CN108866142B

CN108866142B - 细胞色素p450、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素p450还原酶及其应用

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Publication number: CN108866142B
Application number: CN201710325719.6A
Authority: CN
Inventors: 周志华; 杨成帅; 严兴; 肖友利; 李伟超; 李晨
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2017-05-10
Filing date: 2017-05-10
Publication date: 2022-08-16
Anticipated expiration: 2037-05-10
Also published as: CN108866142A

Abstract

本发明涉及细胞色素P450、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸‑细胞色素P450还原酶及其应用。本发明揭示了一组新的、在萜类化合物羟基化催化及灵芝三萜合成中发挥作用的细胞色素P450(P450 GP01和P450 GP02)，以及与之配合完成羟基化催化的一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸‑细胞色素P450还原酶(GLCPR)。更具体地，本发明的细胞色素P450 GP01能特异和高效地催化四环三萜化合物底物的C‑23位的羟基化；本发明的细胞色素P450 GP02羟基化灵芝酸DM和灵芝酸TR生成多种产物；本发明的GLCPR能够与细胞色素P450配对，协助细胞色素P450发挥羟基化活性。

Description

细胞色素P450、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和微生物学领域；更具体地，本发明涉及新型细胞色素P450、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶及其应用。

背景技术

灵芝三萜是从灵芝及其同属真菌(如紫芝，树舌等)中分离到的高度氧化的羊毛甾醇衍生物，属于四环三萜类化合物，是灵芝的主要药用成分之一。目前，已经从灵芝中分离出了至少150种三萜类化合物，其中部分灵芝三萜被证实具有广泛的生理功能和潜在的药物价值：包括抗肿瘤、抗病毒、护肝、降胆固醇等效果。

从结构上来看，灵芝三萜是羊毛甾醇经过一系列氧化、还原和乙酰化反应形成的生物活性分子。灵芝三萜依据其C-17位侧链功能基团的不同可以分为灵芝醇、灵芝醛和灵芝酸等。灵芝酸是灵芝三萜的重要组分，灵芝酸依据其母核双键的位置和数目可分为Ⅰ型和Ⅱ型灵芝酸，Ⅰ型灵芝酸在C-8与C-9之间存在一个双键，Ⅱ型灵芝酸在C-7与C-8之间和C-9与C-11之间存在共轭双键。除了母核的差异，灵芝酸之间结构上的差异主要体系在母核C-3、C-7、C-11、C-12、C-15、C-22和C-23不同的取代基修饰，主要包括羟基化、脱氢反应和乙酰基修饰等。

不同的修饰位点和不同的取代基使灵芝三萜具有结构多样性，同时也赋予了灵芝酸不同的生理功能和药用价值。例如，灵芝酸A,C2和DM都是Ⅰ型灵芝酸，灵芝酸A具有抗乳腺癌和保肝作用；灵芝酸C2除了可以抗肿瘤还具有抗炎，抗组织胺和抗衰老等作用；灵芝酸DM不仅可以抗乳腺癌，还具有抗前列腺癌和抑制破骨细胞生成的功能。

细胞色素P450的主要功能是在电子供体NAD(P)H的存在下，将氧气中的一分子氧插入到底物分子中。根据氨基酸序列的相似性，目前细胞色素P450已有700多个家族。目前已测序的真菌基因组中，发现存在百种以上不同的P450。其主要参与生物合成途径和生物解毒途径。细胞色素P450在灵芝三萜的生物合成中起着重要的作用，广泛参与了灵芝三萜的合成，其作用是四环三萜母核C-3、C-7、C-11、C-12、 C-15、C-22和C-23插入一个氧原子，引入一个羟基，从而形成或者进一步通过脱氢和乙酰化修饰形成不同药用价值的灵芝酸。

在真核细胞中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶是一种膜蛋白，在细胞色素P450催化反应体系中起重要的作用。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素 P450还原酶负责将电子从电子供体(NADPH)传递给细胞色素P450，为细胞色素 P450羟基化反应提供电子。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶属于核黄素蛋白家族，具有与三个辅酶FMN，FAD和NADPH结合的保守结构域。

目前，灵芝和紫芝的基因组和转录组都已经公布，研究人员已经注释了大量的细胞色素P450，还没有P450的功能得到鉴定和阐述，具体哪些P450参与了灵芝酸的合成还未知。由于灵芝中含有数量众多的细胞色素P450，且它们的含量都很低，所以它们的分离纯化的研究进展缓慢。在灵芝和紫芝的基因组中注释了一个烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶，其功能也尚未得到鉴定。

灵芝酸7-oxo-ganoderic acid Z是一种Ⅰ型灵芝酸，其在灵芝中的含量占干重的百万分之一左右，是一种乙酰辅酶A还原酶和酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶抑制剂，有望用于降血脂和防止动脉硬化。灵芝酸Jc是一种Ⅱ型灵芝酸，其在灵芝中的含量占干重的千万分之三左右，对人早幼粒白血病细胞具有选择性抑制活性，有望用于治疗或辅助治疗人早幼粒白血病。

鉴于灵芝三萜的生物活性和巨大的经济价值。目前灵芝三萜的生产主要依赖于从灵芝组织中分离纯化，但是灵芝酸在灵芝中的含量较低，即使比较丰富的灵芝酸A 的含量也只有灵芝干重的千分之一左右，其它灵芝三萜的含量则更加低。导致灵芝三萜的成本十分高并且产量有限。

因此，本领域有必要发现和鉴定与灵芝三萜合成相关的P450和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶解析灵芝三萜合成途径，生物合成灵芝三萜。

发明内容

本发明的目的就是提供一组细胞色素P450和一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种催化四环三萜化合物的羟基化的方法，所述方法包括：利用细胞色素P450催化四环三萜化合物，获得羟基化的四环三萜化合物；其中，所述的细胞色素P450选自下组：(a)具有SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的多肽；(b)将(a)中任一多肽经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10 个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、并具有(a)多肽的活性的由(a)衍生的多肽；(c)氨基酸序列与(a)中任一多肽所示氨基酸序列的同源性≥85％(较佳地≥90％；更佳地≥95％)，并具有(a)多肽的活性的衍生的多肽；(d) 序列中含有(a)或(b)或(c)所述多肽序列的衍生多肽；(e)在(a)或(b)或(c)所述多肽序列中添加标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的多肽。

在一个优选例中，所述的细胞色素P450的活性是传递对四环三萜化合物底物的羟基化修饰；例如，对真菌的小分子代谢产物进行羟基化修饰。

在另一优选例中，所述的真菌小分子代谢产物为灵芝的次生代谢产物(如灵芝三萜或者甾醇)。

在另一优选例中，在利用细胞色素P450催化四环三萜化合物时，还配合加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶；其中，所述的细胞色素P450选自下组： (1)具有SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的多肽；(2)将(1)中多肽经过一个或多个(如 1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、并具有(1)多肽的活性的由(1)衍生的多肽；(3)氨基酸序列与(1) 中多肽所示氨基酸序列的同源性≥85％(较佳地≥90％；更佳地≥95％)，并具有(1)多肽的活性的衍生的多肽；(4)序列中含有(1)或(2)或(3)中所述多肽序列的衍生多肽；(5) 在(1)或(2)或(3)所述多肽序列中添加标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的多肽。

在另一优选例中，所述的细胞色素P450选自：P450还原酶ATR 1(较佳地来源于拟南芥)；P450还原酶ATR 2.1(较佳地来源于拟南芥)；或P450还原酶ATR 2.2(较佳地来源于拟南芥)；或P450还原酶NCP1(较佳地来源于酵母)。

在另一优选例中，所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶通过传递电子给细胞色素P450、协助细胞色素P450进行对底物的羟基化修饰。例如，对真菌的小分子代谢产物进行羟基化修饰。

在另一优选例中，所述的羟基化是位于四环三萜化合物的C-23位的羟基化。

在另一优选例中，所述的四环三萜化合物是具有式(I)结构的化合物，所述的羟基化的四环三萜化合物是具有式(II)结构的化合物：

其中，R1为羟基、酮基或保护基；R2为氢、酮基或保护基；R3为氢、酮基或保护基；R4为氢、氧乙酰基或保护基；R5为羟基、氧乙酰基或保护基。

在另一优选例中，R1和R2为酮基，R3，R4和R5为氢，所述的式(I)化合物为灵芝酸DM；所述的式(II)化合物为hainanic acid A；或

R1为羟基，R2为酮基，R3，R4和R5为氢，所述的式(I)化合物为7-oxo-ganodericacid Z；所述的式(II)化合物为23-OH-7-oxo-ganoderic acid Z；或

R1为羟基，R2为氢，R3为酮基，R4和R5为氧乙酰基，所述的式(I)化合物为灵芝酸AP2；所述的式(II)化合物为23-OH-AP2；或

R1和R3为酮基，R2和R4为氢，R5为羟基，所述的式(I)化合物为Ganolucidic acidE；所述的式(II)化合物为23-OH-Ganolucidic acid E。

较佳地，所述的式(I)化合物、式(II)化合物及其各基团的更清楚的列表如表1。

表1

式(I)化合物

R1

R2

R3

R4

R5

式(Ⅱ)化合物

灵芝酸DM

O

H

hainanic acid A

7-oxo-ganoderic acid Z

OH

O

H

23-OH-7-oxo-ganoderic acid Z

灵芝酸AP2

OH

H

O

OAc

23-OH AP2

Ganolucidic acid E

O

H

O

H

OH

23-OH-Ganolucidic acid E

在另一优选例中，所述的四环三萜化合物是具有式(III)结构的化合物，所述的羟基化的四环三萜化合物是具有式(IV)结构的化合物

其中，R为羟基或保护基。

在另一优选例中，R为羟基，所述的式(III)化合物为灵芝酸TR；所述的式(IV)化合物为灵芝酸Jc。

在另一优选例中，所述四环三萜化合物包括(但不限于)：达玛烷型四环三萜类化合物(包括S构型或R构型的化合物)、羊毛脂烷型四环三萜类化合物、甘遂烷型四环三萜类化合物、环阿屯烷(环阿尔廷烷)型四环三萜类化合物、葫芦烷四环三萜类化合物、或楝烷型四环三萜类化合物。

在另一优选例中，所述的细胞色素P450是宿主细胞表达的；较佳地，在表达后，破碎细胞，获得含有细胞色素P450的微粒体；或所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶是宿主细胞表达的；较佳地，在表达后，破碎细胞，获得含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶的微粒体。

在另一优选例中，所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞；较佳地，所述原核宿主细胞包括(但不限于)大肠杆菌、枯草杆菌；较佳地，所述真核宿主细胞包括(但不限于)真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞；更佳地，所述的真菌细胞包括(但不限于) 酵母细胞和灵芝细胞；更佳地，所述的酵母包括(但不限于)：酿酒酵母、毕赤酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、假丝酵母等。

在本发明的另一方面，提供分离的多肽，所述的多肽选自下组：(a)具有SEQ IDNO:18或SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的多肽；(b)将(a)中任一多肽经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、并具有(a)多肽的活性的由(a)衍生的多肽；(c)氨基酸序列与(a)中任一多肽所示氨基酸序列的同源性≥85％(较佳地≥90％；更佳地≥95％)，并具有 (a)多肽的活性的衍生的多肽；(d)序列中含有(a)或(b)或(c)中所述多肽序列的衍生多肽。

在本发明的另一方面，提供分离的多肽，所述的多肽选自下组：(1)具有SEQ IDNO:20所示氨基酸序列的多肽；(2)将(1)中多肽经过一个或多个(如1-20个，较佳地 1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、并具有(1)多肽的活性的由(1)衍生的多肽；(3)氨基酸序列与(1)中多肽所示氨基酸序列的同源性≥85％(较佳地≥90％；更佳地≥95％)，并具有(1)多肽的活性的衍生的多肽； (4)序列中含有(1)或(2)或(3)中所述多肽序列的衍生多肽；(5)在(1)或(2)或(3)所述多肽序列中添加标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的多肽。

在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，所述的多核苷酸选自：

(A)编码所述多肽的多核苷酸；

(B)编码如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

(C)核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的多核苷酸；

(D)核苷酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸；

(E)在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的5’端和 /或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸所形成的核苷酸序列；

(F)与(A)-(E)任一所述的核苷酸序列互补(较佳地完全互补)的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供一种载体，所述的载体含有前面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。

在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，它含有前面所述的载体，或其基因组中整合有前面所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种制备所述的多肽的方法，所述方法包括：(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出所述的多肽。

在另一优选例中，在表达后，破碎所述的宿主细胞，获得所述的多肽的微粒体；较佳地，所述的宿主细胞是灵芝、酿酒酵母、毕赤酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、假丝酵母等。

在本发明的另一方面，提供所述的P450GP01和P450GP02多肽的用途，用于催化四环三萜化合物的羟基化；较佳地，所述的羟基化是位于四环三萜化合物的C-23 位的羟基化(即：将四环三萜化合物的C-23位的氢替换为羟基)。

在本发明的另一方面，提供所述的GLCPR多肽的用途，用于在利用细胞色素 P450催化四环三萜化合物时，作为还原酶；较佳地，所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸- 细胞色素P450还原酶通过传递电子给细胞色素P450、协助细胞色素P450进行对底物的羟基化修饰。

在本发明的另一方面，提供所述的宿主细胞的用途，用于制备酶催化试剂，或生产细胞色素P450和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶、或作为催化细胞、或产生式(II)和(IV)化合物。

在本发明的另一方面，提供一种用于使四环三萜化合物的羟基化的微粒体，所述的微粒体是前面所述的方法产生的微粒体。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、GP01，GP02和GLCPR的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测的结果。

图2、细胞色素P450基因GP01在酿酒酵母中的表达，获得微粒体，采用anti-6×HisTag Western Blot检测表达情况。

图3、细胞色素P450基因GP01在酿酒酵母中的表达，获得微粒体，进行 SDS-PAGE电泳检测。

图4、细胞色素P450基因GP02在酿酒酵母中的表达，获得微粒体，采用anti-6×HisTag Western Blot检测表达情况。

图5、细胞色素P450基因GP02在酿酒酵母中的表达，获得微粒体，进行 SDS-PAGE电泳检测。

图6、表达GP01的酵母PNGP1宿主的微粒体可以将灵芝酸DM转化为多个化合物峰。

图7、表达GP01的酵母PNGP1宿主的微粒体可以将灵芝酸TR分别转化为多个化合物峰。

图8、表达GP02的酵母PNGP2宿主的微粒体可以将底物灵芝酸DM转化为多个新峰。

图9、表达GP02的酵母PNGP2宿主的微粒体可以将底物灵芝酸TR转化为多个新峰。

图10、表达GP01和GLCPR的酵母PGGP1宿主的微粒体可以将灵芝酸DM转化为多个化合物峰。

图11、表达GP01和GLCPR的酵母PGGP1宿主的微粒体可以将灵芝酸TR转化为多个化合物峰。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，揭示了一组新的、在萜类化合物羟基化催化及灵芝三萜合成中发挥作用的细胞色素P450(P450 GP01和P450 GP02)，以及一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶(GLCPR)。更具体地，本发明的细胞色素 P450 GP01能特异和高效地催化四环三萜化合物底物的C-23位的羟基化；本发明的细胞色素P450 GP02羟基化灵芝酸DM和灵芝酸TR生成多种产物；本发明的GLCPR 具有良好的还原酶特性，可协助细胞色素P450发挥羟基化活性。

如本文所用，“分离的多肽”是指所述多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化所述多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。所述多肽的纯度还可以用氨基酸序列进行进一步分析。

活性多肽、其编码基因、载体及宿主

本发明揭示了一组新的、在萜类化合物羟基化催化及灵芝三萜合成中发挥作用的细胞色素P450(P450 GP01和P450 GP02)。优选地，所述的P450 GP01是具有SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的多肽；所述的P450 GP02是具有SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的多肽。

本发明还揭示了一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶(GLCPR)。优选地，所述的GLCPR是具有SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的多肽。

本发明的活性多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括所述多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述多肽相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇) 融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

所述的多肽优选序列为SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示的多肽，还包括具有与所示多肽具有相同功能的SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或 SEQ ID NO:20序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和 /或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明还提供所述多肽的类似物。这些类似物与天然多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基 (如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明的GP01、GP02和GLCPR多肽的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG、HA、HA1、c-Myc、Poly–His、Poly-Arg、Strep-TagII、AU1、EE、T7、 4A6、ε、B、gE、以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。表2列出了其中的一些标签及其序列。

表2

为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在所述GP01、GP02和 GLCPR的氨基酸氨基末端添加上信号肽序列，如pelB信号肽等。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的蛋白质，但与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件) 下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1) 在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2) 杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3) 仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码 GP01、GP02和GLCPR蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的GP01、GP02和GLCPR核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或GP01、GP02和GLCPR蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的GP01、GP02和GLCPR多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码GP01、GP02和GLCPR多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，GP01、GP02和GLCPR多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含GP01、GP02和GLCPR编码DNA 序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、 DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp 启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属，枯草杆菌；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母，植物细胞，灵芝细胞；果蝇S2或Sf9 的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

作为本发明的优选方式，所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞；较佳地，所述原核宿主细胞包括(但不限于)大肠杆菌、枯草杆菌；较佳地，所述真核宿主细胞包括 (但不限于)真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞；更佳地，所述的真菌细胞包括(但不限于)酵母细胞和灵芝细胞；更佳地，所述的酵母包括但不限于：酿酒酵母、毕赤酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、假丝酵母等。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

作为本发明的优选方式，所述的重组多肽在宿主细胞中表达，在表达后，破碎细胞，获得细胞色素P450微粒体。将所述的微粒体应用于酶反应。微粒体在细胞生物学中定义为从内质网的碎片所得到的小型囊泡。细胞色素P450(CYP)可存在于微粒体上。

应用

本发明的细胞色素P450 GP01、GP02多肽或它们的衍生多肽，可应用于催化四环三萜化合物的羟基化。如本发明的实施例中所论证的，所述的GP01能特异和高效地催化四环三萜化合物底物的C-23位的羟基化，特别是能够将灵芝酸DM和灵芝酸 TR分别转化为hainanic acid A和灵芝酸Jc。所述的细胞色素P450 GP02能羟基化灵芝酸DM和灵芝酸TR生成多种产物。

本发明的GLCPR多肽或其衍生多肽，用于在利用细胞色素P450催化四环三萜化合物时，作为辅酶。本发明的GLCPR具有良好的还原酶特性，可协助细胞色素P450 发挥羟基化活性，分别促进底物灵芝酸DM生成灵芝酸hainanic acid A和灵芝酸TR 生成灵芝酸Jc。

作为本发明的一种优选方式，本发明的活性多肽具有细胞色素P450羟基化活性或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶活性，并且能够催化下述反应：

其中，R1～R5的定义如前。

作为本发明的另一种优选方式，本发明的活性多肽具有细胞色素P450羟基化活性或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶活性，并且能够催化下述反应：

其中，R的定义如前。

本发明中，所述的四环三萜化合物包括但不限于：达玛烷型、羊毛脂烷型、甘遂烷型、环阿屯烷(环阿尔廷烷)型、葫芦烷和楝烷型等四环三萜类化合物。

本发明还提供了应用所述的细胞色素P450 GP01、GP02多肽或它们的衍生多肽催化四环三萜化合物的羟基化的方法。较佳地，所述方法包括：用本发明的细胞色素 P450GP01和GP02多肽分别将式(I)和(III)化合物转化为式(II)和(IV)化合物。在获得了本发明的GP01、GP02多肽和GLCPR酶后，本领域人员可以方便地应用它们来发挥羟基化的作用，特别是对灵芝酸DM和灵芝酸TR的羟基化作用。

在应用时，特别是工业化生产中，本发明的细胞色素P450GP01、GP02多肽、 GLCPR多肽或它们的衍生多肽还可被固定于其它的固相载体上，获得固定化的酶，应用于与底物进行体外反应。所述的固相载体例如是一些无机物制成的微球，管状体等。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。化学法包括结合法、交联法。结合法又分为离子结合法和共价结合法。上述的固定化酶的方法均可被应用于本发明中。

本发明的主要优点：

(1)本发明的细胞色素P450 GP01可以特异性和高效地将四环三萜化合物底物的C-23位引入羟基；

(2)本发明的灵芝来源的NADPH-细胞色素P450还原酶(GLCPR)，其具有良好的还原酶特性，可协助细胞色素P450 GP01发挥羟基化活性，分别促进底物灵芝酸 DM生成灵芝酸hainanic acid A和灵芝酸TR生成灵芝酸Jc；

(3)本发明的细胞色素P450 GP02可以特异性和高效地将四环三萜化合物底物转化为多种产物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

以下实施例中，所应用的引物序列如表3。

表3

实施例1、细胞色素P450和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)-细胞色素P450还原酶的克隆

合成六条引物分别具有序列表中SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、 SEQID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的核苷酸序列。

提取灵芝RNA并进行反转录，获得灵芝的cDNA。以该cDNA为模板进行PCR 扩增，分别使用上述三对引物SEQ ID NO:4/5、SEQ ID NO:6/7和SEQ ID NO:8/9 分别进行PCR扩增。DNA聚合酶选用宝生物工程有限公司的高保真的PrimeSTAR DNA聚合酶。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测(图1)。在紫外下照射，切下目标DNA 条带。然后采用Axygen Gel ExtractionKit(AEYGEN公司)从琼脂糖凝胶中回收DNA 即为扩增出的DNA片段。将此DNA片段与全式金公司的pEASY-Blunt Simple Cloning Vector连接，连接产物转化全式金公司的大肠杆菌Tran1-T1感受态细胞，将转化后的大肠杆菌菌液涂布在添加氨苄霉素50ug/mL、IPTG0.1mM、X-Gal 20μg/mL的LB 平板上，并进一步通过PCR验证重组克隆。进行测序获得相应的P450基因和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶基因，分别命名peasy-GP01，peasy-GP02和 peasy-GLCPR。

细胞色素P450 GP01基因具有序列表中SEQ ID NO:1的核苷酸序列。自SEQ ID NO:1的5’端第1-1530位核苷酸为GP01的开放阅读框(Open Reading Frame， ORF)，自SEQ IDNO:1的5’端的第1-3位核苷酸为GP01基因的起始密码子 ATG，自SEQ ID NO:1的5’端的第1528-1530位核苷酸为GP01基因的终止密码子 TAG。细胞色素P450GP01基因编码一个含有509个氨基酸的蛋白质GP01，具有 SEQ ID NO:18的氨基酸残基序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为 56.75kDa，等电点pI为7.93。自SEQ ID NO:18的氨基端的第439-448位氨基酸为细胞色素P450保守结构域。

细胞色素P450 GP02基因具有序列表中SEQ ID NO:2的核苷酸序列。自SEQ ID NO:2的5’端第1-1509位核苷酸为GP02的开放阅读框，自SEQ ID NO:2的5’端的第1-3位核苷酸为GP02基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:2的5’端的第 1507-1509位核苷酸为GP02基因的终止密码子TGA。细胞色素P450GP02基因编码一个含有502个氨基酸的蛋白质GP02，具有SEQ ID NO:19的氨基酸残基序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为56.31kDa，等电点pI为7.07。自SEQ ID NO:19的氨基端的第436-445位氨基酸为细胞色素P450保守结构域。

GLCPR具有序列表中SEQ ID NO:3的核苷酸序列。自SEQ ID NO:3的5’端第1-2184位核苷酸为GLCPR的开放阅读框，自SEQ ID NO:3的5’端的第1-3 位核苷酸为GLCPR基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:3的5’端的第2182-2184位核苷酸为GLCPR基因的终止密码子TGA。NADPH-细胞色素P450 还原酶基因GLCPR编码一个含有727个氨基酸的蛋白质GLCPR，具有SEQ ID NO:20的氨基酸残基序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为80.759kDa，等电点pI为5.19。

实施例2、细胞色素P450基因GP01和GP02的酵母重组表达载体构建

合成引物分别具有序列表中SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的核苷酸序列。

以酿酒酵母CEN.PK113-3C(购于Euroscarf)基因组为模版，以引物SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25扩增Trp表达元件dTrp-1(即dTrp，其5’和3’端均含有与 pESC-His同源的序列)。将PCR产物用AXYGEN公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。将质粒pESC-His(购于美国安捷伦公司)用 Fermentas公司的Nde Ⅰ和Pst Ⅰ双酶切并用XYGEN公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。将DNA片段和酶切后的pESC-His质粒一起转入酿酒酵母，体内进行同源重组。通过菌落PCR验证阳性转化子，抽提酿酒酵母质粒转化E.coli TOP 10感受态细胞，并涂布于添加100μg/mL氨苄青霉素的 LB平板上。通过菌落PCR验证阳性转化子，并测序进一步验证表达质粒pdTrp构建成功。

以酿酒酵母CEN.PK113-3C基因组为模版，以引物SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11扩增开放阅读框片段NCP1p-1(即NCP1，其5’和3’端均含有与pdTrp同源的序列)。将PCR产物用AXYGEN公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。将质粒pdTrp用Fermentas公司的EcoRⅠ酶切并用XYGEN 公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。将DNA片段和酶切后的pdTrp质粒一起转入酿酒酵母，体内进行同源重组。通过菌落PCR验证阳性转化子，抽提酿酒酵母质粒转化E.coli TOP 10感受态细胞，并涂布于添加 100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上。通过菌落PCR验证阳性转化子，并测序进一步验证表达质粒pdTrp-NCP1构建成功。其中，NCP1的核酸序列如SEQ ID NO:23。

以实施例1构建的含有GP01基因的质粒peasy-GP01为模板，利用引物SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13扩增开放阅读框片段GP01p-1(即GP01，其5’和3’端均含有与pdTrp同源的序列)。反向引物引入6×His Tag以便进行Western Blot检测表达。将PCR产物用AXYGEN公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。将质粒pdTrp-NCP1用Fermentas公司的SmaⅠ酶切并用XYGEN公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。将DNA片段和酶切后的pdTrp-NCP1质粒一起转入酿酒酵母，体内进行同源重组。通过菌落PCR验证阳性转化子，抽提酿酒酵母质粒转化E.coli TOP 10感受态细胞，并涂布于添加 100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上。通过菌落PCR验证阳性转化子，并测序进一步验证表达质粒pdTrp-NCP1-GP01构建成功，将重组菌命名为PNGP1。

以实施例1构建的含有GP02基因的质粒peasy-GP02为模板，利用引物SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15扩增开放阅读框片段GP02p-1(即GP02，其5’和3’端均含有与pdTrp同源的序列)。反向引物引入6×His Tag以便进行Western Blot检测表达。将PCR产物用AXYGEN公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。将质粒pdTrp-NCP1用Fermentas公司的SmaⅠ酶切并用XYGEN 公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。将DNA片段和酶切后的pdTrp-NCP1质粒一起转入酿酒酵母，体内进行同源重组。通过菌落PCR 验证阳性转化子，抽提酿酒酵母质粒转化E.coli TOP 10感受态细胞，并涂布于添加 100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上。通过菌落PCR验证阳性转化子，并测序进一步验证表达质粒pdTrp-NCP1-GP02构建成功，将重组菌命名为PNGP2。

实施例3、细胞色素P450基因GP01和GP02在酿酒酵母中的表达

配制SCO培养基：0.67％(w/v)母无氨基酸基本氮源，2％(w/v)葡萄糖。接种PNGP1和PNGP1于SCO培养基，30℃250rpm培养达到稳定期。配制YPD培养基：1％(w/v) 酵母提取物，2％(w/v)细菌蛋白胨，2％(w/v)葡萄糖，离心收集菌体，重悬于丰富YPD 培养基中，30℃250rpm培养24h。用半乳糖替代葡萄糖诱导蛋白表达。离心收集菌体，裂解细胞，超速离心，获得微粒体。取适量微粒体进行SDS-PAGE电泳检测，与转pdTrp-NCP1对照载体的重组子相比，PNGP1和PNGP2重组子没有明显的条带特征，如图3和图5。采用anti-6×His TagWestern Blot检测表达情况，如图2和图4 所示，表达PNGP1和PNGP2的微粒体显示很强的Western Blot信号，表明细胞色素 P450基因GP01和GP02在酵母中成功表达，而转pdTrp-NCP1对照载体的重组子则没有anti-6×His Tag Western Blot信号。

实施例4、酵母表达产物GP01和GP02体外催化反应和产物鉴定

以分别表达GP01和GP02的酵母宿主PNGP1和PNGP2微粒体作为酶液来催化灵芝酸DM(GADM)和灵芝酸TR(GATR)进行体外反应，表达载体pdTrp-NCP1的酵母微粒体为对照。300μL反应体系：0.1M PH7.4磷酸盐缓冲液，1mM EDTA，1mM NADPH，1mM NADPH，1mg微粒体和50mg/L底物。

反应在30℃下进行12h，然后加入等体积丁醇终止反应，并抽提产物。产物真空干燥后，用无水乙醇溶解。

反应产物用HPLC进行检测分析。在图6中，表达GP01的酵母PNGP1宿主的微粒体可以将灵芝酸DM转化为峰2和峰3，其中峰2为主要产物，峰3为次要产物。用表达载体pdTrp-NCP1的酵母微粒体来替代酶液，没有产生峰2和峰3的产物，但是它们把底物灵芝酸DM转化为峰1。这表明酵母自身可以将底物灵芝酸DM转化为峰1。经鉴定，主要产物峰2为hainanicacid A。由于hainanic acid A与灵芝酸DM 在结构上仅在C-23位多了一个羟基，这表明GP01可以在灵芝酸DM的C-23位发生羟基化作用，将灵芝酸DM的C-23氢转化为羟基。在图7中，表达GP01的酵母PNGP1 宿主的微粒体可以将灵芝酸TR分别转化为峰1、峰2和峰3。其中峰3为主要产物，峰1和峰2为次要产物。作为负对照，用表达载体pdTrp-NCP1的酵母微粒体来替代酶液，则没有任何的产物出现。经鉴定，图7中主要产物峰3为灵芝酸Jc。灵芝酸 Jc与灵芝酸TR在结构上的仅在C-23位多了一个羟基，表明GP01可以在灵芝酸TR 的C-23位发生羟基化作用，将灵芝酸TR的C-23氢转化为羟基。

如图8所示，表达GP02的酵母PNGP2宿主的微粒体与对照菌株pdTrp-NCP1的微粒体相比多出4个新峰。这表明GP02至少可以将灵芝酸DM转化为4种不同的产物。

如图9所示，表达GP02的酵母PNGP2宿主的微粒体与对照菌株pdTrp-NCP1的微粒体相比为多出5个新峰。这表明GP02至少可以将灵芝酸TR转化为5种不同的产物。

实施例5、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶功能验证

合成引物分别具有序列表中SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17的核苷酸序列。

以实施例1构建的含有GLCPR基因的质粒peasy-GLCPR为模板，利用引物 SEQ IDNO:16和SEQ ID NO:17扩增开放阅读框片段GLCPRp-1(即GLCPR，其5’和 3’端均含有与pdTrp同源的序列)。以质粒pdTrp为模版，利用引物SEQ ID NO:21和 SEQ ID NO:22扩增串联启动子片段GAL1/10(即GAL10和GAL1反向串联在一起，其5’端含有与GLCPR同源的序列，3’端均含有EcoR Ⅰ和Nde Ⅰ酶切位点以及与pdTrp 同源的序列。将PCR产物用AXYGEN公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。将质粒pdTrp用Fermentas公司的Sma Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切并用XYGEN公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。将上述开放阅读框片段GLCPRp-1，串联启动子片段GAL1/10和酶切后的pdTrp 片段一起转入酿酒酵母，体内进行同源重组。通过菌落PCR验证阳性转化子，抽提酿酒酵母质粒转化E.coli TOP 10感受态细胞，并涂布于添加100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上。通过菌落PCR验证阳性转化子，并测序进一步验证表达质粒 pdTrp-GLCPR构建成功。

以实施例1构建的含有GP01基因的质粒peasy-GP01为模板，利用引物SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13扩增开放阅读框片段GP01p-1(即GP01，其5’和3’端均含有与pdTrp同源的序列)。反向引物引入6×His Tag以便进行Western Blot检测表达。将PCR产物用AXYGEN公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。将质粒pdTrp-GLCPR用Fermentas公司的EcoR Ⅰ和Nde Ⅰ双酶切并用XYGEN公司的AxyPrep DNA GelExtraction Kit从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。将DNA片段和酶切后的pdTrp-GLCPR质粒一起转入酿酒酵母，体内进行同源重组。通过菌落PCR验证阳性转化子，抽提酿酒酵母质粒转化E.coli TOP 10感受态细胞，并涂布于添加100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上。通过菌落PCR验证阳性转化子，并测序进一步验证表达质粒pdTrp-GLCPR-GP01构建成功。命名为PGGP1。

按照实施例4的方法，接种PGGP1制备微粒体。

按照实施例5的方法，进行体外反应实验，验证GLCPR的活性。

如图10所示，表达GP01和GLCPR的酵母PGGP1宿主的微粒体可以将灵芝酸 DM转化为峰2和峰3。用表达载体pdTrp-GLCPR的酵母微粒体来替代酶液，没有产生峰2和峰3的产物，但是它们把底物灵芝酸DM转化为峰1。经鉴定，图10中主要产物峰2为hainanic acid A。如图11所示，表达GP01和GLCPR的酵母PGGP1 宿主的微粒体可以将灵芝酸TR转化为峰1、峰2和峰3。经鉴定，图11中主要产物峰3为灵芝酸Jc。当将表达GP01和GLCPR的酵母PGGP1宿主的微粒体煮沸失活蛋白时，底物灵芝酸TR没有被转化。用载体pdTrp-GLCPR的酵母微粒体来替代酶液，没有产生峰1、峰2和峰3的产物。这表明灵芝来源的细胞色素P450还原酶(GLCPR)可以辅助GP01的羟基化，促进底物的转化，证明GLCPR具有良好的促进底物转化功能、活性。

同样地，GLCPR对于GP02的羟基化也有辅助作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 细胞色素P450、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶及其应用

<130> 172598

<160> 25

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1530

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgttggccc tgatggacga catccagtca gccgtttttg cctgtgttgc ggtggtcatc 60

gccatctacg cagtgagatg gtacaccgat cctataaatt ccatccccac cgtcggcggc 120

tcgtccctcc cgggcttgtc tttgcttact gcgtggagga ctgtgcacaa ctgcagagag 180

gtgcttacgg ccgggtacag gaaatatccg gactcggtgt tcaagatcgc gatgttcgac 240

tcctggctgg tcatcgcctc cgggcggaac atgatcgagg aggtgcggaa acgccacgac 300

gagctttcta ccacgctcgg gatccaagag gctctccgtt cccgctacat ccgggatcgc 360

caggtcatga cggacgagta ccacgtgcgc gtggtgaagg agaagatgtc ggggcggacg 420

ctccaggcga tgctcccgga cgtcatcgag gaggtctcca ttgccgtcaa ggatcatatc 480

gcaacgcaag ggagcgggtg gaccagccta gaggtcgtcc cggcgatgca gaaagtcatt 540

ttccaggtca acaaccgcgc attcgtcggc cccgtcttgt gtcgcagcaa agagtatctg 600

aacgtggcca tcgatttctc ggagcatact ttcaagtggt ccgcgatcct gagcgtaact 660

cccgaatttg tcagacgtat catagcgccg ttcattaacg aagcgaagaa cgacactcgt 720

cgcgccgttc ccctgcttcg tcccataatc gaggagcgga tgaaagcaca agcggactta 780

ggtgaaggat ggcacgacaa gccgaacgat atactacaat ttgttttgga caaggcgata 840

ccgaaggaag aatccatgtt cctcatcgtg cacaggcttc tgatcgtcaa ccacgcggcg 900

tccggtaatt cggtgaacgc tatcacctac gtgctctatc atctcgcgga gaaccctgat 960

atcctgcagg cctgccggga agaggcagaa gccaagatag cggccgacgg ctggacgagc 1020

acggcgctgg cgaacatgtg gaggctcgat agcatactgc gggaaaccct ccgctatcac 1080

ggcaccgcac tagtttccat gaaccggttg gccacgaagg acgtcgtgct cagcgacggc 1140

acgcggctcc cgaagggcac cttcatgcag gcagccgcgt acccgctgca tcgcgacggc 1200

gccctcgtcg agaacgcaca cacgttcgac ccgttccgct acgcccgcat gcgggacgcc 1260

gatggcgagg gcttgaagca ccaggcttcg acgacctccc cggagtacat cccctttggc 1320

cacgggcagc atgcgtgccc gggaaggtat ttcgcggcgt acgtgctgaa ggccatcctc 1380

gcgcatctca tcgtcaacta tgacctgaag ctcggcgggg acggttcgcg ccccccaatc 1440

cgatacgtcc tcagcgctgt gctgcccccg ccgggcggtt gcgtccttct caaggagcgc 1500

ggtgaaggat cgactactac gacgggatag 1530

<210> 2

<211> 1509

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgacggtcg aggaccctca agcattcatc ttcgccggct tggccatctt tgctgtgatc 60

tacgtcatca aatggcagac cgatcctttg aggtccattc ctaccgtcgg cgggccttct 120

gcgcctggtc tatcgttcgt ggctgcgtac aactggttac acaatagcaa gaacctgata 180

tttgaagctt gccagaagta ccatggctca gcattcaagg tcgccttatt cgacaaatgg 240

cttgtgatag tctcaggaca taagctggtt gagcagctcg tgaggctgcc tgataatgag 300

ctgtcagcta tggagggcaa cctcacggtc gttcgcctta ggcgttttgt taccgctgag 360

tcactcgatg accccttcca tgtcgatatc atcagggaga agctaacacg aagactcgcc 420

gttatttttc cggatatcgt cgacgaggtg aagcttgctt tgtcaggcag cctccccacc 480

aagggcgagg aatgggtcgc tctcaatgtc ttggcgaaga tgcgcgaggt cgtcgtcagg 540

gccagcagtc gggtctttgt ggggcttccg ctatgtcgca acgaggagta tttgaagttg 600

gcactttgct ttacttcgga tatggtccag agtcggaccc aaatcgccgc tttaccatcc 660

ttcctacaac cacttttcgt gcgtttctgg agcaagccac ataggacgat gcgcagagcc 720

atggaattta ccgagccgtt catcgatgaa cgaaaggcta aacttgaaga gctaggggag 780

gactggttgg ataagccaaa cgacatcctc cagtggatcg tcgaagaagg tatttctagg 840

aagactacgg attacggcat cgtcgaacgc atattcctca ttaacttcgc cgctatcgac 900

acctcctcgg ctactgctac acaggtactt tccgatctcg ccgccatgcc ggaacgcatc 960

ccggaactcc gggaagagat cgaatccgtc atcgctaccg acggatggac caagacggcc 1020

ctggggaaaa tgtcgaagct cgatagcgcg atcaaggaga gcatgcgcac ccatacaagc 1080

ctcgtcgggc tcggccggaa ggccatggta gatatcaccc tcagcgacgg gacgttcatc 1140

ccgaagggca cactcgtcgt cgccgctatg gcgcctgtgc actacgacga gtcggtctat 1200

gccgacccag atgtgctcga gcccttccgc tttgcgaaga tgcgcgggga cgacggcgag 1260

ggcctgaagc accagctcgt caacacctcg tacaactttc tccccttcgg ccacggcaag 1320

cacgcctgcc caggacgctt cttcgcggcg aacgagatca aggtcgtcct cgcgctcatc 1380

attctaaact atgacatgaa gctcgggggg gacggcaagc ggtcgaagga cacttatcgc 1440

ggatcgaacg ttcttcttcc cactgagccg gtgttcttca ggaagcgcca gacggtcttc 1500

gaggcgtga 1509

<210> 3

<211> 2184

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggcgtcca ccgacaccgt catcctcgcc ttgggcatag tcctcgctgc tgtctacctc 60

ttccgtgacc agctttttgc cgcttcaaag cccaagtccg tccccgtctc gtcctccaaa 120

gcaaatgtcg gcggaggaaa cccacgggac ttcattgcaa agatgaagga gggcaaaaag 180

cgcatcgtca tcttctacgg ctcacaaaca ggtactgccg aggagtacgc tatccgtctc 240

gctaaggagg ccaagcagaa gttcggcctg gcttctctcg tctgcgatcc cgaggagtac 300

gacttcgaga acctcgacca gatctccgac gactcctgcg tcttcttcgt catggccact 360

tacggtgaag gcgagcccac cgacaacgcg gtcactctct gccagaacct ttccgacgat 420

agcttcgagt tctccaacgg tgagcacaag ctttccggtc tcaagtacgt cgtcttcggt 480

cttggaaaca agacctacga gcactacaac ctcatctccc gcaacgtcga cgccgacctt 540

accaagatgg gcgctatccg tatcggcgaa cgcggcgagg gtgacgacga caagagcatg 600

gaggaggact atctcgagtg gaaggacggc atgtgggagg agttttctcg cgtcatgggc 660

gtcgaagaag gccagggagg cgattcaccg gacttcgtcg ttaccgaagt tgccgatcac 720

ccagcggaga aggtgtacct cggtgaactt tcggcccgcg ctctcacccg ttccaagggc 780

atccacgacg caaagaaccc ctaccctgca cctatcactg tcgctcgcga actcttcgct 840

gagggtgctg accgcaactg cattcacgct gaactcgata ctgagaactc cggcatcacc 900

taccagcatg gcgatcacgt cggtgtctgg ccctccaact cggaggtaga agtagaacgt 960

ctgctctgca ccctgggcct ccacgacaag aaggacaccg tcatccagat cgagtccctc 1020

gacccggcgc ttgccaaggt tcccttccca gtccccacca cctacgttac cgtcctccgt 1080

cactacatcg acatcagcgc cgtcgcaggt cgtcagatcc tcggtgtatt gtccaagttc 1140

gctcccaacc ccgaggctga ggctttcttg aagaacctca acaccaacaa ggaggagtac 1200

aacaatgtgg tcaaccatgg ttgtctcaag ctcgctgaga ttcttcagct cgcggcccgg 1260

gacagtatca gcgtttcccc gactcccgag aacactacgt cctggaagat tccgttcgac 1320

atcattgtct cgtcgatccc ccgtctccaa cctcggtatt actccatctc gtccagccct 1380

aagctccacc ctcactcgat ccacgtcacc tgcgttgttc tcaagtacga gtcggtcaag 1440

aacgagcgag tcgacacccg ctgggtcttc ggtactggtt ccaacttcct gctcaacctc 1500

aaatacgcgg cgaacggcga ggaggtcccc ctccttgaga ccaaggagga gccagcccgc 1560

gtccttcctc cctactatgc catcgagggt ccccgcggcg catacaagca agaaaccatc 1620

tacaaggtcc ccatccacgt tcgccgctcc acattccgcc tcccgaccaa ccccaagagc 1680

ccagtcatta tgattggtcc cggtaccggt gtcgctccgt tccgtggctt cgtccaggag 1740

cgcgtcgcga tggcccggcg cacgatcgag aagaacggcc ccgagggcct cgccgactgg 1800

ggcagcatcc gactgtactt cggatcgcgg acgtcgacgc aggacttcct gtacaaggac 1860

gagtggcccg agtacgggaa ggagctgcac ggcaagttca cgctgcggtg cgcgttctcg 1920

cgcgaggtgt acgccgcgga cgggagcaag atctacgtgc aggacctgct gtgggaggat 1980

cgtgagacgg ttgcggacgc gatcctcaac gggaaggggt acgtgtacat ctgcggtgac 2040

gcgcggagca tgagcaaagc ggtcgaggag acactgtgca ggatccttgg cgaggcgaag 2100

ggcgggagcg cggaggtgga gggtgcggcg gagcttaagt tgttgaagga gaggagcagg 2160

ttcttgacgg atgtttggag ctga 2184

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 扩增灵芝细胞色素P450 GP01序列的正向引物

<400> 4

aggttccgcc acaccgtc 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 扩增灵芝细胞色素P450 GP01序列的反向引物

<400> 5

actcagacca gctattccga 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 扩增灵芝细胞色素P450 GP02序列的正向引物

<400> 6

gtggcctcac ttcaagcg 18

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 扩增灵芝细胞色素P450 GP02序列的反向引物

<400> 7

cgcaaagact gatgcaccac 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 扩增灵芝细胞色素P450 还原酶 GLCPR序列的正向引物

<400> 8

atggcgtcca ccgacaccgt ca 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 扩增灵芝细胞色素P450 还原酶GLCPR序列的反向引物

<400> 9

tcagctccaa acatccgtca ag 22

<210> 10

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 酿酒酵母细胞色素P450 还原酶NCP1表达构建的正向引物

<400> 10

ttatttaata ataaaaatca taaatcataa gaaattcgtt accagacatc ttcttggtat 60

<210> 11

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 酿酒酵母细细胞色素P450 还原酶NCP1表达构建的反向引物

<400> 11

cttctttgcg tccatccaaa aaaaaagtaa gaatttttga aaatgccgtt tggaatagac 60

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 灵芝细胞色素P450 GP01表达构建的正向引物

<400> 12

gttaatatac ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac ccatgttggc cctgatggac 60

<210> 13

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 灵芝细胞色素P450 GP01表达构建的反向引物

<400> 13

cttttcggtt agagcggatc taatgatgat gatgatgatg tcccgtcgta gtagtcgatc 60

<210> 14

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 灵芝细胞色素P450 GP02表达构建的正向引物

<400> 14

ttaatatacc tctatacttt aacgtcaagg agaaaaaacc catgacggtc gaggaccctc 60

<210> 15

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 灵芝细胞色素P450 GP02表达构建的反向引物

<400> 15

tccttttcgg ttagagcgga ttcaatgatg atgatgatga tgcgcctcga agaccgtctg 60

<210> 16

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 灵芝细胞色素P450还原酶GLCPR表达构建的正向引物

<400> 16

cttatttaat aataaaaatc ataaatcata agaaattcgt cagctccaaa catccgtcaa 60

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 灵芝母细胞色素P450还原酶GLCPR表达构建的反向引物

<400> 17

cttctttgcg tccatccaaa aaaaaagtaa gaatttttga aaatggcgtc caccgacacc 60

<210> 18

<211> 509

<212> PRT

<213> 灵芝

<400> 18

Met Leu Ala Leu Met Asp Asp Ile Gln Ser Ala Val Phe Ala Cys Val

1 5 10 15

Ala Val Val Ile Ala Ile Tyr Ala Val Arg Trp Tyr Thr Asp Pro Ile

20 25 30

Asn Ser Ile Pro Thr Val Gly Gly Ser Ser Leu Pro Gly Leu Ser Leu

35 40 45

Leu Thr Ala Trp Arg Thr Val His Asn Cys Arg Glu Val Leu Thr Ala

50 55 60

Gly Tyr Arg Lys Tyr Pro Asp Ser Val Phe Lys Ile Ala Met Phe Asp

65 70 75 80

Ser Trp Leu Val Ile Ala Ser Gly Arg Asn Met Ile Glu Glu Val Arg

85 90 95

Lys Arg His Asp Glu Leu Ser Thr Thr Leu Gly Ile Gln Glu Ala Leu

100 105 110

Arg Ser Arg Tyr Ile Arg Asp Arg Gln Val Met Thr Asp Glu Tyr His

115 120 125

Val Arg Val Val Lys Glu Lys Met Ser Gly Arg Thr Leu Gln Ala Met

130 135 140

Leu Pro Asp Val Ile Glu Glu Val Ser Ile Ala Val Lys Asp His Ile

145 150 155 160

Ala Thr Gln Gly Ser Gly Trp Thr Ser Leu Glu Val Val Pro Ala Met

165 170 175

Gln Lys Val Ile Phe Gln Val Asn Asn Arg Ala Phe Val Gly Pro Val

180 185 190

Leu Cys Arg Ser Lys Glu Tyr Leu Asn Val Ala Ile Asp Phe Ser Glu

195 200 205

His Thr Phe Lys Trp Ser Ala Ile Leu Ser Val Thr Pro Glu Phe Val

210 215 220

Arg Arg Ile Ile Ala Pro Phe Ile Asn Glu Ala Lys Asn Asp Thr Arg

225 230 235 240

Arg Ala Val Pro Leu Leu Arg Pro Ile Ile Glu Glu Arg Met Lys Ala

245 250 255

Gln Ala Asp Leu Gly Glu Gly Trp His Asp Lys Pro Asn Asp Ile Leu

260 265 270

Gln Phe Val Leu Asp Lys Ala Ile Pro Lys Glu Glu Ser Met Phe Leu

275 280 285

Ile Val His Arg Leu Leu Ile Val Asn His Ala Ala Ser Gly Asn Ser

290 295 300

Val Asn Ala Ile Thr Tyr Val Leu Tyr His Leu Ala Glu Asn Pro Asp

305 310 315 320

Ile Leu Gln Ala Cys Arg Glu Glu Ala Glu Ala Lys Ile Ala Ala Asp

325 330 335

Gly Trp Thr Ser Thr Ala Leu Ala Asn Met Trp Arg Leu Asp Ser Ile

340 345 350

Leu Arg Glu Thr Leu Arg Tyr His Gly Thr Ala Leu Val Ser Met Asn

355 360 365

Arg Leu Ala Thr Lys Asp Val Val Leu Ser Asp Gly Thr Arg Leu Pro

370 375 380

Lys Gly Thr Phe Met Gln Ala Ala Ala Tyr Pro Leu His Arg Asp Gly

385 390 395 400

Ala Leu Val Glu Asn Ala His Thr Phe Asp Pro Phe Arg Tyr Ala Arg

405 410 415

Met Arg Asp Ala Asp Gly Glu Gly Leu Lys His Gln Ala Ser Thr Thr

420 425 430

Ser Pro Glu Tyr Ile Pro Phe Gly His Gly Gln His Ala Cys Pro Gly

435 440 445

Arg Tyr Phe Ala Ala Tyr Val Leu Lys Ala Ile Leu Ala His Leu Ile

450 455 460

Val Asn Tyr Asp Leu Lys Leu Gly Gly Asp Gly Ser Arg Pro Pro Ile

465 470 475 480

Arg Tyr Val Leu Ser Ala Val Leu Pro Pro Pro Gly Gly Cys Val Leu

485 490 495

Leu Lys Glu Arg Gly Glu Gly Ser Thr Thr Thr Thr Gly

500 505

<210> 19

<211> 502

<212> PRT

<213> 灵芝

<400> 19

Met Thr Val Glu Asp Pro Gln Ala Phe Ile Phe Ala Gly Leu Ala Ile

1 5 10 15

Phe Ala Val Ile Tyr Val Ile Lys Trp Gln Thr Asp Pro Leu Arg Ser

20 25 30

Ile Pro Thr Val Gly Gly Pro Ser Ala Pro Gly Leu Ser Phe Val Ala

35 40 45

Ala Tyr Asn Trp Leu His Asn Ser Lys Asn Leu Ile Phe Glu Ala Cys

50 55 60

Gln Lys Tyr His Gly Ser Ala Phe Lys Val Ala Leu Phe Asp Lys Trp

65 70 75 80

Leu Val Ile Val Ser Gly His Lys Leu Val Glu Gln Leu Val Arg Leu

85 90 95

Pro Asp Asn Glu Leu Ser Ala Met Glu Gly Asn Leu Thr Val Val Arg

100 105 110

Leu Arg Arg Phe Val Thr Ala Glu Ser Leu Asp Asp Pro Phe His Val

115 120 125

Asp Ile Ile Arg Glu Lys Leu Thr Arg Arg Leu Ala Val Ile Phe Pro

130 135 140

Asp Ile Val Asp Glu Val Lys Leu Ala Leu Ser Gly Ser Leu Pro Thr

145 150 155 160

Lys Gly Glu Glu Trp Val Ala Leu Asn Val Leu Ala Lys Met Arg Glu

165 170 175

Val Val Val Arg Ala Ser Ser Arg Val Phe Val Gly Leu Pro Leu Cys

180 185 190

Arg Asn Glu Glu Tyr Leu Lys Leu Ala Leu Cys Phe Thr Ser Asp Met

195 200 205

Val Gln Ser Arg Thr Gln Ile Ala Ala Leu Pro Ser Phe Leu Gln Pro

210 215 220

Leu Phe Val Arg Phe Trp Ser Lys Pro His Arg Thr Met Arg Arg Ala

225 230 235 240

Met Glu Phe Thr Glu Pro Phe Ile Asp Glu Arg Lys Ala Lys Leu Glu

245 250 255

Glu Leu Gly Glu Asp Trp Leu Asp Lys Pro Asn Asp Ile Leu Gln Trp

260 265 270

Ile Val Glu Glu Gly Ile Ser Arg Lys Thr Thr Asp Tyr Gly Ile Val

275 280 285

Glu Arg Ile Phe Leu Ile Asn Phe Ala Ala Ile Asp Thr Ser Ser Ala

290 295 300

Thr Ala Thr Gln Val Leu Ser Asp Leu Ala Ala Met Pro Glu Arg Ile

305 310 315 320

Pro Glu Leu Arg Glu Glu Ile Glu Ser Val Ile Ala Thr Asp Gly Trp

325 330 335

Thr Lys Thr Ala Leu Gly Lys Met Ser Lys Leu Asp Ser Ala Ile Lys

340 345 350

Glu Ser Met Arg Thr His Thr Ser Leu Val Gly Leu Gly Arg Lys Ala

355 360 365

Met Val Asp Ile Thr Leu Ser Asp Gly Thr Phe Ile Pro Lys Gly Thr

370 375 380

Leu Val Val Ala Ala Met Ala Pro Val His Tyr Asp Glu Ser Val Tyr

385 390 395 400

Ala Asp Pro Asp Val Leu Glu Pro Phe Arg Phe Ala Lys Met Arg Gly

405 410 415

Asp Asp Gly Glu Gly Leu Lys His Gln Leu Val Asn Thr Ser Tyr Asn

420 425 430

Phe Leu Pro Phe Gly His Gly Lys His Ala Cys Pro Gly Arg Phe Phe

435 440 445

Ala Ala Asn Glu Ile Lys Val Val Leu Ala Leu Ile Ile Leu Asn Tyr

450 455 460

Asp Met Lys Leu Gly Gly Asp Gly Lys Arg Ser Lys Asp Thr Tyr Arg

465 470 475 480

Gly Ser Asn Val Leu Leu Pro Thr Glu Pro Val Phe Phe Arg Lys Arg

485 490 495

Gln Thr Val Phe Glu Ala

500

<210> 20

<211> 727

<212> PRT

<213> 灵芝

<400> 20

Met Ala Ser Thr Asp Thr Val Ile Leu Ala Leu Gly Ile Val Leu Ala

1 5 10 15

Ala Val Tyr Leu Phe Arg Asp Gln Leu Phe Ala Ala Ser Lys Pro Lys

20 25 30

Ser Val Pro Val Ser Ser Ser Lys Ala Asn Val Gly Gly Gly Asn Pro

35 40 45

Arg Asp Phe Ile Ala Lys Met Lys Glu Gly Lys Lys Arg Ile Val Ile

50 55 60

Phe Tyr Gly Ser Gln Thr Gly Thr Ala Glu Glu Tyr Ala Ile Arg Leu

65 70 75 80

Ala Lys Glu Ala Lys Gln Lys Phe Gly Leu Ala Ser Leu Val Cys Asp

85 90 95

Pro Glu Glu Tyr Asp Phe Glu Asn Leu Asp Gln Ile Ser Asp Asp Ser

100 105 110

Cys Val Phe Phe Val Met Ala Thr Tyr Gly Glu Gly Glu Pro Thr Asp

115 120 125

Asn Ala Val Thr Leu Cys Gln Asn Leu Ser Asp Asp Ser Phe Glu Phe

130 135 140

Ser Asn Gly Glu His Lys Leu Ser Gly Leu Lys Tyr Val Val Phe Gly

145 150 155 160

Leu Gly Asn Lys Thr Tyr Glu His Tyr Asn Leu Ile Ser Arg Asn Val

165 170 175

Asp Ala Asp Leu Thr Lys Met Gly Ala Ile Arg Ile Gly Glu Arg Gly

180 185 190

Glu Gly Asp Asp Asp Lys Ser Met Glu Glu Asp Tyr Leu Glu Trp Lys

195 200 205

Asp Gly Met Trp Glu Glu Phe Ser Arg Val Met Gly Val Glu Glu Gly

210 215 220

Gln Gly Gly Asp Ser Pro Asp Phe Val Val Thr Glu Val Ala Asp His

225 230 235 240

Pro Ala Glu Lys Val Tyr Leu Gly Glu Leu Ser Ala Arg Ala Leu Thr

245 250 255

Arg Ser Lys Gly Ile His Asp Ala Lys Asn Pro Tyr Pro Ala Pro Ile

260 265 270

Thr Val Ala Arg Glu Leu Phe Ala Glu Gly Ala Asp Arg Asn Cys Ile

275 280 285

His Ala Glu Leu Asp Thr Glu Asn Ser Gly Ile Thr Tyr Gln His Gly

290 295 300

Asp His Val Gly Val Trp Pro Ser Asn Ser Glu Val Glu Val Glu Arg

305 310 315 320

Leu Leu Cys Thr Leu Gly Leu His Asp Lys Lys Asp Thr Val Ile Gln

325 330 335

Ile Glu Ser Leu Asp Pro Ala Leu Ala Lys Val Pro Phe Pro Val Pro

340 345 350

Thr Thr Tyr Val Thr Val Leu Arg His Tyr Ile Asp Ile Ser Ala Val

355 360 365

Ala Gly Arg Gln Ile Leu Gly Val Leu Ser Lys Phe Ala Pro Asn Pro

370 375 380

Glu Ala Glu Ala Phe Leu Lys Asn Leu Asn Thr Asn Lys Glu Glu Tyr

385 390 395 400

Asn Asn Val Val Asn His Gly Cys Leu Lys Leu Ala Glu Ile Leu Gln

405 410 415

Leu Ala Ala Arg Asp Ser Ile Ser Val Ser Pro Thr Pro Glu Asn Thr

420 425 430

Thr Ser Trp Lys Ile Pro Phe Asp Ile Ile Val Ser Ser Ile Pro Arg

435 440 445

Leu Gln Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Pro Lys Leu His Pro

450 455 460

His Ser Ile His Val Thr Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Ser Val Lys

465 470 475 480

Asn Glu Arg Val Asp Thr Arg Trp Val Phe Gly Thr Gly Ser Asn Phe

485 490 495

Leu Leu Asn Leu Lys Tyr Ala Ala Asn Gly Glu Glu Val Pro Leu Leu

500 505 510

Glu Thr Lys Glu Glu Pro Ala Arg Val Leu Pro Pro Tyr Tyr Ala Ile

515 520 525

Glu Gly Pro Arg Gly Ala Tyr Lys Gln Glu Thr Ile Tyr Lys Val Pro

530 535 540

Ile His Val Arg Arg Ser Thr Phe Arg Leu Pro Thr Asn Pro Lys Ser

545 550 555 560

Pro Val Ile Met Ile Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly

565 570 575

Phe Val Gln Glu Arg Val Ala Met Ala Arg Arg Thr Ile Glu Lys Asn

580 585 590

Gly Pro Glu Gly Leu Ala Asp Trp Gly Ser Ile Arg Leu Tyr Phe Gly

595 600 605

Ser Arg Thr Ser Thr Gln Asp Phe Leu Tyr Lys Asp Glu Trp Pro Glu

610 615 620

Tyr Gly Lys Glu Leu His Gly Lys Phe Thr Leu Arg Cys Ala Phe Ser

625 630 635 640

Arg Glu Val Tyr Ala Ala Asp Gly Ser Lys Ile Tyr Val Gln Asp Leu

645 650 655

Leu Trp Glu Asp Arg Glu Thr Val Ala Asp Ala Ile Leu Asn Gly Lys

660 665 670

Gly Tyr Val Tyr Ile Cys Gly Asp Ala Arg Ser Met Ser Lys Ala Val

675 680 685

Glu Glu Thr Leu Cys Arg Ile Leu Gly Glu Ala Lys Gly Gly Ser Ala

690 695 700

Glu Val Glu Gly Ala Ala Glu Leu Lys Leu Leu Lys Glu Arg Ser Arg

705 710 715 720

Phe Leu Thr Asp Val Trp Ser

725

<210> 21

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 串联启动子正向引物GALGLCPR-GAL10-F

<400> 21

gcccaaggcg aggatgacgg tgtcggtgga cgccattttc aaaaattctt actttttttt 60

<210> 22

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 串联启动子反向引物GALGLCPR-GAL1-R

<400> 22

cttttcggtt agagcggatc atatgcttac gcatggaatt cgggtttttt ctccttgacg 60

<210> 23

<211> 2076

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 23

atgccgtttg gaatagacaa caccgacttc actgtcctgg cggggctagt gcttgccgtg 60

ctactgtacg taaagagaaa ctccatcaag gaactgctga tgtccgatga cggagatatc 120

acagctgtca gctcgggcaa cagagacatt gctcaggtgg tgaccgaaaa caacaagaac 180

tacttggtgt tgtatgcgtc gcagactggg actgccgagg attacgccaa aaagttttcc 240

aaggagctgg tggccaagtt caacctaaac gtgatgtgcg cagatgttga gaactacgac 300

tttgagtcgc taaacgatgt gcccgtcata gtctcgattt ttatctctac atatggtgaa 360

ggagacttcc ccgacggggc ggtcaacttt gaagacttta tttgtaatgc ggaagcgggt 420

gcactatcga acctgaggta taatatgttt ggtctgggaa attctactta tgaattcttt 480

aatggtgccg ccaagaaggc cgagaagcat ctctccgccg cgggcgctat cagactaggc 540

aagctcggtg aagctgatga tggtgcagga actacagacg aagattacat ggcctggaag 600

gactccatcc tggaggtttt gaaagacgaa ctgcatttgg acgaacagga agccaagttc 660

acctctcaat tccagtacac tgtgttgaac gaaatcactg actccatgtc gcttggtgaa 720

ccctctgctc actatttgcc ctcgcatcag ttgaaccgca acgcagacgg catccaattg 780

ggtcccttcg atttgtctca accgtatatt gcacccatcg tgaaatctcg cgaactgttc 840

tcttccaatg accgtaattg catccactct gaatttgact tgtccggctc taacatcaag 900

tactccactg gtgaccatct tgctgtttgg ccttccaacc cattggaaaa ggtcgaacag 960

ttcttatcca tattcaacct ggaccctgaa accatttttg acttgaagcc cctggatccc 1020

accgtcaaag tgcccttccc aacgccaact actattggcg ctgctattaa acactatttg 1080

gaaattacag gacctgtctc cagacaattg ttttcatctt tgattcagtt cgcccccaac 1140

gctgacgtca aggaaaaatt gactctgctt tcgaaagaca aggaccaatt cgccgtcgag 1200

ataacctcca aatatttcaa catcgcagat gctctgaaat atttgtctga tggcgccaaa 1260

tgggacaccg tacccatgca attcttggtc gaatcagttc cccaaatgac tcctcgttac 1320

tactctatct cttcctcttc tctgtctgaa aagcaaaccg tccatgtcac ctccattgtg 1380

gaaaactttc ctaacccaga attgcctgat gctcctccag ttgttggtgt tacgactaac 1440

ttgttaagaa acattcaatt ggctcaaaac aatgttaaca ttgccgaaac taacctacct 1500

gttcactacg atttaaatgg cccacgtaaa cttttcgcca attacaaatt gcccgtccac 1560

gttcgtcgtt ctaacttcag attgccttcc aacccttcca ccccagttat catgatcggt 1620

ccaggtaccg gtgttgcccc attccgtggg tttatcagag agcgtgtcgc gttcctcgaa 1680

tcacaaaaga agggcggtaa caacgtttcg ctaggtaagc atatactgtt ttatggatcc 1740

cgtaacactg atgatttctt gtaccaggac gaatggccag aatacgccaa aaaattggat 1800

ggttcgttcg aaatggtcgt ggcccattcc aggttgccaa acaccaaaaa agtttatgtt 1860

caagataaat taaaggatta cgaagaccaa gtatttgaaa tgattaacaa cggtgcattt 1920

atctacgtct gtggtgatgc aaagggtatg gccaagggtg tgtcaaccgc attggttggc 1980

atcttatccc gtggtaaatc cattaccact gatgaagcaa cagagctaat caagatgctc 2040

aagacttcag gtagatacca agaagatgtc tggtaa 2076

<210> 24

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> pdTrp质粒构建正向引物 dTrp-F

<400> 24

tctatatgct gccactcctc cacgtgagta tacgtgatta ag 42

<210> 25

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> pdTrp质粒构建正向引物 dTrp-R

<400> 25

gtatatatat cgtatgctgc agaggcaagt gcacaaacaa tact 44

Claims

1.一种催化四环三萜化合物的羟基化的方法，其特征在于，所述方法包括：利用细胞色素P450催化四环三萜化合物，获得羟基化的四环三萜化合物，所述羟基化是位于四环三萜化合物的C-23位的羟基化；其中，所述的细胞色素P450为：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示的多肽；或(b)在(a)所述多肽序列C末端或N末端添加标签序列或信号序列后所形成的不影响其功能的多肽。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在利用细胞色素P450催化四环三萜化合物时，还配合加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶为：(1) 氨基酸序列如SEQ ID NO: 20所示的多肽；或(2)在(1)所述多肽序列C末端或N末端添加标签序列或信号序列后所形成的不影响其功能的多肽。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶为：

P450还原酶ATR 1；或

P450还原酶ATR 2.1；或

P450还原酶ATR 2.2；或

P450还原酶NCP1。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的四环三萜化合物是式(I)结构的化合物，所述的羟基化的四环三萜化合物是式(II)结构的化合物：

(I) (II)；

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，R1和R2为酮基，R3，R4和R5为氢，所述的式(I)化合物为灵芝酸DM；所述的式(II)化合物为hainanic acid A；或

R1为羟基，R2为酮基，R3，R4和R5为氢，所述的式(I)化合物为7-oxo-ganoderic acidZ；所述的式(II)化合物为23-OH-7-oxo-ganoderic acid Z；或

R1和R3为酮基，R2和R4为氢，R5为羟基，所述的式(I)化合物为Ganolucidic acid E；所述的式(II)化合物为23-OH-Ganolucidic acid E。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的四环三萜化合物是式(III)结构的化合物，所述的羟基化的四环三萜化合物是式(IV)结构的化合物

(III) (IV)；

其中，R为羟基或保护基。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，R为羟基，所述的式(III)化合物为灵芝酸TR；所述的式(IV)化合物为灵芝酸Jc。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述四环三萜化合物包括：达玛烷型四环三萜类化合物、羊毛脂烷型四环三萜类化合物、甘遂烷型四环三萜类化合物、环阿屯烷型四环三萜类化合物、葫芦烷四环三萜类化合物、或楝烷型四环三萜类化合物。

10.如权利要求1～9任一所述的方法，其特征在于，所述的细胞色素P450是宿主细胞表达的；或

所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶是宿主细胞表达的。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的细胞色素P450是宿主细胞表达的，在表达后，破碎细胞，获得含有细胞色素P450的微粒体；或

所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶是宿主细胞表达的，在表达后，破碎细胞，获得含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶的微粒体。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌。

14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述真核宿主细胞包括真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的真菌细胞包括酵母细胞和灵芝细胞。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述的酵母包括：酿酒酵母、毕赤酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、假丝酵母。

17.分离的多肽，所述的多肽为：(a) 氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示的多肽；(b)在(a)所述多肽序列C末端或N末端添加标签序列或信号序列后所形成的不影响其功能的多肽。

18.分离的多肽，所述的多肽为：(1) 氨基酸序列如SEQ ID NO: 20所示的多肽；(2)在(1)所述多肽序列C末端或N末端添加标签序列或信号序列后所形成的不影响其功能的多肽。

19.分离的多核苷酸，所述的多核苷酸为编码权利要求17或18所述多肽的多核苷酸；编码权利要求17所述多肽的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；编码权利要求18所述多肽的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

20.一种载体，所述的载体含有权利要求19所述的多核苷酸。

21.一种宿主细胞，它含有权利要求20所述的载体，或其基因组中整合有权利要求19所述的多核苷酸。

22.如权利要求21所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞。

23.如权利要求22所述的宿主细胞，其特征在于，所述原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌。

24.如权利要求22所述的宿主细胞，其特征在于，所述真核宿主细胞包括真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。

25.如权利要求24所述的宿主细胞，其特征在于，所述的真菌细胞包括酵母细胞和灵芝细胞。

26.如权利要求25所述的宿主细胞，其特征在于，所述的酵母包括：酿酒酵母、毕赤酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、假丝酵母。

27.一种制备权利要求17或18所述的多肽的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a) 在适合表达的条件下，培养权利要求21-26任一所述的宿主细胞；

(b) 从培养物中分离出权利要求17或18所述的多肽。

28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，在表达后，破碎所述的宿主细胞，获得含有权利要求17或18所述的多肽的微粒体。

29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞是灵芝、酵母酿酒、毕赤酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、假丝酵母。

30.权利要求17所述的多肽的用途，用于催化四环三萜化合物的羟基化，所述的羟基化是位于四环三萜化合物的C-23位的羟基化。

31.如权利要求30所述的用途，其特征在于，所述的四环三萜化合物是式(I)结构的化合物，且所述的羟基化的四环三萜化合物是式(II)结构的化合物：

(I) (II)；

32.如权利要求31所述的用途，其特征在于，R1和R2为酮基，R3，R4和R5为氢，所述的式(I)化合物为灵芝酸DM；所述的式(II)化合物为hainanic acid A；或

33.如权利要求30所述的用途，其特征在于，所述的四环三萜化合物是式(III)结构的化合物，且所述的羟基化的四环三萜化合物是式(IV)结构的化合物

(III) (IV)；

其中，R为羟基或保护基。

34.如权利要求33所述的用途，其特征在于，R为羟基，所述的式(III)化合物为灵芝酸TR；所述的式(IV)化合物为灵芝酸Jc。

35.权利要求18所述的多肽的用途，用于在利用细胞色素P450催化四环三萜化合物时，作为还原酶。

36.如权利要求35所述的用途，其特征在于，所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶通过传递电子给细胞色素 P450、协助细胞色素P450进行对底物的羟基化修饰。

37.权利要求21-26任一所述的宿主细胞的用途，用于制备酶催化试剂，或生产细胞色素 P450和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素 P450还原酶、或作为催化细胞、或产生式(II)和(IV)化合物。

38.一种用于使四环三萜化合物的羟基化的微粒体，其特征在于，所述的微粒体是权利要求28或29所述的方法产生的微粒体。