葡萄球菌物种、肠球菌物种、梭菌物种、芽孢杆菌物种、棒杆菌物种、疏螺旋体物种、埃里希氏体物种、立克次氏体物种、衣原体物种、钩端螺旋体物种、密螺旋体物种。

44.一种调节GITR功能的方法，该方法包括在有刺激剂的情况下，将人GITR与权利要求1-10或13-26任一项所述的GITR结合分子进行接触，从而使GITR功能得到调整。

45.一种分离的核酸分子，其包含编码重链可变区的核苷酸序列，所述序列含有SEQ ID NO：9中的核苷酸58-414。

46.一种分离的核酸分子，其包含编码轻链可变区的核苷酸序列，所述序列含有SEQ ID NO：10中的核苷酸61-381。

47.一种分离的核酸分子，其包含编码至少一个CDR的核苷酸序列，所述序列选自SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO：65和SEQ IDNO.13。

48.权利要求47的分离的核酸分子，其包含编码至少两个CDR的核苷酸序列。

49.权利要求47的分离的核酸分子，其包含编码三个CDR的核苷酸序列。

50.一种分离的核酸分子，其包含编码至少一个CDR的核苷酸序列，所述序列选自SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16。

51.权利要求50的分离的核酸分子，其包含编码至少两个CDR的核苷酸序列。

52.权利要求50的分离的核酸分子，其包含编码三个CDR的核苷酸序列。

53.一种分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO：11、12或65、13、14、15和16所示的核苷酸序列。

54.重组表达载体，包含权利要求45-53任一项所述的核酸分子。

55.重组表达载体，其包含核苷酸分子，所述分子具有编码权利要求24所述结合分子的核苷酸序列。

56.宿主细胞，导入了权利要求55所述的重组表达载体。

57.一种制备结合人GITR的GITR结合分子的方法，该方法包括在培养基中培养权利要求56的宿主细胞，直至所述细胞产生结合人GITR的结合分子。

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