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CN109957020A - 一种靶向dr5的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

一种靶向dr5的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 Download PDF

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CN109957020A CN201711422905.8A CN201711422905A CN109957020A CN 109957020 A CN109957020 A CN 109957020A CN 201711422905 A CN201711422905 A CN 201711422905A CN 109957020 A CN109957020 A CN 109957020A
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seq
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张宏玲
龙丽梅
钟春颖
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Shenzhen Benta Biological Technology Co Ltd
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Abstract

本发明提供了一种靶向DR5的单链抗体，所述靶向DR5的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。本发明还提供了一种包括所述靶向DR5的单链抗体的嵌合抗原受体T细胞，所述靶向DR5的嵌合抗原受体可以专一性地靶向DR5，促进T细胞在患者体内的扩增，可以高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，更好的维持细胞的活力和杀伤力，并且对正常细胞不会造成损伤。本发明还提供了一种靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备方法和应用。

Description

一种靶向DR5的单链抗体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种靶向DR5的单链抗体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。
背景技术
癌症已成为威胁人类生命的元凶，发病率成上升趋势，人们从寻找诱导引起肿瘤细胞凋亡或者克服肿瘤细胞对凋亡耐受的角度入手，发现了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)，是能够诱导细胞凋亡的肿瘤坏死因子超家族成员。死亡受体5(death receptor5；DR5)属肿瘤坏死因子受体超家族成员(TN FRSF10B)，其胞质区含死亡结构域，主要分布于肿瘤细胞。TRAIL与细胞表面DR5结合，可诱导细胞凋亡。DR5在肝癌等多种实体瘤细胞中广泛表达，而在普通细胞中表达很微弱的细胞表面抗原。
免疫细胞治疗是现有科技中唯一有可能彻底清除癌细胞的方法，其治疗肿瘤具有特异性强、几乎无毒副作用的巨大优势弥补了传统疗法的弊端，在国内外已经用于临床治疗恶性肿瘤，嵌合抗原受体T细胞技术(CAR-T)为当前过继性细胞回输治疗技术最新的免疫细胞技术之一，因其能够在体内能激活自身免疫系统，持续性地靶向肿瘤细胞进行杀伤，最终达到清除恶性肿瘤细胞的目的而受到广泛的关注和研究。目前还未有靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备和研究。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种靶向DR5的单链抗体，以及包括所述靶向DR5的单链抗体的靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞。所述靶向DR5的嵌合抗原受体可以专一性的靶向DR5，促进T细胞在患者体内的扩增，可以高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，更好的维持嵌合抗原受体T细胞的活力和杀伤力，并且对正常细胞不会造成损伤。本发明还提供了一种靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备方法和应用。
第一方面，本发明提供了一种靶向DR5的单链抗体，所述靶向DR5的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
可选的，所述靶向DR5的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
可选的，所述靶向DR5的单链抗体编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:2具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:1。
本发明第一方面提供的所述靶向DR5的单链抗体能够与DR5蛋白发生特异性结合，对肿瘤细胞特别是表达DR5的实体瘤细胞具有较强的亲和活性。
第二方面，本发明提供了一种靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞，包括靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5，所述CAR-DR5包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向DR5的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中所述靶向DR5的单链抗体包括如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列。
其中，所述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向DR5的单链抗体的氨基酸序列的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，所述胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区的氨基酸序列的氨基端相连。
本发明中，所述胞外铰链区用于促进所述靶向DR5的单链抗体与肿瘤上的DR5结合。可选的，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、CD5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。
进一步可选的，所述胞外铰链区为CD8α铰链区。
可选的，所述CD8α铰链区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
可选的，所述CD8α铰链区的编码基因包括如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD8α铰链区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:7具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:6。
本发明中，所述跨膜区用于固定所述靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5。可选的，所述跨膜区包括CD3跨膜区、CD4跨膜区、CD8跨膜区、CD28跨膜区中的一种或多种的组合。
进一步可选的，所述跨膜区为CD8跨膜区。
可选的，所述CD8跨膜区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
可选的，所述CD8跨膜区的编码基因包括如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD8跨膜区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:9具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:8。
本发明中，所述胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路。可选的，所述胞内信号区包括4-1BB信号区、CD3ζ信号区、ICOS信号区、CD27信号区、OX40信号区、CD28信号区、IL1R1信号区、CD70信号区、TNFRSF19L信号区中的一种或多种的组合。
可选的，所述胞内信号区为从氨基端到羧基端顺次连接的CD28信号区和CD3ζ信号区。
可选的，所述CD28信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。
可选的，所述CD28信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD28信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:11具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:10。
可选的，所述CD3ζ信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
可选的，所述CD3ζ信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD3ζ信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:13具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:12。
可选的，所述CAR-DR5的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。此时，如SEQ ID NO：12的氨基酸序列所示的CD3ζ信号区作为所述T细胞的抗原特异性信号(即，第一信号)，如SEQ ID NO：10的氨基酸序列所示的CD28信号区作为所述T细胞的共刺激信号，在它们的共同作用下，T细胞在识别抗原后被完全活化。特别地，选用如SEQ ID NO：10的CD28信号区作为共刺激信号，可以更好地提升后续T细胞的扩增能力、杀伤活力。
可选的，所述CAR-DR5的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
可选的，所述CAR-DR5的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:4具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:3。
进一步地，所述CAR-CD22的编码基因包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
本发明第二方面提供的所述靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞，包括靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5，该受体可供所述T细胞专一性地靶向表达DR5的肿瘤细胞，在CAR-DR5与DR5结合后，所述T细胞的胞内信号区被激活，促进T细胞在患者体内的扩增，并高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞几乎不会造成损伤。
第三方面，本发明提供了一种重组病毒载体，所述重组病毒载体包括如第二方面所述的靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞的CAR-DR5的编码基因。
可选的，所述CAR-DR5的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
可选的，所述CAR-DR5的编码基因包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。如SEQID NO：5所示的核苷酸序列与如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列相比，多了连接肽的编码基因。所述信号肽的编码基因可以较好地指导所述嵌合抗原受体CAR-CD22表达到细胞表面。
可选的，所述重组病毒载体中的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
进一步可选的，所述病毒载体为慢病毒载体。
本发明第三方面提供的所述重组病毒载体可以用于靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备，有利于促进T细胞在患者体内的扩增，可以高效且特异性的杀伤肿瘤细胞。
第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如第三方面所述的重组病毒载体。
所述宿主细胞用于组装如第三方面所述的重组病毒载体，使其具有感染性。
可选地，所述宿主细胞可以包括HEK293T细胞、293细胞、293T细胞、293FT细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、COS1细胞或COS7细胞等，但不限于此。
进一步可选的，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
第五方面，本发明提供了一种靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：
(1)提供靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向DR5的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向DR5的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；
(2)将所述CAR-DR5的编码基因插入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-DR5重组质粒；
(3)将所述pWPXLD-CAR-DR5重组质粒与包膜质粒、包装质粒共转染宿主细胞，得到重组慢病毒；
(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞；
(5)分离并获得靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞。
上述“从5’端到3’端顺次连接”具体为：所述信号肽的编码基因序列的3’端与所述靶向DR5的单链抗体的编码基因的5’端相连，所述靶向DR5的单链抗体的编码基因的3’端与所述胞外铰链区的编码基因的5’端相连，所述胞外铰链区的编码基因的3’端与所述跨膜区的编码基因的5’端相连，所述跨膜区的编码基因的3’端与所述胞内信号区的编码基因的5’端相连。
在本发明中所述信号肽用于指导所述嵌合抗原受体CAR-DR5表达到细胞表面，所述信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。
可选的，所述信号肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。
可选的，所述信号肽的编码基因包括如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列。
可选的，所述信号肽的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:15具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:14。
所述胞外铰链区、跨膜区、胞内信号区的具体选择及相应的编码基因序列如本发明第二方面部分所述，这里不再赘述。
可选地，所述CAR-DR5的编码基因序列如SEQ ID NO：5所示。如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列与如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列相比，多了所述连接肽的编码基因，但在所述嵌合抗原受体CAR-DR5表达到细胞表面时，所述信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。因此，在翻译成的所述嵌合抗原受体CAR-DR5的氨基酸序列中并未带有如SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列。
所述CAR-DR5的编码基因插入到pWPXLD载体中BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pWPXLD载体的EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-DR5的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-DR5的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamH1酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoR1酶切位点相连。
可选的，所述包膜质粒为PMD2G，所述包装质粒为psPAX2，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
所述包膜质粒PMD2G编码水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳，所述水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳协助重组慢病毒向细胞膜粘附，并保持重组慢病毒的感染性。
本发明所述重组慢病毒可以进一步含有来自其它病毒的被膜蛋白。例如，作为这种蛋白质，最好是来自感染人类细胞的病毒被膜蛋白。对这种蛋白质没有特别的限定，可例举出逆转录病毒的兼嗜性病毒手皮膜蛋白等，例如可以使用来自小鼠白血病病毒(MuMLV)4070A株的被膜蛋白。另外，也可以使用来自MuMLV 10Al的被膜蛋白。另外，作为疱疹病毒科的蛋白，可以举出例如，单纯性疱疹病毒的gB、gD、gH、gp85蛋白，EB病毒的gp350、gp220蛋白等。作为嗜肝病毒科的蛋白，可以例举出B型肝炎病毒的S蛋白等。所述被膜蛋白还可为麻疹病毒糖蛋白与其他单链抗体融合后形成。
重组慢病毒的包装通常采用瞬时转染或采用细胞系包装。瞬时转染时可以用作包装细胞使用的人类细胞株，例如包括293细胞、293T细胞、293FT细胞、293LTV细胞、293EBNA细胞及其他的从293细胞分离的克隆；SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞、HeLa细胞、HT1080细胞、TE671细胞等。也可以采用来源于猴子的细胞株，例如，COS1细胞、COS7细胞、CV-1细胞、BMT10细胞等。而且，通常采用的磷酸钙和PEI转染试剂，还有一些转染试剂如Lipofectamine2000、FuGENE和S93fectin也被经常使用。
重组慢病毒的包装也采用一些慢病毒包装细胞系，如使用最普遍的Env糖蛋白、VSVG蛋白或HIV-1gag-pol蛋白所产生的稳定细胞系。
为了安全起见，大规模使用的慢病毒载体系统都是采用分割基因组的方法，即将起不同辅助功能的基因定位于不同的质粒。目前有四质粒系统(编码gag-pol基因、Rev基因、VSVG基因、SIN转移基因分别位于四个不同的质粒)、三质粒系统(去掉了编码Rev基因的质粒，在gag-pol质粒中gag-pol基因采用了在人细胞中偏爱性的密码子)和二质粒系统(慢病毒载体包装所必需的辅助基因位于同一个质粒上，这些辅助基因是单一的基因序列；另一个则是转基因质粒)。也有超过四质粒系统的慢病毒包装系统在使用。
可选的，步骤(4)中，所述CD3阳性T淋巴细胞是从人源外周血单个核细胞中分离获得。
可选的，所述人源外周血单个核细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。
进一步可选的，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
具体的，所述CD3阳性T淋巴细胞的获得过程如下：向外周血单个核细胞中按一定比例加入CD3/CD28免疫磁珠，孵育一段时间后，放入磁铁进行筛选，得到免疫磁珠包被的CD3阳性T淋巴细胞，去除磁珠后，获得CD3阳性T淋巴细胞。
第六方面，本发明提供了一种如第一方面所述的靶向DR5的单链抗体、如第二方面所述的或如第五方面所述的制备方法制得的靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞、如第三方面所述的重组病毒载体或如第四方面所述的宿主细胞在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
所述应用具体为：提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的靶向DR5的单链抗体、如第二方面所述的靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞、如第三方面所述的重组病毒载体、如第四方面所述的宿主细胞中的一种或多种。
本发明的有益效果：
本发明提供的靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞可以专一性的靶向DR5，促进T细胞在患者体内的扩增，能够高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，同时DR5在肿瘤细胞中广泛表达，而在普通细胞中表达很微弱，因此靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞可以特异性的结合肿瘤细胞，对肿瘤细胞产生杀伤效果，对正常细胞不会造成损伤。
附图说明
图1为本发明实施例提供的pWPXLd-CAR-DR5重组质粒的质粒图谱。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例一
一种靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5的基因序列
分别制备信号肽、靶向DR5的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、CD28信号区和CD3ζ信号区的编码基因，所述信号肽的编码基因如SEQ ID NO：15所示，所述靶向DR5的单链抗体的编码基因如SEQ ID NO：2所示，所述CD8α铰链区的编码基因如SEQ ID NO：7所示，所述CD8跨膜区的编码基因如SEQ ID NO：9所示，所述CD28信号区的编码基因如SEQ ID NO：11所示，所述CD3ζ信号区的编码基因如SEQ ID NO：13所示。
通过PCR的方法将上述信号肽、靶向DR5的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、CD28信号区和CD3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起，得到靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5的编码基因，所述CAR-DR5的编码基因如SEQ ID NO：5所示。
(2)构建pWPXLd-CAR-DR5重组质粒
将CAR-DR5的编码基因插入到pWPXLD载体的BamH1和EcoR1酶切位点之间，并在pWPXLD载体EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-DR5的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-DR5的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamH1酶切位点相连，3’端还可加入有终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoR1酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建pWPXLd-CAR-DR5重组质粒，如图1所示为pWPXLd-CAR-DR5重组质粒。
(3)重组慢病毒构建
将pWPXLd-CAR-DR5重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者共转染入培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照100μl，2×108个/mL分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到重组慢病毒。
(4)靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备
a)PBMC(外周血单个核细胞)的分离
PBMC来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。最好是来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
抽取病人血液，送样至血液分离室；采集外周血单个核细胞，Ficoll离心分离后取中间层细胞；经PBS洗涤后，得到PBMC。
b)免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞
取上述PBMC，加入不含血清的基础培养基，配成细胞悬液；按磁珠与细胞的比例为3:1，加入CD3/CD28免疫磁珠，室温孵1-2h；采用磁铁对孵育好磁珠的细胞进行筛选；PBS洗涤，去除免疫磁珠后，得到CD3阳性T淋巴细胞。
c)病毒转染法制备抗原特异性T淋巴细胞
取上述经过免疫磁珠分离法得到的CD3阳性T淋巴细胞，加入与CD3阳性细胞数相应的病毒滴度的所述重组慢病毒进行培养。
培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×106个/mL，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×106个/mL，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，得到靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞，并保存在回输专用的细胞冻存液中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳宾德生物技术有限公司
<120> 一种靶向DR5的单链抗体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Thr Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
115 120 125
Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val
130 135 140
Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His Tyr Met
145 150 155 160
His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile Gly Arg
165 170 175
Val Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp
180 185 190
Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Pro Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu
195 200 205
Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Asn Gly Ala Tyr Tyr Arg Ser Asp Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
245
<210> 2
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacattgtgc tcacacaatc tacaccttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca acagttttat gcactggttc 120
cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 180
ggcatccccg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 240
cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga agatccctac 300
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaaggtggcg gtggctcggg cggtggtggg 360
tcgggtggcg gcggatctga ggtccagctg cagcagtctg gacctgacct ggtgaagcct 420
ggggcttcag tgaagatatc ctgcaaggct tctggttact cattcactgg ccactacatg 480
cactgggtga agcagagcca tggacagagc cttgagtgga ttggacgtgt taatcctaac 540
aatggtggta ctggctacaa ccagaagttc aaggacaagg ccatattaac tgtagacaag 600
ccatccagca cagcctacat ggagctccgc agcctgacat ctgaggactc tgcggtctat 660
tactgtgcaa gaaacggagc ctactatagg tccgatggga actactttga ctactggggc 720
caaggcacca ctctcacagt ctcctca 747
<210> 3
<211> 498
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Thr Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
115 120 125
Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val
130 135 140
Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His Tyr Met
145 150 155 160
His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile Gly Arg
165 170 175
Val Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp
180 185 190
Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Pro Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu
195 200 205
Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Asn Gly Ala Tyr Tyr Arg Ser Asp Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
245 250 255
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
260 265 270
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
275 280 285
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
290 295 300
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Phe Trp
305 310 315 320
Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val
325 330 335
Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu
340 345 350
Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr
355 360 365
Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr
370 375 380
Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys
385 390 395 400
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
405 410 415
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
420 425 430
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
435 440 445
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
450 455 460
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
465 470 475 480
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
485 490 495
Pro Arg
<210> 4
<211> 1494
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacattgtgc tcacacaatc tacaccttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca acagttttat gcactggttc 120
cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 180
ggcatccccg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 240
cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga agatccctac 300
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaaggtggcg gtggctcggg cggtggtggg 360
tcgggtggcg gcggatctga ggtccagctg cagcagtctg gacctgacct ggtgaagcct 420
ggggcttcag tgaagatatc ctgcaaggct tctggttact cattcactgg ccactacatg 480
cactgggtga agcagagcca tggacagagc cttgagtgga ttggacgtgt taatcctaac 540
aatggtggta ctggctacaa ccagaagttc aaggacaagg ccatattaac tgtagacaag 600
ccatccagca cagcctacat ggagctccgc agcctgacat ctgaggactc tgcggtctat 660
tactgtgcaa gaaacggagc ctactatagg tccgatggga actactttga ctactggggc 720
caaggcacca ctctcacagt ctcctcaacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 780
gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 840
gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 900
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcttttgg 960
gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct tgctatagct tgctagtaac agtggccttt 1020
attattttct gggtgaggag taagaggagc aggctcctgc acagtgacta catgaacatg 1080
actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag cattaccagc cctatgcccc accacgcgac 1140
ttcgcagcct atcgctcccg cgtgaaattc agccgcagcg cagatgctcc agcctacaag 1200
caggggcaga accagctcta caacgaactc aatcttggtc ggagagagga gtacgacgtg 1260
ctggacaagc ggagaggacg ggacccagaa atgggcggga agccgcgcag aaagaatccc 1320
caagagggcc tgtacaacga gctccaaaag gataagatgg cagaagccta tagcgagatt 1380
ggtatgaaag gggaacgcag aagaggcaaa ggccacgacg gactgtacca gggactcagc 1440
accgccacca aggacaccta tgacgctctt cacatgcagg ccctgccgcc tcgg 1494
<210> 5
<211> 1554
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccctgcctg tgacagccct gctgctgcct ctggctctgc tgctgcatgc cgctagaccc 60
gacattgtgc tcacacaatc tacaccttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 120
atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca acagttttat gcactggttc 180
cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 240
ggcatccccg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 300
cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga agatccctac 360
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaaggtggcg gtggctcggg cggtggtggg 420
tcgggtggcg gcggatctga ggtccagctg cagcagtctg gacctgacct ggtgaagcct 480
ggggcttcag tgaagatatc ctgcaaggct tctggttact cattcactgg ccactacatg 540
cactgggtga agcagagcca tggacagagc cttgagtgga ttggacgtgt taatcctaac 600
aatggtggta ctggctacaa ccagaagttc aaggacaagg ccatattaac tgtagacaag 660
ccatccagca cagcctacat ggagctccgc agcctgacat ctgaggactc tgcggtctat 720
tactgtgcaa gaaacggagc ctactatagg tccgatggga actactttga ctactggggc 780
caaggcacca ctctcacagt ctcctcaacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 840
gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 900
gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 960
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcttttgg 1020
gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct tgctatagct tgctagtaac agtggccttt 1080
attattttct gggtgaggag taagaggagc aggctcctgc acagtgacta catgaacatg 1140
actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag cattaccagc cctatgcccc accacgcgac 1200
ttcgcagcct atcgctcccg cgtgaaattc agccgcagcg cagatgctcc agcctacaag 1260
caggggcaga accagctcta caacgaactc aatcttggtc ggagagagga gtacgacgtg 1320
ctggacaagc ggagaggacg ggacccagaa atgggcggga agccgcgcag aaagaatccc 1380
caagagggcc tgtacaacga gctccaaaag gataagatgg cagaagccta tagcgagatt 1440
ggtatgaaag gggaacgcag aagaggcaaa ggccacgacg gactgtacca gggactcagc 1500
accgccacca aggacaccta tgacgctctt cacatgcagg ccctgccgcc tcgg 1554
<210> 6
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 7
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 8
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 9
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 10
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser
65
<210> 11
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 120
aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 180
cgcgacttcg cagcctatcg ctcc 204
<210> 12
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 13
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctaca agcaggggca gaaccagctc 60
tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120
cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180
gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240
agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 300
tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg 336
<210> 14
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro
20
<210> 15
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gccctgcctg tgacagccct gctgctgcct ctggctctgc tgctgcatgc cgctagaccc 60

Claims (10)

1.一种靶向DR5的单链抗体，其特征在于，所述靶向DR5的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的靶向DR5的单链抗体，其特征在于，所述靶向DR5的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
3.一种靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，包括靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5，所述CAR-DR5包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向DR5的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中所述靶向DR5的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区，所述跨膜区包括CD8跨膜区，所述胞内信号区包括从氨基端到羧基端顺次连接的CD28信号区和CD3ζ信号区。
5.如权利要求4所述的靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述CAR-DR5的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
6.如权利要求3或4所述的靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述CAR-DR5的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
7.一种重组病毒载体，其特征在于，所述重组病毒载体包括如权利要求3-6任一项所述的靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞的CAR-DR5的编码基因。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求5或6任一项所述的重组病毒载体。
9.一种靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括：
(1)提供靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向DR5的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向DR5的单链抗体的编码基因包括如SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列；
(2)将所述CAR-DR5的编码基因插入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-DR5重组质粒；
(3)将所述pWPXLD-CAR-DR5重组质粒与包膜质粒、包装质粒共转染宿主细胞，得到重组慢病毒；
(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞；
(5)分离并获得靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞。
10.一种如权利要求1-2任一项所述的靶向DR5的单链抗体、如权利要求3-6任一项所述的或如权利要求9所述的制备方法制得的靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞、或如权利要求7所述的重组病毒载体或如权利要求8所述的宿主细胞在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
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