CN109310711B

CN109310711B - 血小板沉淀裂解物的制备及其治疗神经系统疾病的用途

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Publication number: CN109310711B
Application number: CN201780027923.8A
Authority: CN
Inventors: D·德沃斯; T·布努夫; J-C·德威德疆; 周明礼
Original assignee: Coastal Opal Coast University; University Lille Ii Droit & Sante; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Centre Hospitalier Regional Universitaire de Lille CHRU; Taipei Medical University TMU
Current assignee: Coastal Opal Coast University; University Lille Ii Droit & Sante; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Centre Hospitalier Universitaire de Lille CHU; Taipei Medical University TMU
Priority date: 2016-03-23
Filing date: 2017-03-23
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2037-03-23
Also published as: US20190099448A1; PL3432895T3; IL261981B; EP3432895A1; AU2017238476B2; EP3432895B1; CN109310711A; IL261981A; DK3432895T3; WO2017162830A1; JP2022180609A; ES2908723T3; TW201800581A; PT3432895T; TWI744300B; JP7189123B2; AU2017238476A1; CA3018637A1; JP2019513154A; HUE058308T2

Abstract

一种制备改良的热处理的血小板沉淀裂解物的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供血小板沉淀裂解物，b)在55至65℃的温度下对血小板沉淀裂解物进行热处理持续20至40分钟，c)纯化步骤b)的经热处理的血小板沉淀裂解物，以获得改良的热处理的血小板沉淀裂解物，其总蛋白含量少于步骤a)的血小板沉淀裂解物的总蛋白含量的70％。

Description

血小板沉淀裂解物的制备及其治疗神经系统疾病的用途

技术领域

本发明涉及获得新型血小板沉淀裂解物的方法、血小板沉淀本身及其用于治疗神经系统疾病如神经退行、神经炎症、神经发育和/或神经血管疾病(即中风)，以及脑损伤(创伤性脑损伤，缺氧......)后果的用途。

背景技术

考虑到这些疾病对患者和护理人员造成的巨大社会和经济影响，迫切需要开发有效的“疾病改善策略”，提供神经保护、神经恢复和神经发生来治疗神经退行性疾病，如帕金森病(PD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)和阿尔茨海默病(AD)。

考虑到缺乏经验证的治疗，也在很大程度上期望开发提供神经恢复和神经发生的有效治疗方法，以补偿神经元的损失和中枢神经系统的损伤，如分娩后的严重缺氧或心脏骤停或严重的创伤性脑损伤。

有大量证据表明神经营养因子作为神经元信号通路的激活剂和调节剂，代表了神经系统疾病的合理治疗策略¹。单个重组神经营养生长因子的应用为细胞和动物模型中的神经元保护和修复提供了令人鼓舞的结果^2,3。

血小板衍生的生长因子-CC(PDGF-CC)被证明是几种神经元损伤动物模型中的有效神经保护因子⁴，而通过脑室内(ICV)途径施用的PDGF-BB和脑源性神经营养因子(BDNF)刺激神经发生⁵。此外，在局灶性中风的光血栓模型中全身性施用BDNF可诱导神经发生并改善感觉运动功能⁶。转化生长因子-β(TGF-β)可在帕金森病动物模型中促进多巴胺能神经元的发育和存活，以及神经保护⁷，增强了神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)在偏侧帕金森病大鼠中的营养作用⁸。

临床前研究显示碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)⁹和血管内皮生长因子-β(VEGF-β)具有神经保护作用¹⁰，以及GDNF对神经保护和神经修复具有促进作用^11-15。

不幸的是，所有涉及高剂量ICV施用单个生长因子的随机临床研究未能产生任何实质性的积极临床效果^16-18。

目前，在这种复杂和多方面的神经退行性病理中施用单个神经营养因子不足以产生有意义的治疗结果。

因此，需要开发一种结合几种重组神经营养因子的新方法，这种方法可能更强大，但这在概念上具有挑战性，从而证明来自其他再生医学领域的更实用的策略。

在WHO的基本药物模型清单中¹⁹，血小板浓缩物是一种成熟的治疗产品，其通常用于预防和治疗由血小板减少引起的出血性疾病²⁰。除了它们在止血中的作用外^20,21，血小板在伤口愈合和组织修复中发挥重要的生理功能^21-23。

正在扩大评估血小板和血小板裂解物的再生医学²⁴和细胞疗法²⁵的应用范围。血小板在组织愈合中的治疗益处是多因素的，并且由主要储存在α-颗粒中并协同作用的各种生物活性介质产生^22-24,26。这些包括神经营养生长因子，如PDGF(-AA、-AB和-BB同种型)，BDNF、VEGF、TGF-β、bFGF或上皮生长因子(EGF)。最近显示中风动物模型中血小板裂解物的颅内递送刺激内源性神经干细胞(eNSC)的增殖以及脑室下区和周围病变皮质中的血管生成，从而改善功能结果并减少损伤，并表明神经保护作用²⁷。

然而，血小板裂解物含有血浆携带的纤维蛋白原，这种蛋白质作为炎症的强效诱导剂和神经突生长的抑制剂，在神经系统疾病中起着致病作用³⁵。这可能是尚未报道将血小板裂解物应用于人的神经退行性疾病(如帕金森病)领域的原因。

发明内容

本发明基于意外的发现，即当在特定条件下制备血小板沉淀裂解物(PPL)时，它能够通过诱导更好的神经保护作用以及神经恢复来加强神经系统疾病的治疗。

特别地，本发明人已经发现，在制备PPL期间的热处理降低了裂解物的总蛋白质含量并且促进了增强的神经保护和神经恢复潜力。

因此，在第一个方面，本发明涉及制备改良的热处理的血小板沉淀裂解物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供血小板沉淀裂解物，

b)在55至65℃的温度下对血小板沉淀裂解物进行热处理持续20至40分钟，

c)纯化步骤b)的经热处理的血小板沉淀裂解物，以获得改良的热处理的血小板沉淀裂解物，其总蛋白含量少于步骤a)的血小板沉淀裂解物的总蛋白含量的70％。

令人惊讶和出乎意料的是，与未经热处理的PPL或在37℃处理的PPL相比，如此获得的改良的热处理的PPL提供增强的神经保护。体外测定表明，特别是在低剂量和高剂量时，用改良的热处理的PPL显著增强神经元细胞的活力。此外，改良的热处理的PPL在体外测定中诱导神经恢复。

不希望受限于任何理论，发明人认为本发明的PPL的神经恢复和增强的神经保护活性是其总蛋白质含量降低的结果。据信，在去除沉淀蛋白质的步骤c)之后，在55℃至65℃的温度下进行的热处理诱导蛋白质沉淀，导致根据本发明的改良的热处理的PPL中的总蛋白质含量显著低于起始PPL。改良的热处理的PPL的总蛋白质含量确实少于步骤a)的PPL的总蛋白质含量的70％。优选地，总蛋白质含量少于步骤a)的PPL的总蛋白质含量的60％，特别是50％。改良的热处理的PPL的总蛋白质含量可以是例如4-6mg/mL。

根据本发明的热处理还可以产生不同的相对蛋白质组成。例如，热处理似乎去除在制备起始PPL期间未去除的血浆携带的纤维蛋白原，以及血小板纤维蛋白原，导致改良的热处理的PPL具有降低的纤维蛋白原含量。

有利地，改良的热处理的PPL具有少于1.5mg/mL，优选少于1mg/mL，更优选少于0.5mg/mL，甚至更优选0.1mg/mL至0.3mg/mL的纤维蛋白原。此外，PPL的生长因子含量也可以通过根据本发明的热处理来改变。与正常的新鲜PPL(PPL^F)或过期的PPL(PPL^E)相比，它可以例如导致BDNF、bFGF、EGF和HGF浓度显著地相对降低，而VEGF和TGFβ浓度保持基本不变。术语新鲜PPL是指由收集后5天内处理的血小板浓缩物制备的血小板沉淀裂解物(未过期)。术语过期PPL是指由储存5天后处理的血小板浓缩物制备的血小板沉淀裂解物。

在一个实施方案中，从PPL^F和PPL^E获得的改良的血小板沉淀裂解物的生长因子中的相对含量(以每mg总蛋白质表示)，BDNF、bFGF和HGF显著降低，PDGF-AB和EGF保持不变，且TGFβ显著增加。VEGF和PF4含量在从PPL^F获得的改良的血小板沉淀裂解物中保持不变，在从PPL^E获得的改良的血小板沉淀裂解物中增加。

在一个实施方案中，改良的热处理的PPL的PF4含量多于本发明方法的步骤a)的PPL的PF4含量的50％，优选60％，更优选70％。

热处理步骤b)优选在55℃至60℃的温度下进行，更优选在约56℃的温度下进行。实际上，在约56℃下处理的PPL在神经保护和神经恢复的再现性方面获得了最有希望的结果。

在一个优选的实施方案中，热处理持续约30分钟。

此外，在热处理后，在纯化步骤c)之前，PPL可以冷却至少5分钟，优选冷却至约2-5℃的温度。

可以通过本领域已知的任何方法(例如离心或过滤)纯化热处理的PPL。

有利地，例如在约2-6℃的温度下，以9000x g至11000x g离心至少15分钟。

当使用过滤时，有利地将热处理的PPL通过孔径大小为5μm至0.2μm的过滤器，优选使用孔径分别为5μm至0.2μm的孔径逐渐减小的一系列两个或更多个连续的过滤器。

有利地，步骤c)中纯化热处理的PPL裂解物通过离心进行。不希望受限于任何理论，发明人相信如上所述的低温下的离心有助于进一步去除冷不溶性组分，例如沉淀的纤维蛋白原。

本发明的方法可以在热处理步骤后进一步包括在-20℃至-85℃,优选-25℃至-50℃，更优选约-30℃的温度下冷冻并储存步骤c)中获得的改良的热处理的PPL的步骤。

在进一步的实施方案中，本发明的方法可以在步骤c)之后以及任选的冷冻或冷冻干燥之前进一步包括：病毒灭活的步骤，例如溶剂洗涤剂处理(S/D处理)或巴氏杀菌(在稳定剂存在下于60℃热处理10小时)，和/或使用15、20或35nm的专用病毒过滤器或等效病原体去除过滤器通过纳米过滤去除病毒或朊病毒的步骤。因此，所得的改良的热处理的PPL是病毒和朊病毒安全的。术语“病毒灭活”是指其中病毒保留在血小板沉淀裂解物中，但例如通过溶解其脂质外壳或通过破坏其病毒粒子结构使其无活力的情况。

术语“病毒去除”是指这样的情况：其中具有刚性大尺寸结构的病毒通过保留在过滤器上而从血小板沉淀裂解物中去除，而血小板沉淀裂解物组分通过这种病毒去除过滤器并回收用于进一步处理^36,37。

可以根据熟知的方法制备步骤a)中提供的起始血小板沉淀裂解物(PPL)³⁸。例如，它可以如下进行制备：

i.提供血小板浓缩物；

ii.将所述血小板浓缩物离心以获得血小板沉淀和第一上清液；

iii.去除上清液，并将沉淀悬浮于生理缓冲液中；

iv.将所述悬浮的沉淀冷冻-解冻；

v.将步骤iv)获得的悬浮液离心以获得血小板沉淀裂解物和第二上清液。

步骤i)中提供的血小板浓缩物可以通过合适的标准收集方法从自体或同种异体血小板来源(特别是从全血)获得，或通过机采方法获得，并悬浮在血浆、或血浆和血小板添加剂溶液的组合、或仅血小板添加剂溶液中³⁹。此外，血小板浓缩物可以是白细胞减少的。

步骤iii)中使用的合适的生理缓冲液例如可以是磷酸盐缓冲盐水(PBS)、HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液或醋酸钠缓冲液，或生理盐水。

根据本发明的方法的步骤a)中使用的血小板沉淀裂解物(PPL)可以是新鲜PPL(PPL^F)或过期PPL(PPL^E)，优选PPL^F。

在第二个方面，本发明涉及改良的热处理的PPL，其总蛋白质含量少于未经热处理的PPL的总蛋白质含量的70％，60％，更优选50％。改良的热处理的PPL的总蛋白质含量可以是例如4-6mg/mL。根据本发明的改良的热处理的PPL可以通过上文描述的方法获得。有利地，本发明的改良的热处理的PPL具有少于1.5mg/mL，优选少于1mg/mL，更优选少于0.5mg/mL，甚至更优选0.1mg/mL至0.3mg/mL的纤维蛋白原。

在一个实施方案中，本发明的改良的热处理的PPL的PF4含量多于未经热处理的PPL的PF4含量的50％，优选多于60％，更优选多于70％。

如上所述，本发明的改良的热处理的PPL提供神经恢复和增强的神经保护活性。

因此，在第三个方面，本发明涉及根据本发明的改良的血小板沉淀裂解物用作生物药物或“生物疗法”，尤其用于治疗和/或预防神经系统疾病，优选神经退行性疾病的用途。换言之，本发明还涉及治疗和/或预防神经系统疾病的方法，包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明的改良的血小板沉淀裂解物。优选地，患者是温血动物，更优选是人。

本发明意义内的神经系统疾病包括但不限于神经退行性疾病；神经血管疾病；神经炎症性疾病；神经发育疾病(如自闭症)；脑损伤，例如分娩后的严重缺氧或心脏骤停或严重的颅脑创伤/创伤性脑损伤，即导致神经元显著丧失，从而导致残疾的严重损伤。

本发明意义内的神经退行性疾病包括但不限于多发性硬化症(MS)、帕金森病(PD)、亨廷顿病(HD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、中风、年龄相关性黄斑变性(AMD)、视网膜的退行性疾病、和痴呆，后者包括但不限于阿尔茨海默病(AD)、血管性痴呆、额颞叶痴呆、语义性痴呆和路易体痴呆。优选的神经退行性疾病是多发性硬化症、阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症。

在一个优选的实施方案中，神经退行性疾病选自帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和阿尔茨海默氏病。在一个特别优选的实施方案中，神经退行性疾病是帕金森病。在另一个优选的实施方案中，神经退行性疾病是肌萎缩侧索硬化。

优选的其他神经系统疾病包括中枢神经系统的损伤，例如分娩后的严重缺氧或心脏骤停或严重的颅脑创伤，即导致神经元显著丧失，从而导致残疾的严重损伤。在损伤后用改良的热处理的PPL进行早期治疗可以增强生理性的神经恢复和神经发生能力。

改良的热处理的PPL可以如下施用：包封在天然或合成的纳米颗粒⁴⁰或微粒中，或包含在药物溶液中，所述药物溶液还包含至少一种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。药物溶液可以进一步包含复合物、分子、肽、盐、载体或任何其他化合物，其可以改善或可以有益于治疗神经系统疾病。

施用途径和剂量方案自然取决于患者的疾病严重程度、年龄、体重和性别等。

本发明的改良的热处理的PPL可用于治疗任何患者，尤其是温血动物例如哺乳动物，优选人。

有利地并且如通过体内试验所证明的，根据本发明的改良的热处理的PPL适于脑施用。具体地，所述改良的热处理的PPL适用于鞘内(例如用于肌萎缩侧索硬化，其是脊髓的病理学)或脑室内(ICV)施用，例如进入右侧脑室，优选接近脑室内孔，这样可以将改良的血小板沉淀裂解物施用至第三脑室。例如，为此目的可使用泵，例如ALZET泵(由Alzet销售)。

本发明的改良的热处理的PPL的施用还可以通过本领域技术人员已知的任何其他方法进行，例如鼻内、肌肉内或眼内施用，或器官的灌注或输注(即，直接输注部分脑组织)。

用于施用的暴露剂量可以根据各种参数进行调整，特别是根据所用的施用方式、相关病理学或所需的治疗持续时间。

定义

以下定义和解释是针对整个申请中使用的术语，包括说明书和权利要求。

“神经保护活性”或“神经保护”是指与不受神经毒素影响的神经元细胞相比，保护受神经毒素影响的神经元细胞的神经元结构和/或功能。神经保护旨在通过停止或至少减缓神经元的损失来预防或减缓疾病进展和继发性损伤。例如，它是指与未患帕金森病的患者相比，保护帕金森病患者的纹状体和/或黑质致密部中神经元的数量。

“神经恢复”是指补偿现有的变化并刺激受损神经活性的结构和功能恢复。

术语“患者”是指期待或接受医疗护理，或者是或将是医疗程序的对象的温血动物，更优选人。

术语“人”是指两种性别和在任何发育阶段(即，新生儿、幼儿、少年、青少年、成人)的受试者。在一个实施方案中，人是青少年或成人，优选成人。

如本文所用，术语“治疗”是指包括缓解或消除病症或疾病和/或其伴随的症状。

如本文所用，术语“预防”是指延迟或排除病症或疾病和/或其伴随症状的发作，保护患者不患病症或疾病，或降低患者患上病症或疾病的风险的方法。

如本文所用，术语“治疗有效量”(或更简单的“有效量”)是指足以在施用的个体中实现所需的治疗性或预防性效果的本发明的改良的血小板沉淀裂解物的量。

术语“施用”或其变体是指向待治疗或预防病症、症状或疾病的患者单独或作为药学上可接受的溶液的一部分提供本发明的血小板沉淀裂解物。

参考以下实施例和附图将更好地理解本发明。这些实施例旨在代表本发明的具体实施方案，而不是要限制本发明的范围。

附图说明

图1：从机采血小板浓缩物制备血小板裂解物和血小板沉淀裂解物的模式。

通过将血小板浓缩物(PC)冷冻/解冻3次获得血小板裂解物(PL)。对于血小板沉淀裂解物(PPL)的制备，将血小板沉淀以去除血浆，进行3次冷冻/解冻循环，并离心以去除细胞碎片。将等分试样在-80℃下冷冻直至测试。

图2：PL和PPL的蛋白质表征。

A：PL、PPL^F和PPL^E的对比总蛋白含量(mg/ml)；

B，C：PL和PPL分别的区域电泳图；

D：非还原和还原PPL的SDS-PAGE图谱；

E：PPL的二维电泳图；在pH3-10进行等电点聚焦分离。

图3：在56℃热处理的改良PPL(+)(来自PPL^F和PPL^E)和在37℃处理的PPL(-)的蛋白质表征。A：总蛋白含量(mg/ml)；以ng/ml(B)和ng/mg蛋白质(C)表示的PDGF-AB、BDNF、FGF、VEGF、EGF、HGF、THG-β和PF4的含量。

图4：改良的热处理的PPL和在37℃处理的PPL的对比蛋白质组分。在37℃处理的PPL(对照PPL)或在45、56或65℃热处理的改良PPL的纤维蛋白原和vWF的蛋白质印迹分析(A)和在非还原和还原条件下的SDS-PAGE图(B)。C：与通过细胞因子阵列测定的在37℃处理的PPL(对照)相比，在56℃或65℃热处理的改良PPL的细胞因子的相对变化。

图5：与通过细胞因子阵列测定的在37℃处理的PPL(对照)相比，在56或65℃热处理的改良PPL中各种细胞因子和蛋白质的相对增加或减少。数据表示为平均值和标准差(SD)。

图6：在37℃处理的PPL(对照)或在56或65℃热处理的改良PPL的细胞因子阵列数据的照片。

数据表示为平均值和标准差(SD)。

图7：通过细胞因子阵列可检测的在56℃热处理的改良PPL相对于在37℃处理的PPL(对照)的细胞因子的降低和增加比例。*p<0.05。

图8：通过细胞因子阵列可检测的在65℃热处理的改良PPL相对于在37℃处理的PPL(对照)的细胞因子的降低和增加比例。*p<0.05。

图9：改良的热处理的PPL对神经恢复的功效。

A：在加入改良的热处理的PPL(56℃)之前，用甲萘醌处理的NSC-34细胞的活力；

图例：PPL：改良的热处理的PPL；m：甲萘醌；m3h+PPL：在加入改良的热处理的PPL之前用甲萘醌处理3h；m2h+PPL：在加入改良的热处理的PPL之前用甲萘醌处理2h；m1h+PPL：在加入改良的热处理的PPL之前用甲萘醌处理1h。

B：在加入改良的热处理的PPL(56℃)之前，用斯特罗菌素处理的NSC-34细胞的活力；

图例：PPL：改良的热处理的PPL；STS：斯特罗菌素；STS 3h+PPL：在加入改良的热处理的PPL之前用斯特罗菌素处理3h；STS 2h+PPL：在加入改良的热处理的PPL之前用斯特罗菌素处理2h；STS 1h+PPL：在加入改良的热处理的PPL之前用斯特罗菌素处理1h。

C：在加入改良的热处理的PPL之前，用甲萘醌处理的NSC-34细胞的氧化应激。

图10：用PPL处理LUHMES缺乏毒性和神经保护作用。

A：没有MPP+暴露的情况下，用不同浓度(0.1-5％)的在37℃处理的PPL(PPL对照)进行处理；

B：在暴露于30μM的MPP+之前，用2％的从1(0)、3、6和7-10天(>6)内的PC制备的PPL处理1小时；

C：在暴露于30μM的MPP+之前，用各种剂量(0.025-15％)的在37℃处理的PPL(PPL对照)进行处理。数据表示为在标准生长基中生长且没有暴露于MPP+的LUHMES细胞活力(100％)的％。

图11：暴露于MPP+之前，用0.5-15％的在45℃、56℃和65℃热处理的改良PPL，或在37℃处理的PPL处理LUHMES细胞的神经保护作用。在37℃处理的PPL(A)，或在45℃(B)、56℃(C)或65℃(D)热处理的改良PPL。用剂量增加的在37℃处理的PPL(对照)或在45、56或65℃热处理的改良PPL处理LUHMES细胞提供的神经保护的程度(E)。数据表示为在标准生长基中生长且没有暴露于MPP+的LUHMES细胞活力(100％)的％。

图12：MPTP-中毒小鼠中PPL的神经保护作用。

+：对于指定情况vs对照情况，p<0.05；*：对于指定情况vs MPTP情况，p<0.05。

具体实施方式

贯穿整个说明书、附图和权利要求中使用以下简写：

BAFF：B细胞激活因子；

BDNF：脑源性神经营养因子；

C5/C5a：补充组分5/活化；

CSF：脑脊液；

Ctrl：对照；

Dkk-1：Dickkopf WNT信号传导通路抑制剂1；

DPPIV：二肽基肽酶IV；

EGF：上皮生长因子；

EMMPRIN：细胞外基质金属蛋白酶诱导物；

ENA-78：上皮源性中性粒细胞激活肽78；

FGF：成纤维细胞生长因子；

FGF-β：成纤维细胞生长因子-β；

Fas L：fas配体；

G-CSF：粒细胞集落刺激因子；

GDF-15：生长分化因子15；

HGF：肝细胞生长因子；

IGFBP-2：胰岛素样生长因子结合蛋白-2；

IL：白细胞介素；

IP-10：干扰素蛋白10；

I-TAC：干扰素诱导的T细胞α趋化因子；

kDa：千道尔顿；

LIF：白血病抑制因子

MCP：单核细胞趋化因子细胞因子；

MCP-1：单核细胞趋化因子细胞因子1；

M-CSF：单核细胞集落刺激因子；

MIF：迁移抑制因子；

MIG：由干扰素γ诱导的单核因子；

MIP-1a/1b：巨噬细胞炎性蛋白；

MIP-3a：巨噬细胞炎性蛋白；

MM：分子量；

MPP+：1-甲基-4-苯基吡啶；

MMP：基质金属蛋白酶；

MMP-9：基质金属蛋白酶9；

Neg Ctrl：阴性对照；

PBS：磷酸盐缓冲盐水；

PC：血小板浓缩物；

PDGF：血小板衍生的生长因子；

PDGF-AB：血小板衍生的生长因子-AB；

PDGF-AB/BB：血小板衍生的生长因子-AB/BB；

PF4：血小板因子4；

PL：血小板裂解物；

PPL：血小板沉淀裂解物；

PPL^E：来自过期PC的血小板沉淀裂解物；

PPL^F：来自未过期PC的血小板沉淀裂解物；

RANTES：调节激活正常T细胞表达和分泌；

RAGE：晚期糖基化终产物的受体；

RBP4：视黄醇结合蛋白4；

SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；

TGF-β：转化生长因子-β；

TNF：肿瘤坏死因子；

SHBG：类固醇激素结合球蛋白；

ST2：白细胞介素1受体样1；

TARC：胸腺和激活调节的趋化因子；

TFF3：三叶因子家族3；

TfR：转铁蛋白受体；

uPAR：尿激酶型纤溶酶原激活子受体；

VEGF：血管内皮生长因子；

vWF：Von Willebrand因子。

材料和方法

-收集血浆和血小板

台北医科大学机构审查委员会批准了该研究(编号201301020)。血小板浓缩物获自台北血液中心(台湾官渡)。它们收集自从志愿者健康供体通过机采(MCS+；HaemoneticsCorp.，Braintree，MA，USA)获得的非白细胞减少的血小板浓缩物。如前所述，使用ABC Vet(ABX Diagnostics，Montpellier，France)测定每次捐赠的血小板和其他血细胞计数。

将血小板浓缩物保持于22±2℃的血小板搅拌器中。

用收集5天内(未过期)处理的血小板浓缩物制备PPL^F(“新鲜PPL”)，储存5天以上的那些用于制备PPL^E(“过期PPL”)。

-制备血小板沉淀裂解物

如图1所总结，在无菌条件下制备血小板裂解物。通过以下使用悬浮在血浆中的治疗级机采血小板浓缩物来制备血小板裂解物(PL)对照：-80/30℃±1℃进行三次冷冻-解冻循环，并于22±2℃以4500×g离心30分钟以沉淀并去除细胞碎片。为制备用作本发明方法的步骤a)中的起始材料的血小板沉淀裂解物(PPL)，将血小板浓缩物(200-250mL)离心(3000×g；30分钟；22±2℃)，小心去除血浆上清液，用2mL无菌PBS轻轻洗涤沉淀表面。加入PBS(初始PC体积的10％)，轻轻吹打混合物以悬浮血小板，然后进行三次冷冻-解冻循环(-80/+30±1℃)，并通过离心澄清(4500×g；30分钟；22±2℃)。将PPL等分试样(500μl)保持冷冻在-80℃直至使用。通过以下制备几种热处理的PPL：在45、56、65±1℃的干浴中热处理30分钟，并在冰上冷却至少5分钟，然后离心(10000×g；15分钟；4±2℃)。还使用37±1℃的干浴以相同方式制备对照PPL。然后将上清液(在37℃热处理的PPL或处理的PPL)在-80℃下冷冻保存。

-血小板沉淀裂解物的蛋白质组成、电泳图和蛋白质印迹分析

使用作为标准品的牛血清白蛋白(Thermo Fischer Scientific，Waltham，MA，USA)和nanodrop(NanoDrop；Wilmington，DE，USA)通过micro-Bradford测定法测定不同PPL的总蛋白质。使用SPIFE 3000(Helena，Texas，USA；加载0.5mL蛋白质样品)进行蛋白质区域电泳和脂蛋白电泳。如前所述，使用来自Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)的4％-12％梯度凝胶、试剂、电泳系统和预染色的蛋白质分子量标准(蛋白质梯，Thermo)，在非还原和还原条件下进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)³⁰。

对于二维凝胶电泳，首先使用2-D Clean-up试剂盒(GE Healthcare，LittleChalfont，United Kingdom)对样品进行脱盐，在pH3-10的梯度下进行等电聚焦(EttanIPGphor，GE Healthcare，Little Chalfont，United Kingdom)，并使用4-12％聚丙烯酰胺进行SDS-PAGE。使用Protein Gel Fast Stain Solution染色(Strong BiotechCorporation，Taipei，Taiwan)进行蛋白质检测。

进行蛋白质印迹分析以检测纤维蛋白原和vWF。简言之，将热处理的PPL样品与4x样品缓冲液(0.35M Tris(pH 6.8)、10％w/v SDS、30％v/v甘油、0.6M DTT和0.012％w/v溴酚蓝)混合并加热到95℃，保持5分钟。通过SDS-PAGE分离蛋白质，然后转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。用TBS-0.1％Tween20中的5％脱脂乳封闭膜，并与兔抗人纤维蛋白原抗体(GeneTex，California，USA)和兔抗人Von Willebrand因子(vWF)抗体(Agilent's Dako，California,USA)一起孵育。使用HRP偶联的第二抗体，然后检测增强的化学发光(ECL)(GeneTex，California，USA)。

-通过ELISA和细胞因子阵列测定生长因子和细胞因子含量

如之前所述，根据供应商的说明，使用Quantikine ELISA试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)测定生长因子，重复三次^31-33。

将血小板沉淀裂解物样品稀释500倍(对于37℃和56℃处理的样品)用于测定PDGF-AB；对于BDNF稀释500倍和50倍(分别为37℃和56℃)；对于bFGF，稀释10倍和不稀释(分别为37℃和56℃)；对于VEGF稀释5倍(37℃和56℃)；对于EGF稀释100倍(分别为37℃和56℃)；对于HGF不稀释(37℃和56℃)；对于TGF-β稀释400倍(37℃和56℃)；和对于PF4稀释1x10⁶倍。对于血小板裂解物，稀释倍数分别为200倍、100倍、1倍、2倍、50倍、2倍、100倍和1×10⁵倍。

对于TGF-β1测定，将40μL样品在20μL 1N HCl中酸化10分钟，然后用20μL的1.2NNaOH/0.5M HEPES中和³¹。

根据制造商的说明(R&D Systems)，使用人XL细胞因子阵列以两次重复检测150μgPPL(在56℃或65℃下热处理或不处理)中的102种细胞因子/生长因子的相对含量。使用Imagine J软件量化信号强度。

-LUHMES细胞的维持和分化

从Scholz博士的实验室(University of Konstanz,Germany)获得LUHMES细胞并如之前所述培养²⁸。

简言之，使用Nunclon^TM(Nunc，Roskilde，Denmark)塑料细胞培养瓶和预先涂有50μg/mL聚L-鸟氨酸和1μg/mL纤连蛋白的多孔板(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)在水中于37℃增殖未分化的LUHMES细胞3小时。去除涂覆溶液后，用无菌蒸馏水洗涤培养瓶并风干。在37℃，湿润的95％空气，5％CO₂氛围中生长细胞。增殖培养基是Advanced Dulbecco改良的Eagle培养基(高级DMEM)/F12，其含有1×N-2补充物(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco，Rockville，MD，USA)和40ng/mL重组bFGF(R&D Systems)。当达到约80％融合时，用0.025％胰蛋白酶溶液(Gibco，Rockville，MD，USA)解离细胞，并以3×10⁶个细胞/瓶进行传代。为了诱导分化为神经细胞，将2×10⁶个LUHMES接种并在T75培养瓶的增殖培养基中生长24小时，然后在含有1×N-2补充剂、2mM L-谷氨酰胺(Gibco、1mM二丁酰基cAMP(Sigma-Aldrich)、1μg/mL四环素(Sigma-Aldrich)和2ng/mL重组人GDNF(R&DSystems)的Advanced DMEM/F12中生长。在分化条件下培养两天后，将LUHMES培养至24孔板，在第5天进行进一步的实验。

-LUHMES细胞神经毒性刺激和活力测定

一旦分化(第5天)，将细胞暴露于不同浓度的血小板沉淀裂解物(0.025-15％；v/v)1小时，然后暴露于30μM的MPP+(Sigma-Aldrich)。通过MTT在48小时后评估细胞活力。

向细胞培养基加入0.5mg/ml(终浓度)的MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物)测定。在37℃孵育1小时后，去除培养基，将活细胞中存在的紫色晶体在剧烈摇动下的DMSO中裂解10分钟。将等分试样转移至96孔板以检测570nm处的吸光度(690nm作为背景值)。

使用两个不同的细胞培养板(每个含有对照)评估每种条件，重复两次。数据表示为与其中LUHMES未暴露于MPP+的受控条件相比的％活力。

-改良的热处理的PPL(56℃)诱导的神经恢复

为促进分化，在补充有0.5％FBS、4mM L-谷氨酰胺、1％PS和1μM全反式视黄酸的高级DMEM/F12中，在培养瓶中培养神经干细胞(NSC-34)2天。然后将细胞以每孔3×10⁴个细胞的浓度接种于24孔板中，在含有0.5％FSB的分化培养基中培养6小时。然后将培养基替换为不含FBS的分化培养基。3天后，用不含视黄酸的分化培养基更换培养基进行处理。首先用甲萘醌或斯特罗菌素(STS)处理NSC-34细胞1小时、2小时或3小时，然后加入(5％)改良的热处理的PPL，总计24小时。分别使用碘化丙锭和氢化乙啶通过流式细胞仪评估细胞活力和氧化应激。通过非参数的Mann Whitney检验进行统计分析。

-在小鼠1-甲基-1,2,3,6-四氢吡啶模型(MPTP-小鼠模型)中的立体导向术和血小板颗粒裂解物输注

所有动物手术均按照法国和国际指南进行(1987年10月19日第87-848号法令；法国农林部、动物卫生和福利兽医局)。使用的小鼠为5月龄，体重为28-30g。

以小鼠脑脊液估计体积(40μL)的1％、2.5％、5％和10％注射PPL。

在所需的前后位和侧位立体导向坐标(B-0.34mm，L+1mm，根据Paxinos和Watson脑图谱)插入脑插管，然后用丙烯酸水泥固定在头骨上。

在手术前用盐水(对照)或血小板沉淀裂解物填充Alzet泵(Durect Corporation，Cupertino，CA，USA)，连接到特定的插管并在37℃下装填。就在插入脑插管之前，将泵体皮下插入小鼠背部。手术后两天，将一些小鼠用MPTP急性中毒(腹膜内注射20mg/kg MPTP四次，间隔2小时)。在7天(中毒后5天)内连续注射血小板沉淀裂解物，并在实验期间观察小鼠的毒性体征。

通过免疫染色和计数黑质中存在的酪氨酸羟化酶阳性细胞来初步评估血小板沉淀裂解物的任何神经保护作用。如前所述进行小鼠麻醉、甲醛输注、将脑切片切成片以及与抗体一起孵育和TH阳性神经元计数34。

-统计分析

结果表示为平均值±标准偏差(SD)。在检查数据的正态分布后，使用单向ANOVA进行统计分析。在非正态分布的情况下进行非参数的Wilcoxon和Kruskal-Wallis检验。认为P值<0.05是统计学显著的。

结果

起始血小板浓缩物的血细胞计数和血小板裂解物的表征

用于制备血小板沉淀裂解物和血小板裂解物的血小板浓缩物的平均计数为：血小板1240±252x 10⁹个/L，红血细胞0.08±0.05x 10¹²个/L和白血细胞0.5±0.2x 10⁹个/L。

首先表征PPL的蛋白质组成。PPL^F和PPL^E的蛋白质含量(图2A，约11mg/ml)没有显著差异(p>0.05)，并且比PL(约65mg/ml)低得多(p<0.001)。

PL(图2B)与PPL^F(图2C)和/或PPL^E(未显示)相比的区域电泳图显示较低比例的蛋白质在白蛋白和γ区域中迁移，并且更多地表现为α1、α2和β，白蛋白/γ(A/G)较低(0.5vs1.6)。

PPL^F(和PPL^E；未显示)的SDS-PAGE图谱(图2D)显示分子量分布宽的蛋白质，其中在非还原和还原条件下，主要条带分别在约60、48和15kDa，以及约68、48和15kDa。2D-电泳图谱(图2D)显示，PPL由多个组分组成，这与血小板蛋白质组的复杂性一致。

因此，表征显示，与血小板裂解物相比，血小板沉淀裂解物具有独特的蛋白质组成。

热处理改变蛋白质的含量

首先在56℃处理血小板沉淀裂解物30分钟，以获得根据本发明的改良的热处理的PPL。

热诱导的蛋白质沉淀导致热处理的PPL^E(p<0.01)和PPL^F(p<0.001)的上清液中的总蛋白质含量(图3A)均显著低于正常的PPL^F、PPL^E和PL对照(p<0.001)。

通过ELISA测量(图3B)或表示为每mg蛋白质(图3C)的生长因子的含量受到热的影响具有差异。

尽管与各自的未经热处理的PPL^E或PPL^F相比，PDGF-AB、BDNF、bFGF、EGF和HGF浓度显著降低(p<0.001)，VEGF、TGF-β和CXCL4/PF4(PPL^E)仍然没有显著差异。

在热处理的PPL^E和PPL^F(即，改良的热处理的PPL)中，对于以每mg总蛋白表示的生长因子的相对含量，BDNF、bFGF和HGF显著降低(p<0.001)，PDGF-AB、VEGF(在PPL^F中)和EGF保持不变(p>0.05)，且VEGF(在PPL^E中)、TGF-β和PF4显著升高(p<0.001)。

在非还原或还原PPL的SDS-PAGE图谱上研究45、56和65℃热处理的影响(图4B)。

56和65℃的热处理导致蛋白质组成的主要变化，其特征在于去除了各种分子量的蛋白质。蛋白质印迹分析(图4A)表明，56℃和65℃的热处理去除了血小板携带的纤维蛋白原(MM为约270kDa)，而vWF保持相对不受影响。

将在56℃或65℃热处理的改良PPL中的细胞因子与在37℃处理的PPL(对照)进行比较的阵列鉴定了一些PPL组分的相对富集(图4C、图5和图6)，包括PDGF-AA、-AB/BB和脂联素，以及BDNF，EGF和其他的相对贫乏。此外，在56℃或65℃热处理的改良PPL与在37℃处理的PPL的细胞因子比率表明与含量相关的变化。

实际上，在56℃热处理的改良PPL相对于在37℃处理的PPL的比率表明，脂质运载蛋白-2、腺嘌呤核苷和C-反应蛋白的相对含量增加，而补体因子D、ENA-78、BDNF、促血管生成素-1和内皮糖蛋白的相对含量减少(图7)。

在65℃热处理的改良PPL相对于在37℃处理的PPL的比率表明，脂质运载蛋白-2、腺嘌呤核苷、PDGF-AA和PDGF-AB/BB的相对含量增加，而补体因子D、ENA-78、BDNF、促血管生成素-1、内皮糖蛋白、Dkk-1、CD14、C-反应蛋白、EGF、血小板反应蛋白-1、RANTES、RBP4、维生素D和血管生成素的相对含量减少(图8)。

血小板沉淀裂解物保护LHUMES细胞的活力，并且在MPP+之前添加时发挥显著的神经保护活性，并且热处理增强血小板沉淀裂解物的神经保护活性。

为进一步证明PPL的体外神经保护能力，首先验证0.1-5％(v/v)的PPL对LUHMES细胞没有毒性。

图10B表明，通过MTT测定显示，用2％的PPL^F和PPL^E预处理细胞1小时对30μM的MPP+发挥高度显著(p<0.001)的保护作用。

当用各种剂量(0.025-15％)的PPL^F处理时，观察到剂量反应效应，其中在2％PPL^F处理实现最大的神经保护作用。

因此，PPL^F和PPL^E均保护LUHMES细胞不受MPP+的神经毒性攻击。

关于神经保护活性，0.5-15％的PPL、在37℃处理的PPL(图11A)，或在45℃(图11B)、56℃(图11C)或65℃热处理的改良PPL(图11D)仍保持高度显著的神经保护活性，即使在低至0.5％的浓度下。在56℃的热处理导致较低剂量下的细胞活力提高。用0.5％剂量的在56℃或65℃下热处理的改良PPL处理的LUHMES细胞表现出比用0.5％的在37℃处理的PPL处理的LUHMES细胞(对照)更好的活力。用15％剂量的在56℃和65℃下热处理的PPL也观察到这种定性提高。

图11E比较了各种剂量PPL的神经保护作用，显示对于在最高温度下处理的PPL(56和65℃)，功效在0.5-15％范围内保持相似。

相反，未经热处理的PPL或仅在45℃加热的PPL观察到剂量反应效应，表明在低剂量(0.5％)没有功效，或在较高剂量(10-15％)具有毒性或抑制作用，这可能由蛋白质加载过多引起。

小鼠脑室内输注的血小板沉淀裂解物没有诱导急性毒性并提供神经保护和神经恢复

验证ICV注射在37℃下处理的PPL和根据本发明的改良的热处理的PPL的可能性的实验表明，在四个选择的剂量(1％、2.5％、5％和10％)下没有明显的有害作用。在一周的实验期间内，PPL输注后没有立即可检测的毒性作用。与手术相关的死亡率很低(10只动物中的1只)。

细胞计数分析证明，在暴露于神经毒素甲萘醌或斯特罗菌素1小时、2小时或3小时后，通过改良的热处理的PPL处理，NCS-34细胞的活力几乎完全恢复(图9A和9B)。这些结果表明，根据本发明的改良的热处理的PPL诱导神经恢复。氧化应激的评估证实了这些结果。实际上，通过根据本发明的改良的热处理的PPL的在后处理，由甲萘醌处理诱导的氧化应激(+1200％，以对照的百分比表示)降低至接近正常值(图9C)。如预期一样，检测和计数黑质中的TH阳性神经元(图12)证明了与对照载体溶液(Veh)相比，MPTP具有显著的(p<0.05)神经毒性作用。单独的5％或10％PPL对TH阳性细胞的数量没有显著影响。有趣的是，我们观察到10％对MPTP表现出强烈且显著的(p<0.05)神经保护作用。因此，在高达CFS总体积的至少10％的剂量下，ICV输注PPL似乎是安全的，这提供了针对MPTP中毒的神经保护。

在暴露于神经毒性甲萘醌或斯特罗菌素1小时、2小时或3小时后，用在37℃处理的PPL处理NCS-34细胞。该实验的结果表明，尽管获得了神经保护，但与如上所述的改良的热处理的PPL的处理相比，它降低了20％(参见图9A和9B)。

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Claims

1.改良的热处理的血小板沉淀裂解物在制备用于治疗神经系统疾病的药物中的用途，所述改良的热处理的血小板沉淀裂解物的总蛋白含量少于未经热处理的血小板沉淀裂解物的总蛋白含量的70％，并且其具有少于1.5mg/mL的纤维蛋白原；

所述改良的热处理的血小板沉淀裂解物由包括以下步骤的方法制备：

a)提供血小板沉淀裂解物，

2.权利要求1所述的用途，其中所述改良的热处理的血小板沉淀裂解物的总蛋白含量少于未经热处理的血小板沉淀裂解物的总蛋白含量的60％。

3.权利要求1所述的用途，其中所述改良的热处理的血小板沉淀裂解物的总蛋白含量少于未经热处理的血小板沉淀裂解物的总蛋白含量的50％。

4.权利要求1所述的用途，其中所述改良的热处理的血小板沉淀裂解物具有少于1mg/mL的纤维蛋白原。

5.权利要求1所述的用途，其中所述改良的热处理的血小板沉淀裂解物具有少于0.5mg/mL的纤维蛋白原。

6.权利要求1所述的用途，其中所述改良的热处理的血小板沉淀裂解物具有0.1mg/mL至0.3mg/mL的纤维蛋白原。

7.权利要求1所述的用途，其中所述神经系统疾病选自神经退行性疾病、神经炎症性疾病、神经发育疾病、神经血管疾病和脑损伤。

8.权利要求7所述的改良的用途，其中所述神经系统疾病是选自以下的神经退行性疾病：多发性硬化症(MS)、帕金森病(PD)、亨廷顿病(HD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、中风、年龄相关性黄斑变性(AMD)、阿尔茨海默病(AD)、血管性痴呆、额颞叶痴呆、语义性痴呆和路易体痴呆。

9.权利要求8所述的用途，其中所述神经退行性疾病选自帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、年龄相关性黄斑变性和阿尔茨海默病。

10.权利要求7所述的用途，其中所述神经系统疾病是选自缺氧或创伤性脑损伤的脑损伤。

11.权利要求1-10任一项所述的用途，其中所述改良的热处理的血小板沉淀裂解物通过鞘内、眼内、鼻内或脑室内途径施用。

12.权利要求11所述的用途，其中所述改良的热处理的血小板沉淀裂解物通过脑室内途径施用。

13.权利要求12所述的用途，其中所述改良的热处理的血小板沉淀裂解物施用至右侧脑室。

14.权利要求12所述的用途，其中所述改良的热处理的血小板沉淀裂解物以接近于脑室内孔施用。

15.权利要求12所述的用途，其中所述改良的热处理的血小板沉淀裂解物施用至第三脑室。

16.权利要求12所述的用途，其中所述改良的热处理的血小板沉淀裂解物适于用泵施用。