CN109395073A

CN109395073A - 一种免疫增强型重组prrsv病毒样颗粒亚单位疫苗

Info

Publication number: CN109395073A
Application number: CN201811321685.4A
Authority: CN
Inventors: 陈瑞; 杜恩岐; 董剑辉
Original assignee: Shaanxi Lihua Norwich Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shaanxi Lihua Norwich Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-11-07
Filing date: 2018-11-07
Publication date: 2019-03-01
Anticipated expiration: 2038-11-07
Also published as: CN109395073B

Abstract

本发明公开了一种免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗，由PRRSV病毒样颗粒和复合免疫佐剂组成。本发明通过基因工程的手段，改造了PRRSV GP5‑M基因，通过构建杆状病毒表达载体制备得到具有高免疫原性的PRRSV病毒样颗粒。另外，本发明通过免疫佐剂的改进，得到了一种免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗，该亚单位疫苗具有更好的免疫效果。

Description

一种免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗

技术领域

本发明属于兽用生物技术领域，具体涉及一种免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS) 是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus，PRRSV)引起的一种高度传染性疾病，因其临床上常常造成耳部发绀，又称蓝耳病，，主要引起母猪早产、流产、产死胎或木乃伊胎，仔猪和育成猪出现呼吸道疾病，发病率与死亡率高｡该病最初于20世纪80年代在美国被首先报道，1996年起在我国发现首例临床病毒分离报道，2005年底出现高致病性PRRSV的大面积爆发。PRRSV是呈单股正链的RNA 病毒，属于动脉炎病毒科，根据抗原性和基因序列的不同，将全球的PRRSV 分为以 VR-2332 为代表的美洲型(North American，NA)和以Lelystad virus (LV)为代表的欧洲型(European，EU)。我国流行的PRRSV 主要是经典美洲株和变异型美洲株，但近几年欧洲株也屡有发现。此外，PRRSV 变异性和重组能力强，不时有新分支出现，比如最近报道的NADC30-Like亚型与GM2亚型呈现流行趋势逐渐上升的态势。PRRS 对全球养猪业都是巨大的威胁，2005年PRRS对美国生猪养殖造成的经济损失是5.6亿美元，其中母猪繁殖阶段损失6700万美元，断奶仔猪是2.01亿美元，而生长育肥猪损失最多，达到了2.92亿美元｡2013年，Holtkampra估算PRRS对美国生猪养殖造成的经济损失达到了6.63亿美元，这比2005年高出了10%｡欧洲2012年的数据显示PRRS导致的经济损失是126欧元/头，，这比2005年美国的数据(121美元/头)还要高｡

PRRSV是单股正链、不分节段、有囊膜的RNA 病毒，病毒粒子大小约为50-70 纳米（nanometer，nm），基因组全长为14.9-15.5 kb，含有至少10 个开放阅读框（open readingframe，ORF）。ORF1a 区域编码非结构蛋白（non-structural protein， NSP）NSP1α/β 至NSP8，ORF1b 区域则编码NSP9至NSP12； ORF2a、ORF2b 和ORFs3-7，编码与病毒粒子结合的结构蛋白（Structural protein，SP）GP2、E、GP3、GP4、ORF5a、GP5、M与N，它们是由巢式3’共末端的一系列亚基因组mRNAs 翻译而来的；在10个ORFs两侧分别是5’端非编码区和3’端非编码区。PRRSV的结构蛋白包含GP5-M二聚体蛋白、GP2-GP3-GP4复合体蛋白和具有疏水性的E蛋白与ORF5a蛋白，它们与病毒的侵入及出芽密切相关。GP5蛋白（含大约200个氨基酸）是PRRSV中具有高变异特性的结构蛋白，其与M蛋白（含大约175个氨基酸）通过二硫键结合形成的GP5-M二聚体蛋白可与宿主细胞的唾液酸粘附素受体结合而使病毒吸附到宿主细胞表面，而病毒的内化步骤也与GP5密切相关，最近研究发现宿主细胞中如果存在大量表达的GP5蛋白时，可介导产生β干扰素以抑制PRRSV的增殖；已有研究报道GP5与M可形成病毒样颗粒，病毒样颗粒(virus-like particles， VLPs)是某种病毒的一个或多个结构蛋白装配成的空心颗粒，它既有类似天然病毒的稳定性和免疫原性，又具备携带外源蛋白或多肽的潜能，不含有病毒的核酸，没有感染性，使其有望成为构建多价疫苗的良好载体｡

目前市场上的PRRS疫苗都是传统的灭活疫苗与弱毒活疫苗，主要研发生产企业包含德国勃林格、西班牙海博莱、法国梅里亚、荷兰英特威、山东齐鲁、广东永顺、中牧集团等单位。然而尚无一种疫苗能够让养猪业彻底摆脱PRRSV对生猪的损害，市场亟需更为安全更为高效的PRRS疫苗，而新型基因工程疫苗是未来动物疫苗的发展方向｡2010年Nam 等公开了含有PPRSV GP5和M蛋白的病毒样颗粒，上述两种蛋白通过重组杆状病毒表达，再组装而成病毒样颗粒，可用于制备疫苗，同时有研究认为PPRSV的GP5和M蛋白是组成病毒粒子所不可或缺的部分｡2011年吕风林等将编码PRRSV的M蛋白､N蛋白和GP5蛋白的基因分别克隆到真核表达载体（如pHWD2000､pOPI3CAT､pCAGGS､pcDNA6/TR､ pCMV-HA）中同时转染同一细胞系表达3种蛋白能够形成病毒样颗粒，并能产生良好的细胞免疫和体液免疫｡2012年李杨将PRRSV的ORF5和ORF6两个基因或ORF5､ORF6和ORF7三个基因或ORF5､ORF6､ORF7和NSP2a四个基因组合后都可以在杆状病毒表达载体中形成病毒样颗粒｡2016年Rodriguez等将PRRSV的GP2\GP3\GP4\E\GP5\M表达后制备为病毒样颗粒。

发明内容

基于目前国内PRRSV疫苗发展的情况，本发明旨在提供一种免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗，其一方面能够丰富PRRSV疫苗的种类，另一方面，通过基因改造提高了病毒样颗粒的免疫原性，其相比现有的GP5-M病毒样颗粒具有更高的免疫原性和动物保护率，能够更好的实现动物保护，第三方面，通过佐剂的改进，能够使得该病毒样颗粒疫苗能够获得更好的免疫效果。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术手段：

一种免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗，由PRRSV病毒样颗粒和复合免疫佐剂组成。

所述免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：将重组杆状病毒Ac-PRRSVGP5-M按5-10%比例接种健康sf9细胞，27℃培养4-5天后，反复冻融收集细胞及上清，于4℃条件下12000r/min离心20分钟后收集上清，然后使用硫酸铵沉淀法将目的蛋白沉淀，重悬后使用二乙烯亚胺（BEI）对蛋白溶液进行36-48小时灭活，之后使用等量硫代硫酸钠中和，采用0.9%的生理盐水调整至蛋白含量为100μg/mL，最后与佐剂混合乳化配制疫苗，置于2-8℃备用。

所述重组杆状病毒Ac-PRRSVGP5-M的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，表达PRRSV GP5与M蛋白的重组杆状病毒的构建，通过下述步骤制备获得：

（1）PRRSV的免疫原性基因GP5与M的串联基因GP5M的人工修饰合成：比对分析2006-2016年间PRRSV流行毒株的基因序列，根据田间流行优势毒株氨基酸特征与密码子的偏嗜性，并根据免疫原性的需要，对其进行了基因改造后，人工合成GP5-M基因序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；

（2）杆状病毒转移载体的构建：以pBAC5质粒为骨架，通过Xba I与BamH I酶切载体与插入片段，然后通过T4连接酶于16℃过夜连接，转化筛选阳性克隆，提取重组质粒，酶切鉴定，获得杆状病毒转移载体pBAC-PRRSVGP5-M；

步骤二，重组杆状病毒Ac-PRRSVGP5-M的构建：

（1）重组杆粒rBac-PRRSVGP5-M的获得与鉴定：取测序鉴定正确的杆状病毒转移载体pBAC-PRRSVGP5-M质粒DNA与DH10 Bac感受态细胞混合，冰浴30分钟后，于42℃进行45秒水浴热激，然后冰浴5分钟，加入SOC液体培养基，37℃振荡培养2小时，按10倍系列稀释之后，各梯度菌液涂布LB平板，使用life公司的筛选试剂盒筛选纯化阳性菌落，提取重组杆粒rBac-PRRSVGP5-M。

（2）重组杆状病毒Ac-PRRSVGP5-M的获得：将上一步提取的重组杆粒rBac-PRRSVGP5-M，使用脂质体转染试剂Lipofectamine3000，转染至sf9细胞中，在28℃持续培养观察，于转染后24小时、48小时与72小时利用荧光显微镜观察重组杆状病毒绿色荧光信号，并于转染后72小时收集细胞上清，得到重组杆状病毒，然后将其再次接种健康sf9细胞扩大培养，收集病毒液作为毒种置于-70℃保存备用。

所述佐剂是本发明人在先申请的发明专利CN 2017100589467（CN 106798920 B，授权公告日：2018年10月11日）中的复合免疫佐剂的基础上，根据亚单位疫苗的特点进行组成优化后得到，其具体配方和制备方法如下：一种复合免疫佐剂，所述复合免疫佐剂由以下重量百分含量的组分组成：蜂胶提取物 1%，鱼腥草多糖 1.5%，丙氨酸0.5%，银杏叶黄酮1.5%，聚乙烯蓖麻油 7%，Span80 7%，聚乙二醇 3.5%，角鲨烯8%，注射用大豆油 40%，注射用水30%；

所述复合免疫佐剂的制备方法包括如下步骤：

步骤一，按重量百分含量配比称取各原料；

步骤二，将称取的蜂胶提取物、鱼腥草多糖和丙氨酸与注射用水混合，搅拌至其充分溶剂，得到水相；

步骤三，将称取的银杏叶黄酮与角鲨烯、注射用大豆油混合，搅拌均匀，得到油相；

步骤四，将称取的聚乙烯蓖麻油、Span80与聚乙二醇混合，然后加入步骤三所制得的油相，在650rpm的转速下搅拌4min，得到均匀的油相混合物；

步骤五，将步骤四制得的油相混合物在580的转速下搅拌，边搅拌边以每分钟150微升的速度滴加步骤二所制得的水相，待形成澄清透明的纳米乳后，改为每分钟600微升继续添加步骤二所制得的水相，直至水相全部滴加完成，即得到所述的复合免疫佐剂。

所述蜂胶提取物采用如下方法制备得到：

①称取100g研碎后蜂胶，用滤纸包成5包，每包20g，放入烧杯中；

②烧杯中加入400mL的水，水浴加热，加热温度为75℃，加热时间为1h；

③停止加热后，将包好的5包蜂胶取出放入漏斗中滤干液体，滤出的液体倒入烧杯中，冷却后，置于 4℃冰箱中保存过夜；

④待水提物液面出现凝结成块的蜂蜡，用布氏漏斗对水提物进行抽滤除掉蜂蜡，滤液进行真空冷冻干燥，干燥至含水量低于5%，即得到所述的蜂胶提取物。

鱼腥草多糖和银杏叶黄酮采用本发明人在先申请的发明CN 2017100589467中记载的方法制备得到。

基于以上技术方案，本发明具有如下优点和效果：

第一，本发明对2006-2016年间田间流行PRRSV毒株基因序列进行比对分析与遗传进化分析，筛选出田间流行优势毒株基因序列，进行人工修饰后基因合成，具有更为广谱的交叉免疫原性。

第二，本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒样颗粒具有高免疫原性，制备的病毒样颗粒疫苗相对于现有灭活疫苗，其免疫保护率更高，能产生对PRRSV强毒感染的有效保护。本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒样颗粒疫苗相对于现有的活疫苗更加安全有效，不存在毒力返强以及造成重组病毒出现的风险。

第三，通过对PRRSV GP5和M蛋白进行了优化，相对于大多数报道的GP5蛋白，截去了“TFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFL”、“ YVLSSIYAVCALAALICFVI”等片段,将氨基酸片段中的“VVLDGS”突变为“EELDGS”，将氨基酸片段的“EKGGKV”突变为“EKEEKV”，通过研究发现，改造后的序列能够有效的提高了病毒样颗粒表达的稳定性和蛋白产量，提高了病毒样颗粒的免疫原性，能够更好的刺激免疫动物产生保护抗体，极大地提高了抗体水平和动物保护率。

第四，本发明采用刚性linker （EAAAK）将细菌鞭毛蛋白Tflg片段与PRRSV GP5蛋白进行连接，其相比柔性linker（GGGGS），能够提高同样培养条件下的病毒的滴度以及免疫原性，采用刚性linker连接Tflg，使得鞭毛蛋白能够更好的暴露在病毒粒子表面，刺激了机体更早的产生抗体，并且本发明的抗体效价要明显高于柔性linker的效价，高达其两倍，说明本发明的疫苗具有更好的免疫保护效果。

第五，本发明对免疫佐剂进行了优化和调整，在本发明人在先研发的一种能够显著地提高动物的免疫应答水平，增强动物的免疫保护效果，特别是有效提高PRRSV疫苗的免疫效果的免疫佐剂（参见CN 106798920 B，授权公告日：2018年10月11日）的基础上，为了适应亚单位疫苗的生产和免疫效果，发明人对其进行了优化和调整，具体在原有配方的基础上增加了蜂胶提取物，其中选取鱼腥草多糖、丙氨酸和银杏叶黄酮作为复合免疫佐剂的主要活性成分，三者相辅相成，协同增效，有效地提高了机体的免疫应答水平，提高了免疫保护效果，同时增加的蜂胶提取物也能强化动物的免疫效果，通过蜂胶提取物的加入和用量的调整，取得了预料不到的免疫增强效果。

综上所述，本发明通过基因工程的手段，改造了PRRSV GP5-M基因，通过构建杆状病毒表达载体制备得到具有高免疫原性的PRRSV病毒样颗粒。另外，本发明通过免疫佐剂的改进，得到了一种免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗，该亚单位疫苗具有更好的免疫效果。

附图说明

图1：是pBAC-GP5-M杆状病毒表达载体结构示意图｡

图2：是间接免疫荧光分析重组杆状病毒Ac-PRRSVGP5-M感染sf9细胞后目的蛋白的表达示意图｡

图3：重组杆状病毒Ac-PRRSVGP5-M感染sf9细胞后形成的病毒样颗粒的电镜图｡

具体实施方式

根据下述实施例，可以更为清楚地理解本发明。本发明所述技术步骤，如未特殊说明，均为本领域的常规技术手段，或为商业化或是已公开的试剂材料。

实施例1：

表达人工修饰合成的PRRSV GP5与M蛋白的重组杆状病毒Ac-PRRSVGP5-M的构建

1. PRRSV GP5与M基因序列的合成：

基于2006-2016年间田间流行PRRSV病毒株的全基因序列，使用DNAMAN、MEGA5.1等软件进行比对分析，筛选田间流行优势毒株的基因序列，经过人工修饰与密码子优化之后，送基因合成公司进行基因序列合成，得到GP5与M的串联序列GP5-M。

2. 重组转移载体的构建与鉴定：

含有目的基因序列GP5-M的质粒以及载体pBAC5分别进行Xba I/BamHI双酶切，回收纯化之后，使用T4连接酶进行连接反应，化学法转化至DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆后提取质粒，通过菌落PCR与质粒酶切鉴定，获得成功构建的重组转移载体pBAC-PRRSVGP5-M（载体示意图可见图2）。

3. 重组Bacmid的构建与鉴定

将重组转移载体pBAC-PRRSVGP5-M的质粒DNA分别转化至DH10Bac感受态细胞，转移载体与感受态细胞内的骨架载体通过同源重组，获得包含PRRSV目的基因的重组杆粒rBac-PRRSVGP5-M。

4. 重组杆状病毒的制备

4.1重组杆粒转染昆虫细胞：sf9细胞铺板至六孔板，待其细胞汇合度至80%时，用脂质体转染试剂Lipofectamine3000进行转染，具体如下：

4.1.1 将2μg重组杆粒rBac-PRRSVGP5-M和2μL p3000加入到250μL不含血清和抗生素的opti-MEM培养液中，轻轻混匀；

4.1.2将4μl Lipofectamine3000脂质体加入到250μl不含血清和抗生素的opti-MEM培养液中，轻轻混匀；

4.1.3将步骤4.1.1和步骤4.1.2的液体混合均匀后室温静置10-15分钟；

4.1.4 将步骤4.1.3混合液逐滴滴入六孔板sf9细胞中，然后将六孔板sf9细胞置27℃恒温培养并持续观察。

4.2重组杆状病毒的收获及扩增

4.2.1重组杆状病毒的收获:

对转染后的细胞每天进行细致观察，当细胞出现变大、变不规则甚至开始上漂至液面等情况时，收集细胞及上清，提取样品RNA并进行RT-PCR检测，鉴定目的基因GP5是否存在，一般在转染后第4-5天可见明显细胞病变时，反复冻融收集的细胞与上清，于4℃按12000r/min离心10分钟，收集上清并标记为P1代重组杆状病毒；

4.2.2重组杆状病毒的扩增:

将P1代重组杆状病毒按照1:10接种sf9细胞，于27℃培养4-5天，待细胞病变明显产生时，收获P2代重组杆状病毒；按同样方法获得P3代以及更高代次重组杆状病毒，收集的重组杆状病毒于-70℃保存备用。

4.2.3重组杆状病毒的滴度测定

将P1、P2与P3代病毒分别进行10倍系列稀释，然后接种96孔板sf9细胞，每个稀释度接种8孔，置于27℃恒温培养并每天观察细胞病变情况，然后按Karber法计算病毒TCID₅₀值，得出重组杆状病毒Ac-PRRSVGP5-M的P1、P2、P3代病毒滴度在10^4.875TCID₅₀/ml～10^6.175TCID₅₀/ml。

5.重组蛋白的表达与鉴定

5.1重组蛋白的免疫荧光检测：

重组杆状病毒按10%比例感染健康sf9细胞，同时设置空白对照孔，27℃培养48-72小时并持续观察，待细胞病变达到80%以上时，用预冷的80%丙酮固定细胞2小时，然后PBST洗涤3次，5%脱脂牛奶（使用TBST配制）在4℃过夜封闭，然后PBST洗涤3次，加入1:1000稀释的GP5单克隆抗体，37℃避光孵育1小时，然后PBST洗涤3次，加入1:1000稀释的FITC荧光标记羊抗鼠二抗，37℃孵育1小时，PBST洗涤3次后荧光显微镜下观察并判定结果，重组杆状病毒感染的细胞可见明显绿色荧光而对照组无荧光，由此证实目的基因能在昆虫细胞sf9中表达（图2）。

5.2重组蛋白电镜观察

将新鲜收集的重组杆状病毒液送电镜观察，结果显示检测到形态与PRRSV病毒粒子相似的病毒样颗粒，直径约30-50nm，证实GP5与M蛋白可在体外形成病毒样颗粒（图3）。

在本发明研发过程中，发明人对多种基因改造方案进行了尝试，例如，采用柔性linker（GGGGS）替代本发明的刚性linker（EAAAK）得到对照组1，其核苷酸序列如SEQ IDNo：2所示，氨基酸序列如SEQ ID No：5；如采用不同的基因改造手段得到的对照组2，其核苷酸序列如SEQ ID No：3所示，氨基酸序列如SEQ ID No：6所示，相比而言，对照组2与传统的PRRSV氨基酸序列更接近，而本发明的氨基酸序列相比大多数报道的GP5蛋白，截去了“TFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFL”、“ YVLSSIYAVCALAALICFVI”等片段，相比对照组2的传统片段，本发明将氨基酸片段中的“VVLDGS”突变为“EELDGS”，将氨基酸片段的“EKGGKV”突变为“EKEEKV”。

对于对照组1和对照组2分别采用实施例1的方法，制备得到相应的重组杆状病毒，并在昆虫细胞sf9中表达制备得到相应的病毒样颗粒，并用于后续相应病毒样颗粒疫苗的制备。

经测定，基于实施例1同样的培养条件，对照组1重组杆状病毒的P1、P2、P3代病毒滴度在10^3.135TCID₅₀/ml～10^5.125TCID₅₀/ml；对照组2重组杆状病毒的P1、P2、P3代病毒滴度在10^4.175TCID₅₀/ml～10^5.375TCID₅₀/ml。

实施例2 免疫佐剂的制备

佐剂是本发明人在先申请的发明专利CN 2017100589467（CN 106798920 B，授权公告日：2018年10月11日）中的复合免疫佐剂的基础上，根据亚单位疫苗的特点进行组成优化后得到，其具体配方和制备方法如下：一种复合免疫佐剂，所述复合免疫佐剂由以下重量百分含量的组分组成：蜂胶提取物 1%，鱼腥草多糖 1.5%，丙氨酸0.5%，银杏叶黄酮1.5%，聚乙烯蓖麻油 7%，Span80 7%，聚乙二醇 3.5%，角鲨烯8%，注射用大豆油 40%，注射用水30%；

所述复合免疫佐剂的制备方法包括如下步骤：

步骤一，按重量百分含量配比称取各原料；

所述蜂胶提取物采用如下方法制备得到：

实施例3：

（一）免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗的制备

将重组杆状病毒Ac-PRRSVGP5-M按5-10%比例接种健康sf9细胞，27℃培养4-5天后，反复冻融收集细胞及上清，于4℃条件下12000r/min离心20分钟后收集上清，然后使用硫酸铵沉淀法将目的蛋白沉淀，重悬后使用二乙烯亚胺（BEI）对蛋白溶液进行36-48小时灭活，之后使用等量硫代硫酸钠中和，采用0.9%的生理盐水调整至蛋白含量为100μg/mL，最后与实施例2制备得到的佐剂混合乳化配制疫苗，置于2-8℃备用。

在疫苗制备过程中，本发明实施例1、对照组1和对照组2的重组杆状病毒经培养后，均调整到病毒滴度在10⁵TCID₅₀/ml，而后继续后续的冻融等操作。在疫苗制备过程中，控制蛋白浓度为100μg/mL。

（二）疫苗检验方法及结果：

按照上述实施例1方法制备出两批亚单位疫苗，批号分别为20170502、20170602。

2.1性状检验：两批亚单位疫苗外观呈乳白色乳液，静置后下层略带粉红色。

2.2无菌检验：两批亚单位疫苗按照现《中华人民共和国兽药典》2010年版第三部附录进行检验，T.G、G.P 管和G.A 斜面培养基均未观察到菌落。

2.3外源病毒检验：两批亚单位疫苗按照《中华人民共和国兽药典》2010年版第三部附录进行检验，均无猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒等污染，证明重组猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒样颗粒疫苗的毒种是纯净的。

2.4支原体检验：两批亚单位疫苗按照《中华人民共和国兽药典》2010年版第三部附录进行检验，未发现小瓶和小管培养物颜色出现明显变化，移植的液体培养物在固体培养基上无“煎蛋”状支原体菌落。

2.5安全检验：取PRRSV抗原抗体双阴性的30-40日龄健康仔猪20头，随机分成2组，每组10头，每头肌注10头份疫苗，临床观察14日，均100%健活，未见不良反应发生。

表1：两批重组猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒样颗粒疫苗检验结果

实施例4：疫苗安全性实验

（一）仔猪安全性试验：

随机抽取实验室制备的5批实施例3所制备的病毒样颗粒亚单位疫苗，每批随机取3瓶，然后均匀混合后，对30日龄仔猪进行2倍剂量肌肉注射接种，同时设空白对照组试验猪。所有仔猪在接种前3天以及接种后14天期间，每天测量体温2次，并观察试验猪的精神、食欲等情况。结果表明免疫组试验猪与对照组试验猪的体温、精神状态与食欲均正常。表明该病毒样颗粒亚单位疫苗对仔猪是安全的。

（二）妊娠母猪安全性试验

随机抽取实验室制备的5批病毒样颗粒亚单位疫苗，每批随机取3瓶，然后均匀混合后，对产前70天的妊娠母猪进行2倍剂量肌肉注射接种，同时设空白对照组试验猪。所有试验母猪在接种前3天与接种后14天期间，每天测量2次体温，对试验猪的精神状态、食欲、繁殖生产结果进行持续观察。结果表明妊娠母猪在接种后直至生产后均表现正常，未见繁殖障碍情况与呼吸系统疾病情况。表明该病毒样颗粒亚单位疫苗对妊娠母猪是安全的。

实施例5：仔猪免疫攻毒保护试验

筛选PRRSV抗原抗体双阴性的30-40日龄健康仔猪60头，按10头每组分为六组，第一组试验猪免疫实施例3制备得到的亚单位疫苗，第二组试验猪免疫过程中，采用ISA 206佐剂替换实施例2中的佐剂，按照实施例3同样的方法制备得到的Ac-PRRSVGP5-M病毒样颗粒疫苗（对照组1）；第三组试验猪免疫Ac-PRRSVGP5-M（未突变，对照组2）疫苗（ISA 206佐剂），第四组试验猪免疫接种Ac-PRRSVGP5-M（对照组3）疫苗（ISA 206佐剂），第五组试验猪免疫市售某公司JXA1-R株弱毒活疫苗，第六组试验猪为空白对照组。在免疫后第28天使用高致病性PRRSV强毒株肌肉注射攻毒感染，于攻毒前2天以及攻毒后21天持续监测实验动物体温与临床表现，并于攻毒后第21天剖杀试验动物，观察剖检病变，重点记录肺脏病变情况。

参考文献中PRRSV攻毒后发病标准，即：（1）连续3日体温高于41℃或咳嗽与呼吸困难症状；（2）剖检可见片状的肺部实变。结果表明，本发明实施例3制备的病毒样颗粒亚单位疫苗的免疫保护率最高（表1），其与采用商业化佐剂ISA 206制备得到的疫苗以及商品化的弱毒疫苗能够达到同样水平的保护效力，相较PRRSV JXA1-R株弱毒活疫苗，本发明制备的病毒样颗粒疫苗更加安全有效，不具有毒力返强或造成病毒重组的风险。

表2 仔猪的免疫保护试验结果

分组

免疫原

临床症状

高体温症状（≥41℃）

肺部实变

发病判定

保护率

第一组

亚单位疫苗（实施例3）

1/10异常

0/10

1/10

90%

第二组

病毒样颗粒疫苗（对照组1，ISA206佐剂）

1/10异常

0/10

1/10

90%

第三组

病毒样颗粒疫苗（对照组2）

4/10异常

2/10

4/10

5/10

60%

第四组

病毒样颗粒疫苗（对照组3）

3/10异常

1/10

3/10

70%

第五组

PRRSV JXA1-R弱毒活疫苗

1/10异常

1/10

90%

第六组

生理盐水

10/10异常

9/10

10/10

0%

实施例6：疫苗免疫仔猪的抗体消涨规律

（1）根据实施例3的方法制备免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗。

（2）筛选PRRSV抗原抗体双阴性的30-40日龄健康仔猪18头，随机分为6组，每组3头。第一组试验猪免疫实施例3制备得到的亚单位疫苗，第二组试验猪免疫过程中，采用ISA206佐剂替换实施例2中的佐剂，按照实施例3同样的方法制备得到的Ac-PRRSVGP5-M病毒样颗粒疫苗（对照组1）；第三组试验猪免疫Ac-PRRSVGP5-M（未突变，对照组2）疫苗（ISA 206佐剂），第四组试验猪免疫接种Ac-PRRSVGP5-M（对照组3）疫苗（ISA 206佐剂），第五组试验猪免疫市售某公司JXA1-R株弱毒活疫苗，第六组试验猪为空白对照组。分别于免疫后14日、28日、60日、90日、120日、150日采血，用商品化PRRSV抗体Elisa试剂盒（BioChek）进行抗体检测。

表3 不同PRRSV疫苗免疫仔猪抗体检测结果

注：“-”表示抗体检测结果为阴性，以OD值为阳性的血清最大稀释倍数的抗体效价。

从实验结果可以看出，本发明实施例3所制备得到的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒样颗粒疫苗与PRRSV JXA1-R弱毒活疫苗具有相近的抗体效价，其在免疫接种后均能达到1:3200的抗体效价，而通过抗体产生时间比较而言，本发明实施例3所制备得到的免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗在免疫后第14天相比能够达到一个更高的抗体效价水平，最高为1:400，而弱毒疫苗仅能达到最高1:200，说明本发明的疫苗对于动物免疫早期能够更好的刺激机体产生抗体，通过第150日的结果比较可知，本发明的疫苗在接种150日后仍能保持一个相对较高的抗体水平，说明本发明的疫苗相比弱毒苗具有相对更持久的免疫保护周期。通过本发明实施例3的疫苗与对照组的比较可知，相比对照组1采用的商业化的ISA206佐剂，本发明采用自主研发的免疫佐剂，其能在短时间内更能促进中和抗体的产生，其在免疫后14天均能达到1:400的免疫效价，而对照组1仅1/3达到1:400的水平，同时，在第28天时也能取得更高的抗体水平；相比对照组2，本发明采用刚性linker连接Tflg，使得鞭毛蛋白能够更好的暴露在病毒粒子表面，刺激了机体更早的产生抗体，并且本发明的抗体效价要明显高于对照组2的效价，高达其两倍，说明本发明的疫苗具有更好的免疫保护效果；相比对照组3，本发明通过对GP5进行基因改造，提高了病毒样颗粒疫苗的免疫原性，能够更好地刺激机体产生抗体，形成更好的保护。

尽管本发明内容是结合上述实施例进行说明，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定，其他的任何在限定范围内所作的改变或修饰，均应为等效的置换方式，均包含在本发明的保护范围之内｡

序列表

<110> 陕西诺威利华生物科技有限公司

<120> 一种免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 882

<212> DNA

<213> TFlg-EAAAK- GP5-M(PRRSV)

<400> 1

ggagtcgagg tcagactggg agttggtgct gttagcagac tgaaccgcca gttcacgcac 60

acgctgcaag ttgttgttga tgaggccgcc gccaaggcca agttcgtggc cgcctggacc 120

ctgaaggccg ccgcctccaa cgccgcctcc tcccacatcc agctgatcta caacctgacc 180

ctgtgcgagc tggccggcac cgactggctg gcccagaagt tcgactgggc cgtggaggga 240

ggttccgaca ccgtgggcct ggccaccgtg tccaccgccg gctactacgg ctcgggtcgc 300

ctggccaaga actgcatgtc ctggcgctac tcctgcaccc gctacaccaa cttcctgctg 360

gacaccaagg gccgcctgta ccgctggcgc tcccccgtga tcgtggagaa ggaggagaag 420

gtggaggtgg agggccacct gatcgacctg aagcgcgagg agctggacgg ctccgccgcc 480

acccccctga cccgcgtgtc cgccgagctg tggggccgcc tggggcccgg acctggctcc 540

tccctggacg acttctgcaa cgactccacc gccggcggct ccaaggtgtc ccgcggccgc 600

ggctccggcc acttcgagtc caccaaccgc gtggccggag gttccacctc ccgctgccgc 660

ctgtgcctgc tgggccgcaa gtacatcctg gcccccgccc accacgtgga gtccgccgcc 720

ggcttccacc ccatcgccgc caacgacaac cacgccttcg tggtgcgccg ccccggctcc 780

accaccgtga acggcaccct ggtgcccggc ctgaagtccc tggtgctggg cggccgcaag 840

gccgtgaagc agggcgtggt gaacctggtg aagtacgcca ag 882

<210> 2

<211> 882

<212> DNA

<213> TFlg-GGGGS- GP5-M(PRRSV)

<400> 2

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acgctgcaag ttgttgttga tggaggagga ggttccgcca agttcgtggc cgcctggacc 120

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<210> 3

<211> 882

<212> DNA

<213> TFLG-EAAAK- GP5（未突变）-M(PRRSV)

<400> 3

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acgctgcaag ttgttgttga tgaggccgcc gccaaggcca agttcgtggc cgcctggacc 120

ctgaaggccg ccgcctccaa cgccgcctcc tcccacatcc agctgatcta caacctgacc 180

ctgtgcgagc tggccggcac cgactggctg gcccagaagt tcgactgggc cgtggaggga 240

ggttccgaca ccgtgggcct ggccaccgtg tccaccgccg gctactacgg ctcgggtcgc 300

ctggccaaga actgcatgtc ctggcgctac tcctgcaccc gctacaccaa cttcctgctg 360

gacaccaagg gccgcctgta ccgctggcgc tcccccgtga tcgtggagaa gggcggcaag 420

gtggaggtgg agggccacct gatcgacctg aagcgcgtgg tgctggacgg ctccgccgcc 480

acccccctga cccgcgtgtc cgccgagctg tggggccgcc tggggcccgg acctggctcc 540

tccctggacg acttctgcaa cgactccacc gccggcggct ccaaggtgtc ccgcggccgc 600

ggctccggcc acttcgagtc caccaaccgc gtggccggag gttccacctc ccgctgccgc 660

ctgtgcctgc tgggccgcaa gtacatcctg gcccccgccc accacgtgga gtccgccgcc 720

ggcttccacc ccatcgccgc caacgacaac cacgccttcg tggtgcgccg ccccggctcc 780

accaccgtga acggcaccct ggtgcccggc ctgaagtccc tggtgctggg cggccgcaag 840

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<210> 4

<211> 294

<212> PRT

<213> TFlg-EAAAK- GP5-L2-M(PRRSV)

<400> 4

Gly Val Glu Val Arg Leu Gly Val Gly Ala Val Ser Arg Leu Asn Arg

1 5 10 15

Gln Phe Thr His Thr Leu Gln Val Val Val Asp Glu Ala Ala Ala Lys

20 25 30

Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ser Asn Ala

35 40 45

Ala Ser Ser His Ile Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys Glu Leu

50 55 60

Ala Gly Thr Asp Trp Leu Ala Gln Lys Phe Asp Trp Ala Val Glu Gly

65 70 75 80

Gly Ser Asp Thr Val Gly Leu Ala Thr Val Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr

85 90 95

Gly Ser Gly Arg Leu Ala Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys

100 105 110

Thr Arg Tyr Thr Asn Phe Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg

115 120 125

Trp Arg Ser Pro Val Ile Val Glu Lys Glu Glu Lys Val Glu Val Glu

130 135 140

Gly His Leu Ile Asp Leu Lys Arg Glu Glu Leu Asp Gly Ser Ala Ala

145 150 155 160

Thr Pro Leu Thr Arg Val Ser Ala Glu Leu Trp Gly Arg Leu Gly Pro

165 170 175

Gly Pro Gly Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys Asn Asp Ser Thr Ala Gly

180 185 190

Gly Ser Lys Val Ser Arg Gly Arg Gly Ser Gly His Phe Glu Ser Thr

195 200 205

Asn Arg Val Ala Gly Gly Ser Thr Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu

210 215 220

Gly Arg Lys Tyr Ile Leu Ala Pro Ala His His Val Glu Ser Ala Ala

225 230 235 240

Gly Phe His Pro Ile Ala Ala Asn Asp Asn His Ala Phe Val Val Arg

245 250 255

Arg Pro Gly Ser Thr Thr Val Asn Gly Thr Leu Val Pro Gly Leu Lys

260 265 270

Ser Leu Val Leu Gly Gly Arg Lys Ala Val Lys Gln Gly Val Val Asn

275 280 285

Leu Val Lys Tyr Ala Lys

290

<210> 5

<211> 294

<212> PRT

<213> TFlg-GGGGS- GP5-L2-M(PRRSV)

<400> 5

Gly Val Glu Val Arg Leu Gly Val Gly Ala Val Ser Arg Leu Asn Arg

1 5 10 15

Gln Phe Thr His Thr Leu Gln Val Val Val Asp Gly Gly Gly Gly Ser

20 25 30

Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ser Asn Ala

35 40 45

Ala Ser Ser His Ile Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys Glu Leu

50 55 60

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65 70 75 80

Gly Ser Asp Thr Val Gly Leu Ala Thr Val Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr

85 90 95

Gly Ser Gly Arg Leu Ala Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys

100 105 110

Thr Arg Tyr Thr Asn Phe Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg

115 120 125

Trp Arg Ser Pro Val Ile Val Glu Lys Glu Glu Lys Val Glu Val Glu

130 135 140

Gly His Leu Ile Asp Leu Lys Arg Glu Glu Leu Asp Gly Ser Ala Ala

145 150 155 160

Thr Pro Leu Thr Arg Val Ser Ala Glu Leu Trp Gly Arg Leu Gly Pro

165 170 175

Gly Pro Gly Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys Asn Asp Ser Thr Ala Gly

180 185 190

Gly Ser Lys Val Ser Arg Gly Arg Gly Ser Gly His Phe Glu Ser Thr

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Asn Arg Val Ala Gly Gly Ser Thr Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu

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Gly Phe His Pro Ile Ala Ala Asn Asp Asn His Ala Phe Val Val Arg

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Arg Pro Gly Ser Thr Thr Val Asn Gly Thr Leu Val Pro Gly Leu Lys

260 265 270

Ser Leu Val Leu Gly Gly Arg Lys Ala Val Lys Gln Gly Val Val Asn

275 280 285

Leu Val Lys Tyr Ala Lys

290

<210> 6

<211> 294

<212> PRT

<213> TFlg-EAAAK- GP5（未突变）-M(PRRSV)

<400> 6

Gly Val Glu Val Arg Leu Gly Val Gly Ala Val Ser Arg Leu Asn Arg

1 5 10 15

Gln Phe Thr His Thr Leu Gln Val Val Val Asp Glu Ala Ala Ala Lys

20 25 30

Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ser Asn Ala

35 40 45

Ala Ser Ser His Ile Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys Glu Leu

50 55 60

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65 70 75 80

Gly Ser Asp Thr Val Gly Leu Ala Thr Val Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr

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Gly His Leu Ile Asp Leu Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala

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Thr Pro Leu Thr Arg Val Ser Ala Glu Leu Trp Gly Arg Leu Gly Pro

165 170 175

Gly Pro Gly Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys Asn Asp Ser Thr Ala Gly

180 185 190

Gly Ser Lys Val Ser Arg Gly Arg Gly Ser Gly His Phe Glu Ser Thr

195 200 205

Asn Arg Val Ala Gly Gly Ser Thr Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu

210 215 220

Gly Arg Lys Tyr Ile Leu Ala Pro Ala His His Val Glu Ser Ala Ala

225 230 235 240

Gly Phe His Pro Ile Ala Ala Asn Asp Asn His Ala Phe Val Val Arg

245 250 255

Arg Pro Gly Ser Thr Thr Val Asn Gly Thr Leu Val Pro Gly Leu Lys

260 265 270

Ser Leu Val Leu Gly Gly Arg Lys Ala Val Lys Gln Gly Val Val Asn

275 280 285

Leu Val Lys Tyr Ala Lys

290

Claims

1.一种免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗，由PRRSV病毒样颗粒和复合免疫佐剂组成。

2.根据权利要求1所述的免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：将重组杆状病毒Ac-PRRSVGP5-M按5-10%比例接种健康sf9细胞，27℃培养4-5天后，反复冻融收集细胞及上清，于4℃条件下12000r/min离心20分钟后收集上清，然后使用硫酸铵沉淀法将目的蛋白沉淀，重悬后使用二乙烯亚胺（BEI）对蛋白溶液进行36-48小时灭活，之后使用等量硫代硫酸钠中和，采用0.9%的生理盐水调整至蛋白含量为100μg/mL，最后与复合免疫佐剂混合乳化配制疫苗，置于2-8℃备用。

3.根据权利要求2所述的免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗，其特征在于，所述重组杆状病毒Ac-PRRSVGP5-M的制备方法包括如下步骤：

步骤二，重组杆状病毒Ac-PRRSVGP5-M的构建：

（1）重组杆粒rBac-PRRSVGP5-M的获得与鉴定：取测序鉴定正确的杆状病毒转移载体pBAC-PRRSVGP5-M质粒DNA与DH10 Bac感受态细胞混合，冰浴30分钟后，于42℃进行45秒水浴热激，然后冰浴5分钟，加入SOC液体培养基，37℃振荡培养2小时，按10倍系列稀释之后，各梯度菌液涂布LB平板，使用life公司的筛选试剂盒筛选纯化阳性菌落，提取重组杆粒rBac-PRRSVGP5-M；

4.根据权利要求1所述的免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗，其特征在于，所述复合免疫佐剂由以下重量百分含量的组分组成：蜂胶提取物 1%，鱼腥草多糖 1.5%，丙氨酸0.5%，银杏叶黄酮1.5%，聚乙烯蓖麻油 7%，Span80 7%，聚乙二醇 3.5%，角鲨烯8%，注射用大豆油 40%，注射用水30%。

5.根据权利要求4所述的免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗，其特征在于，所述复合免疫佐剂的制备方法包括如下步骤：

步骤一，按重量百分含量配比称取各原料；

6.一种复合免疫佐剂，所述复合免疫佐剂由以下重量百分含量的组分组成：蜂胶提取物 1%，鱼腥草多糖 1.5%，丙氨酸0.5%，银杏叶黄酮1.5%，聚乙烯蓖麻油 7%，Span80 7%，聚乙二醇 3.5%，角鲨烯8%，注射用大豆油 40%，注射用水30%；

所述复合免疫佐剂的制备方法包括如下步骤：

步骤一，按重量百分含量配比称取各原料；

7.根据权利要求6所述的复合免疫佐剂，其特征在于，所述蜂胶提取物采用如下方法制备得到：