CN109312361A

CN109312361A - 转座子系统及应用方法

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Publication number: CN109312361A
Application number: CN201780025816.1A
Authority: CN
Inventors: D·夏洛克; D·赫尔曼森; E·奥斯特泰格
Original assignee: Posey Ida Therapeutics Ltd By Share Ltd
Current assignee: Posey Ida Therapeutics Ltd By Share Ltd; Poseida Therapeutics Inc
Priority date: 2016-02-26
Filing date: 2017-02-24
Publication date: 2019-02-05
Also published as: RU2018133691A3; IL261343A; JP2019506177A; RU2018133691A; MX2018010288A; SG11201807134RA; WO2017147538A1; KR20180131545A; AU2017224111A1; EP3420090A1; BR112018067536A2; CA3015642A1

Abstract

本文公开了用于对免疫细胞进行离体遗传修饰的组合物和方法，其包括向所述免疫细胞递送：(a)包含编码转座酶的序列的核酸或氨基酸序列，和(b)包含编码转座子的DNA序列的重组且非天然产生的DNA序列。

Description

转座子系统及应用方法

相关申请

本申请要求于2016年2月26日提交的美国临时专利申请号62/300,387的优先权，该文的全部内容通过引用方式纳入本文用于所有目的。

序列表引用

创建于2017年2月24日，大小为26KB，以“POTH-007001WO_SeqList.txt”名称提交的文本文档的内容通过引用其全文的方式纳入本文。

技术领域

本发明涉及用于靶向基因修饰的组合物和方法。

背景技术

采用基于非病毒载体的基因转移递送系统进行的非转化原代人T淋巴细胞的离体遗传修饰极其困难。因此，大多数团队一般采用基于病毒载体的转导，例如逆转录病毒，包括慢病毒。多种非病毒方法已经测试，且包括抗体靶向的脂质体、纳米颗粒、适体siRNA嵌合体、电穿孔、核转染、脂质转染，和肽转导。总体上，这些方式得到的转染效率低，导致细胞毒性，或缺乏实验通量。

质粒载体用于遗传修饰人类淋巴细胞的应用受限于当前可用质粒转染系统的低效率和多数质粒转染试剂对于这些细胞所具有的毒性。对于在免疫细胞中进行非病毒基因修饰的方法具有长期且未满足的需要。

发明内容

与免疫细胞(例如T淋巴细胞)的病毒转导相比，通过DNA转座子(例如piggyBac和睡美人转座子)递送转基因提供以下方面的益处：易用性、递送大得多的被载物的能力、实现临床应用的速度以及生产成本。具体而言，piggyBac DNA转座子提供额外益处：转基因的长期、高水平且稳定的表达，以及相较逆转录病毒而言显著较少的诱变、非致癌性和完全可逆性。采用DNA转座子将转基因递送至T细胞的先前尝试在产生商业可行产物或制造方法方面是不成功的，因为先前方法是低效的。例如，采用DNA转座子将转基因递送至T细胞的先前方法显示低效率，并且致使需要延长的离体扩增。他人为解决该问题所进行的先前的不成功尝试均着眼于增加向免疫细胞递送的DNA转座子的量，这对于非免疫细胞而言已是一种可行策略。本发明显示，增加DNA转座子的量会使免疫细胞中的效率问题更糟糕，因为这会增加DNA介导的毒性。未解决该问题，不同寻常地，本发明方法减少递送至免疫细胞的DNA的量。采用本发明方法，本文提供的数据不仅显示减少导入细胞的DNA转座子的量能够增加活力，而且显示该方法增加了具有转座事件的细胞的百分比，获得可行的商业方法和可行的商业产品。因此，本发明方法证明了其他人失败事项的成功。

本发明提供用于对免疫细胞进行离体遗传修饰的非病毒方法，其包括向所述免疫细胞递送：(a)包含编码转座酶的序列的核酸或氨基酸序列，和(b)包含编码转座子的DNA序列的重组且非天然产生的DNA序列。在某些实施方式中，所述方法还包括如下步骤：用一种或多种细胞因子刺激免疫细胞。

在本文所述方法的某些实施方式中，所述编码转座酶的序列是mRNA序列。该编码转座酶的mRNA序列可体外生成。

在本文所述方法的某些实施方式中，所述编码转座酶的序列是DNA序列。该编码转座酶的DNA序列可体外生成。该DNA序列可以是cDNA序列。

在本文所述方法的某些实施方式中，所述编码转座酶的序列是氨基酸序列。该编码转座酶的氨基酸序列可体外生成。蛋白质sPBo可在与转座子DNA预孵育之后被递送。

在本文所述方法的某些实施方式中，递送步骤包括免疫细胞的电穿孔或核转染。

在本文所述方法的某些实施方式中，用一种或多种细胞因子刺激免疫细胞的步骤在递送步骤之后进行。或者或此外，在某些实施方式中，用一种或多种细胞因子刺激免疫细胞的步骤在递送步骤之前进行。在某些实施方式中，所述一种或多种细胞因子包括IL-2、IL-21、IL-7和/或IL-15。

在本文所述方法的某些实施方式中，所述免疫细胞是自体同源的免疫细胞。所述免疫细胞可以是人类免疫细胞和/或自体同源的免疫细胞。所述免疫细胞可源自非自体同源的来源，包括但不限于：原代细胞、培养的细胞或细胞系、胚胎或成体干细胞、诱导型多能干细胞或转分化细胞。所述免疫细胞可经先前遗传修饰或源自已经遗传修饰的细胞或细胞系。所述免疫细胞可经修饰或可源自已经修饰以抑制一个或多个凋亡途径的细胞或细胞系。所述免疫细胞可经修饰或可源自已经修饰以对该情形(例如，涉及过继细胞转移的治疗)中大多数受者“普遍地”是同种异体的细胞或细胞系。

在本文所述方法的某些实施方式中，所述免疫细胞是活化的免疫细胞。

在本文所述方法的某些实施方式中，所述免疫细胞是静息免疫细胞。

在本文所述方法的某些实施方式中，所述免疫细胞是T-淋巴细胞。在某些实施方式中，T-淋巴细胞是活化的T-淋巴细胞。在某些实施方式中，T-淋巴细胞是静息T-淋巴细胞。

在本文所述方法的某些实施方式中，所述免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。

在本文所述方法的某些实施方式中，所述免疫细胞是细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞。

在本文所述方法的某些实施方式中，所述免疫细胞是自然杀伤T(NKT)细胞。

在本文所述方法的某些实施方式中，所述免疫细胞分离自或源自人类。

在本文所述方法的某些实施方式中，所述免疫细胞分离自或源自非人哺乳动物。在某些实施方式中，非人哺乳动物是啮齿类、兔、猫、狗、猪、马、奶牛或骆驼。在某些实施方式中，所述免疫细胞分离自或源自非人灵长类。

在本文所述方法的某些实施方式中，转座酶是Super piggyBac^TM(sPBo)转座酶。Super piggyBac(PB)转座酶可包含与如下序列至少75％相同的氨基酸序列或由其组成：

MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEVSDHVSEDDVQSDTEEAFIDEVHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQPGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCWSTSKSTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISEIVKWTNAEISLKRRESMTSATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDDLFDRSLSMVYVSVMSRDRFDFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDVFTPVRKIWDLFIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRVYIPNKPSKYGIKILMMCDSGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDNWFTSIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDGPLTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGVDTLDQMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQSRKKFMRNLYMSLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNISNILPKEVPGTSDDSTEEPVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF(SEQ IDNO:1)。

在本文所述方法的某些实施方式中，转座酶是睡美人(Sleeping Beauty)转座酶(参见例如，美国专利号9,228,180，其内容通过引用其全文的方式纳入本文)。在某些实施方式中，睡美人转座酶是高活性睡美人SB100X转座酶。在某些实施方式中，睡美人转座酶包含与如下序列至少75％相同的氨基酸序列：MGKSKEISQDLRKKIVDLHKSGSSLGAISKRLKVPRSSVQTIVRKYKHHGTTQPSYRSGRRRYLSPRDERTLVRKVQINPRTTAKDLVKMLEETGTKVSISTVKRVLYRHNLKGRSARKKPLLQNRHKKARLRFATAHGDKDRTFWRNVLWSDETKIELFGHNDHRYVWRKKGEACKPKNTIPTVKHGGGSIMLWGCFAAGGTGALHKIDGIMRKENYVDILKQHLKTSVRKLKLGRKWVFQMDNDPKHTSKVVAKWLKDNKVKVLEWPSQSPDLNPIENLWAELKKRVRARRPTNLTQLHQLCQEEWAKIHPTYCGKLVEGYPKRLTQVKQFKGNATKY(SEQID NO:2)。在某些实施方式(包括其中睡美人转座酶是高活性睡美人SB100X转座酶的那些)中，睡美人转座酶包含与如下序列至少75％相同的氨基酸序列：

MGKSKEISQDLRKRIVDLHKSGSSLGAISKRLAVPRSSVQTIVRKYKHHGTTQPSYRSGRRRYLSPRDERTLVRKVQINPRTTAKDLVKMLEETGTKVSISTVKRVLYRHNLKGHSARKKPLLQNRHKKARLRFATAHGDKDRTFWRNVLWSDETKIELFGHNDHRYVWRKKGEACKPKNTIPTVKHGGGSIMLWGCFAAGGTGALHKIDGIMDAVQYVDILKQHLKTSVRKLKLGRKWVFQHDNDPKHTSKVVAKWLKDNKVKVLEWPSQSPDLNPIENLWAELKKRVRARRPTNLTQLHQLCQEEWAKIHPNYCGKLVEGYPKRLTQVKQFKGNATKY(SEQ ID NO:3)。

在本文所述方法的某些实施方式中，包含编码转座子的DNA序列的重组且非天然产生的DNA序列可以是环形的。作为非限制性示例，编码转座子的DNA序列可以是质粒载体。作为非限制性示例，编码转座子的DNA序列可以是小环DNA载体。

在本文所述方法的某些实施方式中，编码转座子的重组且非天然产生的DNA序列可以是线性的。编码转座子的线性重组且非天然产生的DNA序列可体外生成。本发明的线性重组且非天然产生的DNA序列可以是环形DNA的限制酶切消化的产物。在某些实施方式中，环形DNA是质粒载体或小环DNA载体。本发明的线性重组且非天然产生的DNA序列可以是聚合酶链式反应(PCR)的产物。本发明的线性重组且非天然产生的DNA序列可以是双链doggybone^TMDNA序列。本发明的Doggybone^TMDNA序列可通过酶法产生，其仅编码抗原表达盒，包含抗原、启动子、多聚A尾和端粒末端。

在本文所述方法的某些实施方式中，编码转座子的重组且非天然产生的DNA序列还包含编码嵌合抗原受体或其部分的序列。本发明的嵌合抗原受体(CAR)可包含(a)含有抗原识别区域的胞外域，(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的内结构域(endodomain)。在某些实施方式中，胞外域还可包含信号肽。或者或此外，在某些实施方式中，胞外域还可包含抗原识别区域和跨膜结构域之间的铰链。在本文所述的CAR的某些实施方式中，信号肽可包含编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR信号肽的序列。在本文所述的CAR的某些实施方式中，信号肽可包含编码人CD8α信号肽的序列。在某些实施方式中，跨膜结构域可包含编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR跨膜结构域的序列。在本文所述的CAR的某些实施方式中，跨膜结构域可包含编码人CD8α跨膜结构域的序列。在本文所述的CAR的某些实施方式中，内结构域可包含人CD3ζ内结构域。在本文所述的CAR的某些实施方式中，所述至少一个共刺激结构域可包含人4-1BB、CD28、CD40、ICOS、MyD88、OX-40胞内区段，或其任何组合。在本文所述的CAR的某些实施方式中，所述至少一个共刺激结构域可包含CD28和/或4-1BB共刺激结构域。在本文所述的CAR的某些实施方式中，铰链可包含源自人CD8α、IgG4、和/或CD4序列的序列。在本文所述的CAR的某些实施方式中，铰链可包含源自人CD8α序列的序列。

在本文所述方法的某些实施方式中，编码转座子的重组且非天然产生的DNA序列还包含编码嵌合抗原受体或其部分的序列。编码嵌合抗原受体的序列的部分可编码抗原识别区域。所述抗原识别区域可包含一个或多个互补决定区。所述抗原识别区域可包含抗体、抗体模拟物、蛋白质支架或其片段。在某些实施方式中，所述抗体是嵌合抗体、重组抗体、人源化抗体或人抗体。在某些实施方式中，所述抗体经亲和性调节(affinity-tune)。本发明抗体的非限制性示例包括单链可变片段(scFv)、VHH、单域抗体(sdAB)、小模块免疫药物(SMIP)分子，或纳米抗体。在某些实施方式中，VHH是骆驼科的。或者或此外，在某些实施方式中，VHH是人源化的。本发明抗体片段的非限制性示例包括互补决定区、可变区、重链、轻链，或其任何组合。本发明抗体模拟物的非限制性示例包括：亲和体(affibody)、Afflilin分子、粘合素(affimer)、Affitin分子，阿尔法体(alphabody)、抗运载蛋白(anticalin)，和Avimer分子、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽，或单体(monobody)。本发明蛋白质支架的非限制性示例包括Centyrin。

在本文所述方法的某些实施方式中，编码转座酶的核酸序列是DNA序列，并且每100μL的电穿孔或核转染反应的编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量等于或少于10.0μg。在某些实施方式中，电穿孔或核转染反应中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于100μg/mL。

在本文所述方法的某些实施方式中，编码转座酶的核酸序列是DNA序列，并且每100μL的电穿孔或核转染反应的编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量等于或少于7.5μg。在某些实施方式中，电穿孔或核转染反应中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于75μg/mL。

在本文所述方法的某些实施方式中，编码转座酶的核酸序列是DNA序列，并且每100μL的电穿孔或核转染反应的编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量等于或少于6.0μg。在某些实施方式中，电穿孔或核转染反应中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于60μg/mL。在某些实施方式中，转座酶是睡美人转座酶。在某些实施方式中，睡美人转座酶是睡美人100X(SB100X)转座酶。

在本文所述方法的某些实施方式中，编码转座酶的核酸序列是DNA序列，并且每100μL的电穿孔或核转染反应的编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量等于或少于5.0μg。在某些实施方式中，电穿孔或核转染反应中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于50μg/mL。

在本文所述方法的某些实施方式中，编码转座酶的核酸序列是DNA序列，并且每100μL的电穿孔或核转染反应的编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量等于或少于2.5μg。在某些实施方式中，电穿孔或核转染反应中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于25μg/mL。

在本文所述方法的某些实施方式中，编码转座酶的核酸序列是DNA序列，并且每100μL的电穿孔或核转染反应的编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量等于或少于1.67μg。在某些实施方式中，电穿孔或核转染反应中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于16.7μg/mL。在某些实施方式中，转座酶是Super piggyBac(PB)转座酶。

在本文所述方法的某些实施方式中，编码转座酶的核酸序列是DNA序列，并且每100μL的电穿孔或核转染反应的编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量等于或少于0.55μg。在某些实施方式中，电穿孔或核转染反应中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于5.5μg/mL。

在本文所述方法的某些实施方式中，编码转座酶的核酸序列是DNA序列，并且每100μL的电穿孔或核转染反应的编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量等于或少于0.19μg。在某些实施方式中，电穿孔或核转染反应中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于1.9μg/mL。

在本文所述方法的某些实施方式中，编码转座酶的核酸序列是DNA序列，并且每100μL的电穿孔或核转染反应的编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量等于或少于0.10μg。在某些实施方式中，电穿孔或核转染反应中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于1.0μg/mL。

在本文所述方法的某些实施方式中，编码转座酶的核酸序列是RNA序列，并且每100μL的电穿孔或核转染反应的编码转座子的DNA序列的量等于或少于10.0μg。在某些实施方式中，电穿孔或核转染反应中，编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于100μg/mL。

在本文所述方法的某些实施方式中，编码转座酶的核酸序列是RNA序列，并且每100μL的电穿孔或核转染反应的编码转座子的DNA序列的量等于或少于7.5μg。在某些实施方式中，电穿孔或核转染反应中，编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于75μg/mL。

在本文所述方法的某些实施方式中，编码转座酶的核酸序列是RNA序列，并且每100μL的电穿孔或核转染反应的编码转座子的DNA序列的量等于或少于6.0μg。在某些实施方式中，电穿孔或核转染反应中，编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于60μg/mL。在某些实施方式中，转座酶是睡美人转座酶。在某些实施方式中，睡美人转座酶是睡美人100X(SB100X)转座酶。

在本文所述方法的某些实施方式中，编码转座酶的核酸序列是RNA序列，并且每100μL的电穿孔或核转染反应的编码转座子的DNA序列的量等于或少于5.0μg。在某些实施方式中，电穿孔或核转染反应中，编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于50μg/mL。

在本文所述方法的某些实施方式中，编码转座酶的核酸序列是RNA序列，并且每100μL的电穿孔或核转染反应的编码转座子的DNA序列的量等于或少于2.5μg。在某些实施方式中，电穿孔或核转染反应中，编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于25μg/mL。

在本文所述方法的某些实施方式中，编码转座酶的核酸序列是RNA序列，并且每100μL的电穿孔或核转染反应的编码转座子的DNA序列的量等于或少于1.67μg。在某些实施方式中，电穿孔或核转染反应中，编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于16.7μg/mL。在某些实施方式中，转座酶是Super piggyBac(PB)转座酶。

在本文所述方法的某些实施方式中，编码转座酶的核酸序列是RNA序列，并且每100μL的电穿孔或核转染反应的编码转座子的DNA序列的量等于或少于0.55μg。在某些实施方式中，电穿孔或核转染反应中，编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于5.5μg/mL。

在本文所述方法的某些实施方式中，编码转座酶的核酸序列是RNA序列，并且每100μL的电穿孔或核转染反应的编码转座子的DNA序列的量等于或少于0.19μg。在某些实施方式中，电穿孔或核转染反应中，编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于1.9μg/mL。

在本文所述方法的某些实施方式中，编码转座酶的核酸序列是RNA序列，并且每100μL的电穿孔或核转染反应的编码转座子的DNA序列的量等于或少于1.0μg。在某些实施方式中，电穿孔或核转染反应中，编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于1.0μg/mL。

本发明提供经本发明方法修饰的免疫细胞。所述免疫细胞可以是T-淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞或自然杀伤T(NKT)细胞。免疫细胞还可由第二基因编辑工具修饰，包括但不限于包含操作性地连接至Cas9或TALE序列的核酸内切酶的那些基因编辑工具。在第二基因编辑工具的某些实施方式中，核酸内切酶通过共价方式操作性地连接至Cas9或TALE序列。在第二基因编辑工具的某些实施方式中，核酸内切酶通过非共价方式操作性地连接至Cas9或TALE序列。在某些实施方式中，Cas9是失活的Cas9(dCas9)。在某些实施方式中，失活的Cas9在催化位点内包含D10A和N580A。在某些实施方式中，Cas9是小且失活的Cas9(dSaCas9)。在某些实施方式中，dSaCas9包含如下氨基酸序列

本发明提供经本发明方法修饰的免疫细胞。所述免疫细胞可以是T-淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞或自然杀伤T(NKT)细胞。免疫细胞还可由第二基因编辑工具修饰，包括但不限于包含操作性地连接至Cas9或TALE序列的核酸内切酶的那些基因编辑工具。或者或此外，第二基因编辑工具可包括仅切除型(excision-only)piggyBac转座酶以再切除插入的序列或其任何部分。例如，仅切除型piggyBac转座酶可用于“再切除(re-excise)”转座子。

本发明提供包含本发明的免疫细胞的组合物。

本发明提供包含本发明的免疫细胞的组合物用于治疗有此需要的对象中的疾病或病症的用途。在某些实施方式中，所述疾病或病症是癌症。在某些实施方式中，所述疾病或病症是感染性疾病。例如，感染性疾病可由病毒、细菌、酵母、微生物或其任何组合造成。在某些实施方式中，所述组合物的免疫细胞是自体同源的。在某些实施方式中，所述组合物的免疫细胞是同种异体的。

本发明提供用于增强经修饰的免疫细胞的活力的培养基，其包含IL-2、IL-21、IL-7、IL-15或其任何组合。所述经修饰的免疫细胞可以是T-淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞或自然杀伤T(NKT)细胞。所述经修饰的免疫细胞可包含一个或多个外源性DNA序列。所述经修饰的免疫细胞可包含一个或多个外源性RNA序列。所述经修饰的免疫细胞可已经电穿孔或核转染。

附图说明

图1的一系列图说明在原代人T淋巴细胞中进行质粒DNA核转染后的转染效率和细胞活力。

图2的一系图说明对于T细胞的DNA细胞毒性。

图3的一系列图显示T细胞中的DNA介导的细胞毒性是剂量依赖性的。

图4的一系列图显示胞外质粒DNA不具细胞毒性。

图5的一系列图说明在Jurkat细胞中采用sPBo mRNA的高效转座。

图6的一系列图说明在T淋巴细胞采用sPBo mRNA的高效转座。

图7的一系列图说明线性化的DNA转座子产物的高效递送。

图8的一系列图显示IL-7和IL-15的添加和在核转染后即刻刺激T细胞增强了细胞活力。

图9的一系列图显示IL-7和IL-15拯救T细胞不受DNA介导的毒性影响。

图10的一系列图显示核转染后即刻刺激T细胞增强了细胞活力。

图11A-C的一系列图说明采用不同量DNA的T细胞转座。原代人泛T细胞采用piggyBac^TM用不同量DNA核转染。T细胞用指示量的转座子和5μg sPBo mRNA核转染。然后，在核转染后第2天通过CD3和CD28刺激细胞。如同预期，用高量DNA核转染的T细胞在核转染后第1天显示了高附加型表达，而在低DNA剂量几乎没有观察到附加型表达。不同的是，在核转染后第21天扩增之后，在较低DNA量的情况中观察到最大百分比的转基因阳性细胞，对于该转座子，DNA量的峰值1.67μg。(A)在第1天和第21天对转基因阳性细胞进行流式分析。(B)转基因阳性T细胞的百分比。(C)第1天和第21天活T细胞的百分比。对于该图中所示的所有图表，Y轴范围为0-100％，增量为20％，X轴范围为0-10⁵，指数增量为10。

图12A-B的一系列图说明采用Sleeping Beauty^TM100X(SB100X)转座酶用低DNA量进行的T细胞转座。原代人泛T细胞用编码piggyBac^TM(PB)或Sleeping Beauty^TM(SB)ITR的GFP质粒核转染。(A)细胞用指示量的SB转座子和1μg SB转座酶mRNA核转染。(B)细胞用指示量的SB转座酶和0.75μg SB转座子核转染。对于所有样品，流式分析在核转染后第14天进行。对于该图中所示的所有图表，Y轴范围为0-250K，增量为50K，X轴范围为0-10⁵，指数差为10。

具体实施方式

本文公开了用于对免疫细胞进行离体遗传修饰的组合物和方法，其包括向所述免疫细胞递送：(a)包含编码转座酶的序列的核酸或氨基酸序列，和(b)包含编码转座子的DNA序列的重组且非天然产生的DNA序列。在某些实施方式中，所述方法还包括如下步骤：用一种或多种细胞因子刺激免疫细胞。

本发明的Centyrin可包含蛋白质支架，其中，所述支架能够特异性结合抗原。本发明的Centyrin可包含蛋白质支架，其含有至少一个纤连蛋白型III(FN3)结构域的共有序列，其中，所述支架能够特异性结合抗原。所述至少一个纤连蛋白型III(FN3)结构域可源自人类蛋白质。所述人类蛋白质可以是生腱蛋白-C。所述共有序列可包含LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT(SEQID NO:5)或MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT(SEQ ID NO:6)。所述共有序列可包含与如下序列至少74％相同的氨基酸序列：LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT(SEQ ID NO:5)或MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT(SEQ ID NO:6)。所述共有序列可由包含如下序列的核酸序列编码：atgctgcctgcaccaaagaacctggtggtgtctcatgtgacagaggatagtgccagactgtcatggactgctcccgacgcagccttcgatagttttatcatcgtgtaccgggagaacatcgaaaccggcgaggccattgtcctgacagtgccagggtccgaacgctcttatgacctgacagatctgaagcccggaactgagtactatgtgcagatcgccggcgtcaaaggaggcaatatcagcttccctctgtccgcaatcttcaccaca(SEQ ID NO:7)。所述共有序列可在如下部分中的一个或多个位置处经修饰：(a)A-B环，其在所述共有序列的第13-16位包含氨基酸残基TEDS(SEQ ID NO:8)或由其组成；(b)B-C环，其在所述共有序列的第22-28位包含氨基酸残基TAPDAAF(SEQ ID NO:9)或由其组成；(c)C-D环，其在所述共有序列的第38-43位包含氨基酸残基SEKVGE(SEQ ID NO:10)或由其组成；(d)D-E环，其在所述共有序列的第51-54位包含氨基酸残基GSER(SEQ ID NO:11)或由其组成；(e)E-F环，其在所述共有序列的第60-64位包含氨基酸残基GLKPG(SEQ ID NO:12)或由其组成；(f)F-G环，其在所述共有序列的第75-81位包含氨基酸残基KGGHRSN(SEQ IDNO:13)或由其组成；或(g)(a)-(f)的任何组合。本发明的Centyrin可包含至少5个纤连蛋白型III(FN3)结构域的共有序列，至少10个纤连蛋白型III(FN3)结构域的共有序列或至少15个纤连蛋白型III(FN3)结构域的共有序列。所述支架可以以选自下述的至少一种亲和性来结合抗原：少于或等于10^-9M，少于或等于10^-10M，少于或等于10^-11M，少于或等于10^-12M，少于或等于10^-13M，少于或等于10^-14M，和少于或等于10^-15M的K_D。K_D可由表面等离子体共振确定。

术语“抗体模拟物”意在描述这样的有机化合物，其特异性结合靶序列且具有与天然产生的抗体不同的结构。抗体模拟物可包括蛋白质、核酸，或小分子。本发明的抗体模拟物特异性结合的靶序列可以是抗原。抗体模拟物可提供优于抗体的优越性质，包括但不限于，优越的溶解性、组织透过性、对于热和酶的稳定性(例如对于酶促降解的抗性)，和更低的生产成本。示例性抗体模拟物包括但不限于，亲和体(affibody)、Afflilin分子、粘合素(affimer)、Affitin分子，阿尔法体(alphabody)、抗运载蛋白(anticalin)，和Avimer分子(也称作亲和力多聚体)、DARPin(经设计的锚蛋白重复蛋白)、Fynomer、Kunitz结构域肽，或单体(monobody)。

本发明的亲和体分子包含蛋白质支架，其包含无任何二硫桥的一个或多个α螺旋或由其组成。优选地，本发明的亲和体分子包含三个α螺旋或由其组成。例如，本发明的亲和体分子可包含免疫球蛋白结合结构域。本发明的亲和体分子可包含蛋白质A的Z结构域。

本发明的Affilin分子包含蛋白质支架，其通过对例如γ-B晶状体蛋白或泛素的暴露的氨基酸进行修饰而产生。Affilin分子在功能上模拟抗体对抗原的亲和性，但结构上不模拟抗体。在用于制造Affilin的任何蛋白质支架中，在正确折叠的蛋白质分子中，可被溶剂或可能的结合伴侣触及的那些氨基酸被认为是暴露的氨基酸。这些暴露的氨基酸中的任何一个或多个均可经修饰以特异性结合至靶序列或抗原。

本发明的粘合素分子包含蛋白质支架，所述蛋白质支架含有高度稳定的蛋白质，其经工程改造以展现肽环，所述肽环为特定的靶序列提供高亲和性结合位点。本发明的示例性粘合素分子包含基于胱抑素蛋白或其三级结构的蛋白质支架。本发明的示例性粘合素分子可共有共同三级结构，其包含位于反平行β片层顶部的α-螺旋。

本发明的Affitin分子包含人工蛋白支架，其结构可以源自，例如，DNA结合蛋白质(例如DNA结合蛋白质Sac7d)。本发明的Affitin选择性地结合至靶序列，其可以是抗原的全部或部分。本发明的示例性Affitin通过如下方式产生：使一个或多个氨基酸序列在DNA结合蛋白的结合表面上随机化，并且使所得蛋白质经历核糖体展示和选择。本发明的Affitin的靶序列可存在于，例如，肽、蛋白质、病毒或细菌的基因组中或表面上。在本发明的某些实施方式中，Affitin分子可被用作酶的特异性抑制剂。本发明的Affitin分子可包括耐热蛋白质或其衍生物。

本发明的阿尔法体分子也可称作细胞穿透型阿尔法体(CPAB)。本发明的阿尔法体分子包含小蛋白质(通常少于10kDa)，其结合至不同的靶序列(包括抗原)。阿尔法体分子能够到达并结合至胞内靶序列。结构上，本发明的阿尔法体分子包含形成单链α螺旋(类似于天然产生的卷曲螺旋结构)的人工序列。本发明的阿尔法体分子可包含蛋白质支架，该蛋白质支架含有经修饰以特异性结合靶蛋白的一个或多个氨基酸。无关于所述分子的结合特异性，本发明的阿尔法体分子保持正确折叠和热稳定性。

本发明的抗运载蛋白分子包含结合至蛋白质或小分子中的靶序列或位点的人工蛋白。本发明的抗运载蛋白分子可包含源自人类脂质运载蛋白的人工蛋白。本发明的抗运载蛋白分子可用于替代，例如，单克隆抗体或其片段。抗运载蛋白分子可显示优于单克隆抗体或其片段的优越组织透过性和热稳定性。示例性本发明的抗运载蛋白分子可包含约180个氨基酸，具有约20kDa的质量。结构上，本发明的抗运载蛋白分子包含桶结构，该桶结构包含由环成对连接的反平行β链和附接的α螺旋。在优选实施方式中，本发明的抗运载蛋白分子包含桶结构，该桶结构包含由环成对连接的八个反平行β链和附接的α螺旋。

本发明的Avimer分子包含特异性结合至靶序列(其也可为抗原)的人工蛋白。本发明的Avimer可识别相同靶标中或不同靶标中的多个结合位点。当本发明的Avimer识别多于一个靶标时，该Avimer模拟双特异抗体的功能。人工蛋白Avimer可包含各自为约30-35个氨基酸的两个或更多个肽序列。这些肽可通过一个或多个接头肽连接。Avimer的一个或多个肽的氨基酸序列可源自膜受体的A结构域。Avimer具有刚性结构，其可任选地包含二硫键和/或钙。相比抗体，本发明的Avimer可显示更高的热稳定性。

本发明的DARPin(经设计的锚蛋白重复蛋白)包含对于靶序列具有高特异性和高亲和性的经遗传工程改造的、重组或嵌合蛋白。在某些实施方式中，本发明的DARPin源自锚蛋白，并且任选地，包含锚蛋白的至少三个重复基序(也称作重复结构单元)。锚蛋白介导高亲和性蛋白质-蛋白质相互作用。本发明的DARPin包含大靶标相互作用表面。

本发明的Fynomer包含小结合蛋白质(约7kDa)，其源自人Fyn SH3结构域且经工程改造以与抗体等同的亲和性和等同的特异性结合至靶序列和分子。

本发明的Kunitz结构域肽包含蛋白质支架，该蛋白质支架包含Kunitz结构域。Kunitz结构域包含用于抑制蛋白酶活性的活性位点。结构上，本发明的Kunitz结构域包含富含二硫化物的α+β折叠。该结构由牛胰蛋白酶抑制剂例示。Kunitz结构域肽识别特定蛋白质结构并且作为竞争性蛋白酶抑制剂发挥作用。本发明的Kunitz结构域可包含艾卡拉肽(Ecallantide)(源自人类脂蛋白相关的凝结抑制剂(LACI))。

本发明的单体是小蛋白质(包含约94个氨基酸并且具有约10kDa的质量)，其在尺寸上与单链抗体相当。这些经遗传工程改造的蛋白质特异性结合靶序列(包括抗原)。本发明的单体可特异性靶向一个或多个不同的蛋白质或靶序列。在优选实施方式中，本发明的单体包含蛋白质支架，所述蛋白质支架模拟人纤连蛋白的结构，且更优选地，模拟纤连蛋白的第十胞外III型结构域的结构。所述纤连蛋白的第十胞外III型结构域，以及其单体模拟物，包含七个β片层，它们在对应于抗体的三个互补决定区(CDR)的各侧上形成桶和三个暴露的环。与抗体的可变结构域的结构不同，单体缺乏供于金属离子的任何结合位点以及中心二硫键。多特异性单体可通过修饰BC和FG环而被最优化。本发明的单体可包括阿迪连接素(adnectin)。

如本文全文所用的单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代对象，除非文本中另有明确说明。因此，例如，提到“方法”包括多种这类方法，提到“剂量”包括本领域技术人员已知的一种或多种剂量和其等同物，等等。

术语“约”或“大约”表示在本领域普遍技术人员确定的特定数值的可接受误差范围内，这将取决于该数值的测量或确定方式，例如，测量体系的极限。例如，“约”可表示在1个或多个标准偏差范围内。或者，“约”可表示给定值的多至20％，或多至10％，或多至5％，或多至1％的范围。或者，尤其对于生物系统或过程而言，该术语可表示某值的一定数量级内，优选5倍内，更优选2倍内。本申请和权利要求书中描述具体值时，除非另有说明，假定术语“约”表示该具体值的可接受的误差范围内。

本发明提供分离的或基本纯化的多核苷酸或蛋白质组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白或其生物活性部分基本或本质上不含其天然产生环境中通常伴随多核苷酸或蛋白或与之相互作用的组分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质通过重组技术产生时基本不含其它细胞物质或培养基，或通过化学方法合成时基本不含化学物质前体或其它化学物质。任选地，“分离的”多核苷酸不含该多核苷酸来源的生物体基因组DNA中天然侧接所述多核苷酸(即位于多核苷酸5'和3'末端处的序列)的序列(任选蛋白编码序列)。例如，在各种实施方式中，分离的多核苷酸包含该多核苷酸来源的细胞基因组DNA中天然侧接所述多核苷酸的少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列。基本不含细胞物质的蛋白质包括具有少于约30％、20％、10％、5％或1％(干重)蛋白质污染物的蛋白质的制剂。本发明的蛋白质或其生物活性部分经重组生产时，最佳的培养基具有少于约30％、20％、10％、5％或1％(干重)的化学物质前体或非感兴趣蛋白的化学物质。

本发明提供公开的DNA序列和由这些DNA序列编码的蛋白质的片段和变体。如本文全文所用的术语"片段"指DNA序列的部分或氨基酸序列的部分，以及由其编码的蛋白质。包含编码序列的DNA序列的片段可编码这样的蛋白质片段，其保留原始蛋白质的生物活性，因而保留对于靶DNA序列的DNA识别或结合活性，如本文所述。或者，可用作杂交探针的DNA序列的片段一般不编码保留生物活性或不保留启动子活性的蛋白质。因此，DNA序列的片段的范围可以是本发明的全长多核苷酸的长达至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸，和长达该全长多核苷酸。

本发明的核酸或蛋白质可通过模块方法构建，该模块方法包括在靶载体中预先组装单体单元和/或重复单元，该靶载体可随后被组装成最终目的载体。本发明的多肽可包含本发明的重复单体(repeat monomer)，并且可通过模块方法构建，该模块方法通过在靶载体中预先组装重复单元来进行，该靶载体可后续被组装成最终目的载体。本发明提供由该方法产生的多肽以及编码这些多肽的核酸序列。本发明提供包含编码由该模块方法产生的多肽的核酸序列的宿主生物体和细胞。

术语"抗体"以最广泛含义使用，并且尤其涵盖单一单克隆抗体(包括激动剂和拮抗剂抗体)和具有多表位特异性的抗体组合物。本发明范围还包括本文相关抗体的天然或合成类似物、突变体、变体、等位基因、同源物和直系同源物(本文统称为“类似物”)的应用，如本文所定义。因此，根据本文的一个实施方式，术语“本文相关抗体”以其最广泛含义涵盖此类类似物。一般而言，相比本文中定义的本文相关抗体，在此类类似物中，一个或多个氨基酸残基可被替代、缺失和/或添加。

本文中所用的"抗体片段"及其全部语法变化形式，定义为包含完整抗体的抗原结合位点或可变区的完整抗体的部分，其中，所述部分不含完整抗体的Fc区的恒定重链结构域(即CH2、CH3和CH4，视抗体同种型而定)。抗体片段的示例包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂和Fv片段；双抗体；是由连续氨基酸残基的不间断序列组成的一级结构的多肽的的任何抗体片段(本文称作"单链抗体片段"或"单链多肽")，包括但不限于(1)单链Fv(scFv)分子，(2)单链多肽，所述单链多肽仅包含一个轻链可变结构域或其含有所述轻链可变结构域的三个CDR的片段，不含相联的重链部分，和(3)单链多肽，所述单链多肽仅包含一个重链可变区或其含有所述重链可变区的三个CDR的片段，不含相联的轻链部分；和由抗体片段形成的多特异性或多价结构。在包含一个或多个重链的抗体片段中，所述一个或多个重链可包含完整抗体的非Fc区中所见的任何恒定结构域序列(例如，IgG同种型中的CHI)，和/或可包含完整抗体中所见的任何铰链序列，和/或可包含融合至或位于铰链序列或所述重链的恒定结构域序列中的亮氨酸拉链序列。该术语还包括单域抗体(“sdAB”)，其一般指具有单一单体可变抗体结构域的抗体片段，(例如，来自骆驼科)。本领域普通技术人员能够容易地理解此类抗体片段类型。

"结合"指大分子之间(例如蛋白质与核酸之间)的序列特异性、非共价相互作用。只要相互作用作为整体为序列特异性的，则不要求结合相互作用的所有组分都是序列特异性的(例如，与DNA主链中的磷酸残基接触)。

术语“包括”或“包含”意在表示所述组合物和方法包括所提及的要素，但并不排除其它要素。当用以定义组合物和方法时，“基本由……组成”应表示排除当用于意图目的时对该组合具有任何基本意义的其它要素。因此，本文中定义的基本由某些要素组成的组合物将不排除痕量污染物或惰性运载体。“由……组成”应表示排除多于其它成分的微量元素和基本方法步骤的部分。通过各这些转换术语定义的实施方式在本发明范围内。

术语“表位”指多肽的抗原性决定簇。表位可包含处于一定空间构象的三个氨基酸，其对于该表位而言是独特的。一般而言，表位由至少4、5、6或7个此类氨基酸组成，且更常见地，由至少8、9或10个此类氨基酸组成。用于确定氨基酸空间构象的方法是本领域已知的，并且包括，例如，x射线结晶法和二维核磁共振法。

本文所用的“表达”是指多核苷酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸源自基因组DNA，则表达可包括真核细胞中mRNA的剪接。

"基因表达"指将基因所含信息转化成基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核糖酶、shRNA、微小RNA、结构RNA或任何其它类型的RNA)或通过mRNA翻译产生的蛋白质。基因产物还包括经修饰的RNA，通过如下加工修饰，例如加帽、聚腺苷酸化、甲基化，和编辑，以及通过如下加工修饰的蛋白质，例如，甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、豆蔻酰化和糖基化。

基因表达的"调控"或"调节"指基因活性的改变。表达的调控可包括但不限于，基因活化和基因阻遏。

术语“操作性连接的”或其等同形式(例如“可操作地连接的”)表示两个或更多个分子相对于彼此定位，从而它们能够相互作用以影响可由一个或两个分子或其组合而引起的功能。

公开了通过非共价方式连接的组分和制造与使用通过非共价方式连接的组分的方法。不同的组分可具有本文所述的多种不同形式。例如，通过非共价方式连接的(即，操作性连接的)蛋白质可用于允许暂时性的相互作用，其能避免本领域中的一个或多个问题。通过非共价方式连接的组分(例如蛋白质)相关联和相脱离的能力使得仅在或主要在某些情形(例如需要此类关联以获得所需活性)下的功能性关联成为可能。连接可进行足够的时间长度以允许获得所需效果。

公开了将蛋白质导向生物体的基因组中的特定基因座的方法。所述方法可包括如下步骤：提供DNA定位组分和提供效应物分子，其中，所述DNA定位组分和所述效应物分子能够通过非共价连接方式操作性地连接。

术语"scFv"指单链可变片段。scFv是免疫球蛋白的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白，由接头肽相连。接头肽的长度可以是约5-40个氨基酸或约10-30个氨基酸或约5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸。单链可变片段缺乏完整抗体分子中存在的恒定Fc区，从而缺乏用于纯化抗体的常见结合位点(例如，蛋白质G)。该术语还包括内抗体(intrabody)形式的scFv，其为在细胞胞质中稳定且可结合至胞内蛋白质的抗体。

术语“单域抗体”表示这样的抗体片段，所述抗体片段具有单一单体可变抗体结构域，其能够选择性地结合至特定抗原。单域抗体一般是约110个氨基酸长的肽链，包含重链抗体或常见IgG的一个可变结构域(VH)，其对于抗原的亲和性一般与完整抗体相似，但更耐热且对清洁剂和高浓度的尿素更稳定。示例为源自骆驼科或鱼抗体的那些。或者，单域抗体可由具有四条链的常见鼠或人IgG制得。

本文中所用的术语“特异性地结合”和“特异性结合”指抗体、抗体片段或纳米抗体优先结合至不同抗原的均匀混合物中存在的特定抗原的能力。在某些实施方式中，特异性结合相互作用将区别样品中的期望抗原和不期望抗原，在一些实施方式中，差异多于约10倍-100倍或更多(例如，多于约1000-或10,000倍)。“特异性”指免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，例如纳米抗体，相对于不同抗原性靶标，优先结合至一种抗原性靶标的能力，其不一定表示高亲和性。

"靶位点"或"靶序列"是限定结合分子将结合的核酸部分的核酸序列，前提是存在结合的充分条件。

术语“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”指共价连接在一起的至少两个核苷酸。对于单链的描述也定义互补链的序列。因此，核酸还可涵盖所述单链的互补链。本发明的核酸还涵盖基本相同的核酸及其保留相同结构或编码相同蛋白质的互补物。

本发明的探针可包含单链核酸，其在严谨杂交条件下杂交至靶序列。因此，本发明的核酸可指在严谨杂交条件下杂交的探针。

本发明的核酸可以是单链或双链的。本发明的核酸可包含双链序列，甚至在大多数分子为单链的情况下也是如此。本发明的核酸可包含单链的序列，甚至在大多数分子为双链的情况下也是如此。本发明的核酸可包括基因组DNA、cDNA、RNA或其杂合体。本发明的核酸可包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合。本发明的核酸可包含碱基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤)的组合。本发明的核酸可经合成以包含非天然氨基酸修饰。本发明的核酸可通过化学合成方法或通过重组方法来获得。

本发明的核酸，它们的完整序列或其任何部分，可以是非天然产生的。本发明的核酸可包含非天然产生的一个或多个突变、取代、缺失或插入，其使完整核酸序列为非天然产生的。本发明的核酸可包含一个或多个二重的、颠倒的或重复的序列，其所得序列为非天然产生的，使得完整核酸序列为非天然产生的。本发明的核酸可包含非天然产生的经修饰的、人工或合成核苷酸，使得完整核酸序列为非天然产生的。

鉴于遗传密码的冗余，多个核苷酸序列可编码任何特定蛋白质。本文考虑所有这些核苷酸序列。

如本文全文所用的术语"操作性连接的"指基因的表达处于其空间连接的启动子的控制之下。启动子可为与其控制的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子和基因间的距离可以与衍生该启动子的基因中该启动子与其控制的基因的距离大致相同。启动子与基因之间的距离的变化可经调节而不失去启动子功能。

如本文全文所用的术语"启动子"指合成或天然衍生的分子，其能够赋予、活化或增强核酸在细胞中的表达。启动子可包含一个或多个特定的转录调节序列以进一步增强核酸的表达和/或改变其空间表达和/或暂时表达。启动子还可包含远端增强子或阻抑物元件，其可位于距转录起始位点多达几千个碱基对处。启动子可源自多种来源，包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物。启动子针对其中发生表达的细胞、组织或器官或针对其中出现表达的发育阶段，或响应外部刺激如生理应激、病原体、金属离子或诱导物质，以组成型方式或差异性方式调节基因组分的表达。启动子的代表性的示例包括细菌噬菌体T7启动子、细菌噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、EF-1Α启动子、CAG启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子和CMV IE启动子。

如本文全文所用的术语“基本互补的"指第一序列与第二序列的互补物在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540，或更多个核苷酸或氨基酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同，或者这两个序列在严谨杂交条件下杂交。

如本文全文所用的术语"基本相同的"指第一和第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同；或者对于核酸而言，第一序列与第二序列的互补物基本互补的情况。

如本文全文所用的术语"变体"，当用于描述核酸时，指(i)参考核苷酸序列的部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补物；(iii)与参考核酸或其互补物基本相同的核酸；或(iv)在严谨条件下与参考核酸、其互补物或与其基本相同的序列杂交的核酸。

如本文全文所用的术语"载体"指含复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、细菌噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自复制染色体外载体，且优选地，是DNA质粒。载体可包含氨基酸与DNA序列、RNA序列，或与DNA和RNA序列的组合。

如本文全文所用的术语"变体"，当用于描述肽或多肽时，指通过氨基酸的插入、缺失或保守取代而在氨基酸序列中有所不同，但保留至少一种生物活性的肽或多肽。变体也可表示这样的蛋白质，其氨基酸序列与保留至少一种生物活性的蛋白质的参考氨基酸序列基本相同。

氨基酸的保守取代，即，其中氨基酸用具有相似性质(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替代，在本领域中认为通常引起较小变化。这些较小变化可部分通过考虑氨基酸的亲水(hydropathic)指数而鉴定，如本领域所理解的那样。Kyte等，J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数基于对其疏水性和带电性的考虑。具有相似亲水指数的氨基酸可被取代并仍保留蛋白质功能。在一个方面中，取代具有±2亲水指数的氨基酸。氨基酸的亲水性也可用于揭示能够获得保留生物功能的蛋白质的取代。就肽而言，对于氨基酸的亲水性的考虑允许计算该肽的最大局部平均亲水性，其已被报道为与抗原性和免疫原性良好相关的有用度量。美国专利号4,554,101，其通过引用全文的方式纳入本文。

具有相似亲水性值的氨基酸的取代可导致保留生物活性(例如免疫原性)的肽。取代可采用彼此的亲水性值在±2以内的氨基酸进行。氨基酸的疏水性指数和亲水性值均受该氨基酸的具体侧链的影响。与该观察结论相一致，与生物功能相容的氨基酸取代理解为取决于那些氨基酸的相对相似性，尤其是那些氨基酸的侧链，如由疏水性、亲水性、带电性、大小和其它性质所揭示的那样。

本文所用的“保守”氨基酸取代可如下表A、B或C中定义。在一些实施方式中，融合多肽和/或编码所述融合多肽的核酸包括保守取代，所述保守取代已通过修饰编码本发明多肽的多核苷酸而被引入。氨基酸可根据物理性质分类，并且构成二级和三级蛋白质结构。保守取代是一个氨基酸被具有相似性质的另一个氨基酸取代的情况。示例性保守取代示于表A。

表A--保守取代I

或者，保守氨基酸可按Lehninger(《生物化学》(Biochemistry)，第二版；沃斯出版公司(Worth Publishers,Inc.)，纽约州纽约，(1975)，第71-77页)所述分类，如表B所示。

表B--保守取代II

或者，示例性保守取代示于表C。

表C--保守取代III

应理解，本发明的多肽意在包括含有氨基酸残基的一个或多个插入、缺失或取代，或其任何组合，以及不同于氨基酸残基的插入、缺失，或取代的修饰的多肽。本发明的多肽或核酸可包含一个或多个保守取代。

如本文全文所用的术语“多于一个”的前述氨基酸取代指，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19，或20或更多的所述氨基酸取代。术语“多于一个”可指2、3、4或5个所述氨基酸取代。

本发明的多肽和蛋白质、它们的完整序列或其任何部分，可以是非天然产生的。本发明的多肽和蛋白质可包含非天然产生的一个或多个突变、取代、缺失或插入，使得完整氨基酸序列是非天然产生的。本发明的多肽和蛋白质可包含一个或多个二重的、颠倒的或重复的序列，其所得序列为非天然产生的，使得完整氨基酸序列为非天然产生的。本发明的多肽和蛋白质可包含非天然产生的经修饰的、人工或合成氨基酸，使得完整氨基酸序列为非天然产生的。

如本文全文所用的“序列相同性”可采用用于对两个序列进行blast检索(bl2seq)的独立可执行BLAST引擎程序来确定，该程序可获自美国国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)的ftp站点，采用默认参数(Tatusova和Madden,FEMS Microbiol Lett.,1999,174,247-250；其通过引用其全文的方式纳入本文)。术语"相同的"或"相同性"，当用于两个或更多个核酸或多肽序列的情况中时，指在各序列的特定区域上相同的残基的具体百分比。该百分比可通过如下方式计算：将两个序列最优地对齐，在具体区域比较这两个序列，确定在这两个序列中同时出现的相同残基的位置数量，以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以该具体区域中位置总数量，和，将结果乘以100，以产生序列相同性的百分比。在两个序列具有不同长度，或比对产生一个或多个错列(staggered)端，且比较的具体区域仅包括单一序列的情况中，单一序列的残基包括在该计算的分母而非分子中。当比较DNA和RNA时，可认为胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)是等同的。鉴定可手动进行或采用计算机序列算法例如BLAST或BLAST 2.0进行。

如本文全文所用的术语"内源性的"，指与靶基因或作为导入对象的宿主细胞天然相关联的核酸或蛋白质序列。

如本文全文所用的术语"外源性"，指与靶基因或作为导入对象的宿主细胞不天然相关联的核酸或蛋白质序列，包括位于非天然产生的基因组位置的天然产生的核酸序列，或天然产生的核酸(例如，DNA序列)的非天然产生的多个拷贝。

本发明提供将包含DNA序列的多核苷酸构建体导入宿主细胞的方法。"导入"意在表示以这样的方式将多核苷酸构建体呈递给植物，该方式使构建体能够进入宿主细胞内部。本发明方法不依赖于用于将多核苷酸构建体导入宿主细胞的具体方法，只要多核苷酸构建体进入宿主的一个细胞内部即可。用于将多核苷酸构建体导入细菌、植物、真菌和动物的方法是本领域已知的，包括但不限于，稳定转化法、瞬时转化法，和病毒介导的方法。

"稳定转化"意在表示，导入植物的多核苷酸构建体整合进入宿主基因组，并且能够由其后代遗传。"瞬时转化"意在表示导入宿主的多核苷酸构建体不整合进入宿主基因组。

如本文全文所用的术语"经遗传修饰的植物(或转基因植物)"指在其基因组中包含外源性多核苷酸的植物。一般而言，且优选地，该外源性多核苷酸稳定整合进入基因组，从而该多核苷酸被连续世代遗传下去。所述外源性多核苷酸可以单独或作为重组表达盒的部分整合入基因组。"转基因(的)"在本文中用于包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，其基因型已因外源性核酸的存在而被改变，包括那些初始经改变的转基因以及从初始转基因通过有性杂交或无性繁殖而产生的那些。本文所用的术语"转基因"不涵盖通过常规植物种植方法或通过天然产生的事件(例如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)对基因组(染色体或染色体外)造成的改变。

如本文全文所用的术语"修饰"意在表示该序列被认为由多肽结合而简单修饰。其不意在表示核苷酸序列发生变化，尽管这些(以及其它)变化能致使多肽与感兴趣核酸的后续结合。一些实施方式中，所述核酸序列是DNA。感兴趣核酸的修饰(就经修饰以包含模块重复单元的多肽与核酸的结合而言)可通过多种方法(例如凝胶迁移率变动分析、采用经标记多肽--标记物可包括放射性、荧光、酶或生物素/链酶亲和素标记物)中的任一种来检测。感兴趣核酸序列的修饰(及其缺失)可以是全部所需形式(例如在疾病诊断中)。然而，期望进行对样品的进一步处理。方便起见，使多肽(和与之特异性结合的核酸序列)与样品的剩余部分分离。有利地，使多肽-DNA复合物结合至固相支持物，以促进所述分离。例如，多肽可存在于丙烯酰胺或琼脂糖凝胶基质中，或者更优选地，固定于膜表面上或处于微滴定板的孔中。

除非有明确的另外说明，所有的百分数和比例/比率都是以重量计。

除非另有说明，所有百分比和比例是基于组合物总量计算的。

贯穿本公开内容给出的每个最大数值限制包括每个较低的数值限制，如同这些较低的数值限制在本文中明确写出一样。本公开全文中给出的每个最小数值限定包括每个较高的数值限定，如同这些较高的数值限定清楚写在这里。本公开全文中给出的每个数值范围包括落入所述较宽数值范围的每个较窄数值范围，如同本文中明确写明这些较窄数值范围。

本文所述的值不应理解为严格限定为所述的精确的数值。相反，除非另有具体说明，所述值各自用于指所述的值和该值周围的功能等同的范围。例如，公开为“20μm”的值意在表示“约20μm”。

除非明确排除或者其他方式限制，否则本文所引述的每篇文献，包括任何交叉引用和相关的专利或申请，通过引用结合入本文。任何文献的引用不是对其作为本文所公开的或受权利要求书保护的任何发明的现有技术，或者其单独地或者与任何其它参考文献的任何组合，或者参考、提出、建议或公开任何此类发明的认可。此外，当本文中术语的任何含义或定义与以引用方式并入的文件中术语的任何含义或定义矛盾时，应当服从在本文中赋予该术语的含义或定义。

虽然已经图示和描述了本公开的特定实施例，但是在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以进行各种其他改变和修改。所附权利要求的范围包括在本公开范围内的所有这些改变和修改。

实施例

为了可以更有效地理解本文公开的发明，下面提供实施例。应当理解，这些实施例仅用于说明目的，不应理解为以任何方式限制本发明。除非另有说明，否则贯穿这些实施例的分子克隆反应和其它标准重组DNA技术，根据Maniatis等，《分子克隆–实验室手册》(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港出版社(Cold Spring HarborPress)(1989)所述的方法进行，采用市售可得的试剂。

实施例1：T细胞的离体遗传修饰

采用piggyBac^TM(PB)转座子系统对人类淋巴细胞进行遗传修饰，以供于自体同源的CAR-T免疫治疗和其它应用的生产。采用质粒DNA转座子和转座酶，对纯化自患者血液或血清法产物的T淋巴细胞进行电穿孔。数种不同电穿孔系统已用于转座子系统的T细胞递送，包括Neon(赛墨飞世尔公司(Thermo Fisher))、BTX ECM 830(哈佛仪器公司(HarvardApparatus))、Gene Pulser(生物辐射公司(BioRad))、MaxCyte PulseAgile(迈克赛特公司(MaxCyte))和Amaxa 2B和Amaxa 4D(隆萨公司(Lonza))。一些采用制造商提供或推荐的电穿孔缓冲液以及数种自行开发的缓冲液测试。结果与静息T淋巴细胞尤其难以DNA转染且似乎电穿孔效率(由来自电穿孔的质粒的GFP表达度量)和细胞活力之间存在逆相关的普遍认知一致。图1显示了测试多重电穿孔系统和核转染程序的实验的实施例。

为了进一步测试质粒DNA在核转染过程中对T细胞是否具有毒性，原代人T淋巴细胞用两种不同DNA质粒电穿孔。第一质粒为pmaxGFP^TM质粒，其在Lonza Amaxa核转染试剂盒中作为对照质粒提供。其由HPLC高度纯化，且不含可检测水平的内毒素。第二质粒为我们自行生成的PB转座子，其编码人EF1α启动子驱动型GFP。由来自电穿孔的质粒的GFP表达度量的转染效率，以及细胞活力，在电穿孔后第2、3和6天由FACS评估。数据示于图2。尽管截止电穿孔后第6天，模拟电穿孔的细胞(无质粒DNA)显示相对高水平的细胞活力，54％，采用任一质粒电穿孔的T细胞活力仅为1.4-2.6％。这些数据显示质粒DNA对于T淋巴细胞具有细胞毒性。此外，这些数据显示DNA介导的毒性并不归因于转座子元件(例如ITR区域或核心绝缘子)，因为pmaxGFP^TM质粒缺乏这些元件且在相同DNA浓度同样是细胞毒性的。两种质粒的大小大致相同，表示相似量的DNA被电穿孔进入T细胞。

为了测试T细胞中DNA介导的毒性是否为剂量依赖性的，我们对我们的PB-GFP质粒进行了滴定。图3显示，随着向核转染反应添加的质粒DNA的剂量递增(1.3、2.5、5.0、10.0和20.0μg的质粒DNA)，细胞活力下降，如在核转染后第1天和第5天检测的那样。截止第4天，甚至1.3μg的质粒DNA造成T细胞活力的2.4倍下降。

很明显地，质粒DNA在核转染过程中对于T细胞具有毒性，所以我们考虑了胞外质粒DNA是否引起细胞死亡。图4显示胞外质粒DNA对于T细胞无细胞毒性。在该实验中，电穿孔后45分钟向细胞添加5μg的质粒DNA，且在第1天或第4天几乎没有观察到细胞死亡。相似地，在不存在电穿孔的情况下向核转染反应添加5μg的质粒DNA时，几乎没有观察到细胞死亡。然而，当质粒DNA在电穿孔反应之前添加时，细胞在第1天显示细胞活力的2.0倍减少，且在第4天显示13.2倍减少。

因为DNA介导的毒性是剂量依赖性的，我们接下来着眼于减少递送至T细胞的转座所需的DNA总量的方式。实现该目的的一种相对直接的方式是以编码为mRNA而非编码为DNA的形式递送转座酶。mRNA向原代人T细胞的递送非常高效，获得高转染效率和高活力。我们将Super piggyBac^TM(sPBo)转座酶亚克隆进入我们自行研获的mRNA生成载体并产生了高质量的sPBo mRNA。PB-GFP转座子与不同剂量的sPBo mRNA(30、10、3.3、3、1、0.33μg mRNA)在Jurkat细胞中的共同递送显示在测试的所有剂量下的强转座(图5)。这些数据显示sPBo转座酶可被递送并且与质粒DNA或mRNA具有等同的效果。此外，sPBo mRNA的量在Jurkats中的总体转座效率方面(就总体GFP+细胞百分比或GPF表达的MFI而言)几乎没有产生差异。为了研究对于T淋巴细胞是否也是如此，我们将PB-GFP与sBPo质粒DNA(3:1比率)或5μg的sPBomRNA进行递送。在核转染反应和IL7与IL15添加后七(7)天，评估GFP转座。图6显示sPBomRNA高效介导了GFP转座子向T淋巴细胞中的转座。重要的是，当以mRNA形式(相对于pDNA)共同递送sPBo时，T细胞活力得到改善；分别为32.4％对比25.4％。这些数据表明mRNA形式的sPBo的共同递送在递送至T细胞的质粒DNA的总量中是剂量节约的(dose-sparing)，因而具有较低细胞毒性。

因为当前的质粒转座子还包含质粒在细菌中扩增所需的主链，可通过排除该序列来显著减少DNA总量。这可通过在核转染反应之前对质粒转座子进行限制酶切消化来实现。此外，这可通过给予PCR产物形式的转座子或doggybone^TMDNA形式(其为通过排除该质粒的细菌复制所需的初始主链元件的机制而体外产生的双链DNA)的转座子来实现。

我们进行了预实验以研究质粒转座子是否需要是环形的，或其是否能以线性形式递送至细胞。为此，转座子与限制性内切酶(ApaLI)孵育过夜以使该质粒线性化。未经切割或线性化的质粒被电穿孔进入原代T淋巴细胞，且在两天后评估GFP表达。图7显示线性化的质粒也被高效递送至细胞核。这些数据显示，线性转座子产物也可被高效地电穿孔进入原代人T细胞。

我们在上文中显示了质粒DNA在原代T淋巴细胞中具有毒性，但我们观察到，该毒性作用在肿瘤细胞系和其它转化细胞中并没有那么剧烈。基于该观察结果，我们假设原代T淋巴细胞可能难以进行质粒DNA转染，这归因于提高的DNA感应途径，其将会保护免疫细胞免受病毒和细菌感染。如果这些数据是提高的DNA感应机制的结果，那么则有可能通过向核转染后反应添加DNA感应途径抑制剂来增强质粒转染效率和/或细胞活力。因此，测试了抑制TLR-9途径、胱冬酶途径，或胞质双链DNA感应中涉及的那些途径的多种不同试剂。这些试剂包括巴弗洛霉素A1，其为干扰干扰内体酸化且阻滞TLR9的NFkB信号转导的自噬性抑制剂，氯喹，其为TLR9拮抗剂，奎纳克林，其为TLR9拮抗剂和cGAS拮抗剂，AC-YVAD-CMK，其为靶向AIM2途径的胱冬酶1抑制剂，Z-VAD-FMK，其为泛胱冬酶抑制剂，Z-IETD-FMK，其为由TLR9途径触发的胱冬酶8抑制剂。此外，我们还通过添加细胞因子IL7和IL15，以及添加抗CD3抗CD28Human T-Expander CD3/CD28珠来测试了对电穿孔的T细胞的刺激。结果见图8。我们发现，在测试剂量下，在核转染后第4天，这些化合物或胱冬酶抑制剂对于细胞活力几乎没有任何阳性作用。然而，我们认识到，可能需要进一步剂量研究来更好地测试这些试剂。也可更有效地从遗传上抑制这些途径。两个核转染后条件确实增强了T细胞活力。当与仅导入质粒转座子而无额外处理的情况相比，添加IL7和IL15，不论它们在电穿孔后1小时或1天添加，均使活力增强超过3倍。此外，采用活化器或扩增器(expander)珠对核转染后的T细胞进行刺激也显著增强了T细胞活力；相比在之后2天进行添加的情况而言，珠在核转染后1小时或1天添加的刺激更佳。最后，我们还测试了ROCK抑制剂，以及死细胞从培养物的移除(采用来自美天旎(Miltenyi)的死细胞移除试剂盒)，但未观察到细胞活力的改善。

为了在这些显示对核转染后T细胞进行刺激能改善活力的发现结果上做出进一步扩展，我们利用细胞因子IL7和IL15的添加来重复该研究。图9显示，与无处理的情况相比，在核转染后即刻或长达之后1小时，以各20ng/mL剂量添加这些细胞因子使细胞活力增强高达2.9倍。在长达核转染后1天添加这些细胞因子也增强活力，但不如先前时间点处所得结果那样强。

因为我们发现，对核转染后T细胞进行即刻刺激能够增加细胞活力，我们假定在核转染前刺激细胞也能增强活力和转染效率。为此，我们在转座子核转染之前2、3或4天刺激了原代T淋巴细胞。图10显示，在核转染反应前刺激T细胞之后共同递送转座子和转座酶的情况中，出现了一些水平的转座。预先刺激的功效可能会受刺激动力学的影响，因此可能依赖于所选扩增器(expander)技术的准确类型。

序列表

<110> 波赛伊达治疗学股份有限公司(Poseida Therapeutics, Inc.)

<120> 转座子系统及应用方法

<130> POTH-007001WO

<150> US 62/300,387

<151> 2016-02-26

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 594

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 1

Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln

1 5 10 15

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50 55 60

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Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg

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Glu Ser Met Thr Ser Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile

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210 215 220

Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val

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Gly Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val

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<211> 340

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 2

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1 5 10 15

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<211> 340

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<220>

<223> 合成构建体

<400> 3

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1 5 10 15

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340

<210> 4

<211> 1053

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 4

Met Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Ala Ile Gly Ile Thr Ser Val

1 5 10 15

Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala Gly

20 25 30

Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg

35 40 45

Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile

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485 490 495

Arg Asn Arg Gln Thr Asn Glu Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg Thr Thr

500 505 510

Gly Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu His Asp

515 520 525

Met Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu Glu

530 535 540

Asp Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu Val Asp His Ile Ile Pro

545 550 555 560

Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Lys

565 570 575

Gln Glu Glu Ala Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln Tyr Leu

580 585 590

Ser Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys His Ile

595 600 605

Leu Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys Lys Glu

610 615 620

Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln Lys Asp

625 630 635 640

Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg Gly Leu

645 650 655

Met Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Val Asn Asn Leu Asp Val Lys

660 665 670

Val Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg Lys Trp

675 680 685

Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu Asp

690 695 700

Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys Lys

705 710 715 720

Leu Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu Lys

725 730 735

Gln Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr Lys Glu

740 745 750

Ile Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe Lys Asp

755 760 765

Tyr Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Glu Leu Ile

770 775 780

Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn Thr Leu

785 790 795 800

Ile Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys Leu

805 810 815

Lys Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr His His

820 825 830

Asp Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln Tyr Gly

835 840 845

Asp Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly Asn Tyr

850 855 860

Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys Ile

865 870 875 880

Lys Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp Asp

885 890 895

Tyr Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys Leu Ser Leu Lys Pro Tyr

900 905 910

Arg Phe Asp Val Tyr Leu Asp Asn Gly Val Tyr Lys Phe Val Thr Val

915 920 925

Lys Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Glu Val Asn Ser

930 935 940

Lys Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ile Ser Asn Gln Ala

945 950 955 960

Glu Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Asn Asn Asp Leu Ile Lys Ile Asn Gly

965 970 975

Glu Leu Tyr Arg Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Leu Leu Asn Arg Ile

980 985 990

Glu Val Asn Met Ile Asp Ile Thr Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu Asn Met

995 1000 1005

Asn Asp Lys Arg Pro Pro Arg Ile Ile Lys Thr Ile Ala Ser Lys

1010 1015 1020

Thr Gln Ser Ile Lys Lys Tyr Ser Thr Asp Ile Leu Gly Asn Leu

1025 1030 1035

Tyr Glu Val Lys Ser Lys Lys His Pro Gln Ile Ile Lys Lys Gly

1040 1045 1050

<210> 5

<211> 88

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser Leu

1 5 10 15

Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu Ile

20 25 30

Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr Val

35 40 45

Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly Thr

50 55 60

Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser Asn

65 70 75 80

Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr

85

<210> 6

<211> 90

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe

20 25 30

Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu

35 40 45

Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro

50 55 60

Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg

65 70 75 80

Ser Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr

85 90

<210> 7

<211> 270

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

atgctgcctg caccaaagaa cctggtggtg tctcatgtga cagaggatag tgccagactg 60

tcatggactg ctcccgacgc agccttcgat agttttatca tcgtgtaccg ggagaacatc 120

gaaaccggcg aggccattgt cctgacagtg ccagggtccg aacgctctta tgacctgaca 180

gatctgaagc ccggaactga gtactatgtg cagatcgccg gcgtcaaagg aggcaatatc 240

agcttccctc tgtccgcaat cttcaccaca 270

<210> 8

<211> 4

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

Thr Glu Asp Ser

1

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe

1 5

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

Ser Glu Lys Val Gly Glu

1 5

<210> 11

<211> 4

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

Gly Ser Glu Arg

1

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 12

Gly Leu Lys Pro Gly

1 5

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 13

Lys Gly Gly His Arg Ser Asn

1 5

Claims

1.用于对免疫细胞进行离体遗传修饰的方法，其包括向所述免疫细胞递送，

(a)核酸或氨基酸序列，其包含编码转座酶的序列，和

(b)重组且非天然产生的DNA序列，其包含编码转座子的DNA序列。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述编码转座酶的序列是mRNA序列。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述编码转座酶的序列是DNA序列。

4.如权利要求1所述的方法，其中，所述编码转座酶的序列是氨基酸序列。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述递送步骤包括所述免疫细胞的电穿孔或核转染。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括如下步骤：用一种或多种细胞因子刺激所述免疫细胞。

7.如权利要求6所述的方法，其中，用一种或多种细胞因子刺激所述免疫细胞的步骤在递送步骤之后进行。

8.如权利要求6所述的方法，其中，用一种或多种细胞因子刺激所述免疫细胞的步骤在递送步骤之前进行。

9.如权利要求6-8中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种细胞因子包括IL-2、IL-21、IL-7和/或IL-15。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述免疫细胞是自体同源的免疫细胞。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述免疫细胞是T淋巴细胞。

12.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。

13.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述免疫细胞是细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞。

14.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述免疫细胞是自然杀伤T(NKT)细胞。

15.如权利要求2和5-14中任一项所述的方法，其中，编码转座酶mRNA序列在体外生成。

16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述转座酶是Super piggyBac^TM(sPBo)转座酶。

17.如权利要求16所述的方法，其中，所述Super piggyBac(PB)转座酶包含与如下序列至少75％相同的氨基酸序列：

MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEVSDHVSEDDVQSDTEEAFIDEVHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQPGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCWSTSKSTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISEIVKWTNAEISLKRRESMTSATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDDLFDRSLSMVYVSVMSRDRFDFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDVFTPVRKIWDLFIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRVYIPNKPSKYGIKILMMCDSGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDNWFTSIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDGPLTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGVDTLDQMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQSRKKFMRNLYMSLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNISNILPKEVPGTSDDSTEEPVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF(SEQ ID NO:1)。

18.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，所述转座酶是睡美人转座酶。

19.如权利要求18所述的方法，其中，所述睡美人转座酶是高活性睡美人SB100X转座酶。

20.如权利要求18或19所述的方法，其中，所述睡美人转座酶包含与如下序列至少75％相同的氨基酸序列：

MGKSKEISQDLRKKIVDLHKSGSSLGAISKRLKVPRSSVQTIVRKYKHHGTTQPSYRSGRRRYLSPRDERTLVRKVQINPRTTAKDLVKMLEETGTKVSISTVKRVLYRHNLKGRSARKKPLLQNRHKKARLRFATAHGDKDRTFWRNVLWSDETKIELFGHNDHRYVWRKKGEACKPKNTIPTVKHGGGSIMLWGCFAAGGTGALHKIDGIMRKENYVDILKQHLKTSVRKLKLGRKWVFQMDNDPKHTSKVVAKWLKDNKVKVLEWPSQSPDLNPIENLWAELKKRVRARRPTNLTQLHQLCQEEWAKIHPTYCGKLVEGYPKRLTQVKQFKGNATKY(SEQ ID NO:2)。

21.如权利要求18或19所述的方法，其中，所述睡美人转座酶包含与如下序列至少75％相同的氨基酸序列：

22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，包含编码转座子的DNA序列的重组且非天然产生的DNA序列是环形的。

23.如权利要求22所述的方法，其中，编码转座子的重组且非天然产生的DNA序列包含在质粒载体中。

24.如权利要求22所述的方法，其中，编码转座子的重组且非天然产生的DNA序列包含在小环DNA载体中。

25.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，编码转座子的重组且非天然产生的DNA序列是线性的。

26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，编码转座子的重组且非天然产生的DNA序列是体外生成的。

27.如权利要求25或26所述的方法，其中，编码转座子的重组且非天然产生的DNA序列是环形DNA的限制酶切消化的产物。

28.如权利要求27所述的方法，其中，所述环形DNA是质粒载体或小环DNA载体。

29.如权利要求25或26所述的方法，其中，编码转座子的重组且非天然产生的DNA序列是聚合酶链式反应(PCR)的产物。

30.如权利要求25或26所述的方法，其中，编码转座子的重组且非天然产生的DNA序列是双链doggybone^TMDNA序列。

31.如权利要求30所述的方法，其中，所述doggybone^TMDNA序列通过仅编码抗原表达盒的酶法产生，所述表达盒包含抗原、启动子、多聚A尾和端粒末端。

32.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述免疫细胞分离自或源自人类。

33.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中，所述免疫细胞分离自或源自非人哺乳动物。

34.如权利要求33所述的方法，其中，所述非人哺乳动物是啮齿类、兔、猫、狗、猪、马、牛、骆驼或灵长类。

35.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，编码转座子的重组且非天然产生的DNA序列还包含编码嵌合抗原受体或其部分的序列。

36.如权利要求35所述的方法，其中，编码嵌合抗原受体的序列的部分编码抗原识别区域。

37.如权利要求35或36所述的方法，其中，所述抗原识别区域包含一个或多个互补决定区。

38.如权利要求35或36所述的方法，其中，所述抗原识别区域包含抗体、抗体模拟物、蛋白质支架或其片段。

39.如权利要求38所述的方法，其中，所述抗体是嵌合抗体、重组抗体、人源化抗体或人抗体。

40.如权利要求39所述的方法，其中，所述抗体是经亲和性调节的。

41.如权利要求38所述的方法，其中，所述抗体包含单链可变片段(scFv)、VHH、单域抗体(sdAB)、小模块免疫药物(SMIP)分子或纳米抗体，或由其组成。

42.如权利要求41所述的方法，其中，VHH是骆驼科的。

43.如权利要求41或42所述的方法，其中，VHH是人源化的。

44.如权利要求38所述的方法，其中，所述抗体片段包含互补决定区、可变区、重链、轻链或其任何组合，或由其组成。

45.如权利要求38所述的方法，其中，所述抗体模拟物包含亲和体、Afflilin分子、粘合素、Affitin分子，阿尔法体、抗运载蛋白，Avimer分子、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽或单体，或由其组成。

46.如权利要求38所述的方法，其中，所述蛋白质支架包含Centyrin，或由其组成。

47.如权利要求5-46中任一项所述的方法，

(a)其中，编码转座酶的核酸序列是DNA序列，并且

(b)其中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量等于或少于10μg/100μL的电穿孔或核转染反应。

48.如权利要求48所述的方法，其中，在电穿孔或核转染反应中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于100μg/mL。

49.如权利要求5-46中任一项所述的方法，

(a)其中，编码转座酶的核酸序列是DNA序列，并且

(b)其中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量等于或少于7.5μg/100μL的电穿孔或核转染反应。

50.如权利要求49所述的方法，其中，在电穿孔或核转染反应中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于75μg/mL。

51.如权利要求5-46中任一项所述的方法，

(a)其中，编码转座酶的核酸序列是DNA序列，并且

(b)其中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量等于或少于6.0μg/100μL的电穿孔或核转染反应。

52.如权利要求51所述的方法，其中，在电穿孔或核转染反应中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于60μg/mL。

53.如权利要求50或51所述的方法，其中，所述转座酶是睡美人转座酶。

54.如权利要求53所述的方法，其中，所述睡美人转座酶是睡美人100X(SB100X)转座酶。

55.如权利要求5-46中任一项所述的方法，

(a)其中，编码转座酶的核酸序列是DNA序列，并且

(b)其中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量等于或少于5.0μg/100μL的电穿孔或核转染反应。

56.如权利要求55所述的方法，其中，在电穿孔或核转染反应中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于50μg/mL。

57.如权利要求5-46中任一项所述的方法，

(a)其中，编码转座酶的核酸序列是DNA序列，并且

(b)其中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量等于或少于2.5μg/100μL的电穿孔或核转染反应。

58.如权利要求57所述的方法，其中，在电穿孔或核转染反应中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于25μg/mL。

59.如权利要求5-46中任一项所述的方法，

(a)其中，编码转座酶的核酸序列是DNA序列，并且

(b)其中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量等于或少于1.67μg/100μL的电穿孔或核转染反应。

60.如权利要求59所述的方法，其中，在电穿孔或核转染反应中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于16.7μg/mL。

61.如权利要求59或60所述的方法，其中，所述转座酶是Super piggyBac(PB)转座酶。

62.如权利要求5-46中任一项所述的方法，

(a)其中，编码转座酶的核酸序列是DNA序列，并且

(b)其中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量等于或少于0.55μg/100μL的电穿孔或核转染反应。

63.如权利要求62所述的方法，其中，在电穿孔或核转染反应中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于5.5μg/mL。

64.如权利要求5-46中任一项所述的方法，

(a)其中，编码转座酶的核酸序列是DNA序列，并且

(b)其中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量等于或少于0.19μg/100μL的电穿孔或核转染反应。

65.如权利要求64所述的方法，其中，在电穿孔或核转染反应中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于1.9μg/mL。

66.如权利要求5-46中任一项所述的方法，

(a)其中，编码转座酶的核酸序列是DNA序列，并且

(b)其中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量等于或少于0.1μg/100μL的电穿孔或核转染反应。

67.如权利要求66所述的方法，其中，在电穿孔或核转染反应中，编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于1.0μg/mL。

68.如权利要求5-46中任一项所述的方法，

(a)其中，编码转座酶的核酸序列是RNA序列，并且

(b)其中，编码转座子的DNA序列等于或少于10μg/100μL的电穿孔或核转染反应。

69.如权利要求68所述的方法，其中，在电穿孔或核转染反应中，编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于100μg/mL。

70.如权利要求5-46中任一项所述的方法，

(a)其中，编码转座酶的核酸序列是RNA序列，并且

(b)其中，编码转座子的DNA序列等于或少于7.5μg/100μL的电穿孔或核转染反应。

71.如权利要求70所述的方法，其中，在电穿孔或核转染反应中，编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于75μg/mL。

72.如权利要求5-46中任一项所述的方法，

(a)其中，编码转座酶的核酸序列是RNA序列，并且

(b)其中，编码转座子的DNA序列等于或少于6.0μg/100μL的电穿孔或核转染反应。

73.如权利要求72所述的方法，其中，在电穿孔或核转染反应中，编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于60μg/mL。

74.如权利要求72或73所述的方法，其中，所述转座酶是睡美人转座酶。

75.如权利要求74所述的方法，其中，所述睡美人转座酶是睡美人100X(SB100X)转座酶。

76.如权利要求5-46中任一项所述的方法，

(a)其中，编码转座酶的核酸序列是RNA序列，并且

(b)其中，编码转座子的DNA序列等于或少于5.0μg/100μL的电穿孔或核转染反应。

77.如权利要求76所述的方法，其中，在电穿孔或核转染反应中，编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于50μg/mL。

78.如权利要求5-46中任一项所述的方法，

(a)其中，编码转座酶的核酸序列是RNA序列，并且

(b)其中，编码转座子的DNA序列等于或少于2.5μg/100μL的电穿孔或核转染反应。

79.如权利要求78所述的方法，其中，在电穿孔或核转染反应中，编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于25μg/mL。

80.如权利要求5-46中任一项所述的方法，

(a)其中，编码转座酶的核酸序列是RNA序列，并且

(b)其中，编码转座子的DNA序列等于或少于1.67μg/100μL的电穿孔或核转染反应。

81.如权利要求80所述的方法，其中，在电穿孔或核转染反应中，编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于16.7μg/mL。

82.如权利要求80或81所述的方法，其中，所述转座酶是Super piggyBac(PB)转座酶。

83.如权利要求5-46中任一项所述的方法，

(a)其中，编码转座酶的核酸序列是RNA序列，并且

(b)其中，编码转座子的DNA序列等于或少于0.55μg/100μL的电穿孔或核转染反应。

84.如权利要求83所述的方法，其中，在电穿孔或核转染反应中，编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于5.5μg/mL。

85.如权利要求5-46中任一项所述的方法，

(a)其中，编码转座酶的核酸序列是RNA序列，并且

(b)其中，编码转座子的DNA序列等于或少于0.19μg/100μL的电穿孔或核转染反应。

86.如权利要求85所述的方法，其中，在电穿孔或核转染反应中，编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于1.9μg/mL。

87.如权利要求5-46中任一项所述的方法，

(a)其中，编码转座酶的核酸序列是RNA序列，并且

(b)其中，编码转座子的DNA序列等于或少于0.1μg/100μL的电穿孔或核转染反应。

88.如权利要求87所述的方法，其中，在电穿孔或核转染反应中，编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或少于1.0μg/mL。

89.根据权利要求1-88中任一项所述的方法修饰的免疫细胞。

90.如权利要求89所述的免疫细胞，其中，所述免疫细胞是T-淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞或自然杀伤T(NKT)细胞。

91.如权利要求89或90所述的免疫细胞，其还经第二基因编辑工具修饰。

92.如权利要求91所述的免疫细胞，其中，所述第二基因编辑工具包含操作性地连接至Cas9或TALE序列的核酸内切酶。

93.如权利要求92所述的免疫细胞，其中，所述核酸内切酶通过共价方式操作性地连接至Cas9或TALE序列。

94.如权利要求92所述的免疫细胞，其中，所述核酸内切酶通过非共价方式操作性地连接至Cas9或TALE序列。

95.如权利要求89-94中任一项所述的免疫细胞，其中，所述Cas9是失活的Cas9(dCas9)。

96.如权利要求95所述的免疫细胞，其中，所述失活的Cas9在催化位点中包含D10A和N580A。

97.如权利要求95或96所述的免疫细胞，其中，所述Cas9是小且失活的Cas9(dSaCas9)。

98.如权利要求97所述的免疫细胞，其中，所述dSaCas9包含氨基酸序列：

mkrnyilglaigitsvgygiidyetrdvidagvrlfkeanvennegrrskrgarrlkrrrrhriqrvkkllfdynlltdhselsginpyearvkglsqklseeefsaallhlakrrgvhnvneveedtgnelstkeqisrnskaleekyvaelqlerlkkdgevrgsinrfktsdyvkeakqllkvqkayhqldqsfidtyidlletrrtyyegpgegspfgwkdikewyemlmghctyfpeelrsvkyaynadlynalndlnnlvitrdenekleyyekfqiienvfkqkkkptlkqiakeilvneedikgyrvtstgkpeftnlkvyhdikditarkeiienaelldqiakiltiyqssediqeeltnlnseltqeeieqisnlkgytgthnlslkainlildelwhtndnqiaifnrlklvpkkvdlsqqkeipttlvddfilspvvkrsfiqsikvinaiikkyglpndiiielareknskdaqkminemqkrnrqtnerieeiirttgkenakyliekiklhdmqegkclysleaipledllnnpfnyevdhiiprsvsfdnsfnnkvlvkqeeaskkgnrtpfqylsssdskisyetfkkhilnlakgkgrisktkkeylleerdinrfsvqkdfinrnlvdtryatrglmnllrsyfrvnnldvkvksinggftsflrrkwkfkkernkgykhhaedaliianadfifkewkkldkakkvmenqmfeekqaesmpeieteqeykeifitphqikhikdfkdykyshrvdkkpnrelindtlystrkddkgntlivnnlnglydkdndklkklinkspekllmyhhdpqtyqklklimeqygdeknplykyyeetgnyltkyskkdngpvikkikyygnklnahlditddypnsrnkvvklslkpyrfdvyldngvykfvtvknldvikkenyyevnskcyeeakklkkisnqaefiasfynndlikingelyrvigvnndllnrievnmidityreylenmndkrppriiktiasktqsikkystdilgnlyevkskkhpqiikkg(SEQ IDNO:4)。

99.一种组合物，其包含如权利要求89-98中任一项所述的免疫细胞。

100.如权利要求99所述的组合物用于治疗有此需要的对象中的疾病或病症的用途。

101.如权利要求100所述的用途，其中，所述疾病或病症是癌症。

102.如权利要求100所述的用途，其中，所述疾病或病症是感染性疾病。

103.如权利要求99-102中任一项所述的用途，其中，所述免疫细胞是自体同源的。

104.如权利要求99-102中任一项所述的用途，其中，所述免疫细胞是同种异体的。

105.一种培养基，其用于增强经修饰的免疫细胞的活力，其包含IL-2、IL-21、IL-7、IL-15或其任何组合。

106.如权利要求105所述的培养基，其中，所述经修饰的免疫细胞是T-淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞或自然杀伤T(NKT)细胞。

107.如权利要求105或106所述的培养基，其中，所述经修饰的免疫细胞包含一个或多个外源性DNA序列。

108.如权利要求105或106所述的培养基，其中，所述经修饰的免疫细胞包含一个或多个外源性RNA序列。

109.如权利要求105-108中任一项所述的培养基，其中，所述经修饰的免疫细胞已经电穿孔或核转染。